CN102368070A - 检测人血浆中mr-1s含量的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药检验技术领域，具体涉及一种检测S亚型人肌纤维生成调节因子1含量的酶联免疫吸附测定试剂盒，由以下试剂组成：抗人MR-1S抗体预包被板1块或MR-1S抗原预包被板1块；抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；系列浓度的人MR-1S标准液；阳性质控液、阴性质控液、生理盐水各1支；洗涤液；样品稀释液；封闭液；底物液；终止液。本发明与现有技术相比，所建立的试剂盒的检测结果显示，对MR-1S浓度可实现定量检测，检测结果可反映人MR-1S的变化范围和发展趋势，满足临床诊断和治疗监测需求，且可在120分钟内完成测试，试剂、方法稳定、操作简便，灵敏度高、特异性较强，有较好的临床应用前景。

Description

检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药检验技术领域，具体涉及一种检测S亚型人肌纤维生成调节因子1含量的酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

当前，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清或血浆中的肿瘤标志物（tumor marker），简称TM，由于TM的检测较为经济，取材方便、检查时创伤小，且适合大批量标本检测，在临床恶性肿瘤患者的病情监测、预后评估中有较好的应用价值。

中国疾控中心的最新统计资料表明，由于人们饮食结构、生活环境及方式的改变，恶性肿瘤，特别是卵巢癌、大肠癌、肝癌等发病近年呈上升趋势。任开环等的研究（J Bio Chem, 2008; 283(51): 35598-35605.）以及我们前期的研究均发现，一种新的肿瘤标志物——S亚型人肌纤维生成调节因子1 （Myofibrillogenesis Regulator-1 S, MR-1S，以下均简称“MR-1S”）与恶性肿瘤，如卵巢癌、肝癌的发生、发展与密切相关，更与肿瘤细胞的粘附、转移息息相关。MR-1是一个新近报道的人类功能基因，该基因在转录过程中可形成3条长度不同的剪接异构体，即MR-1L、MR-1M和MR-1S，分别含10、9和3个外显子，其中S亚型MR-1（Short-type MR-1）即MR-1S的长度最短而得名；MR-1S mRNA全长755bp，可编码一个142个氨基酸组成的蛋白质，第75至92位点18个氨基酸形成一疏水跨膜结构区域，为一种膜蛋白；MR-1S可与转录起始因子3（initiation factor 3）以及具有ADP核糖基化因子（ARF）功能的蛋白（MRIP1）相互作用，其中转录因子的高表达可加速细胞进入细胞周期，增加细胞分裂的速度。因而，临床恶性肿瘤诊疗中需要这一敏感、有效的标志来辅助诊断、监测病情。

该肿瘤标志物目前还没有市售的抗体及抗原，首先采用分子生物学的方法，获得MR-1S的融合蛋白，具有了较好的免疫原性；免疫动物获得了抗体；为制备检测MR-1S的试剂盒提供合适的、有保证的原料。

常用的测定肿瘤标志物的方法有酶免疫法、放射免疫法、化学发光免疫法等所述的定量测定法等，已在诸多肿瘤标志物中有所应用，如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA等。但到目前为止，MR-1S作为一种潜在的、有较好的临床应用前景的肿瘤标志物其测定方法至今未见公开报道。

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA）是目前临床的较认可的一种检测手段，其快速、操作简便、试剂稳定、不易污染等特点而得到广泛应用，适用于肿瘤高危人群的筛查以及肿瘤患者的随访测定。

发明内容

本发明的目的在于克服以往肿瘤标志物检测在临床应用中的不足，其中特别是在卵巢癌临床诊疗中缺乏敏感、有效的肿瘤标志物，提供了一种检测人MR-1S的试剂盒，更具体涉及一种检测人MR-1S含量的酶联免疫测定试剂盒。

为实现上述目的，本发明设计一种一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

抗人MR-1S抗体预包被板1块或MR-1S抗原预包被板1块，抗人MR-1S抗体预包被板中的包被物为浓度为50～500μg/ml的抗人MR-1S抗体；MR-1S抗原预包被板中包被物为1～10μg/ml的人MR-1S融合蛋白；

抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；

系列浓度的人MR-1S标准液，即采用如下浓度的人MR-1S融合蛋白作为标准液：1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187.5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml各1支； 

阳性质控液为含人MR-1S融合蛋白的磷酸盐溶液PBS、阴性质控液为0.9%的生理盐水各1支，所述的含人MR-1S融合蛋白的浓度为300 ng/ml；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4；

洗涤液采用2.42g的三羟基氨基甲烷Tris、13ml 的0.1 mol/L的 HCl和0.5 ml 的Tween-20混合而成；

样品稀释液为0.2 g 的KH₂PO₄、2.9 g 的Na₂HPO₄·12H₂O、8.0g 的NaCl、0.2g 的KCl、0.5 ml 的Tween-20和10g的牛血清白蛋白BSA混合后加蒸馏水至1000 ml所构成；

封闭液采用上述配方的pH 9.6的碳酸盐缓冲液100 ml，再加入1g BSA混合而成；

底物液为由A液和B液组成，所述的A液由5.1 ml的0.1mol/L的Na₂HPO₄和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4.9 ml的 0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 ml 的30%的H₂O₂混合而成；

终止液采用2mol/L的H₂SO₄，即177.6 ml蒸馏水中加入22.4 ml的98％的浓H₂SO₄而成。

所述的抗人MR-1S抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

所述的预包被板采用聚苯乙烯板或聚氯乙烯板或聚氯乙烯酰胺板材质的96微孔板。

所述的抗人MR-1S抗体酶标记液中所采用的酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP。

所述的试剂通过下列步骤制备而成试剂盒：

a、人MR-1S融合蛋白的制备：抽提卵巢癌患者的血液基因组DNA，以分子克隆的方法, 即从血液基因组DNA中用PCR扩增目的基因人MR-1S，双酶切后与同样双酶切的原核表达载体pET21a（+）或PGEX-4T-1，构建pET21a-MR-1S或PGEX-4T-1-MR-1S重组质粒，转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白表达，亲和纯化后Western blot鉴定，MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白浓缩后，用0.01mol/L 、pH7.2 的PBS透析活化，冷冻干燥成冻干粉,得到人MR-1S融合蛋白，-20℃保存；

b、抗人MR-1S抗体的制备及纯化：用上述纯化得到的人MR-1S融合蛋白免疫动物，制备特异的高效价的抗人MR-1S的抗体，并使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化；

c、将抗人MR-1S抗体或作为抗原的人MR-1S融合蛋白与包被液混匀后，包被96微孔板，所述的包被液采用由Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29 g 加蒸馏水至100 ml制得的pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

d、上述包被好的96微孔板，过夜，吹干，再用封闭液封闭，吹干，加一包干燥剂，用铝箔袋封好，得抗人MR-1S抗体预包被板或MR-1S抗原预包被板；

e、抗人MR-1S抗体酶标记液的制备：采用过碘酸钠标记法试剂以过碘酸标记法制备，即通过调整所获得的抗人MR-1S抗体的pH值，再将酶标记于该抗体，然后储存于10 ml塑料瓶；

f、组合成检测人MR-1S的酶联免疫吸附测定试剂盒：将上述d步骤中封好的铝箔袋、上述制备而得的抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；系列浓度的人MR-1S标准液6支；阴性、阳性质控液各1支；样品稀释液1瓶；洗涤液1瓶；底物液A液、底物液B液和终止液各1瓶，置于一个纸制的外包装盒内。

步骤b中所述的人MR-1S融合蛋白免疫动物制备特异的高效价的抗人MR-1S的抗体为：当制备单抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白依次采用杂交瘤方法进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得抗人MR-1S单抗；当制备多抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白与弗氏佐剂混匀，免疫实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清。

步骤e中采用过碘酸钠标记法试剂制备抗人MR-1S抗体酶标记液的具体步骤为：（1）将7.5mg HRP加0.5ml 蒸馏水溶解后；（2）加0.5ml 、0.06 mol/L的 NaIO₄,混合后，置于4℃环境，3分钟；（3）加0.5ml、0.16 mol/L乙二醇溶液，室温30分钟；（4）加7mg/ml的兔抗人MR-1S抗体 IgG 1.0ml 或7mg/ml的抗人MR-1S单抗1.0ml；（5）混合后装透析袋，用1000ml、0.05 mol/L、pH 9.5 碘酸缓冲液透析过夜；（6）第二天，吸出透析物，加5mg/ml 的NaBH₄溶液0.2ml置冰箱2小时；（7）吸出上述综合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃，30分钟后，离心4000转/分15分钟弃上清，沉淀溶于1ml、 pH7.4、0.02 mol/L PBS溶液中，装入透析袋，再用1000ml、0.1mol/L、pH7.4的PBS溶液透析过夜，然后此透析过夜步骤再重复一次；（8）第二天，再离心去除不溶物，即得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”，分装于10 ml塑料瓶中，4℃保存。

所述的过碘酸标记法试剂包括如下试剂：

0.06mol/L的NaIO₄：0.13克NaIO₄加水至10ml；

0.16mol/L的乙二醇溶液：乙二醇 0.1ml加水至10ml；

5mg/ml 的NaBH₄：NaBH₄ 5mg加水至1ml；

0.05mol/L 、pH 9.5碘酸盐缓冲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml成C液；无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml成D液，C液16ml和D液34ml混合后加水至200 ml制备而成；

0.02mol/L pH7.4 PBS溶液: 用0.1mol/L的 pH7.4 PBS溶液稀释而成。

本发明与现有技术相比，所建立的试剂盒的检测结果显示，对MR-1S浓度可实现定量检测，检测结果可反映人MR-1S的变化范围和发展趋势，满足临床诊断和治疗监测需求，且可在120分钟内完成测试，试剂、方法稳定、操作简便，灵敏度高、特异性较强，有较好的临床应用前景。

具体实施方式

本发明提供了一种检测人血浆中S亚型肌纤维生成调节因子1含量，即MR-1S含量的酶联免疫吸附测定试剂盒，该试剂盒根据里面包被板的包被物的不同来采用双抗体夹心法检测人血浆中的MR-1S含量或采用竞争法来检测，该试剂盒由以下试剂组成：

1、抗人MR-1S抗体预包被板1块或MR-1S抗原预包被板1块，抗人MR-1S抗体预包被板中的包被物为浓度为50～500μg/ml的抗人MR-1S抗体；MR-1S抗原预包被板中包被物为1～10μg/ml的人MR-1S融合蛋白。当采用抗人MR-1S抗体预包被板检测时采用双抗体夹心法检测；当采用MR-1S抗原预包被板检测时，则采用竞争法检测；

2、抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；

3、采用如下浓度的人MR-1S融合蛋白作为系列浓度的人MR-1S标准液：分别为1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187.5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml各1支； 

4、阳性质控液为含MR-1S的磷酸盐溶液PBS、阴性质控液为0.9%的生理盐水各1支，其中含人MR-1S融合蛋白的浓度为300 ng/ml；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为0.01mol/L 、pH值为7.4；

5、洗涤液采用2.42 g的三羟基氨基甲烷Tris、13 ml 的0.1 mol/L的 HCl和0.5 ml 的Tween-20混合而成。使用时加蒸馏水至1000 ml进行稀释使用；

6、样品稀释液为0.2 g 的KH₂PO₄、2.9 g 的Na₂HPO₄·12H₂O、8.0g 的NaCl、0.2g 的KCl、0.5 ml 的Tween-20和10g的牛血清白蛋白BSA，加蒸馏水至1000 ml所制成；

7、封闭液采用上述配方的pH 9.6的碳酸盐缓冲液100 ml，再加入1g BSA混合而成；

8、底物液由A液和B液组成，所述的A液由5.1 ml的0.1mol/L的Na₂HPO₄和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4.9 ml的 0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 ml 的30%的H₂O₂混合而成；

9、终止液采用2mol/L的H₂SO₄，即177.6 ml蒸馏水中加入22.4 ml的98％的浓H₂SO₄而成。

本发明通过以下技术方案实现：

主要是利用分子克隆的技术手段从卵巢癌患者的血液基因组DNA中扩增出人MR-1S的目标基因，与原核载体连接，转化大肠杆菌，诱导表达人MR-1S融合蛋白。以纯化的该人MR-1S融合蛋白作为抗原，通过免疫动物，得到一对特异性的高效价的抗体。获得的抗体经分离纯化后，若采用抗人MR-1S抗体预包被板，则将酶标记于该对抗体中的一株，将另一株包被到96微孔板中，根据双抗体夹心法的原理，对人MR-1S进行定量分析测定，得到定量结果，整个测试过程在120分钟内完成；当采用MR-1S抗原预包被板时，则将人MR-1S融合蛋白作为抗原包被到96微孔板中，并将酶标记于经分离纯化后的抗人MR-1S抗体中，采用竞争法检测，对人MR-1S进行定量分析测定，得到定量结果，整个测试过程在120分钟内完成。

人MR-1S融合蛋白的制备：抽提卵巢癌患者的血液基因组DNA，以分子克隆的方法, 即从血液基因组DNA中用PCR扩增目的基因人MR-1S，双酶切后与同样双酶切的原核表达载体pET21a（+）或PGEX-4T-1，构建pET21a-MR-1S或PGEX-4T-1-MR-1S重组质粒，转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白表达，亲和纯化后Western blot鉴定，MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白浓缩后，用10mmol/L 、pH7.2 的PBS充分透析活化，冷冻干燥成冻干粉，得到人MR-1S融合蛋白，-20℃保存。

抗人MR-1S抗体的制备及纯化：用上述纯化得到的人MR-1S融合蛋白免疫实验动物，制备特异的高效价的抗人MR-1S的抗体，并使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化，所述的抗人MR-1S抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，简称单抗或多抗，当制备单抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白依次采用杂交瘤方法进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得抗MR-1S单抗；当制备多抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白抗原与弗氏佐剂混匀，免疫实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清。

实施例1

一、先配制如下试剂：

1、抗人MR-1S抗体预包被板1块，抗人MR-1S抗体预包被板中的包被物为浓度为50-500μg/ml的抗人MR-1S抗体； 

2、抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶； 

3、系列浓度的人MR-1S标准液； 

4、阳性质控液为含人MR-1S融合蛋白的磷酸盐溶液PBS、阴性质控液为0.9%的生理盐水各1支，所述的含人MR-1S融合蛋白的浓度为300 ng/ml；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为0.01mol/L 、pH值为7.4；

5、洗涤液：三羟基氨基甲烷Tris 2.42 g，0.1 mol/L HCl 13 ml，Tween-20 0.5 ml，加蒸馏水至1000 ml；

6、样品稀释液：KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5 ml，牛血清白蛋白BSA 10g，加蒸馏水至1000 ml；

7、封闭液：采用上述配方的pH 9.6的碳酸盐缓冲液100 ml中加1g BSA而成；

8、底物液：为由A液和B液组成，所述的A液由5.1 ml的0.1mol/L的Na₂HPO₄和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4.9 ml的 0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 ml 的30%的H₂O₂混合而成；

9、终止液： 2mol/L的 H₂SO₄即177.6 ml蒸馏水中加22.4ml的浓H₂SO₄而成。

上述试剂中，所涉及的制备如下：

（一）、采用如下分子克隆的方法获得人MR-1S融合蛋白：

PCR扩增目的人基因MR-1S：取卵巢癌患者的外周血，抽提基因组DNA；设计一对特异引物P1：5’-CGGGATCCATGGCGG CGGTGGTAGCTGC-3’和 P2：5’-CCGCTCGAGTCAGGTCTGCACCCCAGAC-3’，两对特异引物中分别引入BamH I和Xhol I酶切位点，扩增出人MR-1S基因；50μl PCR扩增体系由cDNA 1μl，10×Taq buffer 5μl，2.5mM dNTP 5μl，上述两对特异引物各1μl分别作为上下游引物，Taq 酶 1μl再加入去离子水37μl混合而成，然后以94℃反应 5min，再分别采用如下反应条件顺序：94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s依次反应36个循环后，72℃延伸10 min。对扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行产物回收。

重组质粒：取上述3μl PCR产物与1μl pUCm-T载体在T4连接酶的作用下，16℃连接4小时，连接产物转化入感受态DH5α细菌中，涂布于有IPTG和X-gal的含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，其中氨苄青霉素的浓度为100mg/L，37℃,16-24小时，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，接种含氨苄青霉素的 LB培养液，37℃培养过夜；用3S Spin质粒小抽试剂提取质粒，并且进行双酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的重组质粒送上海生工生物公司进行测序，将测序结果进行BLAST同源序列比对。采用pET21a（＋）质粒构建原核表达载体，将测序验证正确的重组质粒经BamH I和Xhol I双酶切后，琼脂糖凝胶回收目的基因片段，并与用相同双酶切处理的pET21a（＋）质粒在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜。

转化大肠杆菌BL21：将该连接产物转化感受态表达菌BL21中，接种至含浓度为100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜；挑选出阳性克隆进行测序鉴定。

诱导MR-1S-His融合蛋白表达：将上述鉴定正确的阳性克隆菌接种后，扩大培养至对数生长期，利用浓度分别为0.1 mmol/L、0.5mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L的IPTG，每个浓度的IPTG分别在温度28℃、30℃和35℃的条件下诱导0、1、2、3、4和5小时后，6000 r/min离心10 min，收集菌体。用pH 7.4 、0.01mol/L 的PBS，悬浮菌体，加入0.3 mg/ml溶菌酶。超声裂解后，加入10 μg/ml DNase，12000×g离心10min，SDS-PAG电泳分析上清及沉淀中MR-1S-His融合蛋白的表达情况。

亲和纯化后Western blot 鉴定：将原核表达的MR-1S-His融合蛋白在非变性条件下经NTA柱亲和层析纯化，用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAG电泳确定最佳洗脱的咪唑浓度。该最佳浓度下的洗脱产物用0.01mol/L、pH7.4的PBS透析。此外，将纯化产物和诱导前BL21菌裂解物经SDS-PAG电泳后，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜；再分别与鼠抗His抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG作用，加化学发光底物，然后X胶片显影。

该MR-1S-His融合蛋白经PEG浓缩后，用0.01mol/L、 pH7.2的PBS充分透析活化，用BCA（Bicinchoninic Acid）法测定蛋白质的浓度，再经冷冻干燥成冻干粉得最终的人MR-1S融合蛋白——MR-1S-His融合蛋白，分装，-20℃保存。 

（二）、抗人MR-1S抗体采用如下方法制备及纯化：

本例中抗人MR-1S抗体的制备采用多抗制备，即制备抗人MR-1S抗血清,其按常规抗血清制备法。首先，将上述纯化的人MR-1S融合蛋白——MR-1S-His融合蛋白自冰箱中取出3 mg，复温至室温，溶于0.5ml 、0.01 mol/L的 pH 7.4 的磷酸缓冲液中，再用生理盐水稀释至3ml制成人MR-1S融合蛋白溶液，将其三等份，即每等份为1ml的1mg/ml的人MR-1S融合蛋白溶液。免疫实验采用3只新西兰雄性兔，体重2.5kg左右，先于每只新西兰雄性兔的双后足掌皮下注射弗氏完全佐剂与一等份的人MR-1S融合蛋白溶液的混合物，弗氏完全佐剂：人MR-1S融合蛋白溶液（体积比）＝1：1，初次免疫用弗氏完全佐剂与人MR-1S融合蛋白溶液充分混匀至呈“油包水”状抗原乳化液。再给新西兰大白兔的颈背部多点及脚垫内注射一等份的人MR-1S融合蛋白溶液，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价符合要求后，心脏采血，分离得到抗血清，抗血清再经辛酸－饱和硫酸铵，即50%饱和(NH4)₂SO4，分步沉淀纯化成特异高效价的抗人MR－1S抗体——兔抗人MR-1S抗体IgG。

抗血清的纯化采用辛酸－饱和硫酸铵法。将上述制得兔抗人MR-1S抗体IgG 1ml，加上4 ml、0.06 mol/L、 pH 4.0的醋酸缓冲液，加120μl辛酸，4℃搅拌30 min，10000rpm离心30 min，取上清用50倍体积0.02 mol/L、pH 7.4的 PBS作透析液，4℃透析过夜，取出，加等体积的pH 8.0饱和(NH₄)₂SO₄，轻轻搅拌30 min，于4℃ 10000 rpm离心20 min，去上清。沉淀溶于1ml的0.02 mol/L 、pH7.4的PBS溶液中，然后对50倍体积的上述的透析液于4℃透析36小时，换透析液三次，即再重复透析三次。再4℃、8000 rpm离心15 min，去除不溶物，得最终的抗人MR-1S抗体，也即兔抗人MR-1S抗体IgG。在紫外分光光度计上测定A₂₈₀和A₂₆₀，根据公式：（1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀）×稀释倍数，计算蛋白浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，-20℃冻存备用。

（三）、抗人MR-1S抗体酶标记液的制备：

本例中为酶标兔抗MR-1S抗体IgG交联物的制备：经纯化所得的兔抗人MR-1S抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠交联获得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”，具体制备如下：

（1）过碘酸钠标记法试剂的配制：

A. 0.06mol/L的 NaIO₄：0.13克NaIO₄，加水至10ml；

B. 0.16mol/L的乙二醇溶液： 乙二醇 0.1ml加水至10ml；

C. 5mg/ml 的NaBH₄ ：NaBH₄ 5mg加水至1ml；

D. 0.05mol/L的 pH 9.5碘酸盐缓冲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml混合而成的C液；无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml混合而成的D液，取C液16ml+D液34ml，加水至200ml制备而成；

E. 0.02mol/L的 pH7.4 PBS：用0.1mol/L 、pH7.4 PBS稀释而成。

（2）过碘酸标记法的操作步骤如下：

 1、7.5mg HRP加0.5ml 蒸馏水溶解；2、再加入0.06 mol/L的NaIO₄ 0.5ml,混合后置4℃，3分钟；3、加入0.16mol/L的乙二醇溶液 0.5 ml，室温30分钟；4、加入7mg/ml的兔抗人MR-1S抗体 IgG 1.0ml；5、混合后装透析袋，用1000ml、0.05 mol/L、pH 9.5 的碘酸缓冲液透析过夜；6、第二天，吸出透析物，加5mg/ml的NaBH₄溶液0.2ml置冰箱2小时；7、吸出上述综合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃，30分钟后，离心4000转/分15分钟弃上清，沉淀溶于1ml、 pH7.4、0.02 mol/L 的PBS中，装入透析袋，再用1000ml、0.1mol/L、pH7.4的PBS透析过夜，然后此透析过夜步骤再重复一次；8、第二天，再离心去除不溶物，即得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”，分装储存于10ml塑料瓶中，4℃保存。

二、表达和纯化的人MR-1S融合蛋白抗原的鉴定

纯化后冻干的MR-1S-His融合蛋白干粉用10～100μl,0.01mol/L、 pH7.2的PBS充分溶解，经SDS-PAG电泳后，考马斯亮蓝染色显示为单一条带，证明抗原已纯化。同样蛋白经SDS-PAG电泳后，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜；再分别与鼠抗His抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG作用，加化学发光底物，然后X胶片显影。结果显示可与抗His抗体结合，出现一条明显的发光条带，条带所在的位置为23,000左右，与预期要求的完全符合。所得MR-1S-His融合蛋白用BCA法测定其蛋白含量以作抗原。

三、人MR-1S抗体的鉴定

经辛酸－饱和硫酸铵纯化的兔抗人MR-1S抗体IgG，经免疫固定电泳后，鉴定结果MR-1S为单一沉淀线，而其他蛋白如牛血清白蛋白BSA、血红蛋白Hb未出现沉淀线。

四、标准曲线的制备

取人MR-1S融合蛋白倍比稀释成系列浓度MR-1S标准液，分别为1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187.5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml，作双抗体夹心法的ELISA测定，绘制出标准曲线，标准曲线呈“S”型，线性范围为93.8-1500 ng/ml，灵敏度良好，最低检测限为93.8 ng/ml。在ELISA夹心法的酶标板上的标准曲线浓度梯度良好，可以满足临床测定的需要。

五、试剂盒的组装

100 μl的100μg/ ml的抗人MR-1S抗体与包被液混匀后包被96微孔板，然后过夜，吹干，加封闭液200 μl，封闭2小时吹干后，得抗人MR-1S抗体预包被板，加一包干燥剂，真空密封包装于铝箔袋中；将抗人MR-1S抗体酶标记液储存于10 ml塑料瓶中；系列浓度的MR-1S标准液6支和阴性、阳性质控液各1支，每支2ml；50 ml的样品稀释液1瓶；40 ml的洗涤液1瓶；底物液A液、B液和终止液各1瓶，置于一个纸制的外包装盒内制成试剂盒。所述的包被液采用由Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29 g 加蒸馏水至100 ml制得的pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

六、 采用上述制备的试剂盒，采用双抗体夹心法检测人血浆中MR-1S含量的操作步骤： 

a、取出抗人MR-1S抗体预包被板，采用洗涤液洗涤；

b、再在抗人MR-1S抗体预包被板加入样品，即在抗人MR-1S抗体预包被板的不同微孔中分别加入待测血浆、系列浓度的人MR-1S标准液、阳性、阴性质控液各0.1ml，以37℃反应2小时后，采用洗涤液洗涤；

c、加入0.1 ml经酶标稀释液稀释过的酶标抗体IgG，37℃、 1小时后，采用洗涤液洗涤；所述的经酶标稀释液稀释过的酶标抗体IgG为上述所制得的酶标抗体IgG采用酶标稀释液稀释，其稀释比例为酶标抗体IgG：酶标稀释液稀释的体积比为1:2000；

d、再加入 0.1ml底物液，该底物液中A液与B液为1：1等量配比，37℃，30分钟； 

e、加入0.05 ml 2mol/L的 H₂SO₄，终止反应；

f、490 nm 测OD值，采用Tecan酶免仪测试，如果测得OD＞2.5，则需要将b步骤中的样品采用样品稀释液以体积比1：10进行稀释后，重新进行b~f步骤；

g、计算MR-1S浓度值。

实施例2

一、先配制如下试剂：

1、MR-1S抗原预包被板1块，MR-1S抗原预包被板中包被物是作为抗原的1~ 5 μg/ml的人MR-1S融合蛋白；

2、抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；

3、系列浓度的人MR-1S标准液；

4、阳性质控液：含人MR-1S融合蛋白的磷酸盐溶液PBS；阴性质控液：0.9%的生理盐水，所述的含人MR-1S融合蛋白的浓度为300 ng/ml；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为0.01mol/L 、pH值为7.4；

5、洗涤液：三羟基氨基甲烷Tris 2.42 g，0.1 mol/L HCl 13 ml，Tween-20 0.5 ml，加蒸馏水至1000 ml；

6、样品稀释液：KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20　0.5 ml，牛血清白蛋白BSA10g，加蒸馏水至1000 ml；

7、封闭液： pH 9.6的碳酸盐缓冲液100 ml中加1g BSA而成；

8、底物液：为由A液和B液组成，所述的A液由5.1 ml的0.1mol/L的Na₂HPO₄和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4.9 ml的 0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 ml 的30%的H₂O₂混合而成；

9、终止液： 2mol/L的 H₂SO₄即177.6 ml蒸馏水中加22.4ml的浓H₂SO₄而成。

上述试剂中，涉及的制备方法如下：

（一）、采用如下分子克隆的方法获得人MR-1S融合蛋白：

PCR扩增目的人基因MR-1S：取卵巢癌细胞株SKOV3，培养细胞至对数期，抽提其中的基因组DNA；设计一对特异引物P1：5’-CGGGATCCATGGCGG CGGTGGTAGCTGC-3’和 P2：5’-CCGCTCGAGTCAGGTCTGCACCCCAGAC-3’，两对引物分别引入BamH I和Xhol I酶切位点，扩增出MR-1S基因。50 μl PCR扩增体系为由cDNA 1μl，10×Taq buffer 5μl，2.5 mmol/L dNTP 5μl，上述两对特异引物各1μl分别作为上下游引物，Taq 酶 1 μl再加入去离子水37μl混合而成，然后以94℃反应5 min；然后再分别采用94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s的条件依次顺序反应36个循环后，72℃延伸10 min。对扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行产物回收。

重组质粒：取上述3μl PCR产物与1μl pUCm-T载体在T4连接酶的作用下，16℃连接4小时。连接产物转化入感受态DH5α细菌中，涂布于有IPTG和X-gal的含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，其中含氨苄青霉素的浓度为100mg/L，37℃，16-24小时，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，接种含氨苄青霉素的 LB培养液，含氨苄青霉素的浓度为100mg/L，37℃培养过夜。用3S Spin质粒小抽试剂提取质粒，并且进行双酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的重组质粒送上海生工生物公司进行测序，将测序结果进行BLAST同源序列比对。利用PGEX-4T-1质粒构建原核表达载体，测序验证正确的重组质粒经BamH I和Xhol I双酶切后，琼脂糖凝胶回收目的基因片段，并与用相同酶切处理的PGEX-4T-1质粒在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜。

转化大肠杆菌BL21:将该连接产物转化感受态表达菌BL21中，接种至含氨苄青霉素的LB平板，含氨苄青霉素的浓度为100mg/L，37℃培养过夜。挑出阳性克隆进行测序鉴定。

诱导MR-1S-GST融合蛋白表达：将上述鉴定正确的阳性克隆菌接种后，扩大培养至对数生长期，采用0.1mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5 mmol/L终浓度的IPTG，每个浓度的IPTG分别在28℃、30℃和35℃的温度条件下，诱导0、1、2、3、4和5小时后，6000 r/min离心10 min，收集菌体。用pH 7.4、0.01mol/L PBS，悬浮菌体，加入0.3 mg/m1溶菌酶。超声裂解后，加入10 μg/m L DNase，12 000×g离心10 min，SDS-PAG电泳分析上清及沉淀中融合蛋白的表达情况。

亲和纯化后Western blot 鉴定：将原核表达的MR-1S-GST融合蛋白在非变性条件下经NTA柱亲和层析纯化，用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，SDS-PAG电泳确定最佳洗脱的咪唑浓度。该浓度下的洗脱产物用0.01mol/L、pH7.4的PBS透析。此外，将纯化产物和诱导前BL21菌裂解物经SDS-PAG电泳后，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜；再分别与鼠抗GST抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG作用，加化学发光底物，然后X胶片显影。

该MR-1S-GST融合蛋白经PEG浓缩后，用0.01mol/L 、pH7.2的PBS充分透析活化，用BCA（Bicinchoninic Acid）法测定蛋白质的浓度，再经冷冻干燥成冻干粉，得最终的人MR-1S融合蛋白——MR-1S-GST融合蛋白，分装-20℃保存。 

（二）、人MR-1S抗体采用如下方法制备及纯化：

本例中人MR-1S抗体的制备采用单克隆体，即抗人MR-1S单克隆抗体的制备：将取上述MR-1S-GST融合蛋白冻干粉自冰箱中取出，复温至室温，称取0.3mg，溶解于3ml生理盐水中作为MR-1S抗原，并分成三等份，每一等份为100μg/ml的MR-1S抗原1ml。将免疫8周龄，体重20克左右的BALB/c小鼠3只。首次每只小鼠取一等份MR-1S抗原加弗氏完全佐剂腹腔注射，MR-1S抗原与弗氏佐剂的体积比为1:1。间隔两周，第二次同样MR-1S抗原剂量加弗氏不完全佐剂腹腔注射，其体积比＝1：1。此后间隔三周。第三次MR-1S抗原100μg/只，不加弗氏佐剂直接溶解于1ml生理盐水N.S中腹腔注射，在第三次免疫一周后，取小鼠眼眶血以间接ELISA法测定抗体效价。经三次免疫后小鼠休息一个月，取抗体效价高的小鼠，细胞融合前三天，腹腔注射50μg MR-1S抗原、尾静脉注射50μg MR-1S抗原以加强免疫。于加强免疫后三天，通过无菌术取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，细胞比例为5:1，在pH7.8-8.0的50%PEG4000的作用下，按常规方法进行细胞融合。融合细胞以RPMI1640液洗涤一次去除PEG4000后，重新悬浮于HAT选择性培养液中。接种于预置饲养细胞层的96微孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁵个细胞。置37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养10-13天。期间显微境观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞克隆长至一个中倍镜视野大小时，取其培养上清液采用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选出的阳性孔，用有限稀释法进行克隆化培养，经过3-5次克隆化培养，获得了稳定分泌抗人MR-1S单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将已建株的单克隆杂交瘤细胞注入预先用硅胶H处理过的BALB/c小鼠腹腔，待腹部膨大时抽取腹水。3000rpm离心30min，取上清液加入1/1000（w/v）NaN₃后，4℃保存待纯化鉴定。

单克隆抗体腹水的纯化采用辛酸法。1ml腹水加2ml 0.06mol/L pH4.0的醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调至pH4.8，加33 μl辛酸，摇匀。于室温继续搅拌30min，再4℃、10000rpm离心30min，取上清用50倍体积的0.02mol/L、pH7.4的PBS作为透析液，4℃透析24小时，换透析液两次重复上述步骤。上清用BCA法测定蛋白质的浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，得最终的抗人MR-1S单克隆抗体，简称“抗人MR-1S单抗”，-20℃冻存备用。

（三）、抗人MR-1S抗体酶标记液的制备：

本例中为酶标抗MR-1S单克隆抗体交联物的制备：经纯化所得的抗人MR-1S单抗与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠交联获得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”。

（1）过碘酸钠标记法试剂的配制：

A. 0.06mol/L的NaIO₄：0.13克NaIO₄，加水至10ml；

B. 0.16mol/L的乙二醇溶液：乙二醇 0.1ml加水至10ml；

C. 5mg/ml 的NaBH₄：NaBH₄ 5mg加水至1ml；

D. 0.05mol/L 、pH 9.5碘酸盐缓冲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml成C液；无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml成D液， 取C液16ml+D液34ml，加水至200 ml制备而成；

E. 0.02mol/L pH7.4 PBS: 用0.1mol/L的 pH7.4 PBS稀释而成。

（2）过碘酸标记法的操作步骤：

1、7.5mg HRP加0.5ml 蒸馏水溶解；2、加0.5ml 、0.06 mol/L的 NaIO₄,混合后置4℃，3分钟；3、加0.5ml、0.16 mol/L乙二醇溶液，室温30分钟；4、加7mg/ml的抗人MR-1S单抗1.0ml；5、混合后装透析袋，用1000ml、0.05 mol/L、pH 9.5 碘酸缓冲液透析过夜；6、第二天，吸出透析物，加5mg/ml 的NaBH₄溶液0.2ml置冰箱2小时；7、吸出上述综合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃，30分钟后，离心4000转/分15分钟弃上清，沉淀溶于1ml、 pH7.4、0.02 mol/L PBS中，装入透析袋，再用1000ml、0.1mol/L、pH7.4的PBS透析过夜，然后此透析过夜步骤再重复一次；8、第二天，再离心去除不溶物，即得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”，分装塑料瓶中，4℃保存。

二、表达和纯化的MR-1S融合蛋白抗原鉴定

纯化后冻干的MR-1S-GST融合蛋白干粉用10～100μl、0.01mol/L、 pH7.2的PBS充分溶解，经SDS-PAG电泳后，考马斯亮蓝染色显示为单一条带，证明抗原已纯化。同样蛋白经SDS-PAG电泳后，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜；再分别与鼠抗GST抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG作用，加化学发光底物，然后X胶片显影。结果显示可与抗GST抗体结合，出现一条明显的发光条带，条带所在的位置为49,000左右，与预期要求的完全符合。所得融合蛋白用BCA法测定蛋白含量以作抗原。

三、抗人MR-1S单抗的鉴定

经辛酸－饱和硫酸铵纯化的抗人MR-1S单抗，经免疫固定电泳后，鉴定结果MR-1S为单一沉淀线，而其他蛋白如牛血清白蛋白BSA、血红蛋白Hb未出现沉淀线。

四、标准曲线的制备

取人MR-1S融合蛋白倍比稀释成系列浓度的MR-1S标准液，分别为1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187.5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml，作竞争法的ELISA测定，绘制出标准曲线，标准曲线呈”L”型，线性范围为93.8-750 ng/ml，灵敏度良好。最低检测限为93.8 ng/ml。在ELISA夹心法的酶标板上的标准曲线浓度梯度良好，也可以满足临床测定的需要。

五、试剂盒的组装

取100 μ l 的10μg/ ml 的MR-1S抗原与包被液混匀后包被96微孔板，过夜，吹干，加封闭液200 μ l，封闭2小时，吹干后，得MR-1S抗原预包被板，加一包干燥剂，用铝箔袋封好，其余步骤同实施例1。所述的包被液采用由Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29 g 加蒸馏水至100 ml制得的pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

六、采用上述制备的试剂盒，竞争法检测MR-1S含量的操作步骤： 

a、取MR-1S抗原预包被板，采用洗涤液洗涤；

b、再在MR-1S抗原预包被板加入样品，即在MR-1S抗原预包被板的不同微孔中分别加入待测血浆、系列浓度的人MR-1S标准液、阳性、阴性质控液各0.1ml，37℃，2小时后，采用洗涤液洗涤；

c、加入0.1 ml经酶标稀释液稀释过的酶标单抗，37℃ 1小时后，采用洗涤液洗涤；所述的经酶标稀释液稀释过的酶标单抗为上述所得的酶标抗体IgG采用酶标稀释液稀释，其稀释比例为1:2000；

d、再加入0.1 ml底物液，该底物液中A液与B液为1：1等量配比，37℃，30分钟； 

e、再加入0.05 ml、2mol/L的 H₂SO₄，终止反应；

f、490 nm 测OD值，采用Tecan酶免仪，如果测得OD＞2.5，则需要将b步骤中的样品采用样品稀释液以体积比1：10进行稀释后，重新进行b~f步骤；

g、计算MR-1S浓度值。

Claims (8)

1.一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

抗人MR-1S抗体预包被板1块或MR-1S抗原预包被板1块，抗人MR-1S抗体预包被板中的包被物为浓度为50～500μg/ml的抗人MR-1S抗体；MR-1S抗原预包被板中包被物为1～10μg/ml的人MR-1S融合蛋白；

抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；

系列浓度的人MR-1S标准液，即采用如下浓度的人MR-1S融合蛋白作为标准液：1500 ng/ml、750 ng/ml、375 ng/ml、187.5 ng/ml、93.8 ng/ml、0 ng/ml各1支； 

阳性质控液为含人MR-1S融合蛋白的磷酸盐溶液PBS、阴性质控液为0.9%的生理盐水各1支，所述的含人MR-1S融合蛋白的浓度为300 ng/ml；所述的磷酸盐溶液PBS的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4；

洗涤液采用2.42g的三羟基氨基甲烷Tris、13ml 的0.1 mol/L的 HCl和0.5 ml 的Tween-20混合而成；

样品稀释液为0.2 g 的KH₂PO₄、2.9 g 的Na₂HPO₄·12H₂O、8.0g 的NaCl、0.2g 的KCl、0.5 ml 的Tween-20和10g的牛血清白蛋白BSA混合后加蒸馏水至1000 ml所构成；

封闭液采用上述配方的pH 9.6的碳酸盐缓冲液100 ml，再加入1g BSA混合而成；

底物液为由A液和B液组成，所述的A液由5.1 ml的0.1mol/L的Na₂HPO₄和4 mg邻甲苯胺混合而成，所述的B液由4.9 ml的 0.05 mol/L的柠檬酸和0.05 ml 的30%的H₂O₂混合而成；

终止液采用2mol/L的H₂SO₄，即177.6 ml蒸馏水中加入22.4 ml的98％的浓H₂SO₄而成。

2.按权利要求1所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒，其特征在于：所述的抗人MR-1S抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

3.按权利要求1所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒，其特征在于：所述的预包被板采用聚苯乙烯板或聚氯乙烯板或聚氯乙烯酰胺板材质的96微孔板。

4.按权利要求1所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒，其特征在于：所述的抗人MR-1S抗体酶标记液中所采用的酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP。

5.一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒的制备方法，其特征在于将权利要求1所述的试剂通过下列步骤制备而成试剂盒：

a、人MR-1S融合蛋白的制备：抽提卵巢癌患者的血液基因组DNA，以分子克隆的方法, 即从血液基因组DNA中用PCR扩增目的基因人MR-1S，双酶切后与同样双酶切的原核表达载体pET21a（+）或PGEX-4T-1，构建pET21a-MR-1S或PGEX-4T-1-MR-1S重组质粒，转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白表达，亲和纯化后Western blot鉴定，MR-1S-His融合蛋白或MR-1S-GST融合蛋白浓缩后，用0.01mol/L 、pH7.2 的PBS透析活化，冷冻干燥成冻干粉,得到人MR-1S融合蛋白，-20℃保存；

b、抗人MR-1S抗体的制备及纯化：用上述纯化得到的人MR-1S融合蛋白免疫动物，制备特异的高效价的抗人MR-1S的抗体，并使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化；

c、将抗人MR-1S抗体或作为抗原的人MR-1S融合蛋白与包被液混匀后，包被96微孔板，所述的包被液采用由Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.29 g 加蒸馏水至100 ml制得的pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

d、上述包被好的96微孔板，过夜，吹干，再用封闭液封闭，吹干，加一包干燥剂，用铝箔袋封好，得抗人MR-1S抗体预包被板或MR-1S抗原预包被板；

e、抗人MR-1S抗体酶标记液的制备：采用过碘酸钠标记法试剂以过碘酸标记法制备，即通过调整所获得的抗人MR-1S抗体的pH值，再将酶标记于该抗体，然后储存于10 ml塑料瓶；

f、组合成检测人MR-1S的酶联免疫吸附测定试剂盒：将上述d步骤中封好的铝箔袋、上述制备而得的抗人MR-1S抗体酶标记液1瓶；系列浓度的人MR-1S标准液6支；阴性、阳性质控液各1支；样品稀释液1瓶；洗涤液1瓶；底物液A液、底物液B液和终止液各1瓶，置于一个纸制的外包装盒内。

6.按权利要求5所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒的制备方法，其特征在于步骤b中所述的人MR-1S融合蛋白免疫动物制备特异的高效价的抗人MR-1S的抗体为：当制备单抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白依次采用杂交瘤方法进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得抗人MR-1S单抗；当制备多抗时为采用将获得的人MR-1S融合蛋白与弗氏佐剂混匀，免疫实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清。

7.按权利要求5所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒的制备方法，其特征在于步骤e中采用过碘酸钠标记法试剂制备抗人MR-1S抗体酶标记液的具体步骤为：（1）将7.5mg HRP加0.5ml 蒸馏水溶解后；（2）加0.5ml 、0.06 mol/L的 NaIO₄,混合后，置于4℃环境，3分钟；（3）加0.5ml、0.16 mol/L乙二醇溶液，室温30分钟；（4）加7mg/ml的兔抗人MR-1S抗体 IgG 1.0ml 或7mg/ml的抗人MR-1S单抗1.0ml；（5）混合后装透析袋，用1000ml、0.05 mol/L、pH 9.5 碘酸缓冲液透析过夜；（6）第二天，吸出透析物，加5mg/ml 的NaBH₄溶液0.2ml置冰箱2小时；（7）吸出上述综合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃，30分钟后，离心4000转/分15分钟弃上清，沉淀溶于1ml、 pH7.4、0.02 mol/L PBS溶液中，装入透析袋，再用1000ml、0.1mol/L、pH7.4的PBS溶液透析过夜，然后此透析过夜步骤再重复一次；（8）第二天，再离心去除不溶物，即得抗人MR-1S抗体酶标记液，简称“酶标抗体IgG”，分装于10 ml塑料瓶中，4℃保存。

8.按权利要求5或7所述的一种检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的过碘酸标记法试剂包括如下试剂：

0.06mol/L的NaIO₄：0.13克NaIO₄加水至10ml；

0.16mol/L的乙二醇溶液：乙二醇 0.1ml加水至10ml；

5mg/ml 的NaBH₄ ：NaBH₄ 5mg加水至1ml；

0.05mol/L 、pH 9.5碘酸盐缓冲液：无水碳酸钠10.6克加水至500ml成C液；无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml成D液，C液16ml和D液34ml混合后加水至200 ml制备而成；

0.02mol/L pH7.4 PBS溶液: 用0.1mol/L的 pH7.4 PBS溶液稀释而成。