CN105021813A - 一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条 - Google Patents

一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条 Download PDF

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CN105021813A CN201410151281.0A CN201410151281A CN105021813A CN 105021813 A CN105021813 A CN 105021813A CN 201410151281 A CN201410151281 A CN 201410151281A CN 105021813 A CN105021813 A CN 105021813A
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李芳芊
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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体金垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成，所述检测线处包被有展示有P53蛋白多肽的噬菌体，所述P53蛋白多肽为如下a）或b）蛋白：a）序列1所示蛋白；b）将a）所限定蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与P53抗体特异结合的蛋白；所述质控线处包被有人IgG；所述胶体金垫上包被有抗所述人IgG的抗体；所述检测线位于所述包被膜靠近所述胶体金垫的一端；所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。本发明成本低廉，操作简单，检测过程无需特殊仪器，能广泛应用于医院及科学研究，对肿瘤早期发现具重要意义。

Description

一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条，为一种检测P53抗体的试纸条，具体为一种利用噬菌体展示及胶体金层析技术检测血清P53抗体的试纸条及应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要杀手，在我国每年新发肿瘤病例为312万例，死亡约270万。导致这一现象的原因很多，其中一个重要的原因是目前人类还不能对肿瘤的发生发展过程进行有效的诊断，尤其是早期诊断。
p53是一种抑癌基因，其蛋白对维持正常的细胞分裂与生长起重要的调节作用，但是一旦该基因发生突变，编码的突变型蛋白半衰期延长，失去抑癌作用，积累于细胞内则刺激免疫系统产生相应抗体。研究表明，二十多种常见肿瘤患者血清中可以检测到P53抗体的存在，并且该抗体可以在肿瘤形成的早期检测到。因此，血清P53抗体可以作为一种广谱性的肿瘤标志物用于肿瘤早期检测、肿瘤高危人群的筛查及肿瘤患者预后的监视。目前，血清P53抗体的检测方法主要是ELISA，该方法操作繁琐、耗时长，且包被所用的重组P53蛋白具有制备繁琐、价格昂贵等缺点。
噬菌体展示技术能够将基因型与表现型联系起来，使研究者可以在基因水平上实现对蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。
胶体金免疫层析技术是一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，利用微孔膜的毛细管作用，使滴加在样品垫上的溶液缓慢经过金标垫、醋酸纤维素（NC膜）到达试纸条的另一端。该技术具有快速（全部检测过程仅需3-15分钟）、准确、简便、操作简单、稳定性好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测P53抗体的试纸条。
本发明所提供的检测P53抗体的试纸条，由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体金垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述样品垫的末端与所述胶体金垫的始端相连，所述胶体金垫的末端与所述包被膜的始端相连，所述包被膜的末端与所述吸水垫的始端相连；
所述检测线处包被有展示P53蛋白多肽的噬菌体，所述P53蛋白多肽为如下a）或b）蛋白：
a）由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与P53抗体特异结合的蛋白质；
为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
所述质控线处包被有人IgG；
所述胶体金垫上包被有抗所述人IgG的抗体（如羊抗人IgG的抗体）；
所述检测线位于所述包被膜靠近所述胶体金垫的一端；
所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。
在所述试纸条中，所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：
（a1）将所述P53蛋白多肽的编码基因插入到噬菌体载体pfd8SY的酶切位点SacII和BstB I之间，得到重组噬菌体载体；
（a2）将所述重组噬菌体载体转化大肠杆菌（如大肠杆菌NM522），得到重组菌；
（a3）培养所述重组菌，并向培养体系中加入辅助噬菌体，从而获得所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体。
在本发明中，所述（a1）中所述重组噬菌体载体具体为：将由单链DNA分子1和单链DNA分子2互补结合而成的具有粘性末端的双链DNA与经SacII和BstB I双酶切噬菌体载体pfd8SY所得的骨架载体大片段相连而形成的。
所述单链DNA分子1为：
5’-GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT-3’；
所述单链DNA分子2为：
5’-CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC-3’。
在本发明中，所述（a3）具体为：将所述重组菌加入到含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中至终浓度为1011cfu/ml，再加入所述辅助噬菌体至终浓度为0.05ng/ml，37℃200rpm（旋转半径为16mm）震荡培养3小时；2599g离心10min，弃上清；将沉淀用等倍体积的新的含有100μg/ml Amp的LB液体培养基重悬，37℃200rpm（旋转半径为16mm）震荡培养5小时；5095g离心10mim，将上清按照6：1的比例加入到PEG/NaCl液体中（即上清和PEG/NaCl液体的体积配比为6:1），4℃静置12-14h；6773g离心30min，弃上清（记为上清A），用所述上清A的1/10体积的TE溶液溶解沉淀，16421g离心20min，弃沉淀；向上清中加入1/6体积的所述PEG/NaCl溶液，4℃静置4h，16421g离心20min，弃上清，所得沉淀即为所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体。
其中，所述PEG/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：3M NaCl，167g/LPEG8000。所述TE溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：1.0mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0。
在如上（a1）中，所述P53蛋白多肽的编码基因具体为序列表中序列2所示的DNA分子。
在如上（a3）中，所述辅助噬菌体具体可为M13K07。
在所述试纸条上，所述检测线和所述质控线的垂直距离为4-7mm（如5mm）。
在所述试纸条中，所述样品垫具体可按照包括如下方法制备得到：
将玻璃纤维素膜（如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-Y102）放入样品垫处理液中处理1-2小时（如1小时），60℃烘干2-4小时（如2小时），即得所述样品垫；所述样品垫处理液为含有0.5%体积分数吐温-20、0.5g/L叠氮化钠及10g/L牛血清白蛋白的0.1M磷酸盐缓冲液。
其中，所述0.1M磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：80g/L NaCl、2g/LKCl、29g/L Na2HPO3·12H2O、2g/L KH2PO4，pH7.2。
在所述试纸条中，所述胶体金垫具体可按照包括如下方法制备得到：
将标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体（如羊抗人IgG的抗体）铺在玻璃纤维膜（如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-BX101）上，-80℃孵育1-2小时（如1小时）后冻干，即得所述胶体金垫。
其中，所述“标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体”是按照如下方法制备得到的：
用0.2M碳酸钾水溶液调节胶体金的pH值至9.0，按照每毫升所述胶体金加入50-100μg所述抗人IgG的抗体（如羊抗人IgG的抗体）的用量，向所述胶体金中加入所述抗人IgG的抗体，静置30分钟，然后用金标抗体封闭液封闭30分钟，6773g离心30分钟，弃上清，将沉淀用金标抗体保存液溶解为原体积（离心前的整个体系的体积）的十分之一，即得所述“标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体”。
其中，所述金标抗体封闭液的溶剂为所述0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2），溶质及其浓度为：100g/L BSA、10g/L PEG-20000。所述金标抗体保存液的溶剂为所述0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2），溶质及其浓度为：10g/L BSA、10g/L PEG-20000、50g/L蔗糖、250μl/L Tween-20。
其中，将标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体（如羊抗人IgG的抗体）铺在玻璃纤维膜（如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-BX101）上的铺设密度为：每毫升所述“标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体”铺4平方厘米面积的所述玻璃纤维膜。
在所述试纸条中，在所述包被膜（如硝酸纤维素膜）上所述检测线处包被所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体，具体可按照如下方法实现：用包被缓冲液将所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体调节浓度至500-1000μg/ml（如1000μg/ml），然后使用划膜仪喷在所述检测线上，50-60℃（如60℃）烘干4-6小时（如4小时）；所述包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液；所述0.05M碳酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.6g/LNa2CO3，2.9g/L NaHCO3，pH9.6。
在所述试纸条中，在所述包被膜（如硝酸纤维素膜）上所述质控线处包被所述人IgG，具体可按照如下方法实现：用所述0.01M磷酸盐缓冲液将所述人IgG调节浓度至500-1000μg/ml（如1000μg/ml），然后使用划膜仪喷在所述质控线上，50-60℃（如60℃）烘干4-6小时（如4小时）。
在所述试纸条中，所述底板具体可为PVC板；所述吸水垫具体可为吸水滤纸（如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-X101）。
含有所述的试纸条的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒具体是：为所述试纸条配制可与所述试纸条扣合的且符合如下条件的盖板后形成的产品：所述盖板上具有与所述样品垫对应的加样窗口，以及与所述检测线和所述控制线对应的显示窗口。
所述试纸条在如下（a）或（b）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a）检测离体人血清中P53抗体；
（b）制备癌症检测产品。
与现有检测P53抗体的ELISA试剂盒相比，本发明具有以下优点：
1.通过免疫胶体金技术，首次将展示P53蛋白优势表位的杂合噬菌体引入到检测试纸条中，实现P53抗体的快速检测。
2.本发明利用杂合噬菌体实现P53抗体的快速检测，能够大幅度降低血清P53抗体检测成本。
3.该试纸条具有特异性高，检测过程简单，结果准确可靠，检测过程在10分钟内便可判定结果，方便实现P53抗体检测的临床推广应用。
总之，本发明成本低廉，操作简单，检测过程中无需特殊仪器设备，因此能广泛应用于医院及科学研究，特别适用于农村及基层单位使用。这对肿瘤早期发现具有重要意义。
附图说明
图1为SDS-PAGE及Western blot鉴定展示P53蛋白表位的杂合噬菌体。其中，A为SDS-PAGE结果，1：野生噬菌体，2-3：杂合噬菌体。B为Western blot验证杂合噬菌体，1：健康人血清，2-3：两例P53抗体阳性癌症患者血清。
图2为本发明试纸条的结构示意图。其中，1为底板；2为包被膜；3为胶体金垫；4为样品垫；5为吸水垫；6为检测线（T线）；7为质控线（C线）。
图3为本发明试纸条检测结果示意图。其中，a为阳性；b为阴性；c和d为无效。
图4为本发明试纸条检测结果效果图。其中，a为阳性；b为阴性；c和d为无效。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
噬菌体载体pfd8SY：记载于“Malik P1,Perham RN.New vectors for peptide displayon the surface of filamentous bacteriophage.Gene.1996,171(1):49-51.”一文，公众可从东北师范大学获得。
辅助噬菌体M13K07：为NEW ENGLAND BioLabs产品，Catalog:N0315S。
大肠杆菌NM522：为Agilent Technologies产品，Catalog Number:200270。
实施例1、基于噬菌体展示技术快速检测血清P53抗体的试纸条的制备
一、展示有P53蛋白表位多肽的杂合噬菌体的制备
1、利用商业生物公司的DNA合成仪进行P53蛋白表位SQAMDDLMLS（序列1）基因片段的合成，即合成如下两个互补的DNA片段，并分别于94℃90s及65℃5min条件下使其互补结合成具有粘性末端的双链DNA。
5’-GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT-3’；
5’-CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC-3’。
2、以噬菌体载体pfd8SY为原始质粒，进行重组载体构建，具体过程如下：取5μg噬菌体载体pfd8SY，分别加入5μl限制性内切酶Sac II和BstB I，加入对应的酶切缓冲液和无菌水至总体积200μl。酶切5h后，回收载体骨架大片段。
3、将步骤2回收的载体骨架大片段与步骤1获得的具有粘性末端（与Sac II和BstB I酶切后产生的粘性末端相匹配）的双链DNA按摩尔浓度1:5混合，10μl混合液中加入1μl T4DNA连接酶和1μl缓冲液，16℃，过夜连接。
4、将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌NM522感受态细胞，涂平板37℃过夜培养。
5、挑单克隆，过夜培养后进行PCR验证，将验证正确的阳性克隆送去公司进行测序，将经测序表明将噬菌体载体pfd8SY的酶切位点Sac II和BstB I之间的小片段替换为“AGGGT+序列2+CC”的重组载体命名为pfd8SY-P53。
在重组载体pfd8SY-P53中，序列2所示的P53蛋白表位多肽的编码基因插入到了pⅧ外壳蛋白编码基因的5’端。
6、将测序正确的菌液接种到5ml LB液体培养基（含有100μg/ml Amp）中，37℃，100rpm过夜培养。
7、次日，取2ml过夜培养的菌液加入到200ml LB液体培养基（含有100μg/ml Amp）中扩大培养至菌体终浓度为1011cfu/ml，加入辅助噬菌体M13K07，使辅助噬菌体M13K07最终浓度为0.05ng/ml，37℃，200rpm（旋转半径16mm）震荡培养3小时。
8、5000rpm（相当于2599g）离心10min，弃上清。将沉淀用等倍体积的新的LB液体培养基（含有100μg/ml Amp）重悬，37℃200rpm（旋转半径为16mm）震荡培养5小时。
9、7000rpm（相当于5095g）离心10mim，将上清按照6:1的比例加入到PEG/NaCl溶液（即上清和PEG/NaCl液体的体积配比为6:1）中，充分溶解后，4℃静置12-14h。
其中，所述PEG/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：3M NaCl，167g/LPEG8000。
10、8000rpm（相当于6773g）离心30min，弃上清，控干后用1/10所述上清体积的TE溶液（配方：TE溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.0mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0）溶解沉淀，12000rpm（相当于16421g）离心20min，弃沉淀。
11、向上清中加入1/6体积的PEG/NaCl溶液（配方同上），4℃静置4h，12000rpm（相当于16421g）离心20min，弃上清，所得沉淀即为展示有P53蛋白多肽的杂合噬菌体。
12、用TE溶液（配方同上）溶解沉淀，通过在270nm处测定样品的OD值，代入下列公式算出杂合噬菌体的浓度（μg/μl）：OD270×稀释倍数/3.84。
13、将制备的杂合噬菌体进行SDS-PAGE及Western blot分析。
其中，SDS-PAGE为直接针对杂合噬菌体自身进行鉴定，同时以未展示P53蛋白表位的野生型噬菌体（即辅助噬菌体M13K07）为对照。Western blot分析为：以健康人血清（临床证实P53抗体阴性）和两例临床证实P53抗体阳性癌症患者血清为待测样本，采用杂合噬菌体作为抗原，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司产品，其产品目录号为ZDR-5301）为二抗，进行鉴定。
结果显示，图1中A所示的SDS-PAGE图谱中，杂合噬菌体样品得到了大小约为6.5KD的rpⅧ蛋白（pⅧ外壳蛋白与P53蛋白表位多肽形成的融合蛋白）；而作为对照的野生型噬菌体样品中得到的是比所述rpⅧ蛋白略小一些的所述pⅧ外壳蛋白，与预期结果一致。证明以上制备的杂合噬菌体成功展示了P53蛋白SQAMDDLMLS表位。另外，Western blot分析结果显示该表位能够特异性的识别癌症患者血清P53抗体（图1中B）。
二、包被膜的制备
1、试剂的配制
0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液：0.16g Na2CO3与0.29g NaHCO3溶解于100ml超纯水中，作为包被缓冲液。置4℃备用，有效期15天。
0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO3·12H2O、0.2g KH2PO4溶解于1000ml超纯水。
2、包被膜制备
一方面，用包被缓冲液将步骤一制备得到的所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体调节浓度至1000μg/ml，然后使用划膜仪喷在硝酸纤维素膜（NC膜，上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为NC-b110）的检测线上；另一方面，用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液将人IgG（上海生工生物工程股份有限公司产品，其产品目录号为AB10501）调节浓度至1000μg/ml，然后使用划膜仪喷在硝酸纤维素膜（NC膜）的质控线上，保证检测线和质控线的两线垂直距离为5mm，应细致均匀。最后将所述硝酸纤维素膜（NC膜）于60℃烘干4小时。
三、胶体金垫的制备
1、氯金酸的配制
用超纯水溶解氯金酸，配制溶液，置4℃备用，有效期7天。100ml0.01%氯金酸溶液配方：0.01g氯金酸溶于100ml超纯水。
2、柠檬酸三钠的配制
用超纯水溶解柠檬酸三钠，配成1%溶液，置4℃备用，有效期7天。100ml1%柠檬酸三钠溶液配方：1g柠檬酸三钠溶解于100ml超纯水。
3、0.2M碳酸钾的配制
超纯水配制，4℃备用，有效期7天。100ml0.2M碳酸钾溶液配方：2.76g碳酸钾溶解于100ml超纯水。
4、金标抗体封闭液的配制
1%PEG-20000，10%BSA，0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液（配方同上），4℃备用，有效期7天。100ml金标抗体封闭液配方：10g BSA、1g PEG-20000溶解于100ml0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液。
5、金标抗体保存液的配制
1%BSA，1%PEG-20000，5%蔗糖，0.25%Tween-20，0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液（配方同上），4℃备用，有效期7天。100ml金标抗体保存液配方：1g BSA、1gPEG-20000、5g蔗糖、25μl Tween-20溶解于100ml0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液。
6、胶体金的制备
取0.01%氯金酸水溶液100ml，加热煮沸，加入1%柠檬酸三钠4ml，继续煮沸，直至溶液变成鲜红色即停止加热，冷却至4℃备用。
7、金标抗体的制备
用0.2M碳酸钾调节胶体金的pH值至9.0，按照50-100μg/ml胶体金加入羊抗人IgG抗体（上海生工生物工程股份有限公司产品，其产品目录号为AB11025），静止30分钟，接着用金标抗体封闭液封闭30分钟，8000rpm（相当于6773g）离心30分钟，弃上清，将沉淀用金标抗体保存液溶解为原体积（离心前的整个体系的体积）的十分之一，4℃备用，有效期7天。
8、胶体金垫的制备
将步骤7获得的金标抗体均匀的铺在玻璃纤维膜（上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-BX101）上，每毫升金标抗体铺4平方厘米玻璃纤维膜，-80℃孵育1小时后冻干机冻干，置于4℃备用。
四、样品垫的处理
将样品垫材料玻璃纤维素膜（上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-Y102）放入样品垫处理液中处理1小时，然后60℃烘干2小时。样品垫处理液的配方为：含0.5%（体积分数）Tween-20、0.05%（0.05g/100mL）叠氮化钠及1%（1g/100mL）BSA的0.1M pH7.2磷酸盐缓冲液（配方同上）。
五、试纸条的组装
将以上制备得到的样品垫、胶体金垫、包被膜、吸水垫（上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-X101）按照图2所示顺序层叠连接相互交错2mm（即样品垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与包被膜的始端相连，包被膜的末端与吸水垫的始端相连）粘贴在PVC底板上，并裁剪成每人份宽度为2-3mm的小条，使检测线与胶体金垫的连接NC膜的一端边缘的垂直具体为15mm。
进一步，配制能与所述小条扣合的盖板，且所述盖板上具有与所述样品垫对应的加样窗口，以及与所述检测线和所述控制线对应的显示窗口。使用时，将待测样本滴加到加样窗口，当待检测样本中含有P53抗体时，抗体首先与胶体金垫上的金标抗体（胶体金标记的羊抗人IgG的抗体）结合，由于层析作用反应复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的杂合噬菌体时，形成杂合噬菌体-P53抗体-金标抗体复合物而富集在检测线（T线）上，形成紫红色沉淀线，为阳性结果，从而快速诊断P53抗体的存在。
检测结果示意图及效果图分别如图3和图4所示。加样后10分钟如果检测线（T线）和质控线（C线）均出现红色沉淀带，结果则判定为阳性，说明样品中含有P53抗体；C线出现红色条带，而T线不出现红色条带，结果为阴性，说明样品中不含有P53抗体；如果C线不出现红色条带，说明试纸条失效，检测结果无效。
实施例2、实施例1制备的试纸条的特异性分析
利用实施例1制备的试纸条检测了50例P53抗体阴性常规体检者血清，试纸条检测结果全部为阴性，与常规检测血清P53抗体的ELISA方法检测结果一致，表明本发明实施例1制备的试纸条的特异性较高。
上述常规检测血清p53抗体的ELISA方法详见本发明的发明人前期已发表的论文“Yu DH,Li JH,Wang YC,Xu JG,Pan PT,Wang L.Serum anti-p53antibody detection incarcinomas and the predictive values of serum p53antibodies,carcino-embryonic antigen andcarbohydrate antigen12-5in the neoadjuvant chemotherapy treatment for III stage non-small celllung cancer patients.Clin Chim Acta2011;412(11-12):930-5.”
实施例3、实施例1制备的试纸条的灵敏度分析
基于实施例1的试纸条，其中试纸条包被膜质控线（C线）包被兔源IgG（上海生工生物工程股份有限公司产品，其产品目录号为AB10502），胶体金垫的金标抗体为羊抗兔IgG（上海生工生物工程股份有限公司产品，其产品目录号为AB11018），其他组成部分与实施例1完全一致。利用该试纸条检测兔源P53多克隆抗体（通过常规生物学方法制备纯化，以GenBank：BAC16799.1所示的P53蛋白作为免疫原免疫兔子制备得到的多克隆抗体），原液浓度为1μg/μl，分别倍比稀释200倍、400倍、800倍、1600倍。
结果显示当兔源p53多克隆抗体稀释至200倍、400倍、800倍时，该试纸条的检测结果都为阳性；而当p53抗体稀释至1600倍时，该试纸条的检测结果为阴性。表明该试纸条的灵敏度为1.25ng/μl，满足实际P53抗体检测要求。
实施例4、实施例1制备的试纸条的临床应用
利用实施例1制备的试纸条，随机检测20例乳腺癌患者血清，检测到4例P53抗体阳性患者，经过ELISA（参见“Yu DH,Li JH,Wang YC,Xu JG,Pan PT,Wang L.Serumanti-p53antibody detection in carcinomas and the predictive values of serum p53antibodies,carcino-embryonic antigen and carbohydrate antigen12-5in the neoadjuvant chemotherapytreatment for III stage non-small cell lung cancer patients.Clin Chim Acta2011;412(11-12):930-5.”）及Western blot验证这4例患者确实为p53抗体阳性，表明本发明实施例1制备的试纸条的准确性好。

Claims (9)

1.一种检测P53抗体的试纸条，由依次连接并固定于底板上的样品垫、胶体金垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成，其特征在于：所述检测线处包被有展示有P53蛋白多肽的噬菌体，所述P53蛋白多肽为如下a）或b）：
a）由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与P53抗体特异结合的蛋白质；
所述质控线处包被有人IgG；
所述胶体金垫上包被有抗所述人IgG的抗体；
所述检测线位于所述包被膜靠近所述胶体金垫的一端；
所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
（a1）将所述P53蛋白多肽的编码基因插入到噬菌体载体pfd8SY的酶切位点SacII和BstB I之间，得到重组噬菌体载体；
（a2）将所述重组噬菌体载体转化大肠杆菌，得到重组菌；
（a3）培养所述重组菌，并向培养体系中加入辅助噬菌体，从而获得所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体；
在（a1）中，所述P53蛋白多肽的编码基因具体为序列表中序列2所示的DNA分子：
在（a3）中，所述辅助噬菌体具体为M13K07。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：所述检测线和所述质控线的垂直距离为4-7mm。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸条，其特征在于：所述样品垫是按照包括如下方法制备得到的：
将玻璃纤维素膜放入样品垫处理液中处理1-2小时，60℃烘干2-4小时，即得所述样品垫；所述样品垫处理液为含有0.5%体积分数的吐温-20、0.5g/L叠氮化钠及10g/L牛血清白蛋白的0.1M磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试纸条，其特征在于：所述胶体金垫是按照包括如下方法制备得到的：
将标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体铺在玻璃纤维膜上，-80℃孵育1-2小时后冻干，即得所述胶体金垫。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试纸条，其特征在于：所述包被膜为硝酸纤维素膜；
在所述包被膜上所述检测线处包被所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体，是按照如下方法实现的：用包被缓冲液将所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体调节浓度至500-1000μg/ml，然后使用划膜仪喷在所述检测线上，50-60℃烘干4-6小时；所述包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液；
在所述包被膜上所述质控线处包被所述人IgG，是按照如下方法实现的：用0.01M磷酸盐溶液将所述人IgG调节浓度至500-1000μg/ml，然后使用划膜仪喷在所述质控线上，50-60℃烘干4-6小时。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试纸条，其特征在于：所述底板为PVC板；所述吸水垫为吸水滤纸。
8.含有权利要求1-6中任一所述的试纸条的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是为权利要求1-6中任一所述的试纸条配制可与所述试纸条扣合的且符合如下条件的盖板后形成的产品：所述盖板上具有与所述样品垫对应的加样窗口，以及与所述检测线和所述控制线对应的显示窗口。
9.权利要求1-7中任一所述的试纸条或权利要求8所述试剂盒在如下（a）或（b）中的应用：
（a）检测离体人血清中P53抗体；
（b）制备癌症检测产品。
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