CN106084044A - 一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,包含轻链可变区和重链可变区,所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体;且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫技术领域,尤其涉及一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,还涉及上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
背景技术
间皮素(mesothelin,MESO)前体多肽是通过磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol,GPI)锚定的一种糖基化的细胞表面蛋白,可以被裂解为30kDa N端的分泌多肽和40kDa C端多肽仍与细胞表面结合,GPI锚定方式,被命名为间皮素连接蛋白。Mesothelin在某些肿瘤细胞中高表达,尤其是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞,而在正常组织表达受限,因此成为肿瘤治疗的理想靶标。mesothelin的功能是未知的,在mesothelin缺陷型小鼠中,没有明显的复制,血液异常或是解剖异常。
已有实验证实抗MESO的抗体可以阻止相关肿瘤细胞的增殖及转移等。所以制备抗MESO的抗体。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题,本发明的目的在于提供一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体。
本发明的目的又在于提供一种编码上述人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的DNA分子。
本发明的目的又在于提供一种含有能编码上述人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的DNA分子表达载体。
本发明的目的又在于提供一种被上述的表达载体所转化的宿主细胞。
本发明的目的还在于提供一种编码人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的应用。
为了实现本发明的目的,发明人通过大量试验研究,包括:人鼠嵌合Fab噬菌体抗体库的筛选,抗MESO特异性抗体的纯化,抗MESO全分子抗体IgG的制备、表达及纯化,抗MESO全分子抗体IgG的特性分析;最终获得了一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,包含轻链可变区和重链可变区,
(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体;
且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
优选地,所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示;所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明还提出的一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,包含轻链恒定区和重链恒定区,所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示,所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。
本发明还提出的一种DNA分子,其编码上述的全分子IgG抗体的重链或/和轻链。
优选地,其编码轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示,编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明还提出的一种表达载体,包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。
本发明还提出的一种宿主细胞,被上述的表达载体转化。
优选地,该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freestyle细胞。
本发明还提出的上述的全分子IgG抗体在制备与MESO相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。
本发明通过杂交瘤技术获得对MESO具有高度亲和力的鼠源IgG抗体,并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列,并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有人IgG1抗体恒定区的表达载体连接,最终获得了具有特异的抗原结合性和在细胞学上证明抗体可以抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗MESO的人鼠嵌合单克隆抗体。MESO在某些肿瘤细胞中高表达,尤其是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞,而在正常组织表达受限,因此本发明的抗MESO抗体可应用于有关MESO阳性的肿瘤的诊断和治疗。本发明以MESO为靶分子,利用杂交瘤技术制备鼠源抗体,然后利用基因工程技术制备人鼠嵌合抗体。对制备的人鼠嵌合抗MESO抗体做功能鉴定,显示该抗体能够与MESO特异性结合,体外细胞实验证实抗体能够抑制MSEO阳性的肿瘤细胞的增殖。
附图说明
图1为本发明实施例1所得纯化人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的SDS-PAGE检测结果;其中M为蛋白分子量标准品,1为抗MESO抗体,2为细胞培养上清,3为流穿;可见使用Pro.A柱纯化抗MESO抗体的纯度高。
图2为本发明实施例1所得抗MESO抗体的酶联免疫吸附试验检测结果,可见抗MESO抗体与MESO蛋白的结合能力较强。
图3为本发明实施例1所得抗MESO抗体的免疫印迹鉴定结果;其中1为抗MESO抗体与MESO阳性人肺癌细胞NCI-H226;2为抗MESO抗体与MESO阴性的人正常上皮细胞BEAS-2B;可见抗体与MESO蛋白有特异性结合能力。
图4为本发明实施例1所得抗MESO抗体的亲和力检测结果,KD值为5.561×10-10M。
图5为本发明实施例1所得抗MESO抗体对MESO阳性人肺癌细胞NCI-H226的杀伤作用,实验结果显示抗体浓度在15μmol/mL时可以使细胞存活率降低至25%,而对正常的肺上皮细胞没有影响。
具体实施方式
下面,通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的制备
1)用MESO抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术获得抗MESO的鼠源单克隆抗体,然后通过PCR扩增测序获得抗体的可变区序列。
2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列,设计引物。
3)扩增抗MESO抗体重链、轻链。
以上述制备的鼠源IgG为模板,分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。
(1)PCR
反应体系如下:
反应条件如下:
(2)2%琼脂糖凝胶电泳,紫外下观察目的条带,切胶回收。
(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段,去离子水洗脱。
4)双酶切IgG表达质粒
IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Kappa)恒定区碱基编码序列。
(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切
反应体系如下:
反应条件为:37℃酶切过夜。
(2)1%琼脂糖凝胶电泳,紫外下切胶回收。
(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段,去离子水洗脱。
5)Infusion PCR重组表达质粒
反应体系如下:
反应条件为:50℃孵育15min。
取5μL反应液转化感受态细菌,铺于相应抗性的平板上,次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养,提取质粒。
6)抗MESO抗体的表达
(1)取50μg重组后的重链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中,取50μg的轻链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中,取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中,将上述三种混合液室温静置5min。
(2)然后将两个质粒混合液混合均匀后,补加500μL的Opti-MEM培养基混合均匀后直接加入转染试剂293Fectin的混合液,混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞,将293F细胞离心后用293F Expression Medium重悬,然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比,吸取1.00×108个细胞于培养瓶中,用293F Expression Medium定容为94mL。
(3)20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中。
(4)将细胞放在摇床培养箱中培养,培养条件8%CO2,120rmp,37℃,6天后收集细胞上清。
7)抗MESO抗体的纯化
将收集的细胞上清用0.22μm的滤膜过滤,同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA纯化仪按照Protein A纯化的标准步骤纯化,以1mL/min的速度上样,以1.5mL/min的速度洗脱。
结果成功表达并纯化抗MESO抗体。将纯化抗MESO抗体进行SDS-PAGE检测,其结果如图1所示,由图1可知纯化的抗体纯度很高,且用Pro.A柱纯化效果较好。
实施例2抗MESO抗体的功能活性鉴定
1)酶联免疫法
用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液,pH9.6)MESO蛋白至2μg/mL包被ELISA96孔板,每孔加入100μL,4℃过夜;PBST(PBS含0.5%Tween20)5%脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭,37℃孵育2h;PBST洗涤5次后,每个孔中加入100μLPA21抗体(2μg/mL起始浓度,14个浓度梯度稀释)37℃2h;以1:4000稀释的羊抗人二抗100μL/孔加入到孔内,37℃孵育1h;过氧化物酶底物显色液100μL/孔,室温下10分钟后用2M硫酸中止反应,上机检测比色采用双波长450nm/690nm。
结果如图2示所示,由图2可知:抗MESO抗体能与MESO蛋白起抗原抗体反应。
2)Western blot
将MESO阳性人肺癌细胞NCI-H226和MESO阴性的人正常上皮细胞BEAS-2B,进行10%SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上,将此膜与2μg/mL PA21抗体室温孵育1h,1:4000稀释HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司)和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)曝光于凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。
结果如图3所示,由图3可知:抗MESO抗体与人肺癌细胞NCI-H226表达的MESO蛋白有特异性结合。
3)亲和力检测
根据MESO蛋白的等电点以及按照BiacoreX100 control soft的protocol优化偶联条件,斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释MESO样品稀释至25ug/ml后偶联到CM5芯片上。预设偶联水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀释MESO样品,稀释一系列浓度至0uM、5nM、10nM 20nM、40nM、80nM。设置进样时间为180s,解离时间10min,再生缓冲液用50mMpH2.2Gly-HCl。按照BiacoreX100 control soft的protocol进行上机测试。
亲和力检测结果如图4所示,KD值为5.561×10-10M。
4)MESO抗体对MESO阳性肿瘤杀伤
将被试人肺癌细胞NCI-H226和人正常上皮细胞BEAS-2B培养在含有10%小牛血清(FBS)和1%抗生素(P/S)的DMEM培养基中,37℃5%二氧化碳条件下培养。待细胞培养良好后转种在96微孔细胞培养板上,过夜培养当细胞生长在96微孔细胞培养板上达70%时,无菌条件下加入不同剂量的抗体,继续培养24小时,显微镜下观察细胞死亡情况并照相,然后加Cell Titer 96 aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)检查LDH,计算分析细胞死亡百分数,实验重复三次。
抗MESO抗体与肺癌细胞的相互作用结果如图5所示,由图5可知:在抗体的作用下,MESO阳性的肺癌细胞,细胞存活率为25%左右,而对MESO阴性人正常肺上皮细胞没有杀伤作用。
上述文中M为mol/L的含义。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,包含轻链可变区和重链可变区,其特征在于,
(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体;
且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
2.根据权利要求1所述全分子IgG抗体,其特征在于,所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示;所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
3.一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体,包含轻链恒定区和重链恒定区,其特征在于,所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示,所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。
4.一种DNA分子,其编码权利要求1-3任一项所述的全分子IgG抗体的重链或/和轻链。
5.根据权利要求4所述的DNA分子,其特征在于,其编码轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示,编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。
6.一种表达载体,包含有权利要求4或5所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。
7.一种宿主细胞,被权利要求6所述的表达载体转化。
8.权利要求1-3任一项所述的全分子IgG抗体在制备与MESO相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。
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