CN109557321A

CN109557321A - 一种鹅催乳素的双抗体夹心elisa检测方法

Info

Publication number: CN109557321A
Application number: CN201811450039.8A
Authority: CN
Inventors: 施振旦; 陈蓉; 朱欢喜
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明公开一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，属于生物技术领域的免疫学检测方法；本发明以抗原亲和纯化的催乳素抗体为捕获抗体，生物素标记的催乳素抗体为检测抗体，鹅催乳素重组蛋白为标准品，建立了一种检测鹅催乳素的双抗体夹心ELISA方法；该方法易于操作，灵敏度高，重复性好，能够准确检测鹅血浆中催乳素浓度的变化，弥补了国内外水禽催乳素检测方法的不足。

Description

一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域的免疫学检测方法，具体涉及一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法。

背景技术

催乳素(Prolactin,PRL)是一种主要由动物垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质激素。在哺乳动物中，PRL的主要作用是促进乳腺发育，刺激并维持泌乳。在禽类中，PRL的主要作用是促进和维持就巢，以及感受光周期调节禽类的季节性繁殖。

PRL的定量检测方法包括生物学测定方法和免疫学测定方法。生物学测定方法包括鸽嗉囊促进实验、兔泌乳促进实验和Nb2型淋巴细胞增殖实验等。虽然生物学测定方法能够检测具有生物学活性的PRL含量，但是其检测限高、重复性差、耗时长。免疫测定方法则利用了抗原-抗体反应，其特异性强，灵敏度高。其中，放射免疫法(RIA)的灵敏度比酶联免疫法(ELISA)高，但其缺点也十分明显，如同位素标记有效期短、损害实验人员健康和危害环境等。化学发光和电化学发光法的灵敏度优于RIA法和ELISA法，但其需要的仪器昂贵，且都为针对人PRL开发的封闭系统，限制了它的广泛使用。因此，ELISA法因其灵敏度高，简单快速，重复性较好，避免了RIA法的缺点，受到众多实验室的欢迎。

目前，国内外许多厂商开发了分别适用于人类以及鼠、猪、羊、牛和鸡等动物的PRLELISA试剂盒，但是缺乏适用于水禽如鸭和鹅的PRLELISA试剂盒。虽然鸡和鸭、鹅PRL蛋白之间的氨基酸序列同源性较高，但是将鸡PRL ELISA试剂盒应用于水禽PRL的定量检测，目前尚无文献报道。目前市场上销售的一些鸭和鹅PRLELISA检测试剂盒，其检测灵敏度无法验证，且不能实现鹅PRL的定量检测。此外，这些商品化试剂盒中所使用的PRL标准品大多是从动物垂体中提取的天然PRL蛋白，其提取纯化的工艺步骤复杂、难度大、产量低，使得目前的试剂盒售价均高昂。

成熟的人PRL蛋白是由199个氨基酸残基组成的多肽，分子量为23kD。但是，正常人的血清中存在着多种形式的PRL异构体，分子量主要为16，22，23，48和56kD。这些不同分子量的PRL异构体是由PRL转录产物的可变剪接，翻译后修饰(如糖基化和磷酸化)以及多聚体化等原因造成的，其对于PRL生理功能的发挥具有重要作用。已有文献报道，以兔抗鸡PRL多克隆抗体为检测抗体，在鸡和鹅垂体提取物中均发现了从20-45kD范围内5种不同分子量的PRL异构体，这表明在鸡和鹅体内也存在着多种PRL异构体。因此，在开发禽类PRL的ELISA检测方法时，抗PRL抗体是否能够特异性识别多种PRL异构体是至关重要的。目前，文献报道的兔抗鸡PRL多克隆抗体是采用鸡垂体提取的天然PRL蛋白作为抗原获得的。由于动物体内天然蛋白的提取困难，通常采用基因工程技术生产的重组蛋白作为替代品来获得抗PRL抗体。目前，基因工程技术多采用原核蛋白表达系统生产重组蛋白，该重组蛋白不存在翻译后修饰，与天然蛋白相似度较低。随着对水禽卵泡发育和产蛋调控技术等研究的深入，迫切需要开发一种适用于测定水禽PRL的ELISA检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明利用基因工程技术制备鹅PRL重组蛋白，并通过制备相应的高特异性抗体，建立了一种具有灵敏度高、特异性强、准确、方便操作的鹅PRL双抗体夹心ELISA检测方法，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测；所述鹅PRL重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述鹅PRL多克隆抗体是通过如下方法制备的：首先利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清，然后对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和纯化后，获得鹅PRL多克隆抗体；其中，所述利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔具体步骤如下：选取2只2月龄雌性新西兰大白兔，将鹅PRL重组蛋白与弗氏佐剂等量混合后进行首次免疫和加强免疫，每次颈背部皮下多点注射抗原0.5mg，每隔3周加强免疫1次；第2次加强免疫后，选择抗血清ELISA效价大于50K的新西兰大白兔，进行颈动脉取血；将获得的血样在37℃生化箱中倾斜放置2h，使其完全凝固，再转至4℃过夜，使血凝块进一步收缩，第二天将析出的血清吸出，即获得了含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清；所述对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和纯化，具体步骤如下：1)将鹅PRL重组蛋白偶联到溶胀后的CNBr-activated Sepharose^TM 4B上，制备抗原亲和层析柱；2)用0.2M NaHCO₃pH 9.0缓冲液以0.5mL/min流速平衡亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；3)抗血清经0.45μm滤膜过滤后以0.5mL/min流穿亲和层析柱；4)用10mM PBS pH7.4缓冲液以1mL/min流速洗涤亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；5)用100mM甘氨酸pH2.8缓冲液以1mL/min流速洗脱亲和层析柱，收集流出液，并立即用1MNaHCO₃pH 9.0缓冲液中和至中性；6)上述收集的抗体溶液加入透析袋中，置于10mM PBSpH7.4缓冲液中透析过夜，获得鹅PRL多克隆抗体。

进一步，所述生物素标记PRL抗体是通过如下方法获得的：将鹅PRL多克隆抗体用100mM碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/mL，获得抗体溶液；每1mL抗体溶液中加入120μl N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，室温、避光条件下持续搅拌90min，然后加入4.8μl 1M NH₄Cl溶液终止反应；将反应液置于10mM PBS缓冲液中透析，以去除游离的N-羟基琥珀酰亚胺生物素，获得生物素标记PRL抗体。

进一步，本发明所述以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测的具体步骤为：

1)用PBS缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至5μg/mL，加入酶标板中，4℃孵育过夜；次日弃去液体，加入含有质量百分数为5％牛血清白蛋白的PBST溶液，37℃孵育1h；再次弃去液体，PBST溶液洗板，备用；

2)标准品检测：

用PBST将鹅PRL重组蛋白依次稀释至浓度为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5ng/mL，加入步骤1)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板；

3)待测样本检测：

用PBST溶液将待测样本稀释至标准品浓度范围内，加入步骤1)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板；

4)用PBST溶液将生物素标记PRL抗体稀释至0.14μg/mL，分别加入步骤2)和步骤3)获得的酶标板中，37℃孵育1h后，PBST溶液洗板；

5)用PBST溶液将链霉亲和素-过氧化物酶结合物按照体积比1:12000稀释后，加入步骤4)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h；弃去反应液，PBST溶液洗板；

6)加入TMB显色液，37℃孵育10min后，加入1M盐酸；然后置于酶标仪上读取450nm处的OD值；

以PRL标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程，回归方程为y＝0.1396x+0.0224，R²＝0.99；

然后将待测样本的OD值带入所述回归方程，即获得待测样本中鹅催乳素浓度。

与现有技术相比，本申请提供的检测方法具有以下有益效果：

1、本发明采用基因工程的方法生产鹅PRL重组蛋白作为标准品，可以弥补从动物垂体提取PRL纯品的不足，试剂盒价格昂贵的问题；本发明检测方法操作简单，蛋白产量高，价格相对便宜。

2、本发明采用哺乳动物细胞表达鹅PRL重组蛋白，所表达的鹅PRL重组蛋白存在着翻译后修饰，与天然蛋白相似度较高，且基于它产生的抗体也能够识别多种鹅PRL异构体，因此制备的抗原亲和纯化抗体特异性高。运用本发明检测鹅PRL的线性检测范围为0-12.5ng/mL，灵敏度为0.39ng/mL，批内和批间变异系数分别低于10％和15％。

3、本发明检测方法仅需3-4个小即可测得结果，且操作简单，且一块96孔板可检测82个样品。本发明为科研和生产中鹅PRL的快速检测提供了可靠的手段。本发明便于操作、使用成本低、稳定性和重复性好，适合大规模推广应用。

附图说明

图1为鹅PRL重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图中：M为蛋白Marker；1为纯化后的鹅PRL重组蛋白(箭头指示)。

图2为鹅PRL多克隆抗体的Westernblot检测图。

图中：M为蛋白Marker；1为产蛋鹅脑垂体组织；1为产蛋鸭脑垂体组织；1为产蛋鸡脑垂体组织。

图3为标准曲线和血清倍比稀释曲线图。

图4为不同生理状态下鹅血浆PRL浓度的变化示意图。

图5为人工光周期处理下公鹅血浆PRL浓度的变化示意图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1鹅PRL重组蛋白的制备

根据Genbank中收录的鹅催乳素基因序列(Genbank号：DQ345782)，采用基因合成技术合成鹅PRL成熟肽编码序列(第91-687位碱基)，然后用T4DNA连接酶连接至含有His标签蛋白序列的商业化真核表达载体pAZ-V5中，构建pAZ-V5-PRL重组表达载体。将测序正确的阳性克隆，用无内毒素质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)进行质粒抽提。

宿主细胞用商业化的Invitrogen FreeStyle^TM 293F细胞(购自Invitrogen公司)。当293F细胞处于对数生长期，活力大于95％，细胞密度为1.8-2.2*10⁶时进行质粒转染。

转染方法如下：1)将转染试剂PEI(购自Polyscience公司)和转染缓冲液提前37℃预热，质粒DNA提前室温预热10min；2)转染体系为每27mL细胞培养液加入3mL转染缓冲液，其中含质粒DNA 30ug，PEI 90ug；3)将所需质粒DNA及PEI添加入转染缓冲液里面，充分混匀，37℃孵育7min；4)将孵育好的混合物添加到293F细胞培养液中，37℃悬浮培养；5)转染24h后，补充N源和生长因子；6)第6天进行计数细胞，观察细胞状态及死亡率，待细胞活率下降至50％以下，离心收集细胞培养上清液。

将收集的细胞培养上清液用Ni-IDA亲和层析柱(购自Thermo公司)进行纯化。具体方法如下：1)用Balance buffer(50mM Tris，300mM NaCl，PH7.4)缓冲液以0.5mL/min流速平衡Ni柱，至流出液OD280值到达基线；2)细胞上清液以0.5mL/min流穿Ni柱；3)用WashingBuffer(30mM咪唑，50mM Tris，300mM NaCl，PH7.4)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；4)用Elution Buffer(300mM咪唑，50mM Tris，300mM NaCl，PH7.4)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，置于10mM PBS缓冲液(pH7.4)透析过夜，然后进行SDS-PAGE电泳检测(见图1)。由图1可见，在25kD处有一条蛋白条带，纯度高达95％，与预期的PRL蛋白大小相符合，说明鹅PRL重组蛋白成功地在哺乳动物细胞中进行了表达。本实施例获得的重组蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2鹅PRL多克隆抗体的制备

鹅PRL多克隆抗体的制备，是用实施例1中获得的鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得的，具体制备过程如下：选取2只2月龄雌性新西兰大白兔，将鹅PRL重组蛋白与弗氏佐剂(购自Sigma公司)等量混合后进行首次免疫和加强免疫，每次颈背部皮下多点注射抗原0.5mg，每隔3周加强免疫1次。首次免疫前采血作为阴性对照。每次加强免疫后1周，采血，进行间接ELISA检测，确定抗血清效价。第2次加强免疫后，选择抗血清ELISA效价更好(大于50K)的1只新西兰大白兔，进行颈动脉取血。血样在37℃生化箱中倾斜放置2h，使其完全凝固，再转至4℃过夜，使血凝块进一步收缩。第二天将析出的血清小心的吸出，-20℃保存备用(避免反复冻融)，即获得了含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清。

将上述抗血清用抗原亲和纯化的方法进行纯化，获得针对鹅PRL的特异性多克隆抗体。其具体操作步骤如下：1)将鹅PRL重组蛋白偶联到溶胀后的CNBr-activatedSepharose^TM 4B(购自GE公司)上，制备抗原亲和层析柱；2)用0.2M NaHCO₃pH 9.0缓冲液以0.5mL/min流速平衡亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；3)抗血清经0.45μm滤膜过滤后以0.5mL/min流穿亲和层析柱；4)用10mM PBS pH7.4缓冲液以1mL/min流速洗涤亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；5)用100mM甘氨酸pH2.8缓冲液以1mL/min流速洗脱亲和层析柱，收集流出液，并立即用1MNaHCO₃pH 9.0缓冲液中和至中性；6)上述收集的抗体溶液加入透析袋中，置于10mM PBS pH7.4缓冲液中透析过夜，获得鹅PRL多克隆抗体。

实施例3鹅PRL多克隆抗体的特异性检测

分别选取产蛋期母鹅、母鸡和母鸭各1只，采集脑垂体组织并提取组织总蛋白。取适量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳并转印至PVDF膜上，使用实施例2中获得的鹅PRL多克隆抗体作为一抗进行孵育(抗体稀释比例为1:10000)，然后使用商品化的山羊抗鸡IgY酶标二抗进行检测。

检测结果如图2所示，由图2可见，在产蛋鹅和鸭垂体组织中，鹅PRL多克隆抗体分别能够识别6条特异性条带，大小在20-55KD之间；在产蛋鸡垂体组织中，该抗体仅能识别4条特异性条带，缺少20和35KD左右的特异性条带(图2)。这些特异性条带分别对应于不同的PRL异构体，它们来源于PRL蛋白翻译后的糖基化和磷酸化修饰等。这些结果表明实施例2中获得的鹅PRL多克隆抗体特异性识别鹅和鸭PRL的能力更强。同时也说明本检测方法中使用的鹅PRL多克隆抗体对PRL异构体有很好的检测效果。

实施例4生物素标记PRL抗体的制备

将实施例2中获得的鹅PRL多克隆抗体用100mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)稀释至1mg/mL。向每1mL抗体溶液中加入120μl N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液(购买自Sigma公司，DMSO溶解至1mg/mL)，室温、避光条件下持续搅拌90min，然后加入4.8μl 1M NH₄Cl溶液(pH9.6)终止反应。将反应液置于10mM PBS缓冲液(pH7.4)下充分透析，以去除游离的N-羟基琥珀酰亚胺生物素，获得生物素标记PRL抗体。

实施例5双抗体夹心ELISA方法的建立

(1)PRL抗体包被：用10mM PBS缓冲液(pH7.4)将实施例2中鹅PRL多克隆抗体稀释至5μg/mL，加入酶标板中，每孔100μl，4℃孵育过夜；

(2)封闭：弃去包被液，在吸水纸上拍干，加入含有5％牛血清白蛋白的PBST溶液(含0.05％Tween-20的10mM PBS缓冲液，pH7.4)，每孔200ul，37℃孵育1h；

(3)洗板：弃去封闭液，PBST溶液洗板1次，在吸水纸上拍干；

(4)标准品和待测样本：

A、待测样本的制备与保存

使用EDTA-Na₂抗凝管收集鹅血液样本后，1000g离心20min，收集上清，获得鹅血浆样本，-20℃保存，备用；

B、待测样本的稀释

待测样本进行检测前估算其中目标蛋白的浓度，并选择合适的稀释倍数，本实施例待测样本稀释至浓度为5.5、2.75、1.375、0.6875ng/ml。

在具体实施中，稀释后的目标蛋白浓度落在标准品的浓度范围内，均可实现检测目的。

C、用PBST溶液将实施例1中鹅PRL重组蛋白进行倍比稀释，浓度为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5ng/mL，加入酶标板中，每孔100ul，37℃孵育0.5h；D、用PBST溶液将待测样本稀释至标准品浓度范围内，加入酶标板中，每孔100ul，37℃孵育0.5h；

(5)洗板：弃去反应液，PBST溶液洗板3次，在吸水纸上拍干；

(6)生物素标记物：用PBST溶液将实施例4中生物素标记催乳素抗体稀释至0.14μg/mL，加入酶标板中，每孔100ul，37℃孵育1h；

(7)洗板：弃去反应液，PBST溶液洗板3次，在吸水纸上拍干；

(8)酶标记物：用PBST溶液将链霉亲和素-过氧化物酶结合物(购自碧云天公司)稀释至工作液(1:12000)，加入酶标板中，每孔100ul，37℃孵育0.5h；

(9)洗板：弃去反应液，PBST溶液洗板5次，在吸水纸上拍干；

(10)显色：加入TMB显色液(含有0.1mg/mL TMB和0.02％H2O2的0.05M柠檬酸缓冲液，pH4.5-5.5)，每孔100ul，37℃孵育10min；

(11)终止：加入1M盐酸，每孔100ul；

(12)读数：置于酶标仪上读取450nm处的吸光度。

以PRL标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程。

本实施例建立的标准曲线如图3所示，回归方程为y＝0.1396x+0.0224(R²＝0.99)。由图3可见，该ELISA方法的线性检测范围为0-12.5ng/mL，且鹅血浆的倍比稀释曲线与标准曲线相平行。说明了此方法的有效性，可以作为准确检测鹅PRL的方法。

实施例6 ELISA方法的灵敏度检测

按照实施例5所确立的ELISA方法，设置10个空白对照孔，测定它们的OD值，并计算出平均值和标准差。根据标准曲线的回归方程，计算出平均值加上两个标准差后的对应PRL浓度为0.39ng/mL，此浓度即为该ELISA方法的灵敏度。

实施例7 ELISA方法的准确性检测

按照实施例5所确立的ELISA方法，选取3个不同PRL浓度的鹅血浆样本，分别在同一块酶标板上重复检测6次，计算该ELISA方法的批内变异系数小于10％；分别在3块独立的酶标板上各重复检测6次，计算该ELISA方法的批间变异系数小于15％。说明本方法检测准确程度较高(根据根据药审中心发布的《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》规定一般情况下酶法小于20％即为合格)。

实施例8利用ELISA方法检测不同生理状态下鹅血浆PRL的浓度变化本实施例将实施例5所确立的ELISA方法进行了具体的实际应用，具体实施方案如下：分别选取处于就巢期、开产期、产蛋高峰期和停产期的鹅各12只，翅静脉采血，分离血浆后进行PRL浓度的测定。

检测结果如图4所示，由图4可见，鹅血浆中PRL浓度在就巢期最高，开产时降至最低，然后随着产蛋活动的进行逐渐升高。该变化模式与PRL维持禽类就巢、抑制产蛋的理论相一致。也说明了本发明所建立的鹅血浆PRL ELISA检测方法是准确可靠的。

实施例9利用ELISA方法检测人工光周期处理下鹅血浆PRL的浓度变化

将实施例5所确立的ELISA方法进行了具体的实际应用，具体实施方案：选取人工光周期处理下不同时间点的公鹅各10只，翅静脉采血，分离血浆后进行PRL浓度的测定。

检测结果如图5所示，由图5可见，在8h短光照处理时，公鹅血浆PRL浓度低于5ng/mL；当日光照时间由8h增加至12h后，公鹅血浆PRL浓度逐渐升高，达到峰值20ng/mL，然后逐渐下降至5ng/mL；当日光照时间增加至16h后，公鹅血浆PRL浓度急剧升高，达到峰值30ng/mL，然后迅速下降。该变化模式符合短时间的长光照处理促进鹅的繁殖活动，而长时间的长光照处理抑制鹅的繁殖活动的光周期调控理论。也说明了本发明所建立的鹅血浆PRLELISA检测方法是准确可靠的。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据本发明说明书中公开的内容，结合本领域的基本常识或惯用手段，对本发明做出的非实质性的延伸，都没有超出本发明权利要求限定的范畴。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法

<141> 2018-11-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Pro Ile Cys Pro Asn Gly Ser Ala Asn Cys Gln Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Leu Phe Asp Arg Ala Val Lys Leu Ser His Tyr Ile His Phe Leu

20 25 30

Ser Ser Glu Met Phe Asn Glu Phe Asp Glu Arg Tyr Ala Gln Gly Arg

35 40 45

Gly Phe Ile Thr Lys Ala Val Asn Gly Cys His Thr Ser Ser Leu Thr

50 55 60

Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Ile His His Glu Asp Leu

65 70 75 80

Leu Asn Leu Val Leu Gly Val Leu Arg Ser Trp Asn Asp Pro Leu Ile

85 90 95

His Leu Ala Ser Glu Val Gln Arg Ile Lys Glu Ala Pro Asp Thr Ile

100 105 110

Leu Trp Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Asn Lys Arg Leu Leu Glu

115 120 125

Gly Met Glu Lys Ile Val Gly Arg Val His Ser Gly Asp Ile Gly Asn

130 135 140

Glu Val Tyr Ser Gln Trp Glu Gly Leu Pro Ser Leu Gln Leu Ala Asp

145 150 155 160

Glu Asp Ser Arg Leu Phe Ala Phe Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu His

165 170 175

Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Val Leu Lys Cys Arg

180 185 190

Leu Ile His Asp Ser Asn Cys His His His His His His

195 200 205

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcctatct gccccaatgg atctgccaac tgccaagttt cccttgggga actttttgac 60

cgtgcggtta aactctcaca ctacatccac ttcctctctt cagaaatgtt caatgaattt 120

gatgaacgct atgctcaggg tcggggtttc attacaaaag ctgttaatgg ctgccacact 180

tcctccttaa ccactcctga agacaaggag caagctcagc agattcacca tgaagaccta 240

ctgaatttag tactgggagt gctgcgctcc tggaatgatc ccctgatcca tctggcctct 300

gaggtacaaa gaatcaaaga agctccagac accatcctct ggaaggctgt agagattgag 360

gaacaaaaca agcggcttct agaaggaatg gagaaaatag ttgggcgggt tcattctggc 420

gacatcggaa atgaagttta ttctcagtgg gaaggccttc catccttgca acttgctgat 480

gaggactcca gactctttgc cttttacaac ctgctgcatt gcctccacag agattcccac 540

aaaattgaca actatctcaa ggttttgaag tgccgcctaa tacatgatag caattgccat 600

catcatcatc atcattaa 618

Claims

1.一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测。

2.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述鹅PRL重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述鹅PRL多克隆抗体制备方法如下：首先利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清，然后对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和层析纯化，获得鹅PRL多克隆抗体。

4.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述生物素标记PRL抗体是通过如下方法获得的：利用碳酸氢钠缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至1mg/mL，获得抗体溶液；然后每1mL抗体溶液中加入120μl N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，室温、避光条件下持续搅拌90min；再加入 NH₄Cl溶液终止反应；将反应液置于10mM PBS缓冲液中透析后，即获得生物素标记PRL抗体。

5.如权利要求1-4任一所述鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测是指：

1）用PBS缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至5μg/mL，加入酶标板中，4℃孵育过夜；次日弃去液体，加入含有质量百分数为5% 牛血清白蛋白的PBST溶液，37℃孵育1h；再次弃去液体，PBST溶液洗板，备用；

2）标准品检测：

用PBST溶液将鹅PRL重组蛋白梯度稀释后，加入步骤1）获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板，备用；

3）待测样本检测：

用PBST溶液将待测样本稀释至标准品浓度范围内，加入步骤1）获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板，备用；

4)用PBST溶液将生物素标记PRL抗体稀释至0.14μg/mL，分别加入步骤2）和步骤3）获得的酶标板中，37℃孵育1h后，PBST溶液洗板；

5)用PBST溶液将链霉亲和素-过氧化物酶结合物按照体积比1:12000稀释后，加入步骤4）获得的酶标板中，37℃孵育0.5h；弃去反应液，PBST溶液洗板；

以PRL标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程，回归方程为y=0.1396x+0.0224，R²=0.99；

6.根据权利要求5所述鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，步骤2）所述梯度稀释是指，将鹅PRL重组蛋白依次稀释至浓度为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5ng/mL。