CN105137074A - 小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法及应用。结合生物素-亲和素系统的高度放大作用和抗原-抗体识别的特异性，建立了一种用于检测小麦黄花叶病毒的新的检测方法。该检测方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度高于ELISA，与RT-PCR比较灵敏度略低，但特异性一致，因此可有效地应用于田间小麦黄花叶病毒的早期诊断和监测。该方法因高度的灵敏度和特异性而减少抗体的用量，大大节约了检测成本；生物素-亲和素的偶联放大作用，大大提高了特异和准确性；另可操作性强适用于推广应用，从而为小麦病毒病的诊断、检测及科学防控提供了技术支撑。

Description

小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法及应用。

背景技术

小麦黄花叶病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)是一种由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)传播的麦类土传病毒，禾谷多黏菌是一种专性寄生于植物根部的真核低等生物，该介体分布范围广，可在30多种禾谷类作物和杂草上寄生，且拥有抗逆性很强的休眠孢子和完成侵染循环的游动孢子，只要条件适宜，即可激发游动孢子携带病毒侵染寄主的根系，造成严重的病害。小麦黄花叶病由日本的Sawada在1927年首次发现并描述，至今仍是麦类生产上的一种重要病害。在自然条件下WYMV常与中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)复合侵染小麦，导致严重的田间病害，这两类病毒都属于真菌传棒状病毒组，电镜下观察病毒粒子为直棒状二分体。

小麦黄花叶病主要分布在日本、韩国和中国。我国目前主要分布于长江、黄河中下游和淮河流域，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里下河地区和宁镇扬丘陵地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区发生较重。该病害已经成为我国冬小麦产区的一种重要的病毒病，对小麦的产量和品质有严重影响。一般病田发病减产10％-30％，严重的达70％-80％，甚至绝收。为了监测和防控小麦黄花叶病的发生和扩散，急需建立该病害的高度特异和灵敏的检测方法。

目前，对病害的检测方法主要有直接观察法、分子生物学法和血清学方法。症状观察是判断田间发病情况的一种比较常用和直观的方法。但由于发病症状的相似性，隐症现象，以及复合侵染的情况，所以这种方法一般情况下判断不够准确。RT-PCR的检测方法虽然比较灵敏且特异性好，但由于它的花费成本大且仪器要求高，一般局限于实验室用。综合而言，血清学方法操作简便、特异性好、灵敏度高且成本低，更适用于田间大规模样品的检测，并易于在基层进行推广。WYMV的血清学检测方法是通过制备抗血清，利用ELISA或Westernblot对病毒进行检测和研究。向荣等和韩成贵等分别制备了WYMVP1和CP的抗血清，可以通过ELISA或Westernblot等血清学手段检测病毒；尚巧霞等建立了WYMVELISA检测系统。但这些以多抗建立的血清学方法未见其在田间样品大规模检测中应用的报道。因此本实验室利用提纯的WYMV病毒粒子为免疫原，经杂交瘤技术获得了几株能够高效分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞制备了腹水单抗。在常规以单抗为核心建立的能准确检测小麦中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA等血清学方法的基础上，有研究表明生物素-亲和素(Biotin-Avidin)技术是近年来发展迅速的一门生物学技术，依靠其高度的特异亲和性、复合物的稳定性、可与酶及固相载体等的偶联性、多级放大性等特点，现已广泛应用于生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等，目前应用于植物病毒的检测上还较少，基于提高WYMV血清学检测方法的灵敏度、特异性、可操作性和推广性等方面，本研究对WYMV抗体进行了配对筛选和生物素标记，建立了WYMV双抗夹心生物素-亲和素ELIAS检测方法，并成功应用于田间小麦黄花叶病毒的检测，为WYMV田间大规模快速检测的实现提供了物质和技术支撑，从而推动了小麦黄花叶病的预报预警和科学防控体系的建立。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、特异性强、应用广泛且适合大量样本检测的小麦黄花叶病毒(WYMV)双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法，包括以下步骤：

1)每孔用100uL病毒特异性抗体包被酶标板，37℃放置2h后，4℃过夜放置，洗板，甩干；

2)每孔加入200uL含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2h，洗板，甩干；

3)每孔分别加入100uL待检病毒样品、阳性和阴性样品，37℃孵育1h，洗板，甩干；

4)每孔加入100uL生物素标记的二抗，37℃孵育1h，洗板，甩干；

5)每孔加入100uL亲和素标记的酶，37℃孵育1h，洗板，甩干；

6)每孔加入100uL显色底物，37℃孵育5～15min进行显色反应，肉眼观察显色后每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD值，以大于等于阴性对照OD值3倍的作物阳性结果的阈值。

优选的，步骤1)所述病毒特异性抗体为小麦黄花叶病毒纯化单抗2D4。

优选的，步骤1)中，用PH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将病毒特异性抗体稀释为5～10ug/mL浓度后包被酶标板。

优选的，步骤1)、2)、3)、4)和5)中洗板用的洗涤液为PH7.4含0.5mol/LTween-20的磷酸盐缓冲液。

优选的，步骤4)所述生物素标记二抗为生物素标记的小麦黄花叶病毒纯化的单抗2D3，使用浓度为0.2ug/mL。

优选的，步骤5)所述亲和素标记的酶为辣根过氧化物酶。

优选的，步骤6)所述显色底物为四甲基联苯胺。

优选的，步骤6)所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

优选的，步骤6)所述OD值在波长450nm下测定。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

1)本发明结合生物素-亲和素系统的高度放大作用和抗原-抗体识别的特异性，建立了一种用于检测小麦黄花叶病毒的新的检测方法。该检测方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度高于ELISA，与RT-PCR比较灵敏度略低，但特异性一致，因此可有效地应用于田间小麦黄花叶病毒的早期诊断和监测。

2)本发明建立的检测小麦黄花叶病毒的双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法，既不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备，又可以一次性检测大量样品，不但节约了检测成本，还达到了简便、快速、稳定的检测效果。

3)本发明建立的方法因高度的灵敏度和特异性而减少抗体的用量，大大节约了检测成本；生物素-亲和素的偶联放大作用，大大提高了特异和准确性。

4)本发明建立的方法，因其操作简便、适用性强等特点，可有效地作用于田间作物中小麦黄花叶病毒的大规模检测，且可在基层推广应用，为该病毒病的预测预警和科学防控提供了物质和技术支撑。

附图说明

图1为双抗夹心生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法检测小麦黄花叶病叶的灵敏度分析图；

图2为酶联双抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)方法检测小麦黄花叶病叶的灵敏度分析图；

图3为田间小麦样品检测小麦黄花叶病毒的RT-PCR结果(M为MarkerIII；1-9为小麦样品；10为感染WYMV植株；11为健康植株)。

具体实施方式

本发明在常规酶联免疫检测方法的基础上，结合生物素与亲和素间的高度信号放大作用，建立了一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，即起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，从而大大提高了检测小麦黄花叶病毒抗原灵敏度的目的。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1

小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备：

1.免疫原的制备及免疫动物

用蔗糖硫酸铯不连续密度梯度离心法提纯小麦黄花叶病毒粒子，再用提纯的病毒粒子免疫4-5周龄体重18-20gBALB/c雌性小鼠。初次免疫：提纯的WYMV病毒粒子用生理盐水加以稀释，与等体积弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant，FC)混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射；3周后再次免疫：免疫原仍用生理盐水稀释，再与等体积的弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant，FIA)充分乳化后，进行腹腔注射；之后每隔3周进行2次加强免疫：取2倍剂量的抗原进行腹腔注射。第四次免疫3天后取脾细胞进行融合。

2.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma，分子量1500)作为融合剂，在37℃下水浴下加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

3.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，以感染WYMV的小麦叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获42个阳性孔。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得4株能分泌抗WYMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。用ACP-ELISA方法对单克隆抗体进行特异性分析发现4个抗体均能特异地与小麦黄花叶病毒反应；并对用于酶联实验的配对抗体进行分析，最终确定了最佳配对抗体细胞株2D4和2D3。

4.单克隆抗体腹水的制备及纯化

取对数生长期的杂交瘤细胞，1500rpm离心1min，细胞沉淀悬浮于加适量链霉素和青霉素生理盐水中，悬浮细胞浓度约为10⁶个/mL。取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL阵植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入0.2mL杂交瘤细胞悬浮液，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，针头刺入小鼠腹部采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06MPH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/mL腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清液，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。用亲和层析法纯化抗体，用间接ELISA方法测定了包被抗体和标记抗体的工作浓度，包被抗体2D4的使用浓度5～10ug/mL，标记抗体的使用浓度为0.2ug/mL。

实施例2

抗体的生物素标记：

1)将纯化的小麦黄花叶病毒单克隆抗体2D3用0.1mol/L的碳酸氢钠缓冲液(PH8.0)稀释到1mg/mL，用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(PH8.0)透析处理24h，得到抗体溶液；

2)用1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解NSHB(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)1mg，得到NSHB溶液；

3)将1mL抗体溶液加入120uLNSHB溶液，在室温下持续搅拌2h，再加入9.6uL1mol/L的NH4Cl，在室温下搅拌10min；

4)在4℃下，用PBS缓冲液透析24h，期间换液一次，再用分子筛柱缓慢洗脱，收集，加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及终浓度为1.0g/L的牛血清白蛋白(BSA)，再加入50％甘油，混匀，置-20℃保存。

实施例3

双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法与酶联双抗体夹心方法检测小麦黄花叶病叶的灵敏度比较分析

1.双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立及灵敏度

双抗夹心生物素-亲和素ELISA的操作步骤：

1)首先将小麦黄花叶病毒纯化单抗2D4用PH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将病毒特异性抗体稀释为5～10ug/mL浓度后包被酶标板，每孔用100uL，37℃放置2h后，4℃过夜放置，用洗涤液(PH7.4含0.5mol/LTween-20的磷酸盐缓冲液)洗板，甩干；

2)每孔加入200uL含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2h，洗板，甩干；

3)每孔分别加入100uL待检病毒样品、阳性和阴性样品，37℃孵育1h，洗板，甩干；

4)每孔加入100uL生物素标记的小麦黄花叶病毒纯化的单抗2D3，37℃孵育1h，洗板，甩干；

5)每孔加入100uL亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育1h，洗板，甩干；

6)每孔加入100uL四甲基联苯胺显色底物，37℃孵育5～15min进行显色反应，肉眼观察显色即每孔加入100uL2mol/L硫酸终止液，用酶标仪测定波长450nm下的OD值，以大于等于阴性对照OD值3倍的作物阳性结果的阈值。

用方阵试验确定检测小麦病叶的双抗夹心生物素-亲和素ELISA包被抗体、标记抗体和亲和素标记酶的最适工作浓度，试验表明包被抗体2D4的使用浓度5～10ug/mL，标记抗体(Biotin-2D3)的使用浓度为0.2ug/mL，亲和素标记酶稀释10000倍使用。

在以上工作浓度下，对WYMV病叶从1∶100至102400作倍比稀释，以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，每个处理重复3次，进行上述双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法的检测。结果表明双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法对1∶100～51200倍稀释的病叶汁液呈阳性反应(图1)，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶51200，表明该方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2.检测WYMV的TAS-ELISA检测方法

TAS-ELISA方法的操作流程：

1)5000倍稀释的抗WYMV的兔抗血清(自提纯的WYMV病毒粒子免疫兔子制备)100uL/孔包被酶标板，37℃2-4h或4℃过夜；

2)0.01mol/LPBST洗涤3次，每次静置3min，然后加5-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA封闭，200ul/孔，37℃封闭30-60min；

3)加入检测样品100uL/孔，同时以WYMV病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37℃1-2h；

4)0.01mol/LPBST洗涤3次后，加入封闭液稀释5000倍的单抗腹水，100uL/孔，37℃1-2h；

5)0.01mol/LPBST洗涤3次后，加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)，100uL/孔，37℃1-2h；

6)0.01mol/LPBST洗涤5次，拍干后每孔加入显色底物100uL(显色底物：PH9.8的10％乙二醇胺底物缓冲液和PNPP按1mL∶1mg比例配制)，室温显色30min，肉眼观察阳性孔底物颜色变成黄绿色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。

TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将WYMV病叶汁液用0.01mol/LPBS液进行倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，测定结果为：TAS-ELISA检测病叶的灵敏度达到1∶25600倍稀释(w/v，g/mL)(图2)。

比较双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法与酶联双抗体夹心方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度，前者灵敏度高于后者。

实施例4

用建立的双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法对2014-2015年来自田间小麦样品进行检测，同样的样品用RT-PCR方法进行检测，结果发现：RT-PCR方法检测的9个样品中有6个样品产生小麦黄花叶病毒特异性条带(图3)，双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法检测9个样品中有5个样品显示阳性(表1)，结果表明双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法灵敏度略低于RT-PCR方法，但特异性一致。说明双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法方法同样能够准确、可靠地用于WYMV的检测。

表1双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法检测田间样品的结果

Claims (9)

1.一种小麦黄花叶病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测方法，包括以下步骤：

1)每孔用100uL病毒特异性抗体包被酶标板，37℃放置2h后，4℃过夜放置，洗板，甩干；

2)每孔加入200uL含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2h，洗板，甩干；

3)每孔分别加入100uL待检病毒样品、阳性和阴性样品，37℃孵育1h，洗板，甩干；

4)每孔加入100uL生物素标记的二抗，37℃孵育1h，洗板，甩干；

5)每孔加入100uL亲和素标记的酶，37℃孵育1h，洗板，甩干；

6)每孔加入100uL显色底物，37℃孵育5～15min进行显色反应，肉眼观察显色后每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD值，以大于等于阴性对照OD值3倍的作物阳性结果的阈值。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述病毒特异性抗体为小麦黄花叶病毒纯化单抗2D4。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中，用PH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将病毒特异性抗体稀释为5～10ug/mL浓度后包被酶标板。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)、2)、3)、4)和5)中洗板用的洗涤液为PH7.4含0.5mol/LTween-20的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4)所述生物素标记二抗为生物素标记的小麦黄花叶病毒纯化的单抗2D3，使用浓度为0.2ug/mL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤5)所述亲和素标记的酶为辣根过氧化物酶。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤6)所述显色底物为四甲基联苯胺。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤6)所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤6)所述OD值在波长450nm下测定。