JP2016065008A - 抗変異型プロテインs抗体、該抗体を含む診断用組成物、変異型ヒトプロテインsの検出方法および該抗体を含むキット - Google Patents
抗変異型プロテインs抗体、該抗体を含む診断用組成物、変異型ヒトプロテインsの検出方法および該抗体を含むキット Download PDFInfo
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Abstract
Description
特に抗凝固タンパク質を代表するプロテインC、プロテインSおよびアンチトロンビンIIIの遺伝的欠陥は、静脈血栓症患者において高い割合で存在し、血栓症の素因の60%超は遺伝的要因である(非特許文献1、特許文献5)。
プロテインSの量的欠損を検出するには、ヒトプロテインSを特異的に認識するモノクローナル抗体およびC4bpとプロテインSとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体(特許文献1および6)、C4b結合タンパク質とプロテインSとの結合を阻害する抗C4bp抗体(特許文献2)、遊離型とC4bp結合型とのヒトプロテインSを2価金属イオンの存在下においてのみ認識する、いわゆる立体構造特異的モノクローナル抗体(特許文献3)、遊離型プロテインSに特異的なモノクローナル抗体(特許文献4)、プロテインSのC4bpとの結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体(特許文献7および8ならびに非特許文献2)等の抗体を使用して、血中の結合型/遊離型プロテインS濃度の測定を行う。
また、市販のキット(STA試薬シリーズ プロテインS(クロット)、ロシュ・ダイアグノスティックス(株))等を使用する活性化プロテインCの抗凝固活性を促進するコファクター活性測定または遺伝子検査によってもプロテインSの質的異常を検出することができる。
CKNGFVMLSNK(配列番号3)は、好ましくは、配列番号1で表される野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列に含まれる。
本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、少なくともK196Eの変異を有する変異型ヒトプロテインSに特異的である。
本発明の抗体またはその断片は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
本発明の免疫学的診断用組成物は、好ましくは血栓塞栓症、例えば静脈血栓塞栓症を診断するためのものである。
本発明の検出方法は、変異型ヒトプロテインSを、免疫比濁法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも1つの免疫学的測定法により検出する工程をさらに含むことが好ましい。
また、プロテインSのK196E変異の検出には、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)を指標にするプロテインSのコファクター活性の測定が困難なため(非特許文献3)、例えば、GeneChips、Taqman対立遺伝子識別法、パイロシーケンス法等の遺伝子検査を行うことも考えられるが、本発明にかかる手法によれば、プロテインSのK196E変異をはるかに低コストで、正確かつ簡便に検出することができる。
本発明によって、プロテインSの活性が低下し、血栓症のリスクが高まる例えば妊婦等に対し、血栓症のリスク判断のための診断薬として用いることが可能になる。
本発明における「プロテインS」(PS)またはPROS1タンパク質は、ヒト由来のあらゆるPS遺伝子、cDNAもしくはRNAの産物、またはPSタンパク質が含まれ、例えば配列番号1で表されるアミノ酸配列やGenBankアクセッション番号AAH15801に開示されたアミノ酸配列等からなり、本明細書中「ヒトプロテインS」、または単に「プロテインS」とも記す。野生型のヒトプロテインSの代表的なアミノ酸配列を配列番号1に示すが、本発明においては、配列番号1のアミノ酸配列の196番目に相当するアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されたもののみを「変異型ヒトプロテインS」と定義する。この変異を有さなければ、これ以外のアミノ酸1個または複数個の欠失、置換および/または付加の変異を有していても、「野生型ヒトプロテインS」と定義する。この野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の配列同一性を有する。
本発明は、一態様において、抗原として、CKNGFVMLSNK(配列番号3)に対するよりも、CKNGFVMLSNE(配列番号2)に対して、例えばELISAにより測定した抗体の結合定数等を指標として、有意に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供するものである。すなわち、本発明の抗体またはその抗原結合断片(単に「その断片」とも記す)は、配列番号2のアミノ酸配列を有するペプチドには特異的であって、かつ配列番号3のアミノ酸配列を有するペプチドには有意に結合しないともいえ、好ましくは配列番号2のペプチドと配列番号3のペプチドとに対し交差反応するものではない。
本発明の抗体は、その由来として、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳動物(マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ヒト等)または鳥類(ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、アヒル等)などが挙げられる。
ヒトプロテインSは、野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列において435〜468番目の領域でC4bpと結合するので(特許文献4)、本発明の抗体またはその断片は、遊離型のプロテインSのみならず、プロテインS−C4bp複合体における結合型のプロテインSにも結合することができる。
本発明の抗体の作製方法としては、例えば、CKNGFVMLSNE(配列番号2)からなるペプチドを免疫原(抗原)として用いてマウス、好ましくは胚中心B細胞に核内タンパク質GANPを高発現するトランスジェニックマウス(GANP(登録商標)マウス)等の前記哺乳動物または前記鳥類に免疫し、この動物の脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合して得られたハイブリドーマが産生する抗体をスクリーニングするとともに、特定の抗体を産生するハイブリドーマのクローニングを行う従来の方法等が挙げられる。具体例としての詳細は本実施例を参照。
ただし、合成ペプチドを免疫原とするこのような場合、そのままでは免疫原として認識されづらいため、その合成ペプチドのN末端またはC末端にシステインをあえて加え、そのシステインを介して、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等の抗原性刺激のあるキャリアタンパク質と合成ペプチドとを結合させることがある。
当業者は通常、免疫抗原としての合成ペプチド内に、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を含まないように選択するが、本発明は、あえてシステイン残基を含む配列をエピトープとする抗体を作製することで、抗原として認識されやすい抗体を作製することに成功した。
また、本発明は、別の一態様において、本発明の抗体またはその断片を含む、免疫学的診断用組成物を提供するものであり、該組成物は、好ましくは血栓塞栓症、より好ましくは静脈血栓塞栓症、例えば、エコノミークラス症候群やロングフライト血栓症とも呼ばれる肺血栓塞栓症および深部静脈血栓症等の遺伝的素因があるか否かを判定するために使用するものである。
本発明の免疫学的診断用組成物には、本発明の抗体および/またはその断片の他に、例えば、緩衝液等を含んでもよい。
また、本発明の免疫学的診断用組成物の調製方法としては、例えば、本発明の抗体またはその断片の製造方法に準じ、本発明の抗体またはその断片が失活しなければ、従来公知の任意の方法を用いることができる。
さらに、本発明は、他の一態様において、配列番号1で示されるアミノ酸配列の196番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインSを試料から検出する方法を提供するものであって、該方法は、
前記試料を、本発明の抗体またはその断片と接触させる工程
を含み、好ましくは、
変異型ヒトプロテインSを、従来公知の免疫比濁法(TIA)、ラテックス凝集(LPIA)法、イムノクロマト法(IC)および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも1つの免疫学的測定法により検出する工程
をさらに含むものである。
ELISAの原理を利用する固相免疫法としては、抗体への標識物質の種類により、例えば、放射性同位元素を標識するRIA、ユーロピウム等の蛍光発光物質を標識する蛍光免疫測定法(FIA)、ルミノール等の化学発光物質を標識する化学発光免疫測定法(CLIA)、ペルオキシダーゼ等の酵素を標識する酵素免疫測定法(EIA)等が挙げられる。
さらにまた、本発明は、さらに他の一態様において、本発明の抗体および/またはその断片ならびに免疫学的診断用組成物を夫々含む、配列番号1で示されるアミノ酸配列の196番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインSを検出するための検出用キットおよび診断用キットを提供するものである。
これらのキットには、例えば、緩衝液、抗体への標識物質、二次抗体、シグナルを検出するための検出用試薬、またはキットの使用説明書等がさらに含まれていてもよい。
[実施例1]抗体の作製
配列番号2で示されるCKNGFVMLSNEのペプチドを免疫原として免疫したマウスから得られたマウス血清に含まれる抗体の希釈系列と、固相化抗原として夫々、配列番号2のペプチド、配列番号3のペプチド、KLHを結合した配列番号2のペプチドおよびKLHのみとの抗体抗原反応をELISAにより確認した。その結果を図1に示す。なお、二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG(γ)抗体を、HRPの基質としてオルトフェニレンジアミンを用いた。
次に、以下の常法に従って、前記の免疫したマウスからハイブリドーマを作製し、配列番号3のCKNGFVMLSNKペプチドに対するより、配列番号2のペプチドに対して有意に結合するか否かを指標に、所望のモノクローナル抗ペプチド抗体のスクリーニングおよび抗体産生細胞のクローニングを行った。最終的に本発明では3種類のモノクローナル抗体(4B1、15C8、16E3)を得ることに成功した。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ケーラーとミルシュタインの方法(Koehler & Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975))に準じて得ることができる。すなわち、配列番号2の合成ペプチドのシステイン残基にKLHを結合させたものを用いてマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と融合させる。得られたハイブリドーマをマイクロタイタープレートにまき込んで、抗体のスクリーニングと抗体産生細胞のクローニングを行い、このハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取した。
採取したハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で半永久的に保存することができる。所望のモノクローナル抗体は、インビトロにおける培養法により大量調製することができる。インビトロ培養法は、ハイブリドーマを適当な血清培地若しくは無血清培地中で培養することにより実施でき、所望のモノクローナル抗体は培地中に産生される。この培養法によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。
本実験においては、前記「マウス」として、GANP(登録商標)マウスを使用した。
固相化抗原として、配列番号1で表される野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列における42〜676番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインS(0.8mg/ml)と、配列番号1で表される野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列において196番目のリジン残基(K)がグルタミン酸残基(E)に変異した場合の42〜676番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインS(1.0mg/ml)の夫々に対し、実施例1で得られた3種のモノクローナル抗体(4B1、15C8、16E3)との抗体抗原反応をELISAにより確認した。
洗浄バッファー(PBS−0.05%Tween20)にてウェルを3回洗浄後、ブロッキングバッファー(0.5%ゼラチンPBS−0.05%Tween20)を200μl/ウェル添加し、4℃で終夜(約16時間)静置した。
洗浄バッファーにてウェルを3回洗浄後、抗体希釈液(0.05%ゼラチンPBS−0.05%Tween20)で希釈した抗ヒトプロテインS−K196Eモノクローナル抗体(2μg/ml)を50μl/ウェル添加し、室温で1時間静置した。
洗浄バッファーにてウェルを3回洗浄後、TMB(KPL社、SureBlue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate)を100μl/ウェル添加し、室温で10分間静置した。反応停止液(1NのHCl)を100μl/ウェル添加し、Thermo Labsystems Multiskan Ascent(サーモバイオアナリシスジャパン社)を使用して吸光度を450/650nmで夫々の試料について3回測定した。その結果を図2と表1に示す。
また、プロテインS(42-676)は、当該分野において公知の方法に従い調製した。
実施例2において、固相化抗原として、野生型プロテインS(42-676)の代わりに、配列番号1で表される野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列における117〜283番目の配列からなる遺伝子組み換え体の野生型ヒトプロテインS(9mg/ml)を、変異型プロテインS(42-676)の代わりに、配列番号1で表されるヒトプロテインSのアミノ酸配列において196番目のリジン残基(K)がグルタミン酸残基(E)に変異した場合の117〜283番目の配列からなる遺伝子組み換え体のヒトプロテインS(5.3mg/ml)を用いた以外は、実施例2と同様にしてELISA測定を行った。その結果を図3と表2に示す。
また、プロテインS(117-283)は、当該分野において公知の方法に従い調製した。
通常の方法によりウェスタンブロットを行い、実施例2および実施例3の夫々において調製した遺伝子組み換え体のヒトプロテインSと実施例1で得られたモノクローナル抗体(15C8)との結合を検出した。
分子量マーカーとして、プレシジョンPlusプロテイン2色スタンダード(BIO-RAD社、製品番号161-0374)を使用した。ゲルとして、スーパーセップエース10−20%ゲル(Wako社、製品番号198-15041)を使用した。メンブレンとして、Immun-Blot PVDFメンブレン(BIO-RAD社)を使用した。ブロッキングには5%スキムミルクを使用した。二次抗体として、anti−mouse−IgG−HRP(KPL社、製品番号074-1806)を使用し、一次抗体および二次抗体夫々の反応の際は室温で1時間静置した。発色には、immobilon western Chemiluminescent HRP Substrate(ミリポア社)を使用した。画像解析には、LAS-3000を使用した。得られた結果を図4に示す。
野生型プロテインSおよび変異型プロテインSを夫々含むヒト血漿サンプルをウェルに添加し、室温で静置した。
コーティングバッファー(50mM 炭酸/炭酸水素バッファー、pH9.6)を、0.159gのNa2CO3および0.293gのNaHCO3を100mlの水に溶解させて調製した。このコーティングバッファーを用いて希釈した10μg/mlのPolyclonal Rabbit Anti-Human Protein S(DAKO社、製品番号A0348)を100μl/ウェル添加し、4℃で終夜(約16時間)静置した。洗浄バッファー(TBS−0.1%Tween20)にて3回洗浄後、ブロッキングバッファー(1%BSA−TBS)を200μl/ウェル添加し、室温で2時間静置した。さらに洗浄バッファーにて3回洗浄後、試料希釈液(TBS)で希釈した試料(ヒト血漿1/20)を100μl/ウェル添加し、室温で2時間静置した。洗浄バッファーにて3回洗浄後、HRP標識抗ヒトプロテインS−K196Eモノクローナル抗体(15C8)を抗体希釈液(1%BSA−TBS−0.1%Tween20)で5μg/mlに希釈し、100μl/ウェル添加し、室温で1時間静置した。洗浄バッファーにて5回洗浄後、TMBを100μl/ウェル添加し、室温で10分間静置した。反応停止液(1N HCl)を100μl/ウェル添加し、吸光度450/650nmで測定した。その結果を図5と表3に示す。なお、HRPはPeroxidase Labeling Kit NH2(Dojindo社)を用いて標識した。また、10×TBS(pH7.4)は6.06gのTrisおよび5.8gのNaClを100mlの水に溶解させて調製した。
実施例2および3のELISAの結果から、実施例1で得られた3種類のモノクローナル抗体(4B1、15C8、16E3)のいずれも、K196Eの変異を有するヒトプロテインSの遺伝子組み換え体と有意に結合することがわかった。
実施例4のウェスタンブロットの結果(図4)から、実施例1で得られたモノクローナル抗体15C8は、ヒトプロテインSの全長(42-676)およびEGF様ドメイン(117-283)のいずれにも同じように結合することがわかった。また、同結果から、モノクローナル抗体15C8が、K196E変異を有するヒトプロテインSのEGF様ドメイン(117-283)を標的とすることも確認することができた。
図4において、ヒトプロテインSの全長(42-676)およびEGF様ドメイン(117-283)の各バンドのシグナル強弱が、SDS−PAGEに供した各タンパク質のモル数に差があること(ただし、SDS−PAGEにロードした各タンパク質の重量は等しい)、分子量の大きいタンパク質ほどブロッティング効率が低くなる傾向にあること等が原因であることを本発明者らは突きとめている。
さらに、プロテインSの変異を検出する従来法(特許文献7および非特許文献2)は、試料中の総プロテインSのタンパク質量および試料中の総プロテインSの活性値を別々に測定し、比活性を求めること等を特徴とするが、本発明においてはプロテインSの変異を検出するためにプロテインSの活性値の測定は不要であることから、簡便にプロテインSの変異を検出することが可能である。
Claims (11)
- 抗原として、CKNGFVMLSNK(配列番号3)に対するよりも、CKNGFVMLSNE(配列番号2)に対して有意に結合する抗体またはその抗原結合断片。
- CKNGFVMLSNK(配列番号3)が、配列番号1で表される野生型ヒトプロテインSのアミノ酸配列に含まれる、請求項1に記載の抗体またはその断片。
- 少なくともK196Eの変異を有する変異型ヒトプロテインSに特異的である、請求項2に記載の抗体またはその断片。
- モノクローナル抗体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、免疫学的診断用組成物。
- 血栓塞栓症を診断するための、請求項5に記載の組成物。
- 血栓塞栓症が、静脈血栓塞栓症である、請求項6に記載の組成物。
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の196番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインSを試料から検出する方法であって、前記試料を、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と接触させる工程を含む、前記方法。
- 変異型ヒトプロテインSを、免疫比濁法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法および固相免疫法からなる群から選択される少なくとも1つの免疫学的測定法により検出する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、配列番号1で示されるアミノ酸配列の196番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインSを検出するための検出用キット。
- 請求項5〜7のいずれか一項に記載の組成物を含む、配列番号1で示されるアミノ酸配列の196番目のリジン(K)がグルタミン酸(E)に変異した非同義変異を少なくとも有する変異型ヒトプロテインSを検出するための診断用キット。
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