CN105044340A - 一种基于量子点的前列腺特异抗原免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents

一种基于量子点的前列腺特异抗原免疫层析试纸条的制备方法 Download PDF

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CN105044340A CN201510381888.2A CN201510381888A CN105044340A CN 105044340 A CN105044340 A CN 105044340A CN 201510381888 A CN201510381888 A CN 201510381888A CN 105044340 A CN105044340 A CN 105044340A
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Abstract

本发明涉及一种基于量子点的前列腺特异抗原免疫层析试纸条的制备方法；试纸条由经预处理的聚酯纤维作为样品垫及结合物释放垫，由经预处理的硝酸纤维素膜作为层析膜和吸水垫组装而成，样品垫用于滴加样品，结合垫表面涂有量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，层析膜包被有β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体及羊抗鼠二抗，分别形成T线即检测线和C线即质控线，吸水垫提供待测液流动的动力。与现有产品和技术相比，本发明的整个制备过程简单，适合于产业化生产；根据量子点的荧光特性，可定性定量检测前列腺特异性抗原，且特异性良好；整个检测过程，成本低廉且操作非常简便，适合高危人群的社区肿瘤筛选，建立了一种肿瘤检测的新方法。

Description

一种基于量子点的前列腺特异抗原免疫层析试纸条的制备方法
技术领域
本发明涉及医药诊断技术领域，更具体的是涉及一种新型基于量子点的检测前列腺特异抗原免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
前列腺癌(prostatecancer,PCa)是一种老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。在欧美发达国家，前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位，病死率仅次于肺癌。近年来，我国前列腺癌的发病率呈上升趋势，已高居泌尿系肿瘤的第三位，并且发病年龄也日趋年轻化，临床上已经将其作为老年男性常见恶性肿瘤之一。但患者如能在发病早期发现，治愈率可以达到80％以上，因此，前列腺癌的早期诊断已经成为近年来研究的热点。
前列腺特异性抗原(prostatespecificantigenPSA)是由前列腺上皮细胞分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种糖蛋白，直接分泌到前列腺导管系统内。其浓度超过正常值，则患前腺癌的危险性增加。因此，将前列腺特异性抗原作为肿瘤标志物，对高危人群进行筛查，对前列腺癌的早期诊断、病情发展和预后监测等工作也有所帮助。因此，对生物体内的肿瘤标志物实现高灵敏度的检测是生命科学领域研究的一项重要课题，发展一种新的灵敏度高的检测方法也成为研究者们努力的目标。
免疫层析检测试纸条是近年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体(或抗原)作为捕获试剂固定于硝酸纤维素膜的特定区域，加入待测样品后，在毛细作用力的推动下，待测样品沿着膜向前移动，当移动至固定有捕获试剂的区域时，样品中的抗原(或抗体)与捕获试剂发生特异性结合，标记试剂(如胶体金，酶等)则显示出一定的颜色从而实现特异性检测的免疫分析方法。现已商品化的免疫层析试纸条多用胶体金作为标记物，虽然检测结果通过肉眼可见，但无法完成定量检测，而抗原浓度低的样本检测条带颜色太浅无法用肉眼识别。目前量子点因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面,而免疫层析试纸条检测则因为它的简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制前列腺特异性抗原量子点免疫荧光试纸条，对前列腺肿瘤标志物进行检测，建立前列腺肿瘤标志物检测的新方法。
发明内容
免疫层析技术在肿瘤检测中的重要地位、量子点这种纳米粒子独特的光学性质以及层析技术简便和价格方面的优势。我们将结合量子点和免疫层析试纸条两种技术，利用量子点羧基和肿瘤标志物相应抗体的氨基反应，制得量子点荧光探针。探针、肿瘤标志物和包埋在试纸条的另一种肿瘤标志物抗体通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构。对前列腺特异性抗原(prostatespecificantigenPSA)——前列腺癌肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立肿瘤标志物检测的新方法，致力于简单迅速、价格低廉、定性定量、操作简便的消化系统肿瘤早期诊断方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于量子点的前列腺特异性抗原免疫层析试纸条的制备方法，样品垫经预处理后滴加待测的前列腺特异性抗原，结合物释放垫经预处理后，表面涂有量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，层析膜包被有β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体及羊抗鼠二抗，分别形成T线即检测线和C线即质控线。
本发明的量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体的操作步骤如下：
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照原料质量比为1:4000～10000比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体按照摩尔比为1:20～40比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2-4小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有0.5～5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液。
所述的前列腺特异性抗体为鼠源单克隆特异性抗体是ab140337、ab403、ab63590、ab0187或ab130880的一种。
具体说明如下：
一种基于量子点的前列腺特异性抗原免疫层析试纸条的制备方法，试纸条由经预处理的聚酯纤维作为样品垫及结合物释放垫，由经预处理的硝酸纤维素膜作为层析膜和吸水垫组装而成，样品垫用于滴加样品，结合垫表面涂有量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，层析膜包被有β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)，分别形成T线即检测线和C线即质控线，吸水垫提供待测液流动的动力。
层析膜预处理方法如下：
将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到0.5～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
样品垫预处理方法如下：
将聚酯纤维浸入含0.1％～2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的Tris-HCl缓冲液中静置5～10分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
结合物释放垫预处理方法如下：
将聚酯纤维浸入含1％～5％的牛血清白蛋白(BSA)、1％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1％～5％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含1％～5％的牛血清白蛋白(BSA)、1％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1％～5％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
结合物释放垫终处理方法如下：
用含1％～5％的BSA、1％～5％的PEG-4000、0.1％～2％的Tween-20、1％～5％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。所述稀释液与混合液的体积比为稀释倍数为5～10:1。
试纸条的组装：可以采用通常的处理方法，也可以采用如下方法处理：
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。(如图2、图4所示)
所述的制备方法，其特征在于所述量子点是聚(叔丁基丙烯酸脂-乙基丙烯酸脂-甲基丙烯酸)三嵌段共聚物改性CdZnSe量子点得到的水溶性量子点。(如图1所示)
本发明制备的新型基于量子点的前列腺特异性抗原免疫层析试纸条优势在于：
1.采用量子点这种具有优异的光学性质，已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面的纳米材料作为探针荧光来源，将纳米技术应用到肿瘤检测领域。
2.采用免疫层析技术作为检测用的基材，免疫层析技术因其简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。
3.采用量子点的羧基和抗体的氨基之间的反应形成的牢固的化学键，而非传统的静电吸附作用，提高了试纸条抵抗非特异性吸附的能力，量子点荧光强度和前列腺特异性抗原浓度之间的线性关系可同时实现定性定量检测。(如图3、图4所示)
附图说明
图1:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)试纸条的量子点透射电镜照片。
图2:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)试纸条阳性和阴性样品的检测图片。
图3:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的特异性实验数值。
图4:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
图5:实施例1:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
图6:实施例2:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
图7:实施例3:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
图8:实施例4:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
图9:实施例5:制备的基于量子点的前列腺特异性抗原(PSA)免疫层析试纸条的灵敏性实验数值。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1:
1.量子点偶联前列腺特异性抗体
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液按照原料质量比为1:4000比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(ab140337)按照摩尔比为1:20比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液，置于4℃保存。
2.层析膜、样品垫以及结合物释放垫的预处理
(1)将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到0.5mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
(2)将聚酯纤维浸入含0.1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10000)的Tris-HCl缓冲液中静置5分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
(3)将聚酯纤维浸入含1％的牛血清白蛋白(BSA)、1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含1％的牛血清白蛋白(BSA)、1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
(4)用含1％的BSA、1％的PEG-4000、0.1％的Tween-20、1％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，稀释倍数为5倍，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
3.试纸条的组装
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
4.样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。数据如下，拟合曲线(图5)：
Conc.(ng/mL) T/C Aver STDEV
0 0.170321141 0.002983316
0.78125 0.270215088 0.003506777
3.125 0.47162713 0.002741294
12.5 0.544953688 0.004835757
50 0.973027288 0.004797072
200 1.448888461 0.018305344
实施例2:
1.量子点偶联前列腺特异性抗体
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液按照原料质量比为1:7000比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(ab403)按照摩尔比为1:30比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应3小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液，置于4℃保存。
2.层析膜、样品垫以及结合物释放垫的预处理
(1)将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到1mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
(2)将聚酯纤维浸入含1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40000)的Tris-HCl缓冲液中静置7分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
(3)将聚酯纤维浸入含2％的牛血清白蛋白(BSA)、2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含2％的牛血清白蛋白(BSA)、2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
(4)用含2％的BSA、2％的PEG-4000、1％的Tween-20、2％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，稀释倍数为7倍，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
3.试纸条的组装
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
4.样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。数据如下，拟合曲线(图6)：
Conc.(ng/mL) T/C Aver STDEV
0 0.203824223 0.004992926
0.78125 0.197049913 0.010075481
3.125 0.327610441 0.006327858
12.5 0.642397978 0.004754696
50 1.06983359 0.015115092
200 1.710781798 0.014012508
实施例3:
1.量子点偶联前列腺特异性抗体
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液按照原料质量比为1:10000比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(ab63590)按照摩尔比为1:40比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应4小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液，置于4℃保存。
2.层析膜、样品垫以及结合物释放垫的预处理
(1)将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
(2)将聚酯纤维浸入含2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-55000)的Tris-HCl缓冲液中静置10分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
(3)将聚酯纤维浸入含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
(4)用含5％的BSA、5％的PEG-4000、2％的Tween-20、5％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，稀释倍数为10倍，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
3.试纸条的组装
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
4.样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。数据如下，拟合曲线(图7)：
Conc.(ng/mL) T/C Aver STDEV
0 0.170321141 0.002983316
0.78125 0.270215088 0.003506777
3.125 0.47162713 0.002741294
12.5 0.544953688 0.004835757
50 0.973027288 0.004797072
200 1.448888461 0.018305344
实施例4:
1.量子点偶联前列腺特异性抗体
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液按照原料质量比为1:8000比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(ab0187)按照摩尔比为1:25比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2-4小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液，置于4℃保存。
2.层析膜、样品垫以及结合物释放垫的预处理
(1)将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
(2)将聚酯纤维浸入含2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10000)的Tris-HCl缓冲液中静置10分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
(3)将聚酯纤维浸入含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
(4)用5％的BSA、5％的PEG-4000、2％的Tween-20、5％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，稀释倍数为10倍，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
3.试纸条的组装
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板
中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
4.样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。数据如下，拟合曲线(图8)：
Conc.(ng/mL) T/C Aver STDEV
0 0.185499402 0.003797214
0.78125 0.125927176 0.009615783
3.125 0.314044767 0.011122677
12.5 0.402934905 0.002013414
50 0.942847211 0.009974535
200 1.670238564 0.022579338
实施例5:
1.量子点偶联前列腺特异性抗体
(1)将水溶性量子点、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液按照原料质量比为1:6000比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，得到活化的水溶性量子点；
(3)将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(ab130880)按照摩尔比为1:40比例混合于磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应4小时；
(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液，置于4℃保存。
2.层析膜、样品垫以及结合物释放垫的预处理
(1)将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体(此处所指的β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体与本文提到的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，为针对前列腺癌抗原上不同结合位点的两种不同的特异性单克隆抗体)以及羊抗鼠二抗(与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体特异性结合的抗体)用PBS缓冲液稀释到2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
(2)将聚酯纤维浸入含2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10000)的Tris-HCl缓冲液中静置10分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存备用。
(3)将聚酯纤维浸入含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含5％的牛血清白蛋白(BSA)、5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5％的蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存备用。
(4)用5％的BSA、5％的PEG-4000、2％的Tween-20、5％的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，稀释倍数为10倍，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
3.试纸条的组装
(1)所得预处理的层析膜固定于单面塑胶板上，所得预处理的样品垫及终处理的结合物释放垫按顺序贴在层析膜上，最后在层析膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠2mm，试纸条组装完成。
(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
4.样品的测试和结果判读
(1)定性检测：用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯即可；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有前列腺特异性抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含前列腺特异性抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效。
(2)定量检测：通过一系列浓度梯度的前列腺特异性抗原标准液滴加到免疫层析试纸条上，20分钟后用检测仪读取T线和C线的荧光强度数值，并建立Log(T/C)与前列腺特意性抗原浓度的相对应关联公式，将待测样本检测获得的T线与C线数值通过公式，计算出其前列腺特异性抗原的浓度。数据如下，拟合曲线(图9)：
Conc.(ng/mL) T/C Aver STDEV
0 0.139590561 0.002320703
0.78125 0.189965018 0.005198652
3.125 0.281625545 0.006186954
12.5 0.489191254 0.007102512
50 0.970343795 0.006946154
200 1.462915207 0.017895089

Claims (8)

1.一种基于量子点的前列腺特异性抗原免疫层析试纸条的制备方法，样品垫经预处理后滴加待测的前列腺特异性抗原，结合物释放垫经预处理后，表面涂有量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体，层析膜包被有β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体及羊抗鼠二抗，分别形成T线即检测线和C线即质控线。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是量子点标记的α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体的操作步骤如下：
（1）将水溶性量子点、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照原料质量比为1:4000～10000比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应30分钟；
（2）反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，得到活化的水溶性量子点；
（3）将活化的水溶性量子点与α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体按照摩尔比为1:20～40比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2-4小时；
（4）反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的抗体，最后将产物分散在含有0.5～5%牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，4℃静置过夜或恒温培养37度1小时后，获得封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液。
3.如权利要求2所述的方法；其特征是所述的前列腺特异性抗体为鼠源单克隆特异性抗体是ab140337、ab403、ab63590、ab0187或ab130880的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述层析膜预处理方法如下:
将β-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到0.5～2mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理后的层析膜。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述样品垫预处理方法如下:
将聚酯纤维浸入含0.1%～2%的聚乙烯吡咯烷酮的Tris-HCl缓冲液中静置5～10分钟，然后放入37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的样品垫，封袋置于4℃保存。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述结合物释放垫预处理方法如下:
将聚酯纤维浸入含1%～5%的牛血清白蛋白、1%～5%的聚乙烯吡咯烷酮、1%-5%的蔗糖的PBS缓冲液中，静置至聚酯纤维充分吸收含1%～5%的牛血清白蛋白、1%～5%的聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖的PBS缓冲液，然后置于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，获得预处理的结合物释放垫，封袋置于4℃保存。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述结合物释放垫终处理方法如下:
用含1%～5%的BSA、1%～5%的PEG-4000、0.1%～2%的Tween-20、1%～5%的蔗糖的PBS缓冲液作为稀释液，对封闭后的水溶性量子点-α-前列腺癌抗原特异性单克隆抗体混合液进行稀释，并将稀释后的溶液均匀滴加在预处理后的结合物释放垫上，静置至预处理后的结合物释放垫充分吸收该溶液，并随后于37℃恒温干燥箱中至完全干燥，得到终处理的结合垫，封袋置于4℃保存备用。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是所述稀释液与混合液的体积比为稀释倍数为5～10:1。
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