CN104122401A - 降钙素原和c反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

降钙素原和C反应蛋白的检测试纸，为一种量子点标记免疫定量检测试纸，包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构，各层膜结构之间部分重叠；所述结合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I、以及量子点标记的兔IgG；所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线、一条包被C反应蛋白特异性抗体II的检测线，以及一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线。该试纸可方便快捷、准确定量地同时检测降钙素原和C反应蛋白。

Description

降钙素原和C反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及医药检测领域，尤其涉及降钙素原和C反应蛋白的检测试纸及其制备方法和检测方法。

背景技术

降钙素原（PCT）是存在于人体的一种特定标记物。PCT的检查在对诊断发热性疾病有着重要的作用，它是区别细菌和非细菌性感染的重要标志物。普通检测方法检测PCT浓度下线为0.5ng/ml可用于判断全身性细菌感染，更高浓度的2-10ng/ml可能为严重细菌感染，>10ng/ml可能为感染性休克。如果能够更精确检测PCT浓度，则能够判断局部细菌感染和胞内病原微生物感染（如立克次体、布鲁菌、军团菌、支原体、衣原体等）等。

PCT适应症：1、细菌感染与病毒感染的鉴别诊断；2、帮助SIRS/脓毒症的早期诊断,评估疾病的严重程度及预后；3、抗生素治疗效果的评估,指导临床抗生素使用；4、手术和严重创伤患者细菌感染并发症监测；5、胰腺炎鉴别诊断。

目前检测PCT的试纸检测精度不高，不能定量检测。

CRP是一种急性反应蛋白，多种因素均可引起其升高，其检测在临床应用相当广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断，手术后感染的监测；抗生素疗效的观察；病程检测及预后判断等。

CRP适应症：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术后感染及并发症的指标：手术后病人CRP升高，术后7—10天CRP水平应下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清CRP升高，而病毒性感染则多数不升高。

现有技术中不能同时检测PCT和CRP，给临床带及诊断来不便，也不利于准确诊断病因和病情。另外，检测结果受温度干扰大。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供降钙素原和C反应蛋白的检测试纸，从而可方便快捷、准确定量地同时检测降钙原PCT和C反应蛋白CRP。

本发明解决的又一技术问题在于，提供降钙素原和C反应蛋白的检测试纸制备方法，从而获得可方便快捷、准确定量地检测降钙素原PCT和C反应蛋白CRP的检测试纸。

本发明解决的再一技术问题在于，提供同时检测降钙素原PCT和C反应蛋白CRP的检测方法，从而可方便快捷、准确定量地检测降钙素原PCT和C反应蛋白CRP。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：降钙素原和C反应蛋白的检测试纸，其为一种量子点标记免疫定量检测试纸，包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构，各层膜结构之间部分重叠；所述结合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I、以及量子点标记的兔IgG；所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线、一条包被C反应蛋白特异性抗体II的检测线，以及一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线。所述降钙素原特异性抗体I、II配对，所述C反应蛋白特异性抗体I、II配对，所述配对的特异性抗体I和特异性抗体II可分别识别对应抗原的不同位点。

进一步地，所述降钙素原的特异性抗体I、II分别为：抗抗钙素单克隆抗体和抗降钙素多克隆抗体。

进一步地，所述CRP的特异性抗体I、II分别为：鼠抗人CRP单克隆抗体7C1/5D1。

进一步地，CRP的特异性抗体I、II可选自：可与位点N-terminal结合的CRP单抗、可与位点19-108结合的CRP单抗、可与位点FL结合的CRP单抗或可与C-terminal位点结合的CRP单抗。

进一步地，所述量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I以及量子点标记的兔IgG三种量子点的发射荧光波长均在于550nm；且三种量子点波长范围不相同；所述质控线位于所述两检测线的后侧。

进一步地，所述底板为低荧光特性；所述样品垫是一种玻纤膜或聚酯膜，为待检样品收集区，其前端搭接粘贴于底衬前端上；所述过滤垫为红细胞过滤膜，过滤垫位于样品垫与底衬之间，其前端搭接粘贴于底衬上，后端自样品垫后端下方延伸出一定长度；所述结合垫的基体为玻璃纤维素膜或聚酯膜，结合垫位于过滤垫与底衬之间，其前端搭接粘贴于底衬上，后端自过滤垫后端下方延伸出一定长度；所述层析膜为低荧光特性的硝酸纤维素膜，其前端插设于结合垫与底衬之间且搭接粘贴于底衬上，并平铺至底衬的后端；所述吸水垫为吸水玻纤膜，其搭接于底衬后端覆盖于层析膜后端上一定长度。

进一步地，所述量子点选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一种或几种化合物的组合；所述量子点中进一步掺杂Cu、Mn 、Hg中至少一种。

本发明还提供制备降钙素原和C反应蛋白的检测试纸的方法，包括以下步骤：

步骤1，量子点标记抗体的制备：用化学交联或生物分子间特异性作用将降钙素原特异性抗体I连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；将兔IgG连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；将C反应蛋白特异性抗体I连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；

步骤2，试纸制作，进一步包括：

制备结合垫：将量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I和量子点标记的兔IgG混合，加入牛血清白蛋白，蔗糖，吐温20，吐温80、曲拉通X-100，之后均匀喷涂在结合垫的基体膜上制成结合垫；

制备层析膜：对层析膜的基材使用PBS封闭液处理，清洗，然后在氮气中干燥；再喷涂降钙素原特异性抗体II形成PCT检测线，C反应蛋白特异性抗体II形成CRP检测线、羊抗兔IgG抗体形成质控线；

层叠：在底板上依次搭接地粘贴样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫，从而形成紧密连接且部分重叠的多层膜结构。

进一步地，所述步骤1中，取1.0g四甲基氢氧化铵五水合物，加入1mL巯基丙酸和10mL氯仿，摇均静置去除上层液体，然后加入100μL的量子点溶液，溶液中有红色沉淀析出后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的量子点，量子点相转移前后荧光特性无明显变化，向磷酸缓冲液中加入60pmol量子点、10μgEDC、15μgNHS溶液和20μg降钙素原特异性抗体或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体溶液，混合均匀并于室温下反应，加入1mg甘氨酸封闭，用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体修饰的量子点；或者，将量子点与1mg/mL的降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体混合，并在新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺盐酸盐作用下室温反应，加入甘氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体修饰的量子点。

进一步地，所述步骤2之制备结合垫工艺中，是将量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I和量子点标记的兔IgG按摩尔比1:10:10比例混合，加入质量百分数1％的牛血清白蛋白，3%的蔗糖，1%的吐温20，0.1%的吐温80、0.2%的曲拉通X-100，之后均匀喷涂在结合垫的基体膜上，每ml溶液铺3cm²，制成结合垫，37℃干燥后密封，低温保存；结合垫的基体膜为玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述步骤2之制备层析膜工艺中：层析膜基材为硝酸纤维素膜，使用含3.0%BSA、0.1%吐温-20的0.01M PBS封闭液处理2小时后，用含0.1%吐温-20的0.01M PBS清洗，然后在氮气中干燥后低温保存。

本发明再提供降钙素原和C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

将血清、血浆或全血样本滴加到加样孔中进行层析反应；

对观察窗中的检测线和质控线上的荧光强度以荧光定量仪检测，根据不同检测线上的荧光强度，依据标准曲线获得降钙素原和C-反应蛋白的含量；

其中，当使用标准浓度的PCT溶液和标准浓度的CRP溶液作为样本分别进行检测时获得标准曲线X1和X2；检测过程中，质控线在入射光照下会产生荧光光强为C；当待测溶液中含有PCT时，PCT检测线在入射光照射下会产生荧光光强T1，该荧光光强比值T1/C与待测溶液中PCT含量成正相关特性；当待测溶液中还有CRP时，CRP检测线在入射光照射下会产生荧光光强T2，该荧光光强比值T2/C与待测溶液中CRP含量成正相关特性；分别测定检测线和质控线上量子点产生荧光光强的T1/C和/或T2/C比率，分别与标准浓度的PCT溶液形成的校正线X1、与标准浓度的CRP溶液形成的校正线X2比照，从而定量检测待测溶液中的PCT和CRP。

进一步地，在样本进行层析反应之前，还包括预润的步骤：具体是在层析膜上滴加缓冲液进行层析反应；所述缓冲液体积为20~80μl，润湿时间为10秒~2分钟；所述缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9.0的磷酸缓冲液。

上述技术方案至少具有如下有益效果：

本发明的检测试纸和方法可同时检测待测血样中的PCT和CRP，给临床带来及大的便利，减少多次取样；有利于准确诊断病情。通过同时检测CRP和PCT，可以区分是急慢性炎症、细菌性感染，局部细菌性感染、和病毒性感染等情况，并评估相关疾病的严重性。

进一步地，本发明的检测试纸或检测方法是通过检测线和质控线的比值来获得检测结果，因此抗温度干扰强，检测结果更准确可靠。

 

附图说明

图1是本发明实施例的检测试纸带有外包壳的正面结构示意图。

图2是本发明实施例的检测试纸去掉外壳后的侧面剖视图。

图3是本发明实施例的检测试纸去掉外壳后的正面结构示意图。

具体实施方式

请参照图1~图3，本发明提供一种同时定量检测降钙素原和C反应蛋白的检测试纸10，其为一种量子点标记免疫定量检测试纸，大致呈长条状，外层进一步设置有外包装20。

所述试纸10包括底衬1以及依次搭接地粘贴在底衬1上的样品垫2、过滤垫3、结合垫4、层析膜5和吸水垫6等多层膜结构，且各层膜结构之间部分重叠。其中，结合垫4上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I，以及量子点标记的兔IgG（发射荧光波长550-590nm）。层析膜5上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线8、一条包被C反应蛋白特异性抗体II的检测线9，以及在检测线8、9后侧的一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线7。

其中，降钙素原特异性抗体I、II配对，C反应蛋白特异性抗体I、II配对，该配对的特异性抗体I和特异性抗体II可分别识别对应抗原的不同位点。

作为本发明的实施例，降钙素原的特异性抗体I、II可以分别为：抗抗钙素单克隆抗体和抗降钙素多克隆抗体。当然，配对的降钙素原特异性抗体I、II只要可分别识别抗原的不同位点即可，并不限于抗抗钙素单克隆抗体和抗降钙素多克隆抗体。

同样地，配对的C反应蛋白特异性抗体I、II为可分别识别抗原的不同位点的C反应蛋白特异性抗体。

作为本发明的实施例所述CRP的特异性抗体I、II可以分别为但不局限于：鼠抗人CRP单克隆抗体7C1/5D1。

女例如，CRP的特异性抗体I、II可选自：可与位点N-terminal结合的CRP单抗、可与位点19-108结合的CRP单抗、可与位点FL结合的CRP单抗或可与C-terminal位点结合的CRP单抗等抗体中的两种可识别抗原不同位点的抗体。

上述外包装20上对应于该试纸10适当位置设置有加样孔21、观察窗2；还可以进一步设置预润孔23。所述加样孔21以及预润孔23为贯穿外包装20的通孔，以利于待测血清、血浆或全血样本滴加到加样孔21后渗至位于其正后方的试纸10的样品垫2，以及自预润孔23中滴加的缓冲液渗透至其正后方的试纸10的层析膜5。通常设计中，所述加样孔21以及预润孔23为圆形或椭圆形，当然其它形状也可适用。所述观察窗22为透明窗体，或者可以直接设置为通孔，以通过观察窗22可以读取检测结果，一般设计中，该观察窗22为长方形，且位于加样孔21及预润孔23之间。可以理解，该观察窗22也可设计为其它形状，其位置及面积与位于其正后方的试纸10上层析膜5的检测线8、9以及两条质控线7相对应。可以理解，预润孔23也可以不设置。

底板1为低荧光特性塑料，承载前述各层膜结构，其根据试纸10的形状对应裁剪而成，如本实施例为长条形。

样品垫2是一种玻纤膜或聚酯膜，为待检样品收集区，其前端搭接粘贴于底衬1前端上，过滤垫3夹设于样品垫2与底衬1之间，且靠近样品垫2后端。

过滤垫3为红细胞过滤膜，作用是滤过红细胞。红细胞过滤膜3的设置使得试纸10能适用于测量血清、血浆或全血等各种血样中的降钙素原以及C反应蛋白，适用性提高。过滤垫3位于样品垫2与底衬1之间，其前端搭接粘贴于底衬1上，后端自样品垫2后端下方延伸出一定长度。

结合垫4的基体材料为玻璃纤维素膜或聚酯膜，结合垫4上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I、量子点标记的兔IgG。

其中，量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I以及量子点标记的兔IgG等均应使用发射波长在550nm以上的量子点，以避免底板及层析膜的荧光干扰；且较佳地，三种量子点要求波长范围不相同。但荧光发射的波长范围是可以根据需要进行调整的，检测时设备检测量子点荧光光强时需要使用对应的滤光片。

作为一种具体实例，分别调节量子点标记的降钙素原特异性抗体I发射波长为620-650nm，量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I发射波长为590-620nm，量子点标记的兔IgG的发射波长为550-590nm。

结合垫4位于过滤垫3与底衬1之间，其前端搭接粘贴于底衬1上，后端自过滤垫3后端下方延伸出一定长度。

层析膜5要求低荧光特性，其材料为硝酸纤维素膜，层析膜5上包被有一条抗降钙素多克隆抗体的检测线8、一条包被C反应蛋白特异性抗体的检测线9，以及在检测线8、9后侧有一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线7。层析膜5的前端插设于结合垫4与底衬1之间且搭接粘贴于底衬1上，并平铺至底衬1的后端。

吸水垫6为吸水玻纤膜。其搭接于底衬后端覆盖于层析膜5后端上一定长度。

其中，样品垫2、过滤垫3、结合垫4、层析膜5、吸水垫6宽度与底衬1宽度齐平，依次搭接粘贴于底衬1上，各层之间紧密连接且部分重叠。各膜层的上表面在该试纸10上表面（即正面结构）依次平铺展开一定区域。如图3所示，该试纸10的正面上各膜层平行连接，侧面对齐，自试纸10的前端开始，依次为样品垫2、过滤垫3、结合垫4、层析膜5、吸水垫6等的正面区域沿试纸10（或底衬1）的长度方向依次邻接且相互平行，检测线8、9和质控线7平行设置于层析膜5且位于结合垫4和吸水垫6正面区域之间。检测线8、9位于质控线7之前。

该试纸10整体呈长条状，相应地，外包装20也呈长条状。在一具体实施方式中，所述样品垫2、过滤垫3、结合垫4长度均为7mm，宽度4mm；层析膜5、吸水垫6长度为15mm，宽度为4mm；样品垫2、过滤垫3、结合垫4、层析膜5之间的重叠区域为2mm长度，层析膜5和吸水垫6之间的重叠区域为3mm长度。层析膜5上检测线和质控线的宽度为1.5mm，间隔为5mm。

外包装20与试纸10二者形状相适配。包装后，外包装20上设置的加样孔21正对样品垫2的正面区域，观察窗22正对层析膜5的正面区域且使得检测线8、9和质控线7部分长度位于观察窗22后方，预润孔23也正对层析膜5的正面区域。

本发明检测降钙素原和C反应蛋白的检测试纸10的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤1，量子点标记抗体的制备

用化学交联或生物分子间特异性作用将降钙素原特异性抗体I连接到量子点表面，得到其修饰的量子点，发射波长为620-650nm；同理将C反应蛋白特异性抗体连接到量子点表面，得到其修饰的量子点，发射波长为590-620nm；同理将兔IgG连接到量子点表面，得到其修饰的量子点，发射波长为550-590nm。 

本发明实施例的量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。所述化合物为选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一种或几种，而且可掺杂Cu、Mn 和Hg。

具体制作过程举例：

取1.0g四甲基氢氧化铵五水合物，加入1mL巯基丙酸和10mL氯仿，摇均，静置30分钟后，去除上层液体，然后加入100μL的CdSe/ZnS 量子点溶液。溶液中有红色沉淀析出，48小时后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的CdSe/ZnS量子点。量子点相转移前后荧光特性无明显变化。向磷酸缓冲液中加入60pmol量子点、10μgEDC、15μgNHS溶液和20μg降钙素原特异性抗体I溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I修饰的620-650波长的量子点。同理获得兔IgG修饰的550-590nm波长的量子点和C反应蛋白特异性抗体I修饰的590-620nm波长的量子点。制备后用1%~5%的牛血清白蛋白封闭并4℃保存。

作为另一实例，将发射波长为600nm的量子点与1mg/mL的降钙素原特异性抗体I混合，并在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1mg/mL)和碳化二亚胺盐酸盐(EDC，1mg/mL) 作用下室温反应4至5小时，加入1mol/L 甘氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I修饰的620-650波长的量子点。同理获得兔IgG修饰的550-590nm波长的量子点和C反应蛋白特异性抗体I修饰的590-620nm波长的量子点。制备后用1%~5%的牛血清白蛋白封闭并4℃保存。

步骤2，试纸制作，进一步包括：

1）制备结合垫4

将量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I和量子点标记的兔IgG按摩尔比1:10:10比例混合，加入1％（质量百分数，下同）的牛血清白蛋白，3%的蔗糖，1%的吐温20，0.1%的吐温80、0.2%的曲拉通X-100等，之后均匀喷涂在结合垫4的基体膜上，每ml溶液铺3cm²，制成结合垫4，37℃干燥后密封，4℃下保存。结合垫4的基体膜为玻璃纤维素膜或聚酯膜，其上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I、量子点标记的兔IgG。

2）制备层析膜5

层析膜的基材为硝酸纤维素膜，使用含3.0%BSA、0.1%吐温-20的0.01M PBS封闭液处理2小时后，用含0.1%吐温-20的0.01M PBS清洗3次，每次5分钟，然后在氮气中干燥1小时后低温4℃保存。使用XYZ3000点膜仪在处理过的层析膜上从近到远依次喷涂以1μL/cm喷涂降钙素原特异性抗体II形成PCT检测线8，C反应蛋白特异性抗体II形成CRP检测线9、羊抗兔IgG抗体形成质控线7，作为一实施例，喷涂线宽1.5mm，线间隔5mm。层析膜5制成后干燥封袋并低温4℃保存。

3）层叠

制作免疫层析试纸条，在底板1上依次搭接地粘贴样品垫2、过滤垫3、结合垫4、层析膜5和吸水垫6。样品垫2为玻璃纤维素膜或聚酯膜，作为待检样品收集区；过滤垫3为红细胞过滤膜，作用是滤过红细胞，使得试纸可以测量血清、血浆或全血中的降钙素原；吸水垫6为吸水玻璃纤维膜。各膜层按现有技术的方法制备或直接从市场上获得。

包括步骤3，提供外包装20，所述外包装20上设有所述加样孔21、观察窗22，或者进一步包括预润孔23。

本发明的试纸用于同时检测降钙素原和C反应蛋白的含量的检测原理及方法如下：采用双抗夹心模式，待测溶液滴加到样品垫2时，由于毛细作用、渗透和虹吸作用，待测溶液可以迅速湿透结合垫4并溶解结合垫4上的量子点标记特异性抗体I、量子点标记的CRP特异性抗体I和量子点标记兔IgG。如果待测溶液中存在目标PCT和CRP，那么待测溶液中的PCT就会和溶解的量子点标记抗抗钙素单抗（简称QDot1-Ab1）发生特异性免疫反应，形成QDot1-Ab1-PCT免疫复合物; 待测溶液中的CRP就会和溶解的量子点标记的CRP特异性抗体（简称QDot2-Ab2）发生特异性免疫反应，形成QDot2-Ab2-CRT免疫复合物。然后这些免疫复合物、量子点标记兔IgG（简称QDot3-Ab3）和剩余未结合的量子点标抗体随着测试溶液，在层析膜上由层析作用和吸水垫的虹吸作用下向前迁移。测试溶液流经层析膜上的检测线8、9和质控线7，测试溶液中的QDot1-Ab1-PCT和检测线8上的抗降钙素多克隆抗体（简称Ab4）形成免疫复合物QDot1-Ab1-PCT-Ab4；同理在检测线9上形成免疫复合物QDot2-Ab2-CRT-Ab5；在质控线7上形成免疫复合物QDot3-Ab3-Ab6。还有剩余极少量免疫复合物可能没有被测试线或质控线捕获而最终进入吸水垫6。由此无论待测溶液中是否含有PCT或CRT，质控线7在入射光照下会产生荧光光强为C；当待测溶液中含有PCT时，检测线在入射光照射下会产生荧光光强T1，该荧光光强比值T1/C与待测溶液中PCT含量成正相关特性；当待测溶液中还有CRP时，检测线在入射光照射下会产生荧光光强T2，该荧光光强比值T2/C与待测溶液中CRP含量成正相关特性。因此通过分别测定免疫层析试纸10上检测线8、9和质控线7上量子点产生荧光光强的T1/C和T2/C比率，分别与标准浓度的PCT溶液形成的校正线X1、与标准浓度的CRP溶液形成的校正线X2比照，可以定量检测待测溶液中的PCT和CRP。如果在检测过程中，免疫层析试纸条上的质控线没有出现荧光时，则表示该试纸条已经失效，检测结果无意义。

本发明的检测方法包括以下步骤：

1. 在层析膜5上对应的预润孔23中滴加50μL的缓冲液以润湿层析膜，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9.0 的磷酸缓冲液，层析反应1min；目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均匀通过层析膜，且减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样本流动速度，从而增加特异性结合，其中缓冲液体积一般为20 ～ 80μl，润湿时间一般为10秒～ 2 分钟；

2．将150μl 血清、血浆或全血样本滴加到加样孔21中，层析反应20min；

3．对观察窗22中的检测线8、9和质控线7上的荧光强度以荧光定量仪检测，根据不同检测线上的荧光强度，依据标准曲线获得降钙素原和C-反应蛋白的含量，检测下限分别为0.5ng/mL和50ng/mL，标准曲线的获得方法与上述步骤相同，此时待测样品是用标准浓度的PCT溶液和标准浓度的CRP溶液进行检测。

检测过程中，质控线7在入射光照下会产生荧光光强为C；当待测溶液中还有PCT时，检测线8在入射光照射下会产生荧光光强T1，该荧光光强比值T1/C与待测溶液中PCT含量成正相关特性；当待测溶液中还有CRP时，检测线9在入射光照射下会产生荧光光强T2，该荧光光强比值T2/C与待测溶液中CRP含量成正相关特性。通过分别测定免疫层析试纸10上检测线8、9和质控线7上量子点产生荧光光强的T1/C和T2/C比率，分别与标准浓度的PCT溶液形成的校正线X1、与标准浓度的CRP溶液形成的校正线X2比照，可以定量检测待测溶液中的PCT和CRP。

可以理解，上述检测步骤1也可以选择性地去掉，直接操作步骤2和3。

本发明的检测试纸10可同时检测待测血样中的PCT和CRP，给临床带来及大的便利，减少多次取样；有利于准确诊断病情。急性反应蛋白CRP，多种因素均可引起其升高，包括在心血管疾病中也会导致其升高，所以临床单凭CRP一项标志物，大大限制了辅助诊断作用。PCT作为一种的感染标志物，水平不受非感染因素影响。因此PCT对细菌感染的诊断价值明显高于WBC计数及CRP，是一项灵敏度好，特异性高的具有鉴别诊断意义的新指标。鉴别细菌性感染和非细菌性感染的能力明显的优于CRP，而且PCT还可以辅助临床诊断重症感染和败血症的需求。PCT对细菌感染发生的局部感染或全身感染在临床指导上比CRP更具意义，CRP目前对全身感染有一定的敏感性，在针对局部细微感染其作用是受限制的。PCT比CRP在抗生素治疗效果上更具有的指导性，PCT可避免抗生素乱用。

通过同时检测CRP和PCT，可以区分是急慢性炎症、细菌性感染，局部细菌性感染、和病毒性感染等情况，并评估相关疾病的严重性。

以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.降钙素原和C反应蛋白的检测试纸，其特征在于，其为一种量子点标记免疫定量检测试纸，包括底衬以及依次搭接地粘贴于底衬上的样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫从而形成多层膜结构，各层膜结构之间部分重叠；所述结合垫上包被有量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I、以及量子点标记的兔IgG；所述层析膜上有一条包被降钙素原特异性抗体II的检测线、一条包被C反应蛋白特异性抗体II的检测线，以及一条包被羊抗兔IgG抗体的质控线；所述降钙素原特异性抗体I、II配对，所述C反应蛋白特异性抗体I、II配对，所述配对的特异性抗体I和特异性抗体II可分别识别对应抗原的不同位点。

2.如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述降钙素原的特异性抗体I、II分别为：抗抗钙素单克隆抗体和抗降钙素多克隆抗体；所述CRP的特异性抗体I、II分别为：鼠抗人CRP单克隆抗体7C1/5D1。

3.如权利要求1所述的试纸，其特征在于，CRP的特异性抗体I、II选自：可与位点N-terminal结合的CRP单抗、可与位点19-108结合的CRP单抗、可与位点FL结合的CRP单抗或可与C-terminal位点结合的CRP单抗。

4.如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I以及量子点标记的兔IgG三种量子点的发射荧光波长均大于550nm，且三种量子点波长范围不相同；所述质控线位于所述两检测线的后侧。

5.如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述底板为低荧光特性；所述样品垫是一种玻纤膜或聚酯膜，为待检样品收集区，其前端搭接粘贴于底衬前端上；所述过滤垫为红细胞过滤膜，过滤垫位于样品垫与底衬之间，其前端搭接粘贴于底衬上，后端自样品垫后端下方延伸出一定长度；所述结合垫的基体为玻璃纤维素膜或聚酯膜，结合垫位于过滤垫与底衬之间，其前端搭接粘贴于底衬上，后端自过滤垫后端下方延伸出一定长度；所述层析膜为低荧光特性的硝酸纤维素膜，其前端插设于结合垫与底衬之间且搭接粘贴于底衬上，并平铺至底衬的后端；所述吸水垫为吸水玻纤膜，其搭接于底衬后端覆盖于层析膜后端上一定长度。

6.如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述量子点选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP 中的任意一种或几种化合物的组合；所述量子点中进一步掺杂Cu、Mn 、Hg中至少一种。

7.制备一种如权利要求1-6中任一项所述的降钙素原和C反应蛋白的检测试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，量子点标记抗体的制备：用化学交联或生物分子间特异性作用将降钙素原特异性抗体I连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；将兔IgG连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；将C反应蛋白特异性抗体I连接到量子点表面，得到其修饰的量子点；

步骤2，试纸制作，进一步包括：

制备结合垫：将量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I和量子点标记的兔IgG混合，加入牛血清白蛋白，蔗糖，吐温20，吐温80、曲拉通X-100，之后均匀喷涂在结合垫的基体膜上制成结合垫；

制备层析膜：对层析膜的基材使用PBS封闭液处理，清洗，然后在氮气中干燥；再喷涂降钙素原特异性抗体II形成PCT检测线，C反应蛋白特异性抗体II形成CRP检测线、羊抗兔IgG抗体形成质控线；

层叠：在底板上依次搭接地粘贴样品垫、过滤垫、结合垫、层析膜和吸水垫，从而形成紧密连接且部分重叠的多层膜结构。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1按下述两种工艺中任意一种进行：步骤1的工艺一：取四甲基氢氧化铵五水合物，加入巯基丙酸和氯仿，摇均静置去除上层液体，然后加入量子点溶液，溶液中有红色沉淀析出后取出红色悬浮物，以氯仿纯化后，溶于水溶液中，得到表面官能团为羧基的量子点，量子点相转移前后荧光特性无明显变化，向磷酸缓冲液中加入量子点、EDC、NHS溶液和降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体溶液，混合均匀并于室温下反应，加入甘氨酸封闭，用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体修饰的量子点；步骤1的工艺二：将量子点与降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体混合，并在N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺盐酸盐作用下室温反应，加入甘氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到降钙素原特异性抗体I或量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I或量子点标记的兔IgG抗体修饰的量子点；所述步骤2之制备结合垫工艺中，是将量子点标记的降钙素原特异性抗体I、量子点标记的C反应蛋白特异性抗体I和量子点标记的兔IgG按摩尔比1:10:10比例混合，加入质量百分数1％的牛血清白蛋白，3%的蔗糖，1%的吐温20，0.1%的吐温80、0.2%的曲拉通X-100，之后均匀喷涂在结合垫的基体膜上，每ml溶液铺3cm²，制成结合垫，37℃干燥后密封，低温保存；结合垫的基体膜为玻璃纤维素膜或聚酯膜；所述步骤2之制备层析膜工艺中：层析膜基材为硝酸纤维素膜，使用含3.0%BSA、0.1%吐温-20的0.01M PBS封闭液处理2小时后，用含0.1%吐温-20的0.01M PBS清洗，然后在氮气中干燥后低温保存。

9.降钙素原和C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

将血清、血浆或全血样本滴加到加样孔中进行层析反应；

对观察窗中的检测线和质控线上的荧光强度以荧光定量仪检测，根据不同检测线上的荧光强度，依据标准曲线获得降钙素原和C-反应蛋白的含量；

其中，当使用标准浓度的PCT溶液和标准浓度的CRP溶液作为样本分别进行检测时获得标准曲线X1和X2；检测过程中，质控线在入射光照下会产生荧光光强为C；当待测溶液中含有PCT时，PCT检测线在入射光照射下会产生荧光光强T1，该荧光光强比值T1/C与待测溶液中PCT含量成正相关特性；当待测溶液中还有CRP时，CRP检测线在入射光照射下会产生荧光光强T2，该荧光光强比值T2/C与待测溶液中CRP含量成正相关特性；分别测定检测线和质控线上量子点产生荧光光强的T1/C和/或T2/C比率，分别与标准浓度的PCT溶液形成的校正线X1、与标准浓度的CRP溶液形成的校正线X2比照，从而定量检测待测溶液中的PCT和CRP。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在将血清、血浆或全血样本滴加到加样孔中进行层析反应的步骤之前，还包括预润的步骤：具体是在层析膜上滴加缓冲液以预润湿层析膜；所述缓冲液体积为20~80μl，润湿时间为10秒~2分钟；所述缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9.0的磷酸缓冲液。