CN204228720U - 用于c反应蛋白检测的双粒径荧光微球试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了一种检测C反应蛋白的试纸条，所述试纸条包括加样层、第一抗体包被层、第二抗体包被层、检测层和吸水层，所述第一抗体包被层上包被由有一种粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体，所述第二抗体包被层上包被有由另外一种不同粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体，所述检测层具有相互间隔的检测带和质控带，所述检测带上固定有抗C反应蛋白第二抗体，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体。本实用新型的试纸条能够实现高灵敏度和宽线性范围的C反应蛋白检测效果。

Description

用于C反应蛋白检测的双粒径荧光微球试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种用于C反应蛋白检测的双粒径荧光微球试纸条。

背景技术

近年来，人们逐渐认识到原来传统意义中正常水平的C反应蛋白(CRP)的轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素。通过提高检测灵敏度，能够实现对超敏CRP的定量测定。超敏CRP检测即是针对正常范围0-10.0mg/L的CRP浓度水平设计的，对低浓度的准确性要求更高，检测极限可达0.005-0.20mg/L。

临床上超敏CRP的检测主要应用在如下方面：1)首次发生心肌梗塞和中风的预测及随访预后；2)动脉粥样硬化危险性的评价及预后；3)其他心血管疾病危险性的评价及预后；4)新生儿感染的诊断及监测。

实用新型内容

技术问题

目前，对于CRP，特别是超敏CRP的检测缺乏一种能够快速且精确的方法。因此，本实用新型提供了一种用于检测C反应蛋白的试纸条。

技术方案

一方面，本实用新型提供了一种用于C反应蛋白检测的双粒径荧光微球试纸条，其特征在于，所述试纸条包括彼此依次顺序搭接的以下组件：

-加样层，

-包被有由一种粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体的第一抗体包被层，

-包被有由另外一种不同粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体的第二抗体包被层，

-具有相互间隔的检测带和质控带的检测层，其中所述检测带上固定有抗C反应蛋白第二抗体，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和

-吸水层。

在一个实施方式中，所述试纸条进一步包括布置有加样层、第一抗体包被层、第二抗体包被层、检测层和吸水层的底板。

在一个实施方式中，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为100nm和300nm。

在一个实施方式中，所述抗C反应蛋白第一抗体和抗C反应蛋白第二抗体分别特异性识别不同的C反应蛋白免疫学表位。

在一个实施方式中，所述第一抗体包被层和所述第二抗体包被层由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制成。

在一个实施方式中，所述检测层由硝酸纤维素膜制成。

在一个实施方式中，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。

有益效果

本实用新型的C反应蛋白检测试纸条能够实现C反应蛋白的精确检测。此外，本实用新型的C反应蛋白检测试纸条结构简单、材料易得，有利于工业化生产和大规模临床应用。

附图说明

图1本实用新型的C反应蛋白检测试纸条的侧视结构示意图。

图2本实用新型的C反应蛋白检测试纸条的俯视结构示意图。

附图标记表示为：

1-加样层、2-第一抗体包被层、3-第二抗体包被层、4-检测层、5-吸水层、6-底板、7-大粒径荧光微球、8-小粒径荧光微球、9-检测带和10-质控带。

具体实施方式

为了促进对于本实用新型的C反应蛋白检测试纸条的原理理解，以下将参照在附图中说明并描述于以下的说明书中的实施方案。应理解由此不意图限制本实用新型的范围。

图1为本实用新型的C反应蛋白检测试纸条的侧视结构示意图。

如图1所示，本实用新型的C反应蛋白检测试纸条包括底板6和在底板6上顺序搭接粘结的加样层1、第一抗体包被层2、第二抗体包被层3、检测层4和吸水层5。

加样层1可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成。加样层1可以起到过滤样品中的颗粒性不溶物。因此，与市售的部分试纸条相比，采用单独加样层的设计有助于提高检测灵敏度。

第一抗体包被层2和第二抗体包被层3相连，且分别搭接加样层1和检测层4。第一抗体包被层2和第二抗体包被层3由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制成。第一抗体包被层2上包被有由一种粒径荧光微球标记的抗CRP抗体，第二抗体包被层3上包被有由另外一种不同粒径荧光微球标记的抗CRP抗体。第一抗体包被层2和第二抗体包被层3的顺序可以互换。在一个实施方式中，第一抗体包被层2上包被有由大粒径荧光微球7标记的抗CRP抗体，同时第二抗体包被层3上包被有由小粒径荧光微球8标记的抗CRP抗体。在另一个实施方式中，第一抗体包被层2上包被有由小粒径荧光微球8标记的抗CRP抗体，同时第二抗体包被层3上包被有由大粒径荧光微球7标记的抗CRP抗体。大粒径荧光微球7的粒径大小范围在300nm至600nm之间，优选300nm至500nm之间，优选300nm。小粒径荧光微球8的粒径大小范围在50nm至250nm之间，优选50nm至200nm之间，优选100nm。

在超敏C反应蛋白定量测定时，对低浓度的准确性要求更高，检测极限有时需要达到0.005-0.20mg/L。大粒径荧光微球标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求，而小粒径荧光微球标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域。因此，本实用新型的试剂条可同时满足C反应蛋白测定对高灵敏度和宽检测线性范围的要求。此外，将大小不同粒径的抗CRP抗体分别包被于不同的包被层上，最大程度降低了抗体之间的相互影响，提高了检测的灵敏度。

检测层4上包被有检测带9和质控带10。检测层4可由诸如硝酸纤维素膜制成。检测带9上固定有另一种抗CRP抗体。检测带9上固定的抗CRP抗体与第一抗体包被层2和第二抗体包被层3上包被的抗CRP抗体分别识别CRP的不同免疫学表位。质控带10上固定有抗鼠IgG的抗体。检测带9和质控带10彼此的间隔距离可以在0.05cm至0.8cm之间，优选0.1cm至0.6cm之间，优选0.3cm至0.5cm之间。通过采用双抗体夹心法检测CRP，进一步提高了检测灵敏度。

吸水层5可由选自由棉绒、玻纤的材料制成，优选由棉绒制成。

加样层1、第一抗体包被层2、第二抗体包被层3、检测层4和吸水层5可以依次搭接粘结在底板6上。需要说明，图1的各个层之间的搭接方式，例如一层逐渐高于一层的搭接方式仅是示例性说明，诸如采用高低变化等搭接方式同样在本实用新型要求保护的试纸条的范围内。

试纸条的整体长度在8cm至10cm之间，整体宽度在0.2cm至0.5cm之间，优选在0.2cm至0.3cm之间，最优选为0.3cm。本实用新型的试纸条在提供灵敏度和检测线性范围的同时，通过降低试纸条的长度和/或宽度可降低抗体的用量，大大节约了生产成本。

图2是本实用新型的C反应蛋白检测试纸条的俯视结构示意图。对图2中与图1相同的内容不再赘述。

实施例

下述实施例中，所述抗CRP第一抗体、抗CRP第二抗体、抗鼠IgG抗体、荧光微球、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。

所述应用两种不同粒径荧光微球检测CRP的荧光免疫层析试纸条的制备方法为：

1)加样层的制备

将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入加样层处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。

2)第一抗体包被层的制备

A、第一抗体包被层的预处理

将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入抗体包被层处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。

B、标记抗体的大粒径荧光微球的制备

将CRP第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4℃透析过夜，调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。

使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤大粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为1∶20至1∶80，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。

C、第一抗体包被层的制备

将步骤B制备获得的大粒径荧光微球使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。

3)第二抗体包被层的制备

A、第二抗体包被层的预处理

将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入抗体包被层处理液(含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3-5小时后，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干3-5小时。

B、标记抗体的小粒径荧光微球的制备

将CRP第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4℃透析过夜，调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。

使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤小粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使第一抗体与荧光微球的质量比为1∶8至1∶60，室温反应2小时后，加入含有10％BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1％BSA和0.1％Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。

C、第二抗体包被层的制备

将步骤B制备获得的小粒径荧光微球使用定量喷膜仪以2μl/cm-8μl/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。

4)检测层的制备

A、检测带的制备：将CRP第二抗体以0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液4℃透析过夜，使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将透析后的CRP第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。

B、质控带的制备：使用包被液(含有0.1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以0.8μl/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时。

C、检测层的制备：用封闭液(含有1-10％BSA和1-10％海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜封闭1-2小时，取出后置35-39℃鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。

5)试纸条及试剂卡的组装

在湿度小于30％，温度20-30℃条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的加样层、第一抗体包被层、第二抗体包被层、检测层及吸水层。在检测层粘覆底板时，检测带的位置靠近抗体包被层，质控带的位置靠近吸水层。吸水层为高强度吸水纸。组装好后裁剪成试纸条，并组装入试剂卡中。

6)校准品及待检样品的测定

将100μl的标准品或者待检样品加入到试剂卡的加样孔，进行免疫层析反应，3-10分钟后将试剂卡置于专门的荧光检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量测定。

虽然已说明C反应蛋白检测试纸条，并在附图和以上说明书中详细描述，但是同样应理解其特征是说明性的，并非是限制性的。应理解仅提供优选的实施方案；并且希望保护在本实用新型精神内的所有变化，修改和其他应用。

Claims (7)

1.一种用于C反应蛋白检测的双粒径荧光微球试纸条，其特征在于，所述试纸条包括彼此依次顺序搭接的以下组件：

-加样层，

-包被有由一种粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体的第一抗体包被层，

-包被有由另外一种不同粒径荧光微球标记的抗C反应蛋白第一抗体的第二抗体包被层，

-具有相互间隔的检测带和质控带的检测层，其中所述检测带上固定有抗C反应蛋白第二抗体，所述质控带固定有抗鼠IgG的抗体，和

-吸水层。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条进一步包括布置有加样层、第一抗体包被层、第二抗体包被层、检测层和吸水层的底板。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述两种不同粒径大小的荧光微球的粒径大小分别为100nm和300nm。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述抗C反应蛋白第一抗体和抗C反应蛋白第二抗体分别特异性识别不同的C反应蛋白免疫学表位。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述第一抗体包被层和所述第二抗体包被层由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制成。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述检测层由硝酸纤维素膜制成。

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。