KR20140100939A - 시트룰린화된 14-3-3 유래 항원 및 류마티스 관절염 진단에서의 이의 용도 - Google Patents

시트룰린화된 14-3-3 유래 항원 및 류마티스 관절염 진단에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시트룰린화된 14-3-3η 펩티드 및 이에 대한 항체 및 류마티스 관절염과 같은 관절염 병태를 평가하기 위해 이를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

시트룰린화된 14-3-3 유래 항원 및 류마티스 관절염 진단에서의 이의 용도 {ANTIGENS DERIVED FROM CITRULLINATED 14-3-3 AND USES THEREOF IN THE DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS}
본 발명은 일반적으로 혈청 자가항체, 특히 관절염 병태를 갖고 있는 환자의 혈청 중에 존재하는 항-14-3-3 자가항체에 의해 특이적으로 결합되는 시트룰린화된 펩티드에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 시트룰린화된 14-3-3 에타 서열, 또는 이의 일부를 포함하며, 이때 자연 서열 중 아르기닌은 시트룰린에 대해 탈이민화된 것이다. 또한, 본 발명은 류마티스 관절염을 포함하는 관절염 병태를 평가하기 위한 이들 펩티드의 용도 및 이들 시트룰린화된 펩티드를 향한 항체에 관한 것이다.
관절염이나 관절통은 일반적으로 신체의 관절의 염증 질환을 말하며, 일반적으로 통증, 부종 및 강직을 수반한다. 관절염은 감염, 외상, 퇴행성 질환, 신진 대사 장애 또는 장해 또는 기타 알 수 없는 병인론을 포함하는 여러 가지 원인 중 하나 또는 여러 개에서 발생할 수 있다.
예를 들어, 류마티스 관절염 (RA)은 활액 막의 만성 염증성 장애이며, 가장 통상적인 전신성 자가면역 질환 중 하나이다. RA 의 진단은 주로 임상 표명에 의존적이나, 실험적 결과치가 차등 진단 및 질환 관리에 있어서 도움이 된다. RA 의 조기 진단은 질환 치료 및 관리 모두에 있어서 중요하다. Kim and Weisman (2000) Arthritis. Rheum. 43:473-84.
발병 환자의 혈청은 질병에 대한 마커일 수 있는 인자를 함유하고 있으며, 이는 조기 진단을 가능하게 한다. 역사적으로, 류마티즘성 인자 (RF) 는 RA 의 1차적인 혈청학적 지표 중 하나가 되어 왔다. 또한, 항-케라틴 자가항체 (AKA) (이는 또한 항-핵주변 자가항체로서도 공지되어 있음) 는 RA 환자의 40-55% 에서 검출되며 RF 음성인 RA 환자로 임상적으로 진단된 RA 환자의 40-50% 에서 검출된다. Vincent et al. (1989) Ann. Rheum. Dis. 48:712-22; Corconnier et al. (1996) Br. J. Rheumatol. 35:620-4; Gabay et al. (1993) Ann. Rheum. Dis. 52:785-9. AKA 는 일반적으로 RF 보다 더욱 현저하게 특이적인 것으로 간주된다. 또한, AKA 는 수 개월 또는 수년 간 RA 의 임상연구에 선행하였다. PCT 공보 제 2010102412 호 (발명의 명칭: "Compositions and Methods for Characterizing Arthritic Conditions") 는 또한 관절염 병태 예컨대 RA 를 평가하기 위한 14-3-3 단백질에 대한 자가항체 및 이를 사용하는 방법을 기술하고 있다. 예를 들어, 14-3-3 에타는 보통 세포내에 존재하는 단백질이며, 오직 질환 상태에서만 이는 세포외 공간으로 방출된다. 그 자체로서, 혈청 14-3-3 에타 및/또는 이에 대한 자가항체는 조기 및 확립 RA 에서 다른 혈청학적 지표를 보충하는 마커로서 진단 유틸리티를 가지며 RA 및 PsA 에서 관절 손상과 연계된 것이다.
최근, 시트룰린을 함유하는 에피토프를 인식하는 AKA 가 측정되었다. von Venrooj (2000) Arthritis Res. 52:785-9. 시트룰린화는 변역 후 변형 (PTM) 형탱이며, 이에 의해 펩티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD) 는 질소-기재 부분을 자유롭게 하는 화학적 변화를 야기하는 아미노산 아르기닌 (R) 의 시트룰린 (C) 로의 탈이민화를 촉매작용한다. 규제되지 않은 시트룰린화는 RA 와 같은 염증성 병태에서 활성 프로세스인 것으로 나타나며, 이에 의해 "인설트" 는 1) PAD 의 활성화; 2) PAD 효소의 활액 공간으로의 분비; 3) 비멘틴 및 필라그린과 같은 세포외 단백질의 시트룰린화; 4) 시트룰린화된 항원에 대항하는 체액성 면역 반응 및 5) 질병의 영구화를 야기한다. 이들 항-시트룰린화된 항체의 검출은 또한 RA 의 조기 진단에 있어서 유용할 수 있다.
CCP (시클릭 시트룰린화된 펩티드) 로서 공지되어 있는 시트룰린을 함유하는 합성 펩티드에 대항하는 IgG 항체는 기타 자가면역 질환과 RA 를 구별하는데 있어서 AKA 또는 RF 보다 더욱 양호한 것으로 증명되었으며, 항-CCP 항체의 존재는 RA 를 갖는 환자에서 상승된 RF 수준과는 별개로 발생한다. 그러나, 환자의 현저한 % 가 항-CCP 에 대해 혈청반응 음성이거나 음성으로 남아 있다. 따라서, 이들 질환의 더욱 양호하고 구체적으로 진단하는 지표를 개발할 필요가 있다.
발명의 개요
본원에 개시된 바와 같이, 인간 14-3-3 에타 의 시트룰린화 부위는 임상 시료를 사용하여 실리코에서 시험관 내에서 확인되었다. 시트룰린화된 형태의 14-3-3 에타 및/또는 번역후 변형에 대해 특이적인 항-14-3-3 자가항체는, 14-3-3 에타 의 자연 또는 비-시트룰린화된 형태에 비해, 항-CCP 음성 환자에서 류마티스 관절염의 진단 및 예후에 대해 사용될 수 있다. 특히, 본원에 처음 개시된 바와 같은, 14-3-3 에타 는 항-CCP 음성 RA 환자 대 건강한 대조건에서 상이하게 발현되는 신규한 시트룰린화 표적을 나타내며, 이는 시트룰린화된 단백질, 및/또는 시트룰린화된-14-3-3 에타 에 특이적인 자가항체가 RA 진단을 현저히 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 시트룰린화된 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 류마티스 관절염의 진단 및 예후에 대해 이를 사용하는 방법을 제공한다. 또한 본원에서는, 상기 단백질 내에서 상응하는 자연 또는 비-시트룰린화된 형태와는 대조적으로, 시트룰린화 부위에 특이적인 및/또는 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는 조성물이 제공되며, 이를 이용하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 시료에서 14-3-3 에타의 시트룰린화된 형태에 대항하는 자가항체의 존재/양이, 대상체에서 관절염 병태의 존재 및/또는 상태의 지표임을 밝힌 것에 관한 것이다. 또한 본원에서는, 대상체로부터의 생물학적 시료에서 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편을 갖는 순환 면역 컴플렉스를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서의 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특징화하는 방법이 제공된다.
바람직한 구현예에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편은, 하나 이상의 시트룰린화 부위, 바람직하게는 자연 14-3-3 에타 서열의 위치 4, 위치 12, 위치 19, 위치 42, 위치 61, 위치 86 또는 위치 227 로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위, 또는 이의 조합에서 하나 이상의 시트룰린 잔기를 포함한다. 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편은 단리될 수 있거나, 보다 바람직하게는 본원에 보다 상세히 기술된 바와 같은 고형 지지체에 결합될 수 있다.
따라서, 본원에서는, 대상체로부터의 생물학적 시료를 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 것, 및 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하여 자가항체를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특징화하는 방법이 기재되어 있으며, 이때 상기 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체의 존재/양은 대상체에서 관절염 병태의 존재 및/또는 상태의 지표이다. 또한 본원에서는, 대상체로부터 생물학적 시료에서 자가항체와 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 사이의 순환성 면역 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특징화하는 방법이 제공되며, 이때 시료에서 면역 복합체의 존재/양은 대상체에서 관절염 병태의 존재 및/또는 상태의 지표이다.
하나의 구현예에 있어서, 검출 단계는 대조군 시료과 비교하여 생물학적 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편을 갖는 면역 복합체 또는 자가항체의 수준을 정량화하고/측정하는 것을 포함한다. 따라서, 대상체에서 관절염 병태를 평가하기 위해 현재 청구되는 방법은 진단적 및 예후적 결정을 제공할 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 대조군 시료는 정상 대조군이고, 이를 비교하는 것은 관절염 진단의 지표이다. 하나의 구현예에 있어서, 정상 대조군 시료 (예를 들어, 관절염 병태를 갖지 않는 다른 대상체로부터의 시료) 과 비교하여, 상기 생물학적 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 (또는 이를 갖는 면역 복합체에 대항하는) 자가항체의 수준이 증가하는 것은, 상기 대상체에서 관절염 병태의 진단학적 지표이다.
따라서, 일부 구현예에 있어서, 대상체로부터의 생물학적 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 면역 복합체에 대한 자가항체의 존재, 및/또는 대상체로부터의 생물학적 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 면역 복합체에 대한 자가항체의 존재는, 정상 (즉, 비-관절염) 대조군 시료에서 이러한 자가항체 또는 면역 복합체의 수준에 비교하여, 대상체가 관절염 병태를 갖고 있는지 여부를 진단한다.
하나의 양태에 있어서, 대조군 시료는 포유동물 대상체로부터의 사전 생물학적 시료이고, 비교하는 것은 질병 진행의 지표 및/또는 치료학적 요법의 효능의 지표이다. 하나의 구현예에 있어서, 이전 시료 (예를 들어, 상기 대상체로부터의 기준 생물학적 시료) 과 비교하여 상기 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 순환성 면역 복합체에 대한 자가항체의 감소된 수준은 진행성 치료학적 요법의 효능의 지표이다. 또다른 구현예에 있어서, 이전 시료과 비교하여 상기 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 순환성 면역 복합체에 대한 자가항체의 증가된 수준은 치료학적 요법에 대한 반응이 부족함을 나타내는 지표이다.
따라서, 일부 구현예에 있어서, 동일한 대상체로부터의 기준 생물학적 시료 중 존재하는 자가항체 또는 복합체의 수준과 비교하여, 대상체로부터의 생물학적 시료에서 검출된 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 단편, 또는 이를 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 상대적인 수준은, 관절염 병태의 예후적 지표, 및/또는 제안된 치료 계획의 잠재적 효능의 치료진단 지표를 나타낸다.
하나의 양태에 있어서, 대조군 시료는 포유동물 대상체로부터의 동일한 생물학적 시료이고, 자연 또는 비-시트룰린화된 14-3-3 에타에 대한 자가항체의 상대적인 수준 또는 양과 이를 비교하는 것은, 본원에 기술된 바와 같은 잠재적 치료 계획의 효능 및/또는 질병 진행의 지표일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 동일한 시료 중 자연 또는 비-시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 순환성 면역 복합체에 대한 자가항체의 수준과 비교하여, 상기 시료 중 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 순환성 면역 복합체에 대한 자가항체의 수준이 증가된 것은, 질병의 단계 및/또는 예후에 대한 지표, 또는 잠재적 치료 중재의 제안 지표이다 (예를 들어, 펩티딜 아르기닌 디이미나아제 등을 직접 표적으로 하는 저해제).
따라서, 일부 구현예에 있어서, 대상체로부터 동일한 또는 순차적인 생물학적 시료(들) 중 자연 또는 비-시트룰린화된 형태에 대해 자가항체 또는 복합체의 수준과 비교하여, 대상체로부터의 생물학적 시료에서 검출된 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 단편 또는 이를 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 상대적인 수준은, 관절염 병태의 예후적 지표, 및/또는 제안된 치료 계획의 잠재적 효능의 치료진단 지표를 제공한다.
하나의 양태에 있어서, 대조군 시료는 관절염 대조군이고, 이를 비교하는 것은 질병 예후의 지표이다. 하나의 양태에서, 대조군 시료는 관절염 대조군이고, 비교는 질환 예후를 나타낸다. 하나의 구현예에서, (예를 들어, 뚜렷한 관절염 병태가 있는 다른 대상체로부터) 관절염 대조군 시료와 비교에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 면역 복합체에 대한 상대 자가항체의 수준은 관절염의 예후적 지표이다.
따라서, 일부 구현예에서, 상이한 관절염 상태에 있는 대상체는 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편, 및/또는 그의 순환성 면역 복합체에 대한 자가항체의 수준에서의 검출가능 차이를 갖고, 이들 차이는 예후 관련된 것이다. 하나의 예에서, 본 명세서는 다른 환자 등에서 관절염 상태의 경과를 통해, 예를 들어, 치료 전, 치료 동안, 치료 후에 존재하는 것으로 미리 측정된 수준과 비교하여 대상체에서 검출된 상대 자가항체의 수준을 기반으로 특이 질환 단계 또는 관절염 상태의 병리조직학적 표현형을 측정하기 위해 사용될 수 있는 방법을 개시한다. 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 예를 들어 데이터베이스에 저장될 수 있는 대조군 시료와 비교하여 생물학적 시료에서 검출된 상대 자가항체의 수준을 기반으로 관절염 상태의 징후에 대한 고위험에서 대상체로부터 유래하는 바와 같이 생물학적 시료를 분류하기 위해 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 방법은 치료 계획으로 성공적으로 치료되었던 제 2 대상체로부터의 예를 들어 제 2 생물학적 시료의 대조군 시료와 비교하여 대상체로부터의 생물학적 시료에서 검출된 상대 자가항체의 수준을 기반으로 치료 계획에 대한 대상체의 반응을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 제 1 대상체로부터의 생물학적 시료 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 상대 자가항체의 수준은 치료에 대한 반응 능력이 공지된 대상체로부터의 생물학적 시료 중 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대항하거나 그 단백질을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준과 비교되고, 여기서, 그와 같은 치료에 대한 제 1 대상체의 반응 잠재력을 측정한다. 그 다음, 치료 계획에 대한 대상체의 민감성의 측정은 관절염 상태에 있는 대상체를 치료하는 방법을 알려 주기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서는 관절염 상태에 있는 대상체의 치료 방법을 개시하고 있고, 그 방법은 (예를 들어, 자가항체의 수준/시트룰린화된 14-3-3 에타 면역 복합체 형성을 측정하여) 대상체로부터의 생물학적 시료 중 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대항하는 자가항체의 수분을 측정하고, 치료 계획에 대한 대상체의 민감성을 갖는 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대항하거나 그 단백질을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준과 관련시키고, 대상체에 대한 치료 계획을 제공하는 것을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 관절염 상태의 치료를 모니터링하는 방법을 제공하고, 이 방법은 환자 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 순환성 복합체에 대항하는 자가항체의 수준을 측정하고, 치료를 받고 있는 환자에서 시트룰린화된 14-3-3 에타를 수반하는 자가항체의 수준/면역 복합체를 모니터링하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서는 환자의 서브타입의 관절염을 측정 및/또는 분화시키기 위한 방법을 제공한다. 이 양태에서, 제 1 대상체로부터의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나, 또는 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 상대 자가항체는, 서브타입의 관절염이 공지되어 있고/있거나 미리 확립되어 있는 하나 이상의 다른 대상체로부터의 생물학적 시료 중 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대항하거나 또는 그 단백질을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준과 비교되고, 여기서, 그와 같은 비교는 제 1 대상체에 대한 서브타입의 관절염을 측정한다.
제 1 대상체로부터의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준이 서브타입의 관절염이 공지되고/되거나 미리 확립된 다른 대상체의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준과 유사하다는 측정은, 제 1 대상체가 다른 대상체와 동일한 서브타입의 관절염을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 제 1 대상체로부터의 생물학적 시료 및 염증성 관절염, 예를 들어, 류마티스성 관절염을 갖는 것으로 공지된 다른 대상체의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 유사한 수준은, 제 1 대상체가 또한 염증성 관절염, 예를 들어, 류마티스성 관절염을 갖는 것으로 측정할 수 있다.
추가로, 제 1 대상체로부터의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준이 생물학적 시료, 또는 서브타입의 관절염이 공지되고/되거나 미리 확립된 다른 대상체의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준과 상이하다는 측정은, 제 1 대상체가 다른 대상체와 상이한 서브타입의 관절염을 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 제 1 대상체로부터의 생물학적 시료, 및 비염증성 관절염, 예를 들어, 골관절염을 갖는 것으로 공지된 다른 대상체의 생물학적 시료 중 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하거나 그 단백질 또는 단편을 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 상이한 수준은, 제 1 대상체가 염증성 관절염, 예를 들어, 류마티스성 관절염을 갖는 것으로 측정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 검출 단계는 면역학 기반 기술, 예를 들어, 면역침전법, ELISA, 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학, 면역형광법, "샌드위치(sandwich)" 면역검정, 면역방사성측정 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 제자리 면역검정, 침전 반응, 응집 검정, 보체 고정 검정, 단백질 A 검정, 면역전기영동 검정, 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 분석, 방사성면역검정 등을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체를 검출 및/또는 측정하는 것은 시료 중 자가항체 및 시트룰린화된 14-3-3 또는 이의 단편 사이의 면역 복합체이 형성을 관찰하고, 또는 시료 중 존재 자가항체/시트룰린화된 14-3-3 복합체의 존재를 측정하여 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 형성은 검출가능하게 표지된 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들) 또는 이의 단편(들)에 의해 검출될 수 있다. 다른 구현예에서, 복합체는 면역글로불린, 예를 들어, 자가항체의 면역글로불린 골격에 결합하는 검출가능하게 표지된 2차 항체와 자가항체/시트룰린화된 14-3-3 복합체 사이의 제 2 면역 복합체를 형성하여 검출될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 방법은 환자의 혈액, 관절 유체, 혈장, 혈청, 또는 조직 (예를 들어, 활막성 관절, 손상된 관절 조직 등) 중 시트룰린화된 14-3-3 또는 그의 면역 복합체에 대항하는 자가항체를 검출하는 것을 수반한다. 하나의 구현예에서, 검출은 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 사용하여 혈액, 관절 유체, 혈장, 혈청 또는 조직으로부터의 시트룰린화된 14-3-3 에 대항하는 자가항체의 면역침전법에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 검출은 ELISA의 사용을 수반한다. 하나의 구현예에서, 검출은 환자로부터의 관절 유체, 혈장, 또는 혈청을 포함하는 시료의 웨스턴 블롯 분석을 수반한다. 하나의 구현예에서, 검출은 방사성면역검정의 사용을 수반한다. 하나의 구현예에서, 검출은 스트립 테스트의 사용을 수반한다. 하나의 구현예에서, 검출은 캐어 테스트의 지점의 사용을 수반한다. 하나의 구현예에서, 시트룰린화된 14-3-3 에타 또는 이의 순환 복합체에 대항하는 자가항체의 검출은 관절염의 다른 마커의 검출 (예를 들어, MMP, 항-CCP, 항-RF 및/또는 CRP)과 조합된다.
또한, 본 명세서에는, 대상체에서의 관절염 상태를 평가하기 위한 시약을 포함하는 키트가 기재되어 있고, 여기서, 상기 시약은 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 특이적으로 인식한다. 하나의 구현예에서, 시약은 고형 지지체 상에 고정될 수 있는 검출가능하게 표지된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 복수의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 동형 사이에 공유된 에피토프를 포함할 수 있고, 또는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 동형의 하나 또는 서브셋에 특이적인 에피토프를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 시트룰린화된 14-3-3 에타 및/또는 감마 에피토프를 포함한다. 하나의 구현예에서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 시트룰린화된 14-3-3 동형, 예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 감마에 의해 공유된 시트룰린화된 14-3-3 에타 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 시트룰린화된 14-3-3 에타 에피토프는 시트룰린화된 14-3-3 에타에 특이적이다.
다른 양태에서, 본원에서 제공되는 것은 각각 자연 인간 14-3-3 에타 단백질 또는 자연 인간 14-3-3 에타 이의 단편 보다 시트룰린화된 인간 14-3-3 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 항체이다. 바람직한 구현예에 있어서, 단리된 항체는, 14-3-3 에타 단백질의 자연 또는 비-시트룰린화된 형태에 특이적인 항-14-3-3 에타 자가항체가 아니라, 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 특이적인 항-14-3-3 에타 자가항체를 갖는 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질로의 결합에 대해 경쟁한다.
하나의 구현예에 있어서, 항체는, 각각 자연 14-3-3 에타 단백질 또는 자연 14-3-3 에타 이의 단편 보다는, 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편에 대해 선택적으로 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 항체는 각각 SEQ ID NOs:9-15 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 자연 14-3-3 에타 단백질 보다는 SEQ ID NO: 16-22 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질을 선택적으로 결합할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO:9 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO: 17 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO: 18 의 아미노산을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO: 19 의 아미노산을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO:20 의 아미노산을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO:21 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 아니라, SEQ ID NO:22 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 구현예에 있어서, 항체는, 자연 14-3-3 감마 단백질 보다는 시트룰린화된 14-3-3 감마 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 예를 들어, SEQ ID NO: 5 의 임의의 하나 이상의 위치 4, 12, 19, 42, 61, 86 및 227 에서 단백질 내에서 특정 부위에서 시트룰린 잔기의 확인 및/또는 개별적인 14-3-3 에타 단백질의 시트룰린화 정도는 대상체에서 관절염 병태의 존재 및/또는 상태의 지표라는 발견에 관한 것이다. 또한 본원에서 제공되는 것은, 상기 언급된 선택적 항체를 이용하여 대상체로부터의 생물학적 시료에서 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편의 특정 시트룰린화 위치 및/또는 정도를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특징화하기 위한 방법이다.
따라서, 시트룰린화된 인간 14-3-3 에타 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 대상체로부터의 생물학적 시료와 접촉시키는 것, 및 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편을 검출시키는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특정화하는 방법이 본원에 기술되어 있으며, 이때 규정된 임상적 시험 결과 표준과 비교하여, 상기 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편 내의 시트룰린화의 존재, 정도 및/또는 위치는, 대상 체에서 관절염 병태의 존재 및/또는 상태의 지표이다.
도 1 은, 14-3-3 에타 항원의 재조합 비-시트룰린화된 또는 시트룰린화된 형태 중 하나로 향하는 자가항체 반응성에 의해 측정시, 항-CCP 음성 및 항-CCP 양성 류마티스 관절염 (RA) 환자에서 14-3-3 에타 시트룰린화 특정 자가항체 반응을 나타내는 바 그래프를 나타낸다. 14-3-3 에타 자가항체는 둘 모두의 항-CCP 음성 및 양성 환자에서 14-3-3 에타 항원의 시트룰린화된 형태에 우선적으로 결합한다.
도 2 는 30 개의 항-CCP 음성 류마티스 관절염 (RA) 환자 (▲) 에 비교하여, 30 개의 항-CCP 음성 건강한 대조군 (●) 에서 14-3-3 에타 시트룰린화 특이적 자가항체 반응을 나타내는 도트 플롯이다. y-축 (항-cit-14-3-3η) 은 각각의 개별 대상체에 대해 14-3-3 에타 항원의 시트룰린화된 형태에 대한 반응이다.
"14-3-3" 및 "14-3-3 단백질"은 교환 가능하게 사용되며, 14-3-3 패밀리의 하나 이상의 구성원을 지칭한다. 진핵생물체에서 편재하게 표현된 보존된 세포내 규제 분자의 구성원을 의미한다. 14-3-3 단백질은 키나제, 포스파타제, 및 경막 수용체를 포함하여 기능적으로 다양한 신호 단백질의 다수를 결합할 수 있는 능력이 있다. 실제로 100개 이상의 신호 단백질은 시트룰린화된 14-3-3 에타 리간드로서 보고되어 왔다. 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질은 테트라트리코 펩타이드 반복(Tetratrico Peptide Repeat) 수퍼패밀리의 진화된 구성원으로 간주된다. 그들은 일반적으로 9 또는 10개의 알파 나선을 갖고, 일반적으로 그들의 아미노-테르미니 나선을 따라 동종 및/또는 이종 이합체 상호 작용을 형성한다. 이 단백질은 무엇보다도 다른 이가의 양이온 상호 작용, 인산화 및 아세틸화 및 단백질 가수분해 절단을 위한 지역을 포함한 알려진 많은 도메인을 포함한다.
각각의 이소형이 242-255 아미노산 사이로 구성된 포유류에서 발현될 것으로 알려져 있는 14-3-3 단백질의 일곱개의 독특한 유전적으로 암호화된 이소형이 있다. 일곱개의 14-3-3 단백질 이소형은 14-3-3 α/β (알파/베타), 14-3-3 δ/ξ (델타/제타), 14-3-3 ε (엡실론), 14-3-3 γ (감마), 14-3-3 η (에타), 14-3-3 τ/θ (타우/세타) 및 14-3-3 σ (시그마/스트라티핀)으로 지명된다. 14-3-3 단백질은 고도의 시퀀스 유사성을 갖고, 전사후 과정, 예를 들어, 인산화, 시트룰린화 등을 겪는 것으로 공지되어 있다. Megidish 등 (1998) J. Biol. Chem. 273: 21834-45 참조. 결과적으로, 항-시트룰린화된 14-3-3 자가항체는 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 이소형에 특이적으로 결합 및/또는 그를 인식하거나, 단 하나의 이소형 (예: 14-3-3 에타)에 특이적으로 결합 및/또는 그를 인식할 수 있다.
시트룰린화는 번역 후 변형 (PTM) 의 형태이고, 이에 의해 펩티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD) 는 질소-기재 부분을 자유롭게 하는 화학적 변화를 야기하는 아미노산 아르기닌 (R) 의 시트룰린 (C) 로의 탈이민화를 촉매작용한다. 따라서, 용어 "시트룰린화된 14-3-3 단백질" 및 "시트룰린화된 14-3-3 펩티드" 는, 시트룰린화된 서열에서 시트룰린 잔기를 갖는 자연 서열 중 하나 이상의 아르기닌 잔기의 치환을 제외하고는, 자연 14-3-3 단백질 (예를 들어, 번역 후 변형되지 않은 14-3-3 단백질) 의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.
"치환된" 또는 "대체된" 이란 변형된 형태를 포함하며, 예를 들어, 시트룰린 잔기에 의해 치환된 또는 대체된 아르기닌 잔기라 함은, 예를 들어 PAD 로 인큐베이션하여 아르기닌 잔기가 시트룰린 잔기로 변형된 것을 의미할 수 있다. PAD 에 의한 시트룰린화는 단백질의 NH2-말단에서 대부분 시작하나, 예외적으로는 단백질의 COOH 말단으로부터 시작할 수 있다. 여러 경우, 아르기닌 잔기는 시트룰린 잔기에 의해 대체되고, 이는 상기 수 개의 아르기닌에 대해서 각 단일 아르기닌 잔기가 단일 시트룰린 잔기에 의해 대체됨을 의미하는 것이다.
티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD) (또한 단백질-아르기닌 디이미나아제로서도 지칭됨) 는 칼슘 이온의 존재 하에서 펩티드 중 아르기닌 잔기를 시트룰린 잔기로 전환하는 번역 후 변형 효소의 패밀리이다.
"시트룰린" 및 "Cit" 는 2-아미노-5-(카르바모일아미노)펜탄산을 지칭하며 하기 화학식을 갖는 알파-아미노산이다:
H2NC(0)H(CH2)3CH(H2)C02H.
본원에 상호교환적으로 사용되는 용어 "펩티드" 및 "단백질" 은 펩티드 결합에 의해 연결되는 2 내지 200 개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 펩티드는 임의의 통상적인 20 개의 아미노산 또는 이의 변형된 형태 및 화학적 펩티드 합성 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 혼입된 임의의 비자연적으로 발생된 아미노산을 함유할 수 있다. 펩티드는 항원으로서 사용될 수 있으며 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다.
적어도 상기 단백질의 활성 부분을 포함하는 분자를 지칭하는 단백질을 참조로 하여 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "유도체", "변이체" 및 "단편" 은 항-14-3-3 자가항체에 의해 특이적으로 결합되는 둘 모두의 또는 이 중 하나의 상기 단백질의 시트룰린 잔기 및/또는 에피토프를 적어도 포함하는, 상기 단백질의 활성 부분을 적어도 포함하는 분자를 지칭한다.
용어 "에피토프" 는 B 또는 T 세포 림프구 의 세포 표면에 제시되는 수용체 또는 항체 또는 이의 일부 (Fab1, Fab2', 등) 에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 항원성 단백질의 하나 또는 수 개의 부분 (이는 형태학적 에피토프를 규정할 수 있음) 을 지칭하며, 이는 면역 반응을 유도할 수 있다 (상기 결합에 의해). 에피토프는 분자의 표면 상에 일반적으로 제시되는 화학 특정이고 항체와 상호작용하기 위해 접근될 수 있다. 전형적인 화학적 특징은 아미노산 및 당 분자이고, 이는 전하, 화학친수성 및 친유성을 포함하는 화학적 특성 뿐 아니라 3차원 구조적 특성을 갖는다. 형태학적 에피토프는, 기초 화학 구조에서 임의의 변화가 없는 분자의 공간적 원소에서 변화에 따르는 항체와의 반응성의 손실에 의한 비-형태학적 에피토프로부터 구분된다.
당업자는 자가항체가 항원의 단편을 인식하는 지를 인지할 것이다. 따라서 본원에 사용되는 바와 같이, "이의 단편" 및 "에피토프" 는 항체, 예를 들어 자가항체로 결합할 수 있는 14-3-3 의 결정을 지칭하는데 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 용어 "에피토프" 는 14-3-3 단백질 또는 특정 이성질체를 참조로하여 사용될 때 일반적으로 단백질의 단편을 지칭하며, 이는 항체 예를 들어 자가항체에 결합할 수 있는 시트룰린화된 14-3-3 단백질을 포함한다.
본원에 기술되는 것은 하나 이상의 시트룰린 잔기를 포함하는 시트룰린화된 14-3-3 에피토프이고, 이는 관절염, 구체적으로는 류마티스 관절염으로 진단된 환자에서 자가항체에 의해 인식되는 것이며, 대상체에서 관절염 병태를 평가하고/평가하거나 특징화하기 위해 이러한 에피토프를 이용하는 방법, 및 이러한 에피토프를 포함하는 키트가 기재되어 있다. 에피토프는, 에피토프에 독특한 공간적 형태에서 3 개 정도의 적은 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 6 개 이상의 이러한 아미노산으로 이루어지며, 보다 통상적으로는 적어도 8-10 개의 상기 아미노산으로 이루어진다. 에피토프를 구성하는 아미노산을 측정하는 방법은, x-선 결정학, 2차원 핵자기 공명 및 에피토프 맵핑을 포함한다.
"항체"는 상응하는 항원에 특이적으로 결합하고 면역글로불린의 공통의 일반 구조를 갖는 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 용어 항체는 구체적으로, 다클론 항체, 단클론 항체, 이량체, 다중체, 다중특이 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하고, 단, 상기 항체는 원하는 생물학적 활성을 나타내어야 한다. 항체는 쥣과동물, 인간, 인간화, 키메라, 또는 다른 종으로부터 유도된 것일 수 있다. 전형적으로, 항체는, 항원과 작용하는 결합 도메인으로부터 결합될 때 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함할 것이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 이루어지고, 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론 동형일 수 있다. 유사하게, 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어지고, 이는 카파 또는 람다 동형일 수 있다. VH 및 VL 영역은 또한, 상보적 결정 영역 (CDR)으로 불리는 과변이 영역으로 나누어질 수 있고, 골격 영역 (FR)으로 불리는, 더 보존적인 영역으로 산재된다. VH 및 VL 각각은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이는 하기 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 작용하는 결합 도메인을 갖는다. 항체의 불변 영역은 고전 보체 시스템의 면역계 (예를 들어, 효과기 세포) 및 제 1 성분 (Clq)의 다양한 세포를 포함하는 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자에의 결합을 매개할 수 있다. 중쇄 불변 영역은, 세포 수용체, 예컨대 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등)을 통해 면역글로불린의 숙주 조직 또는 숙주 인자에의 결합을 매개한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체는 또한, 항원에 결합하는 능력을 유지하는 면역글로불린의 항원 결합부를 포함한다. 이들은 예로써 하기를 포함한다: F(ab), VL CL 및 VH CH 항체 도메인의 1가 단편; 및 F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편. 용어 항체는 또한, 재조합 단쇄 Fv 단편 (scFv) 및 2특이적 분자, 예컨대 예를 들어, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디를 의미한다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 제 5,844,094 호).
"항원"은 광범위하게 해석될 수 있으며 분자, 조성물, 또는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 입자를 의미한다. 항원은 그것이 반드시 그 항체의 생산을 유발하지 않더라도 항체와 상호 작용하는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
"자가항체"는 구체적으로 자기 항원, 즉 정상 조직 성분에 결합하는 내인성 항체이다. 자가항체는 이 자가항체를 생산하는 동일한 신체의 자연 발생 항원에 대한 반응으로 생산된다. 따라서, 상호교환적으로 사용되는 용어 "14-3-3 에 대항하는 자가항체" 및 "14-3-3에 대한 자가항체" 시트룰린화될 수 있는 14-3-3 단백질, 또는 상기 숙주로부터 이의 단편에 특이적으로 결합하는 포유동물 대상체에 의해 생산되는 내인성 항체를 지칭한다.
"면역학적 결합" 및 "면역 복합체의 형성"은 교환 가능하게 사용되며 본 문맥에서 일반적으로 항체, 예를 들어, 자가항체와 이 항체가 특이적인 항원 사이에 발생하는 유형의 비공유결합 상호 작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호 작용의 강도 또는 친화도는 상호 작용의 해리 상수 (Kd)로서 표현될 수 있고, 여기서 더 작은 Kd는 더 큰 친화도를 나타낸다. 면역학적 결합 특성은 당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, Davies 등 (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473 참조. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그것이 검출 가능한 수준으로 에서 (예를 들어 ELISA 분석 이내) 리간드와 반응하는 경우 "특이적으로 결합하는", "면역학적으로 결합하는", 및/또는 "면역학적으로 반응성"이라고 하고, 유사한 조건 하에서 무관련 리간드와 검출 가능하게 반응하지 않는다.
단백질 또는 펩티드를 참조로 할 때, 항체에 대해 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는" 이란 구절은, 단백질 및 다른 생물학적 물질의 비상동 개체군에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 항체를 참조로 할 때 용어 "~에 대해 향하는" 단백질 또는 펩티드는 단백질 및 기타 생물학적 물질의 비상동 개체군에서 상기 항체에 의해 단백질의 존재를 결정하는 특이적 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역검정 병태 하에서, 특이적 항체는 2 배 이상 백그라운드에서 특정 단백질에 결합하고 시료 중 존재하는 다른 단백질에 대해 현저한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 병태 하에서 항체로의 특정 결합은 특정 단백질을 위한 특이성에 대해 선택되는 항체를 요구할 수 있다. 예를 들어, 래트, 마우스 또는 인간과 같은 특정 종으로부터 마커 "X" 로 레이징된 폴리클로날 항체는, 마커 "X" 의 대립형질 및 다형성 변이체를 제외하고는, 다른 단백질이 아니라 마커 "X" 와 특이적으로 면역반응하는 오직 폴리클로날 항체를 수득하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 선택은, 다른 종으로부터 마커 "X" 분자와 교차반응하는 항체를 공제함으로써 달성될 수 있다. 다양한 면역검정 포맷은 특정 단백질을 이용하여 특이적으로 면역활성인 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질을 이용한 특이적으로 면역활성인 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity] 을 참조). 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 10 초과 내지 100배 백그라운드인 2배 이상의 백그라운드 신호 또는 노이즈일 것이다.
"진단" 은, 본원에 개시된 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 대해 하나 이상의 자가항체의 존재 또는 부재를 기초로 하는 대상체에서 병리학적 병태의 존재 또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)로 향하는 자가항체의 존재 및 특정 질병의 발병 (예를 들어, 류마티스 관절염, 또는 다른 그룹의 질환 (예를 들어, 관절염 병태)) 사이의 상관관계를 만든다.
"예후" 는 본원에 개시된 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 대해 하나 이상의 자가항체의 존재/부재 및/또는 양을 기초로 하여, 치료하에 또는 치료 없이, 대상체에서 병리학적 병태 및/또는 질환 프로세스의 잠재적 진행 또는 결과를 결정하는 것을 의미한다. 예후적 방법은 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 대한 자가항체의 존재 및/또는 양과 관절염 병태의 가능한 결과 사이의 상관관계를 만든다.
"치료진단" 은, 본원에 개시된 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 대해 하나 이상의 자가항체의 존재/부재 및/또는 양을 기초로 하여 대상체에서 병리학적 병태 및/또는 질병 프로세스에 대한 치료 프로토콜을 제안하가 위한 잠재성 및/또는 가능한 반응을 결정하는 것, 및 결과를 기초로 하여 대상체에 대한 적합한 치료를 재단하는 것을 의미한다. 치료진단 방법은 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 대해 자가항체의 존재 및/또는 양, 및 대상체에서 관절염 병태에 대해 상이한 치료 선택사항의 효능 가능성 사이의 상관관계를 만든다.
상호교환적으로 사용되는 "대상체" 및 "환자" 는 포유동물, 예컨대 인간 및 비인간 영장류, 및 래빗, 래트, 마우스, 염소, 돼지 및 다른 포유동물 종을 나타낸다.
"관절염 병태", "관절염" 및 "관절통"은 교환 가능하게 사용되며 일반적으로 표시된 곳을 제외하고는 신체의 관절의 염증 질환을 의미한다. 통증, 부종, 강직, 및 움직임의 어려움은 관절염 상태와 빈번히 연관된다. 관절염은 100개 이상의 상이한 상태로 구성되어 있다. 이들은 비교적 온화 형태로부터 심하게 손상된 전신 형태 중 임의의 형태일 수 있고, 예를 들어, www.arthritis.ca/types%20of%20arthritis/default.asp?s=1 참고. 관절염 상태는 감염, 외상, 퇴행성 질환, 신진 대사 장애 또는 장해 또는 기타 알 수 없는 병인론을 포함하는 여러 원인 중 하나로부터 초래될 수 있다.
관절염 상태는 서브타입에 따라, 예를 들어, 류마티스 관절염, 혼합 결합 조직 질환 (MCTD), 크리스탈 유발 관절염, 반응성 관절염, 골반통증(spondylarthropathy), 골관절염, 유육종증, 회귀성 류마티스, 외상후 관절염, 악성 종양 관련 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 골관절염, 세균성, 전염성 관절염 등에 대해 더욱 구체적으로 기재될 수 있다. 관절염은 통풍, 강직성 척추염, 전신성 홍반 루푸스, 염증성 장 질환, 건선 등을 포함하는 다른 식별된 질환을 추가로 수반할 수 있다. 잘 정의된 관절염 상태는 관절염의 타입 및 그의 단계, 예를 들어, 발병, 병의 차도, 재발 등에 관한 지식을 의미한다.
시트룰린화된 14-3-3 단백질
자연 14-3-3 단백질의 아미노산 서열을 표 1 에 나타낸다. 일부 구현예에 있어서, 14-3-3 단백질은 표 1 에 제공된 자연 14-3-3 단백질 서열에 대해 동일하다. 또한, 14-3-3 단백질은 표 1 에 제공된 자연 14-3-3 단백질 서열에 대해 실질적으로 상동일 수 있으며 14-3-3 단백질의 기능적 활성을 보유하고, 예를 들어 항-14-3-3 자가항체에 대해 특이적인 것이며, 자연 대립형질 변화 또는 돌연변이 생성으로 인한 아미노산 서열이 달라진다.
[표 1] 14-3-3 단백질
Figure pct00001
본원에 사용되는 바와 같이, 문구 "14-3-3 에타 단백질" 은 SEQ ID NO: 5 및 이와 실질적으로 유사한 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 5 와 75% 이상, 바람직하게는 80%-90%, 여전히 보다 바람직하게는 90%-95% 의 서열 일치성을 갖는 단백질) 을 포함하는 단백질을 지칭한다. SEQ ID NO:5 의 아미노산 서열이 하기에 제공된다.
Figure pct00002
2 개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2 개의 아미노산 서열의 % 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 하나 또는 둘 모두의 제 1 및 제 2 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서 도입될 수 있으며, 이는 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 바람직한 구현예에 있어서, 비교 목적을 위해 정렬되는 참조 서열의 길이는 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 심지어 보다 바람직하게는 60% 이상, 및 보다 더욱 더 바람직하게는 70%, 80%, 또는 90% 이상의 참조 서열 길이이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 상응하는 위치로서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 커플링될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에 개시된 바와 같이, 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 "확인" 은 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 "상동성" 과 등가이다). 2 개의 서열 사이의 % 동일성은, 갭의 수, 각 갭의 길이 (이는 2 개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있음) 를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열을 비교하는 것 및 2 개의 서열 사이의 % 동일성을 결정하는 것은, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 2 개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램으로 도입된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정되며 (http://www.gcg.com 에서 입수가능함), 이는 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나를 사용하고, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 의 갭 중량, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 의 길이 중량을 이용한다. 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 2 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com 에서 입수가능함) 에서 GAP 프로그램을 사용하여 측정되며, 이는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80 의 갭 중량, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 의 길이 중량을 이용하는 것이다. 또다른 구현예에 있어서, 2 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 'E. Meyers 및 W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)' 의 알고리즘을 이용하여 결정되며, 이는 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 에 혼입된 것이며, PAM 120 중량 잔기 표를 이용하는 것이며, 12 의 갭 길이 패널티 및 4 의 갭 패널티를 이용하는 것이다.
본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어 다른 패밀리 멤버를 확인하기 위해 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이타베이스에 대항하여 서치를 수행하기 위해 "쿼리 서열" 로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 서치는 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0) 을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 상동성을 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 =100, 워드길이=12 를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 서치는 본 발명의 14-3-3 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3 을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭이 있는 BLAST 는 문헌 [Altschul et al., (1997) Polynucleotides Res. 25(17):3389-3402] 에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭이 있는 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 파라미터는 예를 들어 www.ncbi.nim.nih.gov 에서 이용될 수 있다.
익히 공지된 방법에 따라 14-3-3 단백질, 단편, 또는 이의 펩티딜아르기닌 디이미나아제와의 융합을 인큐베이션하는 것은, 시트룰린화된 14-3-3 단백질, 단편 또는 이의 융합을 생성한다. 이러한 시트룰린화된 14-3-3 단백질, 단편 또는 이의 융합은 면역원으로서 사용될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 바와 같은 진단, 예후적 및 치료진단 검정에서, 항-14-3-3 항체를 생산하고, 항-14-3-3 항체를 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서, 실리코, 시험관내 및 임상 시료에서 확인된 인간 14-3-3 에타 시트룰린화 부위는 표 2 에 제공된다.
[표 2]
Figure pct00003
본 발명의 시트룰린화된 단백질은 표 2 에 나타낸 아미노산 위치 중 하나에서 적어도 시트룰린 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 시트룰린화된 14-3-3 에타 단편은 SEQ ID NO: 16-22 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
표 3 에 나타낸 바와 같이, 표 2 에 나타낸 7 개의 시트룰린화된 부위 중 전부가 아니라 몇몇개가 다른 14-3-3 아이소형태로 전환되는 것 또한 나타난다. 따라서, 이들 시트룰린화 부위가 다른 14-3-3 아이소형태에서 전환되는 정더로, 이들 부위는 또한 본원에 개시된 방법 및 재료를 사용하는 이들 다른 14-3-3 아이소형태의 시트룰린화 상태를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
[표 3]
Figure pct00004
본 발명의 몇몇 양태는 항-시트룰린화된 14-3-3 자가항체에 대한 항원으로서 이용되는데 적합한 단리된 시트룰린화된 14-3-3 단백질, 및 이의 생물학적으로 활성인 부분에 관한 것이다. 이의 단편을 포함하는 시트룰린화된 14-3-3 단백질은 익히 공지된 방법에 따라 펩티딜아르기닌 디이미나아제를 이용하여, 자연 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 인큐베이션함으로써, 펩티딜아르기닌 디이미나아제의 작용을 통해, 자연, 재조합 또는 합성 14-3-3 단백질로부터 단리될 수 있다. 대안적으로는, 시트룰린화된 14-3-3 단백질는 시틀룰린 잔기를 합성 펩티드로 직접 혼입시킴으로써 익히 공지된 방법에 따라 펩티드 합성에 의해 단리될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 14-3-3 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 적합한 정제 반응에 의해 세포 또는 조직 원천으로부터 단리될 수 있다. 또다른 구현예에 있어서, 14-3-3 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다.
바람직하게는, 본 발명의 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 단편은 통상적인 기술에 따라 발현 벡터 인프레임에서 결찰되며, 예를 들어, 원치 않는 연결 및 효소 라이게이션을 피하기 위해 적합한 알칼리성 포스페이트 처리시 응집 말단의 적합한 말단 필링-인을 제공하기 위해 라이게이션 용 블런트-엔디드 또는 스태거-엔디드 말단을 사용함으로써 발현 벡터 인프레임에서 결찰된다. 대안적으로는, 유전자 단편의 PCR 증폭은 c 유전자 서열을 생성하기 위해 후속 어닐링되고 재증폭될 수 있는 2 개의 보존 유전자 단편 사이의 보충 오버행을 생성하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols In Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992 참조). 더욱이, 많은 발현 벡터는 이미 잔기를 인코딩하는 예를 들어 검출가능한 잔기로 시판될 수 있다. 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 부분, 예를 들어 검출가능한 부분인 발현 벡터가 클로닝될 수 있는 부분은 14-3-3 단백질 또는 단편에 대해 인프레임으로 연결된다.
신호 서열은 분비 단백질 또는 다른 관심 단백질의 분비 및 단리를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 신호 서열은 전형적으론느 하나 이상의 분해 이벤트에서 분비 동안 단백질을 성숙시키는 것으로부터 일반적으로 분해되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 이러한 신호 펩티드는 분비 경로를 통해 이들이 통과할 때 성숙 단백질로부터 신호 서열을 분해하는 것을 허용하는 프로세싱 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 신호 서열이 단백질 가수분해에 의해 분해된 것으로부터의 폴리펩티드 (즉, 분해 산물) 및 신호 서열을 갖는 기술된 폴리펩티드에 관한 것이다. 하나의 구현예에 있어서, 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에서 관심 단백질(예컨대 본래 분비되지 않는 것 또는 분리가 어려운 것)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열은 단백질의 분비에 관여하며, 예건대 발현 벡터가 형질전환된 진핵세포 숙주로부터의 단백질 분비에 관여하며, 신호 서열은 후속적으로 또는 동시해 분해된다. 이후, 단백질은 당업계에 인식된 방법에 의해 세포외 매질로부터 용이하게 정제될 수 있다.
대안적으로는, 예컨대 GST 도메인을 이용하여 정제를 촉진하는 서열을 이용여, 신호 서열은 자연 또는 시트룰린화된 14-3-3 단백질, 단편, 또는 이의 융합물에 연결될 수 있다.
시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대한 항체 및 이의 단편
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 RA 를 진단하고, 예후를 확인하고, 모니터링하고/모니터링하거나 치료하는데 유용할 수 있는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편, 바람직하게는 포유동물 (예를 들어 인간) 14-3-3 단백질 에 특이적으로 결합하는 온전한 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체 분자, 예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 시트룰린화된 단편은 당업자에게 익히 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 제조될 수 있다. 이후, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마는 표준 방법 (예컨대 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)) 을 사용하여 스크리닝되어, 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 생산한다. 예를 들어, 본 발명의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 시트룰린화된 이의 단편은 비-인간 숙주, 예를 들어 당나귀, 염소, 양, 기니 피그, 햄스터, 래빗, 래트 및 마우스를 면역화하는데 사용되어, 자연 14-3-3 단백질 또는 자연 이의 단편이 아닌 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편과 반응하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 펩티드 면역원은 카르복실 말단에서 시스테인 잔기를 추가로 함유할 수 있고, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 과 같은 합텐에 접합될 수 있다. 추가의 펩티드 면역원은 술페이트화된 티로신 잔기로 티로신 잔기를 대체함으로써 생성될 수 있다. 이러한 펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 본 발명의 전장 폴리펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있거나, 대안적으로는 폴리펩티드의 항원성 펩티드 단편이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 항원성 펩티느는 7 개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고 항체가 폴리펩티드를 갖는 특정 면역 복합체를 형성하는 펩티드에 대해 레이징되도록 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 항원성 펩티드는 10 개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하겐느 15 개 이상의 아미노산 잔기, 심지어 보다 바람직하게는 20 개 이상의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 30 개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
모노클로날 항체는 재조합 DNA 기술 업계에서 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체가 확인될 수 있고 본 발명에 관련된 폴리펩티드(예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편)를 갖는 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 단리될 수 있으며, 이로써 본 발명에 관련된 폴리펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리를 단리할 수 있다 (예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 시트룰린화된 이의 단편). 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기술 및 시판되는 키트는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 항체 디스플레이 라이브러리에 사용되기 위한 특정 시약 및 방법의 예는 문헌에 나타낸 것일 수 있다. 예를 들어, "조합 항체 디스플레이" 방법은 익히 공지된 것이며 특정 항원 특이성을 갖는 항체 단편을 확인하고 단리하기 위해 개발된 것이고, 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 면역원으로 동물을 면역화한 후, 생성되는 B-세포 풀의 항체 레퍼토리가 클로닝된다. 올리고머 및 PCR 의 혼합물을 사용하는 방법은 면역글로불린 분자의 다양한 개체군의 가변 영역의 DNA 서열을 수득하기 위해 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 5' 리더 (신호 펩티드) 서열에 상응하는 혼합 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프레임웍 1 (FR1) 서열, 및 보존된 3' 불변 영역로의 프라이머는 많은 쥣과 항체로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 PCR 증폭을 위해 사용될 수 있으며; 인간 항체로부터의 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위해 유사한 전략이 사용되어 왔다.
폴리클로날 혈청 및 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 갖는 적합한 대상체를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 면역화 대상체에서 항체 역가는 표준 기술, 예컨대 고정 단백질을 사용하는 ELISA 에 의해 시간에 따라 모니터링될 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하는 항체 분자는 대상체로부터 단리될 수 있거나 배양 배지로부터 단리될 수 있고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 익히 공지된 기술에 의해 추가로 정제되어 IgG 분획을 수득할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 단편은, 당업계이 익히 공지된 방법에 따라 항체의 분해에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 면역학적으로 활성인 Fab 및 F(ab').sub.2 단편은 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생성될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 키메라, 인간화, 및 단일-사슬 항체는 둘 모두의 인간 및 비인간 부분을 포함하며, 이는 표준 재조합 DNA 기술 및/또는 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리를 사용하여 생산될 수 있다. 인간화 항체는 또한 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있으나, 이는 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있다. 예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 향하는 인간 모노클로날 항체 (mAb) 쥣과 면역글로불린 유전자 보다는 오히려 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 관심 항원을 갖는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 스플레노사이트는 인간 단백질로부터 에피토프에 대한 특이적 친화도를 갖는 인간 mAb 를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
키메라 면역글로불린 사슬을 포함하는 키메라 항체는 당업계에 공지되어 있는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 쥣과 (또는 다른 종의) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 인코딩하는 유전자는 쥣과 Fc 를 인코딩하는 영역을 제거하기 위해 제한 효소로 소화되고, 인간 Fc 불변 영역을 인코딩하는 등가의 부분이 치환된다.
항체 또는 면역글로불린 사슬은 당업계에 공지된 방법에 의해 인간화될 수 있다.
인간화 면역글로불린 사슬을 포함하는 인간화 항체는 항원 결합에 직접 연계되지 않은 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터 등가의 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 인간화 항체를 생성하는 일반적인 방법은 문헌 [Morrison (1985) Science 229: 1202-07; Oi et al.(1986) BioTechniques 4:214; Queen et al., U.S. Pat. Nos. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762] 에 의해 제공되며, 이의 전문 모두는 참조로서 포함되어 있다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 하나 이상으로부터의 면역글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산 서열을 단리하고, 조작하고, 발현하는 것을 포함한다.
이러한 핵산 서열의 원천은 당업자에게 익히 공지되어 있는 것이며, 예를 들어, 미리 결정된 표적에 대항하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 인간화 항체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 DNA 는 적절한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
인간화 또는 CDR-그라프트된 항체 분자 또는 면역글로불린이 CDR 그라프트 또는 CDR 치환에 의해 제조될 수 있으며, 이때, 1 개, 2 개 또는 면역글로불린 사슬의 모든 CDR 이 대체될 수 있다. 예를 들어 다음 문헌을 참조한다: U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321 :552-25; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141 :4053-60; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539 (이의 전문이 본원에 참조로서 포함되어 있음). Winter 는 본 발명의 인간화 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 CDR-그라프트 방법을 기술하고 있다 (UK Patent Application GB 2188638 A; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539) (이의 전문이 참조로서 포함되어 있음). 특정 인간 항체의 CDR 전부는 비인간 CDR 로 대체될 수 있는 CDR 의 오직 일부, 또는 비인간 CDR 의 적어도 일부로 대체될 수 있다. 미리 결정된 항원에 인간화 항체가 결합하는데 요구되는 CDR 의 수를 대체하는 것만이 필요하다.
인간 항체는 항원에 의한 도전에 반응하여 동물의 내인성 항체보다 완전히 인간 항체를 제조하는 것으로서 변형된 트랜스제닉 비인간 동물을 사용하여 추가로 제조될 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 94/02602 를 참조한다. 비인간 숙주에서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 내인성 유전자가 실격되었으며, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 활성좌조 자리가 숙주의 게놈에 삽입된다. 예를 들어, 인간 유전자는 예를 들어, 필수 인간 DNA 분절을 함유하는 효모 인공 크로모좀을 사용하여 혼입된다. 원하는 변형을 모두 제공하는 동물은 변형의 보충 전체 보다 더 적게 함유하는 중간 트랜스제닉 동물의 교잡에 의해 자손으로서 수득된다. 이러한 비인간 동물의 바람직한 구현예는 마우스이며, PCT 공보 WO 96/33735 및 WO 96/34096 에서 개시된 바와 같이 XENOMOUSE™ 로서 지칭된다. 이러한 동물은 완전한 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생산한다. 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마와 같은, 동물 유래 불멸화 B 세포로부터, 또는 대안적으로는 폴리클로날 항체의 제조와 같이 관심 면역원으로 면역화한 후 동물로부터 직접 수득될 수 있다. 또한, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 인코딩하는 유전자는, 예를 들어, 단일 사슬 Fv 분자와 같은 항체 유사체를 수득하기 위해 추가로 별형될 수 있거나, 또는 항체를 직접 수득하기 위해 회수되고 발현될 수 있다.
항체의 다른 부분, 예를 들어 불변 영역의 결손, 첨가 또는 치환에 의해 변형된 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체는 본 발명의 범주 이내이다. 비제한적 예로서, 불변 영역을 결손시키거나, 불변 영역을 또다른 불변 영역, 예를 들어 항체의 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키는 불변 영역, 또는 또다른 종 또는 항체 부류로부터의 불변 영역으로 대체하거나, 불변 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 예를 들어 글리코실화 부위, 효과기 세포 기능, Fc 수용체 (FcR) 결합, 보충 고정, 등의 수를 변경하기 위해 변형함으로써, 항체는 변형될 수 있다.
항체 불변 영역을 변경하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변경된 기능, 예를 들어 세포 상의 FcR 또는 CI 보충 성분과 같은 효과기 리간드에 대해 변경된 기능을 갖는 항체는 상이한 잔기를 갖는 항체의 불변 부분에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, EP 388,151 Al, U.S. Pat. No. 5,624,821 및 U.S. Pat. No. 5,648,260 참조, 이의 내용이 본원에 참조로서 포함되어 있음). 쥣과 (또는 다른 종) 면역글로불린에 대해 유사한 유형의 변경이 이들 기능을 감소시키거나 제거하기 위해 적용될 수 있으며, 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 측쇄 상에서 적합한 기능성을 갖는 잔기(들)로 특정 잔기(들)을 대체함으로써, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트와 같은 하전된 기능기를 도입함으로써, 또는 방향족 비극성 잔기 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌을 도입함으로써, FcR (예를 들어, Fc 감마 Rl), 또는 Clq 결합을 위해 항체 (예를 들어, IgG, 예컨대 a 인간 IgG) 의 Fc 영역의 친화도를 변경하는 것이 가능하다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,624,821 참조).
진단 방법, 예후적 방법 및 치료 방법, 및 치료 모니터링
하나의 양태에 있어서, 본 발명은 시트룰린화된 14-3-3 에 대항하는 자가항체를 포함하는 질환 및 병태를 진단하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 류마티스 관절염의 존재 또는 부재, 또는 환자 예후는, (a) 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 이용하여 포유동물 대상체로부터 수득되는 생물학적 시료를 접촉시키는 것; (b) 시료 중, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 자가항체의 수준을 검출하는 것; 및 (c) 예를 들어, 자연 또는 비-시트룰린화된 14-3-3 단백질의 수준을 적합한 대조군과 이러한 항체에서의 수준을 비교함으로써 측정될 수 있다.
상기 방법은 단백질에 대항하여 자가항체를 검출하기 위해 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 이용하는 것을 포함한다. 시료 중 항체를 검출하기 위해 단백질을 이용하기 위한 당업자에게 공지된 다양한 검정 포맷이 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 을 참조한다. 비제한적 예로서, 시트룰린화된 14-3-3 에 대항하는 자가항체를 검출하는 것은 예를 들어 면역프레시피타티온, ELISA, 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학, 면역형광, "샌드위치" 면역검정, 면역라디오메트릭 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 제자리 면역검정, 침전 반응, 응집 검정, 보충 고정 검정, 단백질 A 검정, 면역전기이동 검정, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석, 표지면역검정, 스트립 시험, 케어 시험 포인트 등을 이용함으로써 수행될 수 있다. 당업자는 생물학적 시료 중 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대항하는 자가항체의 수준, 또는 이를 갖는 면역 복합체에 대항하는 자가항체의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 자동 검출 검정이 이용된다. 자가 면역검정의 방법은 미국 특허 제 5,885,530, 4,981,785, 6, 159,750, 및 5,358,691 호 (이의 각각은 본원에 참조로서 포함되어 있음) 에서 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분석 및 결과 제시 또한 자동화되어 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 있어서, 관절염 병태에 상응하는 단백질 시리즈의 존재 또는 부재를 기초로 한 예후를 생성하는 것이 이용되며, 이는 시트룰린화된 14-3-3 단백질을 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 검정은, 시료의 나머지로부터 시트룰린화된 14-3-3 단백질(들)에 특이적으로 결합하는 자가항체에 결합하고 이를 포획하기 위해 고형 지지체 상에 고정된 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 사용하는 것을 포함한다. 이후, 결합된 자가항체는 항체/단백질 복합체에 특이적으로 결합하고 리포터 기를 함유하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 시약은 예를 들어, 항-인간 항체와 같은 자가항체에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함할 수 있다.
고형 지지체는 당업계에 공지된 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 고형 지지체는 미세적정 플레이트 또는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적합한 막에서 시험 웰일 수 있다. 대안적으로는, 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예컨대 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 지지체는 또한 예를 들어 미국 특허 제 5,359,681 호에 개시된 바와 같은 자석 입자 또는 광학 섬유 센서일 수 있다. 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 당업계에 공지되어 있는 다양한 기술을 사용함으로써 고형 지지체 상에 고정될 수 있으며, 이는 특허 및 과학 문헌에 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 문맥에 있어서, 용어 "고정" 은 비공유 조합, 예컨대 흡착, 및 공유 부착을 둘 다 지칭한다 (이는 항체 사이의 직접적인 연결일 수 있고 지지체 상의 기능기일 수 있거나 가교제에 의한 연결일 수 있음). 미세적정 플레이트에서 웰로의 흡착에 의한 고정 또는 막으로의 흡착에 의한 고정이 바람직하다. 이 경우, 흡착은 시간의 적합한 양에 대해 고형 지지체를 갖는 적합한 완충제에서 항체를 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하나, 이는 전형적으로 약 1 시간 및 약 1 일 사이이다. 하나의 구현예에 있어서, 스트렙타비딘을 갖는 미세적정 플레이트는 비오티닐화된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편과의 결합에 사용된다.
고형 지지체로 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 공유적으로 부착하는 것은 일반적으로, 지지체 및 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편 둘 모두와 반응하는 이중기능성 시약과 지지체를 우선 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이후, 비경쟁적 "샌드위치" 기술을 사용하여 검출될 수 있으며, 여기서 자가항체에 대해 라벨링된 리간드는 세척된 고체 상에 노출된다. 대안적으로는, 경쟁적 포맷이 시료에 대해 라벨링된 항체의 도입 전에 의지하며 라벨링된 형태 및 라벨링되지 않은 형태가 고체 상으로의 결합을 위해 경쟁한다. 이러한 기술은 익히 공지되어 있으며 특허 문헌 및 과학 문헌 둘 모두에 상세히 기술되어 있다. 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: 3,791 ,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876. 효소-연결된 면역흡착제 검정 (ELISA) 방법은 미국 특허 제 3,791 ,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262; 및 4,034,074 호에 상세히 기술되어 있다. ELISA 검정은 자가항체의 매우 낮은 역가를 검출한다.
자가항체는 고체상 방사면역검정 (RIA) 에 의해 검출될 수 있다. 고체 상은 고정 리간드으로의 결합에 대해 경쟁하는 방사선 라벨링된 항체의 존재 하에서 혈청 시료에 노출된다. 이러한 검정에서, 고체 상에 결합된 방사선표지의 양은 혈청 시료 중에 초기에 존재하는 자가항체의 양에 대해 정반대로 관련되어 있다. 고체 상의 분리 후, 비특이적으로 결합된 방사선라벨은 세척에 의해 제거되고, 고체 상에 결합된 방사선표지의 양이 측정도니다. 결합된 방사선표지의 양은 차례로 시료 중에 초기에 존재하는 자가항체의 양에 관한 것이다.
하나의 구현예에 있어서, 검정은 플로우-관통 또는 스트립 시험 포맷에서 수행되며, 이때 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편은 니트로셀룰로오스와 같은 막 상에서 고정된다. 플로우-관통 시험에 있어서, 시료 내의 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대한 자가항체는, 시료가 막에 접촉할 때 고정된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 결합한다. 이후, 제 2 의 라벨링된 결합제가 막에 접촉하는 것을 함유하는 용액으로서 면역 복합체에 결합한다. 이후, 결합된 제 2 결합제의 검출은 상기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 스트립 시험 포맷에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편이 결합되는 막의 하나의 말단은 시료를 함유하는 용액에 함침된다. 시료는 예를 들어 자가항체에 대해 제 2 결합제를 함유하는 영역을 통해 막을 따라 이동하고, 고정된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편의 영역에 대해 제 2 결합제를 함유하는 영역을 통해 막을 따라 이동한다. 고정된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편의 영역에서 제 2 결합제의 농도는 관절염 병태, 또는 환자 예후, 등의 존재를 나타낸다. 전형적으로, 라인과 같은 패턴을 생성하는 부위에서 제 2 결합제의 농도는 가시적으로 판독할 수 있다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 나타낸다. 일반적으로, 상기 논의된 포맷에서 막 상에 고정된 결합제의 양은, 생물학적 시료가 검정에서 양성 신호를 생성하는데 충분한 자가항체의 양을 함유할 때 가시적으로 식별가능한 패턴을 생성하도록 선택된다. 이러한 검정에서 사용되기 위해 바람직한 결합제는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 및 이의 단편이다. 이러한 시험은 전형적으로 생물학적 시료의 매우 소량으로 수행될 수 있고 케어 지점에서 이는 정량화될 수 있다.
시료 중 자가항체의 존재를 검출하는 것 외에도, 많은 방법이 자가항체의 수준을 정량적으로 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 방법에서, 항원은 액체 상에서 자가항체와 반응하고, 자가항체는 면역침전 기술에 의해 정량적으로 측정된다. 예를 들어, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편 (즉, 전장 이성질체 또는 항원성 단편) 은 검출가능하게 라벨링될 수 있다 (예를 들어, 동위원소 또는 효소를 가짐). 폴리펩티드는 합성 동안 라벨링될 수 있거나 (예를 들어, 시험관내 변역 시스템 또는 세포성 발현 시스템에 35S-메티오닌을 첨가함으로써), 또는 합성 후 라벨링될 수 있다. 먹출가능한 항원은 액체 생물학적 시료 (예를 들어, 혈청) 에 직접 첨가되어 면역 복합체를 형성한다. 면역 복합체는, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 침전될 수 있다. 면역 복합체는 제 2 항체 (예를 들어, 염소 항-인간 면역글로불린) 를 이용하여 단리될 수 있거나 고형 지지체 (아가로오스 또는 세파로오스 비드) 에 결합된 다른 종류의 결합 분자 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G) 를 이용하여 단리될 수 있다. 면역침강물은 액체 시료로부터 분리된 후 수회 세척되고 검출가능한 라벨의 강도에 대해 시험된다 (예를 들어, 방사선활성). 따라서, 시료 중 존재하는 자가항체는 검출되고 정량화될 수 있다. 임의적으론, 라벨링되지 않은 폴리펩티드는 또한 자가항체으로의 결합을 위해 라벨링된 폴리펩티드와 경쟁하기 위해 첨가될 수 있다.
본 발명의 진단 방법은 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질과 자가항체 사이에 형성된 면역 복합체를 순환시키는 대상체에서의 검출에 관한 것이다. 위에서 고찰된 방법은 이러한 면역 복합체의 검출을 위해 용이하게 개질될 수 있다. 예를 들어, 고정된 결합 분자 (예, 비드에 결합된 단백질 A 또는 단백질 G)는 액체 생물학적 시료에 첨가될 수 있다. 액체 상으로부터 분리 후, 결합 분자에 의해 포착된 면역 복합체는 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있고, 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 대항하는 다양한 항체에 의해 탐침될 수 있다. 포착된 항원은 또한 직접적인 아미노산 서열 분석에 적용될 수도 있다. 많은 분석이 예를 들면 Tomimori-Yamashita 등, Lepr Rev, 70(3):261-71, 1999 (antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay); Krapf 등, J Clin Lab Immunol, 21(4):183-7, 1986 (fluorescence linked immunosorbent assay); Kazeem 등, East Afr Med J, 67(6):396-403, 1990 (laser immunonephelometry); and Rodrick 등, J Clin Lab Immunol, 7(3):193-8, 1982 (Protein A-glass fiber filter assay, PA-GFF, and polyethylene glycol insolubilization assay)에 기재된 바와 같이 대상체에서 순환하는 면역 복합체를 검출하기 위해 일상적으로 실시된다. 이러한 잘 알려진 분석 각각은 본 발명의 방법을 위해 순환하는 면역 복합체를 감출하기 위해 사용될 수 있다.
임상적 감도를 개선하기 위해, 다수의 마커가 주어진 시료 내에서 분석될 수 있다. 특히, 하나 이상의 관절염의 다른 마커, 또는 예후 지표 등은 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 대한 자가항체와 조합되어 평가될 수 있다. 이러한 다른 마커는 단백질이나 핵산일 수 있다. 바람직한 구현에서, 다른 마커 중 하나 이상은 MMP 단백질 또는 핵산 또는 관절염에 대한 지표로서 통상적으로 사용되는 다른 인자, 예, 항-CCP, 항-RF, CRP, SAA, IL-6, SlOO, 오스테오폰틴, RF, MMP-1, MMP-3, 히알루론산, sCD14, 뼈의 혈관생성 마커 및 제품, 연골 또는 활막 신진 대사 (예: CTX-I 및 CTX-II) 등이다. 기준 서열에 기초하여 핵산을 단리하고 분석하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 환자 시료에서 관심있는 단백질을 검출하는 방법과 마찬가지이다.
당업자는 본 발명의 방법을 위한 생물학적 시료에서 순환성 면역 복합체를 검출하기 위해 사용될 수 있는 익히 공지된 검정 각각을 인식할 것이다. 유사하게, 본원에 기술된 바와 같은 진단, 예후 및 치료진단 검정에서 임상 시험 절차의 일부로서, 14-3-3 단백질의 어느 부위가 시트룰린화되는지 그리고 얼마나 많은 부위가 시트룰린화되는지 여부 및/또는 얼마나 많은 14-3-3 단백질이 시트룰린화되는지를 결정하기 위해, 생물학적 시료 중 14-3-3 단백질의 시트룰린화 상태를 모니터링하기 위해 본 발명에서 개시된 시트룰린화된 14-3-3 단백질 (및 이의 단편) 에 대한 항체를 사용하여, 익히 공지되어 있는 검정법을 사용할 수 있다. 당업자는 검정 포맷, 진단, 예후 및 치료진단 검정 각각을 어떻게 적합화시키는지 여부를 익히 인지하고 있을 것이며, 생물학적 시료 중 14-3-3 단백질의 시트룰린화 상태를 결정하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대해 항체를 이용하기 위한 키트를 인지할 것이다.
조합 분석은 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 마커의 선택은 최적의 감도를 초래하는 조합을 결정하기 위해 정기 실험에 기초할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 관절염 상태를 진단하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 관절염 상태는 환자의 활액 액체, 활액 관절, 혈액, 플라즈마, 또는 혈청에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체의 존재에 기초하여 환자에서 검출될 수 있다. 다시 말하자면, 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대한 자가항체는 관절염을 표시하는 마커로 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 류마티스 관절염을 진단하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 환자의 활액 플루이드, 활액 관절, 혈액, 혈장 또는 혈청에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체의 존재를 기초로 하여, 환자에서 류마티스 관절염이 검출될 수 있다. 즉, 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대한 자가항체는 류마티스 관절염을 나타내는 마커로서 사용될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질은 14-3-3 에타이다.
또한, 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체, 또는 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체의 상대적 수준의 존재는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편의 사용을 통해 결정되는 바와 같이 그것이 약화된 형태로 진행되기 전에 초기-단계 관절염의 예후적 지표일 수 있다. 초기 예후 또는 진단의 장점은 치료 처방의 조기 구현이다.
대상체에서 관절염 상태의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 대상체로부터 생물학적 시료 내의 시트룰린화된 14-3-3 에 대항하는 자가항체 또는 그와의 면역 복합체의 수준은 일반적으로 정상적인 대조군에 상응하는 자가항체/면역 복합체에 비교될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 정상적인 대조군은 관절염 없는 환자로부터 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대항하는 자가항체, 또는 그와의 면역 복합체의 평균 수준으로부터 설정된다. 대안의 구현예에서, 정상적인 대조군 값은 수신기 운영자 곡선(Receiver Operator Curve)을 사용하여 결정될 수 있으며, 예를 들어 Sackett 등의 방법, Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7 참조. 간단히, 이 구체에서, 대조군 값은 진단 검사 결과에 대한 각각의 가능한 컷-오프 값에 상응하는 진정한 긍정적인 비율 (즉, 감성)과 거짓된 긍정적인 비율 (100% - 특이성)의 쌍들의 플롯으로부터 결정될 수 있다. 상단 왼쪽 코너 (즉, 가장 큰 영역을 포위하는 값)에 가장 가까운 플롯에 대한 대조군 값은 가장 정확한 값을 제공하고, 이 방법에 의해 결정된 값보다 높은 신호를 생성하는 시료를 제공한다. 대안으로, 대조군 값은 거짓된 긍정적인 비율을 최소화시키기 위해 플롯을 따라 좌측으로 이동할 수 있거나, 또는 거짓된 부정적인 비율을 최소화시키기 위해 오른쪽으로 이동할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 결정된 대조군 값보다 높은 신호를 발생하는 시료가 관절염에 대해 긍정적인 것으로 간주된다. 대안적으로는, 대조군 값은 플롯에 따라 거짓 양성 비율을 최소화하기 위해 좌측으로 이동될 수 있거나, 거짓 음성 비율을 최소화하기 위해 우측으로 이동될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법에서 측정된 대조군 값 보다 높은 신호를 생성하는 시료는 관절염에 대해 양성인 것으로 고려된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 관절염의 서브타입들 사이의 차별화를 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 이 방법은 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체, 또는 이들과의 면역 복합체의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 환자에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/면역 복합체의 수준은 관절염의 서브타입이 공지 및/또는 이미 확립된 대상체로부터 시료의 그것과 비교된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 관절염에 적용된 치료에 대한 환자의 반응 잠재력을 결정하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 이 방법은 환자 시료에서 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체, 또는 그와의 면역 복합체의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 환자 시료에서 시트룰린화된 14-3-3에 대한 자가항체/면역 복합체의 수준은 치료에 반응하는 능력이 알려져 있는 대상체에서 시료의 그것과 비교된다. 비염증 대상체로부터의 시료 및/또는 다른 염증성 환자로부터 시료에 비해 첫 환자 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/그와의 면역 복합체의 비교적 높은 수준은 첫 번째 환자가 잘 알려진 치료, 예를 들어 항-TNF, 메토트렉세이트, 미노사이클린, 하이드록시클로로퀴논, 술파살라진, 아자티프린, 항-IL-1, 항-IL-6r 등과 같은 질병-개질된 항-류마티스 약물 (DMARD) 치료에 바람직한 후보임을 나타낼 수 있다. 반대로, 다른 염증 환자로부터의 시료에 비해 첫 환자 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/그와의 면역 복합체의 상대적으로 낮은 수준은 첫 번째 환자가 잘 알려진 치료를 위한 바람직한 후보가 아니고 특히 그 수준은 비염증성 대상체로부터의 시료의 그것에 가깝다.
다양한 유형의 관절염 치료를 위한 계획은 당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 류마티스 관절염으로 진단된 환자는 불편을 완화하고 염증을 줄이기 위해, 초기 비스테로이드성 항염증성 투약 (NSAID)으로 처방될 수 있다. 기타 치료 계획, 예를 들어, 스테로이드성 항염증성 약물 (SAID 예: 코르티솔, 프레드니손), 사이클로옥시게나제 2 특이적 억제제 (CSI), 글루코코르티코이드, 및/또는 예를 들어, 표준 질병-개질된 항-류마티스 약물 (DMARD), 예를 들어, 항-TNF-알파 중화 작용제, 면역억제 약물 (예, 시클로스포린, 아자티오프린, 시클로포스파미드), 항생제, 말라리아 예방약 및 세포 독성 약물 (예, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드)를 포함할 수 있다. 치료 계획은 또한 유리하게는 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질을 직접적으로 표적화하는 것들을 포함할 수 있고, 예를 들어, PCT/CA2008/002154 참조. 특정 약물의 복용량 또는 사례에 대한 상세한 설명은 당분야의 숙련된 기술을 가진 사람들에게 알려져 있으며, 예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine 15th ed. BRAUNWALD et al eds. McGraw-Hill or "The Pharmacological basis of therapeutics" 10th edition. 5 HARDMAN HG., LIMBIRD LE. editors. McGraw-Hill, New York, and in "Clinical Oncology" 3rd edition. Churchill Livingstone/ Elsevier Press, 2004. ABELOFF, MD. editor 에서 찾을 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 관절염의 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 이 방법은 환자 시료에서 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체 또는 그와의 면역 복합체의 수준을 결정하고, 치료 중인 환자에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/그와의 면역 복합체의 수준을 모니터링하는 것을 포함한다.
시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/그와의 면역 복합체의 존재 또는 상대적 수준은 환자의 관절염 상태와 연관될 것으로 알려진 다른 단백질의 존재 또는 상대적 수준과 상관 관계일 수 있다. 관절염 상태와 연관될 것으로 잘 알려진 단백질의 비제한적인 예는 종양 괴사 인자, 시트룰린화된 14-3-3 단백질과 같은 염증성 시토킨 및 MMP-1 또는 MMP-3 등과 같은 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)를 포함한다. 적어도 25개의 상이한 MMP가 확인되었다. 환자 시료에서 하나 이상의 염증성 시토킨 및/또는 MMP 중의 하나 이상의 검출과 조합된 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체의 검출은 관절염을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 환자 시료에서 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 이소형, 하나 이상의 MMP 및/또는 하나 이상의 염증성 시토킨과 조합하여 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/면역 복합체의 존재 또는 상대 수준은 관절염이 쇠약 형태로 진행되기 전에 초기-단계 관절염의 예후 지표로서 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 것은 관절염 상태를 평가하기 위한 키트이다. 이러한 키트는 통상적으로 진단 및/또는 예후 분석을 수행하는 데 필요한 두 개 이상의 구성 성분을 포함한다. 이 구성 성분들은 화합물, 시약, 용기, 지시 사항 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들어, 키트 내의 하나의 용기는 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 키트는 항체 결합의 직접 또는 간접적 검출에 적합한 리포터 그룹을 함유하는 상기된 바의 검출 시약을 함유할 수도 있다.
따라서, 환자 시료에서 시트룰린화된 14-3-3 에 대한 자가항체/그와의 면역 복합체 및 임의로 다른 마커, 예를 들어, MMP의 존재를 검출하기 위한 키트가 본원에 기재되어 있고, 이 키트는 여러 가지 관절염 상태를 진단 또는 차별화하는데 적합한 진단 또는 예후 결과를 제공하는 데 유용하다. 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 및/또는 자가항체의 존재가 연루될 수 있는 추가의 징후는 또한, 예를 들어, 심혈관계 및/또는 신경퇴행성(neurodegenerative) 장애를 포함한다. 키트는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, 이는 예를 들면 방사성 활성 라벨, 발광 라벨, 형광 라벨, 효소 등에 의해 임의로 검출 가능하게 표지될 수 있다. 단백질을 검출가능하게 표지하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 그러한 키트는 관절염의 다른 마커에 대해 특이적인 검출 시약, 예를 들면 항-CCP, 항-RF, CRP, SAA, IL-6, SlOO, 오스테오폰틴, RF, MMP-1, MMP-3, 히알루론산, sCD14, 뼈의 혈관신생 마커 및 제품, 연골 또는 활막 대사 (예, CTX-I 및 CTX-II) 등을 추가로 포함할 수 있다. 이 키트는 면역학적으로 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대한 자가항체의 검출에 필요한 다른 2차 시약, 예를 들면, 표지된 이차 항체 (예: 항-인간 항체), 발색성 또는 플루오로겐성 시약, 중합 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 특정 질병 상태의 맥락에서 그러한 자가항체의 수준을 정량화 및/또는 평가하기 위한 적절한 비교 표준을 포함하여 진단 또는 예후 목적을 위한 키트를 사용하기 위한 지침은 또한 유리하게는 인쇄된 형태로 및/또는 적합한 매체 상에 기록될 수 있다.
실시예
RA 에서 14-3-3η 가 활액 공간으로 유리되기 때문에 (여기에 PAD 효소가 존재함), 본 발명자들은 14-3-3η 가 RA 진단에 사용될 수 있는 시트룰린화 표적인지 아닌지를 조사하였고, 만약 그러한 경우, 시트룰린화된 14-3-3η 또는 단편이 항-CCP 음성 RA 환자를 식별하기 우해 사용될 수 있는지 여부를 조사하였다. 14-3-3η 상의 시트룰린화 부위의 확인은 3 개의 단계를 포함한다: 1) 실리코 예측, 2) 시험관내 결정 및 3) 임상 표본을 이용한 비준 및 확인.
실시예 1 : 시트룰린화 부위의 실리코 확인
추정 시트룰린화 부위를 나타내는 아르기닌 (R) 부분은 하기를 기초로 하여 확인되었다: 1) 자연 3D 단백질 배치에 관한 "R" 의 위치; 2) "R" 의 PAD 효소의 접근가능성, 및 3) 서열 플랜킹 "R". 5 개의 추정 시트룰린화 부위를 상응하는 "R": 4, 12, 19, 61 및 227 에 대해 확인하였다.
실시예 2: 시트룰린화 부위의 시험관내 결정
시험관에서, 시트룰린화를 수행하였으며 이로써 재조합 인간 14-3-3 에타를 재조합 인간 PAD2 또는 PAD4 으로 공동-인큐베이션하였고, 이들 2 개의 아이소형태는 RA 에 가장 관련이 깊은 2 개인 것으로 보고되었다.
간단하게 말하면, PAD2 (MQ16.201) 및 PAD4 (MQ16.203) 는 ModiQuest Research 로부터 야기시켰다. 효소를 100μl의 PAD 버퍼 (0.1 M Tris HC1, pH 7.4, 5mM DTT, ImM PMSF, 10μg/ml 아프로토닌, 10μg/ml 루펩틴 및 10μg/ml 펩스타틴을 갖는 lOmM CaCl2) 에 추가로 희석시켜 PAD2 의 저장 농도를 80mU/μl 로 그리고 PAD4 의 저장 농도를 82.5mU/μl 로 만들었다.
전장 재조합 14-3-3 에타의 10 μg 을 PAD2 (8mU) 또는 PAD4 (8.2mU) 중 하나로 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 PAD 버퍼를 이용하여 100 μl 로 조정하고 37℃ 에서 2h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 25 μl 의 4X Lammelli 버퍼를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분해하고 14-3-3 에타에 상응하는 밴드를 잘라냈다. 잘라낸 밴드를 겔로부터 용리하고, 트립신화하고 이어서 Fourier Transform Mass Spectrometry 를 이용하여 분석하여 다른 곳에서 기술된 바와 같이 탈이민화된 부위를 확인하였다. PAD2 및 3 및 PAD4 를 갖는 추정 시트룰린화 부위 4개에 대한 결과를 산출하고, 결과를 표 4 에 나타냈다.
[표 4] 시험관 내에서 측정된 바와 같은 14-3-3η 에 대한 시트룰린화 부위
Figure pct00005
실시예 3 : 임상 시료를 사용하는 시트룰린화된 14-3-3 에타를 향하는 항체의 검출
시험관 내에서, 시트룰린화는 실시예 2 에서 기술된 바와 같이 수행되었고, 96-웰 플레이트를 재조합 14-3-3 에타의 시트룰린화된 또는 비-시트룰린화된 형태 중 하나로 코팅하였다. 항-CCP 양성 및 음성 환자에서 14-3-3 에타의 자연 또는 시트룰린화된 형태 중 하에 대한 인간 자가 항체 반응을 항-인간 항체를 이용하여 정량화하였다.
이들 신규한 자가항체가 항-CCP 음성 RA 환자에서 검출될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 건강한 대조군에 비해 차등적으로 발현되는, 둘 모두의 비- 시트룰린화된 및 시트룰린화된- 14-3 -3 에타에 대한 반응성을 30 명의 항-CCP 음성 RA 환자 및 30 명의 확인된 항-CCP 음성 대조군의 건강한 사람에서 측정하였다. 단위 (U) 에서 발현되는 평균 및 중간 자가항체 수준을 평가하였고 상응하는 t-시험 및 Mann-Whitney U-시험을 사용하여 그룹 사이의 그리고 rfnq 내의 차이점을 결정하였다. ROC 곡선 (AUC) 하의 영역은 진단 유틸리티 평가에 대해 생성시켰고 다양한 항-시트룰린화된 14-3-3 에타 컷오프에 대해 가능성 비율 (LR) 을 결정하였다.
도 1 은, 비-시트룰린화된 14-3-3 에타와 비교하여, 3 명의 항-CCP 양성 RA 환자 중 2 명에서 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대한 25X 까지의 높은 반응성이 관찰되었으며, 이는 RA 에서 14-3-3 에타의 시트룰린화된 형태에 대한 자가항체의 발현의 첫번째 시간을 나타내는 것이다. 항-CCP 음성 RA 그룹 내에서, 자연 14-3-3 에타에 비해 시트룰린화된 14-3-3 에타에 대해 현저하게 높은 반응성이 관찰되었다 (1943U 대 395U, p=0.01). 반응성에서의 현저한 차이가 건강한 그룹 내에서는 관찰되지 않았다. 도 2 는 시트룰린화된 14-3-3 에타 항체 발현이, 건강한 대조군에 대한 155U (122U) 및 100U (45-564U) 에 비해, 1943U (3045U) 및 306U (68-8982U) 의 평균치 (SD) 및 중간치 (min-max) 를 이용하여 항-CCP 음성 RA 환자에서 더욱 현저히 높음을 나타낸다(p<0.002). 건강한 대조군에 비해 항-CCP 음성 RA 환자에서 항-시트룰린화된-14-3-3 에타 항체의 차등적 발현에 대해 상응하는 ROC AUC 는 0.79 였다 (95% CI 0.68-0.91; p<0.0001). 320U 의 컷오프에서, 특이성 및 감도는 90% 및 50% 였고 439U 에서 5 에서 14 로 증가하는 LR 양성을 전달하는 상응하는 특이성은 97% 이고 감도는 47% 였다.
Figure pct00006
실시예 4: 임상 샘플을 사용하는 시트룰린화 부위의 확인
14-3-3 에타는 14-3-3 에타 단백질에 대해 양성인 임상 시료로부터 면역침강반응시켰고 면역침강된 단백질을 SDS-PAGE 로 분해하고 14-3-3 에타에 상응하는 밴드를 잘라냈다. 잘래난 밴드를 겔로부터 용리하고, 트립신처리하고 이어서 Fourier Transform Mass Spectrometry 를 이용하여 분석하여 단백질 상에서 탈이민화된 부위를 확인하였다.
임상적으로 관련된 14-3-3 에타 시트룰린화 부위의 선택
가장 관련되어 있는 14-3-3 에타 시트룰린화 부위를 확인하기 위해, 아르기닐화된 또는 시트룰린화된 부분 중 하나를 포함하는 펩티드를 사용하여, 아르트리티드에 발병 환자 또는 건강한 개인을 구별하고 단백질의 둘 모두의 비-시트룰린화된 형태를 구별하기 위해 사용될 수 있는 14-3-3 에타 상에서의 가장 관련된 시트룰린화 부위를 스크리닝하고 선별하였다.
2 개의 구분되는 접근법을 사용하여, 임상 시료 중 14-3-3 에타 발현 수준을 비교하는 것, MRM/LC-MS 및 ELISA 에 의한 측정은, 발현에서의 변화가 시트룰린화에 기여할 수 있음을 나타내며, 이는 시트룰린을 생성하는 아르기닌의 탈이민화가, 단백질이 시트룰린화되었을 때 트립신이 절단되지 않기 때문에 잘못 절단되는 것을 초래했음을 나타내며, 표 5 를 참조한다. 구체적으로는, 시료 1 내지 6 중에서 14-3-3 에타 단백질의 높은 수준은 ELISA 에 의해 검출될 수 있으며, 시료 7 내지 12 에 비해 질량분석법으로 측정시 무시할만한 수준을 갖는 것으로 보인다. 질량분석법을 이용하여, 시료를 트립신화되고 14-3-3 에타 수준은 특정 펩티드 질량의 결과로서 피크 강도의 측정을 통해 정량화되고, 이의 펩티드는 "AV TEL EPLS ED" 이며, 이는 시트룰린화 부위로서 본원에 기술된 Arg-42 의 옆 잔기이다. Arg-42 에 대한 특정 항체의 시트룰린화는 시료 1 내지 12 에서 ELISA 에 의해 시험되어 Arg-42 가 임상적으로 관련된 시트룰린화 부위임을 증명할 것이다.
[표 5]
Figure pct00007
실시예 5: 진단, 예후 및/또는 치료 모니터링
임상 샘플에서 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 대한 자가항체의 검출
도 1 에 제시된 데이터는 전장 14-3-3 에타의 시트룰린화된 형태에 대해 자가항체의 검출이, 항-CCP 음성인 환자를 식별하고 이에 따라 혈청반응 음성 RA 환자에서 항-CCP 시험을 보완하는데 유용함을 나타낸다. 도 2 에 제시된 RA 대 건강한 개인에서 차등 발현은, 항-시트룰린화된 14-3-3 에타 자가항체가 RA 환자에서 보다 높음을 나타내고 이는 RA 에 대해 매우 특이적일 것이다. 시트룰린화된 14-3-3 에타 단편 (이는 상이한 시트룰린화된 부위를 가짐) 은 각각의 상이한 부위에 대해 자가항체를 검출하는데 사용될 것이다. 부위 특이적 자가항체에 대한 이러한 검출은 전장 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 보다 RA 에 대해 더욱 가능성이 높다.
임상 샘플에서 14-3-3 단백질 의 시트룰린화 상태의 결정
환자가 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질에 대해 자가항체에 대해 양성으로 측정된 경우, 2 개의 파라미터를 평가하기 위해, 단백질의 시트룰린화 상태는 둘 모두의 전장 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질 또는 시트룰린화된 단편 또는 둘 중 하나에 대해 레이징된 모노클로날 항체를 사용하여 평가될 것이다:
1) 얼마나 많은 단백질이 시트룰린화되는가?
2) 단백질 상에서 어느 부위가 시트룰린화되는가? 및/또는 얼마나 많은 부위가 시트룰린화되는가?
시트룰린화된 14-3-3 에타 자가항체의 역가는 이 자신에 대해 시험될 것이며, 단백질의 시트룰린화 상태 및 14-3-3 에타 혈청 단백질 수준에 관해 시험될 것이다. 하기 표 6 은 가능한 결과를 규정한다.
항-시트룰린화된 14-3-3 에타 자가항체 수준 14-3-3 에타 단백질 수준 예후
고 고 안좋음
저 양호
저 고 안좋음
저 양호 또는 14-3-3 에타가 질병 진행에 핵심적이지 않음
요법 반응 및 모니터링을 위해, 항-시트룰린화된 14-3-3 에타 자가항체의 높은 수준은 다른 것 보다는 특정 요법의 사용에 관련될 수 있다. 또한, 시트룰린화된 단백질의 보다 높은 % 가 더욱 현저한 질병 버든과 관련되어 있는 것으로 예측된다. 또한, 상이한 시트룰린화 부위는 단백질에 대한 상이한 생물학적 활성을 부여할 수 있는 것으로 예상되며 이에 따라 상이한 임상 결과가 연계된다. 이러한 정보는 요법 반응을 모니터링하기 위해 특정 환자에 대해 최선인 요법 유형을 결정하는데 보조적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 높은 역가 및/또는 높은 시트룰린화 상태는 펩티딜 아르기닌 디이미나아제를 직접 표적으로 하는 리툭시마브 또는 저해제와 같은 B-세포 저해제를 사용하는 치료에 유용하다. 치려 전 및 후의 수준을 측정함으로써 결과를 모니터링하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 수준이 감소하는 경우, 환자는 약물로부터 이점을 수용할 수 있으며, 즉 요법에 반응하는 반면, 수준이 변화하지 않거나 증가하는 경우, 치료학적 투여량이 증가될 필요성이 있거나 요법 종류를 변경해야 할 필요성이 있는 것이다.
본원에 참조로 된 모든 특허 및 특허 공보는 참조로서 본원에 포함되어 있다.
상기 기술로부터 당업자는 특정 변형 및 개선을 가할 것이다. 본원의 간결함 및 판독성을 위해 생략된 이러한 변형 및 개선은 하기 특허청구범위의 범주 이내이다.
SEQUENCE LISTING <110> Augurex Life Sciences Corp. Marotta, Anthony <120> Antigens Derived from Citrullinated 14-3-3 and Uses Thereof in the Diagnosis of Rheumatoid Arthritis <130> 177073/PCT <150> US61/550,046 <151> 2011-21-10 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Met Asp Lys Ser Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu 1 5 10 15 Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Ala Val Thr 20 25 30 Glu Gln Gly His Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val 35 40 45 Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile 50 55 60 Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Gln Gln Met 65 70 75 80 Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys 85 90 95 Asn Asp Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Pro Asn Ala Thr 100 105 110 Gln Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe 115 120 125 Arg Tyr Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Asp Asn Lys Gln Thr Thr Val 130 135 140 Ser Asn Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe 165 170 175 Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser 180 185 190 Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu 195 200 205 Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp 225 230 235 240 Ala Gly Glu Gly Glu Asn 245 <210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg 65 70 75 80 Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp 85 90 95 Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln 130 135 140 Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu 195 200 205 Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly 225 230 235 240 Glu Gly Gly Glu Asn 245 <210> 3 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Asp Arg Glu Asp Leu Val Tyr Gln Ala Lys Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Val Glu Ser Met Lys Lys Val Ala Gly 20 25 30 Met Asp Val Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Asn Lys Gly Gly Glu Asp Lys Leu Lys 65 70 75 80 Met Ile Arg Glu Tyr Arg Gln Met Val Glu Thr Glu Leu Lys Leu Ile 85 90 95 Cys Cys Asp Ile Leu Asp Val Leu Asp Lys His Leu Ile Pro Ala Ala 100 105 110 Asn Thr Gly Glu Ser Lys Val Phe Tyr Tyr Lys Met Lys Gly Asp Tyr 115 120 125 His Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala 130 135 140 Ala Glu Asn Ser Leu Val Ala Tyr Lys Ala Ala Ser Asp Ile Ala Met 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn 165 170 175 Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys 180 185 190 Arg Leu Ala Lys Ala Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr 195 200 205 Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu 210 215 220 Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Met Gln Gly Asp Gly Glu 225 230 235 240 Glu Gln Asn Lys Glu Ala Leu Gln Asp Val Glu Asp Glu Asn Gln 245 250 255 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Val Asp Arg Glu Gln Leu Val Gln Lys Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Asn Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Ala Val 85 90 95 Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala 130 135 140 Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala His Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu His Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys His Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Asp 225 230 235 240 Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn 245 <210> 5 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Met Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Leu Glu 65 70 75 80 Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Thr Val 85 90 95 Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Ser Gly Glu Lys Lys Asn 130 135 140 Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu Gln Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys Leu Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Glu 225 230 235 240 Glu Ala Gly Glu Gly Asn 245 <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Lys Thr Glu Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Thr Cys Met Lys Ala Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Gly Arg Arg Ser Ala Trp Arg Val Ile Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Asp Thr Ser Asp Lys Lys Leu Gln Leu Ile Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Arg Glu Lys Val Glu Ser Glu Leu Arg Ser Ile Cys Thr Thr 85 90 95 Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Ala Asn Ala Thr Asn Pro 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Cys Gly Asp Asp Arg Lys Gln Thr Ile Asp Asn 130 135 140 Ser Gln Gly Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Asp Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Cys Thr Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu 195 200 205 Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Ser Ala Gly Glu Glu Cys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Glu Gly Ala Glu Asn 245 <210> 7 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Arg Ala Ser Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Asp Met Ala Ala Phe Met Lys Gly Ala Val Glu Lys 20 25 30 Gly Glu Glu Leu Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Gly Gln Arg Ala Ala Trp Arg Val Leu Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Ser Asn Glu Glu Gly Ser Glu Glu Lys Gly Pro Glu 65 70 75 80 Val Arg Glu Tyr Arg Glu Lys Val Glu Thr Glu Leu Gln Gly Val Cys 85 90 95 Asp Thr Val Leu Gly Leu Leu Asp Ser His Leu Ile Lys Glu Ala Gly 100 105 110 Asp Ala Glu Ser Arg Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr 115 120 125 Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Asp Asp Lys Lys Arg Ile Ile 130 135 140 Asp Ser Ala Arg Ser Ala Tyr Gln Glu Ala Met Asp Ile Ser Lys Lys 145 150 155 160 Glu Met Pro Pro Thr Asn Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe 165 170 175 Ser Val Phe His Tyr Glu Ile Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ala Ile Ser 180 185 190 Leu Ala Lys Thr Thr Phe Asp Glu Ala Met Ala Asp Leu His Thr Leu 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ala Asp Asn Ala Gly Glu Glu Gly Gly 225 230 235 240 Glu Ala Pro Gln Glu Pro Gln Ser 245 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Leu Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Ala Val Thr Glu Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn 1 5 10 15 Leu Leu <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser Ser 1 5 10 15 Ile Glu Gln Lys 20 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile 1 5 10 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu 1 5 10 15 Trp Thr Ser <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Citrulline <400> 16 Met Gly Asp Cys Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Citrulline <400> 17 Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Citrulline <400> 18 Arg Leu Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Citrulline <400> 19 Lys Ala Val Thr Glu Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn 1 5 10 15 Leu Leu <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Citrulline <400> 20 Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser Ser 1 5 10 15 Ile Glu Gln Lys 20 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Citrulline <400> 21 Lys Lys Leu Glu Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile 1 5 10 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Citrulline <400> 22 Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu 1 5 10 15 Trp Thr Ser

Claims (20)

  1. 관절염 병태를 앓고 있는 환자의 혈청 중에 존재하는 항-14-3-3 에타 자가항체에 의해 특이적으로 인식되는 단리된 시트룰린화 14-3-3 에타 단백질 또는 이의 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 5 의 위치 4, 위치 12, 위치 19, 위치 42, 위치 61, 위치 86 및 위치 227 로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 시트룰린 잔기를 포함하는 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 16-22 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 관절염 병태가 류마티스 관절염인 단백질.
  5. 고형 지지체에 결합된, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질을 포함하는 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 에타 단백질을 포함하는 키트.
  7. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 관절염 병태 진단 방법:
    - 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편과, 생물학적 시료 중 존재할 수 있는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체 사이에서 하나 이상의 면역 복합체를 형성하는데 적합한 조건 하에서, 대상체로부터의 생물학적 시료를 하나 이상의 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계, 및
    - 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편과, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체 사이의 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계
    (이때, 상기 면역 복합체의 존재는 상기 대상체에서 관절염 병태의 지표임).
  8. 제 7 항에 있어서, 검출하는 단계가, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 대항하는 자가항체의 양을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질이 시트룰린화된 14-3-3 에타인 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질이 시트룰린화된 14-3-3 에타의 단편인 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편이 방사성 라벨, 발광 라벨 및 형광 라벨, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 라벨로 검출가능하게 라벨링되는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 시트룰린화된 14-3-3 단백질 또는 이의 단편이 고형 지지체에 결합되는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 자가항체가 ELISA 검정에 의해 검출되는 방법.
  14. 제 7 항에 있어서, 검출이 화학발광에 의해 발생되는 방법.
  15. 제 7 항에 있어서, 관절염 병태가 류마티스 관절염인 방법.
  16. 제 1 항에 따른 시트룰린화된 14-3-3 단백질에 대한 항체.
  17. 제 16 항에 있어서, 항체가 시트룰린화된 형태에 선택적으로 결합하는 항체.
  18. 제 16 항에 따른 항체를 생산하는 비-인간 숙주.
  19. 제 18 항에 있어서, 하이브리도마 세포주인 숙주.
  20. 하기를 포함하는, 대상체에서의 관절염 병태 진단 및/또는 예후 예측 방법:
    - 생물학적 시료 중에 존재할 수 있는 시트룰린화된 14-3-3 단백질 및 항체 사이에서 하나 이상의 면역 복합체를 형성하는데 적합한 조건 하에서, 대상체로부터의 생물학적 시료를 시트룰린화된 인간 14-3-3 단백질 또는 이의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    - 상기 시트룰린화된 14-3-3 단백질 내에서 하나 이상의 시트룰린 잔기의 존재, 정도 및/또는 위치를 검출하는 단계
    (이때, 하나 이상의 시트룰린 잔기의 존재, 정도 및/또는 위치는 상기 대상체에서 관절염 병태의 지표이거나, 상기 대상체에서 예후 정보를 나타냄).
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