CN105259348A

CN105259348A - 一种分泌型Sema4C蛋白及其应用

Info

Publication number: CN105259348A
Application number: CN201510699053.1A
Authority: CN
Inventors: 马丁; 高庆蕾; 魏军成; 杨洁; 乔龙
Original assignee: ZHUHAI YAMA BIOENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN KAIDEWEISI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105259348B

Abstract

本发明涉及一种分泌型Sema4C蛋白及其应用。本发明所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白的胞外段，包括SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列。所述分泌型Sema4C蛋白可以作为肿瘤标志物进行应用。本发明还提供以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，以Sema4C人重组蛋白为标准品，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明所述的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，可用于肿瘤患者(尤其是乳腺癌患者)的术前诊断、术后治疗效果评估及随访监测。

Description

一种分泌型Sema4C蛋白及其应用

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及一种新发现的分泌型Sema4C蛋白及其应用，具体地为一种可用于乳腺癌早期检测及术后监测的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒的制备及应用。

背景技术

乳腺癌发病率居女性患者第一位，约占女性所患全部恶性肿瘤的23％。据国家卫计委资料显示，2004-2005年，中国女性乳腺癌的死亡率为5.9/10万，居恶性肿瘤死亡率的第6位。近15年间，我国乳腺癌发病和死亡的年龄调整率及绝对死亡人数均明显上升，是近年来恶性肿瘤增长幅度最大的肿瘤，且呈年轻化趋势。面对如此严峻的形式，国家卫计委及时开展两癌筛查以期早期发现乳腺癌，在一定程度上明显降低了局部晚期乳腺癌(LABC)的发病率，使乳腺癌患者病死率明显降低。但乳腺癌患者术后随访时间长，除影像学外尚无明确的肿瘤标记物，严重影响了乳腺癌患者的术后监测，导致不易发现的肿瘤局部复发和转移，是乳腺癌患者的重要死因。因此，临床上迫切需要发现乳腺癌新的血清学肿瘤标志物用于乳腺癌的无创性早期诊断、术后评价治疗效果和随访监测，以期早期发现乳腺癌的复发和转移。

肿瘤标志物的价值表现在其敏感性和特异性上。理想的肿瘤标志物应该是敏感性高，特异性强，表达量或血清中水平与肿瘤组织扩散或肿块大小成正相关。临床上目前尚无乳腺癌特异的肿瘤标志物检测，常常使用肿瘤标志物CEA、CA153用于乳腺癌患者的检测。由于CEA的多克隆抗体容易与样品中无关抗原结合，造成假阳性结果增多。肿瘤标志物CA153也存在着同样的问题，特异性不高。因此，寻找一种兼顾敏感性和特异性的血清学肿瘤标志物，应用于乳腺癌的临床检测，以期达到乳腺癌早期诊断、术后监测及预后评估的目的是乳腺癌诊治中迫切需要解决的课题。

ELISA技术自本世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，在临床和生物疾病的诊断与控制等领域倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，以及单克隆抗体技术的应用，使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性等方面都有了大幅度的提高，并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、携带方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠，已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。

膜型Sema4C蛋白(Semaphorin4C)是一个由833个氨基酸组成的分子量约为93.5KDa的酸性蛋白质，属于脑信号蛋白家族，最初是在神经系统研究中而得，对它的深入研究发现，在健康成人体内膜型Sema4C蛋白表达极微弱，但在各类癌症患者包括乳腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等多种病变组织中可检测到显著高表达。

但是，膜型Sema4C蛋白在应用中存在诸多缺陷，例如，膜型Sema4C蛋白不能通过Elisa检测，必须利用免疫组化技术，免疫组化技术的前提必须把肿瘤组织切除下来后检测，用于肿瘤转移和术后复发监测极不方便，而分泌型Sema4C蛋白可以很好的克服上述缺陷。

SEMA4C基因是发明人早期通过激光捕获、显微切割(LCM)技术从乳腺癌患者及良性乳腺肿瘤患者中切取人淋巴管内皮细胞，微量RNA提取后经无偏性线性扩增，最后进行表达谱芯片检测发现，并进行临床标本验证的在乳腺癌中表达上调最为明显的基因。

国内外目前关于Sema4C在肿瘤中的研究非常有限，尤其是目前尚无分泌型Sema4C蛋白的序列、浓度及检测方法的相关报道，更无相关专利。

因此，如果能够建立分泌型Sema4C的ELISA检测方法，在基础研究和临床医学检测方面都有重要的应用价值。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种分泌型Sema4C蛋白，不仅首次证实了分泌型Sema4C蛋白的存在，并发现该分泌型Sema4C蛋白在正常人和肿瘤患者血清中的表达有显著差异，尤其在乳腺癌淋巴结转移患者血清中明显升高，并与乳腺癌患者肿瘤负荷呈显著正相关，因此能作为一种理想的血清学标记物用于乳腺癌患者的术前诊断、术后治疗效果评估及随访监测，更进一步提供了一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，解决了膜型Sema4C蛋白不能通过Elisa检测而必须利用免疫组化技术使用不便的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种分泌型Sema4C蛋白，所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白的胞外段，包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中包括一段信号肽序列，所述信号肽序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。

本发明通过Elisa技术、Western-blot检测及质谱分析技术等多方面证明人血清中分泌型Sema4C蛋白的存在，并确定其为由600个左右氨基酸组成，大小为90KD左右，略小于膜蛋白93.5KD；此外，在宫颈癌和乳腺癌的患者血清中发明人发现该分泌型Sema4C蛋白浓度升高，而且具有非常高的敏感性和特异性，分泌型Sema4C在很多方面表现出与肿瘤发生相关的活性，包括促进细胞增殖和迁移，促进血管和淋巴管生成，抗肿瘤细胞凋亡和药物作用等。利用反义寡核苷酸链抑制它的表达能够显著抑制肿瘤的生长和转移，这些研究结果表明分泌型Sema4C蛋白在肿瘤的发生、发展和恶化过程中扮演着极为重要的角色。目前，发明人首次证实了该分泌型Sema4C蛋白在血清中表达研究。

本发明采用LCM技术从乳腺癌原发灶和正常乳腺的冰冻组织切片中捕获均一同质性的淋巴管内皮细胞，微量抽提的RNA经RNA无偏性线性扩增获得足量完整的RNA，有效偶联AffymetrixGeneChiparrayHGU133Plus2.0聚寡核苷酸表达谱芯片，筛选乳腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异表达的功能基因群。SEMA4C基因是乳腺癌和正常组织间淋巴管内皮细胞差异表达显著的基因之一，乳腺癌中淋巴管内皮细胞SEMA4C基因的核酸水平明显上调。随后，通过实时RT-PCR和免疫组化进一步证实乳腺癌组织中SEMA4CmRNA和蛋白表达上调。进一步分析SEMA4C表达的蛋白与临床病理参数的关系，发现肿瘤腺上皮过表达Sema4C与淋巴结转移、病理分期相关。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中插入一段标签序列，优选地，插入的标签序列为His标签序列，即分泌型Sema4C蛋白包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；更进一步地，分泌型Sema4C蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。SEQIDNO.2所示的氨基酸序列中同时含有信号肽序列以及标签序列，所述信号肽序列具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，信号肽序列更有利于蛋白的分泌表达；所述标签序列具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列，由6个His组成，与其他种类的标签序列相比，更有利于分泌型Sema4C蛋白的纯化。

进一步，所述分泌型Sema4C蛋白以分泌形式存在且能够在人血清中被检测到。

本发明还提供一种编码上述的分泌型Sema4C蛋白的核苷酸序列。

上述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物的应用。

上述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物在乳腺癌术前检测及术后监测中的应用。

基于上述的分泌型Sema4C蛋白，本发明提供一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，包括：包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体、检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体和标准品，所述标准品Sema4C人重组蛋白，所述Sema4C人重组蛋白包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，优选地，所述Sema4C人重组蛋白就是由SEQIDNO.2所示的氨基酸组成。

利用上述试剂盒能通过检测人血清中分泌型Sema4C蛋白的浓度从而协助诊断及随访乳腺癌患者，克服乳腺癌因缺乏血清学标记物所致的诊断和随访困难的缺点。

具体而言，本发明所述的上述试剂盒是用于检测血清中分泌型的Sema4C蛋白的ELISA试剂盒，其包被一种绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，通过包被的Sema4C抗体捕获血清中的分泌型的Sema4C蛋白，用小鼠抗人Sema4C单克隆抗体检测分泌型的Sema4C蛋白的含量。

本发明所述的试剂盒的检测原理采用双抗体夹心法ELISA。

本发明所述的试剂盒的检测对象为表达Sema4C的肿瘤，所述表达Sema4C的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等，所述肿瘤优选为乳腺癌。

本发明所述的试剂盒用于乳腺癌的早期诊断、监测治疗效果和预后随访。

在本发明所述的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4ug/mL所述检测抗体的工作浓度为0.4ug/mL，所述酶联抗体的工作浓度为1ug/mL。

本发明所述的试剂盒具有良好的特异性、敏感性和稳定性。

本发明所述试剂盒的具体的优点在于：(1)引入一种新的转移相关的乳腺癌分子标志物分泌型Sema4C蛋白，通过检测该标志物，可以协助乳腺癌的临床诊断，进一步判断患者预后情况，指导治疗；同时，作为乳腺癌的一个独立预后因子，该标志物也可能成为治疗新靶点。(2)该标志物的检测只需抽血便可进行，患者所受痛苦较小，且可以随时检测，有利于监测病情。(3)ELISA检测技术在临床应用已经比较成熟，且简单方便，成本低廉，适合临床检测。

进一步，所述包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，母液浓度为0.2mg/mL，稀释50倍后的工作液的浓度为4ug/mL；

1)检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体，母液的浓度为0.2mg/mL，利用生物素标记后(生物素标记方法：采用生物素标记试剂盒购自日本同仁，型号为LK03，具体实施步骤参照该产品说明书)，使用时，稀释500倍得到的工作液浓度为0.4ug/mL；

2)链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体(即Streptavidin-HRPIgG)，母液的浓度为0.5mg/mL；

3)标准品，母液的浓度为100ng/uL，通过昆虫细胞sf9中真核表达并通过亲和纯化。

采用上述进一步方案的有益效果是：

在本发明所述的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4ug/mL，所述检测抗体的工作浓度为0.4ug/mL，所述酶联抗体的工作浓度为1ug/mL，进一步保证了本发明所述的试剂盒具有良好的特异性、敏感性、稳定性以及使用时的便利性。

进一步，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、显色液、反应终止液。

进一步，所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa₂HPO₄、1.8mMKH₂PO₄，pH值为7.4；所述洗涤液为添加了体积分数为0.05％的Tween-20的包被缓冲液；所述封闭液为含有体积分数为1％的牛血清白蛋白的包被缓冲液；所述加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl、0.5MKCl、体积分数为1％的牛血清白蛋白、体积分数0.05％的Tween-20，pH值为8.4；所述反应终止液的成分为2MH₂SO₄。

本发明所用术语″工作浓度″是指在进行检测时所使用的试剂例如抗体的浓度。

本发明所述的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒在使用时，包括以下步骤：收集血清样本，包括正常人样本和患者的血清样本(例如乳腺疾病中乳腺良性病变和乳腺癌患者的血清样本)，按常规血清分离方法处理；96孔酶标板多克隆抗体包被；单克隆抗体检测分泌型Sema4C蛋白；计算血清中分泌型的Sema4C蛋白的含量。

具体操作为：

1)在酶标板中加入包被缓冲液(PBS)稀释50倍的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，每孔100uL，4℃包被24小时；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；

2)每孔加入200uL封闭液，37℃封闭2小时；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；

3)将标准品(浓度分别为0ng/mL、0.78125ng/mL、1.5625ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL)分别加入步骤4)处理的孔中，每孔加入100uL，用于制作标准曲线；

4)将待测样品分别加入步骤3)处理的孔中，每孔加入100uL；加盖封口膜，置于37℃孵育2小时，用于检测待测样品；

5)将步骤3)和步骤4)孔中的液体弃去，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；

6)向步骤5)的孔中，每孔分别加入利用加样缓冲液稀释500倍的生物素标记的小鼠抗人Sema4C单克隆抗体(浓度为0.4ug/mL)，每孔加入100uL，37℃反应2h，加盖封口膜；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤三次，每次5分钟；

7)每孔分别加入100uL的Streptavidin-HRPIgG(浓度为0.5mg/mL)，加盖封口膜，37℃避光反应20min；

8)每孔加入100uL显色液TMB，室温反应10-30min；

9)每孔加入50uL2MH₂SO₄终止反应；

10)在酶标仪中测定OD₄₅₀和OD₅₇₀值；

11)根据标准品测定的OD_450-570值(即利用OD₄₅₀测的数值减去OD₅₇₀测得的数值)，利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线，横坐标为待测样品中分泌型Sema4C蛋白的浓度，纵坐标为OD_450-570值；

12)通过标准曲线和未知浓度样品的OD_450-570值计算待检样品中分泌型Sema4C蛋白的浓度。

附图说明

图1为分泌型Sema4C蛋白在乳腺癌组织中蛋白水平的表达情况。

图2WestemBlotting方法检测MD-MBA-231细胞总蛋白和上清中Sema4C蛋白。

图3质谱分析MD-MBA-231细胞上清中蛋白。

图4为分泌型Sema4C蛋白的检测标准曲线。

图5ELISA试剂盒检测分泌型Sema4C蛋白升高的灵敏度和特异度。

图6为根据公式计算出肿瘤患者和健康对照的分泌型Sema4C蛋白浓度比较，包括图6A、图6B和图6C。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

肿瘤组织中SEMA4C核酸水平明显上调，乳腺癌组织中膜型Sema4C蛋白表达上调。

前期发明人采用LCM技术从乳腺癌原发灶和正常乳腺的冰冻组织切片中捕获均一同质性的淋巴管内皮细胞，微量抽提的RNA经RNA无偏性线性扩增获得足量完整的RNA，有效偶联AffymetrixGeneChiparrayHGU133Plus2.0聚寡核苷酸表达谱芯片，筛选乳腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异表达的功能基因群(Wu，M.，Han，L.，Shi，Y.，Xu，G.，Wei，J.，You，L.，Chen，Y.，Zhu，T.，Li，Q.，Li，S.，etal.(2010).Developmentandcharacterizationofanovelmethodfortheanalysisofgeneexpressionpatternsinlymphaticendothelialcellsderivedfromprimarybreasttissues.JCancerResClinOncol136，863-872)。首次发现基因Semaphorin4C(SEMA4C)在乳腺癌组织淋巴内皮细胞中高度表达，如表1所示。

表1乳腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异高表达的部分功能基因

在芯片结果的基础上，本发明人对差异表达最为显著的基因SEMA4C进行了进一步研究。通过免疫组织化学技术(免疫组织化学技术为本领域的常规技术，具体方法可以参考文献：叶双梅(2012)信号素分子4C在食管癌、胃癌和直肠癌中的表达及其意义。中华医学杂志，92(28).)验证了膜型Sema4C在乳腺癌组织中的表达水平的改变，初步发现Sema4C的表达在肿瘤组织中明显高于癌旁正常组织，如图1所示。

实施例2：分析膜型Sema4C表达与临床病理参数的关系

膜型Sema4C在乳腺癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系见表2。卡方检验分析表明，模型Sema4C阳性表达更易发生于淋巴结转移和乳腺癌组织分型为III型的患者。膜型Sema4C阳性表达组患者的淋巴结转移发生率为82.9％(68/82)明显高于未转移组的13.6％(11/81)。另外，组织分型在两组间的分布率也有差别，乳腺癌组织分型为I型、乳腺癌组织分型为II型患者中Sema4C的表达阳性率为47.9％(59/123)和乳腺癌组织分型为III型患者中的表达阳性率为77.5％(31/40)；在雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)阴性的患者中膜型Sema4C的表达高于在雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性的患者。膜型Sema4C的表达与患者年龄无明显相关(p＞0.05)。

表2SEMA4C表达与临床病理参数间的关系(163例乳腺癌患者)

实施例3：发现分泌型Sema4c蛋白的存在

步骤1

用含EDTA的胰酶(购自Gibco公司，商品名为TYPSIN，其中胰酶的的质量体积比为0.25％)消化收集MD-MBA-231细胞(来自ATCC)，使贴壁的细胞从培养瓶壁上面脱落下来。1×PBS洗涤(其成分为140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa₂HPO₄、1.8mMKH₂PO₄，pH值为7.4)，1000rpm离心5分钟，弃上清，根据细胞量加入蛋白裂解液(碧云天P0013)，裂解30min，4℃12,000rpm，离心15分钟，取上清用考马斯亮蓝染液于紫外分光光度测定OD₅₉₅值后根据标准曲线计算浓度，蛋白定量分别为30ug和50ug后置于-80℃备用，得到细胞总蛋白。

步骤2

用容积为75cm的培养瓶培养ATCC来源MD-MBA-231细胞，待细胞达到70％融合度时换成10mL无血清1640培养基(购自GIBICO公司)培养24小时，收取5瓶上清约50mL，利用低温冻干机冻干成粉末状后，加入5mL蛋白裂解液(购自碧云天，货号为P0013)，溶解后，用考马斯亮蓝染液于紫外分光光度计测定OD₅₉₅值后根据标准曲线计算浓度，蛋白定量分别为30ug和50ug后置-80℃备用，得到上清中的分泌型蛋白。

步骤3

分别将步骤1得到的50ug和30ug细胞总蛋白样品以及步骤2得到的50ug和30ug上清中的分泌型蛋白分别置于2×SDS样品上样缓冲液中，100℃同时变性5分钟，顺序加样到10％的SDS-PAGE凝胶中，通过10％的SDS-PAGE分离，采用湿氏电转仪(Bio-Rad)恒流350mA冰浴转膜1h20min转到0.2mm的PVDF膜，质量体积比5％脱脂牛奶37℃封闭1小时，加一抗多克隆抗体anti-SEMA4C(将原液按照体积比稀释400倍，原液为购自RD公司的多克隆抗体，货号为AF1625)孵育过夜；加二抗(原液为DonkeyantisheepIgG-HRP，工作液的浓度是将原液按照体积比稀释1000倍，购自proteintech，USA)，室温下孵育1小时，化学发光(SuperSignalWestpicoChemiluscentSubstrate，34080，Pierce)，根据试剂盒的说明书进行显影、定影，利用上述WesternBlotting方法检测MD-MBA-231细胞总蛋白(即步骤1得到的蛋白)和上清中分泌型Sema4C蛋白(即步骤2得到的蛋白)的结果见图2。

同时采用另外一种方法确定分泌型Sema4c蛋白的存在，收取步骤2得到的细胞上清委托上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析，分析结果见图3，检测到分泌型Sema4C蛋白肽段的存在。其中，图3展示的是质谱分析得到的Sema4C蛋白的其中2个肽段(AVESDCYAEQVVAR及DLPAEQPGSFLYDAR)的信号强度。根据质谱图表明了质谱能检测到分泌型Sema4C蛋白肽段的存在。

实施例4构建以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒

以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒为ELISA检测试剂盒，包括：包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体、检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体、标准品、包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、显色液、反应终止液。

1)标准品为Sema4C人重组蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，其合成方法为在昆虫细胞sf9中真核表达并经过亲和纯化，母液的浓度为100ng/uL。

2)包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体(作为包被抗体)，购自R&D，目录号为AF6125，母液浓度为0.2mg/mL，利用PBS稀释50倍后的工作液的浓度为4ug/mL。

3)检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体(作为检测抗体)，购自R&D，目录号为MAB6125，母液的浓度为0.2mg/mL，利用生物素标记后，使用时，将生物素标记的小鼠抗人Sema4C单克隆抗体稀释500倍得到的工作液浓度为0.4ug/mL。

4)链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体(即Streptavidin-HRPIgG)，购自R&DSystems，Catalog#DY998，母液的浓度为0.5mg/mL。

5)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(即PBS)，其成分为140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa₂HPO₄、1.8mMKH₂PO₄，pH值为7.4。

6)洗涤液为添加了体积分数为0.05％的Tween-20的包被缓冲液。

7)封闭液为含有体积分数为1％的牛血清白蛋白的包被缓冲液。

8)加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl、0.5MKCl、体积分数为1％的牛血清白蛋白、体积分数为0.05％的Tween-20，pH值为8.4。

9)显色液TMB，购自R&DSystems，Catalog#DY999。

10)所述反应终止液的成分为2MH₂SO₄。

实施例5：以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒的使用方法

1)收集血清样本并按照常规血清分离方法处理，得到血液上清；

2)在96孔酶标板中，每孔加入100uL浓度为4ug/mL绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，4℃孵育24h；弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，用洗涤液洗三次，每次洗涤5分钟，滤纸吸干；

3)每孔加入200uL封闭液封闭2h(37℃条件下封闭)，弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，用洗涤液洗三次，每次洗涤5分钟，滤纸吸干；

4)每孔加入标准品或待检测的血液上清100uL，留出阴性对照孔加PBS做空白对照，37℃孵育2h后，弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，用洗涤液洗三次，每次洗涤5分钟，滤纸吸干；

5)每孔加入100uL小鼠抗人Sema4C单克隆抗体(已生物素化，浓度为0.4ug/mL)，37℃孵育2h，孵育时加盖封口膜，孵育完成后弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，用洗涤液洗三次，每次洗涤5分钟，滤纸吸干；

6)每孔加入100uLStreptavidin-HRPIgG(浓度为0.5mg/mL)，加盖封口膜，37℃条件下避光反应20分钟；

7)每孔加入100uLTMB显色，室温反应20分钟；

8)每孔加入50uL2MH₂SO₄终止反应；

9)在酶标仪中测定OD₄₅₀和OD₅₇₀值(450nm，570nm，BIO-RADModel)。

实施例6标准曲线的制备

将实施例5的步骤4)分别添加不同浓度的标准品，标准品的浓度分别为0ng/mL、0.78125ng/mL、1.5625ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。其余步骤均同实施例5。

根据标准品测定的OD_450-570值(即利用OD₄₅₀测的数值减去OD₅₇₀测得的数值)，利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线，横坐标为待测样品中分泌型Sema4C蛋白的浓度，纵坐标为OD_450-570值；测得标准曲线的方程为：y＝0.0271x+0.0353，其中，y为样品孔的吸光度(OD_450-570值)，x为血清中分泌型Sema4C蛋白绝对含量(ng/mL)。标准曲线如图4所示，R-Square(即标准曲线的回归系数)为0.999，表示该试剂盒在技术上合格。

根据特异性识别血清中分泌型Sema4C蛋白含量，判断患者是否患有恶性乳腺肿瘤。

实施例7利用以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒检测样品

首先，收集血清，按常规血清分离方法，抽取5mL静脉血，促凝管中凝固后，2000g离心10分钟，吸出上层血清，-80℃冻存，使用前4℃解冻。

接下来，按照实施例5所述的检测方法，对乳腺癌癌患者血清样本(n＝982)进行检测，并以标准品、正常个体血清样品(n＝440)及乳腺良性病变(n＝161)作为对照。对该检测结果进行利用软件Spass16.0进行如下的统计学分析。

Cutoff值的确定：根据统计结果中各可能切点的灵敏度和特异度，计算Youden指数，并选择其最大的切点为临界点，确定血浆中含量≥3.405ng/mL为ROC曲线上的最佳临界点，即Cutoff值(如图5所示)。分泌型Sema4C蛋白含量诊断恶性乳腺肿瘤的为84.4％，特异度为93.9％。

Sema4C在乳腺癌患者及正常人群血清中的表达差异，乳腺癌患者分为未转移组及转移组之间表达差异，及治疗后乳腺癌患者Sema4C表达情况。根据实施例6获得的公式y＝0.0271x+0.0353计算出的浓度比较如图6所示。浓度均值(正常个体)＝1.91ng/mL，浓度均值(良性病变)＝2.78ng/mL，浓度均值(乳腺肿瘤患者)＝6.01ng/mL，利用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，Sema4C在乳腺癌中表达高于乳腺良性病变和正常个体，具有统计学差异(图6A)；乳腺癌患者分为未转移组、转移组和复发组，未转移组均值＝4.9ng/mL，转移组均值＝6.15ng/mL，复发组均值＝6.87ng/mL，统计分析发现乳腺癌中Sema4C浓度转移组高于未转移组，且复发患者Sema4C表达明显高于转移组和未转移组(图6B)。另外，随着治疗的进行，患者血清中Sema4C浓度逐渐降低，具有统计学差异，提示Sema4C浓度可能成为乳腺癌治疗效果评估的指标，未治疗组、化疗后术前、术后、术后化疗后浓度均值分别为8.44ng/mL、5.99ng/mL、4.45ng/mL、3.08ng/mL(图6C)。

实施例8：对比实施例

为了验证本技术方案所具备的有益效果，同时设置了其他的条件进行对比试验。

采用Sema4C人重组蛋白为标准品，所述Sema4C人重组蛋白为分泌型Sema4C蛋白，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，利用实施例6所示的方法制作标准曲线。

选取敏感特异配对包被抗体和检测抗体利用方阵滴定法来验证本发明所述的技术的检测条件的有益效果。其中包被抗体为绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，检测抗体为生物素标记后小鼠抗人Sema4C单克隆抗体。

如表3所示，设置不同的包被抗体浓度和检测抗体浓度。

表3添加的标准品的浓度示意图

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125
B	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25
													C	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5
D	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
													E	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125	3.125
F	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25	6.25
													G	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5
H	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25

注：表3中的标准品的浓度的单位为ng/mL，编号1-12代表行号，编号A-H代表列号。

包被抗体浓度的设置：

将包被抗体用包被缓冲液稀释为8ug/mL、4ug/mL、2ug/mL等浓度按列包被96孔板(96孔酶标板，康宁公司，美国)，每个浓度包被两列，共设两组，第一组的所在的列的编号为1-6，第二组所在的列的编号为7-12。

标准品浓度的设置：

向编号A1至A12的孔中、编号E1至E12的孔中均加入弱阳性抗原(Sema4C人重组蛋白浓度为3.125ng/mL)；

向编号B1至B12的孔中、编号F1至F12的孔中均加入弱阳性抗原(Sema4C人重组蛋白浓度为6.25ng/mL)；

向编号C1至C12的孔中、编号G1至G12的孔中均加入强阳性抗原(Sema4C人重组蛋白浓度为12.5ng/mL)；

向编号D1至D12的孔中、编号H1至H12的孔中均加入强阳性抗原(Sema4C人重组蛋白浓度为25ng/mL)。

检测抗体浓度的设置：

将检测抗体用加样缓冲液稀释为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL四个浓度，分别加入上述孔中。其中，编号A1至A6、B1至B6、C1至C6、D1至D6的孔中加入浓度为400ng/mL检测抗体；编号A7至A12、B7至B12、C7至C12、D7至D12的孔中加入浓度为200ng/mL检测抗体；编号E1至E6、F1至F6、G1至G6、H1至H6的孔中加入浓度为100ng/mL检测抗体；编号E7至E12、F7至F12、G7至G12、H7至H12的孔中加入浓度为400ng/mL检测抗体。

加底物(TMB)显色，加酸(硫酸，浓度为2M，体积为50uL)终止反应。分别读取吸光度OD_450-570值(450nm，570nm，BIO-RADModel)。

其余详细的具体步骤(如添加各种试剂的体积、洗涤等等过程)均参照实施例5。

根据实验的检测结果，本技术方案设置的包被抗体的工作浓度以及检测抗体的工作浓度，强阳性抗原液OD值在1.0-3.0左右，阴性参考OD值＜0.2，远远好于其他检测条件，符合构建试剂盒所需达到的标准。本技术方案选取的包被抗体的工作浓度为4ug/mL为最佳工作浓度，本技术方案选取的检测抗体的工作浓度为0.4ug/mL为最佳工作浓度远远好于设置的其他浓度的检测效果。

工业实用性

本发明提供的试剂盒是一种可用于临床检测的实用性试剂盒，通过检测患者血清中Sema4C的水平来协助乳腺癌的早期诊断、预测预后、评估疗效及随访监测以期早期发现肿瘤复发和转移。在目前没有理想的乳腺癌肿瘤标记物的现状下，分泌型Sema4C蛋白的发现，为乳腺癌提供了优于目前临床常用的血清学标记物CA153和CEA(Molina，R.，Jo，J.，Filella，X.，Zanon，G.，Pahisa，J.，Munoz，M.，Farrus，B.，Latre，M.L.，Escriche，C.，Estape，J.，etal.(1998).c-erbB-2oncoprotein，CEA，andCA15.3inpatientswithbreastcancer：prognosticvalue.BreastCancerResTreat51，109-119.；Robertson，J.F.，Jaeger，W.，Syzmendera，J.J.，Selby，C.，Coleman，R.，Howell，A.，Winstanley，J.，Jonssen，P.E.，Bombardieri，E.，Sainsbury，J.R.，etal.(1999).Theobjectivemeasurementofremissionandprogressioninmetastaticbreastcancerbyuseofserumtumourmarkers.EuropeanGroupforSerumTumourMarkersinBreastCancer.EurJCancer35，47-53.)。本发明所述的分泌型Sema4C的灵敏度和特异性均高于CA153和CEA单独使用时的灵敏度和特异性。因此，利用本发明的试剂盒，可以结合影像学检查来开展无创性乳腺癌术前早期诊断及术后监测。且由于该生物标志物是一个独立预后因子，与淋巴结转移明显相关，因此可以预测预后、监测病情、指导治疗。该标志物有望成为乳腺癌治疗新的靶点，为乳腺癌个体化治疗带来新的思路和方案。

分子标志物的血清学检测是基础研究结果向临床实际应用迈进的手段，鉴于以上结果及SEMA4C分泌蛋白的发现，本发明人进一步尝试开发了人血清学检测试剂盒-双抗夹心ELISA试剂盒。酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原和抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。其中双抗体夹心法是检测抗原的最常用的方法。实验结果证实试剂盒构建成功。该试剂盒对乳腺癌患者的可信检出率为80.04％，通过该试剂盒，本发明人发现正常个体与乳腺癌患者血清Sema4C含量有显著差异。

本发明中的一些术语与缩写：mAb：单克隆抗体，monoclonalantibody；pAb：多克隆抗体，polyclonalantibody；BSA：牛血清白蛋白；Tween-20；IgG：免疫球蛋白G；TMB：四甲基联苯胺；OD：吸光度。

需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，所述分泌型Sema4C蛋白为膜型Sema4C蛋白的胞外段，包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中插入一段标签序列。

3.根据权利要求1或2所述一种分泌型Sema4C蛋白，其特征在于，所述分泌型Sema4C蛋白以分泌形式存在且能够在人血清中被检测到。

4.一种编码权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白的核苷酸序列。

5.一种权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物的应用。

6.一种权利要求1或2所述的分泌型Sema4C蛋白作为肿瘤标志物在乳腺癌术前检测及术后监测中的应用。

7.一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体、检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体、标准品，所述标准品为Sema4C人重组蛋白，所述Sema4C人重组蛋白包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，

1)所述包被到酶标板上的绵羊抗人Sema4C多克隆抗体，母液浓度为0.2mg/mL，稀释50倍后的工作液的浓度为4ug/mL；

2)检测抗体为小鼠抗人Sema4C单克隆抗体，母液的浓度为0.2mg/mL，利用生物素标记后，使用时，将生物素标记的小鼠抗人Sema4C单克隆抗体稀释500倍得到的工作液浓度为0.4ug/mL；

3)链霉亲和素-辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG多克隆抗体，母液的浓度为0.5mg/mL；

4)标准品，母液的浓度为100ng/uL。

9.根据权利要求7或8所述一种含有分泌型Sema4C蛋白的试剂盒，其特征在于，还包括包被缓冲液、洗涤液、封闭液、加样缓冲液、显色液、反应终止液。

10.根据权利要求9所述一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，

1)所述包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，其成分为140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa₂HPO₄、1.8mMKH₂PO₄，pH值为7.4；

2)所述洗涤液为添加了体积分数为0.05％的Tween-20的包被缓冲液；

3)所述封闭液为含有体积分数为1％的牛血清白蛋白的包被缓冲液；

4)所述加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl、0.5MKCl、体积分数为1％的牛血清白蛋白、体积分数为0.05％的Tween-20，pH值为8.4；

5)所述反应终止液的成分为2MH₂SO₄。