CN107022527B

CN107022527B - 可分泌抗c反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、c反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107022527B
Application number: CN201710184068.3A
Authority: CN
Inventors: 陈洁; 韩日才; 覃素妮; 宗雪; 龚春喜; 林泽萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2037-03-24
Also published as: CN107022527A

Abstract

本发明涉及一种可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、C反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用。上述C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，分泌第二抗体的杂交瘤细胞保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC No：C2016218。本检测试剂的使用兔多克隆抗体与鼠单克隆抗体进行配对，抗体制备方法简单，实验结果表明该检测试剂的特异性好、线性范围宽。

Description

可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、C反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、C反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用。

背景技术

C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)最早在1930年由Tillet和Francis发现。最初他们观察到一些急性病人的血清可与肺炎链球菌的荚膜C-多糖发生反应，随后证实能与C-多糖反应的物质是一种蛋白质，因而将这种蛋白质命名为C反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)。CRP主要是在白细胞介素(IL-6)等细胞因子调节下，由肝脏合成分泌的一种蛋白质，外周血淋巴细胞亦能合成少量的CRP。CRP以5个相同亚单位形成环状的五聚体，相对分子量为115KD～140KD。电泳分布在慢γ区带，有时可以延伸到β区带，其电泳迁移率易受一些因素影响，如钙离子及缓冲液成分等。

C-反应蛋白(CRP)是急性时相蛋白中变化最显著的一种，也是人体感染的一个重要敏感标志物之一。CRP具有激活补体、增强淋巴细胞活性、促进吞噬细胞功能、清除病理性产物、抑制血小板凝集等作用。近年来，大量研究资料表明，CRP作为炎症因子，虽为非特异性的标志物，但它与某些疾病如感染性疾病、心血管疾病、恶性肿瘤、自身免疫病、抑郁症等疾病的发生发展存在很大的相关性，具体如下：

1、CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高并有成倍增长之势。病变好转时又迅速降至正常，其升高幅度与感染的程度呈正相关。

2、CRP与其它炎症因子的相关性，CRP与其它炎症因子如白细胞总数、红细胞沉降率和多形核白细胞等具有密切相关性。CRP与WBC(白细胞)存在正相关。在炎症反应中起着积极作用使人体具有非特异性抵抗力。在患者疾病发作时CRP可早于WBC而上升，恢复正常也很快，故具有极高的敏感性。

3、CRP可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断，一旦发生炎症CRP水平即升高而病毒性感染CRP大都正常。脓毒血症CRP迅速升高，而依赖血培养则至少需要48小时，且其阳性率不高。又如CRP能快速有效地检测细菌性脑膜炎其阳性率达99％。

4、恶性肿瘤患CRP大都升高，如CRP与AFP的联合检测可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。CRP测定用于肿瘤的治疗和预后有积极意义。手术前CRP上升，手术后则下降，且其反应不受放疗、化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床评估肿瘤的进程。

目前，临床实验室测定CRP的常规方法主要有胶乳凝集试验和免疫浊度法(如散射、透射比浊法,并且已实现了自动化)以及灵敏度和精确度较高的放射免疫测定方法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和超灵敏的发光法，临床检测主要是免疫比浊法。具体如下：

1、免疫浊度法：当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。国内CRP试剂盒一般采用免疫比浊法，其优点是操作简单，特异性强，重复性好，但是免疫学中常因抗原过剩而引起的勾状效应，导致假阳产生。

2、乳胶凝集法：以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附可溶性抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，可产生凝集反应。现国内市场上相关CRP乳胶凝集法试剂盒较少，乳胶凝集法检测CRP缺乏精密度，样品的滴度是靠稀释血清的阳性结果来确定的，不能定量的表示检测结果，而且对于小量浓度的CRP不够敏感，而不能满足现代临床对医学检验的要求。

3、放射免疫测定方法：将高灵敏度的同位素示踪法和高特异性的抗原抗体免疫化学反应结合使用的技术。选用适当的放射性同位素标记抗原，并与限量的抗体结合，形成可逆性的标记抗原-抗体复合物。如果加入待测的非标记抗原，则标记抗原与非标记抗原共同争夺限量抗体，最后达到平衡状态。加入的非标记抗原越多，标记抗原与抗体的结合就越少。放射免疫技术已广泛应用于测定各种激素、肿瘤相关抗原(甲胎蛋白、癌胚抗原)、药物(地高辛、吗啡等)、病毒抗原(乙型肝炎表面抗原)以及Ig等，其灵敏度可达Pg/毫升，为目前最灵敏的分析方法，并有自动化设备。然而，检测放射性同位素需要昂贵的仪器和辐射防护设备，并需要专门从事放射性同位素工作的实验室和放射性废物处理装置，操作人员常常受到放射线照射的威胁，而且，作为放免指示剂的某些放射性同位素，由于半衰期短，限制了其一些试剂的保存时间，其检测所需成本较高时间亦较长。

4、酶联免疫吸附试验：酶联免疫吸附试验，是利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酶结合物示踪，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用OD值进行定量/半定量分析。目前已用酶标法测定血清蛋白质、肿瘤抗原、激素、药物、各种微生物和寄生虫的抗原，以及上述各种抗原所产生的相应抗体。在临床诊断、疾病普查、法医鉴定、兽医检查、植物病害检验等方面应用广泛。国内外很多厂家都有CRP相关试剂盒，在市场最为普遍，但是一般作为初筛，现阶段还不能作为定性、定量、定位手段，特异性较差。且酶联免疫吸附试验(ELISA法)操作较为复杂，人工误差比较大，其检测浓度的线性范围较窄，对于高浓度样本的测定结果误差较大往往低于实际浓度，特异性和重复性较差。

新发展的免疫荧光技术是一种荧光微球免疫层析定量检测方法，该方法充分利用粒子的优良特性，并结合免疫层析技术，在优化试纸条结构和组成材料的基础上，进而实现的荧光定量检测。然而由于荧光标记平台工艺并不成熟，所使用的抗体原料性能善较差，抗体特异性、亲和力上的不足。

综上，传统的C反应蛋白检测试剂特异性不高、线性范围较窄。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性较高、线性范围较宽的C反应蛋白检测试剂及其制备方法，以及可应用在该C反应蛋白检测试剂的可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。

一种可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2016218。

上述的杂交瘤细胞分泌的抗C反应蛋白单克隆抗体，所述抗C反应蛋白单克隆抗体标记为CRP-2。

上述的杂交瘤细胞或上述的抗C反应蛋白单克隆抗体在制备C反应蛋白的检测试剂或C反应蛋白的检测试剂盒中的应用。

一种C反应蛋白检测试剂，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，所述第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，所述第二抗体为所述第一抗体的配对抗体，所述第二抗体通过杂交瘤细胞株CRP2分泌得到，所述杂交瘤细胞株CRP2的保藏号为CCTCC NO：C2016218。

在一个实施方式中，所述第一抗体通过C反应蛋白抗原免疫兔子后提取兔子血清中的抗体得到，所述第一抗体标记为CRP-8。

在一个实施方式中，所述C反应蛋白抗原为重组人C反应蛋白抗原。

在一个实施方式中，所述第一抗体上标记有荧光微球，所述第一抗体与所述荧光微球的质量比为30～50:100。

一种C反应蛋白检测试剂盒，包括上述的C反应蛋白检测试剂。

一种C反应蛋白检测试剂的制备方法，所述C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，所述方法包括如下步骤：

用C反应蛋白抗原分别免疫兔子和小鼠；

提取免疫后兔子血清中的抗体，纯化后获得第一抗体，所述第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体；

收集免疫后小鼠的脾细胞，并将所述脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合，筛选获得能够分泌抗C反应蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞；以及

将多株所述杂交瘤细胞分泌得到的抗C反应蛋白的单克隆抗体分别与所述第一抗体进行抗体配对，并采用双抗体夹心筛选获得与所述第一抗体配对的抗体，得到所述第二抗体。

在一个实施方式中，所述第二抗体通过杂交瘤细胞株CRP2分泌得到，所述杂交瘤细胞株CRP2的保藏号为CCTCC NO：C2016218。

上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗C反应蛋白的单克隆抗体具有高特异性且性能稳定等优点，可广泛应用在制备C反应蛋白检测试剂或C反应蛋白检测试剂盒中。

上述C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，第二抗体为第一抗体的配对抗体。不同于传统使用两个单克隆抗体配对的方法，本检测试剂的使用兔多克隆抗体与鼠单克隆抗体进行配对，并筛选出与相应的兔多克隆抗体配对活性好的鼠单克隆抗体。抗体制备方法简单，实验结果表明该配对信号更优，检测试剂的特异性好、线性范围宽。

附图说明

图1为一实施方式的C反应蛋白检测试剂的制备方法流程图；

图2为施例4中采用C反应蛋白检测试剂测试获得不同浓度C反应蛋白标准品与强度值的线性关系图的。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的可分泌抗C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，于2016年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016218。分类命名：杂交瘤细胞株CRP2。该杂交瘤细胞可分泌出抗C反应蛋白的单克隆抗体，记为CRP-2，CRP-2可以作为检测抗体。CRP-2可以应用于C反应蛋白检测试剂或C反应蛋白检测试剂盒的制备领域中。

一种C反应蛋白检测试剂，包括第一抗体和第二抗体，第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，第二抗体为第一抗体的配对抗体，第二抗体通过杂交瘤细胞株CRP2分泌得到，该杂交瘤细胞株CRP2于2016年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016218。

在一个实施方式中，第一抗体通过C反应蛋白抗原免疫兔子后提取兔子血清中的抗体得到，第一抗体标记为CRP-8。试验结果，由杂交瘤细胞分泌的抗C反应蛋白的单克隆抗体CRP-2与该兔多克隆抗体CRP-8配对活性较强，在金标等定性平台上使用时特异性好、线性范围宽。

具体地，免疫兔子用的C反应蛋白抗原为重组人C反应蛋白抗原，具体到本实施方式中，重组人C反应蛋白抗原为菲鹏生物股份有限公司生产，Lot：FP20160301。经人的C反应蛋白抗原免疫后，兔子血清中能够相应的分泌出抗人的C反应蛋白的抗体，检测特异性好。针对性开发的重组人C反应蛋白抗原作为多抗血清的免疫原，避免了天然抗原成分复杂，抗血清抗体成分太杂的情况，能更容易获得特异性好，专一性佳的多抗血清。之后与单克隆抗体进行夹心检测，保证了产品的特异性优势。

在一个实施方式中，第一抗体上标记有荧光微球，第一抗体与荧光微球的质量比为30～50:100，例如35:100、40:100、45:100等等。实验结果表明，在免疫活化时，抗C反应蛋白的兔多克隆抗体(第一抗体)能够比传统的单克隆抗体标记更大剂量的荧光微球，可以达到更宽的线性范围，从而适用不同浓度的C反应蛋白检测。而传统的单克隆抗体标记的荧光微球一般在质量比为20:100时活性趋势下降，可以达到线性范围较窄。

在一个实施方式中，荧光微球先采用pH值为4.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液进行清洗。实验结果表明，采用pH值为4.7的MES缓冲液进行清洗后可以降低抗体与微球的聚集问题。

在一个实施方式中，荧光微球标记好的抗体可以冻干于试纸条上，利于长期保存。

上述C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，第二抗体为第一抗体的配对抗体。不同于传统使用两个单克隆抗体配对的方法，本检测试剂的使用兔多克隆抗体与鼠单克隆抗体进行配对，并筛选出与相应的兔多克隆抗体配对活性好的鼠单克隆抗体。抗体制备方法简单，实验结果表明该配对信号更优于传统模式，检测试剂的特异性好、线性范围也明显优于同类产品。

该C反应蛋白检测可用末梢血检测。病人易接受、可随身携带、操作简单、方便、3min～5min即可得结果。

此外，本申请还提供一实施方式的C反应蛋白检测试剂盒，该试剂盒中包括了上述C反应蛋白检测试剂。当然，C反应蛋白检测试剂盒还可以包括包装盒、标准品、对照品等。该检测试剂盒可应用于C反应蛋白的免疫荧光检测等等。

此外，请参阅图1，一实施方式的C反应蛋白检测试剂的制备方法，该C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，制备方法包括如下步骤S110～S140。

S110、用C反应蛋白抗原分别免疫兔子和小鼠。

本实施方式中，C反应蛋白抗原为重组人C反应蛋白抗原。

兔子可以选用新西兰兔，具体可采用C反应蛋白抗原与弗氏完全佐剂混合后在兔子的皮下和淋巴结多点免疫，并采血进行效价检测，追加免疫至效价稳定后采集分离血清。

对小鼠免疫时，可采用C反应蛋白抗原与弗氏完全佐剂混合后皮下注射至小鼠腹腔内，并采尾血进行效价检测，追加免疫至效价达到融合要求。

S120、提取免疫后兔子血清中的抗体，纯化后获得第一抗体，第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体。

具体地，可以在对兔子免疫后，当抗体效价稳定后采集分离血清，并用50％的硫酸铵沉淀，缓冲液A复溶后用G25脱盐后再过cTnI抗原亲和柱纯化。缓冲液A中含有20mmol/L的PB(磷酸盐缓冲液)，150mmol/L的NaCl，pH为7.4。

过柱分离时先用缓冲液A平衡亲和柱，上完样后继续用缓冲液A淋洗直到A280降至0.01以下并保持平衡。之后用缓冲液B(0.2mol/L甘氨酸，pH2.7)洗脱，收集蛋白，即获得第一抗体。

在一个实施方式中，洗脱完成获得第一抗体后，在第一抗体中加入为pH9.0的Tris-HCl调节pH到中性，避免抗体变性。收集到的第一抗体可以在4℃用缓冲液A透析过夜，4度保存。

S130、收集免疫后小鼠的脾细胞，并将脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合，筛选获得能够分泌抗C反应蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

具体地，可以在小鼠免疫至效价达到融合要求后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，制成细胞悬液。收集免疫后的小鼠的脾细胞，并将脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合得到融合细胞。细胞融合后，培养至适宜的浓度，通过HAT培养基加入C反应蛋白抗原，筛选出能够分泌抗C反应蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

S140、将多株S130中获得的杂交瘤细胞分泌得到的抗C反应蛋白的单克隆抗体分别与S120中得到的第一抗体进行抗体配对，并采用双抗体夹心筛选获得与第一抗体配对的抗体，得到所述第二抗体。

具体地，可以将第一抗体用胶体金的标记，每株杂交瘤细胞分泌的抗C反应蛋白的单克隆抗体分别用NC膜包被，分别采用双抗体夹心筛选进行配对活性检测，获得配对活性较强的抗体。

本实施方式中，由杂交瘤细胞分泌的抗C反应蛋白的单克隆抗体CRP-2与该兔多克隆抗体CRP-8配对活性较强，在金标等定性平台上使用时特异性好、线性范围宽。相对应筛选获得分泌CRP-2的杂交瘤细胞株CRP2。该杂交瘤细胞株CRP2的保藏号为CCTCC NO：C2016218。

需要说明的是，C反应蛋白检测试剂的制备方法也可以不完全按上述步骤S110～S140的顺序进行，本领域技术人员可以根据需要作出调整，例如S130可以在S120之前进行。再例如，也可以是先对兔子免疫后获得第一抗体后，再进行对小鼠的免疫的操作。

上述C反应蛋白检测试剂的制备方法，不同于传统使用两个单克隆抗体配对的方法，本检测试剂的使用兔多克隆抗体与鼠单克隆抗体进行配对，并筛选出与相应的兔多克隆抗体配对活性好的鼠单克隆抗体。抗体制备方法简单，实验结果表明该配对信号更优于传统模式，获得的检测试剂的特异性好、线性范围宽。

以下为具体实施例。

实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

未特别说明，重组人CRP抗原

实施例1

抗C反应蛋白的兔多克隆抗体的制备

1、动物免疫

挑选健壮新西兰兔(广东省医学实验动物中心：广东省佛山市南海黄岐鄱阳路119号)3只，将重组人CRP抗原(菲鹏生物股份有限公司生产，Lot：FP20160301)稀释成1mg/ml，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，按每只兔1mg免疫原的剂量在皮下和淋巴结多点免疫。以后每隔2周加强免疫一次，抗原改用弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量同前，每次加强免疫后第10天采血检测血清效价，效价稳定后采集分离大样血清。

2、抗体纯化

取以上分离获得的血清，用50％硫酸铵沉淀，12000rpm离心30min，沉淀用缓冲液A(20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，pH7.4)复溶，用G25脱盐后再过cTnI抗原亲和柱，上样缓冲液为A(20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，pH7.4)，上样前先用缓冲液A平衡亲和柱。上完样后继续用缓冲液A淋洗直到A280降至0.01以下并保持平衡。用缓冲液B(0.2M甘氨酸，pH2.7)洗脱，收集蛋白峰，洗脱完成后加入Tris-HCl(1mol/L，pH9.0)调节pH到中性，避免抗体变性，洗收集到的目的抗体在4度用缓冲液A透析过夜，4度保存。

实施例2

抗C反应蛋白的单克隆抗体的制备

1、动物免疫

将重组人CRP抗原(菲鹏生物股份有限公司生产，Lot：FP20160301)稀释成1mg/ml，与弗氏完全佐剂(SIGMA，F5881)等体积混合，得到油状乳液。将该乳液以每只0.2毫升的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心：广东省佛山市南海黄岐鄱阳路119号，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(抗原与弗氏不完全佐剂(SIGMA，F5506)等体积混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。

融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9％氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫。

2、杂交瘤细胞系的制备。

(1)饲养细胞的制备。

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡5分钟，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，180μL/孔，37℃，5％CO₂培养过夜。

(2)免疫脾细胞的制备。

小鼠末次免疫后第三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。

(3)小鼠瘤细胞的制备。

小鼠瘤细胞经筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。

(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤。

将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按1:10细胞数量比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1,200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1,000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。

(5)抗体的检测。

用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释重组人CRP抗原，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜，接着用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。

分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，扩大培养后，用含10％DMSO的完全培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得多株能够稳定分泌抗C反应蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实施例3

抗C反应蛋白的单克隆抗体与抗C反应蛋白的兔多克隆抗体进行抗体配对

将实施例1中纯化所得的抗C反应蛋白的兔多克隆抗体进行胶体金的标记，4/万胶体金标记兔多抗2mg/ml。并NC膜将实施例2中的获得的多株杂交瘤细胞株分泌的抗C反应蛋白的单克隆抗体分别包被，NC膜包被鼠单抗的浓度为2mg/ml。加入CRP参考血清，采用双抗体夹心筛选检测得出一对配对活性较强的抗体。分别为标记为兔多抗CRP-8和鼠单抗CRP-2。筛选所得抗体CRP-8标记配对CRP-2可以实用在金标定性平台，也可用于荧光定量平台模式调试。其中，分泌鼠单抗CRP-2的杂交瘤细胞株于2016年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016218。

实施例4

C反应蛋白检测试剂的应用

清洗：按1mg(100μL)微球+1mL 0.1M的MES缓冲液的比例进行清洗，MES缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液，pH＝6.0。混匀后20000rpm离心20min左右。

活化：加入一定体积的MES缓冲液4.7，超声混匀，加入现配的12μg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与72μg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)至终体积1mL，37℃静置反应18min，每5min混匀一次，离心20000rpm，20min弃上清。

偶联：加入一定体积的浓度为50mmol/L，pH＝7.4的硼酸-硼砂缓冲液(内含0.01％SDS)，超声混匀，同时将0.4mg抗体/mg微球的实施例3筛选获得的抗体CRP-8稀释在浓度为50mmol/L，pH＝7.4的硼酸-硼砂缓冲液中(内含0.01％SDS)，加入CRP-8使反应体系终体积为1mL，37℃静置反应4h左右，每1个小时混匀一次。

封闭：用1mL BSA(5％)封闭1h，20000rpm离心20min，弃上清。

清洗：用Tris-HCl清洗1次，20000rpm离心20min，弃上清。

保存：保存于400μL浓度为25mmol/L的MES(pH＝7.4)的缓冲液中。用的时候再用金标恢复液DB215(菲鹏生物股份有限公司Lot：FP20160226)稀释50倍左右，冻干。

包被：采用实施例3中筛选获得的抗体CRP-2进行包被，终浓度约为1.0mg/mL，包被液为菲鹏荧光平台包被液。

检测：将标本稀释100倍，混匀30s左右，加样60μL～75μL，反应3min～3.5min，检测荧光值。分别检测了两种质控为阳性的C反应蛋白(抗原)，不同浓度C反应蛋白标准品对应的强度值结果如下表1所示。

表1：应用C反应蛋白检测试剂的测试结果

将表1的抗原1的数据作图后得到图2。从图2中看出该C反应蛋白检测试剂测试不同浓度的C反应蛋白时，配对信号的线性范围宽，浓度在300μg/mL以上的C反应蛋白浓度依然能够测试。

进一步采用该C反应蛋白检测试剂检测医院阳性定值血清检测30份，具体数据如下表2所示。

表2：应用C反应蛋白检测试剂的测试结果

由于人工或仪器及其他因素影响，约可以接受±10％左右偏差，符合率达99.4％，其在诊断中可有效判断病情。

由以上结果可得出本实施例的C反应蛋白检测试剂采用兔多抗与鼠单抗进行配对，线性可以0.1μg/mL～300μg/mL，线性较宽，测定医院定值血符合率高达99％以上，此C反应蛋白检测试剂具有诊断上的实用性。

对比例1

测试方法与实施例4相同，C反应蛋白检测试剂采用未经筛选的C反应蛋白的单克隆抗体与兔多抗进行配对，发现标记使用量仅达0.2mg抗体每mg微球。活化试剂使用10mMMESPH6.0，有少量聚集，聚集峰面积30000左右。将同样的标本稀释100倍，混匀30s左右，加样60μL～75μL，反应3min～3.5min，检测强度值。不同浓度样C反应蛋白标准品对应的荧光值结果如下表3所示。

表3：应用对比例1的C反应蛋白检测试剂的测试结果

从表3中可以看出，对比例1的C反应蛋白检测试剂可以看出，C反应蛋白检测试剂的线性过窄，在50μg/mL后活性趋势无明显上升，到100μg/mL有下降趋势。

以上结果表明，实施例3筛选获得的兔多抗CRP-8和鼠单抗CRP-2组成的C反应蛋白检测试剂。荧光微球的标记量可以大幅度提升，检测的线性范围宽，特异性好，达到市场要求。调节相应试剂及pH后使得标记单抗在荧光微球表面均匀分散，与微球的结合能力大大增强，提高了检测的分析灵敏度。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种C反应蛋白检测试剂，其特征在于，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为抗C反应蛋白的兔多克隆抗体，所述第二抗体为抗C反应蛋白的单克隆抗体，所述第二抗体为所述第一抗体的配对抗体，所述第二抗体通过杂交瘤细胞株CRP2分泌得到，所述杂交瘤细胞株CRP2的保藏号为CCTCC NO：C2016218。

2.根据权利要求1所述的C反应蛋白检测试剂，其特征在于，所述第一抗体通过C反应蛋白抗原免疫兔子后提取兔子血清中的抗体得到，所述第一抗体标记为CRP-8。

3.根据权利要求2所述的C反应蛋白检测试剂，其特征在于，所述C反应蛋白抗原为重组人C反应蛋白抗原。

4.根据权利要求1所述的C反应蛋白检测试剂，其特征在于，所述第一抗体上标记有荧光微球，所述第一抗体与所述荧光微球的质量比为30～50:100。

5.一种C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4任一项所述的C反应蛋白检测试剂。

6.一种C反应蛋白检测试剂的制备方法，所述C反应蛋白检测试剂包括第一抗体和第二抗体，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

用C反应蛋白抗原分别免疫兔子和小鼠；

将多株所述杂交瘤细胞分泌得到的抗C反应蛋白的单克隆抗体分别与所述第一抗体进行抗体配对，并采用双抗体夹心筛选获得与所述第一抗体配对的抗体，得到所述第二抗体；所述第二抗体通过杂交瘤细胞株CRP2分泌得到，所述杂交瘤细胞株CRP2的保藏号为CCTCCNO：C2016218。