CN204228722U - 基于双粒径荧光微球的试纸条和试纸卡 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供了一种试纸条,所述试纸条包括样品接收层、结合层、包被层及吸水层,其中所述接收层、结合层、包被层及吸水层顺序排列并依次搭接,所述结合层进一步包被有由两种不同粒径大小的荧光微球分别标记的第一抗体和由生物素标记的第二抗体,所述包被层具有相间隔的检测带和质控带,所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体。本实用新型还提供了一种试纸卡。本实用新型的试纸条和试纸卡具有高灵敏性、使用方便等优点。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种用于免疫检测的试纸条,具体涉及一种基于两种不同粒径的荧光微球的试纸条。本实用新型还涉及一种试纸卡。
背景技术
目前临床常用的方法包括:胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫法、化学发光法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。胶乳增强免疫比浊法虽实现高通量筛选,但由于某些待测物所需的检测灵敏度要求高,导致检测时低值样品CV值过大。酶联免疫法及化学发光法虽可以定量准确,但是对于某些疾病的判定方面其检测耗时过长,大大延误了可能需要的治疗。胶体金免疫层析法操作简单,但只能实现半定量。
但对于灵敏度要求极高的某些待测物如心肌肌钙蛋白I的检测而言(低值需要检测到0.1ng/ml),目前的荧光免疫层析法所采用的荧光微球法存在一定的缺陷。大粒径荧光微球检测的线性范围不够,因此高值检测不准确。小粒径荧光微球检测的低端的测值不准确,CV值过大。此外,目前对于基于上述检测方法所开发的试纸条和/或试纸卡也存在工艺复杂、成本高、灵敏性和准确性差等诸多问题。
因此,仍然需要一种能实现精确检测且能满足产业化大规模应用的试纸条和/或试纸卡。
实用新型内容
技术问题
针对现有技术中存在的工艺流程复杂且检测灵敏度和线性范围亟需改进的问题,本实用新型提供了一种具有四组成构件且使用两种不同粒径大小的荧光微球的试纸条。
技术方案
一方面,本实用新型提供了一种基于双粒径荧光微球的试纸条,其特征在于,所述试纸条包括顺序排列并依次搭接的以下部件:
i)用于接收待测样品的接收层,
ii)包被有由两种不同粒径大小的荧光微球分别标记的第一抗体和由生物素标记的第二抗体的结合层,
iii)具有相间隔的检测带和质控带的包被层,其中所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体,和
iv)吸水层。
在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在30nm-600nm之间。
在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在100nm-400nm之间。
在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小为100nm和300nm。
在一个实施方式中,所述检测带和所述质控带之间的间隔在0.1-0.6cm之间。
在一个实施方式中,所述试纸条包括布置有接收层、结合层、包被层及吸水层的底板。
在一个实施方式中,所述试纸条的宽度在0.2cm-1cm之间。
在一个实施方式中,所述荧光微球上具有选自以下的荧光物质:Cy3荧光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明和四甲基异硫氰酸罗丹明。
在一个实施方式中,所述第一抗体和第二抗体识别同种蛋白的不同表位,所述蛋白选自以下组中:心肌肌钙蛋白I、N末端脑钠肽前体、D-二聚体、心型脂肪酸结合蛋白、降钙素原和C反应蛋白。
另一方面,本实用新型提供了一种基于双粒径荧光微球的试纸卡,所述试纸卡包括:
i)前述任一项实施方式所述的试纸条,和
ii)包覆前述任一项实施方式所述的试纸条的外壳,其中所述外壳包括:
ii-1)设置有加样孔和检测孔的卡盖,其中所述加样孔开口于所述接收层的上侧,以暴露出所述接收层的部分区域,所述检测孔开口于所述包被层的上侧,以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域,和
ii-2)与所述卡盖彼此连接的底座。
有益效果
本实用新型的试纸条和试纸卡的主要优点包括:
应用两种不同粒径的荧光微球,极好的克服了单荧光微球存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题;
通过引入生物素亲和素级联放大系统,进一步提高了检测灵敏度;
将荧光标记的抗体与生物素标记的抗体同时整合到单一结合层上的设计简化了生产工艺及流程;
试纸条形状和结构的设计充分考虑了通过荧光检测仪读取结果的需要,使得试纸条具有更广泛的应用空间;和
试纸卡易于携带和保存,易于实现在相应的荧光检测仪中对试纸条检测结果的分析。
附图说明
图1本实用新型的试纸条的俯视图。
图2-4本实用新型另一实施方式的试纸条的侧视图。
图5本实用新型的试纸卡的俯视图。
图6本实用新型另一实施方式的试纸卡的俯视图。
附图标记:
1接收层、2结合层、3包被层、4吸水层、5底板、6大粒径荧光微球、7小粒径荧光微球、8检测带、9质控带、10卡盖、11底座、12加样孔和13检测孔。
具体实施方式
下文中将参照附图来更详细地描述示例性实施方式。所述附图用于图示说明本实用新型,而非对其进行限制。在附图中,为了清楚的说明,放大了试纸条部分区域的尺寸及其相对比例。
图1是本实用新型的试纸条的俯视图。如图1所述,本实用新型的试纸条包括接收层1、结合层2、包被层3、吸水层4和底板5,结合层2上具有包被有由大粒径荧光微球6和小粒径荧光微球7分别标记的一种抗体以及由生物素标记的另一种抗体,包被层具有相间隔的检测带8和质控带9。
接收层1用于接收样品,其在试纸条的结构中与结合层2搭接。本实用新型的试纸条在传统试纸条的基础上采用单独的接收层1来接收样品。接收层1可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成,优选由玻璃纤维素膜制成。接收层1可以起到样品过滤的作用。例如,当待检测样品为血浆、血清时,接收层可以过滤样品中的颗粒性不溶物。本实用新型的试纸条所适合检测的样品包括但不限于血清、血浆、尿液。在一个实施方式中,接收层所接收的样品为血浆。在另一个实施方式中,接收层所接收的样品为血清。
结合层2用于布置与待测样品中特定蛋白反应的抗体。结合层2位于接收层1和包被层3之间,且分别与接收层1和包被层3搭接。本实用新型的试纸条的结合层2上布置有特异性结合样品中特定蛋白的一种抗体,此抗体由两种不同粒径大小的荧光微球6和7分别标记。大粒径的荧光微球标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求,而小粒径的荧光微球标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域。因此,由于采用两种粒径大小的荧光微球,使得本实用新型的试纸条可同时实现高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在30nm-600nm之间,优选在100nm-400nm之间,更优选在100nm-300nm之间。在一个实施方式中,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为100nm和300nm。
在一个实施方式中,所述荧光微球上具有选自以下的荧光物质:Cy3荧光素、Cy5荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(TAMRA)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)。在一个实施方式中,荧光微球上具有Cy5荧光素。
本实用新型的试纸条的结合层2上进一步布置特异性结合样品中特定蛋白的另一种抗体,此抗体由生物素标记(未示出)。由荧光微球标记的抗体与由生物素标记的抗体分别特异性结合相同蛋白的不同表位。本实用新型的试纸条通过将荧光标记的抗体与生物素标记的抗体同时整合到单一结合层2上,大大简化了生产工艺及流程。
本实用新型的试纸条上的抗体可特异性结合选自以下组中的蛋白:心肌肌钙蛋白I(cTnI)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、D-二聚体(D-Dimer)、心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)、降钙素原(PCT)和C反应蛋白(CRP)。。在一个实施方式中,所述蛋白为心肌肌钙蛋白I。
在一个实施方式中,本实用新型的试纸条上的抗体为抗心肌肌钙蛋白I的抗体,其中一种抗体是分别由不同粒径大小的荧光微球标记的抗心肌肌钙蛋白I的抗体,另一种抗体为由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的抗体,两种抗心肌肌钙蛋白I的抗体分别特异性结合相同心肌肌钙蛋白I的不同表位。
结合层2可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、玻纤硝纤混合膜的材料制成,优选由聚酯膜制成。在一个实施方式中,结合层2的材料可与接收层1相同。在另一个实施方式中,结合层2的材料可与接收层1不同。
包被层3用于布置与检测带8和质控带9。结合层3位于结合层2和吸水层4之间,且分别与结合层2和吸水层4搭接。检测带8上固定有亲和素。本实用新型的试纸条通过采用双抗体夹心法并同时引入生物素-亲和素级联放大系统,进一步提高了检测灵敏度。质控带9固定有抗鼠IgG的抗体。质控带9用于确定反应体系是否成立,并通过计算检测带8与质控带9的荧光信号值以精确进行定量。
包被层3中检测带8和质控带9的宽度在0.4mm至2.0mm之间,以确保所需检测能够完成且最大程度的节约抗体。在一个实施方式中,检测带8和质控带9的宽度在0.6mm至1.8mm之间,优选0.8mm至1.4mm之间。此外,检测带8和质控带9之间的间隔可以在0.05cm至0.8cm之间。在一个实施方式中,检测带和质控带之间的间隔在0.1cm至0.6cm之间,优选在0.3cm至0.5cm之间。
包被层3可由选自由硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜、玻纤硝纤混合膜的材料制成,优选由硝酸纤维素膜制成。
吸水层4与包被层3搭接。吸水层4可由选自由棉绒、玻纤的材料制成,优选由棉绒制成。
本实用新型的试纸条可选地包括布置有接收层1、结合层2、包被层3及吸水层4的底板5。底板5的长度和宽度可以与接收层1、结合层2、包被层3及吸水层4顺序搭接后的长度和宽度一样,或者更大。优选底板5的长度和宽度可以与接收层1、结合层2、包被层3及吸水层4顺序搭接后的长度和宽度一样。
本实用新型的试纸条的长度在5cm至15cm之间,优选8cm至10cm之间。本实用新型的试纸条的宽度在0.2cm至1cm之间,优选在0.2cm至0.8cm之间,优选在0.2cm至0.5cm之间,优选在0.2cm至0.3cm之间,最优选为0.3cm。本实用新型的试纸条在提供灵敏度和检测线性范围的同时,通过降低试纸条的长度和/或宽度可降低抗体的用量,大大节约了生产成本。
图2-4分别是显示本实用新型的试纸条的侧视图。需要说明,图2-4均是本实用新型的试纸条的示例图,均不构成对本实用新型范围的限制。对图2-4不再进行重复描述。
图5是本实用新型的试纸卡的俯视图。
如图5所述,本实用新型还提供了一种试纸卡,所述试纸卡包括前述的试纸条和包覆试纸条的外壳,其中所述试纸卡的外壳包括卡盖10和底座11,卡盖10上设置有加样孔12和检测孔13,以暴露出试纸条的局部区域。本实用新型通过将试纸条组装于彼此相互紧扣的卡盖10和底座11中可制备出试纸卡。加样孔12位于接收层1的上侧,以暴露出接收层1的部分区域。检测孔13位于包被层3的上侧,以暴露出检测带8和质控带9的全部区域。卡盖10和底座11均可由诸如塑料制成。
在一个实施方式中,加样孔12的长度在0.05cm至0.6cm之间,优选0.1cm至0.5cm之间。在一个实施方式中,加样孔12的宽度在0.15cm至0.45cm之间,优选0.2cm至0.4cm之间。在一个实施方式中,检测孔13的长度在0.8cm至2.5cm之间,优选1.0cm至2.0cm之间。在一个实施方式中,检测孔13的宽度在0.15cm至0.45cm之间,优选0.2cm至0.4cm之间。
加样孔12和检测孔13可以为长方形、正方形、圆形、椭圆形等形状。在一个实施方式中,加样孔12为圆形,检测孔13为长方形。
试纸卡易于携带和保存。更重要地是,试纸卡可实现在相应的荧光检测仪中对试纸条检测结果的分析。
图6是本实用新型另一实施方式的试纸卡的俯视图。对图6不再进行重复描述。
实施例
以下实施例用于说明本实用新型,但不应理解为限于在此阐述的实施例。
下述实施例中,所述心肌肌钙蛋白I第一抗体、心肌肌钙蛋白I第二抗体、抗鼠IgG抗体、Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球、亲和素、生物素、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N,N′-二环己基碳二亚胺
(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
所述应用两种不同粒径荧光微球检测心肌肌钙蛋白I的荧光免疫层析试纸卡的制备方法为:
1)接收层的制备
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入接收层处理液(含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
2)结合层的制备
A、结合层的预处理
将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合层处理液(含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。
B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
将心肌肌钙蛋白I第一抗体以0.1M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4℃透析过夜,调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。
使用0.05M,pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的小粒径荧光微球(选自Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种),加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol,室温反应20-30分钟,充分洗涤荧光微球,用0.05M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体,使第一抗体与荧光微球的质量比为1∶8至1∶60,室温反应2小时后,加入含有10%BSA的0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟,充分洗涤荧光微球,用含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
使用0.05M,pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的大粒径荧光微球(选自Cy3荧光素标记的荧光微球、Cy5荧光素标记的荧光微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光微球、四乙基罗丹明(TAMRA)标记的荧光微球、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的荧光微球中的任意一种),加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol,室温反应20-30分钟,充分洗涤荧光微球,用0.05M,pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体,使第一抗体与荧光微球的质量比为1∶20至1∶80,室温反应2小时后,加入含有10%BSA的0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟,充分洗涤荧光微球,用含有1%BSA和0.1%Tween-20的0.05M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
将上述标记第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1∶10到10∶1的比例进行混匀,即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
C、生物素化抗体的制备
将心肌肌钙蛋白I第二抗体以0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜,调整浓度为5mg/ml-10mg/ml。
生物素的预活化:准确称取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中,室温条件下加入183mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),304mg的N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)及0.1ml的吡啶,将反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去反应产生的尿素,滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化,在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。
用二甲基甲酰胺(DMF)溶解预活化的生物素,使其终浓度为0.05M,并加入到透析过的第二抗体中,使得第二抗体与生物素的摩尔比为1∶10-1∶25,室温反应1小时,以0.02M,pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
D、结合层的制备
将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球与步骤C制备获得的生物素化抗体充分混匀,使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时,加入干燥剂封存备用。
3)包被层的制备
A、检测带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到1mg/ml-5mg/ml的浓度,使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
B、质控带的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度,使用定量喷膜仪以0.8μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上,于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
C、包被层的制备:用封闭液(含有1-10%BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M,pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜封闭1-2小时,取出后置35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时,封袋备用。
4)试纸条的组装
在湿度小于30%,温度20-30℃条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料,在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的接收层、结合层、包被层及吸水层。在包被层粘覆底板时,检测带的位置靠近结合层,质控带的位置靠近吸水层。吸水层为高强度吸水纸。组装好后裁剪成试纸条。
5)试纸卡的组装
在湿度小于30%,温度20-30℃条件下进行试纸卡的组装。将上述试纸条置于塑料底座的中间位置,使试纸条的底板与塑料底座相连,并扣合塑料卡盖。卡盖上设置有加样孔和检测孔,加样孔开口于接收层的上侧,暴露出接收层的部分区域,检测孔开口于所述包被层的上侧,暴露出检测带和质控带的全部区域。
6)校准品及待检样品的测定
将100μl的标准品或者待检样品加入到试纸卡的加样孔,进行免疫层析反应,10-15分钟后将试纸卡置于专门的荧光检测仪中,通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
以上实施例仅是为了清楚地说明所做的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上可以做出其他的改进和润饰,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的改进和润饰仍处在本实用新型的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于双粒径荧光微球的试纸条,其特征在于,所述试纸条包括顺序排列并依次搭接的以下部件:
i)用于接收待测样品的接收层,
ii)包被有由两种不同粒径大小的荧光微球分别标记的第一抗体和由生物素标记的第二抗体的结合层,
iii)具有相间隔的检测带和质控带的包被层,其中所述检测带固定有亲和素,所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体,和
iv)吸水层。
2.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在30nm-600nm之间。
3.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小范围在100nm-400nm之间。
4.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小为100nm和300nm。
5.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述检测带和所述质控带之间的间隔在0.1-0.6cm之间。
6.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述试纸条包括布置有接收层、结合层、包被层及吸水层的底板。
7.如权利要求1的试纸条,其特征在于,所述试纸条的宽度在0.2cm-1cm之间。
8.如权利要求1-7中任一项的试纸条,其特征在于,所述第一抗体和第二抗体识别同种蛋白的不同表位,所述蛋白选自以下组中:心肌肌钙蛋白I、N末端脑钠肽前体、D-二聚体、心型脂肪酸结合蛋白、降钙素原和C反应蛋白。
9.一种基于双粒径荧光微球的试纸卡,其特征在于,所述试纸卡包括:
i)权利要求1-8中任一项所述的试纸条,和
ii)包覆权利要求1-8中任一项所述的试纸条的外壳,其中所述外壳包括:
ii-1)设置有加样孔和检测孔的卡盖,其中所述加样孔开口于所述接收层的上侧,以暴露出所述接收层的部分区域,所述检测孔开口于所述包被层的上侧,以暴露出所述检测带和所述质控带的全部区域,和
ii-2)与所述卡盖彼此连接的底座。
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