CN102887943B - 氨基末端脑钠肽的b细胞表位肽段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术，具体为氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段，氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示，其制备的特异性抗体可用于作为心力衰竭的诊断试剂；本发明制备的氨基末端脑钠肽是高纯度的氨基末端脑钠肽单体重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立氨基末端脑钠肽定量检测时的校准品。通过氨基末端脑钠肽蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS‑PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶512000)、特异性好、可大批量制备等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，特别涉及心力衰竭的诊断技术。
背景技术
心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure，HF)作为严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合症，已不再被简单地看作是独立临床疾病，而是作为心血管疾病发展到后期的一个阶段，即从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病、最后发展成为心力衰竭。有学者统计，心力衰竭患者一旦出现典型症状，5年存活率男性为25％，女性为38％，与恶性肿瘤病人相仿。2003年，中国心血管健康多中心合作研究组应用四阶段整群随机抽样方法，在中国10省市抽样调查，结果显示心衰患病率为0.9％，随着年龄增高，心衰患病率显著上升。由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显，HF正成为我国心血管领域的重要公共卫生问题。在发达国家，约有7％的人群患有此病，目前也仅有2％的人被及时确诊。心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿和最主要的死亡原因之一，呼吸困难是充血性心力衰竭(CHF)的主要症状，又是某些肺部疾病的主要临床表现，相互间鉴别比较困难，而在急诊工作中须在短时间内对呼吸困难做出正确诊断，因此，寻找一种敏感、快捷、准确的鉴别诊断方法对于急诊科医生来说是非常重要的，可以在很大程度上方便急诊科医生提高诊断的敏感性和特异性，并帮助判断病情的严重程度。或者在尚未出现明显“充血性”症状之前就着手干预治疗，从根本上防治HF，延缓HF发展进程，提高患者的远期存活率。从这个意义上来看，心力衰竭的早期诊断和治疗监测非常重要。然而，无论是在住院病人还是门诊病人，临床上用常规方法不但对HF的诊断方面存在困难，而且在分析治疗的结果时也不确定。如传统的心电图、超声心动图等检查方式，特异性和及时性都不够，而且传统的检查方式均不能对心肌损伤的长期影响进行评估，难以及时方便地指导患者的治疗。
1988年日本学者Sudoh T等从猪脑内首次分离出一种与心房钠尿肽(Atrialnatriuretic peptide，ANP)功能相似的物质，即具有扩张血管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固醇系统、抑制交感神经活性和促进尿钠排泄作用，虽然这一物质与ANP的分子结构相似，但其氨基酸组成和组织学分布存在差异，故将其命名为脑钠尿肽(Brain natriureticpeptide，BNP)。目前，大量的研究已明确BNP是从其氨基酸前体蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而来，是由心室细胞合成并分泌进入血液的32个氨基酸多肽，裂解同时产生76个氨基酸的无生物学活性的氨基末端脑钠肽(NT-proBNP)，二者来源相同并且等摩尔分泌。通过组织生理学研究发现，牵拉刺激、激素(如儿茶酚胺、血管紧张素、内皮素)分泌以及缺氧均能导致心肌细胞、心脏成纤维细胞分泌proBNP。从理论上讲，无论是检测BNP还是NT-proBNP，都可以反映体内心肌细胞受到的容量负荷和压力负荷的大小，均能够单独地预示左心室(LV)舒张末期压力增高的状况，能应用于充血性心力衰竭等相关疾病的鉴别诊断、疗效监测及预后评估。BNP、NT-proBNP检测与肌钙蛋白、CK-MB和肌红蛋白不同，后三者是由于心脏损伤而释放的标志物，而血浆NT-proBNP水平在心脏功能代偿阶段即可明显升高，有利于更早发现心功能的异常。
研究发现，BNP具有分子内的二硫键并且作为一种分析物不很稳定，其原因是由于BNP作为激素发挥生理功能，因而必须被迅速分解灭活。因此，它作为一种诊断标记的应用仅仅是有限的。而且BNP在血浆中含量较低，仅为7ng/L，而NT-proBNP的血浆含量平均值为41ng/L，后者对于区分健康个体和患有心力衰竭的患者，以及根据心力衰竭的严重程度对患者样本进行分级所需要的检测低限是足够的，可保证自动化实验室的样品常规测试得以实施。另外，NT-proBNP在血浆中的半衰期为120分钟，BNP的半衰期为22分钟，提示NT-proBNP更易进行免疫定量分析。
目前认为，NT-proBNP成为检测HF的标准主要体现在以下几个方面：①诊断症状性心力衰竭，用于急性呼吸困难的鉴别诊断；②诊断无症状性左室功能障碍，早期发现心衰病人；③判断心衰病人的危险分层，以判断是该入院还是出院；④检验心力衰竭的治疗；⑤评估心力衰竭病人的预后；⑥评估急性冠脉综合征(ACS)；⑦筛选慢性心衰高危人群；⑧作为猝死的标志物；⑨诊断舒张功能不全。
罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics，Inc)在美国和欧洲16个医学中心对2000多位健康和病患男女进行的临床研究，此项研究显示充血性心力衰竭症状的严重性与NT-proBNP的水平有关。2002年，国际上已经公认NT-proBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。早期实验的研究对象多是急诊室呼吸困难、肺心病、心脏病患者，显示NT-proBNP与心衰具有很好的相关性，阳性预测值达到90％-95％，其阴性预测能力更具有价值。当急性心力衰竭出现左室充盈压增加的临床综合征以及如缺血、肺栓塞等任何导致肌细胞伸展的情形，检测NT-proBNP非常有益，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，NT-proBNP还能辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导。目前，基于NT-proBNP的心力衰竭试剂盒，仅有罗氏公司持有。灵敏度更高或成本更低的相关试剂盒急需开发。
发明内容
本发明的目的之一在于提供氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，其能作为氨基末端脑钠肽单克隆抗体的抗原。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段，所述氨基末端脑钠肽B细胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。上述氨基酸序列是通过如下手段获取的：从NCBIProtein数据库中获取如SEQ ID NO：5所示的氨基末端脑钠肽蛋白序列；分别对氨基末端脑钠肽的蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性、柔韧性以及可能的糖基化位点，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域，其序列如SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5所示。
所述的B细胞表位肽段化学合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其与BSA的交联能力，接着与BSA或KLH交联。将所述的B细胞表位肽段与载体蛋白BSA或KLH交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。
本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞，其能特异性的分泌氨基末端脑钠肽的单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的制备是通过所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段与BSA或KLH交联后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞悬液并制备SP2/0细胞悬液(脾脏B淋巴细胞)，并与骨髓瘤细胞和融合，将融合细胞选择性培养，通过ELISA筛选后得到的杂交瘤细胞。将筛选出的最强阳性细胞进行克隆化培养，同时在克隆化培养的杂交瘤细胞中筛选出最强阳性化的杂交瘤细胞送于并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO：C201288，其可稳定分泌所述单克隆抗体。
本发明的目的之三在于提供所述一种特异性抗体，其可作为检测氨基末端脑钠肽抗原的试剂。同时，还提供含有上述抗体的试剂盒，该试剂盒可用于心力衰竭的诊断。
所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的特异性抗体。所述特异性抗体为所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
作为优选的，所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO：C201288。
基于诊断心力衰竭的双抗夹心ELISA试剂盒，由缓冲液、单克隆抗体、洗涤液、酶标抗体、TMB底物、终止液组成，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO：C201288的杂交瘤分泌，所述酶标抗体为被辣根过氧化物酶标记的心力衰竭重组蛋白。
本发明的目的之四在于提供三种新应用，该应用为心力衰竭的诊断提供了新的思路。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。所述的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽为免疫原性多肽，其可被B细胞抗原受体(BCR)识别并结合，或与氨基末端脑钠肽抗原的抗体特异性识别并相互结合；所以，所述B细胞表位肽段可以制备成诊断试剂，用于检测标本中的NT-proBNP抗原的特异性抗体含量，进一步判断是否为心力衰竭患者提供指标参数，同时对于鉴别呼吸困难是否为心源性原因具有重要意义，优于临床判断。另外，为辅助判断进展期心衰患者的预后，以及对左心室功能不全的治疗进行监测和指导提供检测基础。
人氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。或人NT-proBNP的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体或氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段的特异性抗体的免疫复合物，可用于免疫原及筛选原的检测，或建立氨基末端脑钠肽定量检测。当氨基末端脑钠肽的含量超过正常人的标准，氨基末端脑钠肽的含量可作为判定心力衰竭的判定辅助参数。
本发明的有益效果在于：本发明制备的氨基末端脑钠肽是高纯度的氨基末端脑钠肽单体重组蛋白，该蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立氨基末端脑钠肽定量检测时的校准品。通过氨基末端脑钠肽蛋白序列的B细胞表位肽段免疫小鼠制备的单克隆抗体具有纯度高(SDS-PAGE检测纯度＞96％)、效价高(ELISA效价达1∶512000)、特异性好、可大批量制备等优点。氨基末端脑钠肽蛋白中B细胞表位肽段化学合成时在其N端引入半胱氨酸，提高了其与KLH或BSA交联率(＞50％)，可获得优质免疫原。通过本发明制备的单克隆抗体、多克隆抗体可用于患者血浆氨基末端脑钠肽含量的检测，如可采用“双抗体夹心”ELISA反应模式，即酶标记人抗氨基末端脑钠肽单抗、酶标板包被抗氨基末端脑钠肽多抗和被测样品氨基末端脑钠肽抗原形成“双抗体夹心”结构进行测定。
附图说明
图1为1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，箭头显示为目的片段。
图2为Western Blot鉴定NT-proBNP单克隆抗体的有效性，其中Control指对照蛋白；NT-proBNP(左)指上样量2.5μg；NT-proBNP(右)指上样量5μg。
图3为Western Blot鉴定NT-proBNP多克隆抗体的有效性，其中NT-proBNP(左)为上样量10μg，NT-proBNP(右)为上样量5μg。
本发明中杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株24-NT-proBNP送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201288，地址位于中国武汉武汉大学，收到日期为2012年6月20日，存活检测日期为2012年6月27日，保藏的培养物名称为小鼠杂交瘤细胞。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和现代免疫学实验技术(沈关心周汝麟主编)中所述的条件或制造商建议的条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。
实施例1重组NT-proBNP基因克隆
从GenBank(登录号NCBI Reference Sequence：NM 002521.2)获取人NT-proBNP编码基因序列，将其提交于生物在线分析软件GCUA(Graphical codon usage analyzer，http://guca.schoedl.del)分析评价，并进行密码子偏嗜性改造优化。优化方式为把NT-proBNP蛋白在大肠杆菌中表达活性低于20％的密码子同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子(在不进行密码子置换的情况下，也能实现相同功能)。SEQ ID No：1为从GenBank获取人NT-proBNP编码基因核苷酸序列，下划线部分为GCUA分析结果显示在大肠杆菌中表达活性低于20％的密码子。
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经过密码子偏嗜性改造优化后的NT-proBNP编码基因核苷酸序列，下划线部分为经过同义置换的密码子，SEQ ID No：2
cacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaacgagcggcctgcaggagcagcgcaaccatctgcagggcaaactgagcgag
ctgcaggtggagcagaccagcctggagccgctgcaggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtggccaccgagggc
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NT-proBNP蛋白相应的氨基酸序列，SEQ ID No：3
“His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly LeuGln Glu Gln ArgAsn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln ThrSer Leu Glu Pro Leu Gln Glu SerPro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg GluVal Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys MetVal Leu Tyr Thr Leu Arg AlaPro Arg”
(谷氨酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸val V；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F；组氨酸his H；脯氨酸pro P；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R；天冬氨酸Asp D)
为进行有效表达及纯化，将序列SEQ ID NQ：2的5′-及3′-端分别添加限制性酶切位点Sal Ⅰ、BamH Ⅰ，其中BamH Ⅰ酶切位点后加入-gatgatgatgataag-核苷酸序列，其编码的-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-氨基酸序列为肠激酶(EK酶)的识别位点。全序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行全基因合成。
实施例2重组pET42a-NT-proBNP质粒构建
将pET42a载体与全基因合成序列亚克隆载体(详见实施例1)经Sal Ⅰ、BamHⅠ酶切4小时，琼脂糖凝胶电泳回收，用T4DNA连接酶4℃过夜连接。将制备好的感受态DH5α菌200μL，冰浴，吸取1μL连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μL室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，分别将50μL、200μL及剩下的全部转化菌涂于3个含卡那霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑去白素菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用Sal Ⅰ、BamHⅠ双酶切4小时，酶切体系为：pET42a-NT-proBNP质粒DNA 10μl，Sal Ⅰ 1μl，BamH Ⅰ 1μL，10×缓冲液K 2μL，ddH2O 6μL，并取酶切产物10μL行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见与设计值255bp一致的片段(图1)。
实施例3重组NT-proBNP蛋白诱导表达
常规方法转化BL21 codon plus(DE3)工程菌，取重组pET42a-NT-proBNP质粒转化BL21 codon plus(DE3)菌，涂布于含氯霉素抗性与卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，培养温度30℃，测细菌OD值达0.6～0.8时加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达4小时。培养后每克湿菌以10倍体积的PBS缓冲液(pH 7.3)重悬，混匀后超声破菌，破菌完全后于4℃10,000rpm离心15min，上清以0.45μm微孔滤膜过滤。分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白可溶性，未诱导的菌液和诱导3.5小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，目的蛋白分子量约为9kD，与预期pET42a-NT-proBNP的表达产物的分子量值相符，而沉淀无此蛋白条带，证实重组融合蛋白为可溶性表达，NT-proBNP表达产物约占细菌总蛋白质量的22％。
实施例4重组NT-proBNP蛋白的纯化
转化pET42a-NT-proBNP重组质粒的工程细菌经0.6mmol/L的IPTG诱导表达后使用GSTrap F.F.初纯化，使用GSTrap F.F.的结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.15MNaCl，pH7.3)重悬后冰上超声破菌，4℃高速离心，留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脱液(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脱，收集洗脱蛋白。将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/l，sodium phosphate，0.5MNaCl，pH7.4)按1∶9的体积比稀释后上HisTrap HP再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)，先体积分数为10％缓冲液洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100％缓冲液将目的蛋白洗下。再用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50Mm Tris-HCl，pH8.0。将获得的纯化重组蛋白用HiTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，按EK酶与蛋白1∶1000的质量比加入带有His标签的EK酶，4℃低速摇床(60r/分钟)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrap HP纯化，分别收集穿透峰、体积分数为10％缓冲液洗脱和100％缓冲液洗脱的蛋白，17.5％SDS-PAGE电泳进行鉴定。pET42a-NT-proBNP表达的融合蛋白是以GST-NT-proBNP形式存在，经EK酶切后得到NT-proBNP目的蛋白。
实施例5重组NT-proBNP蛋白的浓度、纯度鉴定
(一)Lowry法(Folin-酚试剂法)测定NT-proBNP蛋白质含量
Lowry法测定的试剂盒购于上海美季生物技术有限公司，试剂A：1)10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中；2)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份(A)与1份(B)混合，即为试剂甲。
试剂B：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O)，25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85％磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/mL左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9％NaCl溶液。
详见下表：
在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A260值与A280值。根据公式，蛋白浓度C＝(1.45×A280-0.75×A260)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25～150μg范围，按照上表的操作程序反应，测定处650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得实施例4制备的重组NT-proBNP蛋白的浓度为1.050g/L。
(二)纯化产物经高效液相色谱法(HPLC)进行纯度测定
纯化的GST-NT-proBNP经HPLC检测纯度为93.5％，每升诱导菌获得30.5mg融合蛋白。经EK酶切割后的纯化NT-proBNP蛋白检测纯度为97％，每升诱导菌可获得5.2mg重组NT-proBNP蛋白。
实施例6重组NT-proBNP蛋白的免疫反应特异性鉴定
采用胶体金法检测重组NT-proBNP蛋白的免疫反应特异性，免疫胶体金检测试剂购于瑞莱生物工程(深圳)有限公司(产品编号：030291)。结果显示在胶体金试纸条的检测带处出现了清晰的阳性条带。
实施例7重组NT-proBNP蛋白的稳定性
采用冻干保存的方式在4℃的条件下保存6个月，其检测值降低＜5％，而用校准品稀释液(0.01mol/L PBS pH7.2，0.1％BSA，0.1％Proclin-300)保存1个月即降低30％以上，6个月减少75％以上，说明长期保存宜采用冻干的形式。此外，在冻干品用校准品稀释液溶解后，7天内仅降低＜10％，因此在这期间可用于定量检测。
以上实施例制备的重组NT-proBNP蛋白可用于抗体制备的免疫原及筛选原，同时可以作为建立NT-proBNP定量检测试剂的标准品。
实施例8NT-proBNP B细胞表位肽及其衍生物的制备
所述的B细胞表位肽的序列来自生物信息学分析结果，综合分析NT-proBNP蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，对各区段进行分析评分，选取得分高的区域作为B细胞表位区域。具体的，利用Chou&Fasman预测β转角、Emini法预测抗原表面可及性、Karplus&Schulz法预测蛋白柔韧性、Kolaskar&Tongaonkar进行蛋白质抗原性分析、Parker法进行蛋白质疏水分析和Bepipred进行线性抗原表位预测等，综合分析获取的技术参数，获得人NT-proBNP蛋白中潜在的B细胞表位肽氨基酸序列。
所述的筛选B细胞表位肽氨基酸序列SEQ ID NO：4为：
“-Ash HisLeu 24 Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln35 Thr Ser-本序列中，下划线部分，即“-Leu24 Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val GluGln35-”，该序列为B细胞表位肽氨基酸序列，而分别位于N端、C端的-Asn His-、-Thr Ser-为具有保护作用的氨基酸，其序列排列与天然NT-proBNP蛋白氨基酸排列顺序一致。
所述的化学合成B细胞表位肽衍生物是在NT-proBNP的B细胞表位肽氨基酸序列N端引入半胱氨酸(Cys)与牛血清白蛋白(BSA)，Cys可提高表位肽与BSA(也可为KLH)交联率(＞50％)。NT-proBNP的B细胞表位肽衍生物，序列N端阴影部分为引入的牛血清白蛋白与半胱氨酸。
“BSA-Cys-Asn-His-Leu24-Gln-Gly-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Gln-Val-Glu-Gln35-Thr-Ser”
把NT-proBNP的B细胞表位肽衍生物委托北京赛百盛基因技术有限公司进行化学合成。
以下实施例涉及抗NT-proBNP单克隆抗体的制备与鉴定。
实施例9NT-proBNP B细胞表位肽衍生物免疫Balb/c小鼠及血清效价测定
将实施例8获得的NT-proBNP B细胞表位肽抗原(“BSA-Cys-Asn-His-Leu24-Gln-Gly-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Gln-Val-Glu-Gln35-Thr-Ser”)从-80℃冰箱取出作免疫原，溶解后过滤。
选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化选用双注射器互推法。首次免疫时，将NT-proBNP B细胞表位肽衍生物抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化混合，得抗原混合物，每只小鼠按100μg的量皮内多点加腹腔注射。第14和第28天分别进行第2次第3次免疫，佐剂改用不完全弗氏佐剂，抗原量、注射体积和途径不变，第3次免疫后间接ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg表位肽衍生物，3天后细胞融合。
第3次免疫后10天从小鼠尾静脉取血检测血清抗体效价。将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用；用包被液(0.05mol/L碳酸钠缓冲液：0.16gNa2CO3，0.293g NaHCO3，0.02g NaN3，加去离子水溶解定容100ml)将实施例4所得NT-proBNP重组蛋白抗原稀释为最佳工作浓度5μg/mL，每孔加100μL抗原稀释液，37℃温育1小时后，以胶带封口，于4℃过夜，倒尽板孔中液体，吸干孔内残余反应液，加满洗涤液过一次，再注满洗涤液缓缓晃动2min，倾去，反复五次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。自然干燥后以胶带封口，此为NT-proBNP重组蛋白抗原包被的酶标板，加封闭液300μl，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；采血及稀释血清：捏住鼠尾，75％酒精消毒后用剪刀在尾静脉剪一缺口，取血20μL，2000rpm离心30min，取上清1μL加入999μL抗体稀释液混匀，并进行体积倍比稀释，从1∶100至1∶3200，将稀释的被检血清每孔加入100μL，同时取小鼠免疫前血清1∶100稀释做阴性对照，抗体稀释液做空白对照。37℃孵育1～1.5小时，洗涤5次；将辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG(上海亿欣生物科技有限公司)稀释到1∶10000，每孔加100μL，37℃孵育1.5小时，洗涤5次；加邻苯二胺溶液100μL/孔，室温暗处15分钟，每孔加终止液100μL观察结果，OPD氧化后的产物呈橙红色，用酶联免疫检测仪记录492nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值大于阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。血清效价达到1∶3200，可用于细胞融合。
实施例10小鼠脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液的制备
取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血处死，眼血离心后收集血清作ELISA的阳性对照，无菌操作取出脾脏，放入盛有10mL不完全培养基的玻璃皿中，洗涤，小心剥去周围的结缔组织和脂肪组织，换一玻璃皿，将脾脏捞出，置于200目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，不时用不完全培养基冲洗，使脾细胞穿过网孔进入溶液中，将脾细胞移至10mL玻璃离心管中，800rpm水平离心10min，去上清。同法用不完全培养基10mL洗涤细胞1次，离心收集沉淀的细胞，将细胞用10mL不完全培养基重悬混匀，细胞计数约为1×108个细胞。将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，将细胞转移到10mL离心管中，800rpm水平离心10min，弃上清，10mL完全培养液重悬沉淀，把细胞悬液转移到50mL培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长良好后用含8-AG的选择培养基筛选细胞一周；融合前2天，将1瓶细胞传至4瓶，则融合当天细胞正处于对数生长期，活力正好，细胞大小均匀，圆而透亮，融合当天，用弯头滴管将SP2/0细胞从管壁上轻轻吹下，收集于离心管中，离心，弃上清，沉淀用不完全培养基洗涤后，10mL不完全培养基重悬，细胞计数，约为5.5×107。
实施例11滋养细胞的制备
取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血处死，体积分数为75％乙醇浸泡消毒5min，剪开小鼠皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪一小口，弯头滴管吸取预冷的不完全培养基冲洗腹腔，将洗液吸至50mL离心管中。同法用不完全培养基冲洗腹腔3次，收集洗液，室温下1000rpm水平离心10min，去上清，10mL不完全培养基重悬细胞并计数，使细胞浓度为2×105/ml，备用。
实施例12骨髓瘤细胞和脾脏B淋巴细胞融合
融合前将PEG1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个骨髓瘤细胞悬液和1×108个脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶10)至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％PEG1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基30ml终止融合，3min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入10mL HAT培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μL/孔，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
实施例13融合细胞的选择性培养及杂交瘤细胞的筛选
融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加HAT培养基100μL，第14天换HT培养基培养。融合后10～14天，待细胞长到满培养孔的1/2孔底时，采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆；以实施例1制备的纯化后NT-proBNP蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)，4℃过夜，洗涤缓冲液洗涤5次，每次5min，拍干液体，每孔加入封闭液300μl，37℃孵育2h，加入100μL细胞培养上清，阳性对照选小鼠的免疫血清，阴性对照选SP2/0培上清，空白对照用洗涤液，37℃孵育2h；洗涤酶标板：每孔加入100μL效价为1∶10000(体积)稀释的HRP标记的羊抗小鼠IG抗体，37℃孵育2h；洗涤，拍干液体，加新鲜配制的邻苯二胺溶液100μL/孔，室温暗处反应10～15分钟，加终止液每孔100μL终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。结果为以NT-proBNP表位肽段为抗原，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，经克隆化和ELISA筛选后，得到分泌NT-proBNP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其细胞培养上清效价达到1∶12800。这株杂交瘤细胞经数次冻存，体外传代培养3个月以上仍能稳定分泌抗体。
实施例14阳性杂交瘤细胞的克隆化
如实施例13所示的筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备饲养细胞，用10mL不完全培养基重悬，收集阳性克隆细胞并计数，用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/20mL，取一块预先已加有滋养细胞的96孔细胞培养板，加入200μL细胞悬液，将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中扩大培养，收集细胞液氮冻存，同时将培养板在37℃，5％CO2培养箱培养，第3天后显微镜下观察细胞生长情况，10天后用ELISA法检测效价，并将最强的阳性克隆再次克隆化，直至细胞阳性率达100％，即可定株；测取定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价后再将定株的杂交瘤细胞扩大培养，并送中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，保藏号为CCTCC NO：C201288，其可稳定分泌所述单克隆抗体。
实施例15小鼠腹水制备、抗体纯化及效价测定
选用健康雌性Balb/c小鼠10只，腹腔注射0.5mL灭菌石蜡油/鼠，1-2周后每只小鼠腹腔注射0.5×106～1×106个杂交瘤细胞，同时注射0.25ml等量混合的液体石蜡与不完全弗氏佐剂的混合物。小鼠明显产生腹水后拉颈处死，用吸管从腹腔取出腹水，4℃离心15min，分离收集中段的澄清腹水液。选用HiTraprProtein A HP柱接入AKTA Explorer纯化抗体，经SDS-PAGE检测纯度大于95％。纯化的抗体用间接ELISA法检测效价达1∶512000，初步说明获得的单克隆抗体对NT-proBNP分子有较高结合能力，分装冷冻保存，待后续使用。
实施例16抗NT-proBNP单克隆抗体的有效性鉴定
应用商品化的NT-proBNP蛋白(上海叶民生物技术有限公司)作为抗原标准品，通过免疫印迹方法鉴定所制备单抗的有效性，结果显示抗NT-proBNP单抗结合NT-proBNP蛋白处可见清洗条带(图2)。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。
实施例17抗NT-proBNP单克隆抗体的亲和力测定
为检验抗NT-proBNP单克隆抗体的对NT-proBNP抗原的结合能力，运用基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法对所获单抗进行亲和力测定。将纯化好的NT-proBNP抗原(实施例4制备的)溶解在0.05moL/L的碳酸缓冲液(pH9.5)中，调整NT-proBNP的终浓度为1μg/mL，于ELISA板孔中每孔加100μL，胶带封闭条板4℃过夜。次日拍干孔中液体，以含体积分数为1％BSA的PBS溶液对各孔封闭2小时，洗板并干燥后4℃保存备用。根据测定原理及方法建立抗原抗体反应系统，抗NT-proBNP单克隆抗体(实施例15制备的)初始反应浓度稀释至40ng/mL，NT-proBNP抗原初始浓度稀释至360mg/mL。NT-proBNP抗原浓度倍比稀释按30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.235(单位为10-12mol/l)进行，计算抗NT-proBNP单克隆抗体的亲和力常数。结果显示实施例15制备的抗NT-proBNP单克隆抗体具有高亲和力，Kd＝4.8×10-8mol/L。
以下实施例涉及抗NT-proBNP兔多克隆抗体的制备与鉴定，其免疫原为实施例4制备的NT-proBNP重组蛋白。
实施例18免疫动物
以实施例4所得NT-proBNP重组蛋白为免疫原，采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔(也可免疫其它动物)。免疫程序：基础免疫前耳缘静脉取血5ml分离血清作为阴性对照。每只用抗原500μg与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后进行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐剂加强免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐剂第3次免疫。第3次免疫后7天，耳缘静脉取血5mL分离血清，用间接ELISA检测抗血清的效价，效价达不到要求可再加强免疫1次。效价达1∶64000时颈动脉插管收集全血，4℃放置过夜，4000rpm离心收集血清，-70℃保存。
实施例19特异性亲和纯化抗体
将待纯化的血清用上样缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸三钠，pH7.0)适当稀释后加入到Protein A柱中，用洗脱缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸钠，pH3.0)洗脱柱子，收集单峰。收集的纯化产物再经抗原抗体特异性亲和纯化，得到纯化的抗NT-proBNP多克隆抗体，即NT-proBNP重组蛋白的特异性多克隆抗体。将纯化后的抗体通过斑点杂交的方式鉴定其识别并结合抗原的能力。
所述的抗原抗体特异性亲和纯化方法：NT-proBNP抗原用buffer A(0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH 8.0)，按照0.5∶1(buffer∶sample)处理，将填料NHS-activatedSepharose 4FAST Flow装柱，室温下将NT-proBNP重组蛋白偶联在柱上，经过纯化过量的抗原决定簇及大量清洗柱体后，备用。反复上样，保证特异性的抗NT-proBNP抗体充分与柱结合，用100mol/L甘氨酸，pH 2.5洗脱，特异性抗体蛋白直接被洗脱收集入1mol/L Tris，pH9.0，-20℃保存备用。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。
实施例20抗NT-proBNP多克隆抗体的有效性鉴定
应用商品化的NT-proBNP蛋白(上海叶民生物技术有限公司)作为抗原标准品，通过免疫印迹方法鉴定所制备单抗的有效性，结果显示抗NT-proBNP多抗结合NT-proBNP蛋白处可见清洗条带(图3)。本实施例的实验步骤详见《现代免疫学实验技术》(沈关心周汝麟主编)。
实施例21双抗体夹心ELISA检测人血NT-proBNP
(一)双抗体夹心ELISA的建立
用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释所述NT-proBNP单克隆抗体(见实施例15)包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，用洗液(0.05％PBST，pH 7.4)洗3次；5％BSA封闭，200μl/孔，37℃孵育2h后洗3次；加入NT-proBNP标准品(见实施例4)和待测血清样本，100μl/孔，标准品做倍比稀释。37℃孵育1h后洗3次；加入抗NT-proBNP多抗(实施例18制备所得)，100μL/孔，37℃孵育1h后洗3次；再加入HRP标记的羊抗兔IgG(上海亿欣生物科技有限公司)，37℃孵育45min后用洗涤液(0.1％PBST，pH 7.4)洗6次；加TMB底物，100μl/孔，37℃显色10min，以2mol/L硫酸终止反应，在酶标板450nm处测吸光度值(OD450)。
(二)ELISA最佳反应条件的确定
用棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度，将所述NT-proBNP单克隆抗体按照1∶2000、1∶10000、1∶50000稀释3个浓度包被酶标板，阳性对照(0.5μg/mlNT-proBNP重组蛋白为标准品)和阴性对照(PBS)为样品，多抗按1∶2000、1∶5000、1∶10000稀释3个浓度，HRP标记羊抗兔IgG按实际说明书推荐稀释度，按照上述实验步骤操作，确定抗体的最佳工作浓度。然后将HRP标记羊抗兔IgG倍比稀释，再次做棋盘滴定。阳性对照OD450值在1.5左右，阴性对照OD450值小于0.1的条件下为最佳，初次结果不理想，可进一步缩小或扩大稀释度以取得抗原抗体的最佳反应浓度。结果：在捕获抗体(实施例15制备的单抗)稀释度为1∶10000、夹心抗体(实施例18制备所得)的稀释度为1∶5000和所述HRP标记的羊抗兔IgG稀释度为1∶5000条件下该ELISA检测方法的性价比最高。
实施例22心力衰竭的诊断试剂
马锦洪在《NT-proBNP在心力衰竭诊断中的价值》一文中，按Fram-inghan诊断标准和排除标准纳入该院心内科心力衰竭患者139例为心力衰竭组，按美国纽约心脏病学会(NYHA)分级；对照组60例。评价两组心功能和临床情况，并采用固相免疫法测定血浆NT-proBNP浓度。结果血浆NT-proBNP的诊断性实验受试者工作特征曲线的曲线下面积为0.860(P0.01)，cutoff值为309.4pg/mL，其敏感性为76.0％，特异性为90.0％，阳性似然比为7.6。心力衰竭患者血浆NT-proBNP水平明显升高，与对照组比较其差异有统计学意义(P0.01)；血浆NT-proBNP水平随着心力衰竭程度加重而增加(P0.01)。结论在患者心力衰竭的进展中其血浆中NT-proBNP水平与心力衰竭程度密切相关，测定患者血浆NT-proBNP水平是监测心力衰竭程度的有效手段之一。
本实施例运用实施例21中“二ELISA最佳反应条件的确定”提及的方法验证，结果和马锦洪在《NT-proBNP在心力衰竭诊断中的价值》一文中的研究一致。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞的生物保藏编号为CCTCC NO：C201288，所述杂交瘤细胞是由氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段制备而成，所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段偶联有载体蛋白BSA，所述氨基末端脑钠肽的B细胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞制备的特异性单克隆抗体。
3.权利要求2所述的特异性单克隆抗体在制备心力衰竭的诊断试剂中的应用。
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