CN104592387A - 一种抗人mr-1s ecd抗体或抗体片段及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段及其制备方法，其抗MR-1S胞外片段是93至142位氨基酸的蛋白分子；氨基酸序列为：T-K-R-E-V-P-K-D-R-V-K-Q-M-K-A-R-Q-N-M-R-L-S-N-T-G-E-Y-E-S-Q-R-F-R-A- S-S-Q-S-A-P-S-P-D-V-G-S-G-V-Q-T。本发明提供了一种人卵巢癌肿瘤标志MR-1S的胞外区段抗原，进一步通过免疫手段制备抗MR-1S ECD抗体。该抗体具备与MR-1S分子的免疫反应性好，效价至少达到1:10⁶以上的优异效果。

Description

一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种S亚型人肌纤维生成调节因子1（MR-1S）胞外区段（ECD）的抗体及其制备方法。

背景技术

目前，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。恶性肿瘤的诊断主要依赖影像学检查，组织细胞学、生化学和免疫学检验；后者为主要检查血清或血浆中的肿瘤标志物（Tumor Marker，简称TM），由于检测TM较为经济，取材方便、检查时创伤小，且适合大批量标本检测，在临床恶性肿瘤患者的病情监测、预后评估中有较好的应用价值。

中国疾病预防控制中心的最新统计资料表明，由于人们饮食结构、生活环境及方式的改变，某些恶性肿瘤如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌等发病逐年上升。经前期研究以及任开环等的研究（J Bio Chem, 2008; 283(51): 35598-35605.）均发现，一种新的肿瘤标志物——S亚型人肌纤维生成调节因子1 （Myofibrillogenesis regulator-1 S, MR-1S，以下均简称“MR-1S”）与恶性肿瘤，如卵巢癌、肝癌的发生、发展与密切相关。其中，我们的研究也发现，MR-1S与卵巢癌细胞的粘附、转移相关，更与卵巢癌治疗疗效监测及预后高度相关；因此，目前认为MR-1S可能是卵巢癌的一种新颖的肿瘤标志物。

MR-1（Myofibrillogenesis regulator-1）是一个新近报道的人类功能基因，该基因在转录过程中可形成3条长度不同的剪接异构体，即MR-1L、MR-1M和MR-1S三种基因型，分别含10、9和3个外显子，其中S亚型MR-1（Short-type MR-1）即MR-1S的长度最短而得名；MR-1S mRNA全长755bp，可编码一个142个氨基酸组成的蛋白质，第75至92位点18个氨基酸形成一疏水跨膜结构区域，为一种膜蛋白；MR-1S可与转录起始因子3（initiation factor 3）以及具有ADP核糖基化因子（ARF）功能的蛋白（MRIP1）相互作用，其中导致转录因子的表达增多可加速细胞进入细胞周期，增加细胞分裂的速度。

现有技术Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1) is a novel biomarker and potential therapeutic target for human ovarian cancer, Renquan Lu, et al.《BMC Cancer》第11卷，第1期，2011年6月25日，以及中国专利公开号CN102368070A都公开了检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒及其制备方法。但在进一步研究中发现，针对MR-1S全长的检测并非完美；若能在检测时可针对其真正活性区域，效果才能更理想。

临床上，恶性卵巢癌起病隐匿，发现时往往处于晚期，5年的生存率不到30%。在卵巢癌的诊疗中，需要敏感、有效的标志物来辅助诊断、监测病情；新肿瘤标志物MR-1S在卵巢癌细胞中特异表达，特别是其胞外区段ECD易脱落进入血循环而可用于检测；但该肿瘤标志物MR-1S ECD的抗原及抗体目前尚未见任何报道。

发明内容

本发明的目的在于克服以往卵巢癌诊疗时缺乏特异、有效的肿瘤标志物的应用以及抗MR-1S抗体在临床检测应用中存在不足，本发明提供了一种新颖的人卵巢癌肿瘤标志MR-1S的胞外区段（ECD）抗原，进一步通过免疫手段制备抗MR-1S ECD抗体。

为实现上述目的，本发明提出一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，即抗MR-1S胞外片段（93至142位氨基酸）的蛋白分子；氨基酸序列为：T-K-R-E-V-P-K-D-R-V-K-Q-M-K-A-R-Q-N-M-R-L-S-N-T-G-E-Y-E-S-Q-R-F-R-A- S-S-Q-S-A-P-S-P-D-V-G-S-G-V-Q-T；其中维持抗原表位的关键点即第95位的精氨酸和第121位的丝氨酸。该抗体具备（A）纯度高，亲和纯化层析获 得；（B）与MR-1S分子的免疫反应性好，效价至少达到1:10⁶以上。

进一步的，该抗体的保存液为较高浓度的抗MR-1S ECD抗体储存的媒介，也是抗MR-1S ECD抗体的稀释液，由0.01mol/L磷酸盐溶液PBS（pH值为7.4）、7%蔗糖、1%BSA所构成。

进一步的，该抗体可进一步冻干，制成冻干粉。

进一步的，该抗体蛋白可以与恶性肿瘤患者外周血液中、肿瘤组织中的MR-1S ECD发生特异性的免疫反应，是一对一的匹配关系。可由人MR-1S-ECD融合蛋白或MR-1S-ECD-BSA交联体免疫动物而产生。

本发明还提出一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的制备方法，通过下列步骤制备而成：

（一）人MR-1S ECD抗原的制备

步骤a、利用分子克隆的技术手段从卵巢癌患者的肿瘤组织基因组DNA中扩增出人MR-1S ECD基因，与原核载体连接，转化大肠杆菌，诱导表达人MR-1S融合蛋白。

步骤b、人工合成胞外区段的多肽（化学合成法）：同样仅为MR-1S的93至142位氨基酸，但其中维持抗原表位的关键点即第95位的精氨酸和第121位的丝氨酸（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov检索后也证实为活性中心位点），将上述的抗MR-1S-ECD融合蛋白，与BSA交联后，合成交联体。

（二）抗人MR-1S抗体的制备及纯化

步骤c、用上述纯化得到的人MR-1S-ECD融合蛋白免疫动物，制备特异的高效价的抗人MR-1S-ECD的抗体，并使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化后，溶解于0.02mol/L pH7.4 PBS溶液中，或者进一步冻干，制成冻干粉；

步骤a、b所述的人MR-1S ECD抗原可为基因重组工程产物或化学合成制备而得产物。

步骤c所述的抗人MR-1S ECD抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

步骤c中所述的人MR-1S ECD融合蛋白或MR-1S-ECD-BSA交联体（简称MR-1S ECD抗原）免疫动物制备特异的高效价的抗人MR-1S ECD的抗体为：当制备单抗时为采用将获得的MR-1S ECD抗原依次采用杂交瘤方法进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得抗人MR-1S ECD单抗；当制备多抗时为采用将获得的MR-1S ECD抗原与弗氏佐剂混匀，免疫实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清。

（三）抗人MR-1S-ECD抗体的应用检测

 将上述纯化得到的抗人MR-1S-ECD抗体或抗体片段，用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测抗体效价及免疫印迹法（Western Blot）检测抗体特异性。

本发明还提出一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的应用，用于检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒。该试剂盒包含上述抗体或抗体片段和检测所述抗体或抗体片段的装置。

进一步的，上述抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段应用于卵巢癌的检测。

经研究发现，空间结构上，MR-1S蛋白是一种跨膜蛋白，具有胞内区段、跨膜区和胞外区段三个部分。MR-1S蛋白序列用3D-PSSM 蛋白预测Server软件进行三维结构预测分析，结果如图1所示；发现第75至92位氨基酸处呈明显的——α螺旋结构，为疏水跨膜结构区域（图1中深色部分显示，即B部分），在MR-1S蛋白的空间结构中，图1 A、C部分分别为胞内区段和胞外区段；卵巢癌细胞的细胞膜上MR-1蛋白分布示意图，图1 D所示。其中，胞外区（Extracellular Domain/ ECD, 即图中C部分）可以由肿瘤细胞自体分泌或脱落进入血液循环并被检测到；本发明中，通过分子生物学方法即通过分子克隆手段获得MR-1S ECD的融合蛋白以及通过合成多肽的手段，获得MR-1S ECD的抗原，并进一步免疫动物方法获得抗MR-1S ECD抗体。这也为临床及科研中进行MR-1S含量测定及细胞表达定位研究提供了可能。

附图说明

图1是3D-PSSM 蛋白分析Server软件预测MR-1S蛋白的空间结构。图中A为胞内区；B为跨膜结构区域；经验证，为疏水区段；C为胞外区；D为卵巢癌细胞表达MR-1S示意图（箭头所指处为MR-1S-ECD）。

图2是  Western blot检测抗人MR-1S ECD抗体的特异性。图中a是MR-1S ECD融合蛋白； b是细胞裂解样品1； c是细胞裂解样品2。

具体实施方式

实施例1

（一）、人MR-1S ECD融合蛋白的制备:

1、扩增出人MR-1S ECD基因：针对MR-1S胞外段（ECD）的序列（93-142位氨基酸），通过分子克隆技术获得相应肽段的抗MR-1S胞外段（ECD）融合蛋白：MR-1S ECD基因包含有150bp的开放读码框，编码50个氨基酸，根据其基因序列，设计了一对特异的引物：上游引物P1,5’-CGGGATCCA TGAAGCGGGAAGTGGACAAGGAC-3’,下游引物P2, 5’-CCGCTCGAGTCAGG TCTGCACCCCAGAC-3’,分别带有BamH I和Xhol I酶切位点, PCR后与克隆载体pUCm-T载体连接。扩增条件：50μL PCR扩增体系由cDNA 1μL，10×Taq buffer 5μL，2.5mM dNTP 5μL，上下游引物各1μL，Taq 酶 1μL再加入去离子水37μL混合而成，然后以94℃反应 5 min，再分别采用如下反应条件顺序： 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s依次反应36个循环后，72℃延伸10 min。扩增上述的扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒进行产物回收。

2、重组质粒：取上述3μL PCR产物与1μL pUCm-T载体在T4连接酶的作用下，16℃连接4小时，连接产物转化入感受态DH5α细菌中，涂布于有IPTG和X-gal的含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，其中氨苄青霉素的浓度为100mg/L，37℃ 16-24小时，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，接种含氨苄青霉素的 LB培养液，37℃培养过夜；用3S Spin质粒小抽试剂提取质粒，并且进行双酶酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的重组质粒送上海生工生物公司进行测序，将测序结果进行BLAST同源序列比对。采用pEGX-4T-1(＋)质粒构建原核表达载体，将测序验证正确的重组质粒经BamH I和Xhol I双酶切后，琼脂糖凝胶回收目的基因片段，并与用相同双酶酶切处理的pEGX-4T-1(＋)质粒在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜，构建PGEX-4T-1-MR-1S ECD重组质粒。

3、转化大肠杆菌BL21：将该连接产物转化进入表达菌BL21，接种至含浓度为100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜；挑选出阳性克隆进行测序鉴定。

4、诱导MR-1S-ECD-GST融合蛋白进行可溶性表达：将上述鉴定正确的阳性克隆菌接种后，扩大培养至对数生长期，利用浓度分别为0.1 mmol/L、0.5mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），每个浓度的IPTG分别在温度28℃、30℃和35℃的条件下诱导0、1、2、3、4和5小时后，6000 r/min离心10 min，收集菌体。用pH 7.4 、0.01mol/L 的PBS，悬浮菌体，加入0.3 mg/mL溶菌酶。超声裂解后，加入10 μg/mL DNase，12000×g离心10 min，SDS-PAG电泳分析上清及沉淀中MR-1S-ECD-GST融合蛋白的表达情况。

5、亲和纯化后Western blot 鉴定：将原核表达的MR-1S-ECD-GST融合蛋白在非变性条件下经GST亲和层析柱纯化，用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱目的蛋白，SDS-PAG电泳确定最佳洗脱的还原型谷胱甘肽浓度。该最佳浓度下的洗脱产物用0.01mol/L、pH7.4的PBS透析。此外，将纯化产物和诱导前BL21菌裂解物经SDS-PAG电泳后，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜；再分别与兔抗GST抗体、HRP标记的羊抗兔IgG作用，加化学发光底物，然后X胶片显影。

该MR-1S-ECD-GST融合蛋白经PEG浓缩后，用0.01mol/L、 pH7.2的PBS充分透析活化，用BCA（Bicinchoninic Acid）法测定蛋白质的浓度，再经冷冻干燥成冻干粉得最终的人MR-1S ECD融合蛋白——MR-1S-ECD-GST融合蛋白，分装，-20℃保存。

（二）、抗人MR-1S ECD抗体采用如下方法制备及纯化：

本例中抗人MR-1S ECD抗体的制备采用多抗制备，即制备抗人MR-1S ECD抗血清，其按常规抗血清制备法。首先，将上述纯化的人MR-1S ECD融合蛋白——MR-1S-ECD-GST融合蛋白自冰箱中取出3 mg，复温至室温，溶于0.5mL 、0.01 mol/L的 pH 7.4 的磷酸缓冲液中，再用生理盐水稀释至1 mL。免疫实验采用3只新西兰雄性兔，体重2.5kg左右，先于每只新西兰雄性兔的双后足掌皮下注射弗氏完全佐剂与1mg/mL的人MR-1S融合蛋白的混合物，弗氏完全佐剂：人MR-1S融合蛋白（体积比）＝1：1，初次免疫用弗氏完全佐剂与人MR-1S融合蛋白充分混匀至呈“油包水”状抗原乳化液。给新西兰大白兔的颈背部多点及脚垫内注射含1.0 mg人MR-1S-ECD融合蛋白冻干粉的蛋白量，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价符合要求后，心脏采血，分离得到抗血清，抗血清再经辛酸－饱和硫酸铵，即50%饱和(NH4)₂SO4，分步沉淀纯化成特异高效价的抗人MR-1S ECD抗体——兔抗人MR-1S-ECD IgG。

抗血清的纯化采用辛酸-饱和硫酸铵法。将上述制得兔抗人MR-1S-ECD IgG 1mL，加上4 mL 0.06 mol/L pH 4.0的醋酸缓冲液，加120μL辛酸，4℃搅拌30 min，10000rpm离心30 min，取上清用50倍体积0.02 mol/L、pH 7.4的 PBS作透析液，4℃透析过夜，取出，加等体积的pH 8.0饱和(NH₄)₂SO₄，轻轻搅拌30 min，于4℃ 10000 rpm离心20 min，去上清。沉淀溶于1mL的0.02 mol/L 、pH7.4的PBS溶液中，然后对50倍体积的上述的透析液于4℃透析36小时，换透析液三次，即再重复透析三次。再4℃、8000 rpm离心15 min，去除不溶物，得最终的抗人MR-1S-ECD抗体，也即兔抗人MR-1S-ECD抗体IgG。在紫外分光光度计上测定A₂₈₀和A₂₆₀，根据公式：（1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀）×稀释倍数，计算蛋白浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，-20℃冻存备用。

抗人MR-1S-ECD抗体的应用检测：将上述纯化得到的抗人MR-1S-ECD抗体，用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测抗体效价及免疫印迹法（Western Blot）检测抗体特异性。

（1）ELISA检测：以pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液将MR-1S-ECD蛋白稀释至10μg/m L包被聚氯乙烯酶标板，100μL /孔，置4℃24小时。取出，洗涤，以封闭液（含0.5%牛血清白蛋白的pH7.2, 0.02mol/L PB）封闭过夜。取出甩干液体，吹干，4℃干燥储存备用。临用时以pH7.2, 0.02mol/L PB洗3次，每次3分钟，拍干。每孔加入100μL 抗人MR-1S-ECD抗体，37℃温育1小时，取出，洗3次，每次3分钟，每孔加入1:1000稀释的羊抗鼠（兔）IgG-HRP 100μL，37℃温育45min。取出，洗4次，每次3min，每孔加入100μl邻苯二胺（OPD）底物液，37℃避光反应10min，加25μL  2M H2SO4终止反应，置酶标议上波长490nm比色测定。每次实验时设阳性、阴性、试剂空白（培养液）对照。检测孔吸光度（A）/阴性孔吸光度（B）≥ 2.1为阳性；< 2.1，则该孔为阴性。抗体最大稀释倍数仍为阳性，此时即为该抗体的效价。

（2）Western Blot检测：按如下步骤操作：(A)SDS-PAGE电泳：20μl MR-1S-ECD蛋白及肿瘤细胞裂解样品加5μl上样缓冲液，煮沸10min；电泳80v 30min，110v 120min。(B)电转膜：PVDF膜用甲醇浸湿5s，蒸馏水浸泡5min，再转至转膜缓冲液中平衡20min，电泳完毕后将胶置转膜缓冲液中平衡10min。滤纸及专用滤纸置转膜缓冲液中平衡，按下列顺序装好装置：负极→专用滤纸→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→专用滤纸→正极，接通电源，110mA，电转100min。(C)电转后，膜在封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）中室温封闭2h。(D)封闭液1:100稀释一抗即抗人MR-1S-ECD抗体，4℃过夜。(E)过夜的膜室温平衡30min，TBST洗3次，每次10分钟。(F)封闭液1:2000稀释二抗即羊抗鼠（兔）IgG-HRP，室温摇床1.5h。(G)膜 TBST洗4次，每次10分钟。(H)显影：显色液A与显色液B等量混匀，加于膜上，暗室显影2min。

实施例2

（—）、MR-1 ECD化学合成：

人工合成胞外区段的多肽（化学合成法）：根据软件对蛋白分子的空间结构进行分析及细胞蛋白表达定位，MR-1S的ECD确定为其氨基酸组成的93至142位氨基酸，其中维持抗原表位的关键点即第95位的精氨酸和第121位的丝氨酸（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov检索后也证实为活性中心位点）。合成ECD区段，采用固相化学合成法，合成顺序从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，氨基端是先保护，羧基端游离，用Fmoc法合成。合成的氨基酸序列为：T-K-R-E-V-P-K-D-R-V-K-Q-M-K-A-R-Q-N-M-R-L-S-N-T-G-E-Y-E-S-Q-R-F-R-A- S-S-Q-S-A-P-S-P-D-V-G-S-G-V-Q-T，其中需要进行保护的氨基酸有D、E、K、N、Q、R、S、T和Y。每个循环由以下三步反应完成，反复循环直至肽链延伸至所需长度时，即可完成。主要步骤有：（1）脱保护：受保护的氨基酸必须用一种碱性溶液——哌啶（piperidine）去除氨基的保护基团；（2）活化：待连接氨基酸的羧基被活化剂所活化；（3）偶联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽键—NH-CO—，此过程中可使试剂稍过量，促使反应完成。

合成中所用树脂是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交联度1%。合成过程中需监测树脂上的游离氨基来判断连接效率，用Kaiser方法。Kaiser试剂包括：（A）6% 茚三酮的乙醇溶液；（B）80% 苯酚的乙醇溶液；（C）2% 0.001M KCN的吡啶溶液。取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液或树脂出现兰色、红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。合成肽长50个氨基酸，共合成10mg，经基质辅助激光解吸质谱分析（MALDI-MS）鉴定序列正确（空间结构分析采用圆二色谱CD法）、HPLC分析纯度可达99%。将上述的MR-1S-ECD蛋白，与BSA交联后，合成交联体。再经冷冻干燥成冻干粉得最终的人MR-1S ECD与BSA交联蛋白——MR-1S-ECD-BSA交联体，分装，-20℃保存。

（二）、抗MR-1S-ECD抗体的制备：

采用单克隆抗体法，即抗人MR-1S ECD单抗的制备：将取上述MR-1S-ECD BSA交联蛋白、MR-1S ECD-GST融合蛋白冻干粉自冰箱中取出，复温至室温，称取0.3mg，溶解于1mL生理盐水中作为MR-1S ECD抗原。将其免疫8周龄，体重20克左右的BALB/c小鼠3只。首次将MR-1S ECD抗原称取100μg/只加弗氏完全佐剂腹腔注射，MR-1S抗原与弗氏佐剂的体积比为1:1。间隔两周，第二次同样MR-1S抗原剂量加弗氏不完全佐剂腹腔注射，其体积比为1:1；此后间隔三周。第三次MR-1S ECD抗原100μg/只，不加弗氏佐剂直接溶解于生理盐水中腹腔注射，在第三次免疫一周后，取小鼠眼眶血以间接ELISA法测定抗体效价。经三次免疫后，间隔一个月，取抗体效价高的小鼠，细胞融合前三天，腹腔注射50μg MR-1S ECD抗原、尾静脉注射50μg MR-1S ECD抗原以加强免疫。于加强免疫的三天后，通过无菌术取免疫小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞，细胞比例为5:1，在pH7.8-8.0的50%PEG4000的作用下，按常规方法进行细胞融合。融合细胞以RPMI 1640液洗涤一次去除PEG4000后，重新悬浮于HAT选择性培养液中。接种于预置饲养细胞层的96微孔细胞培养板中，每孔接种1×105个细胞。置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养10-13天。期间显微境观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞克隆长至一个中倍镜视野大小时，取其培养上清液采用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选出的阳性孔，用有限稀释法进行克隆化培养，经过3-5次克隆化培养，获得了稳定分泌抗人MR-1S ECD单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将已建株的单克隆杂交瘤细胞注入预先用硅胶H处理过的BALB/c小鼠腹腔，待腹部膨大时抽取腹水。3000rpm离心30min，取上清液加入1/1000（w/v）NaN3后，4℃保存待纯化鉴定。

单克隆抗体腹水的纯化采用辛酸法。1mL腹水加2mL 0.06mol/L pH4.0的醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调至pH4.8，加33 μL辛酸，摇匀。于室温继续搅拌30min，再4℃、10000rpm离心30 min，取上清用50倍体积的0.02mol/L、pH7.4的PBS作为透析液，4℃透析24小时，换透析液两次重复上述步骤。上清用BCA法测定蛋白质的浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，得最终的抗人MR-1S ECD单克隆抗体，简称“抗人MR-1S ECD单抗”，-20℃冻存备用。

抗MR-1S-ECD的单克隆抗体的纯化及应用性能鉴定等其余步骤同实施例1。

（1）经检测物及制备工艺流程改进，我们的抗人MR-1S ECD抗体在1:10⁶仍为阳性，即抗体的效价在1:10⁶（或以上）；结果见下表（表1）。

表1  ELISA检测抗体效价

   （2）制备的抗人MR-1S ECD抗体，Western blot检测，针对MR-1S ECD融合蛋白、细胞裂解样品1、2均呈一条特异的条带，见图2。图2是  Western blot检测抗人MR-1S ECD抗体的特异性。图中a是MR-1S ECD融合蛋白； b是细胞裂解样品1； c是细胞裂解样品2。

本发明不限于上述实施方式，还可以将抗MR-1S-ECD抗原免疫其他动物如豚鼠等，因此利用上述发明原理制成抗MR-1S-ECD抗体也应落在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其抗MR-1S胞外片段是93至142位氨基酸的蛋白分子；氨基酸序列为：T-K-R-E-V-P-K-D-R-V-K-Q-M-K-A-R-Q-N-M-R-L-S-N-T-G-E-Y-E-S-Q-R-F-R-A- S-S-Q-S-A-P-S-P-D-V-G-S-G-V-Q-T。

2.根据权利要求1所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，维持抗原表位的关键点是第95位的精氨酸和第121位的丝氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，所述的抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段为单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，该抗体的保存液由0.01mol/L磷酸盐溶液PBS（pH值为7.4）、7%蔗糖、1%BSA所构成。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，该抗体冻干，制成冻干粉。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，该抗体蛋白与恶性肿瘤患者外周血液中、肿瘤组织中的MR-1S ECD发生特异性的免疫反应，是一对一的匹配关系。

7.根据权利要求1或2或3所述的一种抗MR-1S ECD抗体或抗体片段，其特征在于，由人MR-1S-ECD融合蛋白或MR-1S-ECD-BSA交联体免疫动物而产生。

8.一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的制备方法，通过下列步骤制备而成：

步骤a、利用分子克隆的方法从肿瘤组织基因组DNA中扩增出人MR-1S ECD基因，与原核载体连接，转化大肠杆菌，诱导表达人MR-1S融合蛋白；

步骤b、人工合成胞外区段的多肽：将上述的抗MR-1S-ECD融合蛋白，与BSA交联后，合成交联体；

步骤c、用上述纯化得到的人MR-1S-ECD融合蛋白免疫动物，制备抗人MR-1S-ECD的抗体。

9.根据权利要求8所述的一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，将制得的抗人MR-1S-ECD的抗体使用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化后，溶解于0.02mol/L pH7.4 PBS溶液中，或者进一步冻干，制成冻干粉。

10.根据权利要求8所述的一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，所述步骤a和/或b所述的人MR-1S ECD抗原是基因重组工程产物或化学合成制备而得产物。

11.根据权利要求8所述的一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的制备方法，其特征在于，步骤b或步骤c中所述的人MR-1S ECD融合蛋白或MR-1S-ECD-BSA交联体称为MR-1S ECD抗原，免疫动物制备抗人MR-1S ECD的抗体是：当制备单抗时为采用将获得的MR-1S ECD抗原依次采用杂交瘤方法进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得抗人MR-1S ECD单抗；当制备多抗时为采用将获得的MR-1S ECD抗原与弗氏佐剂混匀，免疫实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清。

12.一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的的应用，是用酶联免疫吸附试验法检测抗体效价及免疫印迹法检测抗体特异性。

13.根据权利要求12所述一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的的应用，用于检测人血浆中MR-1S含量的试剂盒。

14.根据权利要求12所述一种抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段的的应用，所述抗人MR-1S ECD抗体或抗体片段应用于卵巢癌的检测。