CN103487578A - 一种crp/pct联合诊断试纸及其制备方法 - Google Patents

一种crp/pct联合诊断试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域,具体为一种CRP/PCT联合诊断试纸及其制备方法,试纸的底板中部纵向设有一防渗水胶条,并在防渗水胶条两侧的底板上分别设样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫;一结合垫上固定有标记CRP抗体Ⅰ,另一结合垫上固定有标记PCT抗体Ⅰ,两反应膜上均设有定量带和质控带。本发明将CRP检测和PCT检测整合于同一检测试纸中,可同时检测CRP和PCT的浓度,不仅提高了检测效率,还同时具备CRP检测和PCT检测的优点。并且本发明中量子点标记的CRP和PCT抗体的制备方法,量子点的标记效率高,所制备的标记抗体的稳定性高、活性高,将其分别固定于结合垫上可提高试纸的灵敏度和准确性。

Description

—种CRP/PCT联合诊断试纸及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学检测技术领域,尤其涉及一种CRP/PCT联合诊断试纸及其制备方法。
背景技术
[0002] 在急诊治疗和重症监护过程中,快速而准确的评估细菌脓毒症严重程度是医师必须面临的挑战。C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)和降I丐素原(Procalcitonin,PCT)的引入,为早期感染诊断和治疗反应评估提供了有效的方法。荧光免疫层析是一种建立在荧光层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一种免疫检测技术,荧光免疫层析试纸一般包括依次设于底板上且紧密搭接的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫,底板设于塑料卡内,塑料卡上设有分别与样品垫和反应膜配合的加样孔和显示窗口。
[0003] CRP是由肝脏合成的一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形成复合物的一种急性时相反应蛋白。它由5个相同的亚基单位以非共价方式联结。CRP不仅对感染性疾病、妊娠期糖尿病的病程检测及预后判断评估、抗生素疗效等具有重要的临床应用前景,同时也是心血管疾病最重要的预测因子之一。正常人血清中CRP含量极微。一般新生儿血清CRP水平小于2mg/L,大于此值即与细菌感染的严重程度有关;儿童和成人血清CRP水平小于IOmg/L ;10-99mg/L提示局灶性或浅表性感染,大于或等于100mg/L提示败血症或侵袭性感染等严重感染。CRP在感染发生后6-8h开始升高,24-48h达到高峰,比正常值高几百倍甚至上千倍,升高幅度与感染的程度呈正相关。在疾病治愈后其含量急速下降,一周内可恢复正常。临床上CRP—般作为鉴别细菌或病毒感染的一个首选指标,用于自身免疫性及感染性疾病的诊断和监测,以及抗生素疗效观察等。低水平的CRP,又称超敏C-反应蛋白(hs-CRP)。在心血管疾病的诊断中,hs-CRP被认为是心血管炎症病变的生物标志物。在无炎症或感染条件下(代谢稳定下),通常认为:hs_CRP < lmg/L时为低危险性;l_3mg/L为中度危险;大于3mg/L为高危险性。
[0004] PCT是降钙素的前驱物质。正常情况下,降钙素在受到荷尔蒙刺激后仅由甲状腺的C细胞分泌,其浓度通常小于0.1ng/mL。而在促炎症刺激下,特别是在受到细菌感染时,PCT由大量各类细胞产生。当PCT浓度在0.1-0.25ng/mL时,不太可能感染细菌;0.25-0.5ng/mL时可能感染细菌;大于0.5ng/mL时非常可能感染细菌,需要使用抗生素治疗。
[0005] PCT与CRP相比,在感染刺激下的3-6小时内即可观察到PCT不断上升,随着感性的加重PCT不断升高。此外,CRP在病毒和细菌性疾病中均能出现,而PCT只有在细菌性感染的疾病中才能出现。因此,PCT作为诊断指标具有快速和特异性强等特点。而联合应用CRP和PCT,将能更为准确的判断炎症的感染程度。在评估心血管疾病的危险程度时,为了避免个体间的差异,hs-CRP的检测通常应排除炎症感染。因此,CRP和PCT的联合将非常重要。因此,PCT和CRP的联合应用,将比二者单独使用时应用范围更广,更便捷,诊断结果也更为准确。
[0006] 量子点是一种由一定数量的实际原子组成的聚集体,三维尺寸均小于IOOnm的半导体化合物。它具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化和稳定性好等众多优点,在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力,已成为新一代生物荧光标记物。
发明内容
[0007] 本发明解决的技术问题是基于CRP与PCT联合诊断的优势,以及量子点的荧光特性,提供一种灵敏度高、快速、准确的PCT/CRP联合诊断试纸。
[0008] 为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
[0009] 一种CRP/PCT联合诊断试纸,包括设于底板上且依次紧密相连的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫,所述底板设于塑料卡内,所述底板的中部纵向设有一防渗水胶条,所述防渗水胶条将样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫分隔为第一样品垫、第二样品垫、第一结合垫、第二结合垫、第一反应膜、第二反应膜、第一吸水垫和第二吸水垫;所述第一结合垫上固定有标记CRP抗体I,所述第二结合垫上固定有标记PCT抗体I,所述第一反应膜和第二反应膜均设有定量带和质控带。
[0010] 所述标记CRP抗体I为量子点标记的CRP抗体I ,所述标记PCT抗体I为量子点标记的PCT抗体I。所述量子点标记的CRP抗体I与量子点标记的PCT抗体I具有不同的发射波长。
[0011] 所述第一反应膜上设有第一定量带和第一质控带,所述第一定量带固定有与标记CRP抗体I具有不同抗原结合位点的CRP抗体II,所述第一质控带固定有标记CRP抗体I的二抗。
[0012] 所述第二反应膜上设有第二定量带和第二质控带,所述第二定量带固定有与标记PCT抗体I具有不同抗原结合位点的PCT抗体II,所述第一质控带固定有标记PCT抗体I的二抗。
[0013] 所述定量带和质控带的间距为3-5mm。
[0014] 所述底板为黑色底板。
[0015] 所述样品垫为玻璃层析膜。
[0016] 所述试纸具有一个双插槽塑料卡,所述底板设于双插槽塑料卡内。
[0017] 所述双插擦槽的塑料卡上设有两个并列的加样孔和两个并列的显示窗口。
[0018] 以上所述CRP/PCT联合诊断试纸的制备方法,包括以下步骤:
[0019] (I)将具有不同发射波长的量子点标记的CRP抗体I溶液和量子点标记的PCT抗体I溶液分别喷涂于第一结合垫和第二结合垫上并在室温下晾干,于4°C下保存,备用。
[0020] 所述量子点标记的CRP抗体I /PCT抗体I溶液为每IOOmL, 1.5-2.5mg/mL的量子点标记的CRP抗体I /PCT抗体I中分别加入2-5g蔗糖、0.5_lg BSA、0.05-0.1g Tween的溶液。
[0021] (2)用标记CRP抗体I的二抗溶液在第一反应膜上画线并吹干形成第一质控线,用与标记CRP抗体I具有不同抗原结合位点的CRP抗体II溶液在第一反应膜上画线并吹干形成第一定量线;用标记PCT抗体I的二抗溶液在第二反应膜上画线并吹干形成第二质控线,用与标记PCT抗体I具有不同抗原结合位点的PCT抗体II溶液在第二反应膜上画线并吹干形成第二定量线;备用。[0022] (3)将第一样品垫、第一结合垫、第一反应膜和第一吸水垫依次固定在防渗水胶条一侧的底板上并使之紧密搭接;将第二样品垫、第二结合垫、第二反应膜和第二吸水垫依次固定在防渗水胶条另一侧的底板上并使之紧密搭接;得CRP/PCT测试条。
[0023] 所述步骤c所得CRP/PCT测试条插入双插槽塑料卡内。
[0024] 所述量子点标记的CRP抗体I或PCT抗体I由以下步骤制备:
[0025] (I)清洗量子点:用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液清洗量子点至保存量子点的原缓冲液除去,用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液保存量子点并超滤浓缩。
[0026] 所述pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L。
[0027] 所述超滤浓缩为在20-25°C和5000-7000r/min的条件下,用100K的超滤管离心6-8min。
[0028] 所述量子点为羧基水溶性量子点;所述羧基水溶性量子点为核壳型量子点或单一化合物形成的量子点。
[0029] 所述核壳型量子点为ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。
[0030] 所述单一化合物为以下化合物中的任一种:第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素组成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素组成的化合物。具体地,所述单一化合物为 GaSb、InAs> InP、InGaAs> InAlAs、MgSe、MgTe、CaS>CaSe、CaTe、SrS, SrSe, SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、SiC、SiGe、SiSe、SiTe和SiS中的任一种。
[0031] (2)活化:按比例分别称取EDC (1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺),并将EDC和NHS直接加入步骤(I)所得的量子点溶液中,用振荡器混合5-8次后在23-25°C下反应50-70min,得活化量子点;所述EDC、NHS和量子点的摩尔比为(20000-25000):5000:1。优选地,EDC、NHS和量子点的摩尔比为25000:5000:1。优选地,在0-4°C且空气湿度小于或等于30%的条件下称取EDC和NHS,并将其迅速加入反应液中。更优选地,在0-4 V的冰盒中称取EDC和NHS。
[0032] (3) 二次清洗量子点:用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗步骤(2)所得活化量子点至EDC、NHS和磷酸盐缓冲液除去,用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存活化量子点并超滤浓缩,备用。
[0033] 所述PH=8.5的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L ;所述超滤浓缩为在20_25°C和5000-7000r/min的条件下,用100K的超滤管离心6_8min。
[0034] (4)清洗抗体:用ρΗ=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗CRP抗体I或PCT抗体I并超滤浓缩除去抗体原保存液中的NaN3,用ρΗ=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存CRP抗体I或PCT抗体I,备用。
[0035] 所述ρΗ=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L ;所述超滤浓缩为在1_4°C和3000-5000r/min的条件下,用50K的超滤管离心8_10min。
[0036] (5)偶联:将步骤(3)所得活化量子点溶液与步骤(4)所得CRP抗体I或PCT抗体I溶液混合均匀,在23-25°C及不断摇动下反应5-7h,得CRP抗体I或PCT抗体1-量子点偶联物反应液;活化量子点与CRP抗体I或PCT抗体I的摩尔比为1:8-10。优选地,活化量子点与CRP抗体I或PCT抗体I的摩尔比为1:10,活化量子点的浓度为0.8 μ mol/L。[0037] (6)分离:通过排阻层析分离步骤(5)的反应液得CRP抗体I或PCT抗体1-量子点偶联物溶液和CRP抗体I或PCT抗体I回收液;CRP抗体I或PCT抗体1-量子点偶联物溶液经超滤浓缩后加入封闭液并在4°C下保存;CRP抗体I或PCT抗体I回收液经超滤浓缩后回收再利用。排阻层析中使用的排阻层析柱的填料为superdex200或Sephacryl300,流速为1.5ml/min,柱长为40_60cm。所述封闭液为Gly封闭液,Gly的浓度为lmg/mL,溶剂为50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液。
[0038] 向步骤(6)中浓缩后的CRP抗体I或PCT抗体1-量子点偶联物溶液中加入NaN3,使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN3的浓度为0.01-0.05mg/mL,以使蛋白-量子点偶联物溶液可长期保存。
[0039] 与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明将CRP检测和PCT检测整合于同一检测试纸中,可同时检测CRP和PCT的浓度,不仅提高了检测效率,还同时具备CRP检测和PCT检测的优点。在结合垫上固定量子点标记的抗体,利用量子点优越的荧光特性,提高试纸的灵敏度和准确度。并且本发明制备量子点标记的CRP抗体I或PCT抗