JPH03502759A - タンパク質の１３位にアミノ酸変異を有する活性化Ｒａｓタンパク質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の１３位にアミノ酸変異を有する活性化Ｒａｓタンパク質に対するモ ノクローナル抗体発明の分野 本発明はｒａｓタンパク質の１３位がアスパラギン酸またはバリンでアミノ酸置 換された活性化（発癌性）　ｒａｓタンパク質に対して免疫反応性のあるマウス モノクローナル抗体（Ｍａｂ）および抗体断片に関する。集合的にｐ２１と称さ れるこれらの活性化ｒａｓタンパク質は急性骨髄性白血病およびを髄形成異常症 候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と称される前白血 病疾患などの疾病において発見されている。更に、それら抗体を分泌するハイブ リドーマセルライン、本発明の抗体または抗体断片の悪性および前悪性障害の診 断、段階決定（ｓｔａｇｉｎｇ）および分類に際しての使用に関する。

及旦！すし艷 正常遺伝子（ＤＮＡ）は細胞の増殖、分化および生存に必要なタンパク質をコー ドする。細胞濁期の不適切な時点で正常タンパク質が過剰発現、変異または発現 すると正常細胞が癌細胞に変わることがある。正常遺伝子がこのように働くとき それらは発癌遺伝子と呼ばれる。

ｒａｓ遺伝子は広く様々な有核哺乳動物細胞中に存在し、そして正常な細胞機能 に関与している。ｒａｓ遺伝子の７７ミリーは２１．０００の分子量を有しｐ２ １と称される免疫学的に関連付けられる一連のタンパク質をコードする。哺乳動 物細胞中に存在するｒａｓ遺伝子はマウス肉腫ウィルス発癌遺伝子と同種である ことが実証されている（Ｗｅｉｎ−ｂｅｒｇ、　ａｔ　ａｌ、、米国特許第４． ５３５．０５８号：　Ｈａｒｖｅｙ（１９６４）、Ｎａｔｕｒｅ、　１０４　： １１０４　：　Ｋｉｒｓｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９６７）、Ｊ、Ｎ、Ｃ。

１、．３９　：　３１１）。ウィルスおよび細胞のｒａｓ遺伝子は膜結合タンパ ク質をコードしくＷｉｌｌｉｎｇｈａｍ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）、Ｃｅ １１．１９：　１００５）　、そして該タンパク質はグアニンヌクレオチドを結 合しく５ｃｏｌｎｉｃｋ、　ａｔ　ａｌ、　（１９７９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、 ７６　：　５３５５　：　Ｐａｐａｇｅｏｒｇｅ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８２） 、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４４：：５０９およびＦｉｎｅｋ、　ｅｔ　ａｌ、− （１９８４）、Ｃｅ１１．３７：　１５１）また固有のＧＴＰアーゼ活性を有す る（ＭｃＧｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、　３１０　 ：　６４４　：　Ｓｗｅｅｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、　３ １１＝２７３　；　Ｇｉｂｂｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　ＰＮＡＳ（υ５ Ａ）８１　：　５７０４　；およびＭａｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｐ ＮＡＳ　８２　：　３７Ｂ）。

受容体（レシピエンド）としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたＤＮＡ介在トランスフ ェクション実験により、Ｈａｒｖｅｙ　（ｒａｓ−Ｈ）およびＫｉｒｓｔｅｎ（ ｒａｓ−Ｈ）肉腫ウィルスのｒａｓ遺伝子と同種の活性化形質転換遺伝子群が確 認されるに到った。ｒａｓ−Ｎと指体されるｒａｓ群の第三のメンバーが確認さ れているが、レトロウィルスカウンターバートを有するかどうかは分っていない 。活性化ｒａｓ遺伝子はタンパク質の１２．１３または６１位にアミノ酸置換を 有し、それらの正常ホモログとは構造的に区別される（Ｔａｂｉｎ、　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、　３００　：　１４３　：　Ｒｅｄｄｙ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ、　３００　：１４９　；　Ｂｏｓ　ｅ ｔ　ａｌ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、　３１５　：　７１６　；およびＹｕａ ｓａｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０３　：　７７５〜７７９）。

Ｃｈｅｗ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ。

ＣＡ　１００（１）　：　１４２５ｎに引用されているＴａｐａｒｏｗｓｋｙ　 ｅｔ　ａｌ、。

Ｂａｎｂｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ、　１４　：　１２３〜１３３　（１９８３）は 、Ｈｒａｓ　ｐ２１のＮ末端から１２番目の残基がグリシンからバリンＩ；変わ るだけで正常遺伝子を形質転換遺伝子に変えるのに十分であることを教示してい る。Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　９９　（１９）　：１５３０９３６に引 用されているＳｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０４（５９ ２６）、　４９７−５００（１９８３）は、ｖ−ｋｉ−ｒａｓ遺伝子のヒト肺癌 セルラインｃａｌｕ−１ホモログのアミノ酸１２位にシスティン残基が存在して いることを教示している。Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ＣＡ、　９９　（ １９）　：　１５３０８０ｖに引用されているＦｕｓａｎｏ　ｅＬａｌ、、　Ｊ 、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｃｅｎａｔ、、　２（２）　：　１７３〜１８０（ １９８３）はＴ２４Ｈ−ｒａｓ−１遺伝子産生物がＨａｒｖｅｙ肉腫ウィルスに よりコードされるｖ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ２１形質転換タンパク質とほぼ同一である ことを教示している。活性化ｒａｓ形質転換遺伝子は、肉腫、神経芽細胞腫、黒 色腫および癌腫を含む新生物の１０〜２０％に認められている。ある種の形態の 白血病においては、活性化ｒａｓ遺伝子および対応するタンパク質は試験された 腫瘍の５０％以上において認められている。

これらの活性化ｒａｓ遺伝子および変異タンパク質は確立されたセルラインおよ び原発性および転移性腫瘍にも認められている。Ｇａｍｂｋｅ　ｅｔ　ａｌ、（ Ｎａｔｕｒｅ　３０７　：　４７６、１９８４）は急性骨髄芽球性白血病（ＡＭ Ｌ）患者からの骨髄細胞中に形質転換Ｎ−ｒａｓ遺伝子を実証した。これに対し 、同じ患者の神経芽細胞からのＤＮＡは形質転換性ではなかった。

１）２１　　ｒａｓタンパク質はその正常で活性化されていない形では、１２位 および１３位にグリシンというアミノ酸を、そして６１位にグルタミンというア ミノ酸を含んでいる。

正常細胞中に認められるｐ２１タンパク質は５〜１９位のアミノ酸残基に関し次 の一次アミノ酸構造を有している：Ｓリジン−ロイシン−バリン−バリン−バリ ン−クリシン−アラニン−グリシン−グリシン−バリン−グリシン−リジン−セ リン−アラニン−ロイシンＩＩこれまでの報告（Ｆｕｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、（１ ９８２）、　　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

４３：２９４）は、酵母および哺乳動物細胞における正常および活性化または発 癌性（変異）　ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に対し反応性のあるいくつかのラット モノクローナル抗体を記載しているｏ　Ｃａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　８３．　ｐｐ、　７４８５〜７４８９（１９８６）および １９８６年８月６日に公開されたＥＰＯ公開Ｎｏ、　０１９００３は、活性化ｒ ａｓタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を開示している。このモノ クローナル抗体は、１２位のグリシンに代えてバリンをコードする変異ｒａｓ２ Ｉ！伝子のアミノ酸に相当する合成ペプチドに対して作られた。Ｃｈｅｗ、　　 Ａｂｓｔｒａ−ｃｔｓ　１０４：１６６５７０６に引用されているＣａｒｎｅｙ 　ｅｔ　ａｌ、、　ＵＣＬＡＳｙｍｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、 　　Ｎｅｗ　Ｓｅｒ、　　１９８５はヒト癌腫に対し免疫反応性を示すｒａｓ関 連合成ペプチドに対して作られたモノクローナル抗体を開示している。Ｃａｒｎ ｅｙ　ｅｔａｌ、は１２位にグルタミン酸、アルギニンおよびバリンのアミノ酸 置換を含む合成ペプチドに対し作られた一連のモノクローナル抗体を報告した（ １９８７年７月７〜１１日にメリーランド州ＦｒｅｄｅｒｉｃｋのＨｏｏｄ　Ｃ ｏＣｏ１１ｅで開催された発癌遺伝子に関する第３回年余（Ｔｈｅ　３ｒｄ　Ａ ｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔ−４ｎｇ　ｏｎ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）からの抄録誌）。

様々な形態のｒａｓｐ２１タンパク質と反応させるべく様々な方法により作られ た他のモノクローナル抗体も報告されている。Ｈａｎｄｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　８１．　ｐｐ、５２ ２７〜５２３１　（１９３４）　；　Ｔｈｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　Ｖｏｌ、　３１１．　ｐｐ−５６２〜５６５（１９８４）　；　Ｗｏｎｇ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ。

４６、　ｐｐ、６０２９−６０３３　（１９８６）およびＴａｎａｋａ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　８２．　ｐｐ、３４００−３４ ０４（１９８５）。

いくつかの科学的報告は正常細胞が１３位にグリシンを有するｒａｓタンパク質 を含んでいることを示している。

１９８５年にＢｏｓ　ａｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ　３１５：　７２６１９８ ５）はＡＭＬ患者の細胞から単離されたＤＮＡがＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞を形質転 換できることを実証した。この結果は発癌遺伝子の存在について極めて示唆に富 んでいる。これらの形質転換遺伝子は活性化ｒａｓ遺伝子であることが判明した 。これに対し、正常組織からのＤＮＡは形質転換性がなく従って活性化Ｎ　ｒａ ｓを含んでいなかった。これらの研究者はオリゴヌクレオチドグローブを用いて 活性化Ｎ　ｒａｓ遺伝子に変異があったかどうかを分析し、そして活性化Ｎ　ｒ ａｓ遺伝子がタンパク質の１３位にアミノ酸置換を生じる変異を含んでいること を見出した。１３位におけるこれらの変異は正常アミノ酸であるグリシンに代わ るアスパラギン酸またはバリンのいずれかであることが判明した。

１９８７年の二つの報告は１３位にアルギニンを有するｒａｓ変異を記載してい る。Ｎ１ｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　　はヒト直腸癌腫から単離された活性化Ｎ　ｒ ａｓ　ｐ２１の１３位にグリシンからアルギニンへのアミノ酸置換が生じている ことを示した（Ｊｐｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、（Ｇａｎｎ）、　７８．２ １〜２６１９８７）。ＨｉｒａｉｅＬ　ａｌ、による報告（Ｎａｔｕｒｅ　３２ ７　：　４３０１９８７）は、を髄形成異常症候群患者からの骨髄細胞中に活性 化Ｎ　ｒａｓ遺伝子を示した。Ｈｉｒａｉ　　ｅｔ　ａｌ、　　によるこれらの 所見は、１３位が変異した活性化Ｎ　　ｒａｓ遺伝子の存在が白血病の初期段階 で重要かもしれないことを示唆している。

Ｅ、　Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、による報告（Ｎａｔｕｒｅ　３３０：　１８６．１ ９８７）は、を髄形成異常症候群患者のｒａｓ　ｐ２１の１３位にアスパラギン 酸変異が存在していることを該患者が急性白血病に進行する１、５年前に実証し た。従って骨髄芽細胞（ｍｙｅ−１ｏｐｌａｓｔｉｃ）症候群患者を本発明の主 題であるモノクローナル抗体を用いて１３位に変異を有する活性化ｒａｓタンパ ク質の存在を指標にスクリーニングすることはどの骨髄芽細胞症候群患者が急性 白血病に進む危険性が高いかを予測する価値ある試験となり得る。

最も最近では、Ｗｏｄｎａｒ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　　はヒト Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に活性化Ｎ　ｒａｓ遺伝子の存在を報告している（Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ、　ｐｐ、　４５７〜４６Ｌ　Ｖｏｌ、　１．、　Ｎｏ、４（１ ９８７））。これらの研究は１３位のグリシンがシスティンに置換されているこ とを実証した。

寄託についての陳述 １、　１３位にアスパラギン酸を含む活性化ｒａｓタンパク質に対し反応性があ るモノクローナル抗体を分泌することが判明しかつ本発明の対象であるハイブリ ドーマセルラインをブダペスト条約に従ってｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ 　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し た。

ハイブリドーマＤ７５３−１３（１２９）はＨＢ　９６３２と指称され、またハ イブリドーマＤ７６５−１３（１４６）はＨＢ　９６３３と指称され　ｊこ　。

２．１３位にバリンを含む活性化ｒａｓタンパク質に対し反応性があるモノクロ ーナル抗体を分泌することが判明しかつ本発明の主題であるハイブリドーマセル ラインをブダペスト条約に従ってｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。ハイブ リドーマＶ６４７−１３はＨＢ　９６３４と指称された。

本発明の主題は、１３位にアスパラギン酸またはバリンというアミノ酸を含む活 性化ｒａｓタンパク質と反応するモノクローナル抗体の誘導、産生および特徴付 けであり、またこれらのモノクローナル抗体は１３位にグリシンを含む正常ｒａ ｓタンパク質とは反応しない。本発明に記載の抗体は新生物の細胞中および前癌 状態の細胞中の活性化ｐ２１を検出するための価値ある診断ツールである。本発 明に記載の抗体は急性骨髄性白血病患者または白血病発現前症候群患者からの細 胞が１３位にアスパラギン酸またはバリンのいずれかを有する活性化ｒａｓ　ｐ ２１を有しているかどうかを決定するための価値あるツールである。

Ｂａ１ｂ／ｃＸＣ５７ＢＱ／６マウスをペプチドｌまたはペプチド２と指称され る合成ペプチドで数回免疫した。ペプチドｌは１３位にアスパラギン酸を有する 活性化ｐ２１のアミノ酸構造を有しているのに対し、ペプチド２は１３位にバリ ンを有する活性化ｐ２１のアミノ酸構造を有している。

ペプチドｌおよび２はいずれもペプチドのアミノ末端にシスティンというアミノ 酸を用いて合成した。システィンというアミノ酸はｒａｓタンパク質の５位を占 めるリジンの直前の位置を占めるものではないが、担体タンパク質へのペプチド の結合（カップリング）を容易にするためにシスティンを加えた。しかしながら システィンを介しての結合は手順が複雑になり過ぎるので用いなかった。

システィンは合成された断片から除去しなかったが、目的の抗体または抗体断片 を分泌する適切なハイブリドーマセルラインの同定の妨げとはならなかった。ペ プチドｌは次の構造を有するニジスティン−リジン−ロイシン−バリン−バリン −バリン−グリシン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン−グリシン −リジン−セリン−アラニン−ロイシン。ペプチド２は次の構造を有するニジス ティン−リジン−ロイシン−バリン−バリン−／＜リンーグリシンーアラニンー グリシンーバリンーバリンーグリシンーリジンーセリンーアラニンーロイシペプ チドｌおよび２をゲルタールアルデヒドを用いて担体タンパク質である牛甲状腺 グロブリン（ＢＴＧ）またはスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させそ してマウスに接種した。ＢＴＧまたはＫＬＨに結合したペプチドｌまたは２で免 疫されたマウスからの牌細胞をＳｐ２／　０マウス黒色腫細胞と融合させ、そし て２週間後に７１イブリドーマからの培養上清を酵素結合イムノソルベントアッ セイ（ＥＬＩＳＡ）により検索した。免疫ペプチド１（１３位にアスパラギン酸 を含む）に対する反応性を有していることから、またペプチド２（１３位にバリ ンを有する）またはペプチド３と指称される第３のペプチドに対する反応性を欠 いていることから０７５３−１３（１２９）およびＤ７６５−１３（１４６）と 指称されるハイブリドーマを選抜した。ペプチド３は１３位がアスパラギン酸ま たはバリンで置換されているのではなく１３位に正常アミノ酸であるグリシンを 有している点でペプチド１および２と相違した。ペプチド３の構造はシスティン −１リジン−ロイシン−バリン−バリン−バリン−グリシン−アラニン−グリシ ン−グリシン−バリン−グリシン−リジン−セリン−アラニン−ロイシン１１で ある。ペプチド２（１３位にバリンを含む）に対する反応性を有していることか ら、またペプチド１　（１３位にアスパラギン酸を含む）およびペプチド３（１ ３位にグリシンを含む）に対する反応性を欠いていることからＶ６４７−１３と 指称されるハイブリドーマを選抜した。

発明の詳細な記述 Ｂａ１ｂ／ｃｘＣ５７ＢＬ／６マウスをＡＳＰ／ＫＬＨと指称される免疫原で免 疫した。この免疫原は担体タンパク質であるスカシガイのヘモシアニンに結合さ れたペプチド１（１３位にアスパラギン酸置換を含む）から成るものであった。

ペプチドの免疫原性を高めるためにそのペプチドをマウスへの注射に先立ち、担 体タンパク質に結合した。ＡＳＰ／ＫＬＨの初回接種は７０インドの完全アジュ バント中で１日目に行い、その後の免疫原５００μ９の接種は融合まで２週問お きに行った。融合の３日前にＤ７５３−１３が由来するマウス＃４３４１および Ｄ７６５−１３が由来するマウス＃４３５５に対し適切な免疫原であるＡＳＰ／ 　ＫＬＨ免疫原を腹腔内に追加免疫した。

Ｂａ　ｌ　ｂ／　ｃ　ｘ　Ｃ５７ＢＬ／　６　マウスをＶａｌ／ＫＬＨと指称さ れる免疫原で免疫した。これはＫＬＨ担体タンパク質に結合した（１３位にバリ ンというアミノ酸を含む）ペプチド２より構成した。前述のマウスと同様、初回 接種は７０インドの完全アジュバントと混合された免疫原で行い、そして免疫原 ５００μｇの以後の接種は融合まで２週問おきに行った。融合の３日前にマウス にＶａｌ／ＫＬＨ免疫厚を腹腔内に追加免疫した。

ハイブリドーマ作製方法 腹腔内追加免疫の３日後に適切な免疫マウスの肺臓を取り出しそして非分泌型骨 髄腫細胞５ｐ２１０と融合させた。

牌細胞懸濁液を無血清ＤＭＥＭ−高グルコース培地中で調製しそして骨髄腫細胞 と４：ｌの比で混合した。この細胞混合物を室温、１２００ｇで１０分間遠心分 離した。上清除去後、チューブを軽くタッピングして細胞を再懸濁した。

３７６で３０秒間にわたって１．０＋ｆｆの４５％Ｖ／Ｖポリエチレングリコー ル３３５０（Ｂａｋｅｒ）を添加することにより融合手順を開始した。

これらの細胞をピペット先端を用いて時々９０秒間混合しそして５ｍ（１の無血 清ＤＭＥＭ−高グルコース培地を３分間にわたって添加した。その後、１０％牛 脂児血清、Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを 補給した１４１１Ｉ２のＤＭＥＭ−高グルコース（以下ＨＡＴ培地と記す）を添 加した。ＨＡＴ培地は１分間にわたって添加した。

適烏な容量のＨＡＴ培地を細胞に添加し、次いでそれらの細胞を室温、８００Ｘ ９で７分間遠心分離した。上清を吸引しそして細胞ベレットを１０ｍ（２のＨＡ Ｔ培地で解きほぐした（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）。Ｂａ１ｂ／　ｃ　Ｘ　Ｃ５７Ｂ Ｌ／　６よりの腹腔細胞を添加しそして最終容量を、各ウェルに２００．０００ 個の牌細胞が分注されるように調節した。約１４日後にハイブリドーマコロニー を含むウェルからの組織培養上清を担体タンパク質に接合されたペプチドに対す る目的とする反応性の有無についてＥＬＩＳＡにより試験した。

スクリーニング手順およびＥＬＩＳＡプロトコールスクリーニングを行うべく、 ペプチドｌをＢＴＧ担体タンパク質に接合しまたペプチド２をＫＬＨ担体タンパ ク質に結合した。免疫およびスクリーニングのためにペプチドを異なる担体タン パク質に結合したのは担体タンパク質に対して反応性のある抗体の選択を避ける ためであった。ペプチド１　（ＡＳＰ−ＫＬＨ）で免疫したマウスの場合には、 得られるハイブリドーマ培養液をＢＴＧに結合したペプチド１，２および３を用 いてスクリーニングした。ハイブリドーマ上清のスクリーニングに先立ち、５０ ０ｎｇのペプチドのペプチド・担体接合体を９６ウエルマイクロタイタープレー トに分注し３７″で一夜インキユペートした。インキュベーション後、プレート を洗浄し、そしてグレート上の未結合部位を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロ ックした。

ハイブリドーマ上溝をスクリーニングする際に、５０マイクロリツトル（μａ） の液体をペプチド・担体接合物を含むウェルに添加した。液体を４″で一夜イン キユベートした。翌日、ハイブリドーマ上清を除きそしてウェルをＢＳＡ溶液で 洗浄した。次いで各ウェルに、ＢＳＡホスフェート緩衝食塩水ＣＰＢＳ）で希釈 した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＧＡＭＨＲＰ）に接合したヤギ抗−マウスＩ ｇＧ抗体５０μｇを添加した。ウェルを３７″で６０分間インキュベートした。

インキュベージ胃ン後、ＧＡＭＨＲＰを除去し、そしてウェルをＰＢＳ−ＢＳＡ 混合物で３回洗浄した。結合ＧＡＭＨＲＰの存在を、０．１５％過酸化水素含有 ホスフェート緩衝液中の基質０−７二二レンジアミン（ＯＰＤ）を５０μａ添加 することにより測定し！；。ＨＲＰとその基質（ＯＰＤ）の組合せにより黄色生 成物が生じる。黄色生成物の発生は室温で１５分間行わせた。

その酵素反応を５０μｇの４．５Ｍ硫酸の添加により停止させた。得られた反応 生成物の測定は４８８ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより行っ た。ウェル内における黄色の存在は、問題とする抗体がハイブリドーマ上溝中に 存在することを示した。培養液中に存在する抗体が多い程光学密度は高くなる。

問題とするペプチドに対するモノクローナル抗体の特異次の一連の実験において は、ペプチド！、２および３に対するＭａｂの特異性を該ペプチドを担体タンパ ク質に結合することなく試験した。第１表は担体タンパク質に結合されていない ペプチドに対するいくつかのモノクローナル抗体の反応性をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に より試験した結果をまとめたものである。結果は、１３位にアスパラギン酸を含 むペプチドｌに対して作製された抗体がペプチドｌに対してのみ反応性があり、 １３位にバリン、１３位にグリシンヲ含むペプチド２またはペプチド３に対して は反応性がないことを実証している。更に結果は、１３位バリンに対して作製さ れた抗体がそのようなペプチドに対してのみ反応性があり、１３位にそれぞれア スパラギン酸およびグリシンを含むベシチドｌおよび３に対しては反応性がない ことを実証している。

第１表 問題とするペプチドに対するモノクローナル抗体の特異性（数値は光学密度を示 す） ハイブリッド　　　ペプチドｌ　　ペプチド２　　ペプチド３Ｄ７５３−１３　 　　　　　１．８　　　　　０　　　　　　　０Ｄ７６５−１３　　　　　　１ ．２　　　　　０　　　　　　　０Ｖ６４７−１３　　　　　　０．０　　　　 　２．４　　　　　　０活性化ｒａｓ　ｐ２１に対する抗−ペプチドＭａｂの反 応性正常および活性化細胞性ｐ２１に対するＤ７５３−１３およびＤ７６５−１ ３の反応性を試験した。これらの実験を行うために１３位のグリシンをアスパラ ギン酸で置換する活性化Ｎ　　ｒａｓ遺伝子を含むセルラインを選択した。対照 用セルラインとして１３位にグリシンを有するセルラインを選択した。ウェスタ ーンプロット法を行って、１３位にアスパラギン酸を含むペプチド１に対して作 製されたＭａｂが活性化細胞性ｐ２１に対し反応性があるかどうかを測定した。

活性化または正常ｐ２１を含む細胞の非放射性抽出物を１２．５％ポリアクリル アミドゲルにかけた。ゲルに電流を流すことにより細胞性タンパク質を分子量に 従って分離した。この電気泳動法の後、タンパク質を電気泳動的にニトロセルロ ース膜に移した。その膜を５％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした後、それらをｒ ａｓ　　１０と指体される抗−ｐ２１　　Ｍａｂまたはペプチドｌに対し反応性 のある抗体を含む腹水液と共に１時間インキュベートした。この実験の目的は、 抗−ペプチドｌ　Ｍａｂが１３位にアスパラギン酸を有する活性化細胞性タンパ ク質に対して反応性があるかどうかをみるためであった。ｒａｓ　１０または抗 −ペプチド特異Ｍａｂと共にインキュベーションした後、膜をＰＢＳ−ＮＰ−４ ０で３回洗浄した。次いで膜をＨＲＰに結合した抗−マウス免疫グロブリンと共 にインキュベートしてマウス抗体を検出した。次に膜をＰＢＳ−ＮＰ−４０で３ 回洗浄し、モして４−クロロ−１−ナフトール基質と共にインキュベートして反 応を完結させた。

我々の得た結果により、１３位にアスパラギン酸を有するペプチドに対して作製 されたＭａｂは１３位にアスパラギン酸を含む活性化ｐ２１とは反応性があるが 正常ｐ２１また（ｊ他のアミノ酸置換により活性化されたｐ２１とは反応性がな いことが実証された。これらの結果は、単一のアミノ酸置換に対して作製された Ｍａｂが活性化タンパク質全体を検出し得ることを実証するものである。

国際調査報告 暴−ｍｖ＋ｖＩｍ１１Ｍ−＾紳１雪−＝＋−−ｓ−−ＰＣＴ／υ５Ｂ９１００３ ６９

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．１３位にアスパラギン酸を含む発癌性ｒａｓタンパク質上のエピトープに特 異的に結合するが１３位にグリシンを含む正常、非発癌性ｒａｓタンパク質のエ ピトープとは結合しないモノクローナル抗体。
2. ２．１３位にバリンを含む発癌性ｒａｓタンパク質上のエピトープに特異的に結 合するが１３位にグリシンを含む正常、非発癌性ｒａｓタンパク質のエピトープ とは結合しないモノクローナル抗体。
3. ３．請求項１記載の抗体の免疫反応性断片。
4. ４．請求項２記載の抗体の免疫反応性断片。
5. ５．請求項１記載のモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ。
6. ６．請求項２記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
7. ７．Ｄ７５３−１３、Ｄ７６５−１３およびＶ６４７−１３と指称されるハイブ リドーマ。
8. ８．動物から得た組繊または液を請求項１記載のモノクローナル抗体と接触させ そして抗体結合が生じたかどうかを測定することにより該組繊または液に１３位 にアスパラギン酸を含む発癌性ｒａｓタンパク質が存在するかどうか試験するこ とより成る動物における原発性または転移性癌または新生物発生前病変（ｐｒｅ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の検出方法。
9. ９．動物から得た組繊または液を請求項２記載のモノクローナル抗体と接触させ そして抗体結合が生じたかどうかを測定することにより該組繊または液に１３位 にバリンを含む発癌性ｒａｓタンパク質が存在するかどうかを試験することによ り成る動物における原発性または転移性癌、または新生物発生前病変の検出方法 。