CN102282171B - 抗基孔肯雅病毒单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由基孔肯雅病毒(Chikungunya？virus，CHIK)引起的虫媒病毒病领域。本发明特别地涉及抗CHIK单克隆抗体(MAb)，更特别地涉及抗CHIK.E2？MAb及其作为诊断产品在检测CHIK病毒株是否存在的方法中的用途。

Description

抗基孔肯雅病毒单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明涉及由基孔肯雅病毒(Chikungunya，CHIK)引起的虫媒病毒病的领域。本发明特别地涉及抗CHIK单克隆抗体(MAb)，更特别地涉及抗CHIK.E2MAb及其在检测CHIK病毒株是否存在的方法中作为诊断物的用途。
背景技术
基孔肯雅病毒(CHIK)能够在非洲、印度和东南亚引起爆发性流行病(Epstein2007；Powers和Logue的综述2007)。该病毒由伊蚊属(Aedes，Ae.)的蚊子传播。CHIK病毒自2005年起在留尼旺岛(ReunionIsland)和印度洋地区空前大规模爆发，而2006年在印度的爆发使大约140万居民受到感染(Schuffenecker等人2006；Staikowsky等人2006；Arankalle等人2007；Pialoux等人2007年的综述)。
感染了CHIK病毒的人典型地表现出一些急性症状，包括失能多关节痛、严重的肌肉疼痛和关节僵硬，有时随后出现斑丘疹(Johnson和Peters1996；Borgherini等人2007；Pialoux等人2007年的综述；Rulli等人2007)。CHIK病毒感染几乎都与肌痛有关。CHIK病毒对肌肉内卫星细胞的感染可以部分地解释某些临床表现(Ozden等人2007)。基孔肯雅病毒感染的临床症状常常被误诊为由其它致关节炎抗原性(arthritogenic)甲病毒(例如西非的伊-奥病毒(Igbo-Oravirus)、中非的翁-尼病毒(O’nyong-nyongvirus，ONN)、澳大利亚和太平洋地区的罗斯河病毒(RossRivervirus)和Barma病毒、南美的马雅罗病毒(Mayarovirus)和世界范围的辛德毕斯病毒(Sindbisvirus，SIN)引起的虫媒病毒病。
CHIK病毒是披膜病毒科、甲病毒属的成员(Strauss和Strauss的综述1994)。甲病毒是小的包膜单链(+)RNA病毒，其表现出广泛的细胞嗜性。病毒表面覆盖有由包膜E1和E2糖蛋白异二聚体的三联体组成的、锚定在膜上的刺突(spike)。病毒刺突蛋白有助于病毒附着于细胞表面以及病毒进入。E1包膜糖蛋白是II型融合蛋白，其在病毒感染过程中介导由低pH引起的膜融合。E2是50kDa的I型跨膜糖蛋白：其前260个氨基酸构成胞外结构域，接着是约100个氨基酸形成的主干区(stemregion)、30个氨基酸的跨膜区以及30个氨基酸的短胞质内结构域(Pletnev等人2001；Mukhopadhyay等人2006)。pE2(E3和E2蛋白的62kDa前体)和E1在内质网中装配成异二聚体(Strauss和Strauss的综述1994)。pE2在高尔基体中被切割形成E3和E2后，E1-E2复合体被运送至质膜(plasmamembrane，PM)。胞质中E2胞内结构域与预先装配之核壳体的相互作用是PM上病毒包膜过程中的起始步骤之一。E1和E2的直接相互作用使病毒颗粒保持完整(Strauss和Strauss，1994)。在甲病毒的生活周期中，E2糖蛋白负责与受体结合。大多数中和抗体识别E2而非E1的表位(Strauss和Strauss的综述，1994)。识别E2外表面之构象表位的抗体具有中和甲病毒感染的潜力。
对CHIK病毒感染的生物学诊断主要基于病毒感染初期的基于定量实时RT-PCR的方法(Edwards等人2007；Laurent等人2007；Santhosh等人2007)。血清学方法检测首次临床表现后早期的抗CHIKIgM以及两周后的特异性IgG(Pialoux等人2007年的综述)。但是，由于CHIK病毒与塞姆利基森林病毒(SemlikiForest，SF)抗原性复合物相关成员存在交叉反应(Greiser-Wilke等人，1991)，因此ELISA和免疫检测测定的特异性和灵敏度较差。
附图说明
图1：CHIK蛋白组成和病毒制备物的抗原特异性。在变性条件下，CHIK抗原(CHIKAg)通过4～12％SDS-PAGE进行分离，并利用考马斯蓝染色直接观察(左图)，或电转至PVDF膜并使用抗CHIKHMAF进行免疫印迹分析(右图)。分子量标记(MW)的位置以kDa表示。
图2：重组可溶性CHIKsE2糖蛋白的抗原性。使用纯化的重组可溶性CHIK.sE2蛋白和DEN-1sE以及抗CHIKHMAF(CHIKHMAF)、正常人血清(阴性血清)和CHIK阳性患者血清(CHIK阳性血清)进行免疫印迹分析。
图3：产生抗体之杂交瘤上清液的动力学排序测定。曲线显示了监测到的50mMCHIK.sE2蛋白与产生抗体之杂交瘤上清液3C3、3E4、5A8、6F2、8A4和9B5随时间的结合(以共振单位(RU)表示)。
图4：使用抗CHIK.E2MAb检测E2的灵敏度。将经蔗糖纯化的CHIK病毒以每孔105FFU包被于ELISA板上，并加入浓度递增的MAb3C3(▲)、3E4(○)和8A4(■)。MAb的反应性通过“方法”中所述的间接ELISA进行测试。
图5：抗CHIK.E2MAb与受感染细胞中内源合成之E2的反应性。使用CHIK.06-49病毒(0.4MOI)感染Vero细胞24小时。(A)中，使用抗CHIK.E2MAb通过IF测定来检测E2。对经固定的细胞进行透化处理(+TX-100)或不进行透化处理(-TX-100)，然后用2.5μg/mL的MAb3C3、3E4或8A4进行免疫染色。抗CHIKHMAF(1∶500稀释)用作对照。(B)中，使用抗CHIK.E2MAb对感染CHIK病毒的细胞进行流式细胞术分析。对经固定的感染细胞(实线)或模拟感染的细胞(虚线)用皂苷进行透化处理(黑线)或不进行透化处理(灰线)，然后用2.5μg/mLMAb3C3、3E4或8A4进行免疫染色。抗CHIKHMAF(1∶500稀释)用作阳性对照。
图6：通过免疫印迹分析来检测抗CHIK.E2MAb对还原型E2蛋白的反应性。用100ng纯化的CHIK.sE2蛋白(泳道1)或105FFU经蔗糖纯化的CHIK病毒(泳道2)印迹于膜上，并按照“方法”中的描述分别与MAb3C3、3E4或8A4孵育。抗CHIKHMAF用作阳性对照。
图7：CHIK病毒(SEQIDNO：1)、伊-奥病毒(SEQIDNO：2)和ONN病毒(SEQIDNO：3)的E2序列的比对，其显示E2-1至E2-364残基的区域。天冬酰胺连接的糖基化位点标记为(◆)。空心框表示ONN病毒与CHIK和伊-奥病毒相比的3个特定氨基酸差异。
图8：使用抗CHIKE2MAb进行抗原捕获ELISA的灵敏度。使用MAb8A4作为捕获抗体、MAb3E4作为检测抗体、病毒培养物上清液(A)和重组可溶性CHIK.sE2糖蛋白作为病毒抗原(B)，进行定量分析。(A)中，将系列稀释的CHIK.06-49病毒培养在蚊AP61细胞(●)或人293A细胞(□)中。(B)中，浓度递增的纯化重组可溶性CHIK.sE2蛋白。
发明内容
本发明人开发了对于研究CHIK病毒的生物学特性和CHIK相关疾病的发病机理特别有优势的单克隆抗体(MAb)，并对其进行表征。
本领域技术人员可以理解，本发明的创新性在于，本发明人制备了一系列特异性结合完整CHIK病毒或CHIKE2糖蛋白(甚至其可溶形式)的单克隆抗体(MAb)，并对其进行表征。
相应地，本发明提供了特异性结合位于CHIK病毒外表面上之表位的单克隆抗体，例如2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心)(28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3822(3C3)、I-3824(3E4)和I-3823(8A4)的单克隆抗体。本文使用的术语“特异性结合”是指抗体与本发明涉及的CHIK蛋白(例如E2糖蛋白)以相对高的亲合力结合，但不显著识别或结合除CHIKE2糖蛋白以外的分子。本文使用的术语“相对高的亲合力”是指抗体与目的蛋白之间的结合亲合力至少为10-6M，优选至少约10-7M，更优选10-8M～10-10M。优选利用本领域技术人员公知的标准竞争性结合免疫测定条件对这种亲合力进行测定。
本文使用的术语“抗体”是指淋巴细胞响应于免疫原刺激而产生的糖蛋白。抗体能够在体外和体内特异性且选择性地与引发其产生的抗原决定簇或表位反应，或者与同源性抗原高度相关的抗原决定簇反应。术语“抗体”意在涵盖利用此抗体之结合(可变)区的结构，以及其它抗体变化形式。因此，可用于本发明方法中的抗体可包括完整抗体、抗体片段、多功能性抗体聚集体，或大体包含抗体中一个或多个特异性结合位点的实体。抗体片段可以是例如Fv、Fab或F(ab’)2片段，或其衍生物(例如单链Fv片段)。抗体或抗体片段可以是非重组的、重组的或人源化的。抗体可以是免疫球蛋白同种型，例如IgG、IgM等。此外，视情况可使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、多聚物、衍生物和缀合物。
本发明的单克隆抗体或其组合特别地可用作诊断试剂和/或用于筛选CHIK感染(即使该感染是无症状的)。本发明的单克隆抗体还可用于诊断方法中，包括但不限于免疫荧光、免疫印迹和ELISA测定。
相应地，本发明提供了用于检测样品中是否存在基孔肯雅病毒(CHIK)毒株的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与本发明的抗CHIK单克隆抗体相接触，或者与本发明抗CHIK单克隆抗体的组合相接触，以形成免疫复合物；以及
b)检测a)中形成的免疫复合物存在与否。
更特别地，本发明涉及检测样品中是否存在来自基孔肯雅病毒(CHIK)E2多肽的包膜E2多肽或功能性衍生物或其前体E3E2(p62)的方法，其包括以下步骤：
a)使样品与本发明的抗CHIKE2单克隆抗体相接触，或者与本发明抗CHIK单克隆抗体的组合相接触，以形成免疫复合物；以及
b)检测a)中形成的免疫复合物存在与否。
本文使用的术语“功能性衍生物”是指E2糖蛋白的片段(例如E2胞外结构域)，其仍能够被本发明的单克隆抗体所识别。术语“表位”是指抗原(例如E2糖蛋白)上与特异性抗体分子(例如本发明的单克隆抗体)结合的位点。本文使用的术语“样品”是指得自个体并可根据本发明用于诊断或检测测定中的多种样品类型。该定义涵盖了生物来源的血和其它液体样品、实体组织样品(例如活检样本或者组织培养物或来源于其的细胞及其子代)。
可以理解，当使用抗CHIK单克隆抗体的组合时，一种单克隆抗体可作为捕获抗体(例如8A4)，另一种单克隆抗体可作为检测抗体(例如3E4)。这种捕获抗体和检测抗体可以在例如ELISA测定中具有优势。
本发明还涉及用于检测样品中是否存在基孔肯雅病毒(CHIK)毒株、更特别地用于检测样品中是否存在基孔肯雅病毒(CHIK)E2多肽的试剂盒。该试剂盒包含至少一种选自2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心)(28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3822(3C3)、I-3824(3E4)和I-3823(8A4)的单克隆抗体。根据本发明这一实施方案的试剂盒可包括包装，其各包含一种或多种进行各诊断测试时所需的上述单克隆抗体(通常采用浓缩形式)。
实施例
对基孔肯雅病毒包膜E2糖蛋白具有反应性的小鼠单克隆抗体的制备及表征
基孔肯雅热是在亚洲和非洲对公众健康产生重要影响的虫媒病毒病。基孔肯雅病毒(CHIK)是甲病毒属的成员，其属于塞姆利基森林病毒(SF)抗原性复合物。本发明人首次描述了对CHIK包膜E2糖蛋白具有反应性的一系列单克隆抗体(MAb)。为了筛选E2特异性MAb，本发明人在果蝇S2细胞中表达了重组可溶性CHIKE2蛋白。通过免疫学方法分析，基于其反应性选出MAb3C3、3E4和8A4。它们的表位位于CHIK病毒颗粒的外表面。这些MAb与SF抗原性复合物的相关成员无交叉反应(伊-奥病毒例外)。抗CHIKE2MAb3C3、3E4和8A4有助于研究CHIK病毒的生物学特性和疾病的发病机理。8A4与3E4的组合适用于开发特异性抗原捕获ELISA。
材料和方法
细胞系和CHIK病毒
Vero细胞在含有5％热灭活的胎牛血清(FBS)和2mML-谷氨酰胺的DMEM培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’sgrowthmedium)(Invitrogen)中培养。293A细胞(Quantum)在含有丙酮酸盐(Invitrogen)、10％FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM生长培养基中培养。Vero和293A细胞均在CO2环境中于37℃孵育。假鳞斑伊蚊(Aedespseudoscutellaris)AP61细胞在含有10％FBS和1％胰蛋白示(tryptose)-磷酸盐培养液(Eurobio)的LeibovitzL-15生长培养基中培养。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)Schneider2(S2)细胞系购自Invitrogen。S2细胞在含有10％FBS的Schneider生长培养基(Invitrogen)中培养。无脊椎动物AP61和S2细胞在27℃下孵育。所有培养基均添加抗生素青霉素和链霉素。
CHIK.06-49病毒(基因型4)从2006年留尼旺岛基孔肯雅热爆发时的一个年轻成人体内分离得到(Schuffenecker等人，2006)。该病毒已利用蚊细胞系传代两次。使用抗CHIKHMAF通过标准化的AP61细胞灶点免疫测定(focusimmunoassay，FIA)测定病毒储藏物的滴度，表示为FFU/mL(Schuffenecker等人，2006)。由被感染的蚊细胞中得到高浓度的经纯化CHIK.06-49。简言之，用CHIK病毒接种20个培养瓶的AP61单层细胞，每个细胞的感染复数(multiplicityofinfection，MOI)为0.4FFU。感染后两天收集被感染细胞的上清液并澄清。在4℃，用0.5MNaCl中10％(重量∶体积)的聚乙二醇(PEG)8,000(Fluka)沉淀病毒4小时。离心后，用TNE缓冲液(20mMTris-Cl[pH8.0]，150mMNaCl，2mMEDTA)重悬沉淀，并于4℃利用由60％(重量∶重量)和30％(重量∶体积)蔗糖组成的不连续蔗糖梯度、以39,000rpm离心2小时。收集分界面处的可见条带并用TNE缓冲液稀释。于4℃利用11～52％(重量/体积)连续蔗糖梯度、以35,000rpm离心18小时，对病毒进一步纯化。收集可见条带，分装并储存于-80℃。
CHIK抗原的制备
由病毒颗粒得到高浓度的CHIK抗原。用CHIK.06-49病毒(0.4MOI)接种40瓶AP61单层细胞。感染后两天收集被感染细胞的上清液并澄清。如上所述，在0.5MNaCl存在下用PEG8,000沉淀病毒颗粒。向用TNE缓冲液重悬的沉淀中加入20mM三乙醇胺(Sigma)，然后与2％TritonX-100(Sigma)于冰上孵育10分钟。将悬浮液以2,000rpm离心1分钟，将澄清的制备物应用于10～30％连续蔗糖梯度并于4℃以35,000rpm离心16小时。收集上部的级分，并利用SDS-PAGE的考马斯蓝染色和免疫印迹进行评估。利用UV使含有CHIK抗原的合并级分(病毒制备物)失活，其残余感染力通过FIA来验证。
产生抗体的杂交瘤克隆的制备
用等比例的弗式完全佐剂(Sigma)对3μg病毒制备物进行乳化。通过皮下注射对4只11周龄的BALB/c小鼠(CharlesRiver)进行免疫。以3周为间隔，用同样剂量加强注射2次。每次加强后十天对小鼠进行抽血。在融合前四天进行预融合加强(同样剂量分成四次注射，两次皮下注射，随后两次腹膜内注射)。
根据标准方案，将Sp2/0Ag14骨髓瘤细胞系与来自经免疫小鼠的脾细胞进行融合。将产生抗体的杂交瘤进行两次亚克隆并冷冻在液氮中。通过收集高度浓缩的上清液来体外制备单克隆抗体。利用n-蛋白A琼脂糖凝胶(GEHealthcare)进行亲合层析来实现纯化。根据生产商的说明，使用小鼠mAb分型测试试剂盒(AbDSerotec)对MAb进行分型。
重组可溶性CHIKsE2蛋白的构建和表达
利用PCR从含有CHIK.06-49pE2基因的TOPO质粒中扩增编码E2胞外结构域及其后的主干区(残基E2-4至E2-364)的CHIK.06-49序列(Genbank登记号AM258994)，其正向引物为5’AAAAAAGATCTGACAACTTCAATGTCTATAAAGCCACAAGACC-3’(SEQIDNO：4)，反向引物为5’-TTTTTGCGGCCGCGTCATAGTGGGGTACAGCTCATAATAATACAG-3’(SEQIDNO：5)。PCR产物经BgIII和NotI消化，然后，插入到pMT/Bip/V5-HisA质粒中唯一的BglII和NotI位点中，得到pMT/Bip/CHIK.sE2。将CHIKsE2序列与指导重组蛋白进入分泌途径的Bip序列置于同一读码框内。在该表达载体中，CHIKsE2序列的C端之后是V5表位以及使用镍螯合亲合层析时用于亲合纯化的6个组氨酸。使用磷酸钙转染试剂盒(Invitrogen)，用重组质粒pMT/Bip/CHIK.sE2转染果蝇S2细胞(Invitrogen)。通过加入25μg/ml的杀稻瘟素数周，筛选出稳定转染的细胞。将表达CHIK.sE2蛋白的经培养S2细胞在含有10μg/ml杀稻瘟素的无血清培养基中进行适应性培养。加入CuSO4至终浓度为500μM，以诱导重组可溶性CHIK.E2蛋白的合成与分泌。加入CuSO4后10天，培养基中CHIK.sE2的积累达到最大值。将细胞培养上清液通过0.2μM滤器。利用10,000-MWCoVivaspin柱(Vivasciences)浓缩蛋白样品，然后在PBS中透析。作为替代，利用经平衡的螯合柱层析(HiTrapChelatingHP，Amersham)从细胞培养上清液中纯化重组CHIK.sE2蛋白。用清洗缓冲液(0.5MNaCl，50mM磷酸纳缓冲液[pH8.0])清洗柱几次，并用浓度递增的咪唑使所结合的CHIK.sE2洗脱下来。合并含有CHIK.sE2蛋白的级分，并在PBS中透析。可溶形式的DEN-1E糖蛋白(DEN-1sE)也由果蝇S2细胞制备。
动力学排序测定
利用ProteOnXPR36装置(Bio-Rad)进行动力学排序测定，并使用ProteOnManager软件(Bio-Rad)进行数据分析。使用标准胺偶联化学法将抗小鼠IgG(Sigma)固定于GLM传感器芯片(Bio-Rad)上。整个实验均在25℃下连续使用运行缓冲液TPBS(PBS中0.005％Tween-20)。简言之，以0.030mL/分钟的流速注入含有0.2MEDC和0.05MSulfo-NHS的0.2mL混合物，随后注入用10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释的0.075mg/mL的0.2mL抗小鼠IgG。然后，用0.15mL的1M乙醇胺(pH8.5)使表面失活。将杂交瘤上清液用含有1mg/mL藻酸盐的TPBS以1∶2进行稀释，并以0.025ml/分钟的流速注入0.2mL，随后注入0.2mL浓度递增的重组可溶性CHIK.sE2蛋白。
间接ELISA
对于间接ELISA而言，Maxisorp板(NalgenNunc)上包被有105FFU用D-PBS(Invitrogen)稀释的经蔗糖纯化之CHIK病毒体、50ng用于免疫的CHIK抗原或50ng重组可溶性CHIK.sE2蛋白，并于4℃孵育过夜。将非特异性蛋白结合位点用PBS中的3％牛奶于37℃封闭1小时。用含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)清洗板。在经包被的板中加入用PBST中的0.1％牛奶进行系列稀释的免疫后小鼠血清和用同样缓冲液以1∶2稀释的细胞培养上清液，并于37℃孵育2小时。用PBST清洗后，加入以1∶5000稀释的含有1％牛奶的过氧化物酶缀合之AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch)，并于37℃孵育1小时。清洗后，加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物(TMB，KPL)。每孔中加入0.1mL的1MH3PO4以终止显色反应，并用OpsysMRELISA酶标仪(DinexTechnologies)在450nm波长下对板进行检测。
抗原捕获ELISA
为了制备检测MAb，如先前所述(Nakane和Kawaoi，1974)用过氧化物氧化还原酶(POD)标记经纯化MAb的抗体胺基。通过将0.1mL碳酸盐缓冲液[pH9.2]中的2μg/mL抗体于室温下孵育过夜，将用于抗原捕获的纯化MAb固定于Maxisorp板(NalgenNunc)上。然后，用TPBS清洗孔两次，随后用PBS(补充有3％脱脂牛奶)中的8％(重量/体积)蔗糖于37℃封闭1小时。移去封闭试剂后，在50℃下使板干燥10分钟，待孔干燥后储存于4℃备用。将病毒培养上清液或用PBST/1％脱脂牛奶稀释的重组可溶性CHIK.sE2蛋白加至孔中(0.1mL/孔)，于37℃孵育1小时。几次清洗后，向每孔加入1μg/mL用PBST(含有1％脱脂牛奶)稀释的POD缀合MAb(0.1mL/孔)，于37℃孵育1小时。清洗后，加入TMB底物并将板置于暗处再孵育8分钟。利用上述方法测定酶活性。
免疫印迹分析
将蛋白样品与Laemmli样品缓冲液在室温下混合，并加样于4～12％SDS-PAGE(Nupage，Invitrogen)。将样品电转移至PVDF膜(Invitrogen)，并用PBST中的5％牛奶进行封闭。用第一抗体标记膜，用以1∶10,000稀释的POD缀合第二抗体及随后的ECL底物溶液(Amersham)检测所结合的抗体。
IF测定和流式细胞术分析
对于间接免疫荧光(IF)测定而言，将培养于PermanoxLabtek腔室(Nunc)的细胞用PBS中3.2％多聚甲醛(PFA)固定20分钟，然后与PBS中50mMNH4Cl一起孵育10分钟。用PBS中0.1％TritonX-100对细胞进行透化4分钟，或者不进行透化，然后与PBS/0.2％明胶中的第一抗体于37℃孵育30分钟。用PBS充分清洗后，用PBS/0.2％明胶中以1∶100稀释的荧光素缀合山羊抗小鼠IgG(Pierce)于37℃再孵育细胞30分钟。利用荧光显微镜观察样品。
对于流式细胞流动而言，将细胞分散开，然后用PBS/3.2％PFA进行固定。用染色缓冲液SB(1％FBS中0.1％[重量/体积]叠氮钠，pH7.5)充分清洗经固定的细胞，并与用SB或透化缓冲液PB(SB缓冲液中加入1％[重量/体积]皂苷)稀释的第一抗体于37℃孵育90分钟。充分清洗后，将细胞与用SB或PB以1∶100稀释的荧光素缀合第二抗体(Pierce)于37℃孵育1小时。充分清洗后，使用FACSCalibur(BectonDickinson)以及CellQuestPro软件(BDBiosciences)对细胞进行流式细胞术分析。
结果
CHIKE2抗原的制备
为了制备病毒抗原，从感染了CHIK病毒留尼旺岛06-49株(CHIK.06-49)的蚊细胞的上清液中沉淀出CHIK病毒体。将高浓度的病毒颗粒与2％TritonX-100一起孵育，并将病毒悬液应用于蔗糖梯度。离心后，利用免疫印迹分析来评估级分。抗CHIK抗体检测到约15～20％蔗糖浓度处的pE2、C和弱得多的E2。将富含pE2、E2和C的级分合并并用U.V.进行处理，从而在BSL-2实验室中对小鼠进行免疫。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色和免疫印迹(图1)评估后，病毒抗原分离后观察到的主要条带对应于pE2。使用抗CHIK的超免疫小鼠腹水(hyperimmunemouseasceticfluid，HMAF)通过间接ELISA证实了病毒制备物的抗原性(数据未显示)。作为阴性对照的针对登革热病毒(DEN)或西尼罗病毒的小鼠免疫血清未显示反应性。
由于果蝇S2细胞产生的虫媒病毒抗原可与其在蚊中的天然对应物相类似，我们使用果蝇表达系统(Invitrogen)来表达CHIKE2糖蛋白。已建立了表达CHIK.06-49病毒胞外结构域及其后的E2主干区(以下称为“CHIK.sE2”)的稳定转染S2细胞系。向培养基中加入CuSO4诱导重组可溶性CHIK.sE2蛋白的合成和分泌。诱导后两周，培养基中CHIK.sE2的积累达到最大值。对于间接ELISA来说，直接从上清液中富集分泌的CHIK.sE2蛋白并用于包被ELISA板。对于免疫印迹分析和抗原捕获ELISA来说，使用镍螯合亲合层析从细胞培养基中纯化重组可溶性CHIK.sE2蛋白。
免疫印迹分析表明，重组可溶性CHIK.sE2蛋白(表观分子量42kDa)被抗CHIKHMAF和CHIK阳性患者血清所识别(图2)。间接ELISA也观察到了类似的结果(数据未显示)。这些结果表明，S2细胞分泌的重组可溶性CHIK.sE2蛋白具有与天然形式CHIKE2糖蛋白相近似的构象。针对CHIKE2蛋白的MAb的制备
如“材料和方法”部分所述，使用来自经病毒制备物免疫的BALB/c小鼠的脾细胞成功进行了两次融合。为了筛选产生抗体的杂交瘤克隆，将病毒制备物和重组可溶性CHIK.sE2蛋白用作间接ELISA中的CHIK抗原。约60个产生抗体的杂交瘤克隆被鉴定为具有比胎牛血清(FBS)的背景反应水平高出至少4倍的抗体结合水平。在这60个杂交瘤克隆中，有12个通过间接ELISA既能够与经蔗糖纯化的CHIK病毒体反应，也能与重组可溶性CHIK.sE2蛋白反应(数据未显示)。通过IF测定筛选，5个产生抗体的杂交瘤克隆(3C3、3E4、5A8、6F2和8A4)对感染CHIK病毒的细胞表现出强的阳性反应(数据未显示)。ProteOn生物传感器分析显示，5个克隆以高表观结合亲合力识别CHIK.sE2(图3)。在这5个产生抗体的杂交瘤克隆中，有3个(3C3、3E4和8A4)显示出与重组可溶性CHIK.sE2蛋白快速结合且缓慢解离(数据未显示)。根据这些结果，对产生抗体的杂交瘤克隆3C3、3E4和8A4进行亚克隆，然后进行扩增。使用从杂交瘤克隆上清液中纯化的抗CHIK.E2MAb进行以下实验。
MAb3C3、3E4和8A4的特征总结于表1中。
表1：抗CHIK.E2MAb的特征
这3种抗CHIK.E2MAb均属于IgG1，κ亚型。使用灶点减少中和测试(focusreductionneutralizationtest，FRNT)来评价纯化抗CHIK.E2MAb抑制CHIK病毒在培养的Vero细胞中复制的能力。终点效价计算为：CHIK.06-49病毒针对至少90％(FRNT90)的AP61细胞减少～100灶点形成单位(FocusFormingUnit，FFU)时的所测试最高抗体稀释度。抗CHIKHMAF的平均FRNT90为1∶2,500稀释度，而MAb3C3、3E4和8A4在高达10μg/mL的浓度下均未中和CHIK病毒(数据未显示)。抗CHIK.E2MAb与天然形式CHIKE2糖蛋白的反应性
对CHIK病毒进行间接ELISA测试，以评估所选抗CHIK.E2MAb是否识别病毒体的表面。为此目的，使用经蔗糖纯化的CHIK.06-49病毒以每孔105FFU包被于ELISA板上，并加入浓度递增的MAb。在间接ELISA中，MAb3C3、3E4和8A4与天然病毒颗粒反应(图4)，这表明它们的表位暴露于CHIK病毒的外表面上。为了分析这3种抗CHIK.E2MAb在去污剂条件下的结合能力，将CHIK病毒与2％TritonX-100孵育，然后包被于ELISA板上。只有MAb8A4在变性条件下表现出与CHIK病毒的显著反应性(数据未显示)，这表明MAb8A4能够在非离子去污剂存在下识别CHIKE2糖蛋白。
在间接ELISA中，剂量-应答曲线显示MAb8A4和3E4与MAb3C3相比能够更好地结合CHIK病毒(图4)。通过该抗原检测测试估计，MAb8A4和3E4的反应性比MAb3C3高10倍。为了评估这两种抗CHIKE2MAb是否可用于夹心测定(sandwichassay)，利用ProteOn生物传感器分析对重组可溶性CHIK.sE2蛋白进行互补性研究。MAb3C3和3E4显示出与结合有MAb8A4之CHIK.sE2具有显著反应性，当使用MAb3E4作为检测抗体时取得了最佳结果(数据未显示)。因此，抗CHIK.E2MAb8A4(捕获抗体)和3E4(检测抗体)的组合适用于开发抗原捕获ELISA。
利用IF测定(图5A)和流式细胞术分析(图5B)对MAb与CHIKE2糖蛋白的结合能力作进一步研究。抗CHIKHMAF用作阳性对照。在IF测定中，MAb3C3、3E4和8A4与感染了CHIK病毒的Vero细胞中内源合成的E2蛋白强烈反应(图5A)。作为阴性对照，抗DENEMAb4E11显示无反应性(数据未显示)。所有这3种CHIK.E2MAb均识别运送至PM的CHIKE2糖蛋白(图5A，-TX-100)，这表明它们的表位位于E2外表面上的可接近区域。在流式细胞术分析中，对于用皂苷进行透化或未透化的感染了CHIK病毒的细胞，MAb3C3和3E4显示出相似的荧光强度平均值(图5B)。因此，这两种抗CHIK.E2MAb能够类似地识别新合成的E2分子与结合于PM的E2。
流式细胞术分析显示，抗CHIK.E2MAb8A4的反应性与MAb3C3和3E4不同。事实上，在皂苷存在下MAb8A4显示出与感染了CHIK病毒之细胞较弱的反应性(图5B)。由于MAb8A4优选地靶向与PM结合的E2，因此其表位可能主要暴露在天然形式E2的外表面上。
抗CHIK.E2MAb的免疫印迹反应性
用经蔗糖纯化的CHIK病毒体和重组可溶性CHIK.sE2蛋白进行免疫印迹，以确定抗CHIK.E2MAb是否与线性表位结合(图6)。作为阳性对照，抗CHIKHMAF检测结合于CHIK病毒的E2和CHIK.sE2。本发明人观察到，MAb3C3和3E4能够在还原条件下与E2反应。为了确定这些MAb是否识别线性肽表位，通过SPOT技术制备了固定的重叠15肽阵列，所述15肽覆盖整个CHIK.sE2氨基酸序列。线性的合成肽不能形成这两种抗CHIK.sE2抗体的表位(数据未显示)。这些结果表明MAb3C3和3E4部分地识别线性表位。
在免疫印迹分析中，抗CHIK.E2MAb8A4不与结合于CHIK病毒的E2蛋白反应(图6)，这表明该MAb可识别构象表位。尽管与MAb3C3和3E4相比，MAb8A4在还原条件下与CHIK.sE2的反应较弱，但是MAb8A4显示与分子量估计约为100kDa和150kDa的另外两条蛋白条带有反应性(图6，MAb8A4，泳道1)。这一观察结果表明，MAb8A4能够检测可溶性E2的二聚体和三聚体形式。
抗CHIK.E2MAb与东半球甲病毒(OldWorldalphavirus)的交叉反应
对被感染的蚊细胞进行IF测定，以评估这3种抗CHIK.E2MAb是否识别SIN病毒以及分离于东半球中的SF血清复合物的相关成员，例如SF、伊-奥病毒、ONN、Babanki、Zingilamo、Middelburg、Ndumu和Arv9/71病毒。表2总结了MAb的交叉反应性：抗CHIKHMAF显示与CHIKS27株、伊-奥病毒IBH10964株、ONNGulu(ONN-59)株、ZingilamoAnB1245d株和SFIPD/A株有强反应性，与SINAr399株有中度反应性，与BabankiArY251有弱反应性，并且与MiddelburgSAAr749株、NdumuSAAr2204株和Arv9/71病毒无交叉反应性。在荧光抗体测试中，抗CHIK.E2MAb的反应性与抗CHIKHMAF不同。IF测定的结果显示，MAb3C3、3E4和8A4与CHIK病毒有反应，而伊-奥病毒有较低程度的反应(表2)。在IF测定中，MAb8A4显示出与感染了CHIK病毒或伊-奥病毒的蚊细胞相似的反应性。
表2：使用IF测定，抗CHIKE2MAb与甲病毒的交叉反应性
a.荧光抗体测试。将被感染的AP61细胞在转染后24小时用PFA固定，用TritonX-100进行透化，并依照“方法”中所述进行免疫染色。荧光信号：(++)强，(+)中度，(+/-)低。(-)无阳性反应。CHIK：基孔肯雅病毒，
ONN：翁-尼病毒，SF：塞姆利基森林病毒，SIN：辛德毕斯病毒。
b.小鼠免疫血清以1∶500稀释。
c.抗体浓度调整至2.5μg/mL。
d.抗体浓度调整至3.0μg/mL。
图7显示了CHIK.06-49病毒、ONN-59病毒(Genbank登记号M20303)和伊-奥病毒IBH10964株(Genbank登记号AF079457)之E2胞外结构域和主干区的氨基酸序列比对。两个经鉴定的N-连接糖基化位点(第263位和第345位)在CHIK、ONN和伊-奥病毒中都是保守的。对E2的前365个残基进行基因分析的结果显示，伊-奥病毒与ONN病毒株之间只有5个氨基酸不同(同一性为98.5％)(图7)。CHIK病毒与SF抗原复合物的另外两个相关成员之间有45个氨基酸的差异(同一性为87.5％)。E2序列的比较分析显示，ONN-59与CHIK.06-49和伊-奥病毒IBH10964在E2-130、E2-164和E2-288位不同(图7，空心框)。令人感兴趣的是，在CHIK和伊-奥病毒的高度保守区域E2160-177中具有Thr164Ala替换。这一脯氨酸富集区域可能暴露于甲病毒体中E2刺突的表面撒谎能够(Mukhopadhyay等人，2006)。
基于抗CHIKE2MAb的抗原捕获ELISA
如上所述，抗CHIK.E2MAb8A4和3E4适于在夹心ELISA中检测CHIK病毒。用MAb8A4(2μg/mL)作为ELISA板上的捕获抗体，过氧化物酶缀合的MAb3E4(1μg/mL)作为检测抗体。为了测定抗原捕获ELISA的灵敏度，将利用蚊AP61或人293A细胞培养的CHIK.06-49进行系列稀释，并用于确定标准曲线(图8A)。在450nm处、光密度为0.15时，使用DPBST/1％牛奶确定抗原捕获的基线。因此，将检测稀释于DPBST/1％牛奶中的CHIK病毒的临界值设为0.45，其等于针对DPBST/1％牛奶的OD450的平均值+3倍标准差(S.D.)。根据该临界阈值，ELISA的检出限约为106.0AP61FFU的源自蚊细胞之CHIK病毒和104.3FFU的源自人细胞之CHIK病毒(图8A)。抗原捕获ELISA也能够检测可溶形式的E2(CHIK.sE2)，且最小可检测质量约为5ng(图8B)。与蚊细胞相比，所述两种抗CHIK.E2MAb对培养于293A细胞中的CHIK病毒具有更高水平的反应性(图8A)。这可能与被细胞病变性CHIK病毒感染之人细胞的上清液中个体化E2糖蛋白的释放有关。这些结果表明，MAb8A4和3E4可联合使用，以检测病毒培养上清液中的可溶性CHIKE2蛋白以及结合于病毒体的E2蛋白。
在非洲有两种不同的CHIK病毒基因型(Powers和Logue的综述，2007)。第一种基因型包括来自西非的CHIK病毒分离群。第二种基因型包括来自东非/中非/南非的CHIK病毒分离物的组。为了确定所述两种抗CHIK.E2MAb的特异性，对得自中非/东非(中非共和国，1978；印度洋，2005-06)和西非(象牙海岸，1999；塞内加尔，1965-66以及2005)的一组CHIK病毒临床分离群进行了抗原捕获ELISA测试。利用蚊细胞进行培养的所有经测试CHIK病毒非洲毒株均可被识别(数据未显示)。因此，MAb8A4与3E4的组合能够识别在西非和中非/东非CHIK病毒基因型之间保守的E2中的表位。为了进一步确定抗CHIK.E2MAb组合的特异性，对相关的甲病毒进行抗原捕获ELISA。结果与间接ELISA相似。夹心的MAb8A4和3E4与CHIK.06-49株结合，并与伊-奥病毒IBH10964株也有较低程度的结合，但是不与ONN-59毒株或其它分离自非洲或亚洲之SF抗原复合物的相关成员产生交叉反应(数据未显示)。综上，这些数据表明抗CHIK.E2MAb8A4和3E4的组合适用于设计检测CHIK病毒(以及较低程度地检测伊-奥病毒)的夹心测定。
讨论
在本研究中，利用2006年分离自留尼旺岛的CHIK病毒株06-49在免疫小鼠中产生一组针对CHIKE2糖蛋白的MAb。本报道还描述了一种新的重组可溶性CHIKE2糖蛋白。本发明人在果蝇S2细胞中表达了对应于CHIK.06-49E2胞外结构域及其后主干区的CHIK.sE2。在该表达系统中，CHIK.sE2在经诱导之稳定S2细胞克隆的上清液中积累。间接ELISA和免疫印迹测定显示，CHIK.sE2被CHIK病毒的特异性抗体所识别。本发明人能够开发出生产高度纯化的CHIK.sE2抗原的纯化步骤。来自S2细胞培养物上清液的纯化CHIK.sE2蛋白适用于在间接ELISA和免疫印迹分析中容易地检测特异性针对CHIK病毒的抗体。
本发明人证实，3种抗CHIKE2MAb(3C3、3E4和8A4)在间接ELISA中与结合于CHIK病毒的E2糖蛋白具有显著的反应性。由于MAb3C3、3E4和8A4与完整CHIK病毒体中的E2反应，因此它们的表位可能位于病毒表面上。但是，这3种病毒不都能在体外中和灵长类动物细胞的CHIK病毒感染。由于抗CHIK.E2MAb与完整病毒的结合并未抑制病毒与宿主细胞的相互作用，因此它们的表位可能不位于CHIKE2糖蛋白的主要中和结构域。
免疫印迹分析的结果显示，MAb3C3和3E4在还原条件下与结合于CHIK病毒的E2和重组可溶性CHIKE2糖蛋白具有显著反应性。免疫荧光研究显示，这两种抗CHIKE2MAb可在被感染之灵长类动物细胞中成功地检测新合成的E2以及结合于PM的E2。基于它们与CHIK抗原的反应性，推测MAb3C3和3E4所识别的表位在E2外表面上至少部分是线性的。能够与MAb3C3和3E4反应的可溶性CHIK.sE2蛋白可用作表位作图分析中的重组抗原。计划对来源于CHIK.sE2的亚片段进行竞争性结合研究来进行评估。也可应用噬菌体展示的随机肽文库来鉴定抗CHIK.E2MAb的表位(Davis等人，2000)。在免疫印迹分析中，MAb8A4不能识别结合于CHIK病毒体的E2，并且与MAb3C3和3E4相比，其显示出与CHIK.sE2在还原条件下的反应较弱。流式细胞术分析的结果表明，MAb8A4主要靶向感染了CHIK病毒之细胞中结合于PM的E2。免疫印迹分析的结果表明，MAb8A4可识别可溶性E2蛋白的同源寡聚形式。尽管CHIKE2糖蛋白的原子结构尚未确定，然而，MAb8A4所识别的表位很可能是天然形式E2外表面的构象表位。
IF测定显示，这3种抗CHIK.E2MAb显示出与伊-奥病毒的交叉反应性，但是与ONN-59毒株则无交叉反应性。CHIK、ONN和伊-奥病毒从血清学归类上属于SF抗原复合物(Strauss和Strauss的综述，1994)。ONN病毒于1959年从乌干达的人样品中分离得到(Haddow等人，1960)，伊-奥病毒于1966年从尼日利亚的人中分离得到(Olaleye等人，1988，1990)。最近有人提出伊-奥病毒是ONN的一个毒株(Lanciotti等人，1998；Powers等人，2000)。
E2氨基酸水平的序列同一性百分比表明，与2006年分离自留尼旺岛的CHIK.06-49毒株相比，伊-奥病毒BH10964毒株与ONN-59毒株更为相关(图7)。由于在1959年分离的ONN病毒株Gulu中的E2Thr164残基突变为Ala，CHIK和伊-奥病毒中高度保守的区域E2160-177(图7)可能形成这些抗CHIK.E2MAb的抗原性结构域的一部分。事实上，该区域中的残基可能参与形成覆盖于甲病毒体表面之E1-E2异二聚体的E2刺突顶端(Mukhopadhyay等人，2006)。由于1995年分离得到的ONN毒株SG650(ONN-95)在E2-164位具有苏氨酸残基(Lanciotti等人，1998)，对ONN-95的进一步研究可能有助于深入了解E2160-177区域在与抗CHIK.E2MAb结合中的作用。
病毒培养物上清液中存在高滴度的病毒颗粒以及E2存在于病毒颗粒的外表面和质膜上，这表明对CHIK病毒感染的检测应基于病毒抗原。单克隆抗体8A4可用于检测天然CHIK病毒体和可溶形式的CHIKE2糖蛋白。在抗原捕获ELISA中，一对MAb8A4(捕获抗体)和MAb3E4(检测抗体)能够检测培养于人细胞中的至少104.5FFU的CHIK病毒。该测试的检出限约为5ng可溶性E2分子。这一对抗CHIKE2MAb与CHIK病毒的中非/东非和西非的毒株有交叉反应性，而与SF复合物的相关成员无交叉反应(伊-奥病毒除外)。
综上，本发明人制备并表征了对CHIKE2糖蛋白具有反应性的MAb3C3、3E4和8A4三种抗体。这些MAb有助于研究CHIK病毒的生物学特性以及基孔肯雅热的发病机理(Borgherini等人，2007；Ozden等人，2007；Sourisseau等人，2007)。这三种抗CHIKE2MAb可用于CHIK病毒感染的诊断，诊断方法可包括免疫印迹和免疫荧光测定(Powers和Logue的综述，2007)。本发明的数据显示，MAb8A4和3E4还可在抗原检测ELISA中联合用于识别完整的CHIK病毒和可溶性CHIKE2糖蛋白。由于血液和组织中感染性病毒的滴度对于基孔肯雅热早期诊断来说足够高(Santhosh等人，2007)，因此很明显地，抗CHIKE2MAb8A4(捕获抗体)和3E4(检测抗体)的组合适于开发特异且灵敏的抗原检测系统。
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Claims (4)

1.与完整CHIK病毒特异性结合的抗基孔肯雅E2多肽(抗CHIKE2)单克隆抗体用于制备体外检测样品中是否存在基孔肯雅病毒(CHIK)株或来自基孔肯雅病毒(CHIK)的包膜E2多肽的诊断试剂的用途，其中所述单克隆抗体与位于CHIK病毒外表面上的CHIKE2蛋白表位特异性结合并且选自2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3824(3E4)和I-3823(8A4)的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
2.权利要求1的用途，其中所述样品与抗CHIK单克隆抗体的组合接触，所述组合由捕获单克隆抗体和检测单克隆抗体组成，并且其中所述捕获单克隆抗体由2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3823(8A4)的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体组成，且所述检测单克隆抗体由2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3824(3E4)的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体组成。
3.与完整CHIK病毒特异性结合的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与位于CHIK病毒外表面上的CHIKE2蛋白表位特异性结合并且选自2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3824(3E4)和I-3823(8A4)的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
4.检测样品中是否存在基孔肯雅病毒(CHIK)株或基孔肯雅病毒(CHIK)E2多肽的试剂盒，其包含选自2007年9月6日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心，28rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15)的登记号为I-3824(3E4)和I-3823(8A4)的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
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