JP6114256B2 - Ｃｄ４０を拮抗する抗体ポリペプチド - Google Patents

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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

［技術分野］
CD40を標的とし、かつCD40アゴニスト活性を示さない、抗体およびそのフラグメント、それらを含む組成物、ならびにCD40活性が関わる疾患を処置するためにそれらを使用する方法が提供される。
［関連出願の相互参照］
本願は、2011年4月21日に出願された米国仮特許出願第61/477,904号の利益を主張し、この仮特許出願の内容は全て、引用により、本明細書に組み込まれる。
［配列表］
本願はASCIIフォーマットの配列表を含んでおり、これは、引用により、そのまま本明細書に組み込まれる。2012年4月20日に作成された前記ASCIIコピーは、200896WO.txtと名付けられており、サイズは1,188,533バイトである。
［背景］
CD40は、樹状細胞、B細胞、およびマクロファージを含む抗原提示細胞（APC）上に存在する、腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーに属する共刺激分子である。CD40がTH細胞上のそのリガンドCD154（CD40L）に結合すると、APCは活性化される。CD40を介したAPCの活性化は、サイトカイン生産、共刺激分子（CD86など）のアップレギュレーション、ならびに抗原提示およびB細胞増殖の強化を含むさまざまな免疫応答に関与する。CD40は、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および上皮細胞によっても発現されうる。
CD40の活性化は、自己免疫、移植片拒絶、アレルギー応答などに関係するさまざまな望ましくないT細胞応答にも関与する。望ましくないT細胞応答を制御するための戦略の一つは、CD40をアンタゴニスト抗体の標的にすることである。例えば、かつてChiron 1212と呼ばれていたモノクローナル抗体HCD122（ルカツムマブ（Lucatumumab））は、現在、一定のCD40媒介炎症性疾患の処置に関して臨床試験中である。インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル：clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209（最終更新日2011年1月11日）で、Clinical Trials Feeds「Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma」を参照されたい。しかしモノクローナル抗体はアゴニスト活性を呈しうる。例えば抗CD40抗体Chi220の有用性はその弱い刺激能によって制限される。Adams, et al.「Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival」J. Immunol. 174:542-50 (2005)を参照されたい。
［概要］
部分アゴニスト活性を持たない抗CD40抗体アンタゴニストは、今なお、臨床の場において必要とされている。ヒトCD40の新規エピトープに特異的に結合する新規抗体ポリペプチドを提供する。本CD40エピトープは、競合解析によって示されるとおり、また抗体ポリペプチドとCD40との共結晶化によって得られる構造によって示されるとおり、Chi220エピトープとはオーバーラップしない。本抗体ポリペプチドは、有利なことに、CD40アゴニスト活性を示さない。本抗体ポリペプチドは、自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギー応答を含む、CD40活性化が関わる疾患の処置において有用である。本抗体ポリペプチドは可変ドメインを含む。ある実施形態において、本抗体ポリペプチドは単一可変ドメインを含有するドメイン抗体（dAb）の形態にある。もう一つの実施形態において、dAbは、ヒト血清アルブミン（HSA）などに結合することができる第2可変ドメインを含む二重特異性試薬である。
第1可変ドメインを含む抗体ポリペプチドであって、該抗体ポリペプチドはヒトCD40のエピトープに特異的に結合し、エピトープは配列番号（SEQ ID NO:）1のアミノ酸配列を含み、抗体ポリペプチドはドメイン抗体（dAb）BMS3h-56-269（配列番号417）の結合と競合し、エピトープがTrp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159、およびHis162からなる群より選択される少なくとも一つのCD40アミノ酸残基を含む抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインがBMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-56、およびBMS3h-198からなる系統群より選択される抗体ポリペプチドの一つのアミノ酸配列を含み、第1可変ドメインが1pM〜100nMの見掛けの結合定数を有する抗体ポリペプチドが提供される。さらに、第1可変ドメインが1pM〜10nMの見掛けの結合定数を有する抗体ポリペプチドが提供される。
また、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、（a）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR1領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR1領域、（b）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR2領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR2領域、（c）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR3領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR3領域、（d）BMS3h-56-269（配列番号417）のFR1領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているFR1領域、（e）BMS3h-56-269（配列番号417）のFR2領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているFR2領域、（f）BMS3h-56-269（配列番号417）のFR3領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているFR3領域、および（g）BMS3h-56-269（配列番号417）のFR4領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているFR4領域を含む抗体ポリペプチドも提供される。
また、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、（a）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR1領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR1領域、（b）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR2領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR2領域、（c）BMS3h-56-269（配列番号417）のCDR3領域とは2つまでのアミノ酸で異なっているCDR3領域を含む抗体ポリペプチドも提供される。
さらに、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、BMS3h-56-258（配列番号10）またはBMS3h-56-269（配列番号417）のアミノ酸配列とは10個までのアミノ酸で異なっている抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、BMS3h-56-258（配列番号10）またはBMS3h-56-269（配列番号417）のアミノ酸配列とは5個までのアミノ酸で異なっている抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、BMS3h-56-258（配列番号10）またはBMS3h-56-269（配列番号417）のアミノ酸配列とは2つのアミノ酸で異なっている抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、BMS3h-56-258（配列番号10）またはBMS3h-56-269（配列番号417）のアミノ酸配列とは1つのアミノ酸で異なっている抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、BMS3h-56の系統群から選択され、第1可変ドメインのアミノ酸配列がさらに、（a）配列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp（配列番号1274）［配列中、X1はAspまたはGlyであり、Y1はMetまたはLeuである］を有するCDR1領域；（b）配列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly（配列番号1275）［配列中、X2は、Gln、Tyr、Pro、Trp、またはAlaであり、Y2は、Thr、Ser、Asn、Gly、Met、またはGlnであり、Z2は、Arg、Leu、Tyr、His、またはPheであり、A2はLysまたはMetである］を有するCDR2領域；および（c）配列X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3（配列番号1276）［配列中、X3はLeuまたはProであり、Y3は、Phe、Gln、Thr、またはMetであり、Z3は、Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe、またはMetであり、A3は、Gln、His、Asp、Ser、Lys、Glu、またはGlyであり、B3は、Glu、Asp、またはTyrである］を有するCDR3領域を含む抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインのアミノ酸配列が、（a）配列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1（配列番号1277）［配列中、X1はLeuまたはArgであり、Y1はArgまたはAlaである］を有するFR1領域；（b）配列Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser（配列番号1278）［配列中、X2はGlnまたはArgであり、Y2はLysまたはArgであり、Z2はGlyまたはValである］を有するFR2領域；（c）配列Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys（配列番号1279）［配列中、X3はThrまたはMetであり、Y3はGluまたはAspであり、Z3はAlaまたはSerであり、A3はTyrまたはHisであり、B3はAlaまたはThrである］を有するFR3領域；および（d）配列X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4（配列番号1280）［配列中、X4はTrpまたはArgであり、Y4はGlnまたはProであり、Z4はSerまたはAsnである］を有するFR4領域を含む抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、第1可変ドメインがBMS3h-56-258（配列番号10）またはBMS3h-56-269（配列番号417）のアミノ酸配列を含む抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、BMS3h-37の系統群から選択され、第1可変ドメインが配列：
（配列番号1281）
を含み、X1がGlnまたはArgであり、Y1がGluまたはGlyであり、Z1が、Ala、Leu、またはGluであり、A1がPheまたはTyrであり、B1がTrpまたはArgである抗体ポリペプチドが提供される。
また、BMS3h-38の系統群から選択され、第1可変ドメインが配列：
（配列番号1282）
を含み、X1がThrまたはProであり、Y1がAlaまたはSerであり、Z1がArgまたはGlyであり、A1が、Arg、Ser、Asn、Gln、Gly、His、またはLeuであり、B1が、Tyr、Phe、Trp、またはGlyであり、C1がSerまたはGlyであり、D1がArg、Met、またはProである抗体ポリペプチドも提供される。
また、BMS3h-198の系統群から選択され、第1可変ドメインが配列：
（配列番号1283）
を含み、X1がMetまたはLeuであり、Y1がValまたはPheであり、Z1がAspまたはAsnであり、A1がSerまたはThrであり、B1がTyrまたはHisであり、C1がLysまたはArgであり、D1がAspまたはGluであり、E1がTyrまたはPheであり、F1がTrpまたはArgであり、G1がGlyまたはArgであり、H1がGlnまたはHisである抗体ポリペプチドも提供される。
さらに、ドメイン抗体（dAb）である抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、可変ドメインがFcドメインに融合されている抗体ポリペプチドが提供される。
さらに、ヒトCD40以外の抗原である第2抗原に特異的に結合する第2可変ドメインをさらに含む抗体ポリペプチドが提供される。
また、第2抗原が表面抗原分類（cluster of differentiation）（CD）分子または主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子である抗体ポリペプチドも提供される。
また、第2抗原が血清アルブミン（SA）である抗体ポリペプチドも提供される。
本明細書に開示する抗体ポリペプチドをコードする核酸が提供される。
また、本明細書に開示する核酸を含むベクターも提供される。
また、本明細書に開示するベクターを含む宿主細胞も提供される。
治療有効量の本明細書に開示する抗体ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。また、免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤をさらに含む医薬組成物も提供される。
免疫疾患の処置を必要とする患者における免疫疾患を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に開示する医薬組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。また、医薬組成物が免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤と組み合わせて投与される方法も提供される。
自己免疫疾患または移植片関連疾患である免疫疾患を処置する方法が提供される。さらに、アジソン病、アレルギー、強直性脊柱炎、喘息、アテローム性動脈硬化、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、1型および/または2型糖尿病を含む糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植片拒絶、血管炎、AIDS、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性うつ病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、アルコール嗜癖、および薬物嗜癖からなる群より選択される免疫疾患を処置する方法が提供される。
また、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40のエピトープに特異的に結合する第1可変ドメインを使ってCD40を標的にする方法であって、抗体ポリペプチドがドメイン抗体（dAb）BMS3h-56-269（配列番号417）の結合と競合する方法も提供される。
配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40のエピトープに特異的に結合する第1可変ドメインを含み、ドメイン抗体（dAb）BMS3h-56-201（配列番号9）の結合と競合する抗体ポリペプチド、またはその医薬上許容される塩の、医学における使用が提供される。
免疫疾患を処置するための医薬品の製造における、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40のエピトープに特異的に結合する第1可変ドメインを含み、ドメイン抗体（dAb）BMS3h-56-201（配列番号9）の結合と競合する抗体ポリペプチド、またはその医薬上許容される塩の使用が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤と組み合わせて投与される。さらなる実施形態では、免疫疾患が自己免疫疾患または移植片関連疾患である。さらなる実施形態では、免疫疾患が、アジソン病、アレルギー、強直性脊柱炎、喘息、アテローム性動脈硬化、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、1型および/または2型糖尿病を含む糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植片拒絶、血管炎、AIDS、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性 うつ病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、アルコール嗜癖、および薬物嗜癖からなる群より選択される。
免疫疾患を処置するための医薬品の製造に使用するための、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40のエピトープに特異的に結合する第1可変ドメインを含み、ドメイン抗体（dAb）BMS3h-56-201（配列番号9）の結合と競合する抗体ポリペプチド、またはその医薬上許容される塩が提供される。本医薬品は、例えば、免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤と組み合わせて投与することができる。免疫疾患は、例えば、自己免疫疾患または移植片関連疾患であることができる。免疫疾患は、アジソン病、アレルギー、強直性脊柱炎、喘息、アテローム性動脈硬化、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、1型および/または2型糖尿病を含む糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植片拒絶、血管炎、AIDS、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性うつ病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、アルコール嗜癖、および薬物嗜癖からなる群より選択することもできる。
［図面の簡単な説明］
本特許または特許出願ファイルは少なくとも1つの彩色図を含んでいる。この特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料の納付があり次第、特許庁によって提供されるであろう。
ヒトCD40（配列番号1）の2つの異なる共結晶構造（一つはdAb BMS3h-56-5（配列番号321）との共結晶構造であり、一つはChi220抗体のFab'との共結晶構造である）の結合様式を表す図である。BMS3h-56-5分子とChi 220 Fab'分子は、βストランド（dAbでは矢印として表す）と非繰り返し二次構造（dAbではループとして表す）のカートゥーンで表示されている。相補性決定領域（CDR）も示されている。CD40も、ヒトCD40のBMS3h-56-5エピトープ残基と共にカートゥーン表示されている。Chi220エピトープ残基も示されている。ジスルフィド結合も示されている。CD40のN末端（N）およびC末端（C）がラベルで表示されている。 カートゥーン表示したヒトCD40（配列番号1）と接触しているBMS3h-56-5（配列番号321）の空間充填モデルを表す図である。CD40と接触するdAb BMS3h-56-5の表面残基が示されている。BMS3h-56-5のCDR3領域およびFR-2残基Leu45、Arg47、Arg56およびPhe99がラベルで表示されている。この図解ではKabatナンバリング（Kabat et al.「Sequences of Immunological Interest」第5版、米国保健社会福祉省、ワシントンD.C.（1991））が使用されており、βストランドの残基ナンバリングを同一に保つために挿入残基が使用されている点で連続的ナンバリングとは異なる。したがってBMS3h-56-5の場合、連番残基53は残基52Aになり、連番残基84、85、および86はそれぞれ82A、82B、82Cになり、Kabat残基番号100は欠けている（これは連番残基103と104の間にあったであろう）。CD40も、非繰り返し二次構造とBMS3h-56-5エピトープとが、カートゥーンで表されている。ヒトおよびMacaca fascicularis（カニクイザル）の間で異なっているCD40残基、Ala115、Phe99、Ser126、His162、Leu121、およびTrp109は、スティック表示で示されている。BMS3h-56-5エピトープの一部であってヒトとカニクイザルとの間で異なっているCD40残基は、Trp109、Leu121、およびHis162である。CD40残基Trp109およびLeu121は、BMS3h-56-5のCDR3とFR-2の間のクレフト中にある。Trp109の変異はBMS3h-56-5活性の活性を著しく低下させるか、または消失させる。 ヒトおよび霊長類種からの血液試料へのPEG化抗ヒトCD40 dAb、BMS3h38-2C-P40Brの結合を表す図である。図3Aは、ヒトおよびカニクイザルのB細胞へのBMS3h38-2C-P40Br結合を示し、図3Bは、ヒト、アカゲザル、およびチンパンジーのB細胞へのBMS3h38-2C-P40Brを示す。 系統BMS3h-56からの代表的ドメイン抗体ポリペプチドのClustalW2アラインメントを示す図である。 系統BMS3h-37からの代表的ドメイン抗体ポリペプチドのClustalW2アラインメントを示す図である。 系統BMS3h-38からの代表的ドメイン抗体ポリペプチドのClustalW2アラインメントを示す図である。 系統BMS3h-198からの代表的ドメイン抗体ポリペプチドのClustalW2アラインメントを示す図である。
［詳細な説明］
ヒトCD40に特異的に結合する抗体ポリペプチドが提供される。本抗体ポリペプチドはCD40アゴニスト活性を示さず、本抗体ポリペプチドは、CD40活性化が関わる疾患、例えば自己免疫疾患などの処置において有用である。本抗体ポリペプチドは、細胞結合アッセイをを利用する一次スクリーンと、それに続く1ラウンド以上のエラープローン親和性成熟または縮重オリゴヌクレオチド指定親和性成熟とを使って選択することができる。結果として、単一のCD40エピトープに特異的に結合する一群の抗体ポリペプチドが得られる。
「系統」（lineage）とは、下記実施例において開示するようにエラープローン親和性成熟または縮重オリゴヌクレオチド指定親和性成熟によって共通の前駆体から調製され、同じCD40エピトープに結合すると予想される、一組の関連抗体ポリペプチドである。抗体ポリペプチドの呼称を使ってさまざまな系統を指定する。例えば「BMS3h-56」という呼称は、ヒトCD40に対して生じさせた系統56の抗体ポリペプチドを指す。「系統BMS3h-56」抗体ポリペプチドには、BMS3h-56-1〜BMS3h-56-33、およびBMS3h-56-202〜BMS3h-56-288が含まれる。
したがってある態様では、抗体ポリペプチドは、ヒトCD40に特異的に結合する可変ドメインを含み、抗体ポリペプチドは表3に列挙するドメイン抗体（dAb）のいずれか一つの結合と競合する。例えばdAbは、dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201、またはBMS3h-56-258など、例えばBMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-41、BMS3h-43、BMS3h-56、BMS3h-131、BMS3h-198、およびBMS3h-202からなる群より選択される系統に属しうる。もう一つの態様では、抗体ポリペプチドが、表3に列挙するdAbのいずれか一つと同じヒトCD40エピトープに特異的に結合する。例えば、抗体ポリペプチドは、dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201、またはBMS3h-56-258などと同じヒトCD40エピトープに特異的に結合する可変ドメインを含みうる。以下に開示するように、ヒトCD40エピトープは、例えば配列番号1のアミノ酸残基Trp109を含みうる。
本抗体ポリペプチドは単一の可変ドメインを含有するドメイン抗体であることができる。本抗体ポリペプチドはFcドメインなどの追加ドメインを含むこともできる。例えば、本抗体ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（HSA）に特異的に結合する第2可変ドメインを含むことができる。そのような二重特異性抗体ポリペプチドは、例えば増加した半減期を有しうる。
配列表において、配列番号1はヒトCD40のアミノ酸配列であり、配列番号2はMacaca fascicularis CD40のアミノ酸配列である。ドメイン抗体BMS3h-56-5のアミノ酸配列は配列番号321である。
本明細書にいう「特異的結合」は、例えば表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約1μM以下の解離定数（Kd）での、抗体ポリペプチドによる抗原の結合を指す。適切なアッセイ系として、BIAcore（商標）表面プラズモン共鳴システムおよびBIAcore（商標）速度論的評価ソフトウェア（例えばバージョン2.1）が挙げられる。特異的結合相互作用に関するアフィニティまたはKdは、約500nM以下または約300nM以下でありうる。
「約」という用語は当業者には理解されるであろう。また、この用語は、それが使用される文脈によって、多少は変動するであろう。一般に、約は、基準値の±10％である値域を包含する。
この詳細な説明では以下の略号と定義が適用される。本明細書において使用される単数形「ある」、「一つの」（a、an）および「その」（the）は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「ある抗体」への言及は、複数のそのような抗体を包含し、「投薬量」は、1つ以上の投薬量および当業者に知られているその等価物への言及を包含するという具合である。
1．CD40およびCD40活性
ヒトCD40に結合する抗体ポリペプチドが提供される。CD40は、B細胞表面抗原CD40、Bp50、CD40L受容体、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー5とも呼ばれている。ヒトCD40に関する関連構造情報は、例えばUniProtアクセッション番号P25942、Q9BYU0、およびQ53GN5に見いだすことができる。「ヒトCD40」は、次に挙げるアミノ酸配列を含むCD40を指す：
（配列番号1）。CD40は、Mus musculus、Sus scrofa、Bos taurus、Gallus gallus、Canis familiaris、Macaca fascicularis（カニクイザル）、Ovis aries、Equus caballus、およびRattus norvegicusでも、配列決定されている。
CD40への本抗体ポリペプチドの結合はCD40活性を拮抗する。「CD40活性」には、T細胞活性化（例えばT細胞増殖またはサイトカイン分泌の誘導）、マクロファージ活性化（例えばマクロファージにおける反応性酸素種および一酸化窒素の誘導）、およびB細胞活性化（例えばB細胞増殖、抗体アイソタイプスイッチング、または形質細胞への分化）が含まれるが、これらに限るわけではない。CD40活性は、他の分子との相互作用によって媒介されうる。「CD40活性」には、CD40と次に挙げる分子（括弧内のUniprotアクセション番号で同定されるもの）との機能的相互作用が含まれる：
CALR（P27797）；
ERP44（Q9BS26）；
FBL（P22087）；
POLR2H（P52434）；
RFC5（P40937）；
SGK1（O00141）；
SLC30A7（Q8NEW0）；
SLC39A7（Q92504）；
TRAF2（Q5T1L5）；
TRAF3（Q13114）；
TRAF6（Q9Y4K3）；
TXN（Q5T937）；
UGGT1（Q9NYU2）および
USP15（Q9Y4E8）。
例えばCD40「活性」にはTRAF2との相互作用が含まれる。CD40/TRAF2相互作用はNF-κBおよびJNKを活性化する。Davies et al., Mol. Cell Biol. 25:9806-19 (2005)を参照されたい。したがってこのCD40活性は、参照と比較したCD40依存的細胞性NF-κBおよびJNK活性化によって決定することができる。
本明細書において使用する「活性化する」および「活性化された」という用語は、参照との比較で少なくとも10％、例えば少なくとも10％、25％、50％、75％、さらには100％、またはそれ以上の、所与の測定可能なCD40活性の増加を指す。CD40活性は、アンタゴニストの非存在下との比較で、少なくとも10％低下、例示的実施形態では、少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％低下するか、さらには100％低下（すなわち検出可能な活性なし）するのであれば、「拮抗された」という。例えば抗体ポリペプチドは、CD40を活性化することなく、一部または全てのCD40活性を拮抗しうる。ある実施形態において、本抗体ポリペプチドはB細胞増殖を活性化しない。もう一つの実施形態において、本抗体ポリペプチドは、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γからなる群より選択される少なくとも1つのサイトカインであるサイトカインの、T細胞による分泌を活性化しない。
2．CD40エピトープ
ヒトCD40（配列番号1）とdAb BMS3h-56-5（配列番号321）との複合体のX線結晶解析を使って、本開示の抗体ポリペプチドによって認識されるエピトープを明らかにした。CD40とBMS3h-56-5の構造モデルを電子密度データにフィッティングすることによって、一つの結晶形における結晶学的に独立した3つの複合体と、第2の結晶形における結晶学的に独立した4つの複合体とに由来する、CD40/BMS3h-56-5複合体の7つのモデルまたはバージョンを得た。これらのバージョンは、主鎖原子について約0.92および側鎖原子について0.80の実空間相関係数を有する。CD40分子は、これら7つのバージョンにおいて一定量の柔軟性を有するが、CD40/BMS3h-56-5相互作用の全体的性質は全てのバージョンにおいて保たれている。これらのバージョンは、CD40残基Trp109とBMS3h-56-5 Trp103の間の相互作用が異なっている（Kabatナンバリング、下記参照）。BMS3h-56-5 Trp103は、あるバージョンでは、CD40 Trp109とエッジトゥフェイス（edge-to-face）相互作用を形成するが、他のバージョンでは、ずれたスタッキング（displaced stacking）（すなわちフェイストゥフェイス（face-to-face））相互作用を形成している。
これら7つのバージョンに関する形状相補性統計値Scは0.70〜0.77の範囲にあり、これは典型的な抗体/抗原複合体の場合より高度な形状相補性を示す。例えばこれらの値は、4つのプロテアーゼ/タンパク質阻害剤複合体に関する0.71〜0.76や、6つの抗体/抗原複合体に関する0.64〜0.68という範囲に匹敵する。Lawrence et al.「Shape Complementarity at Protein/Protein Interfaces」J. Mol. Biol. 234:946-950 (1993)を参照されたい。
ヒトCD40/BMS3H-56-5複合体のモデルを図1に示す。一つのBMS3h-56-5 dAbが一つのCD40分子に結合している。BMS3h-56-5エピトープは、Chi220 Fab'フラグメントエピトープとはオーバーラップしていない。この複合体の全てのバージョンが、BMS3h-56-5と接触する一組のCD40残基：Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159、およびHis162（配列番号1による）を規定している。複合体の一部のバージョンでは、BMS3h-56-5と接触するCD40残基が、Pro85、Asn86、Leu87、Gly88、Glu106、Glu107、Gly108、His110、Thr112、Cys119、Val120、Gln133、Ile134、Ala135、Thr136、Ser155、およびLys160である。Val154は、全てのバージョンにおいて埋没CD40残基である。一部のバージョンにおいて埋没している他のCD40残基は、Ser118、Arg123、Thr141、Phe151、Asp153、Cys161、およびPro163である。
本明細書において使用する「接触している」という用語は、その最大値がSheriff et al., J. Mol. Biol. 197:273-296 (1987)およびSheriff, Immunomethods 3:191-196 (1993)に定義されている原子タイプ距離依存性（atom type distance dependency）によって決定される原子間距離を指す。
本明細書において使用する「埋没」という用語は、プログラムMS（Connolly, J. Appl. Crystallogr. 16:548-558 (1983)）、1.7Åのプローブ球、およびSheriff, Immunomethods 3:191-196 (1993)に定義されている原子タイプ依存的ファンデルワールス半径によって定義される表面積を持つ少なくとも一つの原子を有する残基を指す。
図2は、接触残基と埋没残基を含むBMS3h-56-5（配列番号321）の表面を示している。CD40（配列番号1）はリボン図として表されており、橙色は非繰り返し二次構造を表し、マゼンタはエピトープ残基を表している。図示されているCD40残基Trp109、Ala115、Leu121、Ser126、およびHis162は、さまざまな非ヒト霊長類配列において異なっている。CD40残基Ala115およびSer126は、BMS3h-56-5結合部位の反対側にある。Trp109とLeu121は、BMS3h-56-5のCDR3とFR-2（残基Leu45およびArg47）の間にあるクレフトにおいて結合する。His162は、BMS3h-56-5のCDR2中の残基（とりわけLys56）と相互作用する。要約すると、CD40エピトープは、配列番号1において使用する番号でいうと、表1に列挙する1つ以上の残基を含む。
BMS3h-56-5は、表3に列挙する他のdAbと同様に、抗原としてヒトCD40を使用し、以下に詳述するスクリーニングおよび親和性成熟法によって調製された。共通の前駆体dAbから親和性成熟によって作出されたdAbは、同じヒトCD40エピトープに結合するであろうと予想される。例えば、後述の競合研究により、共通の前駆体dAbから親和性成熟によって生成したdAbは、ヒトCD40への結合に関して互いに競合することが示される。しかし、同じ競合研究により、これらのdAbは少なくともChi220またはG28-5抗体とは競合しないことが示される。
3．抗体ポリペプチド
抗体ポリペプチドは可変ドメインを含む。ある実施形態では、抗体ポリペプチドが、単一の可変ドメインを含有するdAbの形態にある。抗体ポリペプチドは、ジスルフィド結合によって互いに連結された2つの重（H）鎖と2つの軽（L）鎖を含む完全長抗CD40免疫グロブリン分子であってもよい。この実施形態では、各鎖のアミノ末端部分が、そこに含まれる相補性決定領域（CDR）による抗原認識を主に担っている約100〜110アミノ酸の可変ドメイン（VLまたはVH）を含んでいる。各重鎖のカルボキシ末端側の「半分」は、主にエフェクター機能を担う定常領域（Fc）を規定している。
抗体ポリペプチドは、完全長抗CD40免疫グロブリン分子のうち、CD40に特異的に結合する可変ドメインを含む部分を含む、「フラグメント」であってもよい。したがって「抗体ポリペプチド」という用語には、例えば抗原結合性重鎖、軽鎖、重鎖-軽鎖二量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖Fv（scFv）、およびdAbが包含される。したがって「抗体ポリペプチド」という用語には、組換え操作および組換え発現によって作製されたポリペプチド、ならびに自然の組換えとハイブリドーマ細胞クローンによる分泌とによって生産されるモノクローナル抗体が包含される。
軽鎖は、当技術分野において知られているとおり、カッパ（κ）またはラムダ（λ）に分類され、特定の定常領域CLによって特徴づけられる。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれIgG、IgM、IgA、IgD、またはIgEと規定する。重鎖定常領域は、IgG、IgD、およびIgAの場合は3つのドメイン（CH1、CH2、およびCH3）、またIgMおよびIgEの場合は4つのドメイン（CH1、CH2、CH3、およびCH4）から構成される。抗CD40抗体は、免疫グロブリンクラス（IgA、IgD、IgG、IgM、およびIgE）のいずれかから選択された重鎖定常領域も有しうる。
各軽鎖可変ドメイン（VL）および重鎖可変ドメイン（VH）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序で配置された3つのCDRと4つのフレームワーク領域（FR）から構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。軽鎖の3つのCDRは「LCDR1、LCDR2、およびLCDR3」と呼ばれ、重鎖の3つのCDRは「HCDR1、HCDR2、およびHCDR3」と呼ばれる。
本明細書において使用する「Fcドメイン」という用語は、Kabat et al.「Sequences of Immunological Interest」第5版、米国保健社会福祉省、ワシントンD.C.（1991）に従って区切られたCH2およびCH3定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。Fc領域は、例えばIgG1またはIgG4 Fc領域に由来する。可変ドメインは、Fcドメインに融合することができる。その場合は、可変ドメイン（VLまたはVHドメイン、dAbを含む）のカルボキシル末端を、Fc CH2ドメインのアミノ末端に連結または融合することができる。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端を、CH1ドメイン（これ自体はFc CH2ドメインに融合されている）のアミノ末端に連結または融合してもよい。タンパク質は、CH1とCH2ドメインの間に、ヒンジ領域の全部または一部を含みうる。
CDRは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大半を含有する。図2に示すように、例えばCDR2とCDR3は、FR4残基Trp103と共に、CD40とdAb BMS3h-56-5の間の接触の大半を形成する。例えば、抗体ポリペプチドの可変ドメインは、表3に列挙するdAbの一つのCDR1、CDR2、およびCDR3領域と同じアミノ酸配列を有するか、またはそれらのCDR1、CDR2、およびCDR3領域とはそれぞれ1つまたは2つのアミノ酸で異なる、CDR1、CDR2、およびCDR3領域を含む。例えば、抗体ポリペプチドは、BMS3h-56-5、BMS3h-56-258、またはBMS3h-56-201などのCDR1、CDR2、およびCDR3領域と同じアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、およびCDR3領域を含みうる。
「ドメイン抗体」（dAb）は、CD40などの抗原に特異的かつ一価的に結合する能力を有する単一の可変（VLまたはVH）ドメインを含む。例えば、dAbは、ラクダ科動物dAbに特有のVHH構造を有しうる。本明細書にいう「VHドメイン」は、VHH構造を包含するものとする。もう一つの実施形態において、本発明のVHドメイン（本明細書に実施形態として提示する全ての特徴および特徴の組合せを含む）は、VHHドメイン以外のVHである。dAbは、溶解状態においてホモ二量体またはヘテロ二量体を形成しうる。二価抗CD40抗体は、細胞表面上で結合したCD40分子を架橋する能力ゆえに、アゴニスト活性を示すと考えられる。特定の理論に限定されるものではないが、一価dAbは、CD40を架橋しないので、CD40を活性化しないと考えられる。
本明細書において使用する「可変ドメイン」という用語は、Kabat et al.「Sequences of Immunological Interest」第5版、米国保健社会福祉省、ワシントンD.C.（1991）によって定義される免疫グロブリン可変ドメインを指す。可変ドメイン内のCDRアミノ酸残基のナンバリングと位置付けは、周知のKabatナンバリング法に従う。例えば、表2では、BMS3h-56-5（配列番号321）に関するKabatナンバリングを、連続的にナンバリングした同じ配列と比較する。Kabatナンバリングでは、BMS3h-56-5は挿入残基52A、82A、82B、82Cを有し、残基100を欠いている。どちらのナンバリングシステムでも、発現コンストラクトの一部であるN末端のSerとThrには、負の番号が与えられる。
「ヒト」という用語が、抗体ポリペプチドに適用される場合、これは、その抗体ポリペプチドが、ヒト免疫グロブリン由来の配列、例えばFRおよび/またはCHドメインを有することを意味する。ある配列が、（a）ヒト個体から単離されるか、またはヒト個体からの細胞もしくは細胞株から単離されるか；（b）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列のライブラリーまたはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離されるか；あるいは（c）上記ポリペプチドの1つ以上から変異誘発および選択によって多様化されたものである場合に、その配列はヒト免疫グロブリンコード配列「に由来する」という。本明細書にいう「単離された」化合物とは、自然界においてその化合物に本来付随している少なくとも1つの構成要素から、その化合物が取り出されていることを意味する。
抗体ポリペプチドは、他の種（例えばマウス）からの抗体の投与によってしばしば惹起される抗抗体免疫応答をおおむね回避しつつ、ヒト患者に投与することができる。例えばマウス抗体は、当技術分野において周知の手法に従ってヒト可変ドメインFR上にマウスCDRを移植することによって、「ヒト化」することができる。ただし、本明細書に開示するヒト抗体は、マウス抗体配列の遺伝子操作を必要とすることなく、生産することができる。
可変ドメインは、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントがコードしている対応するフレームワーク領域と同じアミノ酸配列を有する1つ以上のフレームワーク領域（FR）を含みうる。例えば、ドメイン抗体は、VH生殖細胞系遺伝子セグメントDP47、DP45、またはDP38、Vκ生殖細胞系遺伝子セグメントDPK9、JHセグメントJH4b、またはJκセグメントJκ1を含みうる。
抗体ポリペプチド配列には、CD40に特異的に結合する能力を保ったまま、改変を加えることができる。具体的には、抗体ポリペプチド（例えばdAb）は、dAb BMS3h-56-5と同じCD40エピトープに特異的に結合する機能を保っている変異体可変ドメインを含みうる。表1を参照されたい。すなわち、変異体可変ドメインは、配列番号1のTrp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159、およびHis162の少なくとも1つを含むヒトCD40エピトープに結合しうる。ある実施形態では、変異体可変ドメインエピトープが、Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159、およびHis162を含みうる。あるいは、変異体可変ドメインは、CD40残基Trp109を含むCD40エピトープに特異的に結合しうる。さらにもう一つの実施形態では、変異体可変ドメインが、CD40への特異的結合に関してBMS3h-56-5と競合しうる。下記実施例において開示するエラープローン親和性成熟は、同じCD40エピトープに特異的に結合する変異体配列を有する抗体ポリペプチドを作製し同定するための例示的方法の一つになる。
例えば、CD40に特異的に結合する変異体可変ドメインは、表3に列挙する可変ドメインの一つとは、10個までのアミノ酸、またはその間の任意の整数個のアミノ酸で異なりうる。あるいは、変異体可変ドメインは、本配列表に列挙する配列に対して、少なくとも90％の配列同一性（例えば少なくとも92％、95％、または98％の配列同一性）を有しうる。2つの配列間で異なる非同一アミノ酸残基またはアミノ酸は、アミノ酸の置換、付加、または欠失に相当しうる。2つの配列間で異なる残基は、2つの配列を任意の適当なアミノ酸配列アラインメントアルゴリズム、例えばBLASTによってアラインメントした場合に、非同一位置として現れる。
アミノ酸置換は、1つ以上のFRが、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子セグメントがコードしている対応するFRのアミノ酸配列と比較して、2つまでのアミノ酸相違を含むような形で、個々のFR領域に行いうるものとする。さらに、変異体可変ドメインは、1つ以上のCDR中に、1つまたは2つのアミノ酸置換を含有しうるものとする。CD40に特異的に結合する代表的可変ドメインを表3に列挙する。
系統BMS3h-56、BMS3h-37、BMS3h-38、およびBMS3h-198に由来する抗体ポリペプチドの代表的可変ドメイン間のClustalW2アラインメントを、それぞれ図4、図5、図6、および図7に示す。一般に、関連タンパク質配列のアラインメントにおいてあるアミノ酸が保存されている度合は、そのタンパク質の機能にとっての、そのアミノ酸位置の相対的重要性に比例している。すなわち、全ての関連配列において共通しているアミノ酸は、重要な役割を果たしている可能性が高く、容易に置換することはできない。一方、配列間でさまざまである位置は、タンパク質の活性を維持したまま、他のアミノ酸で置換するか、他の形で修飾することができる可能性が高い。図4、図5、図6、および図7に示すアラインメントと、図1および図2から確かめられる構造関係などは、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40のエピトープに特異的に結合する変異体抗体ポリペプチドであって、dAb BMS3h-56-201（配列番号9）の結合と競合するものを構築する際の指針になりうる。そのような変異体抗体ポリペプチドには、表3に列挙する可変ドメインのいずれかとの関連において、置換、挿入、または欠失に相当するアミノ酸修飾を有するものが含まれるが、これらに限るわけではない。変異体抗体ポリペプチドには、表3に列挙する配列間で保存されているアミノ酸修飾に対応するアミノ酸修飾を有するものも含まれる。
重鎖および軽鎖遺伝子のVLまたはVHドメインの境界に関する情報は、CD40に結合することがわかっている抗体ポリペプチドをコードするクローン化重鎖または軽鎖コード配列から可変ドメインを増幅するためのPCRプライマーを設計するために使用することができる。増幅された可変ドメインは、当技術分野においてよく知られる技法を使って、適切な発現ベクター、例えばpHEN-1（Hoogenboom et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137）中に挿入し、単独でまたは別のポリペプチド配列との融合物として、発現させることができる。開示されているアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列に基づき、任意の適切な哺乳動物宿主細胞株、例えばCHO、293、COS、NSOなどにおいて、通常の技術だけを使って、融合タンパク質を生産し、精製した後、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、逆相技法などを含む方法の一つまたはそれらの組み合わせを使って、精製を行うことができる。
ある態様では、抗体ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むヒトCD40に特異的に結合する第1可変ドメインを含む「二重特異性」抗体ポリペプチドである。二重特異性抗体ポリペプチドは、ヒトCD40以外の第2抗原に特異的に結合する第2の可変ドメインを含む。
もう一つの実施形態において、第2抗原は、例えば、免疫エフェクター細胞の細胞表面分子、またはサイトカインなどの可溶性分子であることができる。二重特異性抗体ポリペプチドの結合は、CD40を拮抗し、かつ第2抗原の生物学的活性を拮抗するために使用することができるだろう。免疫エフェクター細胞の細胞表面分子には、表面抗原分類（CD）分子が含まれる。代表的なCDマーカーは、インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル：en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_of _differentiation（最終更新日2012年2月22日）に列挙されている。免疫フェクター細胞の細胞表面分子には、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子も含まれる。これらの細胞表面分子に対する抗体は当技術分野において知られており、二重特異性抗体ポリペプチドを構築するための可変ドメインの供給源として使用することができる。
ある実施形態では、二重特異性リガンドの抗体ポリペプチドを「アミノ酸リンカー」または「リンカー」によって連結することができる。例えば、あるdAbをアミノ酸リンカーのN末端に融合し、もう一つのdAbをそのリンカーのC末端に融合することができる。アミノ酸リンカーは、任意の長さであることができ、アミノ酸の任意の組合せからなりうるが、リンカーの長さは、連結されたドメイン間の相互作用を減少させるために比較的短いもの（例えば5個以下のアミノ酸）であるだろう。かさ高い側鎖を持つアミノ酸または二次構造を持ち込むことになる可能性が高いアミノ酸の数を減らすために、リンカーのアミノ酸組成も調節することができる。適切なアミノ酸リンカーには、3、4、5、6、7、10、15、20、または25アミノ酸長までのものが含まれるが、これらに限るわけではない。代表的なアミノ酸リンカー配列として、(GGGGS)n（配列番号4）［ここで、nは、1〜5の任意の整数であることができる］が挙げられる。他の適切なリンカー配列は、AST（配列番号5）、TVAAPS（配列番号6）、TVA（配列番号7）、およびASTSGPS（配列番号8）からなる群より選択することができる。
第2抗原の結合は抗体ポリペプチドのインビボ半減期を増加させることができる。例えば、二重特異性抗体ポリペプチドの第2可変ドメインは、血清アルブミン（SA）、例えばヒト血清アルブミン（HSA）に、特異的に結合しうる。HSAに結合するようにフォーマットされた抗体ポリペプチドは、フォーマットされていない同じ抗体ポリペプチドと比較して、増加したインビボt-α（「アルファ半減期」）またはt-β（「ベータ半減期」）半減期を有することができる。t-αおよびt-β半減期は、ある物質がどのくらい迅速に体内に分布するか、および身体から排除されるかの尺度になる。HSAへの連結は、抗体ポリペプチドを、例えばHSAに特異的に結合する能力を有する第2の可変ドメインと融合することによって、達成することができる。抗ヒト血清アルブミン抗体は当技術分野ではよく知られている。例えば、Abcam（登録商標）ヒト血清アルブミン抗体ab10241、ab2406、およびab8940（インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル：www.abcam.com/index.htmlにおいて入手可能）またはGenWayのALB抗体（インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル：www.genwaybio.comにおいて入手可能）を参照されたい。HSAに特異的に結合する可変ドメインを、これらの抗体のいずれかから得て、次にそれを、当技術分野においてよく知られている組換え技法を使って本開示の抗体ポリペプチドに融合することができる。
あるいは、HSAへの抗体ポリペプチドの連結は、当業者に周知の技法を使って抗体ポリペプチド配列をHSAコード配列に直接融合することによって達成することもできる。HSAコード配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM000477で入手することができるcDNA配列に由来するプライマーを使ったPCRによって、取得することができる。
ある実施形態では、HSA連結ドメイン抗体組成物のtα半減期が、10％以上増加する。もう一つの実施形態では、HSA連結ドメイン抗体組成物のtα半減期が、0.25時間〜6時間の範囲にある。もう一つの実施形態では、HSA連結ドメイン抗体組成物のtβ半減期が、10％以上増加する。もう一つの実施形態では、HSA連結ドメイン抗体組成物のtβ半減期が、12〜48時間の範囲にある。
もう一つの実施形態では、抗体ポリペプチドを、PEG化により、そのインビボ半減期が増加するようにフォーマットすることができる。ある実施形態では、PEGが共有結合によって連結される。もう一つの実施形態では、PEGが、システイン残基またはリジン残基において、抗体ポリペプチドに連結される。さらにもう一つの実施形態では、PEG連結抗体ポリペプチドが、少なくとも24kDaの流体力学的サイズを有する。さらにもう一つの実施形態では、総PEGサイズが20〜60kD（両端を含む）である。さらにもう一つの実施形態では、PEG連結ドメイン抗体が、少なくとも200kDaの流体力学的サイズを有する。
PEG化は、いくつかのPEG取り付け成分、例えば限定するわけではないが、N-ヒドロキシルスクシンイミド活性エステル、スクシンイミジルプロピオネート、マレイミド、ビニルスルホン、またはチオールなどを使って達成することができる。PEGポリマーは、前もって決定された位置で抗体ポリペプチドに連結するか、ドメイン抗体分子にランダムに連結することができる。PEG化は、ドメイン抗体に取り付けたペプチドリンカーによって媒介することもできる。すなわち、PEG成分を、抗体ポリペプチドに融合されたペプチドリンカー（PEGを取り付けるための部位（例えば遊離のシステインまたはリジン）を与えるもの）に取り付けることができる。抗体をPEG化する方法は、例えばChapman, et al.「PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review」Adv. Drug Deliv. Rev. 54(4):531-45 (2002)に開示されているとおり、当技術分野ではよく知られている。
抗体ポリペプチドは、二量体、三量体、四量体、または他の多量体を形成するように設計することもできる。抗体ポリペプチド、例えばdAbは、当技術分野において知られるいくつかの方法によって、例えば限定するわけではないが、融合タンパク質としての単量体の発現によって、単量体間のペプチドリンカーを介した2つ以上の単量体の連結によって、または翻訳後の単量体を互いに直接的に、もしくはリンカーを介して、ジスルフィド結合で化学的に接合することによって、または二価、三価もしくは多価連結成分への連結によって（例えばマルチアームPEG）、多量体を形成するように連結することができる。ある実施形態において、多量体は単一のCD40分子に結合することができる。
4．医薬組成物および処置の方法
医薬組成物は、治療有効量の1つ以上の抗体ポリペプチドと、場合によっては医薬上許容される担体とを含む。医薬上許容される担体には、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。医薬上許容される担体はさらに、融合タンパク質の貯蔵寿命または有効性を強化する少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤などを含みうる。組成物は、投与後に活性成分の迅速な放出、持続的放出、または遅延放出を与えるように製剤化することができる。適切な医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは当技術分野においてよく知られている。例えばA. Gennaro, et al.編「Remington, The Science and Practice of Pharmacy」第21版、Mack Publishing Co. (2005)を参照されたい。
医薬組成物はさらに、免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤を含みうる。免疫疾患の処置を必要とする患者における免疫疾患を処置する方法は、患者に治療有効量の医薬組成物を投与することを含みうる。CD40を介したT細胞活性化を拮抗することにより、例えば自己免疫、移植片拒絶、またはアレルギー応答に際して起こる望ましくないT細胞応答を阻害することができるであろう。CD40を介したT細胞活性化を阻害することにより、これらの疾患の進行および/または重症度を和らげることができるであろう。
本明細書にいう「患者」とは、動物、例えばヒトを含む哺乳動物を意味する。患者は、免疫疾患と診断されうる。「処置」または「処置する」または「処置すること」とは、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度の軽減を伴うプロセスを指す。「免疫疾患」とは、細胞性および/または体液性免疫反応を含む個体における免疫反応の発生を伴う任意の疾患を指す。免疫疾患の例には、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、または移植片関連疾患などがあるが、これらに限るわけではない。自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、強皮症、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択されうる。
本医薬組成物を投与することによって処置することができる疾患は、アジソン病、アレルギー、強直性脊柱炎、喘息、アテローム性動脈硬化、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、大腸炎、冠動脈心疾患、クローン病、1型および/または2型糖尿病を含む糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤（例えば血友病患者における第VII因子）に対する免疫応答、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植片拒絶、および血管炎からなる群より選択されうる。自己免疫による状態には、患部組織が一次ターゲットである状態および場合によっては二次ターゲットである状態が含まれるが、これらに限るわけではない。そのような状態には、AIDS、アトピー性アレルギー、気管支喘息、湿疹、ハンセン病、統合失調症、遺伝性うつ病、組織および臓器の移植、慢性疲労症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、自閉症、てんかん、アルツス現象、アナフィラキシー、アルコール嗜癖、および薬物嗜癖が含まれるが、これらに限るわけではない。
医薬組成物は、単独で、または免疫抑制/免疫調整および/または抗炎症剤との併用療法として（すなわち同時にまたは逐次的に）投与することができる。異なる免疫疾患は、免疫疾患を処置するのに有用な特定補助化合物の使用を必要とする場合があり、それは患者ごとに決定することができる。例えば医薬組成物は、1つ以上の適切な佐剤、例えばサイトカイン（IL-10およびIL-13など）または他の免疫刺激因子、例えばケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドなどと組み合わせて投与することができる。適切な佐剤は当技術分野において知られている。
抗体ポリペプチドまたは医薬組成物を投与するには、任意の適切な方法または経路を使用することができる。投与の経路には、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が含まれる。投与される抗体ポリペプチドの治療有効量は、例えば処置される免疫疾患のタイプおよび重症度、併用療法の使用、抗体ポリペプチドまたは医薬組成物の投与経路、患者の体重を含む、数多くの因子に依存する。ドメイン抗体の治療有効量に関する非限定的な範囲は、患者の体重に対して、0.1〜20mg/kgであり、ある態様では、1〜10mg/kgである。さらに、疾患状態のインビトロモデルおよび/またはインビボモデルにおけるCD40拮抗作用に必要な抗体ポリペプチドの量も、抗体ポリペプチドの用量の指針になりうる。代表的なモデルを以下に述べ、実施例にも記載する。
5．インビトロモデルおよびインビボモデル
CD40を拮抗する本開示の抗体ポリペプチドの能力は、いくつかの利用可能なインビトロモデル系またはインビボモデル系の一つにおいて試験することができる。適当な動物および細胞モデル系を以下に説明する。さらなる細胞アッセイ系は実施例で述べる。
5.1．炎症性腸疾患（IBD）モデル：
IBDは病院不明の多因子免疫障害である。IBDに似た粘膜炎のいくつかのマウスモデルにより、正常な粘膜免疫機能と病的な粘膜免疫機能の両方を支配する機序への洞察が得られている。IBDモデルには、De Winter et al., Am. J. Physiol. 276: G1317-1321 (1999)の粘膜免疫および炎症系の使用が含まれる。ある態様では、免疫不全マウスへのCD4(+)Tリンパ球のサブセットCD4(+)CD45RBhigh細胞の注入が、腸の炎症をもたらす。病理発生の一因は炎症誘発性サイトカインにある。大腸炎の誘導は、もう一つのCD4(+)亜集団CD4(+)CD45RBlow T細胞の同時移入によって防止することができる。この集団は、活性化マーカーの獲得と宿主腸へのホーミングについては、CD4(+)CD45RBhigh集団と同じように挙動する。しかし、活性化された時のそれらのリンホカインプロファイルは異なり、CD4(+)CD45RBlow T細胞によって分泌および/または誘導される抗炎症性サイトカインは大腸炎を防止する。De Winter et al.の論文には、養子移入モデルと、大腸炎病理発生を促進する因子および防止する因子についての説明がなされている。
5.2．自発的関節炎モデル：
全身性自己免疫によって惹起される臓器特異的疾患のモデルは、Kouskoff et al., Cell 87: 811-822 (1996)によって提供されている。関節リウマチ（RA）は、白血球浸潤と滑膜細胞活性化、それに続く軟骨と骨の破壊を特徴とする、慢性関節疾患である。Kouskoff et al.には、T細胞受容体（TCR）トランスジェニック系統をNOD系統と交配することによって生成した、RAの自発的マウスモデルが開示されている。全ての子孫が、ヒトにおけるRAを強く連想させる関節疾患を発症する。このマウス障害の引き金は、トランスジェニックTCRによるNOD由来主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子の偶発的認識であり、関節炎への進行には、CD4+ T、B、そしておそらくは骨髄性細胞が関与する。
5.3．コラーゲン誘発性関節炎（CIA）モデル：
コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデルは、Brand et al., Methods Mol. Med. 102: 295-312 (2004)によって提供されている。コラーゲン誘発性関節炎（CIA）は、関節軟骨の主要構成成分タンパク質であるタイプIIコラーゲン（CII）を使った免疫処置によって、齧歯類動物（ラットおよびマウス）と非ヒト霊長類の感受性系統において引き出すことができる自己免疫疾患である。免疫処置後に、動物は、RAと共通する臨床的特徴と組織学的特徴をいくつか持つ自己免疫性多発性関節炎を発症する。齧歯類動物におけるCIAに対する感受性は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）のクラスII分子に関連しており、CIIに対する免疫応答は、コラーゲン特異的T細胞の刺激、および免疫原（異種CII）と自己抗原（マウスCII）との両方に特異的な高力価の抗体の生産を、どちらも特徴とする。組織学的には、マウスCIAは、関節炎の臨床的発症と合致する激しい滑膜炎を特徴とする。CIAとRAの病理学的類似性ゆえに、この実験データはCIAを評価するのに有用である。
5.4．抗原誘発性T細胞増殖インビボモデル：
T細胞受容体（TCR）トランスジェニックT細胞の養子移入の使用は、抗原誘発性T細胞増殖のインビボモデルを与える。Pape et al., Immunol. Rev. 156:67-78 (1997)は、既知のペプチド/MHC特異性を有する同定可能なTCRを一様に発現するTCRトランスジェニックT細胞の養子移入を開示している。このモデルは、抗原特異的T細胞のインビボ挙動を監視するために使用することができる。ナイーブT細胞は、まず最初に、二次リンパ組織のT細胞域内で活性化されて、B7依存的に増殖する。この期間中にアジュバントまたは炎症性サイトカインが存在すると、より多数のT細胞が蓄積され、B細胞に富む濾胞へと移動し、IFN-γを生産する能力を獲得して、B細胞がIgG2aを生産するのを助ける。炎症が効果的に拮抗されると、最初に活性化される抗原特異的T細胞の大半が、濾胞に進入することなく消失し、生き残ったものもIL-2およびIFN-γを生産する能力に乏しい。
［実施例］
表3に、本開示の抗体ポリペプチドにとって有用な代表的抗ヒトCD40可変ドメインアミノ酸配列を列挙する。表3に列挙する可変ドメイン配列をコードする代表的核酸を、表4に開示する。当技術分野ではよく知られているとおり、複数のコドンが同じアミノ酸をコードしうる。したがって、タンパク質配列をコードする核酸には、コドン縮重を有する核酸が含まれる。表3に開示する抗体ポリペプチドはCD40に特異的に結合し、以下の実施例において説明する反復的な初回/一次スクリーニングおよび親和性成熟法を使って作製された。
［表3］抗ヒトCD40可変ドメインアミノ酸配列
［表4］ヒト抗CD40可変ドメインをコードするヌクレオチド配列
ヒト抗CD40可変ドメインBMS3h-1〜225の生成
以下の実施例では、BMS3h-1〜BMS3h-225と呼ばれる一連の抗ヒトCD40可変ドメインの生成を説明する。単一免疫グロブリン可変ドメインのレパートリーをファージの表面上に組換え発現させた後、そのファージレパートリーを固定化ターゲット抗原と接触させ、未結合のファージを除去するために洗浄し、結合しているファージを増殖させることによって選択を行う。このプロセスはしばしば「パンニング」と呼ばれる。これは、単一免疫グロブリン可変ドメインや、ディスプレイライブラリー上に発現させることができる他の抗体フラグメント、例えばscFv、Fab、およびFab'のスクリーニングに応用することができる。あるいは、フォールディングされたメンバーだけが結合する固定化汎用リガンド（例えばプロテインAまたはプロテインL）に対するパンニングによって、適正にフォールディングされたメンバー変異体の発現について、ファージを事前選択しておいてもよい。これには、非機能的なメンバーの比率を下げ、それによってターゲット抗原に結合する可能性が高いメンバーの比率を増加させるという利点がある。汎用リガンドによる事前選択は、例えばWO 99/20749に教示されている。ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングについては、例えばHarrison et al., Meth. Enzymol. 267:83-109 (1996)に概説されている。
スクリーニングは、一般に、固形支持体（例えばプラスチック製のチューブまたはウェル）上またはクロマトグラフィーマトリックス（例えばSepharose（商標）（Pharmacia））上に固定化された精製抗原を使って行われる。スクリーニングまたは選択は、複雑な抗原上で、例えば細胞の表面上で行うこともできる（Marks et al., BioTechnology 11:1145（1993）；de Kruif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3938 (1995)）。もう一つの選択肢では、溶解状態にあるビオチン化抗原に結合させた後、ストレプトアビジン被覆ビーズで捕捉することによって選択を行う。
クローンBMS3h-1〜BMS3h-69：
ビオチン化ヒトCD40単量体（供給者BMS、1.5モル・ビオチン/モル・CD40）とビオチン化ヒトCD40-Ig（供給者BMS、3.3モル・ビオチン/モル・CD40-Ig）の両方に対して、使用する抗原の濃度を低下させつつ（第1ラウンドは100nM；第2ラウンドは10nM；第3ラウンドは1nM）、3ラウンドの選択を並行して行った。選択を開始する前に、ナイーブ4Gおよび6G Domantis dAbライブラリーからのファージを、次のように組み合わせた：
1）4G＋6G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
2）4G＋6G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
3）4G＋6G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
4）4G VK、
5）6G VK。
各選択ラウンドでは、ナイーブライブラリープールの一つからのファージまたは以降の選択アウトプットファージ750μlと、PBS＋2％Marvel（2％（w/v）Marvel［Premier Foods、英国］を含有するリン酸緩衝食塩水）750μlとの混合物に、所望の濃度の抗原を加え、エンドオーバーエンド（end-over-end）で混合することにより、室温で1時間インキュベートした。次に、100μlの再懸濁Dynabeads（登録商標）M-280ストレプトアビジン［Invitrogen、英国］を加えることによってビオチン化抗原ファージ複合体を捕捉し、エンドオーバーエンドで混合しながら室温で5分間インキュベートした。次に、KingFisher磁気セパレーター［Thermo Fisher Scientific、英国］を使ってDynabeads（登録商標）を回収し、1mlのPBS＋0.1％Tween 20（0.1％（v/v）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Sigma-Aldrich、英国］を含有するPBS；PBST）で7回洗浄した後、1mlのPBSで1回洗浄した。洗浄したDynabeads（登録商標）上に保持されている結合したファージを、500μlのトリプシン-PBS（50mM Tris-HCl pH7.4、1mM CaCl2に溶解した10mg/mlトリプシン［Sigma-Aldrich、英国］50μlを450μlのPBSに加えたもの）と共にインキュベートすることによって溶離させた。ファージ含有溶液を回収し、250μlを使って、1.75mlの対数増殖期E. coli TG1（OD600が0.4のもの）を、37℃で30分間感染させた。E. coli TG1ファージ感染培養物を、微量遠心機中、11,600gで1分間、遠心分離した。その結果得られた細胞ペレットを1mlの2×TY（1リットル中の16gトリプトン、10g酵母エキスおよび5g NaClを121℃で15分間オートクレーブしたもの）に再懸濁し、15μg/mlのテトラサイクリンを補足したTYが入っている9cmペトリ皿にプレーティングした。プレートを37℃で終夜インキュベートした。次に、15％グリセロールを補足した2mlの2×TYを各プレートに加え、細胞をガラス製スプレッダーでほぐし、よく混合した。掻き取った細菌50マイクロリットルを使って、15μg/mlのテトラサイクリンを補足した50mlの2×TYに接種し、250rpmで振とうしながら37℃で終夜成長させた。終夜培養物を3,300gで15分間遠心分離して細菌をペレット化した。ファージを沈殿させるために、10mlのPEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール8000、2.5M NaCl）を、上清40mlに加えた。ファージ/PEG溶液を混合し、氷上に1時間放置した後、4℃、3,300gで30分間遠心し、上清を捨てた。ペレットを2mlのPBSに再懸濁し、微量遠心機中、11,600gで10分間遠心することにより、残っている細菌片を除去した。次に、その結果得られたファージ含有上清を、適当なビオチン化CD40抗原に対する次の選択ラウンドに使用した。
第2および第3選択ラウンド後にモノクローナルファージELISAを行った。洗浄は全て、250μlのPBSTで3回の洗浄と、それに続く250μlのPBSで3回の洗浄とを使って行った。プレートを、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中の1μg/ml NeutrAvidin（Thermo Scientific、英国）50μl/ウェルにより、4℃で終夜、コーティングした。プレートを洗浄した後、2％MPBS（PBS中の2％（w/v）Marvel脱脂粉乳［Premier Foods］）を使って室温で1時間、ブロッキングした。次に、プレートを洗浄し、2％MPBS中の0.7μg/mlビオチン化ヒトCD40（50μl/ウェル）と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、ファージ上清を等体積の2％MPBSに加えた。次に、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合しているファージを、2％MPBSに1：5000希釈した抗M13-HRPコンジュゲート（GE Healthcare、英国）で検出し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue 1-Component TMB MicroWellペルオキシダーゼ溶液（KPL Inc、米国）を使ってELISAを呈色させた。NeutrAvidinでコーティングされているがビオチン化CD40は含まないプレートとの比較によって、特異的ファージを同定した。MidiPrepを使って、pDOM4（Domantis）第2および第3ラウンドアウトプットからdAb V遺伝子を単離し、pDOM5（Domantis）にクローニングした。WO 2007/085815に開示されているpDOM4は、遺伝子III（gene III）シグナルペプチド配列が酵母糖脂質アンカー型表面タンパク質（GAS）シグナルペプチドで置き換えられているFdファージベクターの誘導体である（WO 2005/093074）。pDOM4はリーダー配列と遺伝子IIIの間にc-mycタグも含んでいて、それが遺伝子IIIをインフレームに戻している。
結合性dAbを次のように同定した。96個の個別コロニー（pDOM5中）を、各アウトプットから、OnEx Autoinuction培地（Novagen、英国）が入っている200μLのテリフィックブロス（Terrific Broth）に拾い、Costar96穴細胞培養クラスター（Corning Incorporated、米国）中、250rpmで振とうしながら、37℃で終夜インキュベートした。培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を、CD40結合性dAbについて、抗原結合ELISAでアッセイした。MaxiSorp96穴イムノプレート（Nunc、米国）を、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中、1μg/mlのNeutrAvidin（50μl/ウェル）により、4℃で終夜、コーティングした。洗浄は全て、ファージELISAについて上述したとおりにした。1％Tween 20を含有する200μlのPBSにより、プレートを室温で1時間ブロッキングした。次にプレートを洗浄し、0.1％PBST中の0.7μg/mlビオチン化ヒトCD40（50μl/ウェル）と共にインキュベートした。清澄化したdAb含有培養上清を、等体積の0.1％PBSTと共にELISAプレートに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートしてから洗浄した。結合しているdAbは、次の2段階工程を使って検出した：まず最初に、0.1％PBSTに1：2000希釈した9E10（抗myc IgG、Sigma-Aldrich、英国）を室温で1時間加えた後、洗浄し、次に、0.1％PBSTに1：2000希釈した抗マウスFc-HRP（Sigma-Aldrich、英国）を室温で1時間加えた。プレートを洗浄し、SureBlue 1-Component TMB MicroWellペルオキシダーゼ溶液（KPL Inc、米国）を使ってELISAを呈色させた。発色させ、等体積の1M HClを加えることによって、比色反応を停止させた。ELISAプレートを450nmで読み取った。NeutrAvidinでコーティングされているがビオチン化CD40は含まないプレートとの比較によって、特異的ファージを同定した。
CD40に特異的なクローンを、ビーズベースまたはELISAベースの受容体結合アッセイ（RBA）のどちらかにおいて試験することで、CD40リガンド結合の阻害について評価した。RBAにおいて阻害を示すドメイン抗体を、B細胞増殖アッセイにおいて試験し、次いで他のさまざまなインビトロ細胞アッセイにおいて試験した。これらのアッセイについては、以下にさらに詳しく説明する。
BMS3h-106〜225：
BMS3h-106〜225は、BMS3h-1〜BMS3h-69について説明したように、ただし次に挙げる変更を加えて、ビオチン化CD40またはビオチン化CD40-Fcに対する選択から単離された。選択を開始する前に、ナイーブ4Gおよび6Gライブラリーからのファージを、次のように組み合わせた：
6）4G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
7）4G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
8）4G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
9）6G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
10）6G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
11）6G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
12）4G VK、
13）6G VK。
第1ラウンドは、CD40-Fcの場合は160nM、CD40の場合は100nMの抗原濃度で行った。アウトプット力価は、2.0×104〜9.0×107TU/ml（機能的ウイルス力価）の範囲にあった。
第2ラウンドでは、第1ラウンドからの濃縮ファージを、選択に使用する前に、二つずつ組み合わせた。
1）4G＋6G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸（第1ラウンドからのプール1＋4）、
2）4G＋6G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸（第1ラウンドからのプール2＋5）、
3）4G＋6G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸（第1ラウンドからのプール3＋6）、
4）4G＋6G VK（第1ラウンドからのプール7＋8）。
選択は、100nMの抗原濃度で行い、NeutrAvidin（Thermo Fisher Scientific、英国）とカップリングしておいたM-280トシル活性化Dynabeads（登録商標）（Invitrogen）を使って、抗原-ファージ複合体を捕捉した。アウトプット力価は6.5×107〜7.5×108TU/mlの範囲にあった。
第3ラウンドは、20nMの抗原濃度と、CD40-Fc選択の場合は、6.7μM遊離ヒトFcテール（BMS）の存在下で行った。アウトプット力価は4.3×107〜1.6×109TU/mlの範囲にあった。
第4ラウンドは、第2ラウンドについて説明したように、ただし2nMの抗原濃度ならびに500倍過剰の非標識CD40-Fcの存在下および非存在下で行った。この競合剤の添加は、ファージをビオチン化抗原と共に最初に1時間インキュベートした後に行い、次に、その混合物を、先と同様に、終夜インキュベートした。この競合ステップは、オフ速度（off rate）が遅いdAbの選択を強化する目的で含めた。アウトプット力価は、競合なしでは1.8×107〜4.4×107TU/ml、競合ありでは1.8×106〜2.3×107TU/mlの範囲にあった。
選択の進行を監視するために、第2および第3ラウンド後にモノクローナルファージELISAを行った。これらは、BMS3h-1〜BMS3h-69について述べたように行った。結合性dAbは、VKライブラリースクリーニングの場合はプロテインLを0.8μg/mlの最終濃度で含めた点以外は、BMS3h-1〜BMS3h-69について説明したようにして同定した。プロテインLの添加は、dAbを架橋することによってシグナル強度を増加させた。
BMS3h-70〜105：
BMS3h-70〜105は、イムノチューブ（immunotube）に受動的に吸着させた抗原に対する選択から単離された。選択を開始する前に、ナイーブ4Gおよび6G Domantis dAbライブラリーからのファージを、次のように組み合わせた：
1）4G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
2）4G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
3）4G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
4）6G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
5）6G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
6）6G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
7）4G VK、
8）6G VK。
第1選択ラウンドについては、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中の10μg/mlヒトCD40-Fc融合物（BMS）1mlを、Nunc MaxiSorpイムノチューブに加え、次に、ローリングさせながら4℃で終夜インキュベートした。次に、チューブを空にして、リン酸緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄した。次に、チューブを縁までMPBSで満たし、室温で1時間インキュベートすることによってブロックした。次にチューブを空にして、PBSで3回洗浄した。MPBS 4ml中のライブラリーファージをチューブに加え、エンドオーバーエンドで回転させながら室温で1時間インキュベートした。
チューブを空にして、PBST（0.1％（v/v）Tween 20を含むPBS）で10回洗浄した。洗浄したチューブ上に保持されている結合したファージを、500μlのトリプシン-PBS（50mM Tris-HCl pH7.4、1mM CaCl2に溶解した10mg/mlトリプシン［Sigma-Aldrich、英国］50μlをPBS 450μlに加えたもの）と共にエンドオーバーエンドで回転させながら室温で10分間インキュベートすることによって、溶離させた。ファージ含有溶液を回収し、250μlを使って、1.75mlの対数増殖期E. coli TG1（OD600が0.4のもの）を、37℃で30分間感染させた。E. coli TG1ファージ感染培養物を、微量遠心機中、11,600gで1分間、遠心分離し、その結果得られた細胞ペレットを1mlの2×TY（1リットル中に16gトリプトン、10g酵母エキスおよび5g NaCl。その懸濁液を121℃で15分間オートクレーブしたもの）に再懸濁し、15μg/mlのテトラサイクリンを補足したLB寒天が入っている9cmペトリ皿にプレーティングした。プレートを37℃で終夜インキュベートした。次に、15％グリセロールを補足した2×TYを各プレートに加え、細胞をガラス製スプレッダーでほぐし、よく混合した。
掻き取った細菌50マイクロリットルを使って、15μg/mlのテトラサイクリンを補足した50mlの2×TYに接種し、250rpmで振とうしながら37℃で終夜成長させた。終夜培養物を3,300gで15分間遠心分離して細菌をペレット化した。ファージを沈殿させるために、10mlのPEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール8000、2.5M NaCl）を、上清40mlに加えた。ファージ/PEG溶液を混合し、氷上に1時間放置した。次に、その溶液を4℃、3,300gで30分間遠心し、上清を捨てた。ペレットを2mlのPBSに再懸濁し、微量遠心機中、11,600gで10分間遠心することにより、残っている細菌片を除去した。次に、その結果得られたファージ含有上清を、CD40-Fc抗原に対する次の選択ラウンドに使用した。第1ラウンドからのアウトプット力価は7.5×104〜1.5×107TU/ml（1mlあたりの形質転換ユニット数）の範囲にあった。
第1選択ラウンドから回収された濃縮ファージを使って第2選択ラウンドを行った。これはまさに上述のとおりに行い、アウトプット力価は2.5×107〜1.2×108TU/mlの範囲にあった。
第3選択ラウンドは第2選択ラウンドから回収された濃縮ファージを使って行った。これらは、上述のように、ただし1μg/mlの抗原濃度を使って行った。アウトプット力価は5.1×107〜7.5×108TU/mlの範囲にあった。
選択の進行を監視するために、第2および第3ラウンド後にモノクローナルファージELISAを行った。個々のコロニーの試料を、15μg/mlテトラサイクリンを補足した200μLの2×TYに拾い、Costar96穴細胞培養クラスター（Corning Incorporated、米国）中、250rpmで振とうしながら、37℃で終夜インキュベートした。培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を、CD40結合性ファージdAbについて、抗原結合ELISAでアッセイした。洗浄は全て、250μlのPBSTで3回の洗浄と、それに続く250μlのPBSで3回の洗浄とを使って行った。MaxiSorp96穴イムノプレート（Nunc、米国）を、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中の0.5μg/ml CD40-Fc（BMS）（50μl/ウェル）により、4℃で終夜コーティングした。プレートを洗浄した後、250μlの2％MPBSにより、室温で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、ファージ上清を等体積の2％MPBSに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合しているファージを、2％MPBSに1：5000希釈した抗M13-HRPコンジュゲート（GE Healthcare、英国）で検出し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue 1-Component TMB MicroWellペルオキシダーゼ溶液（KPL Inc、米国）を使ってELISAを呈色させた。遊離Fcでコーティングしたプレートとの比較によって、特異的ファージdAbを同定した。
上記第2および第3ラウンド選択アウトプットのそれぞれからのdAb遺伝子を、E. coli株HB2151中の可溶性発現ベクターpDOM5に、プールとしてサブクローニングした。このベクターにより、c-mycタグ（Roche Diagnostics GmbH）を有する遊離dAbのE. coliにおける発現と、上清への分泌とが可能になった。
受動的選択からのCD40結合性dAbを次のように同定した。96個の個別コロニー（pDOM5中）を、各アウトプットから、OnEx Autoinuction培地（Novagen、英国）が入っている200μLのテリフィックブロス（Terrific Broth）に拾い、Costar96穴細胞培養クラスター（Corning Incorporated、米国）中、250rpmで振とうしながら、37℃で終夜インキュベートした。培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を、CD40結合性dAbについて、抗原結合ELISAでアッセイした。MaxiSorp96穴イムノプレート（Nunc、米国）を、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中、0.5μg/mlのCD40-Fc（BMS）（50μl/ウェル）により、4℃で終夜、コーティングした。洗浄は全て、ファージELISAについて上述したとおりにした。1％Tween 20を含有する250μlのPBS（PBST）により、プレートを室温で1時間ブロッキングした。清澄化したdAb含有培養上清を、等体積の0.1％PBSTと共にELISAプレートに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、洗浄した。結合しているdAbは、次の2段階工程を使って検出した：まず最初に、0.1％PBSTに1：2000希釈したビオチン化9E10（抗myc IgG、Sigma-Aldrich、英国）を室温で1時間加えた後、洗浄し、次に、0.1％PBSTに1：5000希釈したストレプトアビジン-HRP（Bender MedSystems、オーストリア）を室温で1時間加えた。プレートを洗浄し、SureBlue 1-Component TMBを使ってELISAを呈色させた。特異的dAbを、遊離Fcでコーティングしたプレートとの比較によって同定した。
CD40に特異的なクローンを、ビーズベースまたはELISAベースの受容体結合アッセイ（RBA）のどちらかにおいて試験することで、CD40リガンド結合の阻害について評価した。RBAから得られた効力測定値を表5（一次スクリーニング作業）に示す。RBAにおいて阻害を示したドメイン抗体を、B細胞増殖アッセイにおいて試験し、次いで他のさまざまなインビトロ細胞アッセイにおいて試験した。
BMS3h-210〜225
BMS3h-210〜225は全細胞に対する選択から単離された。選択を開始する前に、ナイーブ4Gおよび6G Domantis dAbライブラリーからのファージを、次のように組み合わせた：
1）4G＋6G VH CDR3鎖長7〜9アミノ酸、
2）4G＋6G VH CDR3鎖長10〜12アミノ酸、
3）4G＋6G VH CDR3鎖長13〜15アミノ酸、
4）4Gおよび6G VK。
第1ラウンドには、細胞表面発現ヒトCD40で安定にトランスフェクトされたDG44 CHO細胞株（供給者BMS）を、抗原として使用した。これらの細胞に対する選択に先だって、上に概説したライブラリープールを、非トランスフェクトCHO細胞と共にインキュベートすることで、それらから、CD40以外の細胞表面抗原に特異的なdAbをディスプレイしているファージを枯渇させた。どちらのタイプの細胞も、生存性に関する評価の前に、Versene（Invitrogen）と共にインキュベートすることによって収穫した。600万個の非トランスフェクト生CHO細胞を、2％（w/v）BSAを含むPBS（PBS/BSA）4mlに再懸濁し、ブロッキングのために4℃で1時間、エンドオーバーエンドで回転させた。以降のステップは全て、別段の注記がある場合を除き、4℃で行った。細胞を185gで5分間遠心分離し、枯渇ライブラリーファージを含有する上清を、新鮮なチューブに移した。これに、PBS/BSA 1ml中の6×106個の生CHO-CD40細胞を加え、その混合物を1時間回転させた。次に細胞を、185gで5分間遠心分離し、10mlのPBS/BSAに再懸濁することによって、5回洗浄した。最終洗浄後に、細胞を先と同様にペレット化した後、5mM Tris-HCl pH7.4、0.1mM CaCl2を補足したPBS中の1mg/mlウシ膵臓由来トリプシンXIII型（Sigma Aldrich、英国）0.5mlに再懸濁し、微量遠心チューブに移した。細胞を室温で10分間回転させてから、16000gで5分間遠心分離した。上清中の溶離したファージを使ってE. coliを感染させ、アウトプットファージ力価は、5.1×105〜2.7×106TU/ml（1mlあたりの形質転換ユニット）であると決定された。
第1選択ラウンドから回収された濃縮ファージを使って第2選択ラウンドを行った。これらは、上述のように、ただし最初の枯渇（除外）ステップは行わず、CHO-CD40の代わりにRAMOSヒトB細胞（ATCC）を使って行った。アウトプット力価は2.3×105〜7.5×105TU/mlの範囲にあった。
第3選択ラウンドは、第2ラウンドの場合と同様に行った。アウトプット力価は1.9×108〜3.5×108TU/mlの範囲にあった。
上記第2および第3ラウンド選択アウトプットのそれぞれからのdAb遺伝子を、E. coli株HB2151中の可溶性発現ベクターpDOM5に、プールとしてサブクローニングした。このベクターにより、c-mycタグを有する遊離dAbのE. coliにおける発現と、上清への分泌とが可能になった。
CD40に特異的なクローンを、CHO細胞受容体結合アッセイ（RBA）において試験することで、CD40リガンド結合の阻害について評価した。RBAにおいて阻害を示すドメイン抗体を、B細胞増殖アッセイにおいて試験し、次いで他のさまざまなインビトロ細胞アッセイにおいて試験した。
エラープローンPCRによる親和性成熟
下記実施例6で説明するB細胞増殖アッセイにおいて中和活性を示した13のBMS3h dAbについて、エラープローンファージライブラリーを構築した（表17参照）。これは、Mutazyme IIポリメラーゼ（Agilent Technologies製のGeneMorph IIキットのパーツ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅中にdAb遺伝子中にランダムにエラーを導入することによって行った。変異型dAb遺伝子を、感染性ファージ粒子の生成に必要なfd遺伝子を全て含有するpDOM4ベクターに、GAS1リーダー配列の制御下にあるfdファージ遺伝子IIIタンパク質との遺伝子融合物としてクローニングした。これらのライブラリーは、サイズが約1×108CFU（コロニー形成ユニット）で、エラー率はdAb遺伝子あたり2〜5アミノ酸であった。
これらのライブラリーから生成したファージを、可溶性ビオチン化ヒトCD40に対する3ラウンドの選択に付した。第1ラウンドのファージ選択は、ファージライブラリーを2％MPBS（2％（w/v）Marvel乾燥脱脂粉乳を補足したリン酸緩衝食塩水）と事前混合し、ビオチン化ヒトCD40（BMS）を最終体積1ml中に最終濃度が20nMになるように加えることによって行った。その混合物をエンドオーバーエンドで混合しながら室温で少なくとも1時間インキュベートした。次に、50μlのM-280ストレプトアビジンDynabeads（登録商標）（Invitrogen）を使って抗原-ファージ複合体を捕捉し、1mlのPBSTで7回洗浄した後、1mlのPBS中で1回洗浄した。洗浄したファージを、5mM Tris-HCl pH7.4、0.1mM CaCl2を捕捉したPBS中の1mg/mlウシ膵臓由来トリプシンXIII型（Sigma Aldrich、英国）0.5mlと共にインキュベートすることにより、抗原/ビーズ複合体から溶離した。溶離したファージを使ってE. coliを感染させ、アウトプットファージ力価は、2×105〜9×107TU/ml（1mlあたりの形質転換ユニット）と決定された。
第1選択ラウンドから回収された濃縮ファージを、最終濃度2nMのビオチン化CD40と共に使用し、次に上述のようにストレプトアビジンビーズを使って捕捉することにより、第2選択ラウンドを行った。アウトプット力価は3×104〜5×106TU/mlの範囲にあった。
2nMビオチン化CD40を使用し、次にストレプトアビジンビーズを使って捕捉することにより、第3選択ラウンドを行った。溶離したファージ力価は8×104〜4×106TU/mlの範囲にあった。
BIAcore（商標）スクリーニング
上記第3ラウンド選択アウトプットのそれぞれからのdAb遺伝子を、E. coli HB2151中の可溶性発現ベクターpDOM13（Domantis）に、プールとしてサブクローニングした。pDOM13ベクターはpDOM33とも呼ばれ、WO/2008/149143に開示されている。このベクターにより、E. coliにおける遊離dAbの発現と上清への分泌が可能になった。47個の個別コロニーをアウトプットのそれぞれから拾い、Costar96穴細胞培養クラスター（Corning Incorporated、米国）において、Novagen Overnight Express Autoinduction培地（Merck Chemicals、英国）を含有する200μlのテリフィックブロス中、250rpmで振とうしながら、37℃で終夜発現させた。同じプレートにおいて、一つのウェルに、適当な親（野生型）dAbを発現するE. coliを接種した。培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を、親dAbと比較した「オフ速度」（すなわち解離速度定数，kd）の改善について、BIAcore（商標）3000計器（GE Healthcare）でスクリーニングした。
約1600応答ユニット（response unit；RU）のビオチン化ヒトCD40（BMS）を、ストレプトアビジン（SA）BIAcore（商標）チップのフローセルの一つに固定化した。リガンドが固定化されていないもう一つのフローセルは、インライン参照用の参照フローセルとした。解析しようとする各dAb上清をHBS-EP緩衝液（0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005％v/vサーファクタントP20を含む0.01M HEPES pH7.4、GE Healthcare）に1：3希釈した。10マイクロリットルの各Ab上清を、計器のKINJECT機能を使って、CD40固定化フローセルと参照フローセルを順次横切るように注入し、参照セルからのシグナルをインラインで差し引いた。実験は、HBS-EPの流速を10μl/分とし、25℃において行った。各注入が完了した後に、dAbを、緩衝液中で120秒間、リガンドから解離させ、それから、10mMグリシンpH2.0を5μl注入することで再生した。BIAevaluation 4.1ソフトウェア（GE Healthcare）を使って、参照フローセルトレースを各分析物トレースから差し引いた。同じソフトウェアを使って、分析物トレースの解離相への1：1（ラングミュア）速度論モデルの近似フィット（approximate fit）を行った。このモデルにより、各クローンについて、およその解離速度定数（「オフ速度」またはkd）が得られ、野生型dAbとの相対的比較が可能になった。
BMS3h-129および197を除く全ての系統について、オフ速度が改善されたクローンが同定された。上述のように改善された効力を評価するために、オフ速度が改善されたクローンを、ビーズベースまたはELISAベースの受容体結合アッセイ（RBA）のどちらかにおいて試験した。このRBAから得られた効力測定値を「エラープローン成熟クローン」という見出しで表に記載する。次に、RBAにおいてより強力であったクローンを、強化された生物学的効力について、B細胞増殖アッセイにおいて試験し、得られたこれらの測定値を表17に記載する。B細胞増殖アッセイにおいて改善された効力を有するドメイン抗体を、他のさまざまなインビトロ細胞アッセイでも試験した。
トリプレットスキャニング多様化法（triplet scanning diversification）による親和性成熟
トリプレットスキャニング多様化法によるさらなるアフィニティ成熟のために、エラープローン成熟から単離された5つの効力改善型dAb、BMS3h-37-2、-38-2、-56-2、-193-25および-217-23を選んだ。エラープローンPCRを使用する代わりに、一連のオーバーラップ縮重トリプレットオリゴヌクレオチドを使って各dAbの相補性決定（CDR）領域を多様化した点以外は、エラープローンライブラリーについて上で説明したように、これらの親に基づいてファージライブラリーを構築した。アフィニティ成熟させようとする各dAbについて、NNSコドントリプレットを含有するオリゴヌクレオチド（Arkin et al., (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:7811-7815参照）を使って、オーバーラップ伸長（SOE）PCRによるスライシング（slicing）により、各CDRについて、いくつかのライブラリーを作製した。所与のCDRについてオリゴヌクレオチドによって多様化されるトリプレットは、2つのコドンでオーバーラップしていて、CDR毎に2〜4つのライブラリーをもたらした。BMS3h-37-2ライブラリーにおいて多様化されたアミノ酸残基は、位置30、31、32、33、35、50、52、53、55、56、95、96、97、および98（Kabatナンバリング）にあった。BMS3h-38-2ライブラリーにおいて多様化された残基は37-2の場合と同様であったが、位置100を加えた。BMS3h-56-2ライブラリーにおいて多様化された残基は37-2の場合と同様であったが、位置100および101を加えた。BMS3h-193-25および-217-23ライブラリーにおいて多様化された残基は、位置27、28、30、31、32、34、49、50、51、53、89、91、92、93、94、および96にあった。
これらのライブラリーから生成したファージをCDR毎にプールし、BMS3h-37-2、-38-2、-56-2および-193-25については、使用した抗原の濃度が、第1、第2および第3ラウンドにおいて、それぞれ10、1および0.1nMであった点以外は、上述のようにして、選択を行った。BMS3h-217-23の場合、使用した抗原の濃度は、第1、第2および第3ラウンドにおいて、それぞれ20、2および0.2nMであった。カニクイザルCD40に対して交差反応性であるBMS3h-193-25については、カニクイザル（cyno）CD40に対する選択も並行して行った。加えて、第2および第3選択ラウンドは、それぞれ100倍過剰または1000倍過剰の非標識CD40の存在下および非存在下で行った。この競合剤の添加は、ファージをビオチン化抗原と共に最初に1時間インキュベートした後に行い、次に、その混合物を、先と同様に、さらに1時間インキュベートした。この競合ステップは、オフ速度が遅いdAbの選択を強化する目的で含めた。第1ラウンド力価は1.4×106〜1.4×109の範囲にあった。第2ラウンドにおける力価は、競合なしでは1.3×105〜4.0×108、競合ありでは8.6×104〜1.3×108の範囲にあった。第3ラウンドにおける力価は、競合なしでは1.2×105〜1.9×108、競合ありでは6.0×105〜1.2×108の範囲にあった。
これらの選択アウトプットを、エラープローン親和性成熟について説明したようにサブクローニングし、スクリーニングした。BMS3h-193-25を除く全ての系統について、オフ速度が改善されたクローンが同定された。改善された効力について評価するために、オフ速度が改善されているクローンを、ELISA受容体結合アッセイ（RBA）において試験した。このRBAから得られた効力測定値を「追加成熟クローン」（further-matured clone）という見出しで表に記載する。次に、RBAにおいてより強力であったクローンを、強化された生物学的効力について、B細胞増殖アッセイにおいて試験し、得られたこれらの測定値を表17に記載する。B細胞増殖アッセイにおいて改善された効力を有するドメイン抗体を、他のさまざまなインビトロ細胞アッセイでも試験した。
受容体結合アッセイ（RBA）を使ったスクリーニング
実施例1において生成した抗ヒトCD40可変ドメインアミノ酸配列のCD40アフィニティを決定するために、いくつかのインビトロ受容体結合アッセイ（RBA）を使用した。3つのRBAフォーマットを使用した：（1）ビーズRBA、（2）ELISA RBA、および（3）CHO細胞RBA。
ビーズRBA：
リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄したSpheroストレプトアビジンポリスチレン粒子（Saxon Europe、英国）を、0.5μg/mlビオチン化ヒトIZ-CD40L（BMS）でコーティングした。コーティング後に、ビオチン化CD40L粒子をPBS中で洗浄し、PBSアッセイ緩衝液中の0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma-Aldrich、英国）に1：10希釈した。384穴透明底黒壁プレート（Applied Biosystems）において、ある希釈度範囲の精製dAb、0.25μg/mlヒトCD40（BMS、CY24FEB06-01）、5000分の1のマウス抗ヒトIgG（Fc）mAbクローンGG-7（Sigma-Aldrich、英国）、0.25μg/mlヤギ抗マウスALEXA Fluor 647（Invitrogen、Molecular probes、英国）およびビオチン化CD40Lポリスチレン粒子を均一に混合し、遮光下、室温で6時間インキュベートしておいた。インキュベーション後に、ビオチン化CD40L粒子へのdAbとヒトCD40との競合的結合を、AB8200細胞検出装置（Applied Biosystems）で、相対的蛍光を使って評価した。
ELISA RBA：
透明壁ハイバインド（High Bind）384穴プレート（Corning、英国）を、0.2M炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.4中の1μg/ml Neutravidin 25μlにより、4℃で終夜コーティングした。翌日、アッセイプレートを0.1％（v/v）Tween PBS緩衝液で洗浄し、PBS中の1％（w/v）BSAにより、室温で1時間ブロッキングし、再び洗浄した。過剰の洗浄緩衝液を除去した後、1μg/mlのビオチン化ヒトIZ-CD40L（BMS）25μlを、アッセイプレートと共に、室温で1時間インキュベートした。同時に、ある希釈度範囲の精製dAbと1μg/mlのヒトCD40（BMS、CY24FEB06-01）とを、1：1の比で複合体にした。アッセイプレートの洗浄後に、そのdAb：ヒトCD40複合体を、アッセイプレート中、穏やかに撹拌しながら、室温で2時間インキュベートした。5000分の1のマウス抗ヒトIgG（Fc）mAbクローンGG-7（Sigma-Aldrich、英国）および10000分の1のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートヤギ抗マウスIgG（Fc）二次検出抗体（Sigma-Aldrich、英国）と逐次的にインキュベートすることによって、ビオチン化CD40LへのdAbとヒトCD40との競合的結合を検出した。1M HCl溶液による中和後に、SpectraMax M5eプレートリーダー（Molecular Devices）を使って、450nmにおいて、吸光シグナルを測定した。
細胞アッセイ：CD40 CHO細胞RBA：
安定トランスフェクトヒトCD40発現CHO-DG44細胞またはネイティブCHO-DG44細胞（どちらもBMS）を、Versene（Invitrogen）を使って細胞培養フラスコから剥離した。1ウェルあたり4万個の細胞を、ある希釈度範囲のdAb、0.25μg/mlのビオチン化ヒトIZ-CD40L（BMS）、および0.25μg/mlのストレプトアビジンAlexa Fluor 647（Invitrogen、Molecular probes、英国）を含む0.1％（w/v）BSA PBSアッセイ緩衝液に入れて、96穴ハイバインド黒壁透明底プレート（Corning、英国）に播種した。その混合物を遮光下で6時間インキュベートした。インキュベーション後に、可溶性ビオチン化IZ-CD40LへのdAbとヒトCD40 CHO細胞との競合的結合を、AB8200細胞検出装置（Applied Biosystems）で、相対的蛍光を使って評価した。
表5〜7は、それぞれ、試験した抗ヒトCD40 dAbについての、一次スクリーニング作業（「ナイーブクローン」）および後続の親和性成熟ラウンド（「エラープローン成熟クローン」および「追加成熟クローン」）からの結果を示す。
［表5］一次スクリーニング作業
［表6］エラープローン成熟クローン
［表7］追加成熟クローン
CD40結合速度論
一次スクリーニング作業（「ナイーブクローン」）および後続の親和性成熟ラウンド（「エラープローン成熟クローン」）において同定された抗ヒトCD40 dAbについて、結合速度論を決定した。使用した方法は、CD40に対するdAbのアフィニティを直接測定するものである。
BIAcore（商標）3000計器（GE Healthcare）を使って、CD40に対するCD40特異的dAbの結合速度論を解析した。およそ600応答ユニット（RU）のビオチン化ヒトCD40（BMS）を、ストレプトアビジン（SA）BIAcore（商標）チップのフローセルの一つに固定化した。リガンドが何も固定化されていないもう一つのフローセルを、インライン参照用の参照フローセルとした。解析しようとする各dAbの適当な二倍希釈系列を、HBS-EP緩衝液（0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005％v/vサーファクタントP20を含む0.01M HEPES pH7.4、GE Healthcare）中に調製した。180マイクロリットルの各dAbを、二つ一組にして、計器のKINJECT機能を使って注入した。各dAbは、CD40固定化フローセルと参照フローセルを順次横切るように注入し、参照セルからのシグナルをインラインで差し引いた。実験は、HBS-EPの流速を30μl/分とし、25℃において行った。各注入が完了した後に、dAbを、緩衝液中で300秒間、リガンドから解離させ、それから、10mMグリシンpH2.0を10μl注入することで再生した。各分析物トレースから差し引くための第2の参照とするために、HBS-EP緩衝液ブランク（分析物を含有しないもの）の参照注入物も、同じ条件下で注入した。BIAevaluation 4.1ソフトウェア（GE Healthcare）を使って、参照フローセルトレースと緩衝液ブランクトレースの両方を各分析物トレースから差し引いた。同じソフトウェアを使って、分析物希釈系列トレースの会合相および解離相への1：1（ラングミュア）速度論モデルの同時グローバルフィッティングを行った。このモデルにより、相互作用の会合および解離速度定数（それぞれkaおよびkd）ならびに平衡状態解離定数（KD）が得られた。それらを表8および9に詳述する。
［表8］ナイーブクローン
［表9］エラープローン成熟クローン
生物物理学的特徴づけ
一次スクリーニング作業（「ナイーブクローン」）および後続の親和性成熟ラウンド（「エラープローン成熟クローン」および「追加成熟クローン）において同定された抗ヒトCD40 dAbを、生物物理学的パラメータの解析によって、さらに特徴づけた。dAbの相対的安定性を測定するために、それらの融点を示差走査熱量測定（DSC）によって決定した。融解温度が高いdAbの方が安定である。dAbが溶解状態において多量体型凝集体を形成するかどうかを決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー/マルチアングルレーザー光散乱（SEC-MALLS）によってdAbをアッセイした。結果を表10〜12に示す。
［表10］ナイーブクローン


［表11］エラープローン成熟クローン






［表12］追加成熟クローン
競合解析
BIAcore（商標）3000計器（GE Healthcare）を使って、CD40特異的dAbが同じCD40エピトープに結合するかどうかを解析した。およそ600応答ユニット（RU）のビオチン化ヒトCD40（BMS）を、ストレプトアビジン（SA）BIAcore（商標）チップのフローセルの一つに固定化した。リガンドが何も固定化されていないもう一つのフローセルを、インライン参照用の参照フローセルとした。解析しようとする各dAbまたはFabの適当な希釈液をHBS-EP緩衝液（0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005％v/vサーファクタントP20を含む0.01M HEPES pH7.4、GE Healthcare）に調製した。選ばれた希釈度は、後述のように注入した場合に、その特定阻害剤に関して考えうる最大の結合RUの＞80％をもたらすもの、典型的には1〜10μMであった。次に、競合について解析しようとする第2のdAbまたはFabを使って、上記と同じ（同じ最終濃度の）dAbまたはFabの混合物を調製した。計器のCOINJECT機能を使って、60μlの単一阻害剤希釈液を、CD40固定化フローセルおよび参照フローセルを順次横切るように注入し、その直後に、60μlの二阻害剤混合物を注入した。参照セルからのシグナルのインライン差し引きは、計器の制御ソフトウェアによって行った。実験は、HBS-EPの流速を30μl/分とし、25℃において行った。各同時注入が完了した後に、阻害剤を、緩衝液中で60秒間、リガンドから解離させ、それから、10mMグリシンpH2.0を10μl注入することで再生した。2回目の注入（2つの阻害剤の混合物）について得られた最大RUを記録し、単独で注入した場合の同じ阻害剤について得られたRUのパーセンテージとして表した。
第2の阻害剤が単独で注入した場合に通常結合するRUの少なくとも100％を保っていたとすると、それは、それら2つの阻害剤が別個のエピトープに結合することを含意した。第2の阻害剤について100％未満の結合が観察されたとすると、それは、CD40への結合に関するそれら2つの阻害剤の競合を示した。この競合には、次に挙げるように、いくつかの理由が考えられる：2つの阻害剤は同じエピトープまたはオーバーラップしているエピトープに結合しうる、結合の立体阻害が存在しうる、または第1阻害剤の結合が第2阻害剤の結合を防止するまたは低減させる抗原のコンフォメーション変化を誘導しうる。
各系統（BMS3h-217を除く）からのクローンの例を、オーバーラップする群内の他のdAbとの競合について試験した。表13および表14に示すように、試験した全てのdAbが、CD40への結合に関して、互いに競合するようである。このデータは、系統BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-41、BMS3h-43、BMS3h-56、BMS3h-131、BMS3h-198、およびBMS3h-202からなる群より選択される全ての抗体ポリペプチドが、ヒトCD40に対して、これらの系統のいずれからのdAbの結合とも競合するはずであることを示唆している。
［表13］競合BIAcore（商標）


［表14］

また、表15および表16に示すように、さまざまなdAbをChi220 Fab'との競合について試験した。この場合、競合を示すBMS3h-217を除けば、どのdAbも、Chi220 Fab'とは競合しない。BMS3h-56-5およびBMS3h-193-12 dAbは、結合したChi220またはG28-5 Fab'の存在下でも、単一dAb RUの少なくとも100％で結合したことから、これらのFabはこれらのdAbとは異なるエピトープに結合することが示唆された。Chi220 Fab'は、G28-5の存在下で、結合RUの低下を示した。結合の順序を反対にしても、同じ結果が観察された。これは、G28-5 Fab'がChi220 Fab'と同じエピトープに結合することを示唆している。
［表15］


［表16］
CD40活性アッセイ
抗ヒトCD40 dAbを、CD40活性を拮抗するそれらの能力について、機能的にアッセイした。試験したCD40活性は、B細胞増殖、および初代ヒト単球由来樹状細胞（DC）のhCD40L駆動性活性化によるサイトカイン生産であった。別段の注記がある場合を除き、アッセイは全て、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したRPMI培地中で行った。さまざまなアッセイを使った結果を表17に示す。
可溶性IZ-hCD40L駆動性初代ヒトB細胞増殖：
1×105個の扁桃ヒトB細胞を、0.6μg/mlのIZ-hCD40Lと共に、さまざまな力価測定値（titration）の抗体ポリペプチドと合わせて、96穴丸底プレート中、200μl/ウェルの最終体積でインキュベートした。プレートを37℃で72時間インキュベートした後、チミジン（3H；0.5μci/ウェル）を6時間加えた。B細胞増殖をチミジン取り込みに基づいて定量した。
CHO-hCD40L駆動性初代ヒトB細胞増殖：
CHO細胞にヒトCD40Lをトランスフェクトすることで、細胞表面に高レベルのCD40Lを発現する安定細胞株を生成させた。ヒトB細胞と共にインキュベートする前にCHO-CD40L細胞に10,000Radを照射した。1×105個の扁桃ヒトB細胞を、1×103個のCHO-CD40L細胞（CHO-CD40L：ヒトB細胞の比は1：100）と共に、さまざまな力価測定値の抗体ポリペプチドと合わせて、96穴丸底プレート中、200μl/ウェルの最終体積でインキュベートした。プレートを37℃で72時間インキュベートした後、3H-チミジン（0.5μci/ウェル）を6時間加えた。B細胞増殖をチミジン取り込みに基づいて定量した。
可溶性IZ-hCD40L駆動性カニクイザル脾臓ヒトB細胞増殖：
1×105個のカニクイザル脾臓B細胞を、0.5μg/mlのIZ-hCD40Lと共に、さまざまな力価測定値の抗体ポリペプチドと合わせて、96穴丸底プレート中、200μl/ウェルの最終体積でインキュベートした。プレートを37℃で72時間インキュベートした後、3H-チミジン（0.5μci/ウェル）を6時間加えた。B細胞増殖をチミジン取り込みに基づいて定量した。
初代T細胞駆動性ヒトB細胞増殖：
T細胞を、ヒト末梢血単核球（PBMC）から単離し、ヒツジ赤血球（SRBC）ロゼット形成を使って濃縮した。ヒト扁桃B細胞は、扁桃組織を単一細胞懸濁液までホモジナイズすることによって単離した。白血球をフィコール分離によって取得してから、SRBCロゼット形成を使ってB細胞を負に選択し、ロゼット形成した細胞を捨てることによって濃縮した。
濃縮されたヒトT細胞を、PM-LCL（EBV形質転換B細胞株；10,000Radを照射）と共に、5：1の比（T：LCL）および37℃で、6日間培養することにより、同種異系T細胞の集団を生成させた。6日目に、増殖したT細胞を単離し、3000Radを照射した後、初代ヒト扁桃B細胞（1×105個のB細胞/ウェル）と共に、抗CD3 mAb（OKT3）がコーティングされた96穴平底プレート中、1：2の比で、培養した（5×104T細胞/ウェル）。さまざまな力価測定値の抗体ポリペプチドを各ウェルに加えた。各ウェルの最終体積は200μlであった。試験プレートを37℃で3日間インキュベートした。ヒトB細胞増殖は、3H-チミジン（0.5μci/ウェル）を培養物に最後の18時間加えることによって決定した。
初代ヒト単球由来樹状細胞（DC）のCHO-hCD40L駆動性活性化：
SRBCロゼット形成でT細胞を枯渇させることによって、ヒトPBMCを、単球について濃縮した。単球が濃縮されたPBMCを、10ng/ml GM-CSFおよび5ng/ml IL-4と共に、6穴プレート中、37℃で6日間、培養した。2日目と5日目に、培養したプレートに新鮮培地（GM-CSFおよびIL-4を含むもの）を補充した。6日目に、未成熟樹状細胞（DC）を細胞アッセイに使用した。8×104個の未成熟DCを、4×103個のCHO-hCD40L細胞（10,000Radを照射したもの）と共に、さまざまな力価測定値の抗体ポリペプチドと合わせて、96穴平底プレート中で培養した。24時間後に上清を収穫し、さまざまなサイトカイン（IL-12、TNF、IL-23）の存在について試験した。サイトカイン生産のレベルによってDC活性化を決定した。
［表17］
CD40および血清アルブミンに結合する二重特異性dAb
CD40ヒト血清アルブミン（HSA）またはカニクイザル血清アルブミン（CSA）に特異的に結合する二重特異性dAbを構築し、細胞ベースのアッセイにおいて活性について試験した。アルブミン特異的dAbを「AlbudAb」と呼ぶ。この実施例では、AlbudAb融合物が、CD40に結合するBMS3h dAbと、HSAを認識するもう一つのドメイン抗体DOM7hとを含む。これら2つのdAbをアミノ酸リンカーのアミノ末端とカルボキシル末端にインフレームに融合して、インライン融合（ILF）ポリペプチドを形成させる。そのILFポリペプチドを、単一融合タンパク質として組換え発現させる。AlbudAb ILFの活性を実証するRBAを以下に説明し、結果を表18に示す。表19に、試験したAlbudAb ILFに使用したリンカー配列を要約する。BIAcore（商標）アッセイによって決定された速度論的結合データを表20に示す。
上清中のdAbを検出するためのヒトCD40 CHO細胞ELISA：
安定トランスフェクトヒトCD40発現CHO-DG44細胞またはネイティブCHO-DG44細胞（どちらもBMS）を、0.25％トリプシンEDTAを使って細胞培養フラスコから剥離し、1ウェルあたり100,000個の細胞を成長培地に入れて96穴組織培養処理プレート（NUNC）に播種した。細胞を湿潤雰囲気下、37℃、5％CO2で付着させた。アッセイの当日に、細胞シートをPBSで洗浄してから、2％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）で20分間固定した。固定後に細胞シートを再びPBS中で洗浄し、次に、PBS中の15％ウシ胎児血清（FBS、PAA）による1時間のブロッキングステップを行った。プレートをもう一度洗浄してから、100μl/ウェルのdAb上清を加え、室温で2時間インキュベートした。dAb上清を細胞と共にインキュベートした後、プレートを洗浄し、dAbがVHドメインであるかVLドメインであるかに応じてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート抗プロテインAまたはLのインキュベーションで、dAb結合を検出した。1M HClによる中和後にSpectraMax M5eプレートリーダー（Molecular Devices）を使って、450nmにおいて、吸光シグナルを測定した。
ICAM-1アップレギュレーション細胞アッセイ：
安定トランスフェクトヒトCD40L発現COS細胞を、Versene（Invitrogen）を使って細胞培養フラスコから剥離した。1ウェルあたり20,000細胞を、アッセイ緩衝液（フェノールレッドを含まないRPMI 1640（Sigma-Aldrich、英国）＋1％ペニシリン/ストレプトマイシン＋10％FBS Gold（どちらもPAA Laboratories、英国））に入れて、96穴ハイバインド黒壁透明底プレート（Corning、英国）に播種した。細胞を湿潤雰囲気下、37℃、5％CO2で放置して、終夜付着させた。翌日、付着していない細胞を含有する消耗されたアッセイ緩衝液に、100μlの新鮮アッセイ緩衝液を補充した。これに、20,000個のRAMOS細胞/ウェルを、ある希釈度範囲のdAbと共に、アッセイ緩衝液に入れて加えた。アッセイプレートを、37℃、5％CO2の湿潤雰囲気に、さらに24時間戻しておいた。陰性対照ウェルには、RAMOS細胞を加えなかった。COS細胞の細胞表面上のCD40Lへの曝露に応答して起こるRAMOS細胞の細胞表面におけるICAM-1のアップレギュレーションを阻害するdAbの能力を、0.5μg/mlマウス抗ヒトICAM-1抗体（R&D systems）と0.2μg/mlヤギ抗マウスALEXA flour 647（Invitrogen、Molecular probes、英国）とを加えることによって評価した。遮光下で3時間のインキュベーション期間後に、AB8200細胞検出プラットフォーム（Applied Biosystems）で測定される相対的蛍光を検出した。
インライン融合物（ILF）の血清アルブミンへの結合の速度論の解析：
BIAcore（商標）3000計器（GE Healthcare）を使って、ヒトおよびカニクイザル血清アルブミンへの抗CD40-AlbudAb ILFの結合速度論を解析した。約400応答ユニット（(RU）のヒト血清アルブミン（HSA）またはカニクイザル血清アルブミン（CSA）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を使ってCM5 BIAcore（商標）チップのフローセルに固定化した。リガンドが何も固定化されていない第2のフローセルをインライン参照用の参照フローセルとした。解析しようとする各dAbの適当な二倍希釈系列を、HBS-EP緩衝液（0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005％v/vサーファクタントP20を含む0.01M HEPES pH7.4、GE Healthcare）中に調製した。計器のKINJECT機能を使って、200マイクロリットルの各ILFを、二つ一組にして注入した。注入は、血清アルブミン-固定化フローセルおよび参照フローセルを順次横切るように行い、参照セルからのシグナルをインラインで差し引いた。実験は、HBS-EPの流速を40μl/分とし、25℃において行った。各注入が完了した後に、dAbを、緩衝液中で120秒間、リガンドから解離させ、それから、10mMグリシンpH2.0を10μl注入することで再生した。各分析物トレースから差し引くための第2の参照とするために、HBS-EP緩衝液ブランク（分析物を含有しないもの）の参照注入物も、同じ条件下で注入した。BIAevaluation 4.1ソフトウェア（GE Healthcare）を使って、参照フローセルトレースと緩衝液ブランクトレースの両方を各分析物トレースから差し引いた。同じソフトウェアを使って、分析物希釈系列トレースの会合相および解離相への1：1（ラングミュア）速度論モデルの同時グローバルフィットを行った。このモデルにより、相互作用の会合および解離速度定数（それぞれkaおよびkd）ならびに平衡状態解離定数（KD）が得られた。それらのパラメータ値を表20に示す。
［表18］活性アッセイ




［表19］代表的リンカー配列

［表20］BIAcore（商標）解析

表21に、CD40とHSAまたはCSAとに特異的に結合することができる代表的AlbudAb ILFのアミノ酸配列を列挙する。各ILFの名称はそのリンカー配列を明らかにしている。すなわち「GxS」は、リンカーが「x」残基のグリシンとそれに続くセリンを有することを意味し、「(GxS)y」は、リンカーがy個の繰り返し単位GxSを有することを意味する。表21に列挙したILF配列をコードする代表的核酸を、表22に開示する。当技術分野では知られているとおり、複数のコドンが同じアミノ酸をコードしうる。したがって、あるタンパク質配列をコードする核酸には、コドン縮重を有する核酸が含まれる。
［表21］二重特異性dAbアミノ酸配列
（表21は、それぞれ配列番号5〜7、1207〜1209および8として開示される「AST」、「TVAAPS」、「TVA」、「G4S」、「(G4S)3」、「(G4S)5」および「ASTSGPS」を開示している）










［表22］二重特異性dAbをコードするポリヌクレオチド
（表22は、それぞれ配列番号5〜7、1207〜1209および8として開示される「AST」、「TVAAPS」、「TVA」、「G4S」、「(G4S)3」、「(G4S)5」および「ASTSGPS」を開示している）
抗カニクイザルCD40 dAb
ヒトCD40に特異的に結合する抗体ポリペプチドを生成させるための本明細書に開示する方法は、他の種のCD40に特異的に結合する抗体ポリペプチドを生成させるために使用することができる。例えば、抗カニクイザル（抗cyno）CD40抗体ポリペプチドは、ここに開示する方法を使って作製することができる。抗cynoCD40抗体ポリペプチドは、例えば抗ヒトCD40 dAbと同じ初回/一次スクリーニングおよび親和性成熟のスキームを使って生成させることができる。抗cynoCD40 dAbを取得するための方法を開示し、抗cynoCD40 dAbの代表的な例を、下記表23に記載する。
ELISA RBA：
透明壁ハイバインド384穴プレート（Corning、英国）を、炭酸塩緩衝液中の1μg/mlニュートラアビジン25μlで、4℃において終夜コーティングした。翌日、アッセイプレートを0.1％Tween PBS緩衝液で洗浄し、PBS中の1％BSAを使って室温で1時間ブロッキングし、再び洗浄した。過剰の洗浄緩衝液を除去した後、1μg/mlのビオチン化ヒトIZ-CD40L（BMS、保存液濃度1.2mg/ml）25μlを、アッセイプレートと共に、室温で1時間インキュベートした。同時に、ある希釈度範囲の精製dAbと1μg/mlのcynoCD40（BMS）を1：1の比で複合体化した。アッセイプレートの洗浄後に、dAb：cynoCD40複合体を、アッセイプレート中、室温で穏やかに撹拌しながら2時間インキュベートした。ビオチン化CD40LへのdAbとcynoCD40との競合的結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート抗ヒト(Fc)二次抗体（Sigma-Aldrich、英国）で検出した。1M HClで中和した後、Spectromax M5eプレートリーダー（Molecular Devices）を使って、450nmにおいて、吸光シグナルを測定した。
AB8200 FMATを用いるcynoCD40 CHO細胞RBA：
安定トランスフェクトcynoCD40発現CHO-DG44細胞またはネイティブCHO-DG44細胞（BMS）を、Versene (Invitrogen）を使って細胞培養フラスコから剥離した。1ウェルあたり40,000個の細胞を、ある希釈度範囲のdAb、0.25μg/mlのビオチン化ヒトIZ-CD40L（BMS、保存液濃度1.2mg/ml）および0.25μg/mlのストレプトアビジンAlexa Fluor 647（Invitrogen、Molecular probes、英国）と共に、0.1％ BSA PBSアッセイ緩衝液に入れて、96ウェルハイバインド黒壁透明底プレート（Corning、英国）に播種した。その混合物を遮光下で6時間インキュベートした。インキュベーション後に、AB8200細胞検出プラットフォーム（Applied Biosystems）によって測定される相対的蛍光を使って、可溶性ビオチン化IZ-CD40LへのdAbとcynoCD40 CHO細胞との競合的結合を測定した。
CHO-hCD40L駆動性初代ヒトB細胞増殖：
CHO細胞（ATCC）にヒトCD40Lをトランスフェクトして、細胞表面に高レベルのCD40Lを発現する安定細胞株を生成させた。ヒトB細胞と共にインキュベートするために、CHO-CD40L細胞に10,000Radを照射した。1×105個の扁桃ヒトB細胞を、1×103個のCHO-CD40L細胞（CHO-CD40L：ヒトB細胞の比は1：100）と共に、さまざまな力価測定値のdAbまたはモノクローナル抗体と合わせて、96穴丸底プレート中、200μl/ウェルの最終体積でインキュベートした。プレートを37℃で72時間インキュベートした後、チミジン（3H；0.5μci/ウェル）を6時間加えた。B細胞増殖をチミジン取り込みに基づいて定量した。別段の注記がある場合を除き、アッセイは全て、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したRPMI培地において行った。
可溶性IZ-hCD40L駆動性カニクイザル脾臓B細胞増殖：
カニクイザル脾臓から単離された1×105個のB細胞を、0.5μg/mlのIZ-hCD40Lと共に、さまざまな力価測定値のdAbまたはmAbと合わせて、96穴丸底プレート中、200μl/ウェルの最終体積でインキュベートした。プレートを37℃で72時間インキュベートした後、3H-チミジン（μci/ウェル）を6時間加えた。B細胞増殖をチミジン取り込みに基づいて定量した。別段の注記がある場合を除き、アッセイは全て、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したRPMI培地において行った。
［表23］
抗ヒトCD40 dAbはCynoCD40に結合しない
CynoCD40は、ヒトCD40におけるTrp109の代わりにLeu109残基を有する。Macaca fascicularis CD40のアミノ酸配列を、以下に転載する：
（配列番号2）
抗ヒトCD40 dAbを、カニクイザル、アカゲザルおよびチンパンジー血中のB細胞ならびにマーモセット血中のリンパ球への交差反応性について、フローサイトメトリー法を使って試験した。以下に詳述する手順は、複数の実験でCD40 dAb検出に使用した方法を要約したものである。表24に示す結果は、抗ヒトCD40 dAbがcynoCD40に結合しないことを示唆している。これは、ヒトCD40中のTrp109（これはcynoCD40には存在しない）がdAbとヒトCD40との間の複合体形成にとって重要であるという、上に開示した証拠と合致している（図1および図2参照）。
方法：
PEG化抗ヒトCD40 dAb（BMS3h-56-5C-40LおよびBMS3h38-2C-P40Br）またはビオチン-コンジュゲートdAb（BMS3h38-2-ビオチン）を、ローテータ上で、ヒトおよび霊長類血液試料と共に、37℃で1時間インキュベートした。各血液試料から100μlを12×75mmチューブに分注し、FACS緩衝液（0.5％FBS/PBS/0.1％アジ化ナトリウム）と共に3回洗浄した。チューブを1500rpmで5分間遠心分離し、洗浄と洗浄の間に上清をデカントした。洗浄後に、チューブを氷上に置き、Fc受容体を介した非特異的結合をブロックするために、ヒトIgGと共に5分間インキュベートした。
PEG化dAb検出のために、抗PEG抗体（クローンCH-2074（Silver Lake Research）またはクローン2-2（Open Biosystems））をチューブに加え、30分間インキュベートした。試料をFACS緩衝液中で1回洗浄した後、APC標識CD20抗体（クローン2H7、BD Biosciences）およびPE標識抗マウスIgG（Fcγ1特異的；Calbiochem）と共に、さらに30分間、氷上でインキュベートした。
ビオチン-コンジュゲートdAb検出のために、PE標識ストレプトアビジン（Invitrogen）とAPC標識CD20抗体（クローン2H7、BD Biosciences）をチューブに加え、室温で30分間インキュベートした。
さらに、ヒトおよび霊長類血液中のCD40レベルを測定するために、各血液試料のアリコートを、APC標識CD20抗体（クローン2H7、BD Biosciences）および霊長類種と交差反応するPE標識抗ヒトCD40抗体（クローン5C3、BD Biosciences）と共に、室温で30分間インキュベートした。
検出抗体インキュベーション後に赤血球を溶解し、白血球を固定するために、FACS溶解溶液（BD Biosciences）を全てのチューブに加え、試料を室温で15分間インキュベートした。試料を遠心分離し、FACS溶解溶液に再懸濁し、BD FACSCanto（商標）でのフローサイトメトリーによって解析し、解析のためにCD20＋ B細胞にゲートをかけた。
マーモセット試料の場合は、CD20抗体が交差反応性ではなかったので、解析は、前方および側方散乱特性（サイズ）によって同定される全てのリンパ球で行った。
結果：
PEG化およびビオチン化抗ヒトCD40 dAbの結合を、上記の方法に従って、ヒトおよび霊長類血液試料において試験した。ヒト血液試料ではCD20＋ B細胞への抗ヒトCD40 dAb結合が検出された。対照的に、カニクイザル、アカゲザル、もしくはチンパンジー血液試料中のCD20＋ B細胞、マーモセット血液試料中のリンパ球では、PEG化およびビオチン化CD40 dAbの結合は検出されなかった。BMS3h-38-2C-P40Br dAbに関する結果を図3のパネルAおよびBに示す。他のdAbについても同様の結果が得られた。霊長類CD40と交差反応する抗ヒトCD40抗体を使って、ヒトおよび霊長類種のB細胞上に同等レベルのCD40が確認された。これらのデータは、BMS3h-56およびBMS3h-38系統からのヒトCD40 dAbが、霊長類種におけるCD40に結合できないことを示している。このデータは、図1および図2に示すようにCD40と抗CD40 dAbとの間の複合体の形成にはTrp109残基が重要であることと合致している。
CD40とdAb BMS3h-56-5との間の複合体のX線結晶構造
データの収集と処理
ヒトCD40（配列番号1）/BMS3h-56-5（配列番号321）複合体の構造決定に際して、2つの異なる結晶形を解析した。100Kにフラッシュ冷却（flash-cool）して100Kに維持し、Rigaku AFC-9ゴニオメーターにマウントした、CD40/BMS3h56-5複合体の結晶から、データを収集した。X線源は、MicroMax（商標）共焦点光学系およびSaturn 92検出器を伴い、銅ターゲットを用いる、Rigaku FR-Eであった。データは、硫黄異常回折シグナルを強化して、そのシグナルをデータの位相決定に利用することを期待して、極めて高い多重度で収集された。データは、HKL2000（HKL Research；Otwinowski et al.、「Methods Enzymol. Macromolecular Crystallography part A」（Carter et al編）vol.276のp.307-326、Academic Press, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク (1997)）で処理した。この結晶に関するデータ収集統計値を以下と表24とに要約する。
空間群：I222；
単位格子：a＝156.6Å；b＝158.3Å；c＝200.7Å；
モザイク度（mosaicity）0.59〜0.84；除外された観察結果：1028；0.06％。
［表24］

第2の結晶形は、100Kにフラッシュ冷却してRayonix MX-225検出器にマウントした結晶から、Canadian Light SourceビームラインCMCF1（08-ID-1）において収集し、波長は0.9793Åだった。これらのデータは、Shamrock Structures（R. WalterおよびG. Ranieri）によって収集され、HKL2000で処理された。この結晶に関するデータ収集統計値を以下と表25とに要約する。
空間群：C2；
単位格子：a＝199.3Å；b＝48.7Å；c＝138.8Å；β＝118.2°；
モザイク度0.62〜0.71；除外された観察結果：70；0.08％。
［表25］

分子置換モデル：
dAb、BMS3h-56-5のモデルは、PDB ID 2VYR E鎖残基1〜124から導き出し、CDR31〜35、50〜57、および99〜111に対応する連番残基（Kabatナンバリングの31〜35、50〜56、および95-100Gに対応する）をSPLIT_PDBによって除去した後、MUTATEにかけ、最後にRENUMBERで番号を再付与した。MUTATEは、非同一残基を最小同一残基（minimum identical）、すなわち通常はAlaまたはGlyに変えるが、例えばTyr→PheおよびPhe→TyrはPheを与えるであろう。これが原子を構築することはないが、Thr→Val、Val→Thr、Cys→Ser、およびSer→Cysについては適当な原子名に置き換える（ただし位置は変化させない）。RENUMBERは、ナンバリングを、CDRおよびフレームワーク残基の説明を簡単明瞭にする抗体の標準的ナンバリングシステムであるKabatナンバリング（Kabat et al.「Sequences of Immunological Interest」第5版、米国保健社会福祉省、ワシントンD.C.（1991））に変える。
CD40モデルは、PDB ID 1JMA（B鎖）、1NCF（A鎖）、1TNR（R鎖）、2HEV（R鎖）、2HEY（R鎖、T鎖）、および2UWI（A鎖、B鎖）から、phenix.ensembler（ケンブリッジ大学、英国）を使って構造のアンサンブルを生成することによって、構築した。これらの分子のN末端（残基24〜78）＋6残基セグメント（残基95〜100）は、Cα原子について許容できる二乗平均平方根距離で重ね合わせることができ、それをCD40のN末端領域のモデルとして使用した。
分子置換法：
分子置換にはプログラムPHASER（McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40:658-674 (2007)）を使用した。真の解が見つかったかどうかを決定するために、並進関数Zスコア（translation function Z-score）（TFZ）と対数尤度ゲインの増加（increase in the log-likelihood gain）を監視した。8以上のTFZスコアは一般に解を表す。それより小さいTFZスコアであって、対数尤度ゲインの実質的な増加（＞50）を伴うものも、許容できる指標である。
モデル構築、密度修正、および結晶学的精密化法：
分子グラフィクス用のモデル構築ツールには、COOTプログラムを含めた（Emsley et al., Acta Crystallogr Sect. D 60:2126-2132 (2004)；Emsley et al.「Features and Development of Coot」Acta Crystallogr Sect. D 66:486-501 (2010)））。既知の密度修正プログラムおよび他のプログラムを使って、非結晶学的対称性マップ平均化法による密度修飾を行い、分子間のオイラー角および並進を算出した。精密化は、autoBUSTER（GlobalPhasing, Ltd.：Bricogne et al., Acta Crystallogr. Sect. D 60: 2210-2221 (2004)；Tronrud et al., Acta Crystallogr. Sect. A 43: 489-501 (1987)）を使って行った。
ドメイン抗体ナンバリングシステム：
ドメイン抗体の残基ナンバリングシステムはKabatのものに従った。以下にBMS3h-56-5について、Kabatナンバリングを単純な連続的ナンバリングと比較する。
Kabatナンバリングでは、BMS3h-56-5は、挿入残基52A、82A、82B、82Cを有し、残基100が欠けている。どちらのナンバリングシステムでも、発現コンストラクトの一部であるN末端のSerおよびThrには、負の番号が付与される。
CD40/BMS3h-56-5複合体の構造の決定：
PHASERは、I222結晶形では4つのBMS3h-56-5 dAb分子を、またC2結晶形では3つのBMS3h-56-5 dAb分子を位置づけることができた。I222結晶形では、TFZスコアが7.6〜41.0の範囲にあり、対数尤度ゲインの増加は77〜446の範囲にあった。BMS3h-56-5 dAb分子に関するこれらの解は、大きなチャネルによって他のカラムから分離された、I222結晶を貫くdAb分子のらせんカラムを形成した。C2結晶では、TFZスコアが7.7〜16.5の範囲にあり、対数尤度ゲインの増加は110〜150の範囲にあった。この結晶形におけるdAbのパッキングは反復性でも対称性でもなかった。
CD40 N末端ドメインのアンサンブルモデルを使って、I222結晶形内に、5.7〜8.5のTFZスコアおよび83〜389の範囲の対数尤度ゲインの増加で、4分子のCD40のN末端ドメインを置くことができた。I222結晶形中の4つのCD40のN末端ドメインは、4つのdAb分子のカラムの間に等しく中心を置く塊を形成した。しかし、それらはBMS3h-56-5 dAb分子に触れてはいなかった。C2結晶形には、5.8〜12.1の範囲のTFZスコアおよび100〜198の範囲の対数尤度ゲインの増加で、3分子のCD40のN末端ドメインを置くことができた。この結晶形でも、N末端ドメインはBMS3h-56-5 dAb分子と接触していなかった。
I222結晶形において、CD40/Chi220 Fab複合体からのCD40のN末端ドメインと、2UWIからのN末端ドメインを、CD40 N末端ドメインに重ね合わせた。N末端を特定のBMS3h-56-5 dAbと関連づけることができたことから、非結晶学的対称性（NCS）マップ平均化の使用が可能になった。NCS平均化の出発相関係数は、0.71〜0.81の非対角値を与えた。最終非対角値は0.88〜0.92だった。N末端領域近くの電子密度は明確で、BMS3h-56-5 dAbのCDR3についてパスをトレースすることができた。CD40/Chi220 Fab'複合体からの残基82〜94および101〜121を2UWI上の対応する残基に重ね合わせ、次にCOOTを使って、手作業でフィットを改良した。次に、CD40の第2ドメイン（残基82〜94および101〜121）に関するこの位置を、他の3つのN末端ドメインに変換した。
一サイクルの精密化を行ったところ、R-freeは0.437から0.380に低下し、R-workは0.447から0.381に低下して、理想値からの二乗平均平方根結合距離および角偏差が改良された。その結果得られた電子密度マップは、残基109がTrpと合致する側鎖を有すること、およびCD40のC末端側の70残基中の少なくともいくつかの残基について密度が存在することを示した。
CD40は、二次構造をほとんど持たないので、C末端側の約70残基を電子にフィッティングすることは困難であることがわかった。そこで、鎖のトレースに指針を与えるのに役立つ適切なモデルを求めて、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Baseを検索した。44残基中16残基同一および44残基中24残基マッチ（match）の上位2つのヒットが2AW2および1JMAであった。これらは同じ配列を有している。
（配列番号1270〜1271）
同一残基を適当な一文字記号でコンセンサス行に記し、類似残基をアスタリスクでコンセンサス行に示す。これは、CD40のN末端ドメインの残基41〜84の場合と同じ残基のストレッチであった。
（配列番号1272および1270）
同一残基を適当な一文字記号でコンセンサス行に記し、類似残基をアスタリスクでコンセンサス行に示す。
ジスルフィド結合のマッチング：
CD40の残基41〜84および125〜168におけるジスルフィド結合の比較
括弧内の残基は、配列リピート中の残基範囲の外にある
1JMA/2AW2モデルをガイドにして、COOTプログラムを使って、CD40鎖の一つをフィッティングした。次に、フィッティングされたこのモデルを、他の3つのCD40鎖の一つと重ね合わせた。しかし、この新しい残基のストレッチの位置は、他の2つのCD40鎖では異なる配向を持つと思われ、それらは、この時点ではフィッティングしなかった。一サイクルの精密化を行ったところ、R-freeは0.393から0.366に低下し、R-workは0.400から0.349に低下して、理想値からの二乗平均平方根結合距離および角偏差がかなり改良された。
I222結晶形中の分子の一つからのBMS3h-56-5 dAbを、C2結晶形中の3つのdAbのそれぞれに重ね合わせた。その変換マトリックスを使って、I222結晶形の第2およびC末端ドメインを配向させた。COOTプログラムを使ってモデルを再構築した。一サイクルの精密化を行ったところ、R-freeは0.361から0.334に低下し、R-workは0.375から0.306に低下して、理想値からの二乗平均平方根結合距離および角偏差が改良された。その結果得られた電子密度マップは、さらに多くのCD40残基を配置するための指針を与えた。もう一サイクルの精密化を行ったところ、R-freeは0.302から0.287に低下し、R-workは0.299から0.270に低下して、理想値からの二乗平均平方根結合距離および角偏差が改良された。
次に、従来のモデル構築と精密化とを使って、構造決定を完了した。さらに数ラウンドの最適化によって最終的な精密化に至り、統計値は次のとおりになった：R-free 0.260、R-work 0.228、二乗平均平方根結合距離0.010Å、二乗平均平方根角1.4°。実空間相関係数は主鎖原子について0.92、側鎖原子について0.80である。最終モデルは13個の水分子を持っていた。
C2結晶形からのC末端ドメインのモデルをガイドとして用いて、I222結晶形におけるCD40モデルをさらに精密化した。COOTプログラムを使ったモデル構築とautoBUSTERプログラムによる精密化をさらに数サイクル行うことで、次の統計値に至った：R-free 0.323、R-work 0.292、二乗平均平方根結合距離0.011Å, 二乗平均平方根角1.5°。実空間相関係数は主鎖原子について0.91および側鎖原子について0.80である。このモデルは水分子を含有していなかった。
CD40/BMS3h-56-5複合体の全体的構造：
一つのBMS3h-56-5 dAbが一つのCD40分子に結合する。図1に示すように、BMS3h-56-5は、N末端領域において結合する抗体Chi220のそれとは異なるエピトープに結合する。CD40残基（配列番号1）は、エピトープ残基を除いて、緑色で示されている。Chi220のためのCD40エピトープ残基は青色で示されており、BMS3h-56-5 dAbエピトープ残基はシアンで示されている。Chi220 FabおよびBMS3h-56-5のβストランドは赤色で示され、CDR残基はマゼンタで示され、他のループは橙色で示されている。CD40、Chi220、およびBMS3h-56-5分子について、ジスルフィド結合が、硫黄原子を黄色にして示されている。
I222結晶形は4つの結晶学的に独立したCD40/BMS3h-56-5複合体を含有し、C2結晶形は、3つの結晶学的に独立したCD40/BMS3h-56-5複合体を含有する。CD40分子は、一定量の柔軟性を有し、ドメインは、複合体の7つのユニークなバージョンにおいてさまざまに配列されるが、相互作用の全体的性質は全ての例で保持されている。
BMS3h-56-5 dAbエピトープ残基：
BMS3h-56-5に対する最小CD40エピトープは、BMS3h-56-5原子とファンデルワールス接触または水素結合接触している少なくとも1つの原子を含有するCD40残基と定義される。どの複合体でも最小エピトープは、配列番号1で言えば、次に挙げるCD40残基を含んでいる：Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159、およびHis162。次に挙げるさらなる残基は、いくつかの複合体において、ファンデルワールス接触または水素結合接触している：Pro85、Asn86、Leu87、Gly88、Glu106、Glu107、Gly108、His110、Thr112、Cys119、Val120、Gln133、Ile134、Ala135、Thr136、Ser155、Lys160。
最大CD40エピトープは、1.7Åプローブ球で埋没している原子を含有する残基と定義される。これらの残基には上記の残基の全てに加えて、全ての複合体におけるVal154が含まれる。いくつかの複合体では、さらなる埋没残基がSer118、Arg123、Thr141、Phe151、Asp153、Cys161、およびPro163である。
BMS3h-56-5の表面を接触残基と共に描写したものを図2に示す。接触BMS3h-56-5残基が示されている。埋没残基も示されている。CD40はカートゥーンとして表され、橙色は非繰り返し二次構造を表し、マゼンタはエピトープ残基を表している。CD40残基Trp109、Ala115、Leu121、Ser126、およびHis162もスティック（炭素原子はシアン）として示されているが、これらは、ヒトとカニクイザル（Macaca fascicularis）との間で異なる7つの残基のうちの5つである。Ala115およびSer126は、BMS3h-56-5結合部位から見て、CD40の反対側にある。Trp109およびLeu121は、CDR-3とFR-2（BMS-3h-56-5残基Leu45およびArg47）の間にあるBMS-h-56-5のクレフト中に結合する。CD40のHis162は、BMS3h-56-5 dAbのCDR2のArg58と相互作用する。Trp109の変異は、BMS3h-56-5活性をかなり低下させるか、消失させる。
結晶学的に独立した複合体に応じて、660〜740Å2のCD40表面積が埋没しており、より微細なレベルで表すと16〜21個の残基が接触し、46〜67原子が接触している。BMS3h-56-5の場合は、660〜780Å2の表面積が埋没しており、より微細なレベルで表すと14〜17残基が接触しており、48〜62原子が接触している。これらの接触は、結晶学的に独立した複合体に応じて、3〜7個の水素結合および111〜142個のファンデルワールス相互作用を与える。
CD40上のdAb結合エピトープの同定
CD40上のdAb結合エピトープを同定するために、残基76、109、または121に特異的アミノ酸残基置換を含有する7つのCD40-Fc融合タンパク質に対して、dAb結合を試験した。これらのCD40-Fc融合タンパク質には、野生型ヒトCD40（wt-hCD40）、野生型カニクイザルCD40（wt-cCD40）、および特定のアミノ酸残基をカニクイザルCD40（M1、M2、M4、M5）またはチンパンジーCD40（M3）の配列からの対応する残基に変異させた5つの変異型ヒトCD40タンパク質（M1〜M5）が含まれる。アミノ酸置換を表26に列挙する。
野生型ヒトCD40細胞外ドメイン（1〜193）の配列は、REFSEQ：アクセッションNM_001250.3からのものである。カニクイザルコンストラクトおよび変異型コンストラクトは、表26に示す位置における野生型配列の部位指定変異誘発法を使って生成させた。細胞外ドメインを、トロンビン切断が可能なリンカーDPGGGGGRLVPRGFGTGDP（配列番号1273）と融合し、そのリンカーをヒトIgG1 Fcと融合した。TIG-pYD7-GATEドローチャー（Durocher）発現ベクターをトランスフェクトしたHEK-293-6E細胞において、タンパク質を発現させた。5日後に上清を収穫した。各CD40タンパク質を条件培地からプロテインAファストフロークロマトグラフィーを使って精製した。カラムをPBS（20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2）で洗浄してから、80mM酢酸ナトリウム、pH3を使って、1/5体積の1M Tris-HCl、pH8中に溶出させた。溶出物をPBS中のSuperdex-200カラムにかけた。
［表26］
3h217、3h37、3h38、および3h56系統からの代表的dAbを、表26に列挙したCD40-Fc融合タンパク質へのそれらの結合についてアッセイした。アッセイはBioRad ProteOn XPR36 SPR計器で行った。10mM酢酸ナトリウムpH4.5中の8μg/ml抗ヒトIgG(Fc)抗体（Biacore/GE Healthcare）をBioRad GLCセンサーチップに標準的なエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）/N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）化学を使って固定化すると共に、エタノールアミンブロッキングを行うことにより、SPR表面を調製した。固定化および速度論敵結合解析用のランニング緩衝液は10mMリン酸ナトリウム、130mM塩化ナトリウム、0.05％Tween 20、pH7.1とした。濃度20μg/mlのCD40-Fc融合タンパク質を、これらの表面で、Fcテールを介して垂直方向に捕捉し、CD40-Fcタンパク質を欠く参照表面を参照差し引きに使用した。速度論的実験は、捕捉されたCD40-Fc表面上に、405、135、45、15、および5nMのdAb分析物を、25℃において、240秒の会合時間および420秒の解離時間を使って、30μl/分の流速で、水平方向に流すことによって行った。3M MgCl2の30秒パルスの後、ランニング緩衝液を60μl/分で流すことによって、表面を水平、垂直、両方向に再生した。センサーグラムデータを二重に参照値と関連付けて（double-referenced）から、BioRad ProteOn Manager V.2.1.0.38ソフトウェアを使って1：1ラングミュアモデルにフィッティングすることで、会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡状態解離定数（KD）を決定した。
3h-37、3h-38、および3h-56系統のdAbは全て、ヒトCD40残基W109およびL121を含有するCD40-Fc融合タンパク質に高いアフィニティ（KD＜10-8M）で結合することがわかったが、カニクイザルCD40（L109、P121）またはチンパンジーCD40（R109）からの対応残基を有するCD40-Fc融合タンパク質への結合は、有意に低いか、検出不可能であった。これは、3h37、3h38、および3h56系統のそれぞれからのdAbが、ヒトCD40の残基109および121を含むエピトープに特異的に結合することを示している。対照的に、3h-217系統の試験したメンバーは全て、試験したCD40-Fc融合タンパク質の全てに、類似するアフィニティで結合したことから、3h-217系統のメンバーは、残基76、109、または121を含まないCD40上の部位に結合することが示された。それゆえに、3h-217系統は、3h-37、3h-38、および3h-56系統とは異なるエピトープに結合する。ProteOn XPR36計器でのSPRを使ってCD40-Fc融合タンパク質へのdAb結合について決定されたKD値を、表27に要約する。表27中の「X」は、これらの条件下では結合の証拠が見つからなかったことを意味する。
［表27］
ProteOn XPR36計器でのSPRを使ってCD40-Fc融合タンパク質へのdAb結合について決定された会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡状態解離定数（KD）を、表28に示す。表28中の「X」は、これらの条件下では結合の証拠が見つからなかったことを意味する。
［表28］
Fc融合物ポリペプチドの構築
dAbを含む抗体ポリペプチドは、本明細書に開示するように、さまざまな構成で構築することができる。この実施例では、さまざまなdAbをFcドメインに融合することで、3h37-202、3h37-235、3h37-258、および3h37-202などの抗ヒトCD40可変ドメインコンストラクトのFc融合物ポリペプチドを生成させた。
代表的な実施形態の一つでは、dAb BMS3h-56-269（配列番号417）を修飾IgG1（IgG1*）Fcドメイン（配列番号1284）と融合した。このdAb-IgG1* Fcドメイン融合物ポリペプチドでは、dAb BMS3h-56-269のC末端が、配列Ala-Ser-Thrを有するリンカートリペプチドに融合され、そのリンカートリペプチドが、IgG1* Fcドメイン（配列番号1284）に融合された。IgG1* Fcドメインは、配列番号1284における位置のナンバリングでいうと、修飾C5Sを含有する。IgG1 FcドメインのC5は、通常、IgG分子の軽鎖中のCys残基とのジスルフィド結合を形成する。IgG1* Fcドメインは、IgG1ヒンジ領域中の鎖間ジスルフィド結合を排除するために、C11SおよびC14S変異も含有していた。最後に、IgG1* Fcドメインは、Fcドメインエフェクター機能を低下させるために、P23S変異を含有していた。dAb-IgG1* Fc融合物ポリペプチドは以下の配列を有する。ここでは、Ala-Ser-Thrリンカーをボールド体で記し、Fcドメインへの修飾を、ボールドイタリック体で記す。
（配列番号1286）
配列番号1286に示すdAb-IgG1* Fc融合物ポリペプチドは、39,127Daの計算分子量を有する単量体である。これは78,254Daの計算分子量を有する二量体を形成することができる。
あるいは、dAb BMS3h-56-269（配列番号417）を、ヒトIgG4 Fcドメイン（配列番号1285）と融合した。dAb BMS3h-56-269のC末端を、ここでもAla-Ser-Thrリンカーに融合し、それをIgG4 Fcドメイン（配列番号1285）に融合した。IgG4 Fcドメインは、配列番号1285における位置のナンバリングでいうと、修飾S10Pを含有していた。BMS3h-56-269-IgG4 Fc融合物ポリペプチドは以下の配列を有する。ここでは、Ala-Ser-Thrリンカーをボールド体で記し、S10P修飾をボールドイタリック体で記す。


（配列番号1287）
配列番号1287に示すBMS3h-56-269-IgG4 Fc融合物ポリペプチドは、38,867Daの計算分子量を有する単量体である。これは77,734Daの計算分子量を有する二量体を形成することができる。
BMS3h-56-269（配列番号417）、BMS3h-56-269-IgG1* Fc融合物ポリペプチド（配列番号1286）、およびBMS3h-56-269-IgG4 Fc融合物ポリペプチド（配列番号1287）の配列を以下に整列する。ここでは、Fcドメインの開始点を矢印で示す。



実施例11に開示した細胞培養法を使ってFc融合物ポリペプチドを発現させた。カラムをPBS（20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.2）で洗浄してから、80mM酢酸ナトリウム、pH3を使って、1/5体積の1M Tris-HCl、pH8中に溶出させた。溶出物をPBS中のSuperdex-200カラムにかけた。
CD40 Fc融合物ポリペプチド活性アッセイ
抗ヒトCD40 Fc融合物ポリペプチドを、CD40活性を拮抗するそれらの能力について、機能的にアッセイした。試験したCD40活性は、B細胞増殖および初代ヒト単球由来樹状細胞（DC）のhCD40L駆動性活性化によるサイトカイン生産である。B細胞増殖およびサイトカイン生産は、実施例6に開示したアッセイを使って測定した。別段の注記がある場合を除き、アッセイは全て、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したRPMI培地中で行った。dAb-Fcドメイン融合物ポリペプチドは、CD40依存的活性化の強力な阻害（すなわち拮抗作用）を示した。ヒトCD40特異的dAb-Fcドメイン融合物ポリペプチドのいずれにも、アゴニスト性は認められなかった。さまざまなアッセイを使って得られた結果を表29に示す。3h56-269-IgG4は、実施例11に開示したアッセイを使って、固定化ヒトCD40へのその結合についてアッセイした。3h56-269-IgG4については、固定化ヒト-CD40への結合に関する見掛けのアビディティの影響を受けたKd値を、30pMかつ25C、および40pMかつ37Cで、測定する。
［表29］
本実施形態を上記の実施例を参照して詳細に説明したが、これらの実施形態の要旨から逸脱することなくさまざまな修飾を加えることができ、当業者にはそれらの修飾がすぐにわかるであろうことは、いうまでもない。

Claims (13)

  1. 第１可変ドメインを含む抗体ポリペプチドであって、第１可変ドメインは、
    （ａ）ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ１領域（配列番号４１７のアミノ酸３１〜３５）からなるＣＤＲ１領域、
    （ｂ）ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ２領域（配列番号４１７のアミノ酸５０〜６６）からなるＣＤＲ２領域、
    （ｃ）ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ３領域（配列番号４１７のアミノ酸９９〜１０５）からなるＣＤＲ３領域
    を含み、該抗体ポリペプチドはヒトＣＤ４０に結合するドメイン抗体である、抗体ポリペプチド。
  2. 第１可変ドメインが、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１７）を含む、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
  3. 第１可変ドメインが、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１７）からなる、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
  4. 第１可変ドメインとＦｃドメインとを含む融合ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
  5. ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１＊ Ｆｃ融合物ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１２８６）を含む、請求項４に記載の抗体ポリペプチド。
  6. 配列番号１２８６のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体ポリペプチド。
  7. ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ４ Ｆｃ融合物ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１２８７）を含む、請求項４に記載の抗体ポリペプチド。
  8. 配列番号１２８７のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の抗体ポリペプチド。
  9. ヒトＣＤ４０以外の抗原である第２抗原に特異的に結合する第２可変ドメインをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチド。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチドをコードする核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸を含む単離された宿主細胞。
  12. 治療有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む、免疫疾患を処置するための医薬組成物。
  13. 抗体ポリペプチドが、請求項２、請求項３、請求項５、請求項６、請求項７または請求項８に記載の抗体ポリペプチドである、請求項１２に記載の医薬組成物。
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