CN110412267A - 犬副流感病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

犬副流感病毒单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及犬副流感病毒的鼠单克隆抗体2B7和4H1，该单克隆抗体的可变区序列能特异性、保守性地结合犬副流感病毒。其作为抗体对制备的胶体金检测试剂盒能高灵敏度的检测多种犬副流感病毒流行株和标准株，与RT‑PCR检测方法符合率高，能满足现阶段临床上的迫切需求。

Description

犬副流感病毒单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及犬副流感病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体的抗原检测试剂盒和应用，属于生物技术领域。
背景技术
犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)属于副黏病毒科、腮腺炎病毒属病毒，感染动物后多以咳嗽甚至伴随发热为主要症状，可引发咽炎、扁桃体炎和支气管炎等病症。该病毒可感染犬、狐狸、水貂、牛、家兔、猴、羊、马、禽类、豚鼠、小鼠、仓鼠、貉、虎等多种动物(刘腾飞，犬副流感病毒的检测和NP基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫学活性的研究,新疆农业大学,硕士学位论文，2010)，以犬、狐狸、水貂的阳性率较高；其中犬是其自然宿主，可感染各个品种及各个年龄段的犬类，特别是幼犬(最易感、病情严重且死亡率高)。此外，CPIV感染后可降低犬的免疫力，引起其它病原如犬瘟热病毒、犬腺病毒2型或细菌如支气管炎博德特菌、霉形体等病原混合感染或继发感染，其中临床上以其与犬瘟热病毒感染引发呼吸道感染，或与支气管炎博德特菌为主引起的传染性呼吸系统疾病(俗称犬窝咳)最为常见(Nicola Decaro，Molecular surveillance of traditional andemerging pathogens associated with canine infectious respiratory disease)。
犬传染性呼吸道疾病是犬类的常见疾病，至少有9种病原微生物可以在犬传染性呼吸道疾病发生过程中起着重要作用，分别是犬流感病毒、犬瘟热病毒、犬呼吸道冠状病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬疱疹病毒、支气管败血波氏菌、马链球菌兽疫亚种、支原体。这些病原感染后临床表现非常相似，难以区别。目前，确诊CPIV病原学的检测方法包括病毒分离、电镜观察、免疫荧光试验、RT-PCR或荧光定量PCR。其中，病毒分离、电镜观察、免疫荧光试验操作繁琐，灵敏度低；RT-PCR、荧光定量PCR，灵敏度高，但耗时长，对设备及人员技能要求均较高，仅适用于实验室检测，不适用于现场快速准确检测。而对于临床的检测及推广，胶体金检测试纸条具有检测快速、操作简便的优点，适用性更强。但是，目前CPIV胶体金检测试纸条的生产厂家较少，主要有上海快灵生物的胶体金检测卡以及Venture的犬副流感病毒胶体金检测试纸条，但其敏感性较低，易漏检，从而导致不必要的经济损失，而且这些商用试剂盒均不能在犬以外的宿主身上检测。
同时，现阶段的犬副流感病毒发生了一定程度的变异(参见文献Jae-Ku Oem等.Molecular characteristics of canine parainfluenza viruses type 5(CPIV-5)isolated in Korea.Canadian Journal of Veterinary Research,Volume 79,Number 1,January 2015,pp.64-67(4)；以及孙明等，犬副流感病毒的分离鉴定及部分基因序列，中国比较医学杂志，2016.02,26(2):77-82)，其抗原的变化为有效检测和准确确定动物的感染带来了更大的难度。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了两种犬副流感病毒单克隆抗体，特别地，均为针对犬副流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，其能特异性、保守性地结合犬副流感病毒。
本发明涉及一种特异性结合犬副流感病毒的鼠单克隆抗体2B7的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明的单克隆抗体2B7的可变区序列能特异性结合犬副流感病毒，其针对的抗原表位位于NP蛋白上，因此能保守性地结合犬副流感病毒的多个毒株，包括多个流行毒株和标准株。
本发明还涉及一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有所述的鼠单克隆抗体2B7的可变区序列，所述抗体或抗体片段能特异地结合犬副流感病毒。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合犬副流感病毒的能力。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体2B7，所述单克隆抗体2B7重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1编码的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQID No.2编码的氨基酸序列。
所述单克隆抗体2B7为犬副流感病毒NP蛋白的单克隆抗体；能对犬副流感病毒多个流行毒株和标准株均能保守性地反应，且IFA效价均为1︰6400～1︰12800，具有良好的反应性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞2B7株，所述杂交瘤细胞2B7株分泌所述单克隆抗体2B7。
本发明还涉及一种特异性结合犬副流感病毒的鼠单克隆抗体4H1的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明的单克隆抗体4H1的可变区序列能特异性结合犬副流感病毒，其针对的抗原表位位于NP蛋白上，能保守性地结合犬副流感病毒的多个毒株。
本发明还涉及一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有所述的鼠单克隆抗体4H1的可变区序列，所述抗体或其片段能特异地结合犬副流感病毒。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合犬副流感病毒的能力。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体4H1，所述单克隆抗体4H1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3编码的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQID No.4编码的氨基酸序列。
所述单克隆抗体4H1为犬副流感病毒NP蛋白的单克隆抗体；对犬副流感病毒多个流行毒株和标准株均能保守性地反应，且IFA效价均为1︰6400～1︰12800，具有良好的反应性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞4H1株，所述杂交瘤细胞4H1株分泌所述单克隆抗体4H1。
本发明还涉及一种犬副流感病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体2B7、有效量的金标记所述单克隆抗体4H1，或有效量的所述单克隆抗体4H1、有效量的金标所述单克隆抗体2B7，以及对犬副流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体2B7、有效量的金标记所述单克隆抗体4H1，以及对犬副流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得犬副流感病毒抗原与所述单克隆抗体4H1的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4H1，所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体2B7，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述有效量的所述单克隆抗体2B7为1～3mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体4H1胶体金标记时为20～150μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为2mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述有效量的单克隆抗体2B7含量为2～3mg/ml，有效量的所述单克隆抗体4H1胶体金标记时含量为50～150μg/ml。
本发明的试剂盒不仅能对犬副流感病毒的流行株和标准株的犬进行检测，还能对其他的犬副流感病毒宿主狐狸、貂进行检测。
作为本发明的一种实施方式，本发明试剂盒为犬瘟热病毒-犬副流感病毒联检试剂盒，其中，所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4H1和胶体金标记的所述单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜上包括固定化有所述单克隆抗体2B7的检测线，还包括固定化有所述单克隆抗体6E11的检测线，有效量的所述单克隆抗体6E11含量为1～3mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体1G5胶体金标记时含量为20～50μg/ml；所述单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌，所述单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌。
犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(保藏号为CCTCC No：C2015202)分泌获得，犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5(保藏号为CCTCC No：C2015201)分泌获得。2株杂交瘤细胞公开于中国专利CN105695420A。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件相互接触，而不相邻的部件之间不接触。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述样品处理液为pH7.4，0.02mol/L PBS缓冲液。
本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤1)用胶体金分别标记所述单克隆抗体4H1为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml；步骤2)固定所述单克隆抗体2B7、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、质控线，所述单克隆抗体2B7稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为2mg/ml固定后作为质控线；步骤3)配制样品处理液，分装；以及步骤4)将所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)用胶体金分别标记所述单克隆抗体4H1、单克隆抗体1G5为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml、所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～50μg/ml；所述步骤2)固定所述单克隆抗体2B7、固定单克隆抗体6E11、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、检测线T2、质控线，所述单克隆抗体2B7、所述单克隆抗体6E11分别稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1、T2，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为2mg/ml固定后作为质控线。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。
本发明还涉及所述试剂盒的检测方法，其中，所述检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心，10分钟后判定结果。
本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬副流感病毒检测中的应用，其中，所述非诊断目的的犬副流感病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测。
含本发明所述单克隆抗体或所述试剂盒可用于非诊断目的的犬副流感病毒检测中的应用，可应用于流行病学分析、对离体组织进行检测、健康体检及排查、表位鉴定研究、犬副流感病毒抗原反应性的检测等非诊断目的方面。
本发明还涉及所述抗体或抗体片段用于犬副流感病毒抗原表位鉴定研究及反应性评价，所述抗体或抗体片段为单克隆抗体2B7或4H1。
本发明制备的单克隆抗体针对的抗原表位位于犬副流感病毒高度保守蛋白即核蛋白上，可与犬副流感病毒多个毒株反应且反应性良好。本发明的含所述单克隆抗体对的试剂盒，检测犬副流感病毒多个毒株均为阳性且灵敏度较高，克服了现有技术不能检测犬副流感病毒多个毒株或易漏检阳性病料的技术难题；还可检测多种动物，如犬以外的狐狸、貂，克服了现有试剂盒不能检测犬以外的宿主的问题。
具体实施方式
术语“犬副流感病毒”(Canine parainfluenza virus，CPIV)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属病毒，为单股负链RNA病毒，可自然感染各种年龄、各种性别的犬科动物，特别是幼龄犬，感染动物后多以咳嗽甚至发热为主要症状；主要通过病犬的眼分泌物、唾液、呼吸道分泌物等散播，经呼吸道途径感染从而损坏犬的上呼吸道组织并引发干咳、尖咳、鼻塞等症状，严重者会引发犬的咽炎、扁桃体炎、支气管炎和支气管肺炎等病症，并给其它病原体的感染创造条件。
术语“犬副流感病毒核蛋白”又称犬副流感病毒NP蛋白(nucleocapsid protein)或N蛋白，分子量为60kD，保守性较高(达90％以上)。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能保持与犬副流感病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4～10的范围，优选约5～9的范围，更优选约6～8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实例中所用的样品处理液为PBS缓冲液(pH7.4，0.02mol/L)，其1L体积PBS缓冲液配方示例为：Na2HPO4·12H2O 5.8g、NaH2PO4·2H2O 0.59g，但不限于此配方；若无特殊说明，均用PBS缓冲液稀释。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1现有产品检测情况
将流行病学调查时收集到的多份样品中的60份临床采集的疑似犬副流感病毒感染犬的眼鼻拭子、咽拭子。分别用RT-PCR、商品化犬副流感病毒胶体金检测试纸条1(快灵)以及商品化试纸条2(Venture)进行检测，结果(见表1)显示：RT-PCR检测阳性46份、阴性14份，而商品化试纸条1和2分别检测阳性21份、24份，阳性符合率(45.7％、52.2％)、总符合率(58.3％、63.3％)均较低，漏检率均较高，表明商品化试纸条的敏感性低。
表1临床样品检测结果
检测方法或产品 阳性 阴性
RT-PCR 46 14
商品化纸条1 21 39
商品化纸条2 24 36
实施例2犬副流感病毒的分离
取实施例1中RT-PCR检测阳性、商品化试纸条检测均为阴性的22份样品用0.22μm滤膜过滤后，接种至80％左右的Vero细胞，吸附1小时后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下继续培养，并观察细胞病变情况，盲传3代后收毒，结果：18份样品接种后产生的细胞病变不明显或病变在传代过程中丢失，仅有4份样品接种后可产生明显的细胞病变，将收获的4份病毒液设计引物并用分子生物学方法扩增后进行F基因测序，在NCBI比对后确定均为犬副流感病毒，分别命名为S0419株、S0422株、S0427株、S0443株，其中S0427株病毒液接种后病变最为明显。
依次同步接种4份犬副流感病毒病毒液至单层的Vero细胞，37℃5％CO2条件下培养。待细胞病变80％以上时收毒，-20℃冻融2次后，3000转/分钟离心30分钟，去除细胞碎片后，上清进行分装，-70℃以下保存。
实施例3犬副流感病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
3.1小鼠免疫
分别用实施例2分离的4株犬副流感病毒作为免疫原，按常规方式乳化后免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠，200μl/只。第二次免疫开始每次免疫后7日采血，用IFA方法检测不同阶段免疫后小鼠血清的抗体效价。结果(见表2)显示，犬副流感病毒S0422株、S0443株2株病毒液作为免疫原免疫的小鼠血清不产生效价，仅S0419株、S0427株病毒液免疫的小鼠血清产生效价，且S0427株的IFA效价为最高，因此，选择该组免疫小鼠进行细胞融合以制备单克隆抗体。
表2免疫小鼠血清IFA效价
注：“/”表示测不出效价。
3.2IFA抗原板制备及检测
将Vero细胞均匀铺置96孔板，将犬副流感病毒100倍稀释液按100μl/孔加入96孔板中，并设健康细胞对照。于37℃5％CO2培养箱内培养72小时，弃去培养液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)洗涤3次，加入预冷的80％丙酮，100μl/孔，4℃固定30分钟，弃液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)洗涤后晾干即为IFA抗原板。检测时，将细胞上清或腹水等待检样品用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)进行稀释，取稀释液按100μl/孔加入检样孔内，同时设置健康细胞对照，37℃作用50分钟。弃液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)洗涤3次后，加入1∶200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃作用40分钟。弃去液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.4)洗涤3次，最后加入PBS(0.01mol/L，pH值7.4)，50μl/孔。结果判定：将96孔板置于荧光显微镜下观察荧光情况，记录阳性孔。判定标准：设立的不接毒正常细胞对照孔不出现特异黄绿色荧光，而接毒的细胞板孔内可观察到特异性的黄绿色荧光，判定为阳性孔。
3.3单克隆抗体的制备与鉴定
3.3.1制备
取效价高的小鼠，按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratorymanual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press.1998,139-312)文献的操作方法进行细胞融合，采用IFA方法进行杂交瘤细胞的筛选，经多次筛选及亚克隆后仅获得4株单克隆的杂交瘤细胞，命名为4H1、1A4、2B7、5D2，分别制备腹水，IFA方法检测腹水的效价。结果(见表3)：3株单克隆抗体4H1、1A4、2B7的腹水IFA效价均可达到1︰6400～1︰12800，1株单克隆抗体5D2的IFA效价可达到1︰800～1︰3200。
3.4单克隆抗体的鉴定
3.4.1与不同犬副流感病毒毒株的反应情况
分别将实施例2分离的犬副流感病毒S0427株及HeN0718株(Caihong Liu，Xiangdong Li et.al.Isolation and genomic characterization of a canineparainfluenza virus type 5strain in China.Archives of Virology,August 2017,Volume 162,Issue 8,pp 2337–2344)、D008株(标准株，购自ATCC)接种vero细胞，按照实施例3.2中IFA制备及检测方法对4株单克隆抗体进行检测，结果(见表3)：4株单克隆抗体均可与3个毒株发生反应且IFA效价相当。
表3单克隆抗体与不同CPIV毒株反应情况
3.4.2单克隆抗体识别犬副流感病毒不同蛋白的鉴定
为确定各单抗特异性结合何种抗原，根据NCBI中公布的犬副流感病毒基因序列(登录号：KP893891.1)分别设计NP蛋白、M蛋白、SH蛋白、HN蛋白基因扩增引物，并以D008株(标准株，购自ATCC)作为模板，分别扩增各蛋白基因；将鉴定正确的扩增产物克隆重组在真核表达载体中，分别转染Vero细胞培养48小时后，用80％冷丙酮固定，用IFA方法分别对4株单克隆抗体进行检测。结果显示，4株单克隆抗体均只与NP蛋白表达的载体呈阳性反应而不识别其它蛋白，即均为犬副流感病毒NP蛋白的单克隆抗体。
3.4.3识别抗原表位异
为验证上述单克隆抗体是否针对犬副流感病毒NP蛋白同样的抗原表位，用抗体相加试验进行测定：将犬副流感病毒包被于96孔酶标板、封闭，然后加入第一株单克隆抗体(1:100稀释)与之反应，洗涤，拍干，再加入另一株单克隆抗体(1:100稀释)与之反应。2株单克隆抗体反应完毕后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG与之反应，洗涤，显色，用酶标仪测定其A值(OD450nm)。按公式AI＝[(A1.2-A1)/A2]×100％分别计算单克隆抗体两两相加指数AI，其中，A1、A2为单抗1和2的A值，A1.2为单抗1叠加单抗2的A值，AI大于50％即可初步断定两种单抗对应不同的抗原结合位点。按照此方法对4株抗体进行检测，结果见表4，可知，3株单克隆抗体2B7、4H1、1A4两两相加指数AI均高于50％，表明3株抗体之间均识别不同的抗原表位。
表4单克隆抗体两两叠加的增值指数AI
注：“/”表示未检测。
综上所述，单克隆抗体2B7、4H1、1A4均为针对犬副流感病毒NP蛋白特异性的单克隆抗体，且识别NP蛋白不同的抗原表位，进一步可将3株单克隆抗体作为双抗体夹心方法检测抗原的原料进行调试。
3.4.4试纸条用单克隆抗体类型和亚类的鉴定
运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit(购自Pierce公司)并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定，结果：单克隆抗体2B7、4H1的重链均为IgG1，轻链均为Kappa。
3.4.5试纸条用单克隆抗体特异性的鉴定
采用IFA方法进行检测。分别将犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒2型、犬冠状病毒接种敏感细胞，培养48～72h后用80％丙酮水溶液固定，对1︰100稀释的2株单克隆抗体2B7、4H1分别进行检测，同时设置各病毒阳性血清作为阳性对照，经荧光染色后对结果进行判定。结果：2株单克隆抗体与其它病毒均不反应，均为针对犬副流感病毒的特异性单克隆抗体。
3.4.6试纸条用单克隆抗体可变区序列的测定
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1-H：ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAA
P2-H：CCAGGGRCCARKGGAT ARACNGRTGG
设计轻链可变区引物序列：
P3-L1：ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG
P4-L1：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA
和
P3-L2：ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTCCTTGCTG
P4-L2：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA
收集2株杂交瘤细胞2B7、4H1，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体2B7的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，单克隆抗体4H1的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。
实施例4犬副流感病毒胶体金检测试纸条的制备与应用
4.1试纸条用单克隆抗体配对模式的选择
为进一步验证和优化，特取4H1、1A4、2B7 3株纯化后单克隆抗体按实施例4.2分别制备小批量的金标抗体。将犬副流感病毒S0427株(病毒含量为105.8TCID50/ml)、D008株(病毒含量为105.6TCID50/ml)用PBS缓冲液稀释，连同PBS缓冲液一同用不同搭配模式组装试纸条进行检测，结果(见表5)：单克隆抗体1A4与单克隆抗体4H1或2B7组合时，检测灵敏度低且出现非特异反应；而单克隆抗体2B7、4H1组合时，均未出现非特异反应，且以包被单克隆抗体2B7与金标单克隆抗体4H1搭配检测病毒灵敏度最高(检测0427株、D008株灵敏度分别为103.8TCID50/ml、103.6TCID50/ml)。表明并非针对犬副流感病毒NP蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体就可搭配制备试纸条以检测抗原。因此，用配对方式为2B7作为检测线包被的单克隆抗体，4H1作为金标单克隆抗体进行后续研究。
表5单克隆抗体搭配及活性检测
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。
4.2犬副流感病毒胶体金检测试纸条的制备
4.2.1胶体金试纸条制备相关参数的摸索
分别按照表6对应的包被抗体浓度及金标抗体标记浓度制备试纸条，对不同稀释度的S0427株病毒液(病毒含量为105.8TCID50/ml)、D008株病毒液(病毒含量为105.6TCID50/ml)、PBS缓冲液以及20份临床样品(RT-PCR检测阳性)进行检测，选择试纸条检测灵敏度高、与RT-PCR符合率好且检测PBS缓冲液背景清晰的搭配模式，作为胶体金试纸条制备的包被抗体浓度及金标抗体标记浓度。结果(见表6)，包被抗体浓度为1～3mg/ml、金标抗体标记浓度为20～150μg/ml时均可制备成试纸条用于检测，但当包被抗体浓度为2～3mg/ml、金标抗体标记浓度为50～150μg/ml时制备成的试纸条检测效果最优。
表6不同条件下制备试纸条的评价
4.2.2胶体金试纸条的制备
将0.01％氯金酸(HAuCl4)溶液加热后再加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液制备成胶体金，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH值至8.2，匀速搅拌后将单克隆抗体4H1加到胶体金溶液中至终浓度为20～150μg/ml，继续搅拌，逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30分钟。于2～8℃静置2小时后，2～8℃2000转/分钟离心后将沉淀用含1％BSA的PBS缓冲液溶解，即为金标抗体4H1。将金标抗体4H1均匀吸附于金标垫上，干燥后备用。将固定抗体2B7用PBS缓冲液稀释至1～3mg/ml；将羊抗鼠多克隆抗体用PBS缓冲液稀释至2mg/ml，按照1.0μl/cm的量分别喷凃于硝酸纤维素膜检测线(T线)线和对照线(C线)处。将包被好的硝酸纤维素膜置于干燥间(温度为20～25℃，相对湿度低于20％)干燥后，常温密封保存。将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫按序粘贴在塑料底板上，每相邻部分少量重叠，裁剪后即为犬副流感病毒胶体金检测试纸条，简称自制试纸条1。
用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH值至8.2，匀速搅拌后将单克隆抗体1G5加到胶体金溶液中至终浓度为20～50μg/ml，继续搅拌，逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30分钟。于2～8℃静置2小时后，2～8℃、2000转/分钟离心后将沉淀用含1％BSA的PBS缓冲液溶解，即为金标抗体1G5。将金标抗体4H1和金标抗体1G5混合后均匀吸附于金标垫上，干燥后备用。将固定抗体2B7、6E11分别用PBS缓冲液稀释至1～3mg/ml；将羊抗鼠多克隆抗体用PBS缓冲液稀释至2mg/ml，按照1.0μl/cm的量分别喷涂于硝酸纤维素膜检测线1(T1线)、检测线2(T2线)和对照线(C线)处。将包被好的硝酸纤维素膜置于干燥间(温度为20～25℃，相对湿度低于20％)干燥后，常温密封保存。将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫按序粘贴在塑料底板上，每相邻部分少量重叠，裁剪后即为犬瘟热病毒、犬副流感病毒胶体金联检试纸条，简称自制试纸条2。
配制样品处理液无菌分装后，连同自制试纸条1或2分别组装成试剂盒。
4.3自制试纸条1、2的检测
检测方法步骤如下：
(1)样品的处理，将采集的眼、鼻、咽拭子插入样品处理管中充分溶解，将病毒培养物及其它液体样品溶解于置于样品处理管中充分溶解。
(2)加样及结果判定，滴加2～4滴溶解后的样品至加样孔，10分钟内观察结果。对照线、检测线均显色，判为阳性；检测线不显色即为阴性；对照线未显色，则判定为无效结果，需重测。
4.4自制试纸条1、2的评价及应用
4.4.1敏感性检测
犬副流感病毒：分别将犬副流感病S0427株(105.8TCID50/ml)、D008株(105.6TCID50/ml)、HeN0718株(106.1TCID50/ml)病毒液进行一系列稀释，然后分别用自制试纸条1、自制试纸条2、商品化试纸条1(上海快灵犬副流感病毒一步法胶体金快速检测试纸条)、商品化试纸条2(Venture犬副流感病毒胶体金检测试纸条)进行检测，结果自制试纸条检测3个病毒液灵敏度分别为103.8TCID50/ml、103.6TCID50/ml、104.1TCID50/ml；商品化试纸条1检测D008株灵敏度为104.6TCID50/ml，检测其余毒株1︰10稀释为阴性，商品化试纸条2检测3个毒株1︰10稀释均为阴性。说明自制试纸条灵敏度优于2个商品化试纸条。取实施例2分离的犬副流感病毒S0419株(病毒含量为105.3TCID50/ml)、S0422株(病毒含量为105.6TCID50/ml)、S0443株(病毒含量为106.2TCID50/ml)病毒液，分别用4个试纸条进行检测，结果自制试纸条1、自制试纸条2检测3个毒株均为阳性，而2个商品化试纸条均检不出。综上所述，自制试纸条1、自制试纸条2敏感性较优且可检测犬副流感病毒多个毒株，包括流行株和标准株。
表7试纸条检测不同毒株灵敏度比较
注：“/”表示检不出。
犬瘟热病毒：分别将犬瘟热病毒AV299株(105.5TCID50/ml)病毒液进行一系列稀释，然后分别用自制试纸条2、韩国安捷犬瘟热病毒胶体金检测试纸条、原试纸条(参见中国专利CN105695420A中的试剂盒2)进行检测，结果：3个试纸条检测犬瘟热病毒液灵敏度均为103.5TCID50/ml，说明自制试纸条灵敏度不低于市售产品。
表8自制试纸条2与其它试纸条检测犬瘟热病毒液的比较结果
4.4.2特异性检测
用自制试纸条1、自制试纸条2对犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬冠状病毒以及20份临床鼻咽拭子样品(CPIV、CDV RT-PCR为阴性)进行检测，结果除自制试纸条2检测犬瘟热病毒为阳性外其余均为阴性，说明自制试纸条1、自制试纸条2特异性均良好。
4.4.3重复性及可靠性检测
用3批自制试纸条1、自制试纸条2分别对同样的15份样品于国内3个不同的地点进行批间、批内重复性检测，结果：均一致，自制试纸条重复性和可靠性良好。
4.4.4保存期
将自制试纸条1、自制试纸条2于2～30℃放置，分别于保存6、12、18、24、27、30个月按实施例3.4.1、3.4.2进行敏感性与特异性检测，均无明显变化，表明自制试纸条1、自制试纸条2于2～30℃下可保存30个月。
4.4.5临床应用
4.4.5.1犬源病料
CPIV、CDV抗原检测：分别用CPIV RT-PCR、CDV RT-PCR、自制试纸条1、自制试纸条2、商品化试纸条1、商品化试纸条2、韩国安捷犬瘟热病毒胶体金检测试纸条(简称“韩国安捷试纸条”)、原试纸条对102份犬源临床样品(含有发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状犬及攻毒试验犬咽拭子、眼鼻拭子、血清样品)进行检测。
CPIV抗原检测：CPIV RT-PCR检测CPIV阳性64份、阴性38份，自制试纸条1检测阳性50份、阴性52份，与RT-PCR的阳性符合率均为78.1％(50/64)，总符合率均为86.3％(88/102)；自制试纸条2检测阳性51份、阴性51份，与RT-PCR的阳性符合率均为79.7％(51/64)，总符合率为87.3％(89/102)；而商品化试纸条1与RT-PCR阳性符合率为48.4％(31/64)、总符合率为67.6％(69/102)，商品化试纸条2与RT-PCR的阳性符合率为53.1％(34/64)、总符合率为70.6％(72/102)。自制试纸条1、自制试纸条2检测CPIV的临床适用性更优。
表9犬源临床样品检测CPIV结果
CDV抗原检测：CDV RT-PCR检测CDV阳性56份、阴性46份，自制试纸条2检测阳性44份、阴性58份，与RT-PCR的阳性符合率为78.6％(44/56)，总符合率为88.2％(90/102)；而韩国安捷试纸条与RT-PCR阳性符合率为75％(42/56)、总符合率为86.3％(88/102)；原试纸条与RT-PCR的阳性符合率为76.8％(43/56)、总符合率为87.3％(89/102)。自制试纸条2检测CDV的临床适用性更优。
表10犬源临床样品检测CDV结果
4.4.5.2狐狸源、貂源病料
将分别收集狐狸源、貂源具有呼吸道症状的咽拭子、眼鼻拭子等病料各25份、25份(经CDV RT-PCR鉴定均为阴性)，经CPIV RT-PCR鉴定14份阳性、36份阴性，分别用自制试纸条1、自制试纸条2进行检测，结果两试纸条均检出阳性10份，阴性40份，与RT-PCR的阳性符合率、总符合率为62.5％(10/16)、88％(44/50)，见表11。表明自制试纸条1、自制试纸条2还可用于狐狸源、貂源病料中犬副流感病毒抗原的检测(商品化试纸条1、2说明书中均未提及可用于犬以外动物的检测，实际检测狐狸源、貂源病料时结果也不理想)。
表11狐狸源、貂源临床样品检测CPIV结果
4.5其它配对模式的检测
参考实施例4.1中以单克隆抗体2B7作为金标单克隆抗体，4H1作为检测线包被抗体的搭配模式进行条件优化并制备试纸条，检测实施例4.4.5所述犬源及狐狸、貂源病料，结果：犬源病料检出CPIV阳性30份，阴性72份，与RT-PCR阳性符合率为46.9％(30/64)，总符合率为66.7％(68/102)；狐狸、貂源病料检出CPIV阳性6份，阴性44份，与RT-PCR阳性符合率为37.5％(6/16)，总符合率为80％(38/50)。说明该条件也可用于试纸条制备。
综上所述，本发明制备的试纸条1、2检测犬副流感病毒临床适应性好，且试纸条2可用于犬瘟热病毒与犬副流感病毒的联合及鉴别检测。
实施例5犬副流感病毒单链抗体的制备及鉴定
5.1抗体可变区蛋白的表达
将实施例2.2.3扩增2株单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因，移入连接肽后，连接至元和变大载体pET-32a(+)，分别构建重组质粒pET-32a-2B7-ScFv以及pET-32a-4H1-ScFv，转化BL21进行表达，获得融合蛋白。
5.2单链抗体活性的鉴定
采用IFA方法进行检测。将实施例3制备的IFA抗原板，对表达的单链抗体进行IFA检测，同时设置对应的个天然抗体作为阳性对照，经荧光染色后对结果进行判定。结果显示：单链抗体2B7、4H1均可与犬副流感病毒反应。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
<120> 犬副流感病毒单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 1
gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctctttact agtcgacatg aagatgtggg tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ttttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240
ctctatcttc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga 300
gaagctctct actactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 2
<211> 336
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 2
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcggt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
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ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaag 336
<210> 3
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<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 3
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gctccaggaa agggtttgga atgggttgct cgcataagaa gtaaaagtaa taattatgca 180
acatattatg ccgattcagt gaaagacagg ttcaccatct ccagagatga ttcacaaagc 240
atggtctatc tgcaaatgaa caacttgaaa actgaggaca cagccatgta ttactgtgtg 300
agagaagctc tctactactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 4
<211> 336
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）
<400> 4
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atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgtaga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

Claims (10)

1.一种特异性结合犬副流感病毒的鼠单克隆抗体2B7的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
2.一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有权利要求1所述的鼠单克隆抗体2B7的可变区序列，所述抗体或抗体片段能特异地结合犬副流感病毒；优选地，所述抗体为单克隆抗体2B7，所述单克隆抗体2B7重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.1编码的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2编码的氨基酸序列。
3.一种特异性结合犬副流感病毒的鼠单克隆抗体4H1的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4编码的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
4.一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有权利要求3所述的鼠单克隆抗体4H1的可变区序列，所述抗体或其片段能特异地结合犬副流感病毒；优选地，所述抗体为单克隆抗体4H1，所述单克隆抗体4H1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3编码的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4编码的氨基酸序列。
5.一种犬副流感病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体2B7、有效量的金标记所述单克隆抗体4H1，或有效量的所述单克隆抗体4H1、有效量的金标所述单克隆抗体2B7，以及对犬副流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
优选地，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体2B7、有效量的金标记所述单克隆抗体4H1，以及对犬副流感病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括：底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得犬副流感病毒抗原与所述单克隆抗体4H1的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4H1，所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体2B7，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述有效量的所述单克隆抗体2B7含量为1～3mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体4H1胶体金标记时含量为20～150μg/ml，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗含量为2mg/ml；更优选地，所述有效量的单克隆抗体2B7含量为2～3mg/ml，有效量的所述单克隆抗体4H1胶体金标记时含量为50～150μg/ml。
6.根据权利要求5所述的犬副流感病毒检测试剂盒，其中，所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体4H1和胶体金标记的所述单克隆抗体1G5，所述硝酸纤维素膜上包括固定化有所述单克隆抗体2B7的检测线，还包括固定化有所述单克隆抗体6E11的检测线，有效量的所述单克隆抗体6E11含量为1～3mg/ml，所述有效量的所述单克隆抗体1G5胶体金标记时含量为20～50μg/ml；所述单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌，所述单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌。
7.根据权利要求5所述的犬副流感病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述样品处理液为pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液。
8.一种小鼠杂交瘤细胞2B7株，所述小鼠杂交瘤细胞2B7株分泌权利要求2所述的单克隆抗体2B7。
9.一种小鼠杂交瘤细胞4H1株，所述小鼠杂交瘤细胞4H1株分泌权利要求4所述的单克隆抗体4H1。
10.根据权利要求5中所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤1)用胶体金分别标记所述单克隆抗体4H1、为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml；
步骤2)固定所述单克隆抗体2B7、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、质控线，所述单克隆抗体2B7稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为2mg/ml固定后作为质控线；
步骤3)配制样品处理液，分装；以及
步骤4)将所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒；
优选地，所述步骤1)用胶体金分别标记所述单克隆抗体4H1、单克隆抗体1G5为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml、所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～50μg/ml；
所述步骤2)固定所述单克隆抗体2B7、固定单克隆抗体6E11、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、检测线T2、质控线，所述单克隆抗体2B7、所述单克隆抗体6E11分别稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1、T2，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为2mg/ml固定后作为质控线。
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