ES2550997T3 - Anticuerpos monoclonales anti-Chikungunya y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente al virus CHIK entero, en donde el anticuerpo monoclonal se fija específicamente a un epítopo de la proteína CHIK E2 localizado en la superficie exterior de un virus CHIK y se selecciona del grupo depositado en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos) 28 rue du Docteur Ros, 75724 Paris Cedex 15, en fecha 6 de septiembre de 2007 bajo los números de acceso I-3824 (3E4), e I-3823 (8A4).
Description
Anticuerpos monoclonales anti-Chikungunya y usos de losmismos
La presente invención se refiere al campo de la arbovirosis causada por el virus Chikungunya (CHIK). La presente invención concierne específicamente a anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-CHIK, y más específicamente MAbs anti-CHIK.E2 y su uso como productos de diagnóstico en métodos para detección de la presencia o ausencia de una cepa de CHIK.
El virus Chikungunya (CHIK) tiene la capacidad de causar epidemias explosivas en África, India, y el Sudeste de Asia (Epstein, 2007; revisado por Powers y Logue, 2007). El virus es transmitido por mosquitos del género Aedes (Ae.). El virus CHIK ha sido responsable de epidemias de magnitud sin precedentes en la isla La Reunión y el Océano Indico desde 2005, y en India, en donde una cifra estimada de 1,4 millones de habitantes se han infectado en 2006 (Schuffenecker et al., 2006; Staikowsky et al., 2006; Arankalle et al., 2007; revisado por Pialoux et al., 2007).
Los humanos infectados con el virus CHIK experimentan típicamente enfermedad aguda con poliartralgia incapacitante, dolor muscularsevero yrigidezen lasarticulacionesseguidaavecesporuna erupciónmaculopapular (Johnston y Peters,1996;Borgherin et al., 2007; revisado por Pialoux et al., 2007; Rulli et al., 2007). La infección del virus CHIK está asociada en casi todos los casos con mialgias. La infección del virus CHIK de las células satélites en el interior de los músculos podría explicar, en parte, algunas características de las manifestaciones clínicas (Ozden et al., 2007). Los síntomas clínicos de la infección de virus Chikungunya son a menudo diagnosticados erróneamente para enfermedades arbovirales debido a otros alphavirus artritogénicos tales como elvirus Igbo-Ora de África Occidental, el virus O'nyong-nyong (ONN) de África Central, los virus Ross River y Barma de Australia y el virusPacíficoMayaro de América del Sur, así como el virus Sindbis (SIN) cosmopolita.
El virus CHIK es un miembro del género alphavirus y la familia Togaviridae (revisado por Strauss y Strauss, 1994). Los alphavirus son pequeños virus de RNA positivos monocatenarios envueltos que exhiben un gran tropismo celular. Las superficies virales están cubiertas de picos anclados a la membrana compuestos de tripletes de heterodímeros de las glicoproteínas E1 y E2 de la envoltura. Las proteínas del pico viral facilitan la fijación a las superficies celulares y la entrada del virus. La glicoproteína E1 de la envoltura es una proteína de fusión de clase II que media la fusión membranal activada a pH bajo durante la infección del virus. E2 es una glicoproteína transmembranal de tipo I de 50 kDa: los primeros 260 aminoácidos constituyen el ectodominio, seguido por aproximadamente 100 aminoácidos que forman la región del vástago, una región que abarca 30 aminoácidos, y un endodominio citoplásmico corto de 30 aminoácidos (Pletnev et al., 2001; Mukhopadhyay et al., 2006). pE2 (el precursor de 62 kDa para las proteínas E3 y E2) y E1 están ensamblados como heterodímeros en el retículo endoplásmico (revisado por Strauss y Strauss, 1994). Después de la escisión de pE2 en el aparato de Golgi para formar E3 y E2, los complejos E1-E2 son transportados a la membrana plasmática (PM). La interacción del ectodominio citoplásmico E2 con la nucleocápsida preensamblada es uno de los pasos iniciales en el proceso de la envoltura delvirus en laPM.La integridad delvirion semantieneporinteraccionesdirectasentreE1 yE2 (Strauss y Strauss, 1994). Durante el curso del ciclo vital del alphavirus, la glicoproteína E2 es responsable de la fijación del receptor. La mayoría de los anticuerpos neutralizantes reconocen epítopos en E2 más bien que en E1 (revisado por Strauss y Strauss, 1994). Los anticuerpos que reconocen epítopos conformacionales en la superficie exterior de E2 tienen potencial para neutralizar la infección de alphavirus.
La diagnosis biológica de la infección de virus CHIK está basada esencialmente en un método cuantitativo en tiempo real basado en RT-PCR durante la fase virémica inicial (Edwards et al., 2007; Laurent et al., 2007; Santhosh et al., 2007). Los métodos serológicos detectan tempranamente IgM anti-CHIK después de las primeras manifestaciones clínicas e IgG específica después de 2 semanas (revisado por Pialoux et al., 2007). Sin embargo, los ensayos ELISA y de inmunodetección son escasamente específicos y sensibles debido a la reactividad cruzada del virus CHIK con miembros afines del complejo antigénico del Bosque de Semliki (SF) (Greiser-Wilke et al., 1991).
Figura 1: Composición de la proteína CHIK y especificidad antigénica de la preparación viral. Antígenos CHIK (CHIK Ags) se separaron por 4-12% SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y se visualizaron directamente por tinción con Azul Coomassie (izquierda) o se sometieron a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF para análisis de inmunotransferencia utilizando anti-CHIK HMAF (derecha). Las posiciones de los marcadores de peso molecular (MW) se indican en kDa.
Figura 2: Antigenicidad de la glicoproteína CHIK sE2 recombinante soluble. Se realizó el análisis de imunotransferencia con la proteína CHIK.sE2 recombinante soluble purificada y DEN-1 sE anti-CHIK HMAF (CHIK HMAF), suero humano normal (suero neg.), y suero de paciente CHIK-positivo (suero CHIK pos.).
Figura 3: Ensayos de clasificación cinética en sobrenadantes de hibridoma productores de anticuerpos. Las curvas muestran la fijación monitorizada en unidades de resonancia (RU) de la proteína 50 mM CHIK.sE2 en sobrenadantes de hibridoma productores de anticuerpos 3C3, 3E4, 5A8, 6F2, 8A4, y 9B5 a lo largo del tiempo.
Figura 4: Sensibilidad de detección de E2 utilizando MAbs anti-CHIK.E2. Se utilizó el virus CHIK purificado con sacarosa para recubrir las placas ELISA a 105 FFU/pocillo y se añadieron concentraciones crecientes de MAbs 3C3 (▲), 3E4 (○), y 8A4 (■). La reactividad de MAbs se ensayó por ELISA indirecto como se describe en Métodos.
Figura 5: Reactividad de MAbs anti-CHIK.E2 con E2 sintetizado endógenamente en células infectadas. Se infectaron células Vero 24 horas con virus CHIK.06-49 a 0,4 MOI. En (A), detección de E2 por ensayo IF utilizando MAbs anti-CHIK.E2. Las células fijadas se permeabilizaron (+TX-100) o no se permeabilizaron (-TX-100) y se sometieron luego a inmunotinción con 2,5 μg.mL-1 MAb 3C3, 3E4, o 8A4. Se utilizó como control anti-CHIK HMAF (dilución 1:500). En (B), análisis de citometría de flujo de células infectadas con el virus CHIK utilizando MAbs anti-CHIK.E2. Las células infectadas fijadas (línea continua) o células falsamente infectadas (línea de puntos) se permeabilizaron con saponina (línea negra) o no se permeabilizaron (línea gris) y se sometieron luego a inmunotinción con 2,5 μg.mL-1 de MAb 3C3, 3E4, o 8A4. Como control positivo se utilizó anti-CHIK HMAF (dilución 1:500).
Figura 6: Se determinó la reactividad de MAbs anti-CHIK.E2 para las proteínas E2 reducidas por análisis de inmunotransferencia. Las membranas se transfirieron con 100 ng de proteína CHIK.sE2 purificada (pista 1) o 105 FFU de virusCHIKpurificadoconsacarosa(pista2)yseincubaronindividualmenteconMAb 3C3,3E4,u 8A4 como se describe en Métodos. Como control positivo se utilizó anti-CHIK HMAF.
Figura 7: Alineación de secuencias E2 de CHIK (SEQ ID NO: 1), Igbo-Ora (SEQ ID NO: 2) y virus ONN (SEQ ID NO: 3), mostrando la región de los residuos E2-1 a E2-364. Los sitios de glicosilación enlazados a asparagina están marcados con (♦). Los marcos abiertos indican las tres diferencias específicas de los aminoácidos en el virus ONN en comparación con los virus CHIK e Igbo-Ora.
Figura 8: Sensibilidad de ELISA de captura de antígeno utilizando MAbs anti-CHIK E2. Se realizó un análisis cuantitativo utilizando MAb 8A4 como anticuerpo de captura y MAb 3E4 como anticuerpo de detección y sobrenadantes de cultivo de virus (A) y glicoproteína recombinante soluble CHIK.sE2 como antígeno viral (B). En (A), virus CHIK.06-49diluidoenserie desarrollado encélulasdemosquito AP61 (●) o células humanas 293A(□). En
(B) concentraciones crecientes de proteína recombinante soluble CHIK.sE2 purificada.
Los inventores han desarrollado y caracterizado anticuerpos monoclonales (MAbs) que encuentran una ventaja particular en el estudio de la biología del virus CHIK y la patogénesis de la enfermedad relacionada con CHIK.
Como puede apreciar un experto en la técnica, la originalidad de la presente invención reside en el hecho de que los inventores han producido y caracterizado un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) que se fijan específicamente al virus CHIK entero o a la glicoproteína CHIK E2, incluso a su forma soluble.
En conexión con esto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente a un epítopo localizado en la superficie externa de un virus CHIK, tal como los depositados en la NCCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, en fecha 6 de septiembre 2007 bajo los números de acceso I-3824 (3E4), e I-3823 {8A4). Como se utiliza en esta memoria, el término "se fija específicamente a" se refiere a anticuerpos que se fijan con afinidad relativamente alta a una proteína CHIK contemplada por la presente invención, tal como la glicoproteína E2, pero que no reconocen sustancialmente ni se fijan a moléculas distintas de la glicoproteína CHIK E2. Como se utiliza en esta memoria, el término "afinidad relativamente alta" significa una afinidad de fijación entre el anticuerpo y la proteína de interés de al menos 10-6 M, y con preferencia de al menos aproximadamente 10-7 M y de modo aún más preferible 10-8 M a 10-10
M. La determinación de dicha afinidad se realiza preferiblemente en condiciones de inmunoensayo estándar de fijación competitiva que es conocimiento común para un experto en la técnica.
Como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína producida por células linfoides en respuesta a una estimulación con un inmunógeno. Los anticuerpos poseen la capacidad de reaccionar in vitro e in vivo específica y selectivamente con un determinante antigénico o epítopo que provoca su producción o con un determinante antigénico estrechamente relacionado con el antígeno homólogo. El término "anticuerpo" debe entenderse que abarca construcciones que utilizan la región de fijación (variable) de dicho anticuerpo, y otras modificaciones del anticuerpo. Así, un anticuerpo puede comprender un anticuerpo entero, un fragmento de anticuerpo, un agregadopolifuncional de anticuerpo, o engeneral unasustancia que comprende uno omás sitios de fijación específicos de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento tal como un fragmento Fv, Fab o F(ab')2 o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv monocatenario. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser no recombinante, recombinante o humanizado. El anticuerpo puede ser de un tipo de inmunoglobulina, v.g., IgG, IgM, etcétera. Adicionalmente, puede utilizarse en caso apropiado un agregado, polímero, derivado y conjugado de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención o combinación de los mismos, encuentran un uso particular como reactivos de diagnosis, y/o para el cribado de una infección de CHIK incluso si tal infección es asintomática. Los anticuerpos monoclonales de la invención encuentran un uso adicional en métodos de diagnóstico que pueden incluir, pero sin carácter limitante, ensayos de inmunofluorescencia, inmunotransferencia y ELISA.
Se proporciona un método para detección de la presencia o ausencia de una cepa de Chikungunya virus (CHIK) en una muestra, que comprende los pasos de:
a) puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo monoclonal anti-CHIK de la presente invención o
con una combinación de anticuerpos monoclonales anti-CHIK de la invención para formar un complejo
inmune; y
b) detección de la presencia o ausencia del complejo inmune formado en a).
Más específicamente, la presente invención concierne a un método para detección de la presencia o ausencia del polipéptido E2 de la envoltura o derivado funcional o su precursor E3E2 (p62) del polipéptido E2 de Chikungunya (CHIK) en una muestra, que comprende los pasos de:
a) puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo monoclonalE2anti-CHIK de la presente invención
o con una combinación de anticuerpos monoclonales anti-CHIK de la invención para formar un
complejo inmune; y
b) detección de la presencia o ausencia del complejo inmune formado en a).
Como se utiliza en estamemoria,el término"derivadofuncional"serefiere a un fragmento delaglicoproteína E2,tal como el ectodominioE2,que retiene todavía la capacidaddeserreconocido porlos anticuerposmonoclonalesde la presenteinvención.Eltérmino "epítopo"serefiere alsitio en un antígeno,tal como la glicoproteína E2,al cualse fija una molécula de anticuerpo específica, tal como los anticuerpos monoclonales de la invención. Como se utiliza en esta memoria, el término "muestra"se refiere a una diversidad de tipos de muestra obtenidos a partir de un individuo y puede utilizarse en un ensayo de diagnóstico o detección conforme a la presente invención. La definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras sólidas de tejido tales como un espécimen de biopsia
o cultivos o células de tejido derivados del mismo, y la progenie delmismo.
Como puede apreciarse, en el caso en que se utiliza una combinación de anticuerpos monoclonales anti-CHIK, un anticuerpo monoclonal puede consistir en un anticuerpo de captura, tal como 8A4, y un segundo anticuerpo monoclonal puede consistir en un anticuerpo de detección, tal como 3E4. Tales anticuerpos de captura y de detección pueden encontrar, por ejemplo, uso ventajoso en un ensayo ELISA.
La presente invención concierne también a un kit para detección de la presencia o ausencia de una cepa de Chikungunya virus (CHIK) en una muestra, y más específicamente para detección de la presencia o ausencia de un polipéptido E2 de Chikungunya virus (CHIK) en una muestra. Los kits comprenden al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo depositado en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 28 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, en fecha 6 de septiembre 2007 bajo los números de acceso I-3824 (3E4), e I-3823 (8A4). Los kits pueden comprender paquetes, cada uno de los cuales contiene uno o más de los anticuerpos monoclonales arriba mencionados (típicamente en forma concentrada) que se requieren para realizar los tests de diagnóstico respectivos.
EJEMPLO
La fiebre Chikungunya es una arbovirosis de gran impacto en la salud pública en Asia y África. El virus Chikungunya virus (CHIK) es miembro del género Alphavirus y pertenece al complejo antigénico del Bosque de Semliki (SF). Los inventores describen por primera vez un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) reactivos con la glicoproteína E2 de la envoltura de CHIK. Para el cribado de MAbs específicos de E2, los inventores expresaron una proteína recombinante soluble CHIK E2 en células S2 de Drosophila. Analizados por métodos inmunológicos, se seleccionaron MAbs 3C3, 3E4 y 8A4 sobre la base de su reactividad.Sus epítopos están localizados en la superficie exterior de los viriones de CHIK. Estos MAbs no tienen reactividad cruzada alguna con los miembros afines del complejo antigénico SF, con la notable excepción del virus Igbo-Ora. Los MAbs E2 anti-CHIK 3C3, 3E4, y 8A4 son útiles para estudiar la biología del virus CHIK y la patogénesis de la enfermedad. La combinación de 8A4 y 3E4 es adecuada para desarrollar un ELISA específico de captura de antígeno.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se cultivaron células Vero en medio de crecimiento de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) desactivado por calor y 2 mM L-glutamina. Las células 293A (Quantum) se dejaron crecer en medio de crecimiento DMEM con piruvato (Invitrogen) suplementado con 10% FBS y 2 mM L-glutamina. Las células Vero y 293A se incubaron a 37ºC bajo CO2. Las células de mosquito AP61 Aedes pseudoscutellaris se cultivaron en medio de crecimiento Leibovitz L-15 suplementado con 10% SBS y 1% de caldo triptosa-fosfato (Eurobio). El linaje de células Schneider 2 (S2) de Drosophila melanogaster se adquirió de Invitrogen. Las células S2 se dejaron crecer en medio de crecimiento Schneyder (Invitrogen) con 10% de FBS. Las células AP61 yS2 de invertebradosse incubaron a27ºC.Todoslosmediossesuplementaron conlosantibióticos penicilina y estreptomicina.
El virus CHIK.06-49 (genotipo 4) se aisló de un adulto joven durante la epidemia de 2006 de fiebre Chikungunya en la isla La Reunión (Schuffenecker et al., 2006). El virus se hizo pasar dos veces a través de linajes de células de mosquito. Los stocks de virus se titularon por inmunoensayo estandarizado de enfoque de células AP61 (FIA) utilizando anti-CHIK HMAF, y los títulos se expresaron como FFU.mL-1 (Schuffenecker et al., 2006). Se obtuvieron concentraciones altas de CHIK.06-49 purificado a partir de células de mosquito infectadas. Resumidamente, se inocularon 20 matraces de monocapas de células AP61 con virus CHIK a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,4 FFU por célula. Los fluidos sobrenadantes de las células infectadas se cosecharon dos días después de la infección y se clarificaron. El virus se precipitó con 10% (p:v) de polietilenglicol (PEG) 8000 (Fluka) en 0,5 M NaCl a 4ºC durante 4 horas. Después de la centrifugación, el sedimento se resuspendió en tampón TNE (20 mM Tris-Cl [pH 8,0],150mMNaCl,2 mMEDTA)ysecentrifugó enungradiente discontinuode sacarosacompuestode60% (p:p)y 30% (p:v) de sacarosa a 39.000 rpm a 4ºC durante 2 h. La banda visible en la interfase se recogió y se diluyó en tampón TNE. El virus se purificó ulteriormente en un gradiente continuo de sacarosa 11-52% (p:v) a 35.000 rpm a 4ºC durante 18 h. La banda visible se recogió,se dividió en partes alícuotas, y se guardó a -80ºC.
Se generaron concentraciones altas de antígenos CHIK a partir de partículas de virus. Se inocularon 40 matraces de monocapas de células AP61 con virus CHIK.06-49 a 0,4 MOI. Los fluidos sobrenadantes de las células infectadas se recogieron dos días después de la infección y se clarificaron. Las partículas de virus se precipitaron con PEG 8000 en presencia de 0,5 M NaCl como se ha descrito arriba. El sedimento nuevamente suspendido en tampón TNE se suplementó con 20 mM trietanolamina (Sigma) y se incubó luego con 2% Triton X-100 (Sigma) durante 10 min en hielo. La suspensión se centrifugó durante 1 min a 2000 rpm y la preparación clarificada se aplicó a un gradiente continuo de sacarosa 10 a 30% y se centrifugó a 35.000 rpm durante 16 h a 4ºC. Se recogieron fracciones de la parte superior y se evaluaron por tinción con Azul Coomassie en SDS-PAGE e inmunotrasferencia. Las fracciones reunidas que contenían antígenos CHIK (preparación viral) se desactivaron por UV y la infectividad residual se comprobó por FIA.
Se emulsionaron 3 μg de preparación viral en una ratio igual con adyuvante completo de Freund (Sigma). Cuatro ratones BALB/cde 11semanas (Charles River)se inmunizaron porinyeccionessubcutáneas.Se administraron dos inyecciones de refuerzo a lasmismas dosis con intervalos de 3 semanas. Los ratonesse sangraron 10 días después de cada refuerzo. Se administró un refuerzo pre-fusión 4 días antes de la fusión (la misma dosis dividida en 4 inyecciones, 2 inyecciones subcutáneas seguidas por 2 inyecciones intraperitoneales).
Se fusionó el linaje de células de mieloma Sp2/0Ag14 con esplenocitos de ratones inmunizados conforme a protocolos estándar. Los hibridomas productores de anticuerpos se subclonaron dos veces y se congelaron en nitrógeno líquido. Se produjeron anticuerpos monoclonales in vitro por recogida de los sobrenadantes de alta concentración. Las purificaciones se realizaron por cromatografía de afinidad sobre n-proteína A Sepharose (GE Healthcare). Se determinó el isotipo de los MAbs con un kit de test de isotipificación de mAb de ratón (AbD Serotec) conforme a las recomendaciones del fabricante.
La secuencia CHIK.06-49 (no. de acceso a GenBank AM258994) codificante del ectodominio seguida por la región vástago de E2 (residuos E2-4 a E2-364) se amplificó a partir de un plásmido TOPO que contenía el gen CHIK.06-49 pE2 utilizando PCR con el cebador directo 5'AAAAAAGATCTGACAACTTCAATGTCTATAAAGCCACAAGACC-3' (SEQ ID NO:4)yel cebadorinverso 5'-TTTTTGCGGCCGCGTCATAGTGGGGTACAGCTCATAATAATACAG-3'(SEQIDNO: 5). El producto PCR se digirió con Bgl II y Not I y se insertó luego en los sitios singulares Bgl II y Not I del plásmido pMT/Bip/V5-HisA(Invitrogen)paragenerarpMT/BiP/CHIK.sE2.La secuenciaCHIK sE2 sesituó enmarco con una secuencia BiPque dirige la proteína recombinantealcamino secretor.En el vectordeexpresión,lasecuencia CHIK sE2 va seguida en su término C por el epítopo V5 y 6 histidinas para purificación por afinidad utilizando cromatografía de afinidad con quelato de níquel. Las células S2 de Drosophila (Invitrogen) se transfectaron con el plásmido recombinante pMT/BiP/CHIK.sE2 utilizando el Kit de Transfección con Fosfato de Calcio (Invitrogen). Las células transfectadas de manera estable se seleccionaron por adición de 25 μg/mL de blasticidina durante varias semanas. Las células S2 cultivadas que expresaban la proteína CHIK.sE2se adaptaron en medio de cultivo exento de suero que contenía 10 μg/mL de blasticidina. Se añadió CuSO4 a una concentración final de 500 μMpara inducir la síntesis y secreción de proteína CHIK.E2 recombinante soluble. La acumulación de CHIK.sE2 en el medio de cultivo era máxima 10 días después de la adición de CuSO4. Los sobrenadantes del cultivo de células se sometieron a pases en filtros de 0,2 μM. Las muestras de proteína se concentraron en columnas Vivaspin de 10.000 -MWCo (Vivasciences) y se dializaron luego en PBS. Alternativamente, la proteína CHIK.sE2 recombinante se purificó a partir del sobrenadante del cultivo de células por cromatografía en columna equilibrada de formación de quelato (HiTrap Chelating HP, Amersham). La columna se lavó varias veces con tampón de lavado (0,5 M NaCl, 50 mM tampón de fosfato de sodio, [pH 8.0]) y la CHIK.sE2 fijada se eluyó con concentración creciente de imidazol. Las fraccionesquecontenían las proteínas CHIK.sE2 se agruparon yse dializaron en PBS.La formasolublede DEN-1, glicoproteína E (DEN-1 sE)se produjo también en células S2 de Drosophila.
Los ensayos de clasificación cinético se realizaron en un instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad) y el análisis de los datos se realizó utilizando Software ProteOn Manager (Bio-Rad). Se inmovilizó IgG anti-ratón (Sigma) en un SensorChip GLM (Bio-Rad) utilizando una química estándar de acoplamiento de amina. El tampón de ejecución TPBS (0,005% Tween-20 en PBS) se utilizó continuamente a todo lo largo del experimento a 25ºC. Resumidamente, se inyectaron 0,2 mL de una mixtura de 0,2 M EDC y 0,05 M Sulfo-NHS a una tasa de flujo de 0,030 mL.min-1 , seguido por 0,2 mL de 0,075 mg.mL-1 IgG anti-ratón diluido en tampón de acetato de sodio 10 mM a pH 4,5. La superficie se desactivó luego con 0,15 mL de 1 M etanolamina de pH 8,5. Los sobrenadantes de hibridoma diluidos
1:2 enTPBSsuplementadocon1 mg.mL-1 de alginato se inyectaron en 0,2mL a una tasa de flujo de 0,025 mL-min1, seguido por 0,2 mL de concentraciones crecientes de proteína CHIK.sE2 recombinante soluble.
Para el ELISA indirecto, se cubrió una placa Maxisorp (Nalgen Nunc), con 105 FFU de viriones CHIK purificados en sacarosa diluidos en D-PBS (Invitrogen), 50 ng de antígenos CHIK utilizados para inmunizaciones o 50 ng de proteína CHIK.sE2 recombinante soluble y se incubaron durante una noche a 4ºC. Los sitios inespecíficos de fijación de proteína se bloquearon con leche al 3% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST). Se añadieron sueros de ratones inmunizados, diluidos serialmente en PBST,lecheal 0,1% ysobrenadantesde cultivo decélulas1:2,diluidosen elmismo tampón,yse incubaron a37ºC durante 2 horas en las placas recubiertas. Después de lavado con PBST, se añadió una IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa diluida en ratio 1:5000 (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que contenía leche al 1% durante1hora a37ºC.Despuésdellavado, se añadiósustrato base de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB,KPL). La reacción coloreada se paró con 0,1 mL de 1 M H3PO4, a cada pocillo, y los plastos se examinaron a 450 nm en un lector ELISA OpsysMR (Dinex Technologies).
Para preparar el MAb de detección, los MAb purificados se marcaron con peróxido-oxidorreductasa (POD) en el grupo amina del anticuerpo como se ha descrito previamente (Nakane y Kawaoi, 1974). El MAb purificado para la captura de antígeno se inmovilizó en placas Maxisorp (Nalgen Nunc) por incubación de 2 μg.mL-1 de anticuerpo en 0,1 mL de tampón de carbonato [pH 9,2] durante una noche a la temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron luego dos veces con TPBS, seguido por bloqueo con 8% (p/v) de sacarosa en PBS suplementado con leche desnatada al 3% durante 1 hora a 37ºC. Después de separar el agente de bloqueo, se desecaron las placas durante 10 min a 50ºC, se secaron los pocillos y se guardaron a 4ºC antes de su utilización. Se añadió sobrenadante de cultivo de virus o proteína CHIK.sE2 recombinante soluble diluida en PBST con 1% de leche desnatada a los pocillos (0,1 mL/pocillo) y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de varios lavados, los pocillos se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 1 μg.mL -1 por pocillo de MAb conjugado a POD (0,1 mL/pocillo) en PBST con 1% de leche desnatada. Después del lavado, se añadió sustrato de TMB y las placas se incubaron adicionalmente en la oscuridad durante 8 min. La actividad enzimática se midió como se ha descrito arriba.
Lasmuestras de proteína mezcladas con tampóndemuestradeLaemmlia la temperaturaambientese cargaron en la SDS-PAGE al 4-12% (NuPage, Invitrogen). Las muestras se sometieron a electrotransferencia en una membrana PVDF (Invitrogen) se bloquearon con 5% de leche en PBST. La membrana se sondó con anticuerpo primario y los anticuerpos fijados se detectaron por anticuerpo secundario conjugado a POD a dilución 1:10.000, seguido por soluciones de sustrato ECL (Amersham).
Para el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IF) células que habían crecido en cámaras Permanox Labtek (Nunc) se fijaron con 3,2% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 20 min y se incubaron luego con 50 mM NH4Cl en PBS durante 10 min. Las células se permeabilizaron o no con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 4 min y se incubaron luego con anticuerpo primario en PBS/0,2% gelatina a 37ºC durante 30 min. Después de lavado extenso con PBS, las células se incubaron adicionalmente con IgG anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceína (Pierce)a dilución1:100 en PBS/0,2% gelatina a 37ºC durante30min.Lasmuestrasse observaronpor microscopía de fluorescencia.
Para la fluencia por citometría de flujo, las células se despegaron y se fijaron luego con 3,2% PFA en PBS. Las células fijadas se lavaron prolongadamente con tampón de tinción SB (0,1% p/v) acida de sodio en 1% FBS; pH 7,5), y se incubaron con anticuerpo primario diluido en SB o en tampón de permeabilización PB (tampón SB suplementado con 1% [p/v] saponina) a 37ºC durante 90 min. Después de lavado prolongado, las células se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado a fluoresceína (Pierce) diluido en ratio 1:100 en SB o PB a 37ºC durante 1 hora. Después de lavado prolongado, las células se analizaron por citometría de flujo utilizando un FACSCalibur (Becton Dickinson) con software CellQuest Pro (BD Biosciences).
RESULTADOS
Con objeto de producir antígenos virales, se precipitaron viriones CHIK a partir de sobrenadantes de células de mosquito infectadas por la cepa 06-49 de la isla La Reunión de virus CHIK (CHIK.06-49). Se incubaron concentraciones altasde partículasde viruscon 2%TritonX-100 y se aplicaron suspensionesvirales a un gradiente de sacarosa. Después de centrifugación, las fracciones se evaluaron por análisis Immunoblot. Los anticuerpos anti-CHIK detectaron pE2, C y en mucho menor proporción E2 a aproximadamente 15-20% de concentración de sacarosa. Las fracciones enriquecidas en pE2, E2 y C se reunieron y se trataron con U.V. a fin de llevar a cabo la inmunización de los ratones en un laboratorio BSL-2. Como se evaluó por tinción con Azul Coomassie de SDS-PAGE y de inmunotransferencia (Fig. 1), la banda principal observada después de separación de antígenos virales correspondía a pE2. La antigenicidad de la preparación viral se confirmó por ELISA indirecto utilizando fluidos de ascitis de ratón preinmune anti-CHIK (HMAF) (datos no presentados). Como controles negativos, sueros inmunes de ratón dirigidos contra el virus dengue (DEN) o el virus del Nilo Occidental no acusaban reactividad alguna.
Dado que los antígenos de arbovirus producidos en células S2 de Drosophila podían asemejarse a sus contrapartidas nativas de mosquito, los inventores expresaron glicoproteína CHIK E2 utilizando el Sistema de Expresión de Drosophila (Invitrogen). Se ha establecido un linaje de células S2 transfectadas de manera estable que expresan el ectodominio seguido por el vástago de E2 del virus CHIK.06-49 (designado en lo sucesivo CHIK.sE2). La adición de CuSO4 al medio de cultivo inducía la síntesis y secreción de la proteína recombinante soluble CHIK.sE2. La acumulación de CHIK.sE2 en el medio de cultivo era máxima 2 semanas después de la inducción. Para ELISA indirecto, proteínas CHIK.sE2 secretadas se concentraron directamente a partir de los sobrenadantes y se utilizaron para recubrir las placas ELISA. Para el análisis de inmunotransferencia y el ELISA de captura de antígeno, se purificó proteína recombinante soluble CHIK.sE2 a partir del medio de cultivo de células utilizando cromatografía de afinidad con quelato de níquel.
El análisis de inmunotransferencia demostró que la proteína recombinante soluble CHIK.sE2 (peso molecular aparente de 42 kDa) era reconocida por multi-CHIK HMAF y suero de pacientes CHIK-positivo (Fig. 2). Se observaron resultados similares utilizando ELISA indirecto (datos no presentados). Estos resultados sugieren que la proteína recombinante soluble CHIK.sE2 secretada por las células S2 tiene una conformación que está más próxima a la forma nativa de la glicoproteína CHIK. E2.
Se realizaron con éxito dos fusiones utilizando células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con preparación viral como se describe en las secciones Materiales y Métodos. Para cribado de los clones de hibridoma productores de anticuerpos, una preparación viral y proteína recombinante soluble CHIK.sE2 como antígenos CHIK en ELISA indirecto. Se identificaron aproximadamente 60 clones de hibridoma productores de anticuerpos como fijadores de anticuerpos que eran al menos 4 veces mayores que el nivel de reactividad de ruido de fondo de suero de bovino fetal (FBS). Doce de los 60 clones de hibridoma eran capaces de reaccionar con los viriones CHIK purificados con sacarosa así como proteína recombinante soluble CHIK.sE2 por ELISA indirecto (datos no presentados). Después de cribado por ensayo IF, 5 clones de hibridoma productores de anticuerpos (3C3, 3E4, 5A8, 6F2 y 8A4) exhibían reacción positiva fuerte contra las células infectadas con el virus CHIK (datos no presentados). El análisis con biosensor ProteOn demostró que los 5 clones reconocían CHIK.sE2 con alta afinidad de fijación aparente (Fig. 3). Tres de 5 clones de hibridoma productores de anticuerpos (3C3, 3E4 y 8A4) exhibían asociación rápida y disociación lenta de la proteína CHIK.sE2 recombinante soluble (datos no presentados). Conforme a estos resultados, los clones de hibridoma productores de anticuerpos 3C3, 3E4 y 8A4 han sido subclonados y expandidos posteriormente. Los experimentos siguientes se realizaron utilizando MAbs anti-CHIK.E2 purificados a partir de los sobrenadantes de clones de hibridoma.
Las características de losMAbs 3C3, 3E4 y 8A4 se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1: Características de MAbs anti-CHIK.E2
(FRNT) para evaluar la capacidad de los MAbs anti-CHIK.E2 purificados para inhibir la replicación del virus CHIK en células Vero cultivadas. El título de punto final se calculó como la dilución máxima de anticuerpos testada que
15 reducía ~ 100 Unidades de Formación de Foco en células AP61 (FFU) de virus CHIK.06-49 al menos un 90% (FRNT90). Mientras que el anti-CHIK HMAF daba un FRNT90 de los medios de dilución 1:2500, ni MAb 3C3, MAb 3E4, ni MAb 8A4 neutralizaban el virus CHIK a una concentración tan alta como 10 μg.ML-1 (datos no presentados).
20 Se realizaron tests ELISA indirectos sobre el virus CHIK para evaluar si los MAbs anti-CHIK.E2 seleccionados reconocen la superficie del virion. Con este objetivo, se utilizó el virus CHIK.06-49 purificado con sacarosa para recubrir las placas ELISA a 105 FFU por pocillo y se añadieron concentraciones crecientes de MAbs. Los MAbs 3C3, 3E4 y 8A4 reaccionaban con las partículas de virus nativas en ELISA indirecto (Fig. 4), lo que sugería que sus
25 epítopos estaban expuestosen la superficie exterior del virus CHIK. Para analizar la capacidad de fijación de los tres MAbs anti-CHIK.E2 en condiciones detergentes, el virus CHIK se incubó con 2% Triton X-100 y se aplicó luegocomo recubrimiento sobre las placas ELISA. Únicamente MAb 8A4 exhibía reactividad importante con el virus CHIK en condiciones desnaturalizantes (datos no presentados), lo que indicaba que el MAb 8A4 es capaz de reconocer la glicoproteína CHIK E2 en presencia de detergente no iónico.
30 En el ELISA indirecto, las respuestas dosis-curva demostraban que MAbs 8A4 y 3E4 se fijaban mejor al virus CHIK que lo hacía MAb 3C3 (Fig. 4). Como se estimó por este test de detección de antígeno, la reactividad de MAb 3C3 era diezvecesmenorcomparada conMAbs 8A4 y3E4.Paraevaluarsilosparesde MAbs anti-CHIKE2 pueden ser útiles para un ensayo sándwich, se realizó un estudio de complementariedad sobre la proteína CHIK.sE2
35 recombinante soluble por análisis con biosensor ProteOn. MAbs 3C3 y 3E4 exhibían reactividad significativa con CHIK.sE2 fijado a MAb 8A4, y el resultado óptimo se obtuvo cuando se utilizó MAb 3E4 como anticuerpo de detección (datos no presentados). Así pues, la combinación de MAbs 8A4 anti-CHIK.E2 (anticuerpo de captura) y 3E4 (anticuerpo de detección) es adecuada para el desarrollo de ELISA de captura de antígeno.
40 La capacidad de fijación de MAbs a la glicoproteína CHIK E2 se investigó ulteriormente por ensayo IF (Fig. 5A) y análisis de citometría de flujo (Fig. 5B). Se utilizó HMAF anti-CHIK como control positivo. En el ensayo IF, los MAbs 3C3, 3E4 y 8A4 reaccionaban fuertemente con las proteínas E2 sintetizadas endógenamente en células Vero infectadas con el virus CHIK (Fig. 5A). Como control negativo, el MAb 4E11 anti-DEN E no exhibía reactividad alguna (datos no presentados). La totalidad de los tres MAbs anti-CHIK.E2 reconocían la glicoproteína CHIK E2
45 transportada a la PM (Fig. 5A, -TX-100), lo que sugería que sus epítopos están accesibles en la cara exterior de E2. Por análisis de citometría de flujo,MAbs 3C3 y 3E4 exhibían valores medios similares de intensidad de fluorescencia en células Vero infectadas por el virus CHIK permeabilizadas o no con saponina (Fig. 5B). Así pues, ambos MAbs anti-CHIK.E2 son capaces de reconocer moléculas E2 reciénsintetizadas análogamente y E2 asociadas a PM.
El análisis por citometría de flujo reveló que la reactividad de MAb 8A4 anti-CHIK.E2 era distinta de MAbs 3C3 y 3E4. De hecho, MAb 8A4 exhibía una reactividad más débil con las células infectadas porel virus CHIK en presencia de saponina (Fig. 5B). Dado que MAb 8A4 está direccionado preferentemente a E2 asociado a PM, es probable que su epítopo esté expuesto predominantemente en la cara externa de la forma nativa de E2.
Se realizó una inmunotransferencia con viriones CHIK purificados con sacarosa y proteína recombinante soluble CHIK.sE2 a fin de determinar si los MAbs anti-CHIK.E2 se fijaban a epítopos lineales (Fig. 6). Como control positivo, se sondó HMAFanti-CHIKa E2 yCHIK.sE2 asociadosalvirus.Losinventoresobservaron que los MAbs 3C3y3E4 eran capaces de reaccionar con E2 en las condiciones reductoras. Para determinar si estos MAbs reconocen epítopos de péptidos lineales, se preparó un sistema de péptidos 15-meros solapantes inmovilizados que cubrían la secuencia entera de aminoácidos de CHIK.sE2, por medio de la técnica SPOT. Los péptidos sintéticos lineales eran incapaces de formar epítopos para los dos MAbs anti-CHIK.E2 (datos no presentados). Estos resultados sugieren que losMAbs 3C3 y 3E4 reconocían epítopos parcialmente lineales.
El MAb 8A4 anti-CHIK.E2 no lograba reaccionar con la proteína E2 asociada al virus CHIK en análisis de inmunotransferencia (Fig. 6), lo que sugería que este MAb podría reconocer un epítopo de conformación. Si bien MAb 8A4 produce una reacción más débil con CHIK.sE2 en las condiciones reductoras comparado con los MAbs 3C3 y 3E4, el mismo exhibía reactividad con dos bandas de proteína adicionales con pesos moleculares estimados de aproximadamente 100 y 150 kDa (Fig. 6, MAb 8A4, pista 1). Dicha observación sugiere que MAb 8A4 tiene la capacidad de detectar formas trímeras de E2 soluble.
Se realizaron ensayos IF sobre células de mosquito infectadas para evaluar si los tres MAbs anti-CHIK.E2 reconocen el virus SIN y miembros afines del serocomplejo SF aislado en el Viejo Mundo tales como los virus SF, Igbo-Ora, ONN, Babanki, Zingilamo, Milddelburg, Ndumu, y Arv9/71. La Tabla 2 resume la reactividad cruzada de los MAbs: los HMAF anti-CHIK mostraron un alta reactividad con la cepa CHIK S27, la cepa Igbo-Ora IBH10964, la cepa ONN Gulu (ONN-59), la cepa AnB1245d Zingilamo y la cepaSF IPD/A; actividad moderada con la cepa SIN Ar399; actividad débil con la cepa ARy251 Babanki y ninguna reactividad cruzada con la cepa SAAr749 Milddelburg, la cepa SAAr2204 Ndumu y el virus Arv9/71. La reactividad de los MAbs anti-CHIK.E2 en el test de anticuerpos fluorescentes era distinta de HMAF anti-CHIK. Como se muestra por los resultados de los ensayos IF, MAbs 3C3, 3E4,y8A4 reaccionaban conelvirusCHIKyenmenorproporción elvirus Igbo-Ora(Tabla 2).Enelensayo IF,MAb 8A4 exhibía reactividad similar con células de mosquito infectadas con el virus CHIK o el virus Igbo-Ora.
Tabla 2: Reactividad cruzada de los MAbs anti-CHIK.E2 con alphavirus utilizando el ensayo IF
Anticuerpos
- a.
- Test de anticuerpos fluorescentes. Células AP61 infectadas se fijaron 24 horas después de la infección con PFA, se permeabilizaron con Triton X-100 y se sometieron a inmunotinción como se describe en Métodos. (++) señal de fluorescencia fuerte, (+) moderada, y (+/-) baja. (-) Ausencia de reacción positiva. CHIK: Chikungunya, ONN: O'nyong-nyong, SF: Bosque de Semliki, SIN: Sindbis.
- b.
- Suero inmune de ratón a dilución 1:500
- c.
- La concentración de anticuerpos se ajustó a 2,5 μg.mL-1
- d.
- La concentración de anticuerpos se ajustó a 3,0 μg.mL-1
La alineación de las secuencias de aminoácidos del ectodominio y la región del vástago de E2 (E2-1 a E2-364) para el virus CHIK.06-49, el virus ONN-59 (nº de acceso a GenBank M20303) y la cepa 10964 de Igbo-Ora IBH (nº de acceso a GenBank AF079457) se muestra en Fig. 7. Los dos sitios de glicosilación enlazados a N identificados en las posiciones 263 y 345 están conservados en los virus CHIK, ONN, e Igbo-Ora. El análisis genético sobre los 365 primeros residuos de E2 identificó sólo 5 diferencias de aminoácido (98,5% de identidad) entre las cepas de virus Igbo-Ora y ONN (Fig. 7). Existen 45 diferencias de aminoácidos (87,5% de identidad) entre el virus CHIK y los otros dos miembros afines del complejo antigénico SF. El análisis comparativo de las secuencias E2 demostró que ONN59 difiere de los virus CHIK.06-49 e Igbo-Ora IBH 10.964 en las posiciones E2-130, E2-164, y E2-288 (Fig. 7, marcos abiertos). Curiosamente, la sustitución Thr164Ala mapea a la región E2-160-177 estrictamente conservada en los virus CHIK e Igbo-Ora. Esta región rica en prolina podría estar expuesta en la superficie del pico E2 en el alfavirión (Mukhopadhyay et al., 2006).
Como se ha expuesto anteriormente, los MAbs 8A4 y 3E4 anti-CHIK.E2 son adecuados para detección del virus CHIK en un ELISA sándwich. Se utilizó MAb 8A4 (2 μg.mL-1) como anticuerpo de captura en las placas ELISA y MAb 3E4 (1 μg.mL-1) conjugado a peroxidasa como anticuerpo de detección. Para determinar la sensibilidad del ELISA de captura de anticuerpo, se utilizaron diluciones seriadas de CHIK.06-49 cultivadas en células AP61 de mosquito o 293A humanas para determinar curvas estándar (Fig. 8A). Se utilizó DPBST/leche al 1% para determinar la línea basal para captura de antígeno a una densidad óptica de 0,15 a 450 nm. De este modo, el valor de punto de corte para la detección de virus CHIK diluidos en DPBST/leche al 1% se ajustó a 0,45, lo que es igual al valor medio +3 desviaciones estándar (S.D.) de la DO450 para DPBST/leche al 1%. Conforme al umbral de punto de corte, el límite de detección del ELISA era aproximadamente 106.0 AP61FFU del virus CHIK derivado de células de mosquito y 104.3 FFU de virus CHIK derivado de células humanas (Fig. 8A). El ELISA de captura de antígeno era capaz también de detectar E2 en su forma soluble (CHIK.sE2) y la masa detectable mínima era aproximadamente 5 ng (Fig. 8B). El par de MAbs anti-CHIK.E2 tiene nivel de reactividad mayor con el virus CHIK activado en células 293A en comparación con las células de mosquito (Fig. 8A). Esto podría estar relacionado con la liberación de glicoproteínas E2 individualizadas en sobrenadantes de células humanas infectadas por el virus CHIK citopático. Los resultados muestran quelosMAbs 8A4 y3E4 puedenemplearse en combinación paradetectarlaproteína CHIKE2soluble así como la proteína E2 asociada al virión en elsobrenadante de cultivo de virus.
Existen dos genotipos de virus CHIK distintos en África (revisado por Powers y Logue, 2007). El primer genotipocomprendía aislados del virus CHIK de África Occidental. El segundo genotipo agrupaba aislados del virus CHIK deÁfrica Oriental/Central/Meridional. Para determinar la especificidad del par de MAbs anti-CHIK.E2, se realizaron testsELISA de captura de antígeno sobre un panel de aislados clínicos de virus CHIK obtenidos de África Central/Oriental(República Centroafricana, 1978; Océano Indico, 2005-06) y África Occidental (Costa de Marfil, 1999; Senegal, 1965-66 y 2005). Todas las cepas africanas de virus CHIK testadas cultivadas en células de mosquito se reconocieron (datos no presentados). Así pues, la combinación de MAbs 8A4 y 3E4 es capaz de reconocer epítopos en E2 que están conservados a través de los genotipos de virus CHIK de África Occidental y Central/Oriental. Para definir adicionalmente la especificidad de la combinación de MAbs anti-CHIK.E2, se realizó un ELISA de captura de antígeno sobre alphavirus afines. Los resultados eran similares a los de ELISA indirecto. Los MAbs 8A4 y 3E4 en sándwich se fijaban a la cepa CHIK.06-49 y también en menor proporción a la cepa Igbo-Ora IBH 10.964, pero no reaccionaban cruzadamente con la cepa ONN-59 u otros miembros afines del complejo antigénico SF aislado enÁfrica o Asia (datos no presentados). En conjunto, estos datos demuestran que la combinación de los MAbs 8A4 y 3E4 anti-CHIK.E2 es adecuada en el diseño de ensayos sándwich para la detección del virus CHIK, y en menor proporción el virus Igbo-Ora.
En este estudio, se utilizó la cepa 06-49 del virus CHIK aislada en la isla La Reunión en 2006 para generar un panel de MAbs contra la glicoproteína CHIK E2 en ratones inmunizados. Este informe describe también una nueva glicoproteína CHIK E2 recombinante soluble. Los inventores expresaron CHIK.sE2 que corresponde al ectodominio de E2 de CHIK.06-49 seguido por su región vástago en células S2 de Drosophila. En este sistema de expresión, CHIK.sE2 se acumulaba en los sobrenadantes de los clones de células S2 inducidos de manera estable. Los ensayos ELISA indirecto y de inmunotransferencia demostraron que CHIK.sE2 era reconocido por anticuerpos específicos para el virus CHIK. Los inventores lograron desarrollar procedimientos de purificación que producían antígenos CHIK.sE2 altamente purificados. La proteína CHIK.sE2 purificada del sobrenadante de cultivo de células S2 es adecuada para detección fácil de anticuerpos específicos para el virus CHIK en los análisis ELISA indirecto y de inmunotransferencia.
Los inventores demostraron que tres MAbs anti-CHIK E2 (3C3, 3E4, y 8A4) tienen reactividad significativa con la glicoproteína E2 asociada al virus CHIK en ELISA indirecto. Dado que los MAbs 3C3, 3E4, y 8A4 reaccionan con E2 en el contexto de un virión CHIK intacto, sus epítopos están localizados probablemente en la superficie del virus. Sin embargo, la totalidad de los tres MAbs fallaba en lo referente a neutralizar la infección del virus CHIK de las células de primate in vitro. Aunque la fijación de los MAbs anti-CHIK.E2 al virus entero no inhibía la interacción viral con las células hospedadoras, es probable que sus epítopos no mapeen al dominio principal de neutralización de la glicoproteína E2 de CHIK.
Los resultados del análisis de inmunotransferencia demostraron que los MAbs 3C3 y 3E4 tienen reactividad importante con E2 asociado el virus CHIK y la glicoproteína recombinante soluble CHIK E2 en las condiciones reductoras. Estudios de inmunofluorescencia han demostrado que los dos MAbs anti-CHIK.E2 pueden detectar con éxito E2 recién sintetizado así como E2 asociado a PM en células de primate infectadas. Basándose en su reactividad con los antígenos CHIK, se supone que los epítopos reconocidos por MAbs 3C3 y 3E4 son al menos parcialmente lineales en la cara exterior de E2. La proteína soluble CHIK.sE2 que es capaz de reaccionar con los MAbs 3C3 y 3E4 podría ser útil como antígeno recombinante para el análisis de mapeado de epítopos. La evaluación de subfragmentos derivados de CHIK.sE2 para estudios de fijación en competencia está planificada. Bibliotecas de péptidos aleatorios presentados en fago son también aplicables probablemente a la identificación de epítopos para MAbs anti-CHIK.E2 (Davis et al., 2000). En el análisis de inmunotransferencia, MAb 8A4 no lograba reconocer E2 asociado al virión de CHIK y exhibía una reactividad más débil con CHIK.sE2 comparado con MAb 3C3 o 3E4 en las condiciones reductoras. Los resultaos del análisis por citometría de flujo demostraron que MAb 8A4 está direccionado predominantemente a E2 asociado a PM en las células infectadas por el virus CHIK. Los resultados del análisis de inmunotransferencia demostraron que MAb 8A4 podría reconocer formas homooligómeras de proteína E2 soluble. Aunque la estructura atómica de la glicoproteína E2 de CHIK está todavía por determinar, es probable que el epítopo reconocido por MAb 8A4 sea conformacional en la cara externa de la forma nativa de E2.
Los tres MAbs anti-CHIK.E2 exhibían reactividad cruzada con el virus Igbo-Ora pero no con la cepa ONN-59 como se determinó por ensayo IF. Los virus CHIK, ONN e Igbo-Ora están clasificados serológicamente en el complejo antigénicoSF(revisadopor Strauss yStrauss,1994).Elvirus ONNfue aisladodemuestrashumanas en Uganda en 1959 (Haddow et al., 1960) y el virus Igbo-Ora fue aislado de humanos en Nigeria en 1966 (Olaleye et al., 1988, 1990). Se ha propuesto recientemente que el virus Igbo-Ora es una cepa de ONN (Lanciotti et al., 1998; Powers et al., 2000).
Los valores porcentuales de identidad de secuencia al nivel de aminoácidos de E2 indicaban que la cepa Igbo-Ora BH10964 está más estrechamente relacionada con la cepa ONN-59 que la cepa CHIK.06-49 aislada en la isla La Reunión en 2006 (Fig. 7). Dado que el residuo Thr164 de E2 ha mutado a Ala en la cepa Gulu del virus ONN aislada en 1959, la región estrictamente conservada E2 161-177 en los virus CHIK e Igbo-Ora (Fig. 7) podría formar parte del dominio antigénico para estos MAbs anti-CHIK.E2. De hecho, los residuos de esta región podrían participar en la punta del pico E2 de los heterodímeros E1-E2 que cubren la superficie del alfavirión (Mukhopadhyay et al., 2006). Dado que la cepa SG 650 de ONN aislada en 1995 (ONN-95) posee un residuo treonina en la posición E2-164 (Lanciotti et al., 1998), estudios adicionales que emplearan ONN-95 podrían aportar posiblemente ideas acerca del papel de la región E2 160-177 en la fijación de MAbs anti-CHIK.E2.
La presencia de títulos altos de partículas de virus enelsobrenadante de cultivo delvirus,asícomola presencia de E2 en la superficie exterior del virión, y en la membrana plasmática sugieren que la detección de la infección por el virus CHIKpodría estarbasada en antígenos del virus.Elanticuerpomonoclonal8A4 está disponible parauso en la detección de un virión CHIK nativo y en la forma soluble de la glicoproteína CHIK E2. En el ELISA de captura de antígeno, el par de MAb 8A4 (anticuerpo de captura) y MAb 3E4 (anticuerpo de detección) era capaz de detectar al menos 104,5 FFU de virus CHIK cultivado en células humanas. El límite de detección de este test era aproximadamente 5 ng de moléculas E2 solubles. El par de MAbs anti-CHIK.E2 tiene la reactividad cruzada para lascepas de África Central/Oriental y Occidental del virus CHIK y carece de reactividad con miembros afines del complejo SF, con la notable excepción del virus Igbo-Ora.
En conclusión, los inventores han generado y caracterizado tres MAbs 3C3, 3E4, y 8A4 reactivos con la glicoproteína CHIK E2. Tales MAbs son útiles para estudiar la biología del virus CHIK y la patogénesis de la fiebre Chikungunya (Borgherini et al., 2007; Ozden et al., 2007; Sourisseau et al., 2007). Los tres MAbs anti-CHIK.E2 son útiles en diagnósticos de la infección por el virus CHIK y los métodos de diagnóstico pueden incluir los ensayos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia (revisado por Powers y Logue, 2007). Los datos presentes demostraron que los MAbs 8A4 y 3E4 se utilizan también en combinación para reconocer virus CHIK total así como la glicoproteína CHIK E2 soluble en ELISA de detección de antígeno. Dado que el título de virus infeccioso en sangre y tejidos es suficientemente alto para conducir a la diagnosis temprana de la fiebre Chikungunya (Santhosh et al., 2007), está claro que la combinación de los MAbs anti-CHIK.E2 8A4 (anticuerpo de captura) y 3E4 (anticuerpo de detección) es adecuada para desarrollar un sistema específico y sensible de detección de antígeno.
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Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente al virus CHIK entero, en donde el anticuerpo monoclonal se fija específicamente a un epítopo de la proteína CHIK E2 localizado en la superficie exterior de5 un virus CHIK y se selecciona del grupo depositado en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos) 28 rue du Docteur Ros, 75724 Paris Cedex 15, en fecha 6 de septiembre de 2007 bajo los números de acceso I-3824 (3E4), e I-3823 (8A4).
- 2. Un kit para detectar la presencia o ausencia de una cepa del virus Chikungunya (CHIK) o de un virus Igbo10 Oraen una muestra, que comprende almenos un anticuerpo monoclonal conforme a la reivindicación 1.
- 3. Uso de un anticuerpo monoclonal conforme a la reivindicación 1 o una combinación de los mismos como reactivo de diagnosis in vitro.
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