KR20180105710A - 항-시트룰린화 hla 폴리펩티드 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

항-시트룰린화 hla 폴리펩티드 항체 및 이들의 용도 Download PDF

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카이맨 케미칼 컴파니 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 개체에서 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA의 존재에 의해 매개된, 인간 개체에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 치료 효과량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가 양상은 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 포함한다.

Description

항-시트룰린화 HLA 폴리펩티드 항체 및 이들의 용도
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 PCT 국제 특허 출원은 2016년 2월 10일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/293,621에 우선권을 주장하고, 이것의 개시는 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
기술 분야
본 발명은 항-시트룰린화 HLA-DR4 항체 또는 이들의 특이적 결합 단편을 포함하는 조성물, 그리고 이들을 이용하여 인간 개체에서 자가면역 질환의 치료를 위한 방법에 전반적으로 관계한다.
배경
MHC 클래스 II 분자는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 B 림프구 (B 세포)를 비롯하여, 면역계의 항원 제시 세포에 의해 발현된 세포 표면 수용체의 패밀리이다. MHC 클래스 II 분자의 기능은 "항원 제시"로서 알려져 있는 과정에서, 작은, 잠재적으로 항원성 펩티드를 T 림프구 (T 세포)에 전시하는 것이다. T 세포는 그들의 T 세포 수용체를 이용하여 MHC 클래스 II 및 펩티드의 조합을 조사하여, 전시된 펩티드가 숙주 단백질체의 정상적인 성분 (자가)이고, 따라서 무시될 수 있는 지, 또는 이러한 맥락에서 전시된 펩티드가 "외래" (비자기)인 지를 결정한다. MHC 클래스 II에 의해 전시된 외래 펩티드의 인식은 면역 반응을 개시한다; T 세포는 증식하고 사이토킨을 생산함으로써 반응하고, 그리고 외래 펩티드가 목격된 항원 제시 세포에 신호를 돌려 보낸다.
항원이 미량으로 존재할 때, 가장 효율적인 항원 제시 세포는 B-세포이다. 각 B-세포는 항체의 표면-결합된 형태인 독특한 높은 친화성 세포 표면 수용체를 발현한다. 이러한 높은 친화성 수용체를 이용하여, B 세포는 극히 낮은 농도에서 항원을 포획할 수 있다. 포획된 항원은 집어삼켜지고, 펩티드로 처리되고, 그리고 이들 펩티드는 T 세포에 전시를 위해 MHC 클래스 II 분자에 가용해진다. T-세포가 B-세포 MHC 클래스 II에 의해 전시된 펩티드를 인식하면, 이것은 B-세포가 증식하고 항체 생산 세포로 분화하도록 지시한다. 이렇게 생산된 항체는 무손상 항원을 포획한 본래 B-세포 표면 수용체의 높은 친화성 항원 결합능을 공유한다.
펩티드에 결합하고 이들을 T 세포에 전시하는 개별 MHC 클래스 II 분자의 능력은 제한된다; 모든 가능한 펩티드가 전시될 수는 없다. 이런 이유로, 자연적으로 각 개체는 6개까지 상이한 MHC 클래스 II 분자가 제공되는데, 이들은 각각 약간 상이한 펩티드에 결합하고 이들을 전시하고, 따라서 전체 펩티드 결합능의 폭을 확대할 수 있다. 종 수준에서, 인간은 수십 개의 상이한 MHC 클래스 II 분자를 생산하는 유전자 수용력을 갖는다. 종 내에 가능한 MHC 클래스 II 분자의 엄청난 다양성 때문에, 각 개체가 기껏해야 6개의 상이한 형태를 발현한다는 사실과 연계하여, 2명의 개체가 6개 MHC 클래스 II 분자의 동일한 세트를 발현할 가능성은 매우 낮다. 이것은 조직 이식 거부반응의 기초이다. 조직 공여자로부터 MHC 클래스 II 분자는 조직 수용자의 T 세포에게는 외래인 것처럼 보인다. 이러한 "외래" 인식 사건은 심지어, 공여자 (알로) MHC 클래스 II 분자에 펩티드 결합의 부재에서도 일어날 수 있다; 비어 있는 (펩티드 없음) MHC 클래스 II의 인식만으로도 부정합된 수용자에서 큰 백분율의 T 세포를 활성화시키는데 충분하다 (동종이식편반응 반응)(1).
인간 류마티스성 관절염 (RA)은 자가면역 질환인 것으로 일반적으로 생각된다. RA로 고통받는 대부분의 환자는 한 가지 유형의 MHC 클래스 II, HLA-DR4를 발현하는 것으로 오랫동안 인식되었다. HLA-DR4는 HLA-DR 혈청형이다; 이것은 유사한 구조를 공유하는 복수 DRB1*04 유전자 산물을 포함한다. HLA-DR4 혈청형의 구성원은 DRB1*0401, DRB1*0402, DRB1*0403 DRB1*0404 DRB1*0405 DRB1*0406 DRB1*0407 DRB1*0408 DRB1*0409 DRB1*0410 DRB1*0411 DRB1*0412, 그리고 DRB1*0413을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 덜 빈번하지만, HLA-DR4가 아닌 다른 MHC 클래스 II 혈청형 (HLA-DR1 및 HLA-DR14)이 RA를 앓는 환자에서 발현된다. DNA 염기서열결정 기술의 출현으로, HLA-DR4 (DRB1*0401)의 베타 사슬에서 5개 아미노산 스트레치 (70-74)가 RA에 대한 감수성과 가장 강하게 연관되는 HLA-DR4의 영역인 것으로 밝혀졌다. 많은 경우에, 이러한 5개 아미노산 서열은 DRB1*0401의 경우에서처럼, 글루타민-리신-아르기닌-알라닌-알라닌 (QKRAA)이다. 일부 경우에, 상기 아미노산 서열은 약간 상이하다; QRRAA (DRB1*0404, DRB1*0101 및 DRB1*0405에서) 또는 RRRAA (DRB1*1001에서). 각 경우에, 위치 71에서 양성으로 하전된 아미노산 (K 또는 R) 및 위치 72에서 양성으로 하전된 R이 존재한다. 이러한 5개 아미노산 스트레치의 발현을 공유하지 않는 DRB1*04 대립형질은 RA 감수성과 연관되지 않는다. 이러한 "공유된 에피토프" (SE)는 거의 모든 인간 RA 환자에서 공통 인자인 것으로 보인다. 이의 가장 기본적인 형태에서, 공유된 에피토프 가설은 이들 5개 공통 아미노산은 독특한 펩티드가 RA 환자에서 MHC 클래스 II 분자에 어떻게든 결합할 수 있게 하고, 그리고 이러한 펩티드-MHC 조합은 T 세포에게는 외래인 것처럼 보인다고 제안한다. 이러한 친관절염성 펩티드의 식별은 아직 결정되지 않았다.
RA 환자에서 면역 반응의 다른 독특한 특질은 항-시트룰린화 단백질 항체 (ACPA)의 생산이다. 이들 항체는 RA 환자의 ~70%에서 발견되고, 그리고 다른 질환에서 또는 건강한 개체에서 드물게 발견된다. ACPA의 존재는 RA에 대한 신뢰할 만한 진단적 도구가 되고 있다. 시트룰린화는 아르기닌 (R)의 다른 아미노산, 시트룰린 (Cit)으로의 효소적 전환 (탈이민화)이다. 단백질 또는 펩티드의 시트룰린화는 펩티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD) 패밀리 구성원, PAD1, PAD2, PAD3 및 PAD4에 의해 매개된다. 시트룰린화 피브리노겐 및 비멘틴을 비롯하여, ACPA에 의해 결합되는 여러 자연발생 시트룰린화 단백질이 확인되었다. ACPA가 RA의 병리에 관련되는 지는 현재 알려져 있지 않다. 이들 항체의 존재는 질환의 개시에 앞서 10 년까지 겹겹이 쌓인 혈장 표본에서 발견되었는데, 이것은 이들이 직접적으로 병원성이 아니라는 것을 암시한다.
RA와 연관된 유전자 또는 유전적 돌연변이를 찾는 복수 유전적 연관 연구가 공개되었다. 단연코, 가장 강한 유전적 연관은 HLA-DR4 베타 사슬 (DRB1*0401) 또는 다른 공유된 에피토프-내포 MHC 클래스 II 유전자에 있다. PAD4를 인코딩하는 유전자 (PADI4)를 비롯하여, 적은 숫자의 다른 유전자가 복수 연구에서 연관되었다. 따라서, RA 환자에서, 질환의 1) 특정한 MHC 클래스 II 분자, 2) 단백질을 시트룰린화하는 효소 및 3) 항-시트룰린화 단백질 항체의 생산과의 강한 상관이 존재한다. 이들 관찰 결과는 거의 십 년 동안 치열한 연구의 초점이 되고 있는 가설의 산출을 야기하였다. 상기 가설은 조절장애된 PAD4가 면역계에 의해 외래인 것으로 정상적으로 인식되지 않는 세포외 단백질 (가령, 피브리노겐 또는 비멘틴)을 시트룰린화한다고 제안한다. 시트룰린화 단백질은 시트룰린화 단백질을 인식하는 표면 수용체를 발현하는 B 세포에 의해 포획되고, 섭취되고, 그리고 펩티드로 처리된다. 처리된 펩티드 중에서 일부는 그들이 한때 아르기닌을 발현했던 곳에서 시트룰린 잔기를 내포하고, 그리고 하전된 아미노산의 이러한 상실은 변형된 펩티드가 변형되지 않은 펩티드가 결합할 수 없었을 HLA-DR4에 결합하도록 허용한다. 시트룰린화 펩티드는 이러한 조합을 외래로서 인식하는 T-세포에 제시되고, 그리고 항원-제시 B-세포가 항-시트룰린화 단백질 항체를 생산하도록 지향시킨다.
일부 시트룰린화 펩티드가 선천적인 시트룰린화되지 않은 펩티드보다 우수하게 HLA-DR4에 결합할 수 있다는 것을 증명하는 여러 연구가 공개되었다. 다른 연구는 HLA-DR4에 의해 제시될 때, 시트룰린화 비멘틴 또는 피브리노겐으로부터 유래된 펩티드는 T 세포가 변형되지 않은 펩티드에 반응하는 T 세포보다 약간 더 많이 사이토킨을 생산하거나 또는 증식하도록 유발할 수 있다고 보고하였다. 한 연구소는 인간 HLA-DR4를 발현하도록 가공된 생쥐가 시트룰린화 인간 피브리노겐으로 면역화될 때 관절염이 발달할 수 있다고 보고하였지만, 다른 연구소는 이들 조사 결과를 재현하는 것이 불가하다고 보고하였다. 다년에 걸친 많은 노력에도 불구하고, HLA-DR4에 의해 제시될 때, 인간 또는 생쥐에서 관절염을 유발하거나, 또는 T 세포에서 견실한 증식성 반응을 생산할 수 있는 어떤 특정한 펩티드도 확인되지 않았다. 따라서, 본래 펩티드 제시 가설은 증명되지 않았다.
HLA-DR4 공유된 에피토프의 펩티드-제시 역할을 강하게 뒷받침하는 데이터의 부재에서, 대안적 가설이 제시되었다. Holoshitz 등은 T 세포에 대한 펩티드 제시와는 관계없이, 공유된 에피토프의 대안적 기능을 규정하였다. 이들은 공유된 에피토프가 선천성 면역의 강력한 매개체인 칼레티쿨린에 직접적으로 결합할 수 있다고 보고하였고, 그리고 이러한 상호작용이 그 자체로 친염증성이고, 신호전달 및 산화질소 산출을 활성화시킨다고 가정하였다. 공유된 에피토프의 이러한 제안된 역할은 T 세포에 펩티드 제시와 무관할 뿐만 아니라 시트룰린화, PAD4 및 ACAP와도 무관하다.
요약
첫 번째 양상에서, 본 발명은 개체에서 최소한 하나의 시트룰린화 에피토프: QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA를 갖는 HLA-DR4의 존재에 의해 매개된, 인간 개체에서 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염을 치료하기 위한 방법이 제공하고, 상기 방법은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
두 번째 관련된 양상에서, 본 발명은 HLA-DR4 수용체 단백질 서열에서 존재하는 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 제공한다. 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 HLA-DR4 수용체 단백질 서열에서 존재하는 QKRAA, QRRAA 또는 RRRAA 펩티드 서열에 실질적으로 결합하지 않는다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 RA 환자에서 자가면역 반응의 산출을 위해 T 세포를 활성화시키는, B 세포 상에서 HLA-DR4 수용체로부터 시트룰린화된 공유된 에피토프의 제시를 위한 제안된 기전의 개략적 표시를 묘사한다.
도면 2a는 다양한 항원: MHC 클래스 II 펩티드 (EQKRAA), 시트룰린화 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKCitAA), 에놀라아제, 시트룰린화 에놀라아제, H3 단백질 및 시트룰린화 H3 단백질에 대항하여 단리된 항 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKCitAA) 단일클론 항체의 ELISA 결합 결과를 묘사한다.
도면 2b는 다양한 항원 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKRAA), 시트룰린화 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKCitAA), H3 펩티드 (1-21) 및 시트룰린화 H3 펩티드 (Cit R 2+8+17)에 대항하여 단리된 항 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKCitAA) 단일클론 항체의 ELISA 결합 결과를 묘사한다.
상세한 설명
정의:
본 발명의 목적으로, 달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 가령, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)를 참조한다. 이들 참고문헌은 전체적으로 참조로서 본원에 편입된다.
본원에서 언급된 모든 간행물 및 참고문헌은 참조로서 편입된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해서 이런 공개보다 선행할 권리가 없다는 것을 시인하는 것으로 해석되지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 유의되어야 한다.
이행 관용구 "으로 구성되는" 또는 "으로 본질적으로 구성되는"을 포함하는 구체예는 언급된 요소 및 비활성 성분만을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 이것이 이용되는 숫자의 수치 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 이런 이유로, 약 50%는 45%-55%의 범위에 있다는 것을 의미한다.
"임의선택적" 또는 "임의선택적으로"는 차후에 설명된 구조, 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 또는 일어날 수 없고, 그리고 상기 설명이 상기 사건이 발생하는 사례 및 이것이 발생하지 않는 사례 둘 모두를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체가 항체의 항원 결합 부위 (파라토프로 불림)에 의해서 결합하는 항원 상에서 영역을 함께 형성하는 분자의 집합적인 특질, 예를 들면, 일차 구조 및 전하를 지칭한다. 에피토프는 단백질의 일차 서열 내에서 함께 근접한 아미노산 잔기, 또는 일차 서열에서 충분히 분리되지만 단백질의 선천적인 완전한 기능적 모양으로의 자연 접힘의 결과로서 합쳐지는 아미노산 잔기의 세트로서 규정될 수 있다. 일차 서열 내에서 함께 근접한 잔기로 구성되는 에피토프는 인접한, 연속적, 순차적 또는 선형 에피토프로 불리고, 반면 일차 서열에서 분리된 잔기로 구성되는 에피토프는 대조적으로, 불연속적, 입체형태적 또는 "조립된" 에피토프로 불린다.
에피토프는 자연에서 존재하고, 그리고 인간에 의해 지도화되거나, 단리되거나, 정제되거나 또는 만약 그렇지 않으면 제조/도출될 수 있다. 가령, 에피토프는 자연 자원으로부터 단리에 의해 제조될 수 있거나, 또는 이들은 당해 분야에서 표준 프로토콜에 따라서 합성될 수 있다. 이들 방법 중에서 한 가지는 단백질 항원의 합성 단편 (펩티드)의 이용인데, 이것은 항체에 의한 결합을 허용할 만큼 전체 항원의 상동성 부분과 충분히 유사할 수 있다. 에피토프에 대한 항체의 친화성은 항체/펩티드 복합체가 면역검정의 조건 하에 유의미하게 분리되지 않는 그런 정도이어야 한다. 이러한 상황은 선형 에피토프에서 발생하고, 따라서 이들 에피토프를 규정하기 위한 펩티드의 이용, 그리고 개별 에피토프를 규정하기 위한 아미노산 및 아미노산 모방체의 이용을 허용한다. 유래된/제조된 에피토프는 선천적 에피토프의 유사체일 수 있다. 명세서 전반에서, 용어 에피토프 및 합텐은 종종 교체 가능하게 이용된다.
용어 "특이적 결합 분자"는 특이적 결합을 할 수 있는 분자, 바람직하게는 소형 분자를 지시하기 위해 본원에서 이용된다. 이점에 관하여 특이적 결합은 상기 분자가 선별된 표적 분자에 결합할 수 있고, 반면 동일한 조건 하에 다른 비관련된 표적 분자에는 결합하지 않을 것이라는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 가령, 결합 분자는 이것이 혈청 알부민에 결합하고, 그리고 다른 단백질 또는 바람직하게는, 혈청에서 발견되는 임의의 다른 단백질에 더욱 적게 결합하거나 또는 결합하지 않을 때, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다. 본 발명에서 이용된 바와 같이 바람직한 특이적 결합 분자는 시트룰린화 에피토프 QKCitAA 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA에 결합하거나, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA에 결합할 수 있는 특정한 결합 작용제, 예를 들면, 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다.
이러한 문맥에서 용어 "시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응한다" 또는 "시트룰린화 에피토프와 반응성" 또는 "시트룰린 에피토프와 반응성"은 특이적 결합 분자 또는 항체가 구조, 예를 들면, 시트룰린 잔기를 내포하는 펩티드, 예를 들면, 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA와 반응하고, 반면 상기 항체, 또는 이의 항체 단편이 시트룰린 잔기 대신에 아르기닌 잔기를 내포하는 동일한 구조와 더욱 적게 반응하거나 또는 바람직하게는 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 용어 "펩티드"는 본원에서 설명된 바와 같은 특이적 결합 분자와의 면역반응성에 대한 정확한 맥락에서, 바람직하게는 인간 또는 동물 신체에서 나타나는 것과 동일한 맥락에서, 바람직하게는 선천적 폴리펩티드의 맥락에서 시트룰린 잔기를 제시할 수 있는 구조로서 해석되어야 한다.
"특이적 결합 분자"는 표적 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는, DNA, RNA, 펩티드, 단백질 도메인, 전체 단백질, 또는 이들의 조합 또는 이들의 부분으로 구성되는 분자, 바람직하게는 소형 분자일 수 있다. 특이적 결합 분자의 바람직한 실례는 펩티드, 또는 항체 또는 이들의 항체 결합 단편이다.
선천적 항체 (면역글로불린으로서 또한 알려져 있음)는 척추동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견될 수 있고, 그리고 이물질, 예를 들면, 세균 및 바이러스를 확인하고 중화시키기 위해 면역계에 의해 이용되는 감마 글로불린 단백질이다.
선천적 항체는 전형적으로, 기본 구조 단위 -- 각각 2개의 큰 중쇄 및 2개의 작은 경쇄를 가짐, 예를 들면, 1개의 단위를 갖는 단위체, 2개의 단위를 갖는 이합체 또는 5개의 단위를 갖는 오합체로 만들어진다. 항체는 B 세포로 불리는 백혈구에 의해 생산된다. 상이한 종류의 항체를 유발하는 여러 상이한 유형의 중쇄가 있다. 항체는 그들이 소유하는 중쇄에 근거하여, 상이한 아이소타입으로 군화될 수 있다. 포유동물에는 상이한 역할을 수행하고, 그리고 조우되는 각각 상이한 유형의 이물질에 대한 적절한 면역 반응을 주도하는데 도움을 주는 5개의 상이한 항체 아이소타입이 알려져 있다. 일부 동물 종, 예를 들면, 낙타 (가령, 라마) 및 상어는 일탈적 항체 구조를 가질 수 있다.
비록 모든 항체의 전반적인 구조가 매우 유사하긴 하지만, 이들 단백질의 첨단부에서 작은 영역은 극히 가변적이고, 약간 상이한 첨단부 구조를 갖는 수백 만 개의 항체가 존재할 수 있도록 허용한다. 이러한 영역은 초가변 영역으로서 알려져 있다. 이들 변이체 각각은 항원으로서 알려져 있는 상이한 표적에 결합할 수 있다. 항체의 이러한 엄청난 다양성은 면역계가 동등하게 넓은 다양성의 항원을 인식하도록 허용한다.
항체에 의해 인식되는 항원의 독특한 부분은 에피토프로 불린다. 이들 에피토프는 항체가 생물체를 구성하는 수백 만 개의 상이한 분자 가운데 그들의 독특한 항원을 확인하고 여기에만 결합하도록 허용하는 고도로 특이적인 상호작용에서 그들의 항체와 결합한다. 항체에 의한 항원의 인식은 면역계의 다른 부분에 의한 공격을 위해 이것을 태깅한다. 항체는 또한, 예로서 이것이 감염을 유발하는데 필요한 병원체의 부분에 결합함으로써 표적을 직접적으로 중화시킬 수 있다.
항체의 크고 다양한 개체군은 상이한 항원 결합 부위 (또는 파라토프)를 인코딩하는 한 세트의 유전자 분절의 무작위 조합, 그 이후에 추가 다양성을 창출하는, 항체 유전자의 이러한 구역에서 무작위 돌연변이에 의해 산출된다. 항체 유전자는 또한, 중쇄의 염기를 다른 것으로 변화시켜, 항원 특이적 가변 영역을 유지하는 항체의 상이한 아이소타입을 창출하는 클래스 전환으로 불리는 과정에서 재조직화된다. 이것은 단일 항체가 면역계의 여러 상이한 부분에 의해 여러 상이한 아이소타입에서 이용되도록 허용한다.
야생형 항체는 전형적으로, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 갖는다. 중쇄와 경쇄 각각은 가변과 불변 영역으로서 지칭되는 2개의 상이한 영역으로 구성된다. 따라서 가변 중쇄 (VH), 불변 중쇄 사슬 (CH), 가변 경쇄 (VL) 및 불변 경쇄 (CL)가 있다. 항체의 가변 영역 (VH 및 VL)은 분자의 항원 결합 서열을 내포하고, 그리고 따라서, 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 가변 영역에서, 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 각각에 대해 3개의 루프가 항원 결합 부위를 형성한다. 3개의 루프는 각각, 상보성 결정 영역, 또는 "CDR"로서 지칭된다. VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3으로서 지정된 6개의 CDRs (중쇄마다 3개 및 경쇄마다 3개)이 있다. 이들 CDRs 외부 및 중간에 가변 영역은 프레임워크 영역으로서 지칭된다.
항체는 단일 사슬 항체, 단일 사슬 가변 단편 (scFvs), 단편 항원 결합 영역 (Fabs), 재조합 항체, 단일클론 항체, 선천적 항체의 항원 결합 도메인 또는 앱타머를 포함하는 융합 단백질, VHH 항체로서 또한 알려져 있는 단일-도메인 항체 (sdabs), 나노바디 (낙타-유래된 단일-도메인 항체), VNAR로 불리는 상어 IgNAR-유래된 단일-도메인 항체 단편, 안티칼린, 앱타머 (DNA 또는 RNA), 그리고 이들의 활성 성분 또는 단편으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체는 선천적 항체의 항원 결합 도메인 또는 앱타머, 예를 들면, DNA 또는 RNA의 형태에서 앱타머를 포함하는 융합 단백질이다.
항체 또는 다른 특이적 결합 분자의 맥락에서 용어 "또는 이의 부분" 또는 "이의 특이적 결합 단편"은 항체 또는 특이적 결합 분자의 특이적 결합 부위를 구성하고, 그리고 전체 항체 또는 특이적 결합 분자와 동일한 에피토프와 여전히 반응할 수 있는 항체 또는 특이적 결합 분자의 부분으로서 해석될 수 있는 항체 또는 특이적 결합 분자의 부분을 지칭하는 것으로 의미된다.
인간 항체 또는 이들의 특이적 결합 단편은 본 발명의 바람직한 구체예이다. 바람직하게는, IgG1 중쇄 및 람다 또는 카파 경쇄를 갖는 IgG1 (가령, IgG1) 항체가 유리하게 이용될 수 있다. 하지만, 카파 또는 람다 경쇄와 조합으로 IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE를 포함하는 다른 인간 항체 아이소타입 또한 본 발명에 의해 포괄된다. 또한, 다양한 아이소타입의 모든 동물-유래된 항체가 본 발명에서 이용될 수 있다. 항체는 전체 크기 항체, 또는 Fab, F(ab')2, 단일 사슬 Fv 단편, 또는 단일-도메인 VHH, VH 또는 VL 단일 도메인을 비롯한 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.
용어 "시트룰린화 HLA-DR4 에피토프와 반응성인 특이적 결합 분자"는 더욱 큰 구조, 예를 들면, HLA-DR4 폴리펩티드 또는 이의 부분의 맥락에서 시트룰린 잔기와 특이적으로 반응하는 특이적 결합 분자로서 해석된다.
"단리된"은 본 발명에 따른 항체, 이런 항체를 인코딩하는 핵산 및 숙주 세포가 바람직하게는 내포되는 상태를 지칭한다. 항체 및 핵산에 대하여, "단리된"은 항체 및 핵산이 일반적으로, 그들이 자연적으로 연관되는 물질, 예를 들면, 자연 환경에서 또는 예로서, 이런 제조물이 재조합 DNA 기술에 의할 때 그들이 제조되는 환경 (가령, 세포 배양)에서 그들과 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 또는 실제적으로 없을 것이라는 것을 의미한다. 숙주 세포에 적용될 때, "단리된"은 그들이 기원하는 생물체, 예를 들면, 예로서 세포 배양 중인 세포로부터 단리된 숙주 세포를 지칭한다. 항체, 핵산 및 숙주 세포는 희석제 또는 어쥬번트로 조제되고, 그리고 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있다.
"아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기 치환, 삽입 및 결실을 지칭한다. "치환"은 폴리펩티드 서열 내에 특정 위치에서 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 대체를 지칭한다. "삽입"은 폴리펩티드 서열 내에 특정 위치에서 2개의 기존 아미노산 잔기 사이에 아미노산 잔기의 부가를 지칭한다. "결실"은 폴리펩티드 서열 내에 특정 위치에서 아미노산 잔기의 제거를 지칭한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 HLA-DR4에 의한 시트룰린화 펩티드의 제시를 필요로 하지 않지만 PAD4 및 ACAP와 연관되는 공유된 에피토프에 대한 신규한 역할을 제시한다.
A. 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 항체
본 발명은 HLA-DR4에 의한 시트룰린화 펩티드의 제시를 필요로 하지 않지만 PAD4 및 ACAP와 연관되는 공유된 에피토프에 대한 신규한 역할을 확인한다. 이것은 다음의 관찰 결과를 이용한다: 1) PAD4는 자동시트룰린화되고, 2) RA 환자의 부분집합은 PAD4를 인식하는 항체를 만들고, 3) 공유된 에피토프 서열 QKRAA는 시트룰린화될 수 있는 아르기닌 잔기를 내포한다. 본 발명은 시트룰린화 PAD4, 시트룰린화되지 않은 PAD4, 또는 PAD4에 의해 시트룰린화되는 과정에 있는 단백질을 인식할 수 있는 세포 표면 수용체를 갖는 B 세포가 세포 표면 상에서 PAD4를 직접적으로 또는 간접적으로 포획할 수 있다고 제안한다. 포획된 PAD4는 효소적으로 활성 상태로 남아있고, 그리고 B 세포 표면 상에 또는 식포 내에 공유된 에피토프 QKRAA, QRRAA 또는 RRRAA에서 인접한 HLA-DR4 분자를 시트룰린화한다. 공유된 에피토프의 위치 72에서 아르기닌은 시트룰린화 잔기 중에서 하나다. 이렇게 변형되면, 시트룰린화 HLA-DR4는 동종반응성 방식에서 T 세포에게는 외래인 것처럼 보인다. 대안으로, 시트룰린화 HLA-DR4는 HLA-DR4가 시트룰린화되지 않았다면 제시되지 않았을 T 세포에 독특한 펩티드를 제시할 수 있다. 어떤 상황이든, 반응하는 T 세포는 B 세포가 항-PAD4, 항-시트룰린화 PAD4, 또는 다른 시트룰린화 단백질을 비롯하여, 표면 수용체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체를 생산하도록 지시할 것이다.
이러한 신규한 기전의 인식은 세포용해 치료 항체, 항체의 공유된 에피토프 결합 단편, 또는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 결합하고, 시트룰린화 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포를 파괴하고, T 세포 활성화를 예방하는 항체-유사 생물학적 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, RA의 치료 또는 예방을 위한 새로운 약리학적 작용제의 개발을 알려준다.
도면 1에서 보여 지는 바와 같이, 부분 B-D는 공유된 에피토프 QKRAA의 QKCitAA로의 직접적인 시트룰린화를 묘사한다. 비록 도시되진 않지만, 공유된 에피토프는 또한, QRRAA 또는 RRRAA를 포함할 수 있었는데, 이것은 PAD에 의해 시트룰린화되어 T 세포 반응성 에피토프 QRCitAA 및 RRCitAA를 산출할 수 있다. 도면 1, 부분 B에서 보여 지는 바와 같은 예시적인 구체예에서, 시트룰린화 단백질에 특이적인 B-세포 표면 면역글로불린 (Y)은 자동시트룰린화된 PAD에 결합한다. PAD 효소는 공유된 에피토프 QKRAA를 인접한 HLA-DR4 분자 상에서 QKCitAA로 시트룰린화한다 (HLA-DR4 (H) 상에서 작은 원. 시트룰린화 HLA-DR4 분자는 추가 결합된 펩티드가 있거나 또는 없이, T 세포 수용체 (W)에 의해 직접적으로 인식된다. T 세포는 B 세포가 항-시트룰린화 단백질 항체 (ACAP)를 생산하도록 지시한다.
도면 1, 부분 C에서, IgG에 특이적인 B 세포 표면 면역글로불린 (Y)은 PAD에 결합한 항체에 결합한다. 결합된 PAD는 인접한 HLA-DR4 분자 (H) 상에서 공유된 에피토프 서열을 시트룰린화한다. 시트룰린화 HLA-DR4 분자는 추가 결합된 펩티드가 있거나 또는 없이, T 세포 수용체 (W)에 의해 직접적으로 인식된다. T 세포는 B-세포가 항-IgG 항체 (류마티스양 인자)를 생산하도록 지시한다.
도면 1, 부분 D에서, PAD에 특이적인 B 세포 표면 면역글로불린 (Y)은 PAD에 결합한다. B 세포 결합된 PAD는 HLA-DR4 (H) 내에 공유된 에피토프 QKRAA를 인접한 HLA-DR4 분자 (H) 상에 QKCitAA 아미노산 서열로 시트룰린화한다. 시트룰린화 HLA-DR4 분자는 추가 결합된 펩티드가 있거나 또는 없이, T 세포 수용체 (W)에 의해 직접적으로 인식된다. T 세포는 B 세포가 항-PAD 항체를 생산하도록 지시한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 예시적인 PAD는 PAD4 또는 PAD2 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
임의의 특정한 이론에 한정됨 없이, 시트룰린화 PAD4, 시트룰린화되지 않은 PAD4, 또는 PAD4에 의해 시트룰린화되는 과정에 있는 단백질을 인식하거나 또는 이것에 결합할 수 있는 세포 표면 수용체를 갖는 B 세포는 B 세포의 세포 표면 상에서 PAD4를 직접적으로 또는 간접적으로 포획할 수 있는 것으로 생각된다. 포획된 PAD4는 효소적으로 활성 상태에 남아있고, 그리고 B 세포 표면 상에서 또는 B 세포 식포 내에서 인접한 HLA-DR4 분자를 시트룰린화한다. HLA-DR4의 공유된 에피토프의 위치 72에서 아르기닌은 시트룰린화 잔기 중에서 하나다. 이렇게 변형되면, 시트룰린화 HLA-DR4 수용체는 동종반응성 방식에서 T 세포에게는 외래인 것처럼 보인다. 대안으로, 시트룰린화 HLA-DR4는 HLA-DR4가 시트룰린화되지 않았다면 T 세포에 제시되지 않았을, T 세포에 독특한 펩티드를 제시할 수 있다. 어떤 상황이든, 반응하는 T 세포는 B 세포가 활성화되는 것에 더하여, PAD4, 시트룰린화 PAD4, 또는 다른 시트룰린화 단백질을 비롯하여, 표면 수용체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체를 생산하고, 그리고 친염증성 사이토킨, 예를 들면, TNF-α를 방출하도록 지시할 것이다.
이러한 신규한 기전의 인식은 세포용해 치료 항체, 이들의 항원 결합 단편, 또는 시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 결합하고 시트룰린화 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포를 파괴하는 항체-유사 생물학적 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, RA의 치료 또는 예방을 위한 새로운 약리학적 작용제의 개발을 알려준다. 항원 제시 세포, 예를 들면, B 세포 상에 존재하는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 항체 또는 항체-유사 생물학적 분자의 결합은 다른 기전 중에서 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 기전 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 통해 이들 세포의 제거를 할 수 있게 한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA에 특이적이고 높은 친화성으로 결합하는 포유류 항체를 포함하는 유용한 치료 조성물을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 시트룰린화된 공유된 에피토프로서 지칭된 아미노산 서열, 여기서 프리-시트룰린화 에피토프는 QKRAA, QRRAA 또는 RRRAA이고, 그리고 상기 프리-시트룰린화 에피토프에서 아르기닌 잔기 중에서 하나는 효소 펩티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD)에 의해 아르기닌을 시트룰린 ("Cit")으로 탈이민화함으로써 작용된다.
펩티딜아르기닌 디이미나아제 (PAD; EC 3.5.3.15) 효소는 단백질 내에서 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 전환을 촉매작용한다. 시트룰린에 대한 tRNA는 존재하지 않는다; 단백질 내에서 시트룰린 잔기의 존재는 배타적으로, 번역후 변형의 결과이다. 포유동물 (인간, 생쥐 및 쥐)에서, 상이한 유전자에 의해 각각 인코딩된 5개 PAD 아이소타입 (PAD1-PAD6; "PAD4" 및 "PAD5"는 동일한 아이소타입에 대해 이용된다)이 확인되었다 (Vossenaar et al., Bioessays 25, 1106-1118, 2003). 이들 효소 모두 활성을 위해 Ca2+의 존재에 강하게 의존하고 유리 L-아르기닌을 유리 L-시트룰린으로 전환할 수 없다. 유리 L-아르기닌은 진핵생물에서 산화질소 신타아제 (EC 1.14.13.39)에 의해 또는 세균에서 아르기닌 디이미나아제 (EC 3.5.3.6)에 의해 유리 L-시트룰린으로 전환될 수 있다. 이들 효소는 Ca2+ 의존성이 아니다.
시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA에 특이적이고 높은 친화성으로 결합하는 포유류 항체 또는 이들의 단편을 만들기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다. 일부 구체예에서, 단일클론 항체를 만들기 위한 세포 융합 방법, 예를 들면, 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 5,916,771에서 개시된 것들이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 간단히 말하면, 이러한 방법에 따라, 원하는 중쇄 (또는 중쇄의 단편)을 인코딩하는 DNA가 첫 번째 포유류 숙주 세포 내로 도입되고, 반면 원하는 경쇄 (또는 경쇄의 단편)을 인코딩하는 DNA가 두 번째 포유류 숙주 세포 내로 도입된다. 첫 번째 형질전환된 숙주 세포 및 두 번째 형질전환된 숙주 세포는 이후, 세포 융합에 의해 조합되어 세 번째 세포를 형성한다. 첫 번째와 두 번째 세포의 융합에 앞서, 형질전환된 세포가 특정적으로 원하는 특징, 예를 들면, 높은 발현 수준에 대해 선별될 수 있다. 융합 후, 결과의 하이브리드 세포는 원하는 중쇄를 인코딩하는 DNA 및 원하는 경쇄를 인코딩하는 DNA 둘 모두를 내포하고 발현하여, 다중결합 항체의 생산을 유발한다. 일정한 구체예에서, 단일클론 항체는 표준 기술에 의해 생산된다. 일정한 구체예에서, 단일클론 항체는 당해 분야에서 널리 공지되는 하이브리도마-기초된 방법에 의해 생산된다. 다양한 구체예에서, HLA-DR4의 서열로부터 에피토프 QKCitAA에 지향된 생쥐 단일클론 항체를 생산하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다, 예를 들면, 일정한 이런 구체예에서, 적합한 동물, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 원숭이 또는 다른 포유동물은 항체-분비 세포를 생산하기 위해 면역원으로 면역화된다. 다양한 구체예에서, 면역원은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA일 수 있거나, 또는 이것은 폴리펩티드 또는 단백질에 연결되거나 융합된 시트룰린화 에피토프 중에서 한 가지일 수 있다. 이들 구체예에서, 선별검사 과정은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA에 결합하지만 접합된 폴리펩티드 또는 단백질에 결합하지 않는 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마를 산출할 것이다.
일정한 구체예에서, 항체-분비 세포는 B 세포, 예를 들면, 림프구 또는 비장세포이다. 일정한 구체예에서, 림프구 (가령, 인간 림프구)는 시험관내에서 면역화되어 항체-분비 세포를 산출한다. 가령, Borreback et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:3995-3999를 참조한다.
일정한 구체예에서, 항체 분비 세포는 "영속화된" 세포주, 예를 들면, 골수성-유형 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 생산한다. 일정한 구체예에서, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예로서, ELISA에 의해 확인된다. 일정한 구체예에서, 이런 세포는 이후, 하위클로닝되고 표준 방법을 이용하여 배양될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 세포는 또한, 적합한 동물 숙주에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단일클론 항체는 표준 분리 절차, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피를 이용하여, 하이브리도마 배양 배지, 혈청 또는 복수 유체로부터 단리된다. 일정한 구체예에 따른 하이브리도마의 생산 및 단일클론 항체의 정제를 위한 보도는 가령, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 8 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)에서 제공된다.
일정한 구체예에서, 생쥐 단일클론 항체는 유전적으로 변경된 생쥐를 면역원으로 면역화함으로써 생산된다. 일정한 이런 구체예에서, 생쥐는 HLA-DR4-결함성 생쥐이다. 일정한 이런 구체예에서, 생쥐는 인간 HLA-DR4를 인코딩하는 유전자 중에서 전부 또는 일부를 결여하는 "녹아웃" 생쥐이다. 일정한 구체예에서, 이런 녹아웃 생쥐는 단독으로, 또는 폴리펩티드 또는 단백질에 접합될 때, 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA로 면역화된다.
일정한 구체예에서, 인간 단일클론 항체는 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자도입 동물 (가령, 생쥐)에서 조성된다. 가령, U.S. 특허 번호 6,075,181 A와 6,114,598 A; 및 WO 98/24893 A2를 참조한다. 가령, 일정한 구체예에서, 내인성 Ig 유전자가 비활성화된 생쥐 내로 인간 면역글로불린 유전자가 도입된다 (가령, 효모 인공 염색체, 인간 염색체 단편, 또는 생식계열 통합을 이용하여). 가령, Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Tomizuka et al. (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:722-727; 및 Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156 (유전자도입 생쥐의 XenoMouse II.RTM. 라인을 설명)을 참조한다.
일정한 구체예에서, 이런 유전자도입 생쥐는 면역원으로 면역화된다. 일정한 이런 구체예에서, 항체를 발현하는 생쥐로부터 림프성 세포 (가령, B 세포)가 획득된다. 일정한 이런 구체예에서, 이런 회수된 세포는 "영속화된" 세포주, 예를 들면, 골수성-유형 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 생산한다. 일정한 이런 구체예에서, 하이브리도마 세포는 관심되는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 것들을 확인하기 위해 선별검사되고 선별된다. 인간 단일클론 항체의 생산에 적합한 일정한 예시적인 방법과 유전자도입 생쥐는 가령, Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; and WO 98/24893에서 설명된다. 일정한 구체예에서, 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA에 대항하여 인간 단일클론 항체는 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염의 치료를 위한 치료 항체 또는 이들의 단편으로서 이용에 적합하다.
파지와 효모 전시-기초된 방법
일정한 구체예에서, 인간 단일클론 항체는 전시-기초된 방법, 예를 들면, 예로서 아래에 설명된 것들 중에서 한 가지를 이용하여 생산된다.
일정한 구체예에서, 단일클론 항체는 파지 전시 기술을 이용하여 생산된다. 일정한 예시적인 항체 파지 전시 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 가령, Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, N.J.)에서 설명된다. 가령, 일정한 구체예에서, 항체의 라이브러리는 실모양 파지, 예를 들면, 비용해성 실모양 파지 fd 또는 M13의 표면에서 전시된다. 일정한 구체예에서, 항체는 항체 단편, 예를 들면, scFvs, Fabs, VH-VL 쌍을 안정시키기 위한 가공된 분자간 이황화 결합을 갖는 Fvs, 그리고 디아바디이다. 일정한 구체예에서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체는 이후, 선별될 수 있다. 항체 파지 전시 방법의 일정한 예시적인 구체예는 아래의 추가 상세에서 설명된다.
일정한 구체예에서, 항체 파지 전시 라이브러리는 당업자에게 공지된 일정한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 가령, Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, N.J.)을 참조한다. 일정한 구체예에서, 가변적 유전자 레퍼토리는 항체-분비 세포의 유전체 DNA, 또는 mRNA로부터 유래된 cDNA의 PCR 증폭에 의해 제조된다. 가령, 일정한 구체예에서, cDNA는 시트룰린화 에피토프 QKCitAA에 대한 항체를 발현하는 B 세포의 mRNA로부터 제조된다. 일정한 구체예에서, 중쇄와 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 cDNA는 예로서, PCR에 의해 증폭된다.
일정한 구체예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA는 적합한 벡터 내로 클로닝된다. 일정한 구체예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA는 클로닝 과정 동안 무작위로 조합되고, 따라서 다양한 scFvs 또는 Fabs를 인코딩하는 cDNA 라이브러리의 어셈블리를 유발한다. 일정한 구체예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA는 적합한 벡터 내로 클로닝되기 전 결찰된다. 일정한 구체예에서, 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA는 적합한 벡터 내로 단계별 클로닝에 의해 결찰된다.
일정한 구체예에서, cDNA는 파지 전시 벡터, 예를 들면, 파지미드 벡터 내로 클로닝된다. 일정한 예시적인 파지미드 벡터, 예를 들면, pCES1은 당업자에게 공지되어 있다. 일정한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 cDNA는 동일한 벡터 상에 존재한다. 가령, 일정한 구체예에서, scFvs를 인코딩하는 cDNA는 소수 파지 외피 단백질 pill을 인코딩하는 유전자 III의 전부 또는 일부와 인프레임으로 클로닝된다. 일정한 이런 구체예에서, 파지미드는 파지 표면 상에서 scFv-pIII 융합의 발현을 주도한다. 대안으로, 일정한 구체예에서, 중쇄 (또는 경쇄)를 인코딩하는 cDNA는 유전자 III의 전부 또는 일부와 인프레임으로 클로닝되고, 그리고 경쇄 (또는 중쇄)를 인코딩하는 cDNA는 동일한 벡터 내에서 신호 서열의 하류에 클로닝된다. 신호 서열은 숙주 세포의 주변세포질 내로 경쇄 (또는 중쇄)의 발현을 주도하는데, 여기서 중쇄와 경쇄는 Fab 단편으로 조립된다. 대안으로, 일정한 구체예에서, 중쇄를 인코딩하는 cDNA 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA는 별개의 벡터 상에 존재한다. 일정한 이런 구체예에서, 중쇄와 경쇄 cDNA는 하나는 파지미드 내로 및 다른 것은 파지 벡터 내로 별개로 클로닝되는데, 이들 둘 모두 숙주 세포 내에서 생체내 재조합을 위한 신호를 내포한다. 재조합 파지미드 또는 파지 벡터는 적합한 세균 숙주, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 내로 도입된다. 파지미드를 이용하는 일정한 구체예에서, 숙주는 파지 구조 단백질을 공급하기 위한 조력 파지로 감염되고, 따라서 파지 표면 상에 항체-pill 융합 단백질을 보유하는 파지 입자의 발현을 허용한다.
다양한 예시적인 구체예에서, "합성" 항체 라이브러리가 시험관내에서 재배열되는 가변적 유전자의 레퍼토리를 이용하여 작제된다. 가령, 일정한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 개별 유전자 분절 (각각, V-D-J 또는 V-J)은 PCR을 이용하여 무작위로 조합된다. 일정한 이런 구체예에서, 추가 서열 다양성이 예로서, 오류 가능성 PCR에 의해 CDRs 및 아마도 FRs 내로 도입될 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 추가 서열 다양성은 CDR3, 예를 들면, 중쇄의 H3 내로 도입된다.
일정한 구체예에서, "미경험" 또는 "보편적인" 파지 전시 라이브러리가 비면역성 동물로부터 핵산을 이용하여 앞서 설명된 바와 같이 작제된다. 일정한 구체예에서, 비면역성 동물은 인간이다. 일정한 구체예에서, "면역화된" 파지 전시 라이브러리가 면역화된 동물로부터 핵산을 이용하여 앞서 설명된 바와 같이 작제된다. 일정한 구체예에서, 면역화된 동물은 인간, 쥐, 생쥐, 햄스터, 또는 원숭이이다. 일정한 이런 구체예에서, 동물은 아래에 설명된 면역원 중에서 한 가지로 면역화된다.
일정한 구체예에서, 파지 전시 라이브러리로부터 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 선별은 연속적인 패닝 단계에 의해 달성된다. 패닝의 일정한 구체예에서, 라이브러리 파지 제조물은 항원에 노출된다. 일정한 이런 구체예에서, 파지-항원 복합체는 세척되고, 그리고 결합되지 않은 파지는 폐기된다. 일정한 이런 구체예에서, 결합된 파지는 회수되고, 그리고 차후에, 대장균 (E. coli)을 감염시킴으로써 증폭된다. 일정한 이런 구체예에서, 단일클론 항체-생산 파지는 단일 플라크를 선발함으로써 클로닝될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 과정은 반복된다.
일정한 구체예에서, 패닝에서 이용된 항원은 아래에 설명된 면역원 중에서 한 가지이다. 일정한 구체예에서, 항원은 친화성 크로마토그래피에 의한 항원 결합 파지의 정제를 허용하기 위해 고체 지지체 위에 고정된다. 일정한 구체예에서, 항원은 비오틴화되고, 따라서 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 이용하여, 결합되지 않은 파지로부터 결합된 파지의 분리를 허용한다. 일정한 구체예에서, 항원은 세포 상에 (직접적인 패닝의 경우), 조직 동결절편 내에, 또는 막 (가령, 나일론 또는 니트로셀룰로오스 막) 위에 고정될 수 있다. 일정한 패닝 절차의 다른 변이는 당업자에 의해 일과적으로 결정될 수 있다.
일정한 구체예에서, 효모 전시 시스템이 단일클론 항체를 생산하는데 이용된다. 일정한 이런 시스템에서, 항체는 효모 AGA2 단백질의 전부 또는 일부와의 융합 단백질로서 발현되는데, 이것은 효모 세포 벽의 표면에서 전시된다. 일정한 이런 구체예에서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체를 발현하는 효모 세포는 이후, 이들 세포를 형광 표지화된 항원에 노출함으로써 확인될 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 항원에 결합하는 효모 세포는 이후, 유세포분석법에 의해 단리될 수 있다. 가령, Boder et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557을 참조한다.
일정한 구체예에서, 단일클론 항체는 재조합 기술에 의해 생산된다. 가령, U.S. 특허 번호 4,816,567을 참조한다. 일정한 이런 구체예에서, 단일클론 항체 사슬을 인코딩하는 핵산은 적합한 숙주 세포에서 클로닝되고 발현된다. 가령, 일정한 구체예에서, RNA는 표준 방법을 이용하여, 원하는 항체를 발현하는 세포, 예를 들면, 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 제조될 수 있다. 일정한 구체예에서, RNA는 이후, 표준 방법을 이용하여 cDNA를 만드는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 cDNA는 예로서, 특정한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 일정한 구체예에서, cDNA는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝된다. 일정한 구체예에서, 발현 벡터는 이후, 적합한 숙주 세포, 예를 들면, 항체를 내생적으로 생산하지 않는 숙주 세포 내로 형질전환되거나 또는 형질감염된다. 일정한 예시적인 숙주 세포는 대장균 (E. coli), COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 골수종 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 중쇄와 경쇄가 동일한 숙주에서 공동발현되는 일정한 구체예에서, 재구성된 항체는 단리될 수 있다.
일정한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 cDNA는 변형될 수 있다. 가령, 일정한 구체예에서, 생쥐 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역은 인간 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역으로 대체될 수 있다. 이러한 방식으로, 일정한 구체예에서, 인간 항체 불변 영역을 소유하지만 생쥐 항체의 결합 특이성을 유지하는 키메라 항체가 생산될 수 있다.
일정한 구체예에서, 재조합 항체는 일정한 세포주에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 특정 항체를 인코딩하는 서열은 적합한 포유류 숙주 세포의 형질전환에 이용될 수 있다. 일정한 구체예에 따라서, 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의할 수 있다. 일정한 예시적인 방법은 U.S. 특허 번호 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455에 의해 구현된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 바이러스에서 (또는 바이러스 벡터 내로) 포장하고, 숙주 세포를 바이러스 (또는 벡터)로 형질도입하고, 그리고 당해 분야에서 공지된 일정한 형질감염 절차를 이용하는 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 이용되는 형질전환 절차는 형질전환되는 숙주에 의존할 수 있다. 포유류 세포 내로 이종성 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 일정한 예시적인 방법은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜에서 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 핵 내로 DNA의 직접적인 미량주사를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
발현을 위한 숙주로서 가용한 일정한 예시적인 포유류 세포주는 당해 분야에서 공지되고, 그리고 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (가령, Hep G2) 및 다수의 다른 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 가용한 많은 영속화된 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 세포주는 어떤 세포주가 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 높은 수준의 항체를 생산하는 지를 결정함으로써 선별될 수 있다.
다양한 구체예에서, 시트룰린화 HLA-DR4 에피토프에 결합하는 항체는 인간화 항체이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 인간 프레임워크 영역 및 비인간 (통상적으로, 생쥐 또는 쥐) 면역글로불린으로부터 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린은 "공여자"로 불리고, 그리고 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용자"로 불린다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 만약 존재한다면, 이들은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실제적으로 동일, 다시 말하면, 최소한 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 또는 그 이상 동일해야 한다. 따라서, 아마도 CDR을 제외하고, 인간화 면역글로불린의 모든 부분은 자연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실제적으로 동일하다.
"인간화 항체"는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 가령, 인간화 항체는 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않을 것인데, 그 이유는 예로서, 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비인간이기 때문이다. 공여자 항체는 "인간화"의 과정에 의해 인간화된 것으로 일컬어지는데, 그 이유는 결과의 인간화 항체가 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 항원에 결합할 것으로 예상되기 때문이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 수용력을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류로부터 초가변 영역 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다.
게다가, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정밀화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 초가변 영역의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의선택적으로, 최소한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 전형적으로 FcγRIIB 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하고 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입 (다시 말하면, 돌연변이)에 의해 변경된 인간 면역글로불린의 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 유도체이다. 이런 인간화 항체는 하나 또는 그 이상의 비인간 CDRs에서 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 인간화 항체 유도체는 비-유도체 인간화 항체와 비교할 때, 실제적으로 동일한 결합, 더욱 우수한 결합, 또는 더욱 불량한 결합을 가질 수 있다. 특정한 구체예에서, CDR의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 아미노산 잔기가 대체되거나, 결실되거나 또는 부가되었다 (다시 말하면, 돌연변이되었다). 항체를 인간화하는데 있어서 추가 상세는 유럽 특허 번호 EP 239,400, EP 592,106 및 EP 519,596; 국제 공개 번호 WO 91/09967 및 WO 93/17105; U.S. 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886 및 6,407,213을 참조한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"으로부터 아미노산 잔기 (다시 말하면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터 잔기 (다시 말하면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 그리고 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 리뷰를 위해, Pluckthun in THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다. 특정한 구체예에서, scFvs는 이중특이적 scFvs 및 인간화 scFvs를 포함한다.
B. 치료 방법
따라서, 본 발명은 이런 이유로, 시트룰린-HLR-DR4 관련된 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는데 이용하기 위한, HLA-DR4 분자 상에 존재하는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 결합하는 특이적 결합 분자에 관계하는데, 상기 질환은 예로서, 염증성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 라임병 유도된 관절염, 류마티스성 관절염, 히드랄라진-유도된 여성 전신성 홍반성 루푸스, 천포창양 임신, 낙엽성 천포창, 폐쇄성 비대 심근병증, 건선성 관절염, 건선, IgA 신장병증, '공유된 증후군'-전신 경화증/류마티스성 관절염 및 류마티스성 다발근육통증을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시트룰린-HLR-DR4 관련된 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는데 이용하기 위한, 본 발명의 HLA-DR4 분자 상에 존재하는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 결합하는 특이적 결합 분자, 예를 들면, 항체는 류마티스성 관절염의 치료에 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 치료가능한 질환과 장애는 다음을 포함할 수 있다: 염증성 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염 및 건선. 본 발명은 이런 이유로, 관절염, 염증성 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염 및 건선으로 구성된 군에서 선택되는 질환을 치료하거나 예방하는데 이용하기 위한, HLA-DR4 분자 상에 시트룰린화된 공유된 에피토프에 특이적으로 결합하는 특이적 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 관계한다. 본 발명은 특히, 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 시트룰린화 HLA-DR4 공유된 에피토프 (가령, QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA)에 높은 친화성을 갖고 특이적으로 결합하는 특이적 결합 분자 (가령, 항체 또는 이의 특이적 결합 단편)에 관계한다. 이들 자가면역 질환은 전체적으로, 또는 부분적으로, 항원 제시 세포, 예를 들면, B 세포 상에 존재하는 HLA-DR4 수용체 상에 존재하는 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA의 존재에 의해 매개된다. 항원 제시 세포, 예를 들면, B 세포에 의해 제공된 시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 QRCitAA, 또는 시트룰린화 에피토프 RRCitAA를 보유하는 HLA-DR4 분자는 T 세포에 의해 외래로서 인식되고, 따라서 T-세포 활성화 및 병원성 면역 반응의 개시를 유발한다.
임의의 특정한 이론에 한정됨 없이, 시트룰린화 HLA-DR4 공유된 에피토프와 반응성인 특이적 결합 분자 (가령, 항체 또는 이의 특이적 결합 단편)의 투여는 시트룰린화 HLA-DR4 공유된 에피토프를 T-세포에 제시하는 항원 제시 세포, 예를 들면, B 세포에 특이적 결합 분자의 결합을 유발할 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 항체 또는 이들의 특이적 결합 단편은 HLA-DR4 분자 상에 존재하는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 결합하고, 그리고 환자의 T 세포가 시트룰린화 HLA-DR4 에피토프를 갖는 외래처럼 보이는 HLA-DR4에 반응하는 것을 예방하는데 이용될 수 있다. 이들 항원 제시 세포, 예를 들면, B 세포는 차후에, 그 중에서도 특히 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 기전 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통해 제거될 수 있다.
인간의 치료에서 이용될 때, 항체 또는 이의 항체 단편은 바람직하게는, 주로 인간 항체 서열로 구성된다, 다시 말하면, 이것은 본 발명의 항체 또는 이들의 특이적 결합 단편에 대한 항체의 생산을 유발하지 않기 위해 인간화된다.
치료적 용도를 위해, 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 적절하게는, 인간 환자에게 투여된 후 안정된다. 가령, 이것은 인간에서 긴 반감기를 가져야 하고, 그리고 투여 후 짧은 시간에 프로테아제에 의해 파괴되지 않아야 한다. 적절하게는, 항체는 수일보다는 수주의 반감기를 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 개설된 바와 같은 시트룰린-HLR-DR4 관련된 자가면역 질환을 앓거나 또는 시트룰린-HLR-DR4 관련된 자가면역 질환을 앓는 것으로 의심되는 개체는 시트룰린화 HLA-DR4 공유된 에피토프 (가령, QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 특이적 결합 분자 (가령, 항체 또는 이의 특이적 결합 단편)의 효과량 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물로 치료될 수 있다. 다양한 구체예에서, 특이적 결합 분자는 시트룰린화된 공유된 에피토프, 예를 들면, QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 시트룰린화 HLA-DR4 에피토프, 예를 들면, 아미노산 서열 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA를 갖는 시트룰린화된 공유된 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중클론, 또는 단일클론 항체, 또는 키메라 항체 또는 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는 담체" 또는 "제약학적 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합될 때, 상기 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 허용하고 개체의 면역계와 무반응성인 임의의 물질을 포함하고, 그리고 생리학적으로 양립성이고, 비독성이고, 활성 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 항체 또는 이들의 항원 결합 단편의 작용 기전을 간섭하지 않는 임의의 모든 용매, 희석제, 담체, 분산 매체, 코팅, 항균제와 항진균제, 등장성과 흡수 지연 작용제 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제약학적 허용되는 부형제는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (가령, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 루트에 따라, 활성 성분, 다시 말하면, 특이적 결합 분자는 이러한 특이적 결합 분자를 비활성화시킬 수 있는 산 및 다른 프로테아제의 작용으로부터 특이적 결합 분자를 보호하는 물질에서 코팅될 수 있다.
본 발명에 따라서 이용되는 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]에서 충분히 설명되고 도해된 바와 같은 임의선택적 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 동결건조된 제약학적으로 허용되는 제제, 용액 및/또는 현탁액의 형태에서 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 완충액 또는 안정제는 이용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 본 발명의 제약학적 조성물에서 이용될 수 있는 적합한 수성 및/또는 비수성 부형제, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브유, 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염을 포함한다. 적절한 유동성은 예로서, 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제, 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산의 이용에 의해 유지될 수 있다. 항산화제는 예로서, (1) 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들면, 아스코빌 팔미트산염, 부틸화된 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈산염, 알파-토코페롤 등; 그리고 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들면, 구연산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 주석산, 인산 등; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물, 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸)를 포함될 수 있다. 다른 예시적인 제약학적으로 허용되는 부형제는 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
한 예시적인 구체예에서, 제약학적 조성물은 임의선택적으로, 생리학적 상태를 근사하기 위해 필요에 따라 제약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, pH 조정제와 완충제 및 독성 조정제, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 젖산나트륨을 내포할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 저장용으로 조제되고, 동결건조되고, 그리고 공지된 동결건조와 재구성 기술에 따라 이용에 앞서 적절한 부형제에서 재구성될 수 있다. 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 내포하는 한 가지 예시적인 제약학적 조성물에서, 상기 조성물은 정맥내 또는 피하 투여를 위한 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 무균, 무보존제 용액으로서 조제된다. 제제는 1회용 미리 충전된 펜으로서, 예로서 약 1 mL를 내포하는 1회용 미리 충전된 유리 주입기로서, 또는 1회용 기관 이용 바이알로서 공급될 수 있다. 바람직하게는, 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 내포하는 제약학적 조성물은 투명하고, 무색이고, 약 6.9-5.0의 pH, 바람직하게는 6.5-5.0의 pH, 이보다 더욱 바람직하게는 약 6.0 내지 약 5.0의 범위에서 pH를 갖는다. 다양한 구체예에서, 이들 제약학적 조성물을 포함하는 제제는 재구성되고 개체에게 투여될 때, 용액의 mL당 약 1,000 mg 내지 약 10 mg, 또는 약 500 mg 내지 약 20 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 30 mg 또는 약 300 mg 내지 약 50 mg의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 내포할 수 있다. 예시적인 주사 또는 주입 부형제는 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 복막내, 또는 피하 투여를 위해 만니톨, 구연산 일수화물, 이염기성 인산나트륨 이수화물, 일염기성 인산나트륨 이수화물, 폴리소르베이트 80, 염화나트륨, 구연산나트륨 및 물을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 구체예에서, 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 약 5 내지 6의 범위에서 변하는 pH에서 아세트산나트륨, 폴리소르베이트 80 및 염화나트륨과 함께 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 더욱 바람직하게는, 약 5-75 mg/mL, 또는 이보다 더욱 바람직하게는, 약 10-50 mg/mL, 또는 훨씬 바람직하게는, 약 10-40 mg/mL의 항체를 내포하는 무균 수성 용액으로서 정맥내 또는 피하 투여용으로 조제된다. 바람직하게는, 정맥내 또는 피하 제제는 pH 5.5에서 20 mM 아세트산나트륨, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 140 mM 염화나트륨과 함께 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mg/mL의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 내포하는 무균 수성 용액이다. 게다가, 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 용액은 많은 다른 화합물 중에서, 히스티딘, 만니톨, 수크로오스, 트레할로스, 글리신, 폴리(에틸렌)글리콜, EDTA, 메티오닌, 그리고 이들의 임의의 조합, 그리고 유관한 분야에서 공지된 많은 다른 화합물을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 pH 5.8에서 다음의 성분을 포함한다: 본 발명의 5-100 mg 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 10 mM 히스티딘, 5% 수크로오스, 그리고 0.01% 폴리소르베이트 80. 이러한 조성물은 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 분말이 전체 용적에서 재구성될 때, 조성물은 동일한 제제를 유지한다. 대안으로, 분말은 절반 용적에서 재구성될 수 있는데, 이러한 사례에서 조성물은 pH 5.8에서 본 발명의 10-200 mg 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 20 mM 히스티딘, 10% 수크로오스, 그리고 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함한다.
한 구체예에서, 용량의 일부는 정맥내 일시 주사에 의해 투여되고, 그리고 나머지는 항체 제제의 주입에 의해 투여된다. 가령, 일부 구체예에서, 약 0.001 내지 약 200 mg/kg, 예를 들면, 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 0.001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위에서 변하는 양의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 정맥내 주사를 통해 일시 주사로서 제공되고, 그리고 항체 용량의 나머지는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 미리 결정된 용량의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예로서, 1 시간 내지 2 시간 내지 5 시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
추가 구체예에서, 용량의 일부는 일시 주사의 형태에서 정맥내 투여, 피하 주사 및/또는 주입에 의해 투여되고, 그리고 나머지는 항체 제제의 주입에 의해 투여된다. 일부 예시적인 용량에서, 항체 제제는 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약 0.001 내지 약 200 mg/kg, 예를 들면, 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 0.001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 정맥내 주사의 범위에서 변하는 용량에서 정맥내 또는 피하 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 용량은 일시 주사로서 제공될 수 있고, 그리고 항체 용량의 나머지는 피하 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 미리 결정된 용량의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 예로서, 1 시간 내지 2 시간 내지 5 시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
본원에서 제시된 바와 같은 예시적인 제제는 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성제, 바람직하게는 서로에 부정적인 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 또한 내포할 수 있다. 가령, 다른 특이성을 갖는 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 또는 이에 더하여, 조성물은 항염증제, 화학요법 작용제, 세포독성 작용제, 사이토킨, 성장 저해제 및/또는 소형 분자 효소 저해제 또는 수용체 조절인자를 포함할 수 있다. 이런 분자는 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 적절히 존재한다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 무균이거나, 또는 거의 그러해야 한다. 이것은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
다양한 구체예에서, 본원에서 설명된 제약학적 조성물의 예시적인 제제는 제약학적 제제의 분야에서 폭넓게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 이런 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 또는 그 이상의 다른 보조 성분과 합치고, 그리고 이후, 바람직하면, 산물을 원하는 단일-또는 다중 용량 단위로 포장하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 또한, 소포, 특히, 하나 또는 그 이상의 리포솜 표면 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 항체 및 이들의 항체 단편을 내포하는 리포솜에 담겨 전달될 수 있는데, 이들은 특정한 세포 또는 장기 내로 선별적으로 수송되고, 따라서 표적화된 약물 전달을 증강한다.
선택된 매체에서 활성 성분(들)의 최적 농도는 당업자에게 널리 공지된 절차에 따라 경험적으로 결정될 수 있고, 그리고 원하는 궁극적인 제약학적 제제 및 이용되는 용도에 의존할 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제약학적 조성물의 성분 중에서 하나 또는 그 이상으로 충전된 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공하는데, 이것은 최소한, 본원에서 설명된 바와 같은 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 것이다. 다른 구체예에서, 키트는 제약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 희석제를 제공하는 하나 또는 그 이상의 추가 용기를 내포할 수 있다. 한 구체예에서, 키트는 최소한 하나의 용기를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 용기는 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에서 개시된 제약학적 조성물 및/또는 항염증성 약물 및/또는 세포독소를 포함하는 면역접합체 및/또는 화학요법 약물 및/또는 면역억제제 및/또는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 시트룰린-HLR-DR4 매개된 질환 또는 장애의 치료를 위해, 최종 제약학적 조성물을 제조하고 이를 치료가 필요한 개체에게 투여하기 위한 한 세트의 사용설명서를 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 본원에서 설명된 활성제의 적절한 용량은 예로서, 치료에 영향을 주는 것으로 당해 분야에서 공지되거나 또는 의심되는, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일부 구체예에서, 견실한 의료 관례에 따르면, 초기 용량은 적정 용량보다 다소간 적은 양으로 시작되고, 그리고 그 후에, 임의의 음성 부작용에 비하여 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지, 작은 증분으로 증가될 것이다. 중요한 진단적 척도는 예로서, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 사이토킨의 수준, 자가항체 역가, 조직 손상, 또는 시트룰린-HLR-DR4 매개된 질환 경과, 예를 들면, 류마티스성 관절염에서 추정된 활성 또는 시기를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에 대한 독성 없이, 특정 개체, 조성물 및 투여 방식에서 원하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 획득하기 위해 변할 수 있다. 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 하나 또는 그 이상의 투여 양상에 의해, 예를 들면, 정맥내 주사, 연속 주입, 또는 예로서, 1 일, 여러 일, 1 주 또는 주당 1-7 회의 간격을 두고 투약에 의해 개체, 예를 들면, 인간 개체에게 투여될 수 있다. 용량은 비경구, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 제공될 수 있다.
단지 실례로서, 그리고 적절한 용량 및 투약 빈도를 결정하기 위한 다양한 인자를 고려하여, 치료가 필요한 환자에게 투여되는 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 예시적인 용량은 예로서, 1 내지 4 주, 또는 1 내지 8 주, 또는 1 내지 12 주, 또는 1 내지 14 주 동안, 또는 치료적으로 필요에 따라 1 개월 내지 수년의 범위에서 변하는 기간 동안 하루 1회 또는 그 이상 및/또는 주당 1회 또는 그 이상 투약되는, 약 0.01 내지 약 100 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 50, 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 10, 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 예시적인 투약 섭생은 유의미한 바람직하지 않은 부작용을 방지하는 최대 용량 또는 투약 빈도의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 전체 일일 또는 주간 용량은 최소한 0.05 μg/kg 체중, 최소한 0.2 μg/kg, 최소한 0.5 μg/kg, 최소한 1 μg/kg, 최소한 10 μg/kg, 최소한 100 μg/kg, 최소한 0.2 mg/kg, 최소한 0.5 mg/kg, 최소한 1.0 mg/kg, 최소한 2.0 mg/kg, 최소한 10 mg/kg, 최소한 15 mg/kg, 최소한 20 mg/kg, 최소한 25 mg/kg, 또는 최소한 50 mg/kg, 또는 최소한 또는 최소한 100 mg/kg일 수 있다.
다른 실례에서, 치료가 필요한 환자에게 투여되는 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 예시적인 용량 (이것은 치료적으로 유효 용량, 또는 치료 용량일 수 있다)은 단일 용량, 예를 들면, 단위 용량, 또는 하루에 2회 이상 투여되는 분할 용량에서 투여되는, 하루에 투약된 환자 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 약 200 mg/kg일 수 있다. 치료가 필요한 개체에 대한 용량은 0.001 mg/kg 및 200 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 100 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 50 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 25 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 10 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 5 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 1 mg/kg, 0.001 mg/kg 및 0.5 mg/kg 사이, 그리고 이들 사이에 임의의 복용량일 수 있다. 무제한적 실례로서, 본 발명에 따른 치료는 24, 12, 8, 6, 4 또는 2 시간마다, 또는 이들의 임의의 조합의 단일 또는 분할 용량을 이용하여, 치료의 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 일자 중에서 최소한 하나, 또는 대안으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 주차 중에서 최소한 하나, 또는 이들의 임의의 조합에서, 하루에 약 0.1-100 mg/kg, 예를 들면, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 양으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 일일 용량으로서 제공될 수 있다.
질환의 심각도 및 본원에서 논의된 다양한 인자에 따라, 치료의 용량, 빈도 및 지속 기간은 당업자에게 공지된 적절한 의학적 표준에 비추어, 그에 맞게 조정될 수 있다. 일정한 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 최소한 약 0.1 mg 내지 약 800 mg, 약 1 내지 약 500 mg, 약 5 내지 약 300 mg, 또는 약 10 내지 약 200 mg, 내지 100 mg 또는 내지 50 mg의 초기 용량으로서 투여될 수 있다. 첫 번째 용량은 초기 부하 용량일 수 있고, 차후에 복수의 유지 용량이 뒤따른다. 일정한 예시적인 구체예에서, 초기 용량은 초기 용량과 거의 동일하거나 또는 이보다 적을 수 있는 양으로 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 두 번째 또는 복수의 차후 용량의 투여가 뒤따를 수 있는데, 여기서 차후 용량은 최소한 1 일 내지 3 일; 최소한 1 주, 최소한 2 주; 최소한 3 주; 최소한 4 주; 최소한 5 주; 최소한 6 주; 최소한 7 주; 최소한 8 주; 최소한 9 주; 최소한 10 주; 최소한 12 주; 또는 최소한 14 주 분리되거나, 또는 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투약은 반복될 수 있고, 그리고 투여가 최소한 1 일, 2 일, 3 일, 5 일, 10 일, 15 일, 30 일, 45 일, 2 개월, 75 일, 3 개월, 또는 최소한 6 개월 분리될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 루트는 예로서, 국소 또는 피부 적용, 정맥내, 복막내, 피하, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내, 피내, 뇌척수내, 병소내, 피하, 낭내, 피막하, 거미막하, 척주내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입에 의한 주사 또는 주입, 또는 지속된 방출 시스템 또는 이식물일 수 있다. 주사가능 제조물은 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 복용 형태를 포함할 수 있다. 다양한 재활용가능 펜 및 자기주사기 전달 장치는 본 발명의 제약학적 조성물의 피하 전달에서 적용을 갖는다. 실례는 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에서 본원에서 예기된 예시적인 펜 기초된 전달 방법으로서 AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DIS-ETRONIC™ 펜 (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMA-LOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind.), NOVOPEN™ I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nor-disk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™ OPTIPEN STARLET™, 그리고 OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)를 포함하지만 이들에 명백히 한정되지 않는다. 본 발명의 제약학적 조성물의 피하 전달에서 적용을 갖는 펜 기초된 장치의 예시적인 실례는 SOLOSTAR™ 펜 (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), 그리고 KWIKPEN™ (Eli Lilly)을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 예로서, 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 2010 ACR/EULAR RA 분류 기준에 비추어, 개체가 류마티스성 관절염을 앓는 것으로 간주될 때, 견실한 의료 관례에 따른 하나 또는 그 이상의 관절염 기준을 전시하는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 미분류 염증성 관절염 또는 미분류 활액막염을 나타내거나, 또는 본원의 표 1에서 나타나 있는 바와 같은 류마티스성 관절염에 대한 2010 American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism 분류 기준에 따른 명확한 RA를 앓는 것으로 확인되는 개체는 본 발명에 따른 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편으로 치료될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 의한 치료는 임의의 시점에서 시작되고, 그리고 증상이 해결될 때까지 또는 증상의 관해에 의해 지시된 바와 같은 미리 결정된 기간 동안 또는 부정 기간 동안 지속될 수 있다.
표 1. 류마티스성 관절염에 대한 2010 American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism 분류 기준
점수
표적 집단 (누가 시험되어야 하는 가?): 다음의 환자:
1) 명확한 임상적 활액막염 (팽화)을 앓는 최소한 1개의 관절을 가짐*
2) 다른 질환에 의해 더욱 우수하게 설명되지 않는 활액막염을 앓음†
RA에 대한 분류 기준 (점수-기초된 알고리즘: 범주 A-D의 점수를 덧셈한다;
환자가 명확한 RA를 앓는 것으로 분류하기 위해 ~6/10의 점수가 필요하다)‡
A. 관절 침범§
1 큰 관절
Figure pct00001
 0
2-10 큰 관절 1
1-3 작은 관절 (큰 관절의 침범이 있거나 또는 없음)# 2
4-10 작은 관절 (큰 관절의 침범이 있거나 또는 없음) 3
> 10 관절 (최소한 1개의 작은 관절)** 5
B. 혈청학 (분류를 위해 최소한 1개의 시험 결과가 필요하다)††
음성 RF 및 음성 ACPA 0
낮은-양성 RF 또는 낮은-양성 ACPA 2
높은-양성 RF 또는 높은-양성 ACPA 3
C. 급성-시기 반응물 (분류를 위해 최소한 1개의 시험 결과가 필요하다)‡‡
정상적인 CRP 및 정상적인 ESR 0
비정상적인 CRP 또는 비정상적인 ESR 1
D. 증상의 지속 기간§§
<6 주 0
~6 주 1
* 이들 기준은 새로운 표현 환자의 분류를 목표로 한다. 이에 더하여, 2010 기준의 사전 충족과 양립하는 병력과 함께 류마티스성 관절염 (RA)을 대표하는 미란성 질환을 앓는 환자는 RA를 앓는 것으로 분류되어야 한다. 질환이 비활성이고 (치료를 받거나 또는 받지 않음) 후향적으로 가용한 데이터에 근거하여, 2010 기준을 사전에 충족한 환자를 비롯하여, 오래된 질환을 앓는 환자는 RA를 앓는 것으로 분류되어야 한다.
† 감별 진단은 상이한 표현을 갖는 환자 사이에서 달라지지만, 전신성 홍반성 루푸스, 건선성 관절염 및 통풍과 같은 질환을 포함할 수 있다. 고려할 만한 유관한 감별 진단이 불명확하면, 류마티스병전문의의 상담을 받아야 한다.
‡ 비록 < 6/10의 점수를 갖는 환자는 RA를 앓는 것으로 분류가능하지 않지만, 이들의 상태는 재사정될 수 있고, 그리고 기준이 시간의 추이에서 점증적으로 충족될지도 모른다.
§ 관절 침범은 검사 시에 임의의 팽화된 또는 연한 관절을 지칭하는데, 이것은 활액막염의 증거를 영상화함으로써 확증될 수 있다. 원위 지골간 관절, 첫 번째 수근중수 관절 및 첫 번째 중족관절은 사정으로부터 배제된다. 관절 분포의 범주는 침범된 관절의 위치와 숫자에 따라서 분류되는데, 관절 침범의 패턴에 근거하여 가능한 가장 높은 범주에 배치된다.
Figure pct00002
"큰 관절"은 어깨, 팔꿈치, 엉덩이, 무릎 및 발목을 지칭한다.
# "작은 관절"은 중수지절 관절, 근위지 관절, 두 번째 내지 다섯 번째 중족관절, 엄지손가락 지골간 관절 및 손목을 지칭한다.
** 이러한 범주에서, 침범된 관절 중에서 최소한 1개는 작은 관절이어야 한다; 다른 관절은 큰 관절과 추가 작은 관절의 임의의 조합뿐만 아니라 다른 곳에서 특이적으로 열거되지 않은 다른 관절 (가령, 측두하악, 견쇄, 흉쇄 등)을 포함할 수 있다.
†† 음성은 실험실 및 검정에 대한 정상치 상한 (ULN)보다 낮거나 또는 이와 동등한 IU 값을 지칭한다; 낮은-양성은 실험실 및 검정에 대한 ULN보다 높지만 ULN의 3 배 이하인 IU 값을 지칭한다; 높은-양성은 실험실 및 검정에 대한 ULN의 >3 배인 IU 값을 지칭한다. 류마티스양 인자 (RF) 정보가 단지 양성 또는 음성으로서만 가용한 경우에, 양성 결과는 RF에 대한 낮은-양성으로서 채점되어야 한다. ACPA = 항-시트룰린화 단백질 항체. ‡‡ 정상/비정상은 지역 실험실 기준에 의해 결정된다. CRP = C-반응성 단백질; ESR = 적혈구 침강 속도.
§§ 증상의 지속 기간은 치료 상태와 상관없이, 사정의 시점에서 임상적으로 침범된 관절의 활액막염의 징후 또는 증상 (가령, 통증, 팽화, 압통)의 지속 기간의 환자 자가-보고를 지칭한다.
본 발명에 따른 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 진단에서 또는 연구 도구로서 이용될 수 있다. 가령, 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 항체는 사이토킨 생산 (가령, TNF-α, IL-6 및 IL-17) T-세포 증식의 상향조절 및 다른 친염증성 세포의 모집을 비롯한 T 세포 매개된 면역 활성을 증진하는데 있어서 원인체인, 시트룰린화 HLA-DR4 공유된 에피토프를 보유하는 항원 제시 세포의 존재에 대해 시험하기 위한 진단 키트에서 양성 대조로서 포함될 수 있다.
시험관내에서 이용될 때 이들 항체 또는 이들의 특이적 결합 단편에 대한 적절한 농도는 10 ng/mL 내지 100 μg/mL일 수 있다. 낮은 배경 (우수한 신호 대 잡음 비율)에서 적합한 신호를 산출하는 적절한 농도는 당업자에 의해 발견될 수 있다. 항체의 희석을 위한 적합한 매체 역시 당해 분야에서 알려져 있고, 그리고 예로서, BSA로 임의선택적으로 보충된 인산염 완충된 식염수일 수 있다.
본 발명의 한 가지 추가 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 진단 키트이다. 이런 키트는 바람직하게는, ELISA 평판, 유세포분석법, 또는 항체 분석을 위한 다른 플랫폼뿐만 아니라 항체, 예를 들면, 표지화된-항인간 항체의 검출을 위한 시약 및 적합한 완충액을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 시험관내 진단에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 초기에, 환자의 백혈구의 표면 상에 제시된 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA의 존재에 대해 선별검사될 수 있다. 이러한 진단 시험은 본 발명에 따른 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 모이어티, 예를 들면, 형광 단백질 또는 작용제 (가령, 플루오레세인 또는 GFP), 방사성 표지, 화학발광 표지 등으로 표지화된다. 환자의 백혈구, 예를 들면, 항원 제시 세포 (가령, B 세포)의 표면 상에서 시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA의 존재는 본원에서 규정된 바와 같은 자가면역 질환을 앓는 개체가 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 치료가능할 수 있다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, RA를 앓는 것으로 확증될 수 없지만 치료에 대한 적합한 후보일 수 있는 개체는 그들이 시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA를 보유하는 지를 결정하기 위해, 하나 또는 그 이상의 진단 시험이 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 진단 시험은 말초혈 B 세포 상에서 시트룰린화된 공유된 에피토프의 존재를 검출하는데 이용될 것이다. 여러 검정, 예를 들면, 1) 항-Cit SE mAb를 이용한 유세포분석법; 2) 샌드위치에서 포획 항체 (가령, IF9 단일클론 항- QKCitAA SE HLA-DR4 항체 및 비-시트룰린화 선천적 에피토프를 인식하는 두 번째 항-DR4 mAb)와 동일한 mAb를 이용한 세포 용해물의 ELISA; 및 3) 시험되는 개체로부터 B 세포 용해물로부터 면역침전된 HLA-DR4의 질량 분광분석법 분석이 이용될 수 있었다. 면역침전은 임의의 항-HLA-DR4 mAb (가령, 항- DR4 mAb (L243))를 이용할 수 있었다. 면역침전된 물질은 이후, 트립신 소화에 종속될 수 있었고, 그리고 결과의 펩티드는 LC-질량 분광분석법 또는 MS을 이용하여 분해되고 확인될 수 있었는데, 그 이유는 시트룰린화 에피토프 펩티드가 에피토프 QKRAA, QRRAA 또는 RRRAA에서 아르기닌 잔기 중에서 하나가 시트룰린화되지 않은 경우보다 클 것으로 예상되는 질량을 가질 것이기 때문이다. 일부 구체예에서, 진단 검정이 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제약학적 조성물을 이용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 개체를 확인하는데 이용될 수 있다. 상기 진단 검정에서, RA 환자에서 류마티스성 윤활막의 분자 영상화는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT) 영상화를 위해 99mTc로 표지화된, 또는 광학적 영상화의 근적외선 염료 (NIR)로 표지화된 본 발명의 항-시트룰린화된 공유된 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1. 시트룰린화 EQKCitAA 펩티드 합텐에 대한 단일클론 항체의 생산
생쥐의 면역화
아미노산 서열 C-아미노헥사노익산-EQKCitAA를 갖는 펩티드는 Cayman Chemical의 과학자들에 의해 설계되었고, 그리고 이의 합성은 LifeTein, LLC와 계약되었다. 운반 단백질에 화학적 연쇄를 허용하기 위해 N 말단 시스테인 (C)이 통합되었다. 아미노헥사노익산은 운반 단백질 및 원하는 합텐 사이에 물리적 공간을 제공하는 링커이다. DRB1*0401로부터 총 6개 아미노산, 아미노산 69-74 (EQKRAA)가 합텐으로서 포함되었는데, 위치 72에서 정상적으로 발견되는 아르기닌 (R)은 아미노산 시트룰린 (Cit)에 의해 대체되었다. 이러한 펩티드는 "면역원"을 생산하기 위해, 상업적인 키트 (Imject 말레이미드 활성화된 운반 단백질 스핀 키트, Thermo Scientific)를 이용하여 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 운반 단백질에 연계되었다.
상기 면역원은 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 200 μg/ml의 농도로 희석되었다. 0 일자에, 1 ml의 면역원이 1 ml의 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA)와 혼합되고 유화되었다. 3마리 BALB/c 암컷 생쥐는 각각, 50 μg의 면역원:CFA 유제로 복막내 (IP) 면역화되었다. 14 및 34 일자에, 1 ml의 면역원이 1 ml의 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)와 혼합되고 유화되었다. 3마리 BALB/c 암컷 생쥐는 각각, 다시 한 번 50 μg의 면역원:IFA 유제로 IP 주사되었다 (부양되었다). 65 일자에, 50 μg의 면역원이 어쥬번트 없이 생쥐의 꼬리 정맥 내로 주사되었다. 68 일자에, 1마리 생쥐가 희생되고 하이브리도마 생산을 위해 비장이 수확되었다.
단일클론 항체의 생산
무균 단일 세포 현탁액이 RPMI-1640 기초 배지에서 생쥐 비장 세포로부터 만들어졌다. 비장 내에 적혈구는 TRIS-완충된 염화암모늄으로 처리에 의해 용해되었다. 나머지 백혈구는 RPMI-1640에서 세척되고, RPMI-1640에서 재현탁되고, 그리고 5:1 비장 세포/골수종 비율에서 P3x63Ag8.653 골수종 세포와 조합되었다. 이들 세포는 펠렛화되었고, 액체는 흡인되었고, 그리고 세포 펠렛은 세포 융합 및 하이브리도마 형성을 유도하기 위해 50% 폴리에틸렌 글리콜로 처리되었다. 융합된 세포는 96-웰 조직 배양 평판 내로 파종되고, 그리고 하이브리도마에 대해 선별하기 위해 HAT 배지에서 성장되었다. 10 일의 선별 후, 상층액은 면역원의 펩티드 부분에 결합할 수 있는 단일클론 항체의 존재에 대해 시험되었다. 이러한 선별검사는 평판-결합된 합텐 펩티드 (C-아미노헥사노익산-EQKCitAA)에 대하여 ELISA에 의해 수행되었다. 유사하게, 선택성을 결정하기 위한 계수기-선별검사가 시트룰린 대신에 아르기닌을 내포하는 평판-결합된 대조 펩티드 (C-아미노헥사노익산-EQKRAA)에 대하여 ELISA에 의해 수행되었다. 한 가지 단일클론 항체, 1F9는 시트룰린-내포 펩티드에는 결합하지만 아르기닌 내포 펩티드에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 단일클론 항체는 평판 결합된 인간 알파 에놀라아제, 시트룰린화 인간 알파 에놀라아제, 히스톤 H3 (전장 단백질), 시트룰린화 히스톤 H3 (전장 단백질), 히스톤 H3 꼬리 펩티드 (아미노산 1-21), 그리고 시트룰린화 히스톤 H3 꼬리 펩티드 (R2, R8 및 R17에서 시트룰린화)에 결합에 대해 ELISA에 의해 더욱 특징되었다. 1F9 항체는 시트룰린화 합텐 펩티드 (C-아미노헥사노익산-EQKCitAA)에만 결합하였다. 이것은 시트룰린화의 여부에 상관없이, 시험된 어떤 다른 펩티드 또는 단백질에도 결합하지 않았다. 이것은 1F9 단일클론 항체가 공유된 에피토프 서열의 시트룰린화 형태에 특이적이라는 것을 지시한다. 1F9 단일클론 항체의 특이적 결합이 공유된 에피토프 서열의 시트룰린화 형태에 특이적이라는 발견을 뒷받침하기 위해, 다양한 항원이 96 웰 평판에서 도말되고 다양한 농도의 1F9 단일클론 항체를 이용하여 선별검사되었다. 이들 평판을 코팅하는데 이용된 항원은 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKRAA), 시트룰린화 MHC 클래스 II 펩티드 (EQKCitAA), 에놀라아제, 시트룰린화 에놀라아제, H3 단백질 및 시트룰린화 H3 단백질을 포함하였다. 도면 2a와 2b에서 보여 지는 바와 같이, 1F9 단일클론 항체는 시트룰린화 펩티드에 특이적으로 결합한다. 심지어 펩티드, 예를 들면, H3 (1-21) 펩티드 및 시트룰린화 H3 펩티드 (1-21) (위치 2, 8 및 17에서 Cit 아르기닌)가 1F9 단일클론 항체의 특이성을 시험하는데 이용될 때에도, 단지 시트룰린화 MHC 클래스 II 펩티드만 IF9 단일클론 항체에 특이적으로 결합하였다.
실시예 2. HLA-DR4 유전자도입 생쥐로부터 B 세포 상에서 DRB1 * 0401 단백질의 시험관내에서 재조합 PAD4로 시트룰린화
내인성 생쥐 MHC 클래스 II 발현의 부재에서 인간 HLA-DRB1*0401 유전자를 발현하는 생쥐는 Taconic, 모형 # 4149-F 또는 4149-M으로부터 획득된다. 이들 생쥐의 비장으로부터 B 세포는 공유된 에피토프 아미노산 서열 QKRAA를 내포하는 DRB1*0401 베타 사슬을 포함하는 HLA-DR4 이형이합체성 단백질을 그들의 표면 상에서 발현한다. 이들 생쥐 중에서 1마리로부터 비장이 무균 조건 하에 수확되고, 그리고 단일 세포 현탁액이 Current Protocols in Immunology, Unit 3.1, "Isolation of Mouse Mononuclear Cells"에서 설명된 바와 같이 생산되는데, 이것의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다. 이들 비장 세포는 1 mM CaCl2로 보충된 TRIS-완충된 식염수에서 1 x 107 세포/ml에서 현탁된다.
비장 세포의 0.5 mL의 분취량은 37℃에서 30 분 동안 mL당 0, 0.05, 0.2, 1 및 5 μg에서 재조합 인간 PAD4 (Cayman Chemical, 카탈로그 번호 #10500, Ann Arbor, MI USA)로 처리된다. 이들 세포는 150 x g에서 5 분 동안 원심분리되고, 상층액은 폐기되고, 그리고 세포 펠렛은 0.2 ml FACS 완충액 (0.1% 소 혈청 알부민 및 0.01% 아지드화나트륨으로 보충된 Hanks 균형 염 용액)에서 재현탁된다.
세포 현탁액에 2 μL의 FITC-접합된 항-B220 mAb (BioLegend 카탈로그 #103205) 및 2 마이크로그램의 APC-접합된 1F9 mAb가 첨가된다. 항-B200은 모든 B 세포를 염색하고, 그리고 1F9 mAb는 시트룰린화된 공유된 에피토프를 발현하는 B 세포만을 염색한다. 이들 세포는 얼음 위에서 30 분 동안 배양되고, 150 x g에서 원심분리되고, 그리고 펠렛이 FACS 완충액에서 재현탁된다. 이들 세포는 유세포분석법에 의해 분석된다. PAD4 처리는 1F9 항체에 의해 차후에 인식되는, DRB1*0401 사슬의 공유된 에피토프 영역의 시트룰린화를 유발한다.
실시예 3. HLA-DR4 유전자도입 생쥐로부터 B 세포 상에서 DRB1 * 0401 단백질의 시트룰린화는 T 세포 증식 및 사이토킨 생산을 유도한다
재조합 인간 PAD4 (Cayman Chemical, 카탈로그 번호 #10500, Ann Arbor, MI USA)는 제조업체의 사용설명서에 따라서, Solulink (Solulink Inc., 카탈로그 번호 S-1002, San Diego, CA USA)로부터 S-HyNic/4FB 접합 기술을 이용하여 1:1 몰 비율에서 염소 항생쥐 IgG/IgM/IgA 항체 (ThermoFisher 카탈로그 번호 A-10666)에 화학적으로 연계된다. 본질적으로, 재조합 인간 PAD4는 S-HyNic 링커 (숙신이미딜-6-히드라지노-니코틴아미드)에 접합되고, 그리고 염소 항생쥐 IgG/IgM/IgA 항체에 연계된 4FB (4-포르밀 벤즈아미드) 링커를 통해 염소 항생쥐 IgG/IgM/IgA 항체에 접합된다. HyNic-변형된 재조합 인간 PAD4는 제조업체의 프로토콜 (Solulink Inc., 카탈로그 번호 S-2006-105, San Diego, CA USA)에 따라서, TurboLink™ 촉매된 접합 반응에서 4FB-변형된 염소 항생쥐 IgG/IgM/IgA 항체와 함께 배양된다.
결과는 354 nm에서 계측가능한 흡광도를 갖는 UV-추적가능, 안정된 결합 (비스-아릴히드라존)을 통해 접합된 재조합 인간 PAD4/염소 항생쥐 IgG/IgM/IgA 항체 복합체이다. 이러한 "PAD4/항생쥐 Ig 접합체"는 완전한 배지에서 1 mg/mL의 농도로 희석되고, 무균 여과되고, 그리고 4℃에서 보관된다.
내인성 생쥐 MHC 클래스 II 발현의 부재에서 인간 HLA-DRB1*0401 유전자를 발현하는 생쥐는 Taconic, (Abb 녹아웃/유전자도입 HLA-DR4 카탈로그 번호 4149-F 또는 4149-M Taconic Biosciences Rensselaer, NY USA)으로부터 획득된다. 이들 생쥐의 비장으로부터 B 세포는 공유된 에피토프 서열 QKRAA을 내포하는 DRB1*0401 베타 사슬을 포함하는 HLA-DR4 이형이합체성 단백질을 그들의 표면 상에서 발현한다. 이들 생쥐 중에서 1마리로부터 비장이 무균 조건 하에 수확되고, 그리고 단일 세포 현탁액이 Current Protocols in Immunology, Unit 3.1, "Isolation of Mouse Mononuclear Cells"에서 설명된 바와 같이 생산되는데, 이것의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다. 이들 비장 세포는 2 x 106/mL의 농도에서 "완전한 배지" (10% 소 태아 혈청, 1 mM CaCl2 및 항생제로 보충된 RPMI-1640)에서 현탁되고 얼음 위에서 30 분 동안 4℃로 냉각된다.
10 ml (2 x 107 전체 세포)의 비장 세포 현탁액은 4℃에서 5 분 동안 150 x g에서 원심분리되고, 상층액은 폐기되고, 그리고 세포 펠렛은 1 mL의 4℃ 완전한 배지에서 재현탁된다. 이러한 1 mL의 비장 세포 현탁액에, 100 μL의 무균 PAD4/항생쥐 Ig 접합체가 첨가되고 얼음 위에서 1 시간 동안 배양된다. 이들 세포는 이후, 4℃에서 5 분 동안 150 x g에서 원심분리되고, 상층액은 폐기되고, 그리고 세포 펠렛은 10 ml의 4℃ 완전한 배지에서 재현탁된다. 이들 세포는 다시 한 번, 4℃에서 5 분 동안 150 x g에서 원심분리되고, 상층액은 폐기되고, 그리고 세포 펠렛은 10 mL의 4℃ 완전한 배지에서 재현탁된다. 이러한 현탁액 내에 B 세포 상에서 표면 면역글로불린 수용체는 현재, 항생쥐 Ig/PAD4 접합체에 의해 결합되고, 그리고 결합되지 않은 접합체는 씻겨 내려갔다.
시트룰린화된 공유된 에피토프에 결합하는 1F9 단일클론 항체는 완전한 배지에서 1 mg/mL로 희석되고, 무균 여과되고, 그리고 즉석 이용 때까지 4℃에서 유지된다.
무균 96-웰 둥근 바닥 마이크로역가 평판에서, 비장 세포 및 항체는 혼합되고 다음의 조건에서 배양된다:
A. PAD4/항생쥐 Ig 접합체 플러스 100 μL의 완전한 배지로 처리되지 않는 100 μL의 비장 세포 현탁액 (2 x 105 세포)을 내포하는 6개 웰.
B. PAD4/항생쥐 Ig 접합체 플러스 100 μL의 완전한 배지로 처리되는 100 μL의 비장 세포 현탁액 (2 x 105 세포)을 내포하는 6개 웰.
C. PAD4/항생쥐 Ig 접합체 플러스 100 μL의 1F9 단일클론 항체 희석액으로 처리되지 않는 100 μL의 비장 세포 현탁액 (2 x 105 세포)을 내포하는 6개 웰.
D. PAD4/항생쥐 Ig 접합체 플러스 100 μL의 1F9 단일클론 항체 희석액으로 처리되는 100 μL의 비장 세포 현탁액 (2 x 105 세포)을 내포하는 6개 웰.
96-웰 평판은 72 시간 동안 37℃ CO2 인큐베이터로 이전된다. 72 시간의 배양 후, 각 조건에서 6개 웰 중에서 3개에 대한 상층액이 제거되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서 TNF-α의 생산에 대해 ELISA에 의해 사정된다 (가령, TNF-α (생쥐) ELISA 키트 카탈로그 번호 500850 Cayman Chemical, Ann Arbor, MI USA를 참조한다). 각 조건에서 나머지 3개 웰의 경우에, 각 웰에서 T 세포 증식의 정도가 Current Protocols in Immunology, Unit 7.10.16, Support Protocol 2에서 설명된 바와 같이 3H-티미딘 통합에 의해 사정되는데, 이것의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
조건 A 또는 C 하에 TNF-α 생산 또는 T 세포 증식은 전혀 검출되지 않는다. 가장 높은 수준의 TNF- α 생산 및 T 세포 증식은 조건 B 하에 검출된다. 중간 수준의 TNF- α 및 T 세포 증식은 조건 D 하에 검출된다.
실시예 4. RA 환자로부터 단리된 B 세포 상에서 시트룰린화 HLA-DRB1 * 0401의 확인
항-시트룰린화 단백질 항체 양성 (ACPA+) 류마티스성 관절염을 앓는 인간 환자 및 건강한 대조로부터 획득된 새로 뽑혀진 말초혈은 Dx Biosamples (San Diego CA USA) (또는 다른 유자격 판매자)로부터 구입된다. 2 mL의 각 혈액 표본은 적혈구를 용해하기 위해 실온에서 10 분 동안 20 ml ACK 용해 완충액 (Thermo Fisher 카탈로그 #A1049201)에 첨가된다. 이들 표본은 이후, 150 x g에서 5 분 동안 원심분리되고, 그리고 살아있는 백혈구를 내포하는 세포 펠렛은 2 mL의 용해 완충액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 10 mM 요오드아세트아미드 및 단백질분해효소 저해제 (Roche))에서 재현탁된다. 용해물은 불용성 물질을 제거하기 위해 10,000 x g에서 30 분 동안 원심분리된다. 투명해진 용해물은 새로운 튜브로 이동되고, 그리고 4℃에서 30 분 동안 50 μL의 세파로오스 비드와 함께 배양된다 (미리 투명해진다). 용해물은 세파로오스를 펠렛으로 만들기 위해 10,000 x g에서 10 분 동안 원심분리된다. 미리 투명해진 용해물은 새로운 튜브로 이전되고, 그리고 100 μg의 생쥐 항인간 HLA-DR [L243] 단일클론 항체 (Abcam, 항-HLA DR 항체 [L243], 카탈로그 번호 ab136320, Cambridge, MA USA)에 공유적으로 연계된 50 μL의 세파로오스 비드가 용해물에 첨가되고 회전하면서 1 시간 동안 배양된다. 용해물 및 L243-세파로오스는 회전하면서 4℃에서 4 시간 동안 배양된다. 이들 튜브는 테이블톱 마이크로퓨즈에서 1,000 x g에서 10 분 동안 원심분리되고, 그리고 상층액이 펠렛화된 L243-세파로오스 접합체로부터 폐기된다. L243-세파로오스 접합체는 1 mL의 용해 완충액으로 세척되고, 그 이후에 20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, pH8.0을 내포하는 1 mL의 세척 용액으로 세척된다. HLA-DR 분자는 0.5 mL의 0.1 M 글리신-HCl, pH 3.0의 첨가에 의해 L243-세파로오스 접합체로부터 용리된다. 용리된 HLA-DR4 분자는 공유된 에피토프 영역 QKRAA의 시트룰린화가 있는 지를 결정하기 위한 트립신 소화 아미노산 분석을 위해 MS Bioworks, (Ann Arbor MI, USA)에 보내진다.
본 발명이 상세한 설명과 함께 설명되긴 했지만, 전술한 설명은 발명을 예시하고 발명의 범위를 한정하지 않는 것으로 의도되고, 상기 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정되는 것으로 이해된다. 다른 양상, 이점 및 변형은 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (14)

  1. 아미노산 서열: QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA를 포함하는 HLA-DR4 시트룰린화된 공유된 에피토프의 존재에 의해 매개된, 인간 개체에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 치료 효과량을 치료가 필요한 인간 개체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 자가면역 질환은 염증성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 라임병 유도된 관절염, 류마티스성 관절염, 히드랄라진-유도된 여성 전신성 홍반성 루푸스, 천포창양 임신, 낙엽성 천포창, 폐쇄성 비대 심근병증, 건선성 관절염, 건선, IgA 신장병증, '공유된 증후군'-전신 경화증/류마티스성 관절염 및 류마티스성 다발근육통증인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 자가면역 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 1형 당뇨병 및 라임병 유도된 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 개체는 초기에, 환자의 백혈구의 표면 상에 존재하는 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA의 존재에 대해 선별검사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA의 존재는 환자의 B 세포를 이용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 환자의 B 세포 상에서 시트룰린화 에피토프 QKCitAA의 존재는 환자의 B 세포를 단일클론 항체 IF9와 혼합하고, 그리고 단일클론 항체 IF9 및 시트룰린화 에피토프 QKCitAA 사이에 특이적 결합을 계측함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 환자의 B 세포 상에서 시트룰린화 에피토프 QKCitAA의 존재는 유세포분석법을 이용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 정맥내, 피하 또는 복막내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 환자는 또한, 항염증제, 화학요법 작용제, 세포독성 작용제, 사이토킨, 성장 저해제, 소형 분자 효소 저해제 또는 수용체 조절인자, 또는 이들의 조합이 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. HLA-DR4 상에 존재하는 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA, QRCitAA 또는 RRCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서, 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편.
  13. 청구항 11에 있어서, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전히 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편.
  14. 청구항 13에 있어서, 인간 시트룰린화 에피토프 QKCitAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 단일클론 항체 IF9 또는 이의 항원 결합 단편으로서 지정되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편.
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