JPWO2011034128A1 - コラーゲンネオエピトープ抗体 - Google Patents
コラーゲンネオエピトープ抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2011034128A1 JPWO2011034128A1 JP2011531960A JP2011531960A JPWO2011034128A1 JP WO2011034128 A1 JPWO2011034128 A1 JP WO2011034128A1 JP 2011531960 A JP2011531960 A JP 2011531960A JP 2011531960 A JP2011531960 A JP 2011531960A JP WO2011034128 A1 JPWO2011034128 A1 JP WO2011034128A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- monoclonal antibody
- collagen
- neoepitope
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 47
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 34
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 23
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 3
- 101000645291 Bos taurus Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 229940122097 Collagenase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 abstract description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 44
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 10
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 9
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 9
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940124761 MMP inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000577887 Homo sapiens Collagenase 3 Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 4
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000008355 cartilage degradation Effects 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 102000054350 human CHI3L1 Human genes 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 2
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 2
- 101710118230 Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 102100029136 Collagen alpha-1(II) chain Human genes 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241001522296 Erithacus rubecula Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000771163 Homo sapiens Collagen alpha-1(II) chain Proteins 0.000 description 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000004079 Prolyl Hydroxylases Human genes 0.000 description 1
- 108010043005 Prolyl Hydroxylases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003846 cartilage breakdown Effects 0.000 description 1
- 230000008414 cartilage metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- GUAQVFRUPZBRJQ-UHFFFAOYSA-N n-(3-aminopropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCCCN GUAQVFRUPZBRJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(1)コラーゲンネオエピトープ断片に特異的に結合し、配列番号20で示されるアミノ酸配列の962位から975位に結合する抗体であって、当該エピトープに含まれるプロリンが非水酸化体の場合における結合親和性と、水酸化体の場合における結合親和性が実質的に同一であるモノクローナル抗体、
(2)前記(1)記載のプロリンが、配列番号20で示されるアミノ酸配列における971位のプロリンである前記(1)に記載のモノクローナル抗体、
(3)エピトープが配列番号20で示されるアミノ酸配列の957位から975位の領域に存在する、前記(1)に記載のモノクローナル抗体、
(4)前記(2)に記載の抗体であって、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体の免疫反応が阻害されるように、配列番号14、17又は18で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを競合させるイムノアッセイにおいて、該免疫反応の50%阻害濃度がいずれのペプチドにおいても0.04μM以下である抗体、
(5)1)相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域;KYGIN(配列番号5)、WINTYSGMTT YADDFKG(配列番号6)、およびSLGYDYGGFAY(配列番号7)、並びに2)相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;RSGQTLVHDNENTYFH(配列番号8)、KISNRFS(配列番号9)、およびSQNTHVPFT(配列番号10)を有するモノクローナル抗体、
(6)1)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および 2)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域;を有するモノクローナル抗体、
(7)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体であってラベルされたモノクローナル抗体、
(8)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ、
(9)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いたコラーゲンネオエピトープ断片の含有量の測定方法、
(10)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて測定したコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を指標とする、コラゲナーゼ活性の測定方法、
(11)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて測定したコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を指標とする、コラゲナーゼ阻害剤のスクリーニング方法、
(12)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて生体試料に含まれるコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を測定する工程を含む、コラゲナーゼが関与する疾患の患者の選別方法、
(13)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むキット、
(14)前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて生体試料に含まれるコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を測定する工程を含む、コラゲナーゼが関与する疾患の診断方法、および
(15)コラゲナーゼが関与する疾患の診断に使用するための前記(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
に関する。
線維性コラーゲンであるI型、II型およびIII型コラーゲンは3本のペプチド鎖がらせん状に撚り合わさって構成されており、コラゲナーゼ(例えば、MMP−1、MMP−8、およびMMP−13)は、これらの線維性コラーゲン3重鎖を未変性の状態でN末から3:1の位置(975−976アミノ酸残基間)で切断する。そしてN末側4分の3断片のC末端およびC末側4分の1断片のN末端が新たに生じる末端構造を「ネオエピトープ」という(図1)。また、切断により生じたコラゲナーゼ断片を「コラーゲンネオエピトープ断片」という。中でも、ヒトII型コラーゲン(Accession No.NP_001835)のC末端側のネオエピトープ部分(969−975位に該当;以下、C末端ネオエピトープともいう)の7アミノ酸残基 Gly−Pro−Pro−Gly−Pro−Gln−Gly(配列番号1)はヒトからマウスまで動物種間で保存されていることが知られている。また、コラーゲンは高いヒドロキシプロリン含有率で特徴付けられるタンパク質の一つであり、この配列のC末側から5番目(もしくは、N末側から971番目)のプロリン残基も多くの場合に水酸化体(以下、ヒドロキシ体もしくはヒドロキシプロリンともいう)となっており、(配列番号2、Gly−Pro−Hyp−Gly−Pro−Gln−Gly、Hypは水酸化プロリン)その割合はコラーゲン合成時の健康状態や栄養状態による影響を受けやすく一定ではないことから、コラーゲンネオエピトープ断片の正確な定量を妨害していると考えられる。したがって、コラーゲンの分解を免疫学的に測定する場合であれば、ネオエピトープを検出する抗体の特性としては水酸化体と非水酸化体(プロリン)を同程度に免疫特異的に認識できることが本来は望ましい。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー(DEAEまたはDE52等)、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインAカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
II イムノアッセイ
I型コラーゲン特異的配列:Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Ala(配列番号11)
II型コラーゲン特異的配列:Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser(配列番号12)
III型コラーゲン特異的:Gly-Glu-Lys-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln (配列番号13)
III 有用性
(1)抗原の免疫:
Gly−Pro−Hyp−Gly−Pro−Gln−Gly(配列番号:2)に示すヒドロキシプロリンを含むネオエピトープペプチドを合成した(Greiner Bio-one社製)。合成ネオエピトープペプチド10mgを1mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、10mgのgiant keyhole limpetsヘモシアニン(マレイミド化KLH、PIERCE社製)を1mlの精製水に溶解したものとを混合し、室温にて4時間、さらに4℃で一晩反応させた。上記の混合液を蒸留水に対して透析後に、凍結乾燥し、ネオエピトープペプチド‐KLH複合体 13mgを得た。
このペプチド‐KLH複合体0.1mgをフロイント完全アジュバントと共に4週令A/J Jms Slc雌マウス7匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、21日後、42日後および63日後にペプチド‐KLH複合体0.1mgをフロイント不完全アジュバントと共に追加免疫し、さらに71日後にペプチド‐KLH複合体0.1mgを生理食塩水0.1mlに懸濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
合成ネオエピトープペプチド0.2mgを0.4mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、0.60mgのPEO-マレイミド活性化ビオチン(PIERCE社製)を0.1mlの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で2時間反応後に逆相HPLCにてビオチン標識ネオエピトープペプチドを精製した。
最終免疫の3日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(p3×63-Ag8.U1、東京腫瘤研究所)を50%のポリエチレングリコール4000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地で選択した。
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを以下に説明するELISAを用いて行なった。384穴マイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに0.35μgの抗マウスIgG抗体(シバヤギ社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5)35μlを加えて4℃で16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を90μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行なった(抗マウスIgG抗体固相化プレート)。各ウェルを90μlの洗浄液で1回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清を含む10μlの緩衝液A(0.5% ウシ血清アルブミン、0.01% Tween80、0.05% Proclin150、0.15M NaClを含む50mM トリス緩衝液、pH7.4)および0.05ngのビオチン標識ネオエピトープベプチドと2ngのStreptavidin-HRP(PIERCE社製)を含む10μlの緩衝液Aを混合し、4℃で16時間反応させた。
ネオエピトープ抗体(20A10)のネオエピトープ認識特異性を調べるために以下のアミノ酸配列を有するネオエピトープペプチドを用いて以下の方法で行なった。
Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-HyP-Gly-Pro-Gln-Gly (配列番号20で示されるアミノ酸配列の962-975位に該当、配列番号:14)
Gly-Pro-Gln-Gly (972-975位に該当、配列番号:15)
Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-Arg (配列番号20で示されるアミノ酸配列の969-980位に該当、配列番号:16)
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-HyP-Gly-Pro-Gln-Gly (配列番号20で示されるアミノ酸配列の957-975位に該当、配列番号:17)
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (配列番号20で示されるアミノ酸配列の957-975位に該当、配列番号:18)
ヒトI型、II型あるいはIII型コラーゲン溶液(Chondrex社製)10μg/10μlに2×酵素反応バッファー(0.3M NaCl、10mM CaCl2、0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.6)を10μl添加して中和し、ヒト活性化MMP13(ヒトPro-MMP13(Calbiochem社製)を1mM APMAで37℃、2時間インキュベートして活性化したもの) 0.2μgを添加して37℃で一晩反応した。その後、停止液(EDTA、終濃度5mM)を加えて天然型ネオエピトープ溶液とした。
各ウェルを90μlの洗浄液で1回洗浄した後、6.4−250nMの天然型ネオエピトープ溶液を含む10μlの緩衝液Aと1ng/mlのビオチン標識ネオエピトープペプチド(配列番号:2)と200ng/mlのStreptavidin-HRPを含む10μlの緩衝液Aおよび、15ng/mlのネオエピトープ抗体(20A10)を含む10μlの緩衝液Aをそれぞれ混合し、4℃、16時間反応させた。
II型コラーゲンの測定を行うために、C末端側にネオエピトープを有するII型コラーゲンネオエピトープの一部(配列番号20で示されるアミノ酸配列の957-965位に相当)に該当するGly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser(配列番号12)の合成ペプチドを免疫原とし、アミノ末端にシステインリンカー付加、カルボキシル末端にアミド化を施した。この合成ペプチド2.1mgを1mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、8mgのgiant keyhole limpetsヘモシアニン(マレイミド化KLH、PIERCE社製)を3mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと混合し、室温にて3時間反応させた。
その後、21日後、42日後および63日後にペプチド‐KLH複合体0.1mgをフロイント不完全アジュバントと共に追加免疫し、さらに71日後にペプチド‐KLH複合体0.1mgを生理食塩水0.1mlに懸濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。合成ペプチド0.2mgを0.1mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、0.25mgのHPDP-ビオチン(PIERCE社製)を0.1mlのジメチルホルムアミドに溶解したものとを混合し、4℃で一晩反応後に逆相HPLCにてビオチン標識ペプチドを精製した。
最終免疫の3日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。
ネオエピトープおよびコラーゲンタイプ特異的内部配列を含む22残基からなる合成ペプチドGly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly(954−975位に相当、配列番号19)を検量標準ペプチドとして合成した。HRP標識20A10を調製した。すなわち、20A10のIgG画分1mgを含む5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)0.5mlに0.1Mメルカプトエチルアミン水溶液0.05mlを加えて37℃で1.5時間反応したのち、PD-10カラム(GEヘルスケア社製)によるゲルろ過を行って還元IgG画分を分取した。Peroxidase(Horse radish由来、Roche社製、HRP)1mgを含む5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)0.2mlにSulfo-SMCC(PIERCE社製)を加えて室温で2時間反応したのち、PD-10カラム(GEヘルスケア社製)によるゲルろ過を行ってマレイミド化HRP画分を分取した。これに前記の20A10の還元IgG画分を加えて4℃で一夜反応し、高速ゲルろ過(5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で平衡化したTSK-GEL G3000カラム(東ソー社製)を付属したLC-6Aシステム(島津社製))を行ってHRP標識20A10画分約0.5mgを分取した。96穴マイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに1.5μgのII型コラーゲン内部配列特異的抗体6G4を含むトリス緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5)150μlを加えて4℃で16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を150μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行なった。各ウェルを300μlの洗浄液で1回洗浄した後、10-500pM標準ペプチドあるいは被検試料を含む50μlの緩衝液A(0.5% ウシ血清アルブミン、0.01% Tween80、0.05% Proclin150、0.15M NaClを含む50mM トリス緩衝液、pH7.4)および0.05ngのHRP標識ネオエピトープ抗体20A10を含む100μlの緩衝液Aを混合し、4℃で16時間反応させた。次に各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後に、100μlのTMB-Substrate Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させ、100μlの0.05M硫酸を添加して反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
5 ng/mlのヒトII型コラーゲン溶液(Chondrex社製)を96ウェルマキシソーププレート(NUNC社製)に添加し、4℃で一晩インキュベート後、洗浄バッファー(0.05 M Tris-HCl、 pH7.6)で2回洗浄してコラーゲンコーティングプレートとする。プレインキュベート用プレート(Costar 社製)に酵素反応バッファー(0.3M NaCl、10mM CaCl2、0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.6)とヒトII型コラゲナーゼの一種であるヒト活性化MMP13およびMMP阻害剤を加えて室温で30分間プレインキュベートした後、酵素反応溶液中のコラーゲンネオエピトープ量を上記実施例4で説明したサンドイッチELISA系により測定した。
10ng/mlのヒトII型コラーゲン溶液を96ウェル培養プレート(住友ベークライト社製)に添加し、4℃で一晩インキュベート後、培養メディウム(0.1mg/ml BSA、ITS、50μM L-アスコルビン酸を含むDMEM培地)で1回洗浄してコラーゲンコーティングプレートとする。
正常ヒト由来軟骨細胞(Chondrex社)をコーティングプレートにウェルあたり4×104個播種し、培養メディウムを用いて37℃、5%CO2条件下で培養する。1日後に培養液を交換して、1ng/mlヒトインターロイキン1β(Genzyme社製)および10ng/ml Oncostatin M(Sigma社製)と被験対象のMMP阻害剤を様々な濃度で添加してさらに2日間培養する。4日後に反応停止液(EDTA、終濃度5mM)を添加した後培養上清を回収し、この中に含まれるコラーゲンネオエピトープ濃度を上記実施例4に記載したサンドイッチELISA系により測定することにより、MMP阻害剤の活性を測定した。
樹立されたハイブリドーマ細胞から、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて、RNAの抽出を行った。抽出したRNAを1μgから、5’RACE Syatem for Rapid Amplification of cDNA Ends、Version 2.0(Invitrogen社製)を用いて、DNA断片の増幅を行った。増幅された断片は、TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen社製)でクローニングされ、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で塩基配列を解析した。それにより、可変領域のアミノ酸配列を特定した(図7)。
Claims (15)
- コラーゲンネオエピトープ断片に特異的に結合し、配列番号20で示されるアミノ酸配列の962位から975位に結合する抗体であって、当該エピトープに含まれるプロリンが非水酸化体の場合における結合親和性と、水酸化体の場合における結合親和性が実質的に同一であるモノクローナル抗体。
- 請求項1記載のプロリンが、配列番号20で示されるアミノ酸配列における971位のプロリンである請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- エピトープが、配列番号20で示されるアミノ酸配列の957位から975位の領域に存在する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項2に記載の抗体であって、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるペプチドへの該抗体の免疫反応が阻害されるように配列番号14、17又は18で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを競合させるイムノアッセイにおいて、該免疫反応の50%阻害濃度がいずれのペプチドにおいても0.04μM以下である抗体。
- 1)相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域;KYGIN(配列番号5)、WINTYSGMTT YADDFKG(配列番号6)、およびS LGYDYGGFAY(配列番号7)、並びに2)相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;RSGQTLVHDN ENTYFH(配列番号8)、KISNRFS(配列番号9)、およびSQNTHVPFT(配列番号10)
を有するモノクローナル抗体。 - 1)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および 2)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域;を有するモノクローナル抗体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体であってラベルされたモノクローナル抗体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いたコラーゲンネオエピトープ断片の含有量の測定方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて測定したコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を指標とする、コラゲナーゼ活性の測定方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて測定したコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を指標とする、コラゲナーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて生体試料に含まれるコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を測定する工程を含む、コラゲナーゼが関与する疾患の患者の選別方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むキット。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて生体試料に含まれるコラーゲンネオエピトープ断片の含有量を測定する工程を含む、コラゲナーゼが関与する疾患の診断方法。
- コラゲナーゼが関与する疾患の診断に使用するための請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009213962 | 2009-09-16 | ||
JP2009213962 | 2009-09-16 | ||
PCT/JP2010/066029 WO2011034128A1 (ja) | 2009-09-16 | 2010-09-16 | コラーゲンネオエピトープ抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2011034128A1 true JPWO2011034128A1 (ja) | 2013-02-14 |
Family
ID=43758729
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011531960A Ceased JPWO2011034128A1 (ja) | 2009-09-16 | 2010-09-16 | コラーゲンネオエピトープ抗体 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120237948A1 (ja) |
EP (1) | EP2479190A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2011034128A1 (ja) |
KR (1) | KR20120064072A (ja) |
CN (1) | CN102482348B (ja) |
WO (1) | WO2011034128A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI457442B (zh) * | 2012-05-17 | 2014-10-21 | Univ Ishou | 用以生產第ii型膠原片段抗體的融合瘤細胞株、及以尿液檢測退化性關節炎之方法 |
EP2891663B8 (en) | 2012-08-31 | 2018-04-04 | Vasculead Inc. | Psf1-derived peptide |
GB201413357D0 (en) * | 2014-07-28 | 2014-09-10 | Philogen Spa | Antibodies for treatment and diagnosis |
GB201601571D0 (en) * | 2016-01-28 | 2016-03-16 | Nordic Bioscience As | Collagen type Vll alpha 1 assay |
CA3009445C (en) * | 2016-02-03 | 2024-03-19 | Nordic Bioscience A/S | Combined biomarker measurement of fibrosis |
GB201712071D0 (en) * | 2017-07-27 | 2017-09-13 | Nordic Bioscience As | Collagen type X alpha-1 assay |
EP4023230A4 (en) | 2019-06-05 | 2023-11-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTIBODY CLEAVAGE SITE BINDING MOLECULE |
WO2021180063A1 (en) * | 2020-03-09 | 2021-09-16 | I-Mab Biopharma Co., Ltd. | Methods for detecting and quantifying biological modifications in antibodies |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5300434A (en) * | 1987-11-06 | 1994-04-05 | Washington Research Foundation | Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide |
US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
US6030792A (en) * | 1997-11-13 | 2000-02-29 | Pfizer Inc | Assays for measurement of protein fragments in biological media |
US6642007B1 (en) * | 1998-11-02 | 2003-11-04 | Pfizer Inc. | Assays for measurement of type II collagen fragments in urine |
WO2002068675A2 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-06 | Colorado State University Research Foundation | Product, method and system for identifying collagenase-cleaved type ii collagen |
EP1845376A4 (en) * | 2005-01-28 | 2008-07-09 | Shionogi & Co | QUANTITATIVE MEASURING PROCEDURE FOR RECOMBINANT PROTEIN |
EP1862801A4 (en) * | 2005-03-07 | 2008-08-27 | Shionogi & Co | TEST METHOD CARRIED OUT WITH RAPPORTEUR GENE |
-
2010
- 2010-09-16 WO PCT/JP2010/066029 patent/WO2011034128A1/ja active Application Filing
- 2010-09-16 JP JP2011531960A patent/JPWO2011034128A1/ja not_active Ceased
- 2010-09-16 KR KR1020127006740A patent/KR20120064072A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-09-16 US US13/496,483 patent/US20120237948A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-16 EP EP10817241.2A patent/EP2479190A4/en not_active Withdrawn
- 2010-09-16 CN CN201080041396.4A patent/CN102482348B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6010062054; Analytical Biochemistry Vol. 380, 2008, pp.249-256 * |
JPN6010062056; Journal of Immunological Methods Vol. 247, 2001, pp.25-34 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2479190A4 (en) | 2013-12-04 |
CN102482348A (zh) | 2012-05-30 |
US20120237948A1 (en) | 2012-09-20 |
CN102482348B (zh) | 2014-08-27 |
WO2011034128A1 (ja) | 2011-03-24 |
EP2479190A1 (en) | 2012-07-25 |
KR20120064072A (ko) | 2012-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2011034128A1 (ja) | コラーゲンネオエピトープ抗体 | |
US8399207B2 (en) | Monoclonal antibodies against osteopontin | |
WO2009107170A1 (ja) | 抗crp抗体及びその利用 | |
JP5437633B2 (ja) | モノクローナル抗体およびその用途 | |
KR20140100939A (ko) | 시트룰린화된 14-3-3 유래 항원 및 류마티스 관절염 진단에서의 이의 용도 | |
JP5147696B2 (ja) | 可溶型lox−1に対するモノクローナル抗体 | |
US20090291462A1 (en) | Detection or Quantification of Aggrecan and its Fragments | |
JPWO2009008414A1 (ja) | Mmp13に対する中和活性を有するモノクローナル抗体 | |
JP2012082210A (ja) | Adamts13活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
WO2015046444A1 (ja) | 抗アルドステロン抗体 | |
JPWO2006004207A1 (ja) | 抗シノビオリン抗体 | |
JP5605879B2 (ja) | sAPPβに対する抗体 | |
KR101237002B1 (ko) | 시트룰린화된 단백질에 특이적인 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 | |
JP5430573B2 (ja) | 抗バソヒビンモノクローナル抗体のセット | |
JPH04252954A (ja) | タンパクの測定方法、試薬及びキット | |
JP2712018B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
CN113939533B (zh) | 抗可溶性cd14亚型抗体、试剂盒及其应用 | |
JP4393210B2 (ja) | 抗体およびその用途 | |
JP4726031B2 (ja) | X型ホスホリパーゼa2の免疫測定方法 | |
JP2005143504A (ja) | 抗体およびその用途 | |
JP2003274946A (ja) | 肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−1に対する抗体とその用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130702 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141028 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150331 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150427 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150804 |
|
A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20151222 |