CN103842382A - 拮抗cd40之抗体多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供特异性结合人类CD40之新颖抗原决定基的抗体多肽。该等抗体多肽不展现CD40促效剂活性。该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病,诸如自体免疫疾病。该等抗体多肽可为包含单一VL或VH域之域抗体(domain antibody,dAb)。该等抗体多肽之半衰期可藉由将该等抗体多肽修饰成亦可结合人类血清白蛋白(human serum albumin,HSA)之双特异性试剂而增加。
Description
发明领域
本发明提供靶向CD40且不展现CD40促效剂活性之抗体及其片段、包含前述者之组合物及使用前述者治疗涉及CD40活性之疾病的方法。
相关申请的交叉引用
本发明要求2011年4月21日提交的美国临时申请61/477,904的权益,在此将其全部内容援引并入本申请。
序列表
本申请案含有ASCII格式之序列表且其据此以全文引用的方式并入本文中。2012年4月17日创建之该ASCII复本被命名为200896WO.txt且大小为1,188,530字节。
现有技术
CD40为属于存在于抗原呈现细胞(antigen presenting cell,APC)(包括树突状细胞、B细胞及巨噬细胞)上之肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体超家族之协同刺激分子。APC在CD40结合TH细胞上之其配位体CD154(CD40L)时活化。CD40介导之APC活化涉及多种免疫反应,包括细胞激素产生、协同刺激分子(诸如CD86)之上调及抗原呈现及B细胞增殖增强。CD40亦可由内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞及上皮细胞表现。
CD40活化亦涉及多种与例如自体免疫性、移植排斥反应或过敏反应相关之不当T细胞反应。控制不合乎需要之T细胞反应的一个策略为以拮抗性抗体靶向CD40。举例而言,先前称为Chiron1212之单株抗体HCD122(鲁卡木单抗(Lucatumumab))有关治疗某些CD40介导之发炎性疾病目前处于临床试验阶段。参见因特网之超文本传送协议:clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209(2011年1月11日最后更新)上之“Study of HCD122(Lucatumumab)and Bendamustine Combination Therapy in CD40+Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma”,Clinical Trials Feeds。然而,单株抗体可显示促效剂活性。举例而言,抗CD40抗体Chi220之适用性受限于其弱刺激潜能。参见Adams等人,“Development of a chimeric anti-CD40monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival”,J.Immunol.174:542-50(2005)。
发明内容
在临床环境中仍需要不具有部分促效剂活性之抗CD40抗体拮抗剂。本发明提供特异性结合人类CD40之新颖抗原决定基之新颖抗体多肽。如由竞争分析及由自抗体多肽与CD40共结晶得到之结构所示,CD40抗原决定基不与Chi220抗原决定基重迭。该等抗体多肽有利的是不展现CD40促效剂活性。该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病,包括自体免疫疾病、移植排斥反应及过敏反应。该等抗体多肽包含可变域。在一个实施例中,抗体多肽呈含有单一可变域之域抗体(dAb)形式。在另一个实施例中,dAb为包含可结合例如人类血清白蛋白(HSA)之第二可变域之双特异性试剂。
本发明提供一种包含第一可变域之抗体多肽,其中该抗体多肽特异性结合人类CD40之抗原决定基,其中该抗原决定基包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列,其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)竞争结合,且其中该抗原决定基包含至少一个选自由Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162组成之群的CD40氨基酸残基。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-56及BMS3h-198组成之谱系群的抗体多肽之一之氨基酸序列,且其中第一可变域之表观结合常数为1pM至100nM。进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之表观结合常数为1pM至10nM。
亦提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列包含(a)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR1区有至多两个氨基酸不同的CDR1区、(b)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区、(c)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区、(d)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR1区有至多两个氨基酸不同的FR1区、(e)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR2区有至多两个氨基酸不同的FR2区、(f)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR3区有至多两个氨基酸不同的FR3区及(g)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR4区有至多两个氨基酸不同的FR4区。
亦提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列包含(a)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR1区有至多两个氨基酸不同的CDR1区、(b)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同 的CDR2区、(c)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有至多10个氨基酸不同。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有至多5个氨基酸不同。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有两个氨基酸不同。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有一个氨基酸不同。
进一步提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-56之谱系群,且其中第一可变域之氨基酸序列进一步包含:(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp(SEQ ID NO:1274)之CDR1区,其中X1为Asp或Gly,且Y1为Met或Leu;(b)具有序列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO:1275)之CDR2区,其中X2为Gln、Tyr、Pro、Trp或Ala,Y2为Thr、Ser、Asn、Gly、Met或Gln,Z2为Arg、Leu、Tyr、His或Phe,且A2为Lys或Met;及(c)具有序列X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3(SEQ ID NO:1276)之CDR3区,其中X3为Leu或Pro,Y3为Phe、Gln、Thr或Met,Z3为Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe或Met,A3为Gln、His、Asp、Ser、Lys、Glu或Gly,且B3为Glu、Asp或Tyr。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域之氨基酸序列包含:(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly--Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1(SEQ ID NO:1277)之FR1区,其中X1为Leu或Arg,且Y1为Arg或Ala;(b)具有序列Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser(SEQ ID NO:1278)之FR2区,其中X2为Gln或Arg,Y2为Lys或Arg,且Z2为Gly或Val;(c)具有序列 Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys(SEQ ID NO:1279)之FR3区,其中X3为Thr或Met,Y3为Glu或Asp,Z3为Ala或Ser,A3为Tyr或His,且B3为Ala或Thr;及(d)具有序列X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4(SEQ ID NO:1280)之FR4区,其中X4为Trp或Arg,Y4为Gln或Pro,且Z4为Ser或Asn。
进一步提供一种抗体多肽,其中第一可变域包含BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列。
进一步提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-37之谱系群,其中第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-X1-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1281);且其中X1为Gln或Arg;Y1为Glu或Gly;Z1为Ala、Leu或Glu;A1为Phe
或Tyr;且B1为Trp或Arg。
亦提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-38之谱系群,其中第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Ile-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-Ile-Ser-Z1-A1-Gly-B1-C1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1282);且其中X1为Thr或Pro;Y1为Ala或Ser;Z1为Arg或Gly;A1为Arg、Ser、Asn、Gln、Gly、His或Leu;B1为Tyr、Phe、Trp或Gly;
C1为Ser或Gly;且D1为Arg、Met或Pro。
亦提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-198之谱系群,其中第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y 1-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-Cys-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1283);且其中X1为Met或Leu;Y1为Val或Phe;Z1为Asp或Asn;A1为Ser或Thr;B1为Tyr或His;C1为Lys或Arg;D1为Asp或Glu;E1为Tyr或Phe;F1为Trp
或Arg;G1为Gly或Arg;且H1为Gln或His。
进一步提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽为域抗体(dAb)。
进一步提供一种抗体多肽,其中可变域融合至Fc域。
进一步提供一种抗体多肽,其中该抗体多肽进一步包含特异性结合第二抗原之第二可变域,其中该第二抗原为除人类CD40以外之抗原。
亦提供一种抗体多肽,其中第二抗原为分化簇(cluster of differentiation,CD)分子或主要组织兼容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)II类分子。
亦提供一种抗体多肽,其中第二抗原为血清白蛋白(SA)。
本发明提供一种编码本文所揭示之抗体多肽的核酸。
本发明亦提供一种包含本文所揭示之核酸的载体。
本发明亦提供一种包含本文所揭示之载体的宿主细胞。
本发明提供一种包含治疗有效量之本文所揭示之抗体多肽及医药学上可接受之载剂的医药组合物。本发明亦提供一种进一步包含免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂之医药组合物。
本发明提供一种治疗需要该治疗之患者的免疫疾病之方法,其包含向该患者投与治疗有效量之本文所揭示之医药组合物。本发明亦提供一种方法,其中该医药组合物与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。
本发明提供一种治疗免疫疾病之方法,其中该免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。本发明进一步提供一种治疗免疫疾病之方法,其中该免疫 疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病(Addison's disease)、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病(Graves' disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象(Arthus's phenomenon)、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
本发明亦提供一种使用特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域靶向CD40之方法,其中抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)竞争结合。
本发明提供抗体多肽或其医药学上可接受之盐的医学用途,该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域,其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)竞争结合。
本发明提供抗体多肽或其医药学上可接受之盐的用途,该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域,其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)竞争结合,该用途系用于制备用以治疗免疫疾病之药剂。在一些实施例中,医药组合物与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。在其他实施例中,免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。在其他实施例中,该免疫疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病、格-巴二氏征候群、桥本氏病、溶血性贫血、 特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
本发明提供一种抗体多肽或其医药学上可接受之盐,该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域,其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)竞争结合,该抗体多肽或其医药学上可接受之盐系用于制备用以治疗免疫疾病之药剂。该药剂可例如与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。免疫疾病可为例如自体免疫疾病或移植相关疾病。免疫疾病亦可选自由以下组成之群:艾迪森氏病、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病、格-巴二氏征候群、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
附图简要说明
图1展示人类CD40(SEQ ID NO:1)之两种不同共晶体结构之结合模式,一者具有dAb BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)及一者具有Chi220抗体之Fab'。BMS3h-56-5及Chi220Fab'分子显示为包含β-股(在dAb中以箭头表示)及非重复二级结构(在dAb中以环表示)之草图。亦显示互补决定区(CDR),CD40亦显示为包含人类CD40之BMS3h-56-5抗原决定基残基之草图。亦显示Chi220抗原决定基残基。亦显示双硫键。标记CD40之N端(N)及C端(C)。
图2展示接触人类CD40(SEQ ID NO:1)之BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)之空间填充模型,其以草图显示。显示接触CD40之dAb BMS3h-56-5之表面残基。标记BMS3h-56-5CDR3区及FR-2残基Leu45、Arg47、Arg56及Phe99。在此图中使用Kabat编号(Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第5版,美国健康与人类服务部(U.S.Dept.Health&Human Services),Washington,D.C.(1991)),且与顺序编号之不同之处在于使用插入残基来保持β-股之残基编号相同。因此,对于BMS3h-56-5,顺序残基53变为残基52A,顺序残基84、85及86分别变为82A、82B、82C,且Kabat残基编号100缺失(其将介于顺序残基103与104之间);CD40亦以包含非重复二级结构及BMS3h-56-5抗原决定基之草图表示。在人类与长尾猕猴(Macaca fascicularis)(食蟹猕猴(cynomolgus monkey))之间不同的CD40残基Ala115、Phe99、Ser126、His162、Leu121及Trp109以棒图标法显示。作为BMS3h-56-5抗原决定基之一部分的在人类与食蟹猕猴之间不同的CD40残基为Trp109、Leu121及His162。CD40残基Trp109及Leu121处于BMS3h-56-5CDR3与FR-2之间的间隙中。Trp109之突变大大降低或消除BMS3h-56-5活性。
图3展示来自人类及灵长类动物物种之血液样品上聚乙二醇化抗人类CD40dAb BMS3h38-2C-P40Br之结合。图3A显示BMS3h38-2C-P40Br结合至人类及猕猴B细胞;图3B显示BMS3h38-2C-P40Br结合至人类、恒河猴及黑猩猩B细胞。
图4、图5、图6及图7显示分别来自谱系BMS3h-56、BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-198之代表性域抗体多肽之ClustalW2比对。
实施方式
本发明提供特异性结合至人类CD40之抗体多肽。该等抗体多肽不展现CD40促效剂活性,且该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病,诸如自体免疫疾病。该等抗体多肽可使用利用细胞结合分析之初步筛检,随后进行一或多轮易错或简并寡核苷酸定向亲和力成熟来选择。结果,提供一类特异性结合单一CD40抗原决定基之抗体多肽。
“谱系”为如以下实例中所揭示由常见前驱体藉由易错或简并寡核苷酸定向亲和力成熟而制备且预期结合相同CD40抗原决定基之一组相关抗体多肽。使用抗体多肽之命名表示各种谱系。举例而言,命名“BMS3h-56”系 指针对人类CD40所产生之谱系56之抗体多肽。“谱系BMS3h-56”抗体多肽包括BMS3h-56-1直至BMS3h-56-33及BMS3h-56-202直至BMS3h-56-288。
因此,在一个实施方式中,抗体多肽包含特异性结合人类CD40之可变域,其中该抗体多肽与表3中所列之任一域抗体(dAb)竞争结合。举例而言,dAb可能属于选自由以下组成之群的谱系:例如BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-41、BMS3h-43、BMS3h-56、BMS3h-131、BMS3h-198及BMS3h-202,诸如dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201或BMS3h-56-258。在另一个实施方式中,抗体多肽特异性结合与表3中所列之任一dAb相同之人类CD40抗原决定基。举例而言,抗体多肽可包含特异性结合与例如dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201或BMS3h-56-258相同之人类CD40抗原决定基的可变域。如下文所揭示,人类CD40抗原决定基可包含例如SEQ ID NO:1之氨基酸残基Trp109。
抗体多肽可为含有单一可变域之域抗体。抗体多肽亦可包含其他结构域,诸如Fc域。举例而言,抗体多肽可包含特异性结合人类血清白蛋白(HSA)之第二可变域。举例而言,该等双特异性抗体多肽可具有增加之半衰期。
在序列表中,SEQ ID NO:1为人类CD40之氨基酸序列;SEQ ID NO:2为长尾猕猴CD40之氨基酸序列。域抗体BMS3h-56-5之氨基酸序列为SEQ ID NO:321。
如本文所用,“特异性结合”系指抗体多肽结合抗原之解离常数(Kd)如例如藉由表面电浆子共振所量测,为约1μM或1μM以下。适当分析系统包括BIAcoreTM表面电浆子共振系统及BIAcoreTM动力学评估软件(例如2.1版)。特异性结合相互作用之亲和力或Kd可为约500nM或500nM以下或约300nM或300nM以下。
术语“约”将为一般熟习此项技术者所了解且在使用其之情形下将有一定程度之变化。一般而言,约涵盖加上/减去提及值之10%的数值范围。
根据此实施方式,以下缩写及定义适用。须注意,除非本文另外明确规定,否则如本文所用,单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该”包括复数个指示物。因此,举例而言,提及“抗体”包括复数个该等抗体,且提及“剂量”包括提及一或多个为熟习此项技术者所知之剂量及其等同量等。
1.CD40及CD40活性
提供结合人类CD40之抗体多肽。CD40亦称为B细胞表面抗原CD40、 Bp50、CD40L受体、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5及肿瘤坏死因子受体超家族成员5。人类CD40之相关结构信息可例如以UniProt寄存编号P25942、Q9BYU0及Q53GN5找到。“人类CD40”系指包含以下氨基酸序列之CD40:
亦已在小家鼠(Mus musculus)、野猪(Sus scrofa)、欧洲牛(Bos taurus)、鸡(Gallus gallus)、家犬(Canis familiaris)、长尾猕猴(食蟹猕猴)、绵羊(Ovis aries)、家马(Equus caballus)及褐家鼠(Rattus norvegicus)中对CD40测序。
本发明抗体多肽与CD40之结合拮抗CD40活性。“CD40活性”包括(但不限于)T细胞活化(例如诱导T细胞增殖或细胞激素分泌)、巨噬细胞活化(例如诱生巨噬细胞中之活性氧物质及氧化氮)及B细胞活化(例如B细胞增殖、抗体同型转换或分化成浆细胞)。CD40活性可藉由与其他分子相互作用来介导。“CD40活性”包括CD40与以下分子之间的功能相互作用,该等分子以其Uniprot寄存编号于括号内标识:
CALR (P27797);
ERP44 (Q9BS26);
FBL (P22087);
POLR2H (P52434);
RFC5 (P40937);
SGK1 (O00141);
SLC30A7 (Q8NEW0);
SLC39A7 (Q92504);
TRAF2 (Q5T1L5);
TRAF3 (Q13114);
TRAF6 (Q9Y4K3);
TXN (Q5T937);
UGGT1 (Q9NYU2);及
USP15 (Q9Y4E8)。
举例而言,CD40“活性”包括与TRAF2之相互作用。CD40/TRAF2相互作用活化NF-κB及JNK。参见Davies等人,Mol.Cell Biol.25:9806-19(2005)。因此,此CD40活性可利用CD40依赖性细胞NF-κB及JNK活化相对于参照组来测定。
如本文所用,术语“活化(activate)”、“活化(activates)”及“活化(activated)”系指既定可量测CD40活性相对于参照组增加至少10%,例如至少10%、25%、50%、75%或甚至100%或100%以上。若活性相对于不存在拮抗剂之情况降低至少10%,且在一个例示性实施例中降低至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%或甚至100%(亦即无可侦测活性),则CD40活性被“拮抗”。举例而言,抗体多肽可拮抗一些或所有CD40活性,而不活化CD40。在一个实施例中,抗体多肽不活化B细胞增殖。在另一个实施例中,抗体多肽不活化T细胞之细胞激素分泌,其中细胞激素为至少一种选自由以下组成之群的细胞激素:IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ。
2.CD40抗原决定基
使用人类CD40(SEQ ID NO:1)与dAb BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)之间的复合物之X射线结晶学来揭示由本发明之抗体多肽所识别之抗原决定基。针对电子密度数据拟合CD40及BMS3h-56-5之结构模型以产生七种模型或型式之CD40/BMS3h-56-5复合物,其来自三种呈一种晶形之结晶学独立复合物及四种呈第二晶形之结晶学独立复合物。该等型式之主链原子之真实空间相关系数(real space correlation coefficient)为约0.92且侧链原子之真实空间相关系数为0.80。在七种型式中CD40分子具有一定量之可挠性,但所有型式中均保留CD40/BMS3h-56-5相互作用之总体性质。该等型式在CD40残基Trp109与BMS3h-56-5Trp103(Kabat编号,参见下文)之间的相互作用不同。BMS3h-56-Trp103与一种型式之CD40Trp109形成边对面相互作用,而与其他型式形成置换堆栈(亦即面对面)相互作用。
七种型式之形状互补性统计值Sc在0.70至0.77之范围内,此显示与典型抗体抗原复合物相比形状互补性之程度较高。举例而言,此等值可与四种蛋白酶/蛋白质抑制剂复合物之0.71至0.76之范围、五种寡聚界面之0.70至0.74之范围及六种抗体/抗原复合物之0.64至0.68之范围比较。参见Lawrence等人, “Shape Complementarity at Protein/Protein Interfaces”,J.Mol.Biol.234:946-950(1993)。
图1中显示人类CD40/BMS3H-56-5复合物模型。一个BMS3h-56-5dAb结合于一个CD40分子。BMS3h-56-5抗原决定基不与Chi220Fab'片段抗原决定基重迭。所有型式之复合物界定一组接触BMS3h-56-5之CD40残基:Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162(参考SEQ ID NO:1)。一些型式之复合物中接触BMS3h-56-5之CD40残基为Pro85、Asn86、Leu87、Gly88、Glu106、Glu107、Gly108、His110、Thr112、Cys119、Val120、Gln133、Ile134、Ala135、Thr136、Ser155及Lys160。在所有型式中Val154为内埋CD40残基。在一些型式中内埋之其他CD40残基为Ser118、Arg123、Thr141、Phe151、Asp153、Cys161及Pro163。
如本文所用,术语“接触”系指原子间距离,其最大值决定于如Sheriff等人,J.Mol.Biol.197:273-296(1987)及Sheriff,Immunomethods3:191-196(1993)所定义之原子型距离依赖性。
如本文所用,术语“内埋”系指一残基具有至少一个具有由程序MS(Connolly,J.Appl.Crystallogr.16:548-558(1983))所定义之表面积、之探针球及如Sheriff,Immunomethods3:191-196(1993)所定义之原子型依赖性凡得瓦尔半径(Van der Waals radii)的原子。
图2显示包括接触残基及内埋残基之BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)之表面。CD40(SEQ ID NO:1)表示为带状图,橙色表示非重复二级结构且洋红色表示抗原决定基残基。在各种非人类灵长类动物序列中所显示之CD40残基Trp109、Ala115、Leu121、Ser126及His162不同。CD40残基Ala115及Ser126位于BMS3h-56-5结合位点之对侧。Trp109及Leu121在位于BMS3h-56-5之CDR3与FR-2(残基Leu45及Arg47)之间的间隙中结合。His162与BMS3h-56-5之CDR2中之残基,尤其Lys56相互作用。总之,CD40抗原决定基包含一或多个表1中所列之残基,参考SEQ ID NO:1中所用之编号。
表1
BMS3h-56-5,如表3中所列之其他dAb,系使用人类CD40作为抗原藉由下文更详细描述之筛检及亲和力成熟方法来制备。预期由常见前驱dAb藉由亲和力成熟产生之dAb将结合相同人类CD40抗原决定基。举例而言,下文所述之竞争研究指示由常见前驱dAb藉由亲和力成熟产生之dAb彼此竞争结合于人类CD40。然而,相同竞争研究显示dAb不与至少Chi220或G28-5抗体竞争。
3.抗体多肽
抗体多肽包含可变域。在一个实施例中,抗体多肽呈含有单一可变域之dAb形式。抗体多肽可为包含藉由双硫键互连之两个重(H)链及两个轻(L)链之全长抗CD40免疫球蛋白分子。在此实施例中,各链之胺基末端部分包括主要经由其中所含之互补决定区(CDR)负责抗原识别的约100至110个氨基酸之可变域(VL或VH)。各重链之羧基末端“半部”界定主要负责效应功能之恒定区(Fc)。
抗体多肽亦可为包含含特异性结合CD40之可变域的全长抗CD40免疫球蛋白分子之一部分的“片段”。因此,术语“抗体多肽”包括例如抗原结合重链、轻链、重链-轻链二聚体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链Fv(scFv)及dAb。因此,术语“抗体多肽”包括藉由重组工程改造及表现而产生之多肽,以及藉由天然重组及融合瘤细胞克隆分泌所产生之单株抗体。
轻链系分类为κ或λ,且如此项技术中所知其特征在于特定恒定区CL。重链系分类为γ、μ、α、δ或ε,且将抗体之同型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。对于IgG、IgD及IgA,重链恒定区包含三个结构域(CH1、CH2及CH3);且对于IgM及IgE,包含四个结构域(CH1、CH2、CH3及CH4)。抗CD40抗体可具有选自任一免疫球蛋白类别(IgA、IgD、IgG、IgM及IgE)之重链恒定区。
各轻链可变域(VL)及重链可变域(VH)由三个CDR及四个构架区(FR)构成,自胺基末端至羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链之三个CDR被称为“LCDR1、LCDR2及LCDR3”,且重链之三个CDR被称为“HCDR1、HCDR2及HCDR3”。
如本文所用,术语“Fc域”系指包含CH2及CH3恒定域之恒定区抗体序列,如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第5版,美国健康与人类服务部(U.S.Dept.Health&Human Services),Washington,D.C.(1991)所 界定。Fc区可源自例如IgG1或IgG4Fc区。可变域可融合至Fc域。在此情况下,可变域(VL或VH域,包括dAb)之羧基末端可连接或融合至Fc CH2域之胺基末端。或者,可变域之羧基末端可连接或融合至CH1域之胺基末端,CH1域之胺基末端本身融合至Fc CH2域。蛋白质可包含CH1与CH2域之间的铰链区整体或部分。
CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用之残基。如图2中所示,例如CDR2及CDR3加上FR4残基Trp103形成CD40与dAb BMS3h-56-5之间的大部分接触。举例而言,抗体多肽之可变域包含具有与表3中所列之dAb之一的CDR1、CDR2及CDR3区相同之氨基酸序列或各与CDR1、CDR2及CDR3区有一或两个氨基酸不同之CDR1、CDR2及CDR3区。举例而言,抗体多肽可包含具有与例如BMS3h-56-5、BMS3h-56-258或BMS3h-56-201之CDR1、CDR2及CDR3区相同之氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3区。
“域抗体”(dAb)包含能够特异性及单价结合抗原(诸如CD40)之单一可变(VL或VH)域。举例而言,dAb可具有骆驼科动物dAb所特有之VHH结构。如本文所用,“VH域”意谓包括VHH结构。在另一个实施例中,本发明之VH域(包括作为本文之实施例呈现的所有特征及特征之组合)不为VHH域。dAb可在溶液中形成均二聚体或杂二聚体。咸信二价抗CD40抗体由于能够交联结合细胞表面上之CD40分子而展现促效剂活性。尽管不受任何特定理论限制,但咸信单价dAb不活化CD40,因为该等dAb不与CD40交联。
如本文所用,术语“可变域”系指由Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第5版,美国健康与人类服务部,Washington,D.C.(1991)所定义之免疫球蛋白可变域。可变域内CDR氨基酸残基之编号及定位系根据熟知Kabat编号约定确定。举例而言,在表2中比较BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)之Kabat编号与依序编号之相同序列。在Kabat编号中,BMS3h-56-5具有插入残基52A、82A、82B、82C,且残基100。在两种编号系统中,给予作为表现构筑体之一部分的N端之Ser及Thr负编号。
表2
术语“人类”在应用于抗体多肽时意谓抗体多肽具有源自人类免疫球蛋白之序列,例如FR及/或CH域。当序列系:(a)自人类个体或自人类个体之细胞或细胞株分离而得;(b)自经选殖之人类抗体基因序列或人类抗体可变域序列之文库分离而得;或(c)藉由自一或多个以上多肽突变及选择而多样化时,该序列系“源自”人类免疫球蛋白编码序列。如本文所用,“经分离”之化合物意谓该化合物已与在自然界中与该化合物天然缔合之至少一种组分分离。
可将抗体多肽投与人类患者,同时基本上避免通常藉由投与来自其他物种(例如小鼠)之抗体而引起的抗抗体免疫反应。举例而言,鼠类抗体可根据此项技术中熟知之程序藉由将鼠类CDR移植于人类可变域FR上而“人类化”。然而,如本文所揭示之人类抗体可在不需要鼠类抗体序列之基因操控之情况下产生。
可变域可包含一或多个具有与由人类生殖系抗体基因区段编码之相应构架区相同之氨基酸序列的构架区(FR)。举例而言,域抗体可包含VH生殖系基因区段DP47、DP45或DP38、Vκ生殖系基因区段DPK9、JH区段JH4b或Jκ 区段Jκ1。
可改变抗体多肽序列,同时保留特异性结合CD40之能力。特定言之,抗体多肽(例如dAb)可包含保留特异性结合与dAb BMS3h-56-5相同之CD40抗原决定基的功能之变异型可变域。参见表1。亦即,变异型可变域可结合包含SEQ ID NO:1之Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162中之至少一者的人类CD40抗原决定基。在一个实施例中,变异型可变域抗原决定基可包含Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162。或者,变异型可变域可特异性结合包含CD40残基Trp109之CD40抗原决定基。在又一个实施例中,变异型可变域可与BMS3h-56-5竞争特异性结合于CD40。如以下实例中所揭示,易错亲和力成熟提供一种制造及鉴别具有特异性结合相同CD40抗原决定基之变异型序列的抗体多肽之例示性方法。
举例而言,变异型可变域与表3中所列之可变域之一可有至多10个或其间之任何整数值个氨基酸不同,其中该变异型可变域特异性结合CD40。或者,变异型可变域相对于本发明序列表中所列之序列可具有至少90%序列一致性(例如至少92%、95%或98%序列一致性)。在两个序列之间不同的非一致氨基酸残基或氨基酸可表示氨基酸取代、添加或缺失。当两个序列藉由诸如BLAST之任何适当氨基酸序列比对算法比对时,在两个序列之间不同之残基以非一致位置呈现。
其限制条件为可对个别FR区进行氨基酸取代,以便一或多个FR相对于由人类生殖系抗体基因区段编码之相应FR之氨基酸序列包含至多两个氨基酸差异。其限制条件进一步为变异型可变域在一或多个CDR中可含有一或两个氨基酸取代。特异性结合CD40之代表性可变域列于表3中。
来自谱系BMS3h-56、BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-198之抗体多肽之代表性可变域之间的ClustalW2比对分别示于图4、图5、图6及图7中。通常,相关蛋白质序列之比对中氨基酸之保守程度与氨基酸位置对蛋白质功能之相对重要性成比例。亦即,所有相关序列中共有之氨基酸可能起重要作用且不能轻易被取代。另一方面,序列之间不同的位置可能经其他氨基酸取代或以其他方式修饰,同时维持蛋白质之活性。示于图4、图5、图6及图7中之比对以及例如由图1及图2确定之结构关系可引导特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的变异型抗体多肽之建构,其中该 抗体多肽与dAb BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)竞争结合。该等变异型抗体多肽包括(但不限于)具有对应于关于表3中所列之任一可变域的取代、插入或缺失之氨基酸修饰的变异型抗体多肽。变异型抗体多肽亦包括具有对应于表3中所列序列之间保守之氨基酸修饰的氨基酸修饰之变异型抗体多肽。
关于重链及轻链基因之VL或VH域之边界的信息可用于设计PCR引子以扩增来自编码已知结合CD40之抗体多肽的经选殖之重链或轻链编码序列之可变域。使用此项技术中熟知之技术,可将扩增之可变域插入适当表现载体(例如pHEN-1)(Hoogenboom等人,(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137)中且使其单独地或以与另一多肽序列之融合物形式表现。基于所揭示之氨基酸及聚核苷酸序列,可产生融合蛋白且仅使用普通技术于任何适当哺乳动物宿主细胞株(诸如CHO、293、COS、NSO及其类似细胞株)中来纯化,随后使用一种方法或方法之组合来纯化,该等方法包括蛋白质A亲和层析法、离子交换法、逆相技术或其类似方法。
在一个实施方式中,抗体多肽为包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之第一可变域的“双特异性”抗体多肽。双特异性抗体多肽包含特异性结合除人类CD40以外之第二抗原之第二可变域。
在另一个实施例中,第二抗原可为例如免疫效应细胞之细胞表面分子或可溶性分子(诸如细胞激素)。双特异性抗体多肽之结合可用于拮抗CD40且拮抗第二抗原之生物活性。免疫效应细胞之细胞表面分子包括分化簇(CD)分子。代表性CD标记列于因特网之超文本传送协议en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_of_differentiation上(2012年2月22日进行最后修改)。免疫效应细胞之细胞表面分子亦包括主要组织兼容性复合体(MHC)II类分子。针对此等细胞表面分子之抗体在此项技术中为已知的且可作为可变域来源用于构筑双特异性抗体多肽。
在一个实施例中,双特异性配位体之抗体多肽可藉由“氨基酸连接子”或“连接子”连接。举例而言,dAb可融合至氨基酸连接子之N端,且另一dAb可融合至连接子之C端。尽管氨基酸连接子可为任何长度且由氨基酸之任何组合组成,但连接子长度可能相对较短(例如五个或五个以下氨基酸)以降低所连接结构域之间的相互作用。亦可调节连接子之氨基酸组成以减少具有庞大侧链之氨基酸或可能引入二级结构中之氨基酸的数目。适当氨基酸连接子包括(但不限于)长度为至多3、4、5、6、7、10、15、20或25个氨基酸之 氨基酸连接子。代表性氨基酸连接子序列包括(GGGGS)n(SEQ ID NO:4),其中n可为1与5之间的任何整数。其他适当连接子序列可选自由以下组成之群:AST(SEQ ID NO:5)、TVAAPS(SEQ ID NO:6)、TVA(SEQ ID NO:7)及ASTSGPS(SEQ ID NO:8)。
第二抗原之结合可增加抗体多肽之活体内半衰期。举例而言,双特异性抗体多肽之第二可变域可特异性结合血清白蛋白(SA),例如人类血清白蛋白(HSA)。经形式设计而可结合HSA之抗体多肽相对于相同的未经形式设计之抗体多肽可具有增加之活体内t-α(“α半衰期”)或t-β(“β半衰期”)半衰期。t-α及t-β半衰期量度物质分布于身体内且自身体内消除有多快。举例而言,键联至HSA可藉由抗体多肽与能够特异性结合HSA之第二可变域之融合来实现。抗人类血清白蛋白抗体在此项技术中为熟知的。参见例如在因特网之超文本传送协议www.abcam.com/index.html上可获知之:人类血清白蛋白抗体ab10241、ab2406及ab8940,或在因特网之超文本传送协议www.genwaybio.com上可获知之GenWay ALB抗体。特异性结合HSA之可变域可获自任一此等抗体,且接着使用此项技术中熟知之重组技术融合至本发明之抗体多肽。
或者,抗体多肽连接至HSA可藉由使用熟练技术者熟知之技术使抗体多肽序列直接稠合至HSA编码序列来实现。HSA编码序列可藉由PCR使用源自例如可以GenBank寄存编号NM000477获得之cDNA序列之引子来获得。
在一个实施例中,经HSA连接之域抗体组合物之tα半衰期增加10%或10%以上。在另一个实施例中,经HSA连接之域抗体组合物之tα半衰期在0.25小时至6小时之范围内。在另一个实施例中,经HSA连接之域抗体组合物之tβ半衰期增加10%或10%以上。在另一个实施例中,经HSA连接之域抗体组合物之tβ半衰期在12小时至48小时之范围内。
在另一个实施例中,可藉由聚乙二醇化对抗体多肽进行形式设计以增加其活体内半衰期。在一个实施例中,将PEG共价连接。在另一个实施例中,将PEG连接至抗体多肽之半胱氨酸或赖氨酸残基。在又一个实施例中,经PEG连接之抗体多肽之流体动力学尺寸为至少24kD。在又一个实施例中,总PEG尺寸为20kD至60kD且包括20kD及60kD。在又一个实施例中,经PEG连接之域抗体之流体动力学尺寸为至少200kD。
聚乙二醇化可使用若干PEG连接部分达成,该等PEG连接部分包括(但不 限于)N-羟基丁二酰亚胺活性酯、丙酸丁二酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜或硫醇。PEG聚合物可连接至抗体多肽之预定位置,或可任意地连接至域抗体分子。聚乙二醇化亦可经由连接至域抗体之肽连接子介导。亦即,PEG部分可连接至融合至抗体多肽之肽连接子,其中该连接子提供用于PEG连接之位点(例如游离半胱氨酸或赖氨酸)。聚乙二醇化抗体之方法在此项技术中熟知,例如如Chapman等人,“PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy:a review”,Adv.Drug Deliv.Rev.54(4):531-45(2002)中所揭示。
抗体多肽亦可经设计以形成二聚体、三聚体、四聚体或其他多聚体。抗体多肽(例如dAb)可藉由此项技术中已知之若干方法(包括(但不限于)以融合蛋白形式表现单体、两个或两个以上单体经由单体之间的肽连接子键联)、或藉由在转译之后彼此直接或藉由双硫键经由连接子以化学方式接合单体、或藉由键联至二价、三价或多价连接部分(例如多臂PEG)来连接以形成多聚体。在一个实施例中,多聚体可结合单一CD40分子。
4.医药组合物及治疗方法
医药组合物包含治疗有效量之一或多种抗体多肽及视情况选用之医药学上可接受之载剂。医药学上可接受之载剂包括例如水、生理食盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物以及其组合。医药学上可接受之载剂可进一步包含极少量之可增加融合蛋白之储存期限或效用之助剂物质,诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。组合物可经调配以在投与之后提供活性成分之快速、持续或延迟释放。适当医药组合物及其制备方法在此项技术中为熟知的。参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro等人编,第21版,Mack Publishing Co.(2005)。
医药组合物进一步可包含免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂。治疗需要该治疗之患者的免疫疾病之方法可包含向患者投与治疗有效量之医药组合物。拮抗CD40介导之T细胞活化可抑制例如自体免疫性、移植排斥反应或过敏反应期间发生之不当T细胞反应。抑制CD40介导之T细胞活化可减缓此等疾病之进展及/或严重程度。
如本文所用,“患者”意谓动物,例如哺乳动物,包括人类。患者可经诊断患有免疫疾病。“治疗(Treatment)”或“治疗(treat)”或“治疗(treating)”系指涉及减轻症状、病症、病状或疾病之进展或严重程度之方法。“免疫疾 病”系指与个体中显现免疫反应,包括细胞及/或体液免疫反应相关之任何疾病。免疫疾病之实例包括(但不限于)发炎、过敏症、自体免疫疾病或移植相关疾病。自体免疫疾病可选自由全身性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病、牛皮癣、硬皮病、动脉粥样硬化、发炎性肠病及溃疡性结肠炎组成之群。
可藉由投与医药组合物治疗之疾病可选自由以下组成之群:艾迪森氏病、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病、格-巴二氏征候群、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应(例如血友病患者中之因子VII)、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应及血管炎。自体免疫介导之病状包括(但不限于)受影响之组织为主要目标,且在一些情况下为次要目标之病状。该等病状包括(但不限于)AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
医药组合物可单独或以与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂之组合疗法投与(亦即同时或依序)。不同免疫疾病可能需要使用适用于治疗免疫疾病之特定助剂化合物,此可根据患者对患者之基准来确定。举例而言,医药组合物可与一或多种例如细胞激素(例如IL-10及IL-13)或其他免疫刺激剂(例如趋化因子、肿瘤相关抗原及肽)之适当佐剂组合投与。适当佐剂在此项技术中为已知的。
可使用任何适当方法或途径来投与抗体多肽或医药组合物。投药途径包括例如经口、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内投与。投与之抗体多肽之治疗有效剂量视许多因素而定,包括例如所治疗之免疫疾病之类型及严重程度、组合疗法之用途、抗体多肽或医药组合物之投药途径及患者之体重。域抗体之治疗有效量之非限制性范围相对于患者之体重为0.1mg/kg至20mg/kg,且在一个实施方式中,为1mg/kg至10mg/kg。在疾病病况之活体外及/或活体 内模型中,抗体多肽之剂量可由为CD40拮抗作用所需之抗体多肽之量进一步引导。代表性模型描述于下文及实例中。
5.活体外及活体内模型
可在若干可获得之活体外或活体内模型系统中之一者中测试本发明之抗体多肽拮抗CD40之能力。适当动物及细胞模型系统描述于下文。其他细胞分析系统描述于实例中。
5.1.发炎性肠病(IBD)模型:
IBD为不明病因之多因性免疫病症。类似IBD之若干黏膜发炎小鼠模型提供了有关控制正常与病理性黏膜免疫功能之机制的理解。IBD模型包括使用De Winter等人,Am.J.Physiol.276:G1317-1321(1999)之黏膜免疫及发炎系统。在一个实施方式中,将CD4(+)T淋巴细胞之子集(亦即CD4(+)CD45RBhigh细胞)注射至免疫缺陷小鼠中会引起肠发炎。发病机理部分系归因于促炎性细胞因子之分泌。结肠炎之诱发可藉由共转移另一CD4(+)亚群(亦即CD4(+)CD45RBlow T细胞)来预防。就获取活化标记及返回宿主肠而言,此群体之行为类似于CD4(+)CD45RBhigh群体。然而,活化时其淋巴介质概况不同,且CD4(+)CD45RBlow T细胞分泌及/或诱导之消炎细胞激素会预防结肠炎。De Winter等人提供有关过继性转移模型及促进及预防结肠炎发病机理之因素的描述。
5.2.自发性关节炎模型:
Kouskoff等人,Cell87:811-822(1996)提供由全身性自体免疫性引起之器官特异性疾病之模型。类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)为慢性关节病,其特征为白血球侵袭及滑膜细胞活化,随后为软骨及骨破坏。Kouskoff等人揭示藉由T细胞受体(T cell receptor,TCR)转殖基因系与NOD系杂交产生之自发性小鼠RA模型。所有子代均显现极易令人想起人类RA之关节病。鼠类病症之触发为由转殖基因TCR机会性识别NOD源性主要组织兼容性复合体(MHC)II类分子;关节炎之进展涉及CD4+T细胞、B细胞及可能存在之骨髓细胞。
5.3.胶原蛋白诱发之关节炎(Collagen Induced Arthritis,CIA)模型:
Brand等人,Methods Mol.Med.102:295-312(2004)提供胶原蛋白诱发之关节炎之小鼠模型。胶原蛋白诱发之关节炎(CIA)为可在啮齿动物(大鼠及小鼠)及非人类灵长类动物之易感染系中藉由用II型胶原蛋白(CII)(亦即关节软 骨之主要成分蛋白质)免疫接种而引发的自体免疫疾病。在免疫接种后,动物显现与RA共有若干临床及组织特征之自体免疫多发性关节炎。在啮齿动物中容易感染CIA与主要组织兼容性复合体(MHC)II类分子有关,且对CII之免疫反应之特征在于刺激胶原蛋白特异性T细胞及产生高效价之对免疫原(异源CII)与自身抗原(小鼠CII)具特异性之抗体。在组织学上,鼠类CIA之特征在于与关节炎之临床发作一致之严重滑膜炎。由于CIA与RA之间具有病理相似性,故此实验数据适用于评估CIA。
5.4.抗原诱发之T细胞增殖活体内模型:
使用T细胞受体(TCR)-转殖基因T细胞之过继性转移为抗原诱发之T细胞增殖提供活体内模型。Pape等人,Immunol.Rev.156:67-78(1997)揭示均一地表现具有已知肽/MHC特异性之可识别TCR的TCR-转殖基因T细胞之过继性转移。可使用该模型来监测抗原特异性T细胞之活体内行为。未处理T细胞最初在次级淋巴组织之T细胞区内活化以按B7依赖性方式增殖。若此时期内存在佐剂或发炎性细胞激素,则T细胞积聚数目增多,迁移至富B细胞之小囊中且获得产生IFN-γ之能力且有助于B细胞产生IgG2a。若发炎得以有效拮抗,则大部分最初活化之抗原特异性T细胞会消失而不进入小囊中,且幸存者为IL-2及IFN-γ之不良产生者。
实施例
表3列出适用于本发明抗体多肽之代表性抗人类CD40可变域氨基酸序列。表4揭示编码表3中所列之可变域序列之代表性核酸。如此项技术中所熟知,多个密码子可编码同一氨基酸。因此,编码蛋白质序列之核酸包括具有密码简并性之核酸。表3中所示之抗体多肽特异性结合CD40且使用以下实施例中所述之反复初始/初步筛检及亲和力成熟方法来制造。
表3
抗人类CD40可变域氨基酸序列
BMS3h-56-201
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFYFQEWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)
BMS3h-56-258
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFYFHEWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)
BMS3h-37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEWYEMQWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKELGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)
BMS3h-38
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEEEEMIWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPFRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)
BMS3h-41
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYEMIWVRQAPGKGLEWVSSISGNGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPLRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)
BMS3h-43
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFNMYEMSWVRQAPGKGLEWVSGISRRGFTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPITYAMRYARFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)
BMS3h-56
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1S)
BMS3h-106
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYHMQWVRQAPGKGLEWVSMIDADGLGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGPQFGQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)
BMS3h-107
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMQWVRQAPGKGLEWVSTISASGVFTYYADSVKGRFTTSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPNRFALNNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)
BMS3h-131
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRANSSILWALAWYQQKPGKAPKLLIESSSGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQNAGWPGTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:18)
BMS3h-193
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIERRLNWYQQKPGKAPKLLIYLASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYASPPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:19)
BMS3h-198
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAGYEMWWVRQAPGKGLERVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPYSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)
BMS3h-202
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPTAEMVWVRQAPGKGLEWVSSISASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPVSYVATFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)
BMS3h-217
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHFIGTLLSWYQQKPGKAPKLLITYGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGVLWPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:22)
BMS3h-1
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPKNEMTWVRQAPGKGLEWVSAIESDGQATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRIPDLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)
BMS3h-2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAGAMTWVRQAPGKGLEWVSSIDKEGLSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPGLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)
BMS3h-3
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDAAMTWVRQAPGKGLEWVSAIQPMGDGTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPTLQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)
BMS3h-4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDSPMTWVRQAPGKGLEWVSAITSNGYETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPTLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:26)
BMS3h-5
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEHDMSWVRQAPGKGLEWVSRIGPDGFHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPTLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)
BMS3h-6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGEYHMSWVRQAPGKGLEWVSRITPLGTLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPSLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:28)
BMS3h-7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTNAMSWVRQAPGKGLEWVSRISPGGDYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRVPDLLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29)
BMS3h-8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPSEEMSWVRQAPGKGLEWVSRISADGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKGRVPDLLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
BMS3h-9
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAEDDMTWVRQAPGKGLEWVSRIAVDGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGKVPSLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:31)
BMS3h-10
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTMDMSWVRQAPGKGLEWVSRITGDGMNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGVTPDLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)
BMS3h-11
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFERDDMTWVRQAPGKGLEWVSRINAGGVHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVTPDLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
BMS3h-12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDDSMTWVRQAPGKGLEWVSRISSDGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVTPDLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
BMS3h-13
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEEDMTWVRQAPGKGLEWVSRIDSVGEGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVTPDLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
BMS3h-14
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSAMSWVRQAPGKGLEWVSRIDNPGQHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTVPTLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)
BMS3h-15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQHSMTWVRQAPGKGLEWVSRIDGGGYNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEVPRLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)
BMS3h-16
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQEPMTWVRQAPGKGLEWVSRIAYNGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGITPNLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)
BMS3h-17
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYPMSWVRQAPGKGLEWVSRINATGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVIPHLMFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)
BMS3h-18
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYDMSWVRQAPGKGLEWVSRITGTGNSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGVVPYLAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)
BMS3h-19
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEADAMTWVRQAPGKGLEWVSRINVDGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTVPTLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:41)
BMS3h-21
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDRADMTWVRQAPGKGLEWVSRISGEGKCTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGMVPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:42)
BMS3h-22
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHWEPMSWVRQAPGKGLEWVSRINSSGWDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGMVPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:43)
BMS3h-24
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADEPMTWVRQAPGKGLEWVSRIPPEGAPTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGITPNLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:44)
BMS3h-26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHNHDMSWVRQAPGKGLEWVSRISRGGLQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGIVPDLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:45)
BMS3h-27
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNEYPMSWVRQAPGKGLEWVSRINGDGANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGIIPAMQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)
BMS3h-28
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDVPMSWVRQAPGKGLEWVSRIDPYGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGIMPSLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:47)
BMS3h-29
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDMSWVRQAPGKGLEWVSRISALGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGQLPALEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:48)
BMS3h-30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKRYYMTWVRQAPGKDLEWVSGIVPSGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPDLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:49)
BMS3h-31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDMTWVRQAPGKGLEWVSRISPTGGQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVIPYLSFSPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)
BMS3h-32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYWMGWARQAPGKGLEWVSSIDSHGAGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAKGAPKFMTTYTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:51)
BMS3h-33
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLSYPMHWVRQAPGKGLEWVSSIDSRGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGHSWTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)
BMS3h-34
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFANSNMTWVRQAPGKGLEWVSRINPDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEGRIPTLHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)
BMS3h-3S
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGPRRMGWVRQAPGKGLEWVSSIDDIGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEGAQGVLLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:54)
BMS3h-36
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEDYRMVWVRQAPGKGLEWVSSISTSGELTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAETAGQFFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)
BMS3h-39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPEYEMVWVRQAPGKGLEWVSAISREGRATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNNLRAEDTAVYYCAKEPVRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:56)
BMS3h-40
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYEMLWVRQAPGKGLEWVSSISSSGNYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPLMFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:57)
BMS3h-42
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDTEEMSWVRQAPGKGLEWVSAISPNGAFTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEPILFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:58)
BMS3h-44
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGHYDMVWVRQAPGRGLEWVSTINGAGLNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQSASRIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:59)
BMS3h-45
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYEMAWVRQAPGKGLEWVSSISTLGTKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQSSTHIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:60)
BMS3h-46
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFIRYEMAWVRQAPGKGLEWVSSISSSGWTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDAHIFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)
BMS3h-47
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYAYEMAWVRQAPGKGLEWVSSISDDGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGQGFDYWSQGTLVTVSS(SEQ ID NO:62)
BMS3h-48
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADHGMTWVRQAPGKGLEWVSGIGPSGEATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRIPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:63)
BMS3h-49
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFESQDMSWVRQAPGKGLEWVSGISPNGWDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRSDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:64)
BMS3h-50
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDYDMWWVRQAPGKGLEWVSRIRHPGGVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAVPKGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:65)
BMS3h-51
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRVYWMTWVRQAPGKGLEWVSSIDPQGGMTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKARIPNLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:66)
BMS3h-52
EVQLLESGGGLVQPGESLRLSCAASGFTFSAYDMTWVRQAPGKGLEWVSRINPTGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAKIPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:67)
BMS3h-53
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADSEMMWVRQAPGKGLEWVSGIAHNGGHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGHPQQTEAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:68)
BMS3h-54
EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFATYDMYWVRQAPGKGLEWVSKISPNGWSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYQTHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:69)
BMS3h-55
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYDMRWVRQAPGKGLEWVSTISSSGTYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPKNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:70)
BMS3h-57
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHEDMTWVRQAPGKGLEWVSSISPNGWDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTRSKFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:71)
BMS3h-58
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEKYIMGWARQAPGKGLEWVSTIDYWGQHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRSHLIPLQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:72)
BMS3h-59
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSTISYVGYYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKALRGEAFTERFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:73)
BMS3h-60
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGPYMMHWVRQAPGKGLEWVSTIEVNGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVGSKTSSDKSFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:74)
BMS3h-61
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTTEMAWVRQAPGKGLEWVSSIGSAGAWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIGGHPQGQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:75)
BMS3h-62
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPREWMAWVRQAPGKGLEWVSSIQPMGQTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYSRNKGFFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:76)
BMS3h-63
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSEYMGWVRQAPGKGLEWVSSIQRYGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHESNWETFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:77)
BMS3h-70
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYSMQWVRQAPGKGLEWVSAITPNGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTLGRGSYPGVDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:78)
BMS3h-71
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPSYAMTWVRQAPGKGLEWVSRITADGTVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSIPMLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:79)
BMS3h-72
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYDMIWVRQAPGKGLEWVSAISPNGTGIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNQSVHHAVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:80)
BMS3h-73
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENYEMTWVRQAPGKGLEWVSRIAPHGRLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGQIPMLDFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:81)
BMS3h-74
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYMMMWVRQAPGKGLEWVSTISHFGDITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNDMVMKNGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:82)
BMS3h-75
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFERYDMSWVRQAPGKGLEWVSRIDSRGWSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLVPHLRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:83)
BMS3h-76
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFANAQMTWVRQAPGKGLEWVSRIDAMGDATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGKVPSIDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:84)
BMS3h-77
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFANAQMTWVRQAPGKGLEWVSRIDAMGDATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVIPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:85)
BMS3h-78
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQNDRMHWVRQAPGKGLEQVSSISATGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQTGTNRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:86)
BMS3h-79
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNQPYMSWVRQAPGKGLEWVSSIDASGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKDRIPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:87)
BMS3h-80
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDNENMTWVRQAPGKGLEWVSRIDGGGYNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGQVPELLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:88)
BMS3h-81
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSSNMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPTLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:89)
BMS3h-82
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSSNMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRIPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:90)
BMS3h-83
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDDSMSWVRQAPGKGLEWVSRINDAGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTIPLLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:91)
BMS3h-84
EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSDTMSWVRQAPGKGLEWVSRIDGTGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGLIPDLQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:92)
BMS3h-85
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEEEMTWVRQAPGKGLEWVSRIIGGGHETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTIPLLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:93)
BMS3h-86
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDNENMTWVRQAPGKDLEWVSRITERGDVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTVPTLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:94)
BMS3h-87
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEEEMTWVRQAPGKGLEWVSRIIGGGHETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTVPTLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:95)
BMS3h-88
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHETEMTWVRQAPGKGLEWVSAINRLGQDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPGLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:96)
BMS3h-89
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDDSMSWVRQAPGKGLEWVSRINDAGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTVPTLEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:97)
BMS3h-90
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDNENMTWVRQAPGKDLEWVSRITERGDVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRIPTLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:98)
BMS3h-91
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDDSMSWVRQAPGKGLEWVSRINDAGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGITPNLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:99)
BMS3h-92
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADEPMTWVRQAPGKGLEWVSRIPPEGAPTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLIPDLQFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:100)
BMS3h-93
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDSDMTWVRQAPGKGLEWVSAIAAPGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRIPNLRFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:101)
BMS3h-94
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVSDTMSWVRQAPGKGLEWVSRIDGTGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGQVPELLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:102)
BMS3h-95
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQDSDMTWVRQAPGKGLEWVSAIAAPGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRIPNLVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:103)
BMS3h-96
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAAGFTFDLAEMTWVRQAPGKGLEWVSRIDEDGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAEGVIPSLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:104)
BMS3h-97
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDKHMSWVRQAPGKGLEWVSRISPDGTYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAEGVIPSLTFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:105)
BMS3h-98
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BMS3h-99
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BMS3h-198-4
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BMS3h-198-5
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BMS3h-198-8
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BMS3h-217-2316
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BMS3h-217-2317
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BMS3h-217-2319
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHWIATLLSWYQVKPGKAPKLLITYGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGVLWPATFGQGTTVEIKR(SEQ ID NO:604)
BMS3h-217-2320
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHFIWGPLSWYQVKPGKAPKLLITYGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGVLWPATFGQGTTVEIKR(SEQ ID NO:605)
BMS3h-217-2321
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHFIGSLLNWYQVKPGKAPKLLITYGSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGVLWPATFGQGTTVEIKR(SEQ ID NO:606)
BMS3h-217-2322
GIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHFIGSLLSWYQVKPGKAPKLLITYGSWLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQGVLWPATFGQGTTVEIKR(SEQ ID NO:607)
表4
编码人类抗CD40可变域之核苷酸序列
BMS3h-56-201
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:608)
BMS3h-56-258
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BMS3h-37
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BMS3h-38
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BMS3h-41
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BMS3h-43
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BMS3h-56
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BMS3h-106
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BMS3h-107
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BMS3h-131
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BMS3h-193
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BMS3h-198
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BMS3h-202
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BMS3h-217
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:621)
BMS3h-1
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BMS3h-2
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BMS3h-3
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BMS3h-4
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BMS3h-5
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BMS3h-6
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BMS3h-7
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BMS3h-8
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BMS3h-9
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BMS3h-10
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BMS3h-11
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BMS3h-12
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BMS3h-13
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BMS3h-14
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BMS3h-15
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BMS3h-16
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BMS3h-17
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BMS3h-18
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BMS3h-19
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BMS3h-21
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BMS3h-22
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BMS3h-24
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BMS3h-26
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BMS3h-27
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BMS3h-28
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BMS3h-29
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGGATTATGATATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTTCGGCGCTTGGTGCTACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTCAGCTTCCGGCGTTGGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:647)
BMS3h-30
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BMS3h-31
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTGATTATGATATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAGGATTTCTCCGACGGGTGGGCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTGTTATTCCGTATTTGTCTTTTTCTCCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:649)
BMS3h-32
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTAAGTATTGGATGGGTTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTGATTCGCATGGTGCTGGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGTCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTGCTCCTAAGTTTATGACTACGTATACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC(SEQ ID NO:650)
BMS3h-33
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BMS3h-34
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BMS3h-35
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BMS3h-36
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BMS3h-39
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BMS3h-40
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BMS3h-42
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BMS3h-44
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BMS3h-45
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BMS3h-46
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BMS3h-47
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BMS3h-48
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BMS3h-49
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BMS3h-61
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BMS3h-62
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BMS3h-70
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BMS3h-76
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BMS3h-78
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BMS3h-89
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BMS3h-91
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BMS3h-94
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BMS3h-95
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BMS3h-96
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BMS3h-97
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BMS3h-98
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BMS3h-99
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BMS3h-100
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BMS3h-101
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BMS3h-102
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BMS3h-103
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BMS3h-108
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BMS3h-109
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BMS3h-110
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BMS3h-111
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BMS3h-139
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BMS3h-140
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BMS3h-143
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BMS3h-144
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BMS3h-145
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BMS3h-146
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BMS3h-147
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BMS3h-167
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BNS3h-168
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BMS3h-169
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BMS3h-170
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BMS3h-171
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BMS3h-200
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BMS3h-2!2
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BMS3h-213
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BMS3h-214
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BMS3h-215
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BMS3h-230
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BMS3h-231
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BMS3h-232
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BMS3h-233
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BMS3h-234
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BMS3h-235
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BMS3h-236
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BMS3h-237
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BMS3h-238
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BMS3h-239
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BMS3h-240
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BMS3h-245
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BMS3h-246
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BMS3h-248
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BMS3h-249
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BMS3h-257
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BMS3h-272
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BMS3h-298
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BMS3h-302
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BMS3h-303
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BMS3h-304
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BMS3h-305
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BMS3h-306
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BMS3h-307
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BMS3h-308
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BMS3h-309
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BMS3h-310
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BMS3h-311
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BMS3h-312
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BMS3h-313
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BMS3h-37-1
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BMS3h-37-4
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BMS3h-37-9
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BMS3h-37-12
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BMS3h-37-201
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BMS3h-37-204
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8MS3h-37-205
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BMS3h-37-206
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BMS3h-37-207
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BNS3h-37-208
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BMS3h-37-209
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BMS3h-37-210
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BMS3h-37-213
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BMS3h-38-5
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BMS3h-38-7
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BMS3h-38-8
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BMS3h-38-9
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BMS3h-38-10
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BMS3h-38-11
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BMS3h-38-12
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BMS3h-38-13
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BMS3h-38-201
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BMS3h-38-202
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BMS3h-38-203
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BMS3h-38-206
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BMS3h-38-208
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BMS3h-38-209
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BMS3h-41-3
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BMS3h-41-4
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BMS3h-41-5
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BMS3h-41-6
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BMS3h-41-7
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BMS3h-41-8
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BMS3h-41-9
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BMS3h-41-10
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BMS3h-41-11
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BMS3h-41-12
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BMS3h-41-13
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BMS3h-41-14
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BMS3h-43-1
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BMS3h-43-2
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BMS3h-43-3
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BMS3h-43-4
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BMS3h-43-5
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BMS3h-43-6
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BMS3h-43-7
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BMS3h-43-8
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BMS3h-43-9
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BMS3h-43-10
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BMS3h-43-11
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BMS3h-43-12
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BMS3h-43-13
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BMS3h-43-14
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BMS3h-43-15
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BMS3h-56-1
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BMS3h-56-2
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BMS3h-56-3
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BMS3h-56-4
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BMS3h-56-5
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BMS3h-56-6
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BMS3h-56-9
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BMS3h-56-15
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BMS3h-56-16
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BMS3h-56-18
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BMS3h-56-19
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BMS3h-56-20
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BMS3h-56-21
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BMS3h-56-22
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BMS3h-56-285
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BMS3h-56-286
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BMS3h-56-287
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BMS3h-56-288
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BMS3h-106-1
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BMS3h-106-2
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BMS3h-107-1
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BMS3h-107-2
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BMS3h-131-1
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BMS3h-131-2
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BMS3h-131-3
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BMS3h-131-4
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAATAGTTCTATTTTGTGGGCGTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGAGAGTTCTTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGTTCAGAATGCGGTTTGGCCTGGTACGTTCGACCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1043)
BMS3h-131-5
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAATAGTTCTATTTTGTGGGCGTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGAGAGTTCTACCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGTTCAGAATGCGGTTTGGCCTGGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1044)
BMS3h-131-6
GACATCCAGATGACCGTGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAATAGTTCTATTTTGTGGGCGTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCGAGAGTTCTTCCGGATTGCAAAGCGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGTTCAGAATGCGGTTTGGCCTGGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1045)
BMS3h-131-7
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BMS3h-131-8
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BMS3h-131-9
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BMS3h-131-10
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BMS3h-131-11
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BMS3h-131-12
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BMS3h-131-13
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BMS3h-131-14
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BMS3h-131-15
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BMS3h-193-1
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BMS3h-193-2
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BMS3h-193-3
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BMS3h-193-4
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BMS3h-193-5
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BMS3h-193-6
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BMS3h-193-7
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BMS3h-193-8
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BMS3h-193-9
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BMS3h-193-10
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BMS3h-193-11
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BMS3h-193-12
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BMS3h-193-13
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BMS3h-193-14
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BMS3h-193-15
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BMS3h-193-16
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGCGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCTTGCTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCAGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCATCAGTATGCGAGTCCACCTTTGACGCTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1070)
BMS3h-193-17
AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGCGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCTTGCTTCTCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCATCAGTATGAGAGTCCACCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1071)
BMS3h-193-18
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BMS3h-193-19
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BMS3h-193-20
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BMS3h-193-21
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BMS3h-193-22
CACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCTTGCTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCCATCAGTATGAGAGTCCACCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:107G)
BMS3h-193-23
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BMS3h-193-24
GACATCCAGATGACCCAGTCGCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCTTGCTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCACCAGTATGAGAGTCCACCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGTAATCAAACGG(SEQ ID NO:1078)
BMS3h-193-25
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCTAGGCTCCTGATCTATCTTGCTACCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCATCAGTATGAGAGTCCACCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1079)
BMS3h-193-2G
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGCCGATTGAGCGTCGTTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCTTGCTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACATACTACTGTCATCAGTATGAGAGTCCACCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1080)
BMS3h-193-27
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BMS3h-193-28
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BMS3h-193-29
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BMS3h-193-30
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BMS3h-198-31
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BMS3h-198-32
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BMS3h-198-33
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BMS3h-198-34
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BMS3h-198-35
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BMS3h-198-3G
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BMS3h-198-37
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BMS3h-198-38
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BMS3h-202-1
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BMS3h-202-2
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BMS3h-202-3
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BMS3h-202-4
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BMS3h-202-5
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BMS3h-202-6
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BMS3h-202-7
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BMS3h-202-8
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BMS3h-202-9
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BMS3h-202-10
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BMS3h-202-11
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BMS3h-217-1
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BMS3h-217-2
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BMS3h-217-3
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BMS3h-217-4
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BMS3h-217-5
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BMS3h-217-6
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BMS3h-217-7
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BMS3h-217-8
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BMS3h-217-9
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCATGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1158)
BMS3h-217-10
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BMS3h-217-11
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGACTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1160)
BMS3h-217-12
AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1161)
BMS3h-217-13
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCAATTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1162)
BMS3h-217-14
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BMS3h-217-15
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BMS3h-217-16
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BMS3h-217-17
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8MS3h-217-18
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BMS3h-217-19
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTACTCTGTTATCTTGGTACCAGCTGAAACCAGGGAAAGCCCCAAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTAGAAAACAAACGG(SEQ ID NO:1168)
BMS3h-217-20
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BMS3h-217-21
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BMS3h-217-22
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BMS3h-217-23
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BMS3h-217-24
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BMS3h-217-25
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BMS3h-217-26
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BMS3h-217-27
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BMS3h-217-28
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BMS3h-217-29
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BMS3h-217-30
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BMS3h-217-31
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BMS3h-217-32
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BMS3h-217-33
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BMS3h-217-34
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BMS3h-217-35
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BMS3h-217-2301
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BMS3h-217-2302
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BMS3h-217-2303
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BMS3h-217-2304
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BMS3h-217-2305
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BMS3h-217-230G
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BMS3h-217-2307
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BMS3h-217-2308
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BMS3h-217-2309
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BMS3h-217-2310
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BMS3h-217-2311
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BMS3h-217-2312
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BMS3h-217-2313
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BMS3h-217-2314
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BMS3h-217-2315
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BMS3h-217-2316
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BMS3h-217-2317
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BMS3h-217-2318
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BMS3h-217-2319
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BMS3h-217-2320
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTTGGGGGCCCTTATCTTGGTACCAGGTGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACAACGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1204)
BMS3h-217-2321
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTAGCCTCTTAAACTGGTACCAGGTGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTATGGTTCCTTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACAACGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1205)
BMS3h-217-2322
GGCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCATTTTATTGGTAGTCTGTTATCTTGGTACCAGGTGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCACTTACGGGTCCTGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGGTCAGGGGGTGCTGTGGCCTGCGACGTTCGGCCAAGGGACAACGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1206)
实施例1
经由BMS3h-225产生人类抗CD40可变域BMS3h-1
以下实施例描述经由BMS3h-225产生一系列命名为BMS3h-1之抗人类CD40可变域。在噬菌体表面上重组表现单一免疫球蛋白可变域谱系之后,藉由使噬菌体谱系与固定目标抗原接触,洗涤以移除未结合之噬菌体且传播结合之噬菌体来进行选择。此方法通常称为“淘选”。其适用于筛检单一免疫球蛋白可变域以及可在呈现文库上表现之其他抗体片段,例如scFv、Fab及Fab'。或者,可藉由针对仅藉由折迭成员结合之固定通用配位体(例如蛋白质A或蛋白质L)淘选来预先选择表现适当折迭之成员变异体之噬菌体。此有如下优势:降低非功能成员之比例,由此增加可能结合目标抗原之成员的比例。举例而言,WO99/20749中教示用通用配位体进行预先选择。举例而言,Harrison等人,Meth.Enzymol.267:83-109(1996)大体描述了噬菌体抗体文库之筛检。
筛检通常使用固定于固体支撑物(例如塑料管或孔)或层析基质(例如SepharoseTM(Pharmacia))上之纯化抗原来执行。筛检或选择亦可在诸如细胞表面之复合抗原上执行(Marks等人,BioTechnology11:1145(1993);de Kruif等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:3938(1995))。另一替代方法涉及藉由结合溶液中之经生物素标记之抗原来选择,随后捕捉于涂布抗生蛋白链菌素之珠粒上。
克隆BMS3h-1至BMS3h-69:
使用递减浓度之抗原(第1轮100nM;第2轮10nM;第3轮1nM)针对经生物素标记之人类CD40单体(由BMS供应,每摩尔CD401.5摩尔生物素)与经生物素标记之人类CD40-Ig(由BMS供应,每摩尔CD40-Ig3.3摩尔生物素)并行进行三轮选择。在起始选择之前,如下组合来自未处理4G及6G Domantis dAb文库之噬菌体:
1)4G+6G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
2)4G+6G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
3)4G+6G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
4)4G VK
5)6G VK
各轮选择涉及将所要浓度之抗原添加至750μl来自未处理文库池之一之 噬菌体或后续选择输出之噬菌体与750μl PBS+2%Marvel(含有2%(w/v)Marvel[Premier Foods,UK]之磷酸盐缓冲盐水)之混合物中且在室温下藉由翻滚混合来培育1小时。接着藉由添加100μl再悬浮M-280抗生蛋白链菌素[Invitrogen,UK]来捕捉经生物素标记之抗原噬菌体复合物,且在室温下藉由翻滚混合来培育5分钟。接着使用KingFisher磁力分离器[Thermo Fisher Scientific,UK]回收且用7×1ml PBS+0.1%吐温20(含有0.1%(v/v)聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯[Sigma-Aldrich,UK]之PBS,PBST),随后用1×1ml PBS洗涤。藉由与500μl胰蛋白酶-PBS(50μl溶解于50mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM CaCl2中之10mg/ml胰蛋白酶[Sigma-Aldrich,UK]添加至450μl PBS中)一起培育来溶离保留在经洗涤上之结合噬菌体。回收含有噬菌体之溶液,且在37℃下使用250μl感染1.75ml对数生长期大肠杆菌(E.coli)TG1(OD600为0.4)30分钟。在微量离心机中在11,600g下离心大肠杆菌TG1噬菌体感染之培养物1分钟。使所得细胞集结粒再悬浮于1ml2xTY(1公升中有16g胰蛋白胨、10g酵母萃取物及5g NaCl,在121℃下用高压釜处理15分钟)中且接种于含有补充有15μg/ml四环素之TY的9cm皮式培养皿(Petri dish)上。在37℃下培育培养盘隔夜。接着将2ml补充有15%甘油之2xTY添加至各培养盘中,并用玻璃散布器分散该等细胞且充分混合。使用50μl刮落细菌接种50ml补充有15μg/ml四环素之2xTY,且在37℃下在250rpm振荡下生长隔夜。在3,300g下离心隔夜培养物15分钟以集结细菌。为了沉淀析出噬菌体,将10ml PEG/NaCl(20%聚乙二醇8000,2.5M NaCl)添加至40ml上清液中。混合噬菌体/PEG溶液且静置于冰上1小时,接着在4℃下在3,300g下离心30分钟,且去除上清液。使集结粒再悬浮于2ml PBS中且在微量离心机中在11,600g下离心10分钟,移除剩余细菌碎片。含有噬菌体之所得上清液接着用于下一轮针对适当经生物素标记之CD40抗原之选择。
在第2轮及第3轮选择之后,进行单株噬菌体ELISA。使用3次250μl PBST之洗涤,随后3次250μl PBS之洗涤执行所有洗涤。在4℃下,用每孔50μl1μg/ml中性链亲和素(Thermo Scientific,UK)于0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物涂布培养盘隔夜。洗涤培养盘,且接着在室温下用2%MPBS(含2%w/v Marvel脱脂奶粉[Premier Foods]之PBS)阻断1小时。接着洗涤培养盘且与每孔50μl0.7μg/ml经生物素标记之人类CD40于2%MPBS中之混合物一起培育。洗涤培养盘,且将噬菌体上清液添加至等体积之2% MPBS中。接着在室温下培育培养盘1小时。洗涤培养盘且用用2%MPBS以1:5000稀释之抗M13-HRP结合物(GE Healthcare,UK)侦测结合噬菌体,且在室温下培育1小时。洗涤培养盘,且使用SureBlue单组分TMB MicroWell过氧化酶溶液(KPL Inc,USA)进行ELISA显色。藉由与涂有中性链亲和素但无生物素标记CD40之培养盘相比较来鉴别特异性噬菌体。使用MidiPrep自pDOM4(Domantis)第2轮及第3轮输出分离dAb V-基因,且选殖至pDOM5(Domantis)中。WO2007/085815中所揭示之pDOM4为Fd噬菌体载体之衍生物,其中基因III信号肽序列经酵母醣脂锚定表面蛋白(yeast glycolipid anchored surface protein,GAS)信号肽置换(WO2005/093074)。pDOM4亦在前导序列与基因III之间含有c-myc标签,此将基因III放回框架中。
如下鉴别结合dAb。在37℃下,在Costar96孔细胞培养集群(Corning Incorporated,USA)中在250rpm振荡下自各输出选取96个个别菌落(于pDOM5中)至200μL含有OnEx自体诱导介质(Novagen,UK)之Terrific培养液中隔夜。离心培养物以集结细胞,且藉由CD40结合dAb之抗原结合ELISA分析上清液。在4℃下用每孔50μl1μg/ml中性链亲和素于0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物涂布MaxiSorp96孔免疫培养盘(Nunc,USA)隔夜。所有洗涤系如噬菌体ELISA所述。在室温下用200μl含有1%吐温20之PBS阻断培养盘1小时。接着洗涤培养盘且与每孔50μl0.7μg/ml经生物素标记之人类CD40于0.1%MPBS中之混合物一起培育。将澄清之含有dAb之培养物上清液添加至具有等体积0.1%PBS之TELISA培养盘中。在室温下培育培养盘1小时且接着洗涤。使用两步方法侦测结合dAb:首先在室温下添加用0.1%PBST以1:2000稀释之9E10(抗myc IgG,Sigma-Aldrich,UK)持续1小时,接着洗涤,随后在室温下添加用0.1%PBST以1:2000稀释之抗小鼠Fc-HRP(Sigma-Aldrich,UK)持续1小时。洗涤培养盘,且使用SureBlue单组分TMB MicroWell过氧化酶溶液(KPL Inc,USA)进行ELISA显色。允许显色,且藉由添加等体积1M HCl中止比色反应。在450nm下读取ELISA培养盘。藉由与涂有中性链亲和素但无生物素标记CD40之培养盘相比较来鉴别特异性噬菌体。
在基于珠粒或基于ELISA之受体结合分析(receptor-binding assay,RBA)中测试对CD40具特异性之克隆以评估CD40配位体结合之抑制。在B细胞增殖分析中,且接着在多种其他活体外细胞分析中测试在RBA中显示抑制作用 之域抗体。下文更详细描述此等分析。
BMS3h-106至BMS3h-225:
BMS3h-106至BMS3h-225系自针对如关于BMS3h-1至BMS3h-69所述但具有以下修饰之生物素标记CD40或生物素标记CD40-Fc之选择来分离。在起始选择之前,如下组合来自未处理4G及6G文库之噬菌体:
6)4G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
7)4G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
8)4G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
9)6G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
10)6G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
11)6G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
12)4G VK
13)6G VK
对于CD40-Fc在160nM之抗原浓度下执行第1轮,且对于CD40在100nM下执行。输出效价在2.0×104至9.0×107TU/ml之范围内(功能病毒效价)。
对于第2轮,来自第1轮之富集噬菌体在用于选择之前被成对组合:
1)4G+6G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间(来自第1轮之池1+池4)。
2)4G+6G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间(来自第1轮之池2+池5)。
3)4G+6G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间(来自第1轮之池3+池6)。
4)4G+6G VK(来自第1轮之池7+池8)
在100nM之抗原浓度下进行选择,且使用与中性链亲和素(Thermo Fisher Scientific,UK)偶合之M-280甲苯磺酰基活化(Invitrogen)捕捉抗原-噬菌体复合物。输出效价在6.5×107TU/ml至7.5×108TU/ml之范围内。
在20nM之抗原浓度下且在CD40-Fc选择之情况下,在6.7μM游离人类Fc尾(BMS)存在下执行第3轮。输出效价在4.3×107TU/ml至1.6×109TU/ml之范围内。
如关于第2轮所述但在2nM之抗原浓度下且在存在及不存在500倍过量未标记CD40-Fc之情况下执行第4轮。在最初使噬菌体与生物素标记抗原一起 培育1小时之后添加此竞争剂,且接着如前所述培育混合物隔夜。包括此竞争步骤,目的在于增强对具有较慢解离速率之dAb之选择。在无竞争之情况下输出效价在1.8×107TU/ml至4.4×107TU/ml之范围内,且在有竞争之情况下在1.8×106TU/ml至2.3×107TU/ml之范围内。
为了监测选择之进展,在第2轮及第3轮之后进行单株噬菌体ELISA。如关于BMS3h-1至BMS3h-69所述执行此等操作。如关于BMS3h-1至BMS3h-69所述鉴别结合dAb,其中例外为在VK文库筛检之情况下,包括最终浓度为0.8μg/ml之蛋白质L。添加蛋白质L会藉由使dAb交联而增加信号强度。
BMS3h-70至BMS3h-105:
BMS3h-70至BMS3h-105系自针对已被动吸附至免疫管之抗原的选择来分离。在起始选择之前,如下组合来自未处理4G及6G Domantis dAb文库之噬菌体:
1)4G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
2)4G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
3)4G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
4)6G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
5)6G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
6)6G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
7)4G VK
8)6G VK
对于第一轮选择,将1ml10μg/ml人类CD40-Fc融合物(BMS)于0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物添加至Nunc MaxiSorp免疫管中且接着在4℃下,在滚动下培育隔夜。接着排空该管且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。接着藉由用MPBS填充至满且在室温下培育1小时来阻断该管。接着排空该管且用PBS洗涤三次。将含文库噬菌体之4ml MPBS添加至该管中且在室温下,在旋转翻滚下培育1小时。
排空该管且用PBST(具有0.1%(v/v)吐温20之PBS)洗涤10次。在室温下,藉由在旋转翻滚下与500μl胰蛋白酶-PBS(50μl溶解于50mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM CaCl2中之10mg/ml胰蛋白酶[Sigma-Aldrich,UK]添加至450μl PBS中)一起培育10min来溶离保留在经洗涤管上之结合噬菌体。回收含有噬菌体之溶液,且在37℃下使用250μl感染1.75ml对数生长期大肠杆菌TG1 (OD600为0.4)30分钟。在微量离心机中在11,600g下离心大肠杆菌TG1噬菌体感染之培养物1分钟,且使所得细胞集结粒再悬浮于1ml2xTY(1公升中有16g胰蛋白胨、10g酵母萃取物及5g NaCl,该悬浮液在121℃下以高压釜处理15分钟)中且接种于含有补充有15μg/ml四环素之LB琼脂之9cm皮式培养皿中。在37℃下培育培养盘隔夜。接着将2ml补充有15%甘油之2xTY添加至各培养盘中,且用玻璃散布器分散该等细胞且充分混合。
使用50μl刮落细菌接种50ml补充有15μg/ml四环素之2xTY,且在37℃下在250rpm振荡下生长隔夜。在3,300g下离心隔夜培养物15分钟以集结细菌。为了沉淀析出噬菌体,将10ml PEG/NaCl(20%聚乙二醇8000,2.5M NaCl)添加至40ml上清液中。混合噬菌体/PEG溶液且静置于冰上1小时。接着在4℃下在3,300g下离心溶液30分钟,且去除上清液。使集结粒再悬浮于2ml PBS中且在微量离心机中在11,600g下离心10分钟,移除剩余细菌碎片。含有噬菌体之所得上清液接着用于下一轮针对CD40-Fc抗原之选择。第1轮之输出效价在7.5×104TU/ml至1.5×107TU/ml之范围内(每毫升之感染单位)。
使用自第一轮选择回收之富集噬菌体执行第二轮选择。如上所述精确执行此操作且输出效价在2.5×107TU/ml至1.2×108TU/ml之范围内。
使用自第二轮选择回收之富集噬菌体执行第三轮选择。如上所述但在1μg/ml之抗原浓度下执行此等操作。输出效价在5.1×107TU/ml至7.5×108TU/ml之范围内。
为了监测选择之进展,在第2轮及第3轮之后进行单株噬菌体ELISA。将个别菌落之样品选取至200μL补充有15μg/ml四环素之2xTY中,且在37℃下,在Costar96孔细胞培养集群(Corning Incorporated,USA)中在250rpm振荡下培育隔夜。离心培养物以集结细胞,且藉由CD40结合噬菌体dAb之抗原结合ELISA分析上清液。使用3次250μl PBST之洗涤,随后3次250μl PBS之洗涤执行所有洗涤。在4℃下用每孔50μl0.5μg/ml CD40-Fc(BMS)于0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物涂布MaxiSorp96孔免疫培养盘(Nunc,USA)隔夜。洗涤培养盘,且接着在室温下用250μl2%MPBS阻断1小时。洗涤培养盘,且将噬菌体上清液添加至等体积2%MPBS中且在室温下培育1小时。洗涤培养盘且用用2%MPBS以1:5000稀释之抗M13-HRP结合物(GE Healthcare,UK)侦测结合噬菌体,且在室温下培育1小时。洗涤培养盘,且使用SureBlue单组分TMB MicroWell过氧化酶溶液(KPL Inc,USA)进行ELISA 显色。藉由与涂有游离Fc之培养盘相比较来鉴别特异性噬菌体dAb。
将来自以上第2轮及第3轮选择输出中之每一者之dAb基因以池形式次选殖至大肠杆菌菌株HB2151中之可溶性表现载体pDOM5中。此载体允许在大肠杆菌中表现具有c-myc标签之游离dAb(Roche Diagnostics GmbH)且分泌至上清液中。
如下鉴别来自被动选择之CD40结合dAb。在37℃下,在Costar96孔细胞培养集群(Corning Incorporated,USA)中在250rpm振荡下自各输出选取96个个别菌落(于pDOM5中)至200μL含有OnEx自体诱导介质(Novagen,UK)之Terrific培养液中隔夜。离心培养物以集结细胞,且藉由CD40结合dAb之抗原结合ELISA分析上清液。在4℃下用每孔50μl0.5μg/ml CD40-Fc(BMS)于0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物涂布MaxiSorp96孔免疫培养盘(Nunc,USA)隔夜。所有洗涤系如噬菌体ELISA所述。在室温下用250μl含有1%吐温20之PBS(PBST)阻断培养盘1小时。将澄清之含有dAb之培养物上清液添加至具有等体积0.1%PBST之ELISA培养盘中。在室温下培育培养盘1小时且接着洗涤。使用两步方法侦测结合dAb:首先在室温下添加用0.1%PBST以1:5000稀释之生物素标记9E10(抗myc IgG,Sigma-Aldrich,UK)持续1小时,接着洗涤,随后在室温下添加用0.1%PBST以1:5000稀释之抗生蛋白链菌素-HRP(Bender MedSystems,Austria)持续1小时。洗涤培养盘且使用SureBlue单组分TMB进行ELISA显色。藉由与涂有游离Fc之培养盘相比较来鉴别特异性dAb。
在基于珠粒或基于ELISA之受体结合分析(RBA)中测试对CD40具特异性之克隆以评估CD40配位体结合之抑制。表5中给出自RBA获得之效能量测(初步筛检工作)。在B细胞增殖分析中,且接着在多种其他活体外细胞分析中测试在RBA中显示抑制作用之域抗体。
BMS3h-210至BMS3h-225
BMS3h-210至BMS3h-225系自针对完整细胞之选择来分离。在起始选择之前,如下组合来自未处理4G及6G Domantis dAb文库之噬菌体:
1)4G+6G VH CDR3长度在7至9个氨基酸之间。
2)4G+6G VH CDR3长度在10至12个氨基酸之间。
3)4G+6G VH CDR3长度在13至15个氨基酸之间。
4)4G and6G VK
在第1轮中,将用细胞表面表现之人类CD40(由BMS供应)稳定转染之DG44CHO细胞株用作抗原。在针对此等细胞作选择之前,使上文所述之文库池与未经转染之CHO细胞一起培育以去除其对除CD40以外之细胞表面抗原具特异性之噬菌体呈现dAb。藉由在评估存活力之前与凡尔生(Versene)(Invitrogen)一起培育来收集两种类型之细胞。使六百万个活的未经转染之CHO细胞再悬浮于4ml具有2%(w/v)BSA之PBS(PBS/BSA)中且在4℃下旋转翻滚1小时以进行阻断。除非另外说明,否则在4℃下执行所有后续步骤。在185g下离心细胞5分钟,且将含有经去除之文库噬菌体之上清液转移至新鲜管中。向此管中添加含6×106个活CHO-CD40细胞之1ml PBS/BSA,且旋转混合物1小时。接着藉由在185g下离心5分钟来洗涤该等细胞5次,且再悬浮于10ml PBS/BSA中。在最终洗涤后,如先前集结细胞且接着再悬浮于0.5ml1mg/ml牛胰腺之XIII型胰蛋白酶(Sigma Aldrich,UK)于补充有5mM Tris-HCl(pH7.4)、0.1mM CaCl2之PBS中的混合物中,且转移至微量离心管中。在室温下旋转细胞10分钟,随后在16000g下离心5分钟。使用上清液中之溶离之噬菌体感染大肠杆菌,且输出噬菌体效价经测定在5.1×105TU/ml与2.7×106TU/ml(每毫升之感染单位)之间。
使用自第一轮选择回收之富集噬菌体执行第二轮选择。如上所述但无初始去除(去选择)步骤且使用RAMOS人类B细胞(ATCC)替代CHO-CD40来执行此等操作。输出效价在2.3×105TU/ml至7.5×105TU/ml之范围内。
如第二轮般执行第三轮选择。输出效价在1.9×108TU/ml至3.5×108TU/ml之范围内。
将来自以上第2轮及第3轮选择输出中之每一者之dAb基因以池形式次选殖至大肠杆菌菌株HB2151中之可溶性表现载体pDOM5中。此载体允许在大肠杆菌中表现具有c-myc标签之游离dAb且分泌至上清液中。
在CHO细胞受体结合分析(RBA)中测试对CD40具特异性之克隆以评估CD40配位体结合之抑制。在B细胞增殖分析中,且接着在多种其他活体外细胞分析中测试在RBA中显示抑制作用之域抗体。
藉由易错PCR进行亲和力成熟
构筑13个在下文实施例6中所述之B细胞增殖分析中显示中和活性之BMS3h dAb的易错噬菌体文库(参见表17)。此系藉由使用Mutazyme II聚合酶(来自Agilent Technologies之GeneMorph II套组之一部分)在扩增期间藉由聚 合酶链反应(PCR)将错误任意引入dAb基因中来执行。在GAS1前导序列控制下将突变dAb基因以与fd噬菌体基因III蛋白质之基因融合物形式选殖至pDOM4载体中,该载体含有为产生感染性噬菌体粒子所必需之所有fd基因。此等文库之尺寸为约1×108个CFU(菌落形成单位),每个dAb基因之错误率为2至5个氨基酸。
使由此等文库产生之噬菌体经受三轮针对可溶性生物素标记人类CD40之选择。第一轮噬菌体选择系藉由将噬菌体文库与2%MPBS(补充有2%(w/v)Marvel干脱脂奶粉之磷酸盐缓冲盐水)预混合且添加生物素标记人类CD40(BMS)至最终浓度为于1ml之最终体积中20nM来执行。在室温下,在翻滚混合下培育混合物至少1小时。接着使用50μl M-280抗生蛋白链菌素 (Invitrogen)捕捉抗原-噬菌体复合物且用1ml PBST洗涤7次,随后用1ml PBS洗涤一次。藉由与0.5ml1mg/ml来自牛胰腺之XIII型胰蛋白酶(Sigma Aldrich,UK)于补充有5mM Tris-HCl(pH7.4)、0.1mM CaCl2之PBS中的混合物一起培育而自抗原/珠粒复合物溶离洗涤之噬菌体。使用溶离之噬菌体感染大肠杆菌,且输出噬菌体效价经测定在2×105TU/ml与9×107TU/ml(每毫升之感染单位)之间。
使用自第一轮选择回收之富集噬菌体用最终浓度之2nM生物素标记CD40执行第二轮选择,随后如上所述使用抗生蛋白链菌素珠粒捕捉。输出效价在3×104TU/ml至5×106TU/ml之范围内。
使用2nM生物素标记CD40进行第三轮选择,随后使用抗生蛋白链菌素珠粒捕捉。溶离之噬菌体效价在8×104TU/ml至4×106TU/ml之范围内。
BIAcoreTM筛检
将来自以上第3轮选择输出各自之dAb基因以池形式次选殖至大肠杆菌HB2151中之可溶性表现载体pDOM13(Domantis)中。pDOM13载体亦称为pDOM33且揭示于WO/2008/149143中。此载体允许在大肠杆菌中表现游离dAb且分泌至上清液中。在37℃下,在Costar96孔细胞培养集群(Corning Incorporated,USA)中在250rpm振荡下自各输出选取47个个别菌落且在200μl含有Novagen隔夜表现自体诱导介质(Merck Chemicals,UK)之Terrific培养液(TB)中表现隔夜。在相同培养盘中,用表现适当亲本(野生型)dAb之大肠杆菌接种单一孔。离心培养物以集结细胞,且用BIAcoreTM3000仪器(GE Healthcare)筛检上清液与亲本dAb相比“解离速率”(亦即解离速率常数,kd) 之改良。
将约1600个反应单位(RU)之生物素标记人类CD40(BMS)固定于抗生蛋白链菌素(SA)BIAcoreTM芯片之一个流槽上。将未固定有任何配位体之第二流槽用作参比流槽进行线内参比。用HBS-EP缓冲液(具有0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005%v/v界面活性剂P20之0.01M HEPES(pH7.4),GE Healthcare)以1:3稀释各待分析之dAb上清液。使用仪器之KINJECT功能将10微升各dAb上清液注射于串联之固定CD40之流槽及参比流槽上,线内减去来自参比槽之信号。在25℃及10μl/min之HBS-EP流速下执行实验。各注射完成后,允许在缓冲液中自配位体解离dAb120秒,随后由注射5μl10mM甘氨酸(pH2.0)而再生。使用BIAevaluation4.1软件(GE Healthcare)自各分析物迹线减去参比流槽迹线。使用同一软件来近似拟合分析物迹线之解离阶段的1:1(朗缪尔(Langmuir))动力学模型。此模型产生各克隆之近似解离速率常数(“解离速率”或kd)且允许与野生型dAb进行相对比较。
鉴别除BMS3h-129及BMS3h-197外之所有谱系的解离速率改良之克隆。如上所述,在基于珠粒或基于ELISA之受体结合分析(RBA)中测试解离速率改良之克隆以对效能之改良进行评估。在标注为“易错成熟之克隆”的表中给出由RBA获得之效能量测结果。随后在B细胞增殖分析中测试在RBA中更有效之克隆以评估生物效能之提高,且表17中给出所获得之此等量测结果。亦在多种其他活体外细胞分析中测试在B细胞增殖分析中效能改良之域抗体。
藉由三联体扫描多样化进行亲和力成熟
选择自易错成熟分离的5种效能改良之dAb,亦即BMS3h-37-2、BMS3h-38-2、BMS3h-56-2、BMS3h-193-25及BMS3h-217-23,以藉由三重扫描多样化进一步亲和力成熟。基于如上针对易错文库所述之此等亲本构筑噬菌体文库,其中例外为替代使用易错PCR,使用一系列重迭简并三联寡核苷酸来多样化各dAb之互补决定(CDR)区。对于待亲和力成熟之各dAb,使用含有NNS密码子三联体之寡核苷酸(参见Arkin等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA89:7811-7815)藉由重迭延伸拼接(slicing by overlap extension,SOE)PCR制得各CDR之许多文库。利用寡核苷酸针对两个密码子重迭之既定CDR使三联体多样化,每个CDR产生2至4个文库。BMS3h-37-2文库中多样化之氨基酸残基在位置30、31、32、33、35、50、52、53、55、56、95、96、97及98 (Kabat编号)。BMS3h-38-2文库中多样化之残基如同BMS3h-37-2一般,但添加了位置100。BMS3h-56-2文库中多样化之残基如同BMS3h-37-2一般,但添加了位置100及101。BMS3h-193-25及BMS3h-217-23文库中多样化之残基在位置27、28、30、31、32、34、49、50、51、53、89、91、92、93、94及96。
由此等文库产生之噬菌体藉由CDR混合且如上所述执行选择,其中例外为对于BMS3h-37-2、BMS3h-38-2、BMS3h-56-2及BMS3h-193-25,第1轮、第2轮及第3轮所用抗原之浓度分别为10nM、1nM及0.1nM。对于BMS3h-217-23,第1轮、第2轮及第3轮之所用抗原之浓度分别为20nM、2nM及0.2nM。对于对猕猴CD40具交叉反应性之BMS3h-193-25,亦并行地针对猕猴CD40执行选择。另外,分别在存在或不存在100倍或1000倍过量之未标记CD40之情况下执行第2轮及第3轮选择。在最初使噬菌体与生物素标记抗原一起培育1小时之后添加此竞争剂,且接着如前所述再培育混合物1小时。包括此竞争步骤,目的在于增强对具有较慢解离速率之dAb之选择。第1轮效价在1.4×106至1.4×109之范围内。在无竞争之情况下第2轮之效价为1.3×105至4.0×108,且在有竞争之情况下为8.6×104至1.3×108。在无竞争之情况下第3轮中之效价为1.2×105至1.9×108,且在有竞争之情况下为6.0×105至1.2×108。
如关于易错亲和力成熟所述次选殖且筛检此等选择输出。鉴别除BMS3h-193-25外之所有谱系的解离速率改良之克隆。在ELISA受体结合分析(RBA)中测试解离速率改良之克隆以对效能改良进行评估。在标注为“进一步成熟之克隆”的表中给出由RBA获得之效能量测结果。随后在B细胞增殖分析中测试在RBA中更有效之克隆以评估生物效能之提高,且表17中给出所获得之此等量测结果。亦在多种其他活体外细胞分析中测试在B细胞增殖分析中效能改良之域抗体。
实施例2
使用受体结合分析(RBA)进行筛检
使用若干活体外受体结合分析(RBA)测定实施例1中产生之抗人类CD40可变域氨基酸序列之CD40亲和力。使用三种RBA格式:(1)珠粒RBA、(2)ELISA RBA及(3)CHO细胞RBA。
珠粒RBA:
经磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤之Sphero抗生蛋白链菌素聚苯乙烯粒子(Saxon Europe,UK)用0.5μg/ml生物素标记人类IZ-CD40L(BMS)涂布。涂布 之后,用PBS洗涤生物素标记CD40L粒子且用含0.1%(w/v)胎牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,UK)之PBS分析缓冲液以1:10稀释。在384孔透明底黑色壁培养盘(Applied Biosystems)中,等量组合稀释范围之纯化dAb、0.25μg/ml人类CD40(BMS,CY24FEB06-01)、1/5000小鼠抗人类IgG(Fc)mAb克隆GG-7(Sigma-Aldrich,UK)、0.25μg/ml山羊抗小鼠ALEXA Fluor647(Invitrogen,Molecular probes,UK)及生物素标记CD40L聚苯乙烯粒子且在无光存在下在室温下培育6小时。培育之后,使用相对荧光用AB8200细胞侦测机制(Applied Biosystems)评估dAb相对于人类CD40与生物素标记CD40L粒子之竞争性结合。
ELISA RBA:
在4℃下用25μl1μg/ml中性链亲和素于0.2M碳酸盐碳酸氢盐缓冲液(pH9.4)中之混合物涂布透明壁高结合384孔培养盘(Corning,UK)隔夜。第二天,用0.1%(v/v)吐温PBS缓冲液洗涤分析培养盘,在室温下用含1%(w/v)BSA之PBS阻断1小时且再次洗涤。在移除过量洗涤缓冲液之后,在室温下使25μl1μg/ml生物素标记人类IZ-CD40L(BMS)与该等分析培养盘一起培育1小时。同时,稀释范围之纯化dAb与1μg/ml人类CD40(BMS,CY24FEB06-01)以1:1之比率复合。在洗涤分析培养盘之后,在室温下,在轻微搅动下,在分析培养盘中培育dAb:人类CD40复合物2小时。在1/5000小鼠抗人类IgG(Fc)mAb克隆GG-7(Sigma-Aldrich,UK),随后1/10,000辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)结合之山羊抗小鼠IgG(Fc)第二侦测抗体(Sigma-Aldrich,UK)相继培育下,侦测dAb相对于人类CD40与生物素标记CD40L之竞争性结合。在用1M HCl溶液中和之后,使用SpectraMax M5e培养盘读取器(Molecular Devices)在450nm下量测吸亮度信号。
细胞分析:CD40CHO细胞RBA:
使用凡尔生(Invitrogen)自细胞培养烧瓶分离稳定转染之表现人类CD40之CHO-DG44细胞或天然CHO-DG44细胞(皆为BMS)。将每孔4万个细胞于具有稀释范围之dAb、0.25μg/ml生物素标记人类IZ-CD40L(BMS)及0.25μg/ml抗生蛋白链菌素Alexa Fluor647(Invitrogen,Molecular probes,UK)之0.1%(w/v)BSA PBS分析缓冲液中接种至96孔高结合黑色壁透明底培养盘(Corning,UK)中。在无光存在下培育混合物6小时。培育之后,使用相对荧光用AB8200细胞侦测机制(Applied Biosystems)评估dAb相对于人类CD40 CHO细胞与可溶性生物素标记IZ-CD40L之竞争性结合。
表5至表7分别显示测试之抗人类CD40dAb之初步筛检工作(“未处理克隆”)及后续各轮亲和力成熟(“易错成熟之克隆”及“进一步成熟之克隆”)的结果。
表5
初步筛检工作:
表6
易错成熟之克隆:
克隆 | ELISA RBA之EC50(nM) | 细胞RBA(CHO-CD40)之EC50(nM) |
BMS3h-37-2 | 32 | |
BMS3h-37-4 | 45 | |
BMS3h-37-11 | 27 | |
BMS3h-38-5 | 1000 | |
BMS3h-38-8 | 2800 | |
BMS3h-41-3 | 200 | |
BMS3h-41-10 | 4300 | |
BMS3h-43-3 | 320 | |
BMS3h-43-5 | 90 | |
BMS3h-56-1 | 7.1 | |
BMS3h-56-2 | 17.0 | |
BMS3h-56-5 | 4.9、7.5、4.7 | 18、28 |
BMS3h-56-7 | 5.5 | |
BMS3h-56-8 | 6.2 | |
BMS3h-56-9 | 4.4、5.5 | |
BMS3h-56-16 | 7.0 | |
BMS3h-56-17 | 66 | |
BMS3h-56-18 | 6.5 | |
BMS3h-56-19 | 5.5、5.1 | |
BMS3h-56-20 | 6.8 | |
BMS3h-56-21 | 6.5、6.2 | |
BMS3h-56-22 | 6.5 | |
BMS3h-56-23 | 24.5 | |
BMS3h-56-24 | 11.7 | |
BMS3h-56-25 | 5.5 | |
BMS3h-56-26 | 5.0 | |
BMS3h-56-27 | 16.3 | |
BMS3h-56-28 | 8.9 |
克隆 | ELISA RBA之EC50(nM) | 细胞RBA(CHO-CD40)之EC50(nM) |
BMS3h-56-29 | 9.7 | |
BMS3h-56-30 | 24.2 | |
BMS3h-56-31 | 61.0 | |
BMS3h-193-5 | >300 | |
BMS3h-193-7 | 300 | |
BMS3h-193-10 | 200 | |
BMS3h-193-11 | 300 | |
BMS3h-193-12 | 200 | |
BMS3h-193-15 | 300 | |
BMS3h-193-18 | 100 | |
BMS3h-193-19 | 100 | |
BMS3h-193-25 | 140 | |
BMS3h-193-26 | 100 | |
BMS3h-193-27 | 100 | |
BMS3h-193-29 | 360、114 | |
BMS3h-193-30 | 290、116 | |
BMS3h-198-1 | 12 | 70 |
BMS3h-198-2 | 115 | |
BMS3h-198-3 | 330 | |
BMS3h-198-9 | 20 | |
BMS3h-198-10 | 35 | |
BMS3h-198-11 | 20 | |
BMS3h-198-14 | 9 | |
BMS3h-198-17 | 20 | |
BMS3h-198-19 | 7.9 | |
BMS3h-198-22 | 10 | |
BMS3h-198-31 | 6.1 | |
BMS3h-198-32 | 24.7 | |
BMS3h-198-33 | 8.7 | |
BMS3h-198-34 | 32.6 |
克隆 | ELISA RBA之EC50(nM) | 细胞RBA(CHO-CD40)之EC50(nM) |
BMS3h-198-37 | 15.1 | |
BMS3h-198-38 | 7.2 | |
BMS3h-202-10 | 7200 | |
BMS3h-202-11 | 8300 | |
BMS3h-217-1 | 23 | |
BMS3h-217-2 | 78 | |
BMS3h-217-3 | 32 | |
BMS3h-217-4 | 部分、15 | |
BMS3h-217-5 | 65 | |
BMS3h-217-6 | 26 | |
BMS3h-217-7 | 39 | |
BMS3h-217-8 | 6 | |
BMS3h-217-9 | 53 | |
BMS3h-217-14 | 8 | |
BMS3h-217-15 | 21 | |
BMS3h-217-16 | 9 | |
BMS3h-217-17 | 60 | |
BMS3h-217-23 | 16 |
表7
进一步成熟之克隆:
实施例3
CD40结合动力学
测定初步筛检工作(“未处理克隆”)及后续各轮亲和力成熟(“易错成熟之克隆”)中所鉴别之抗人类CD40dAb的结合动力学。所用之方法直接量测dAb对CD40之亲和力。
使用BIAcoreTM3000仪器(GE Healthcare)分析CD40特异性dAb与CD40之结合动力学。将约600个反应单位(RU)之生物素标记人类CD40(BMS)固定于抗生蛋白链菌素(SA)BIAcoreTM芯片之一个流槽上。将未固定有任何配位体之第二流槽用作参比流槽进行线内参比。用HBS-EP缓冲液(具有0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005%v/v界面活性剂P20之0.01M HEPES(pH7.4),GE Healthcare)制备一系列适当二倍稀释之各待分析之dAb。使用仪器之KINJECT功能一式两份注射180μl各dAb。将各dAb注射于串联之固定CD40之流槽及参比流槽上,线内减去来自参比槽之信号。在25℃及30μl/min之HBS-EP流速下执行实验。在各注射完成后,允许在缓冲液中自配位体解离dAb300秒,随后由注射10μl10mM甘氨酸(pH2.0)而再生。亦在相同条件下注射HBS-EP缓冲液空白参比注射剂(不包含分析物),以用作自各分析物迹线减去之第二参比。使用BIAevaluation4.1软件(GE Healthcare)自各分析物迹线减去参比流槽迹线与缓冲液空白迹线。使用同一软件同时整体拟合分析物稀释液系列迹线之缔合及解离阶段的1:1(朗缪尔)动力学模型。此模型产生相互作用之缔合及解离速率常数(分别为ka及kd)及平衡解离常数(KD);此等常数详示于表8及表9中。
表8
未处理克隆:
表9
易错成熟之克隆
实施例4
生物物理表征
藉由生物物理参数之分析进一步表征初步筛检工作(“未处理克隆”)及后续各轮亲和力成熟(“易错成熟之克隆”及“进一步成熟之克隆”)中所鉴别之抗人类CD40dAb。为了量测dAb之相对稳定性,藉由差示扫描热量测定法(differential scanning calorimetry,DSC)测定其熔点。具有较高熔融温度之dAb更稳定。为了测定dAb是否在溶液中形成多聚聚集体,藉由尺寸排阻层析法/多角雷射光散射(size exclusion chromatography/multiangle laser light scattering,SEC-MALLS)分析dAb。结果示于表10至表12中。
表10
未处理克隆:
表11
易错成熟之克隆:
表12
进一步成熟之克隆:
实施例5
竞争分析
使用BIAcoreTM3000仪器(GE Healthcare)分析CD40特异性dAb是否结合相同CD40抗原决定基。将约600个反应单位(RU)之生物素标记人类CD40(BMS)固定于抗生蛋白链菌素(SA)BIAcoreTM芯片之一个流槽上。将未固定有任何配位体之第二流槽用作参比流槽进行线内参比。用HBS-EP缓冲液(具有0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005%v/v界面活性剂P20之0.01M HEPES(pH7.4),GE Healthcare)制备适当稀释之各待分析之dAb或Fab。所选稀释液为在如下文所述注射时对于特定抑制剂(典型地为1μM至10μM)产生>80%之最大可能结合RU的稀释液。接着,制备与上文(在相同最终浓度下)相同之dAb或Fab与待进行竞争分析之第二dAb或Fab的混合物。使用仪器之COINJECT功能将60μl单一抑制剂稀释液注射于串联之固定CD40之流槽及参比流槽上,随后立即注射60μl两抑制剂混合物。藉由仪器之控制软件线内减去来自参比槽之信号。在25℃及30μl/min之HBS-EP流速下执行实验。各次共注射完成后,允许在缓冲液中自配位体解离抑制剂60秒,随后由注射10μl10mM甘氨酸(pH2.0)而再生。记下获得之第二注射剂(两抑制剂之混合物)之最大RU且表示为单独注射时获得之相同抑制剂的RU之百分比。
若第二抑制剂保留在单独注射其时通常结合之RU的至少100%,则此表示两种抑制剂结合至个别抗原决定基。若观测到第二抑制剂之结合小于100%,则此指示两种抑制剂之间结合至CD40的竞争。此竞争存在若干可能原因:两种抑制剂可结合至同一或重迭抗原决定基,可能存在结合之空间抑制,或第一抑制剂之结合可能诱发能阻止或减少第二抑制剂结合之抗原构形变化。
测试来自各谱系之实施例克隆(BMS3h-217除外)与重迭群组中之其他dAb之竞争。如表13及表14中所示,所有所测试之dAb似乎会彼此竞争结合于CD40。此数据表明所有选自由谱系BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-41、BMS3h-43、BMS3h-56、BMS3h-131、BMS3h-198及BMS3h-202组成之群的抗体多肽应与来自任一此等谱系之dAb与人类CD40的结合竞争。
表13
竞争BIAcoreTM:
表14
类似地,如表15及表16中所示,测试各种dAb与Chi220Fab'之竞争。在此情况下,所有dAb不与Chi220Fab'竞争,其中例外为BMS3h-217,其显示竞争。在结合之Chi220或G28-5Fab'存在下,BMS3h-56-5及BMS3h-193-12dAb以至少100%之单一dAb RU结合,从而表明Fab'结合与dAb不同之抗原决定基。Chi220Fab'显示在G28-5存在下结合RU降低。在相反次序之结合中观 测到相同之结果。此表明G28-5Fab'结合与Chi220Fab'相同之抗原决定基。
表15
表16
实施例6
CD40活性分析
功能上分析抗人类CD40dAb拮抗CD40活性之能力。所测试之CD40活性为藉由hCD40L驱动之初级人类单核细胞衍生之树突状细胞(dendritic cells,DC)活化进行之B细胞增殖及细胞激素产生。除非另外说明,否则所有分析均在补充有10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)之RPMI培养基中执行。使用各种分析得到之结果示于表17中。
可溶性IZ-hCD40L驱动之初级人类B细胞增殖:
在96孔圆底培养盘中以每孔200μl之最终体积用0.6μg/ml IZ-hCD40L以及不同滴定量之抗体多肽培育1×105个扁桃体人类B细胞。在37℃下培育培养盘72小时,接着添加胸腺嘧啶核苷(3H;0.5μci/孔)6小时。基于胸腺嘧啶核苷并入法定量B细胞增殖。
CHO-hCD40L驱动之初级人类B细胞增殖:
用人类CD40L转染CHO细胞以产生以较高CD40L表现程度表现于细胞表面上之稳定细胞株。以10,000拉德(Rad)照射CHO-CD40L细胞,随后用人类B细胞培育。在96孔圆底培养盘中以每孔200μl之最终体积用1×103个CHO-CD40L细胞(CHO-CD40L:人类B细胞之比率为1:100)以及不同滴定量之抗体多肽培育1×105个扁桃体人类B细胞。在37℃下培育培养盘72小时,随后添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.5μci/孔)6小时。基于胸腺嘧啶核苷并入法定量B细胞增殖。
可溶性IZ-hCD40L驱动之猕猴脾人类B细胞增殖:
在96孔圆底培养盘中以每孔200μl之最终体积用0.5μg/ml IZ-hCD40L以及不同滴定量之抗体多肽培育1×105个猕猴脾B细胞。在37℃下培育培养盘72小时,随后添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.5μci/孔)6小时。基于胸腺嘧啶核苷并入法定量B细胞增殖。
初级T细胞驱动之人类B细胞增殖:
自人类周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)分离T细胞且使用绵羊红血球(sheep red blood cell,SRBC)花结法富集。藉由将扁桃体组织均质化于单细胞悬浮液中分离人类扁桃体B细胞。藉由菲科尔分离(ficoll separation)获得白血球,接着使用SRBC花结法被动选择B细胞且藉由去除花结细胞来富集。
在37℃下用PM-LCL(EBV转化B细胞株;以10,000拉德照射)以5:1之比率(T:LCL)培养富集人类T细胞6天以产生同种异体T细胞群。在第6天,分离扩增之T细胞且以3000拉德照射,且接着在涂有抗CD3mAb(OKT3)之96孔平底培养盘中,用初级人类扁桃体B细胞(每孔1×105个B细胞)以1:2之比率培养(每孔5×104个T细胞)。将不同滴定量之抗体多肽添加至各孔中;各孔之最终体积为200μl。在37℃下培育测试培养盘3天。在最后18小时内经由添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.5μci/孔)至培养物中测定人类B细胞增殖。
CHO-hCD40L驱动之初级人类单核细胞衍生之树突状细胞(DC)活化:
藉由经由SRBC花结法去除T细胞来使人类PBMC富集单核细胞。在37℃,下在6孔培养盘中用10ng/ml GM-CSF及5ng/ml IL-4培养富集单核细胞之PBMC6天。在第2天及第5天用新鲜培养基(具有GM-CSF及IL-4)补充所培养之培养盘。在细胞分析中在第6天使用未成熟树突状细胞(DC)。在96孔平底培养盘中,用4×103个CHO-hCD40L细胞(以10,000拉德照射)以及不同滴定量之抗体多肽培养8×104个未成熟DC。24小时后,收集上清液且测试各种细胞激素(IL-12、TNF、IL-23)之存在。DC活化藉由细胞激素之产生量来测定。
表17
实施例7
结合CD40及血清白蛋白之双特异性dAb
构筑特异性结合CD40及人类血清白蛋白(HSA)或猕猴血清白蛋白(CSA)之双特异性dAb且在基于细胞之分析中测试其活性。白蛋白特异性dAb称为“AlbudAb”。在此实施例中,AlbudAb融合物包含结合CD40之BMS3h dAb及识别HSA之另一域抗体DOM7h。将两种dAb在框架中融合至氨基酸连接子之胺基及羧基末端以形成串联融合(inline fusion,ILF)多肽。ILF多肽以重组方式表现为单一融合蛋白。表明AlbudAb ILF之活性的RBA描述于下文,且结果示于表18中。表19概述所测试AlbudAb ILF中所用之连接子序列。藉由BIAcoreTM分析测定之动力学结合数据示于表20中。
在上清液中侦测dAb之人类CD40CHO细胞ELISA:
使用0.25%胰蛋白酶EDTA自细胞培养烧瓶分离稳定转染之表现人类CD40之CHO-DG44细胞或天然CHO-DG44细胞(皆为BMS),且将每孔100,000个细胞于生长培养基中接种至96孔组织培养物处理之培养盘(NUNC)中。在37℃、5%CO2下,在湿润氛围中使细胞黏附隔夜。分析当天,用PBS洗涤细胞片,随后用2%三聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定20分钟。固定之后,再用PBS洗涤细胞片,随后用含15%胎牛血清(FBS,PAA)之PBS阻断1小时。再洗涤培养盘一次,随后添加每孔100μl dAb上清液且在室温下培育2小时。用细胞培育dAb上清液之后,洗涤培养盘且视dAb为VH或VL域而定由培育辣根过氧化物酶(HRP)结合物抗蛋白质A或L来侦测dAb结合。在用1M HCl中和之后,使用SpectraMax M5e培养盘读取器(Molecular Devices)在450nm下量测吸亮度信号。
ICAM-1上调细胞分析:
使用凡尔生(Invitrogen)自细胞培养烧瓶分离稳定转染之表现人类CD40L之COS细胞。将每孔20,000个细胞于分析缓冲液(无酚红(Sigma-Aldrich,UK)+1%青霉素/链霉素+10%FBS Gold(皆来自PAA Laboratories,UK)之RPMI1640)中接种至96孔高结合黑壁透明底培养盘(Corning,UK)中。在37℃及5%CO2下,在湿润氛围中使细胞黏附隔夜。第二天,用100μl新鲜分析缓冲液补充含有非附着细胞之废分析缓冲液。为此,除稀释范围之dAb之外,在分析缓冲液中添加每孔20,000个RAMOS细胞。将分析培养盘再放回37℃及5%CO2下之湿润氛围中24小时。对于阴性对照孔,不添加RAMOS细胞。dAb抑制RAMOS细胞之细胞表面上的ICAM-1响应暴露于COS细胞之细胞表面上的CD40L而上调之能力藉由添加0.5μg/ml小鼠抗人类ICAM-1抗体(R&D systems)及0.2μg/ml山羊抗小鼠ALEXA flour647(Invitrogen,Molecular probes,UK)来评估。在无灯存在下3小时培育期之后,如由AB8200细胞侦测平台(Applied Biosystems)所量测来侦测相对荧光。
结合至血清白蛋白之串联融合(ILF)动力学分析
使用BIAcoreTM3000仪器(GE Healthcare)分析抗CD40-AlbudAb ILF对人类及猕猴血清白蛋白之结合动力学。使用胺偶合套组(GE Healthcare)将约400反应单位(RU)之人类血清白蛋白(HSA)或猕猴血清白蛋白(CSA)固定于CM5BIAcoreTM芯片之流槽上。将未固定有任何配位体之第二流槽用作参比流槽进行线内参比。用HBS-EP缓冲液(具有0.15M NaCl、3mM EDTA及0.005%v/v界面活性剂P20之0.01M HEPES(pH7.4),GE Healthcare)制备一系列适当二倍稀释之各待分析之dAb。使用仪器之KINJECT功能一式两份注射两种100微升各ILF。在串联之固定血清白蛋白之流槽及参比流槽上进行注射,线内减去来自参比槽之信号。在25℃及40μl/min之HBS-EP流速下执行实验。各注射完成后,允许在缓冲液中自配位体解离dAb120秒,随后由注射10μl10mM甘氨酸(pH2.0)而再生。亦在相同条件下注射HBS-EP缓冲液空白参比注射剂(不包含分析物),以用作自各分析物迹线减去之第二参比。使用BIAevaluation4.1软件(GE Healthcare)自各分析物迹线减去参比流槽迹线与缓冲液空白迹线。使用同一软件同时整体拟合分析物稀释液系列迹线之缔合及解离阶段的1:1(朗缪尔)动力学模型。此模型产生相互作用之缔合及解离速率常数(分别为ka及kd)及平衡解离常数(KD)。参数值示于表20中。
表21列出可特异性结合CD40及HSA或CSA之代表性AlbudAb ILF之氨基酸序列。各ILF之名称鉴别特定连接符序列:“GxS”意谓连接符具有“x”个甘氨酸残基之后为丝氨酸,且“(GxS)y”意谓连接符具有y个GxS之重复单元。表22揭示编码表21中所列之ILF序列之代表性核酸。如此项技术中所熟知,多个密码子可编码同一氨基酸。因此,编码蛋白质序列之核酸包括具有密码简并性之核酸。
表21
双特异性dAb氨基酸序列
(表21揭示分别如SEQ ID NO5至7、1207至1209及8所示之“AST”、“TVAAPS”、“TVA”、“G4S”、“(G4S)3”、“(G4S)5”及“ASTSGPS”)
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DMS0681DOM7h-11-90-(G4S)5-BMS3h-56-258
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DMS0682BMS3h-56-258-TVA-DOM7h-11-90
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DMS0683BMS3h-56-258-ASTSGPS-DOM7h-11-90
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DMS0684BMS3h-56-258-G4S-DOM7h-11-90
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFYFHEWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1236)
DMS0685BMS3h-56-258-(G4S)3-DOM7h-11-90
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DMS0686BMS3h-56-258-(G4S)5-DOM7h-11-90
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFYFHEWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQKPGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1238)
DMS0688DOM7h-11-90-TVAAPS-BMS3h-56-258
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表22
编码双特异性dAb之多核苷酸
(表22揭示分别如SEQ ID NO5至7、1207至1209及8所示之“AST”、“TVAAPS”、“TVA”、“G4S”、“(G4S)3”、“(G4S)5”及“ASTSGPS”)
DMS0654BMS3h-56-201-AST-DOM7h-11-3
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DMS0655BMS3h-56-201-AST-DOM7h-11-87GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCATACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1241)
DMS0656BMS3h-56-258-AST-DOM7h-11-3
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCACGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1242)
DMS0657BMS3h-56-258-AST-DOM7h-11-87
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCACGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCATACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1243)
DMS0658DOM7h-11-3-TVAAPS-BMS3h-56-201
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1244)
DMS0659DOM7h-11-87-TVAAPS-BMS3h-56-201
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCATACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1245)
DMS0660DOM7h-11-3-TVAAPS-BMS3h-56-258
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCACGAGTGG GGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1246)
DMS0661DOM7h-11-87-TVAAPS-BMS3h-56-258
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCATACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCACGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQID NO:1247)
DMS0662DOM7h-11-90-TVAAPS-BMS3h-56-201
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1248)
DMS0663DOM7h-11-86-TVAAPS-BMS3h-56-201
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1249)
DMS0664DOM7h-11-69-TVAAPS-BMS3h-56-201
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGGTGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAG CGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCAGGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1250)
DMS0667DOM7h-11-3-TVAAPS-BMS3h-38-240
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGAGGAGGAGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAGGAACGGTTACAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGGGAAAGAGCCGTTTCGTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1251)
DMS0668BMS3h-38-240-AST-DOM7h-11-3
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGAGGAGGAGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAGGAACGGTTACAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGGGAAAGAGCCGTTTCGTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:1252)
DMS0669DOM7h-14-10-TVAAPS-BMS3h-38-240
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGAGGAGGAGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAGGAACGGTTACAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGGGAAAGAGCCGTTTCGTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1253)
DMS0670BMS3h-38-240-AST-DOM7h-14-10
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GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGACGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACCGTGGCGGCGCCGAGTGAGGTGCAGCTGTTGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGAGGAGGAGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAGGAACGGTTACAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGGGAAAGAGCCGTTTCGTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1257)
DMS0675DOM7h-11-90-TVAAPS-BMS3h-38-235
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCA GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACCGTGGCGGCGCCGAGTGAGGTGCAACTGTTGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGAGGAGGAGATGATTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAGGAACGGTTACAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGGGAAAGAGCCGTTTCGTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1258)
DMS0677DOM7h-11-90-TVA-BMS3h-56-258
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGATGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCTTGCTTTTTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGCGCGCAGGCTGGGACGCATCCTACGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGGGATTATGAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGCGGGTCTCAGCTATTAATCCGCAGGGTACGCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTTCCGTTTTACTTTCACGAGTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO:1259)
DMS0678DOM7h-11-90-ASTSGPS-BMS3h-56-258
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实施例8
抗猕猴CD40dAb
本文所揭示之产生特异性结合人类CD40之抗体多肽之方法可用以产生特异性结合其他物种之CD40之抗体多肽。举例而言,可使用目前揭示之方法产生抗猕猴CD40(anti-cynomolgus/anti-cyno)抗体多肽。举例而言,可使用相同之初始/初步筛检及亲和力成熟流程产生抗猕猴CD40抗体多肽,作为抗人类CD40dAb。且以下表23中揭示获得抗猕猴CD40dAb之方法且提供抗猕猴CD40dAb之代表性实施例。
ELISA RBA:
在4℃下,透明壁高结合384孔培养盘(Corning,UK)用25μl1μg/ml中性链亲和素于碳酸盐缓冲液中之溶液涂布隔夜。第二天,用0.1%吐温PBS缓冲液洗涤分析培养盘,在室温下用含1%BSA之PBS阻断1小时,且再次洗涤。移除过量洗涤缓冲液之后,在室温下用分析培养盘培育25μl1μg/ml生物素标记人类IZ-CD40L(BMS,1.2mg/ml储备液浓度)1小时。同时,稀释范围之纯化dAb与1μg/ml猕猴CD40(BMS)以1:1之比率复合。洗涤分析培养盘之后,在室温下,在轻微搅动下,在分析培养盘中培育dAb:猕猴CD40复合物2小时。用辣根过氧化物酶(HRP)结合之抗人类(Fc)二次抗体(Sigma-Aldrich,UK)侦测dAb相对于猕猴CD40与生物素标记CD40L之竞争性结合。在用1M HCl中和之后,在450nm下,使用Spectromax M5e培养盘读取器(Molecular Devices)量测吸亮度信号。
使用AB8200FMAT之猕猴CD40CHO细胞RBA:
使用凡尔生(Invitrogen)自细胞培养烧瓶分离稳定转染之表现猕猴CD40之CHO-DG44细胞或天然CHO-DG44细胞(BMS)。将每孔40,000个细胞于具有稀释范围之dAb、0.25μg/ml生物素标记人类IZ-CD40,000L(BMS,1.2mg/ml储备液浓度)及0.25μg/ml抗生蛋白链菌素Alexa Fluor647(Invitrogen,Molecular probes,UK)之0.1%BSA PBS分析缓冲液中接种至96孔高结合黑色 壁透明底培养盘(Corning,UK)中。在无光存在下培育混合物6小时。培育之后,如用AB8200细胞侦测平台(Applied Biosystems)所量测,使用相对荧光评估dAb相对于猕猴CD40CHO细胞与可溶性生物素标记IZ-CD40L之竞争性结合。
CHO-hCD40L驱动之初级人类B细胞增殖:
用人类CD40L转染CHO细胞(ATCC)以产生以较高CD40L表现程度表现于细胞表面上之稳定细胞株。以10,000拉德照射CHO-CD40L细胞,随后用人类B细胞培育。在96孔圆底培养盘中以每孔200μl之最终体积用1×103个CHO-CD40L细胞(CHO-CD40L:人类B细胞之比率为1:100)以及不同滴定量之dAb或单株抗体培育1×105个扁桃体人类B细胞。在37℃下培育培养盘72小时,随后添加胸腺嘧啶核苷(3H;0.5μci/孔)6小时。基于胸腺嘧啶核苷并入法定量B细胞增殖。除非另外说明,否则所有分析均在补充有10%胎牛血清(FCS)之RPMI培养基中执行。
可溶性IZ-hCD40L驱动之猕猴脾B细胞增殖:
在96孔圆底培养盘中以每孔200μl之最终体积用0.5μg/ml IZ-hCD40L以及不同滴定量之dAb或mAb培育1×105个自食蟹猕猴脾脏分离之B细胞。在37℃下培育培养盘72小时,在此之后添加3H-胸腺嘧啶核苷(μci/孔)6小时。基于胸腺嘧啶核苷并入法定量B细胞增殖。除非另外说明,否则所有分析均在补充有10%胎牛血清(FCS)之RPMI培养基中执行。
表23
实施例9
抗人类CD40 dAb不结合猕猴CD40
如同人类CD40中,但猕猴CD40具有Leu109残基替代Trp109。以下复制长尾猕猴CD40之氨基酸序列:
使用流式细胞测量方法测试抗人类CD40 dAb与食蟹猕猴、恒河猴及黑猩猩血液中B细胞及来自狨猿血液之淋巴细胞之交叉反应性。以下详述之程序概述用于多个实验中侦测CD40 dAb之方法。表24中所示之结果表明抗人类CD40 dAb不结合猕猴CD40。此情况与上文所揭示之迹象(参见图1及图2)一致,人类CD40中之Trp109(猕猴CD40中不存在)对于dAb与人类CD40之间的复合物形成十分重要。
方法:
在37℃下用旋转器使聚乙二醇化抗人类CD40 dAb (BMS3h-56-5C-40L及BMS3h38-2C-P40Br)或生物素结合dAb (BMS3h38-2-生物素)与人类及灵长 类动物血液样品一起培育1小时。将100μl各血液样品等分至12×75mm管中且用FACS缓冲液(0.5%FBS/PBS/0.1%迭氮化钠)洗涤3次。在1500rpm下将管离心5分钟,且在洗涤之间倾析上清液。洗涤之后,将管置于冰上且与人类IgG一起培育5分钟以经由Fc受体阻断非特异性结合。
对于聚乙二醇化dAb侦测,将抗PEG抗体(克隆CH-2074,Silver Lake Research,或克隆2-2,Open Biosystems)添加至管中且培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤样品一次,接着在冰上用APC标记CD20抗体(克隆2H7,BDBiosciences)及PE标记抗小鼠IgG(具Fcγ1特异性;Calbiochem)再培育30分钟。
对于生物素结合dAb侦测,将PE标记抗生蛋白链菌素(Invitrogen)及APC标记CD20抗体(克隆2H7,BD Biosciences)添加至管中且在室温下培育30分钟。
另外,为量测人类及灵长类动物血液之CD40含量,在室温下用与灵长类动物物种(克隆5C3,BD Biosciences)交叉反应之APC标记CD20抗体(克隆2H7,BD Biosciences)及PE标记抗人类CD40抗体培育各血液样品之等分试样30分钟。
为在侦测抗体培育之后溶解红血球且固定白血球,将FACS溶解溶液(BD Biosciences)添加至所有管中,且在室温下培育样品15分钟。离心样品且再悬浮于FACS溶解溶液中,且经BD FACSCantoTM藉由流式细胞测量术分析,对CD20+B细胞设门进行分析。对于狨猿样品,CD20抗体不具有交叉反应性;因此对如前向及侧向散射特性(尺寸)所鉴别之所有淋巴细胞执行分析。
结果:
根据上文方法,在人类及灵长类动物血液样品中测试聚乙二醇化及生物素标记抗人类CD40dAb之结合。侦测到抗人类CD40dAb结合至人类血液样品中之CD20+B细胞。相反,在猕猴、恒河猴或黑猩猩血液样品中之CD20+B细胞上或在狨猿血液样品中之淋巴细胞上未侦测到聚乙二醇化及生物素标记dAb之结合。BMS3h-38-2C-P40Br dAb之结果示于图3画面A及画面B中。其他dAb获得类似结果。使用与灵长类动物CD40交叉反应之抗人类CD40抗体确定人类及灵长类动物物种之B细胞上CD40之可比含量。此等资料指示来自BMS3h-56及BMS3h-38谱系之人类CD40dAb不能结合灵长类动物物种中之CD40。该等数据与CD40与抗CD40dAb之间形成复合物中Trp109残基之重要性一致,如图1及图2中所示。
实施例10
CD40与dAb BMS3h-56-5之间的复合物之X射线结晶学
数据收集及处理:
在人类CD40(SEQ ID NO:1)/BMS3h-56-5(SEQ ID NO:321)复合物之结构测定期间分析两种不同晶体形式。自CD40/BMS3h56-5复合物之晶体收集数据,骤冷且维持于100K,且安装于Rigaku AFC-9测角器上。X射线源为使用具有MicroMaxTM共焦光学器件及Saturn92侦测器之铜目标的Rigaku FR-E。在极高冗余度下收集数据以增加硫反常绕射信号,希望使用彼信号以使数据分阶段。用HKL2000处理数据(HKL Research;Otwinowski等人,In Methods Enzymol.Macromolecular Crystallography第A部分,Carter等人编,第276卷,第307-326页,Academic Press,Inc.,New York,NY(1997))。此晶体之数据收集统计概述于下文及表24中:
空间群:I222;
镶嵌度为0.59至0.84;排斥观测:1028;0.06%。
表24
由骤冷至100K且安装于Rayonix MX-225侦测器上之晶体在加拿大光源束线CMCF1(Canadian Light Source beamline CMCF1)(08-ID-1)下收集第二晶形,且波长为此等数据藉由夏姆洛克结构(Shamrock Structures)(R.Walter及G.Ranieri)收集且用HKL2000处理。此晶体之数据收集统计概述于下文及表25中:
空间群:C2;
镶嵌度为0.62至0.71;排斥观测:70;0.08%。
表25
分子置换模型:
dAb之模型BMS3h-56-5系源自PDB ID2VYR链E残基1至124,其中与CDR31至35、50至57及99至111对应之连续残基藉由SPLIT_PDB(其与kabat编号31至35、50至56及95至100G)对应移除,且接着穿过MUTATE且最终藉由RENUMBER重新编号。MUTATE使非一致残基变为最小一致,亦即通常Ala或Gly,但例如Tyr→Phe及Phe→Tyr将产生Phe。其不会建立任何原子,但对于Thr→Val、Val→Thr、Cys→Ser及Ser→Cys,其将取代适当原子名称,而不会改变位置。RENUMBER将编号变为Kabat编号(Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第5版,美国健康与人类服务部,Washington,D.C.(1991)),其为直接描述CDR及构架残基之抗体之标准编号系统。
使用phenix.ensembler(University of Cambridge,UK),自PDB IDs1JMA(链B)、1NCF(链A)、1TNR(链R)、2HEV(链R)、2HEY(链R,T)及2UWI(链A、B)构筑CD40模型,产生结构集合。此等分子之N端(残基24至78)加6个残基区段(残基95至100)可与Cα原子之可接受之均方根距离重迭,且用作CD40之N端区之模型。
分子置换方法:
使用程序PHASER(McCoy等人,J.Appl.Crystallogr.40:658-674(2007))进行分子置换。监测转译功能Z分数(translation function Z-score,TFZ)及对数似然增益增加,判定是否存在实际溶液。8及8以上之TFZ分数一般表示溶液。较小之TFZ分数伴随对数似然增益之实质增加(>50)亦为可接受之指示。
模型建立、密度改良及结晶改进方法:
用于分子图形之模型建立手段包括COOT程序(Emsley等人,Acta Crystallogr Sect.D60:2126-2132(2004);Emsley等人,“Features and Development of Coot”,Acta Crystallogr Sect.D66:486-501(2010))。使用已知密度改良程序及计算分子之间的欧拉角(Eulerian angle)及平移的其他程序执行使用非结晶对称图平均法之密度改良。使用自动BUSTER进行改进(GlobalPhasing,Ltd.:Bricogne等人,Acta Crystallogr.Sect.D60:2210-2221 (2004);Tronrud等人,Acta Crystallogr.Sect.A43:489-501(1987))。
域抗体编号系统:
用于域抗体之残基编号系统遵循Kabat。以下比较BMS3h-56-5之Kabat编号与直顺序编号:
在Kabat编号中,BMS3h-56-5具有插入残基52A、82A、82B、82C,且遗漏残基100。在两种编号系统中,给予作为表现构筑体之一部分的N端之Ser及Thr负编号。
测定CD40/BMS3h-56-5复合物之结构:
PHASER能够将4个BMS3h-56-5dAb分子定位于I222晶形中且将3个BMS3h-56-5dAb分子定位于C2晶形中。在I222晶形中,TFZ分数在7.6至41.0之范围内,且对数似然增益之增加在77至446之范围内。用于BMS3h-56-5dAb分子之此等溶液经由I222晶体形成螺旋状dAb分子行,其藉由大信道与其他 行分离。在C2晶形中,TFZ分数在7.7至16.5之范围内,且对数似然增益之增加在110至150之范围内。将dAb包装于此晶形中并不重复或对称。
使用CD40N端结构域之集合模型,可将CD40之N端结构域之4个分子置于I222晶形中,其中TFZ分数在5.7至8.5之范围内,且对数似然增益之增加在83至389之范围内。I222晶形中CD40之4个N端结构域在4行dAb分子之间的正中心形成凝块。然而,其不会触碰BMS3h-56-5dAb分子。在C2晶形中置放CD40之N端结构域之3个分子,其中TFZ分数在5.8至12.1之范围内,且对数似然增益之增加在100至198之范围内。在此晶形中,N端结构域亦不接触BMS3h-56-5dAb分子。
在I222晶形中,可将来自CD40/Chi220Fab复合物之CD40之N端结构域及来自2UWI之N端结构域重迭于CD40N端结构域上。将N端与特定BMS3h-56-5dAb关联之能力允许使用非结晶对称(NCS)图平均法。NCS平均法之起始相关系数得到非对角值为0.71至0.81。最终非对角值为0.88至0.92。接近于N端区之电子密度是清楚的,且可追踪BMS3h-56-5dAb之CDR3之路径。将来自CD40/Chi220Fab'复合物之残基82至94及101至121重迭于2UWI上之相应残基上,且接着使用COOT手动改良拟合。接着将CD40之第二结构域(残基82至94及101至121)之此位置变换至其他三个N端结构域上。
进行一个改进周期,其中自由剩余值(R-free)由0.437降至0.380且加工剩余值(R-work)由0.447降至0.381,与理想之均方根键及角偏差有所改良。所得电子密度图显示残基109具有与Trp一致之侧链,且显示CD40之C端70个残基中之至少一些残基所存在之密度。
因为CD40具有小二级结构,从而证明使C端约70个残基与电子拟合困难,所以搜索结构生物学合作研究协蛋白质数据库(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Base)之适当模型以有助于引导链追踪。44个中有16个一致及44个中有24个匹配之前两个采样数为2AW2及1JMA,其具有相同序列:
一致残基以适当单一字母码记录于共同序列在线,且类似残基以星号记录于共同序列在线。此情况与CD40之N端结构域之残基41至84具有相同残基段:
一致残基以适当单一字母码记录于共同序列在线,且类似残基以星号记录于共同序列在线。
匹配双硫键:
比较CD40之残基41至84及125至168中之双硫键
残基41至84残基125至168
C41-C59C125-C143
[C38]-C51
C62-C77C146-C161
C83[-C103]C167[-C186]
括号中之残基不属于序列重复中之残基范围。
以1JMA/2AW2模型作为指导,使用COOT程序拟合一个CD40链。接着将此拟合模型重迭于其他3个CD40链中之一者上。然而,似乎在其他两个CD40链中此新颖残基段之位置定向不用,且此时其不能拟合。进行一个改进周期,其中自由剩余值由0.393降至0.366且加工剩余值由0.400降至0.349,与理想之均方根键及角偏差有相当大改良。
将来自I222晶形中之一个分子的BMS3h-56-5dAb重迭于C2晶形中之3个dAb中之每一者上。使用彼变换矩阵定向I222晶形之第二及C端结构域。使用COOT程序重建该模型。进行一个改进周期,其中自由剩余值由0.361降至 0.334且加工剩余值由0.375降至0.306,与理想之均方根键及角偏差有所改良。所得电子密度图对置放更多CD40残基提供指导。进行另一改进周期,其中自由剩余值由0.302降至0.287且加工剩余值由0.299降至0.270,与理想之均方根键及角偏差有所改良。
接着使用习知模型建立及改进完成结构测定。若干轮优化产生具有以下统计量之最终改进:自由剩余值0.260,加工剩余值0.228,均方根键均方根角1.4°。主链原子之真实空间相关系数为约0.92且侧链原子之真实空间相关系数为0.80。最终模型具有13个水分子。
使用来自C2晶形之C端结构域之模型作为指导,使I222晶形中之CD40模型进一步改进。若干周期使用COOT程序建立模型及用自动BUSTER程序改进产生以下统计量:自由剩余值0.323,加工剩余值0.292,均方根键,均方根角1.5°。主链原子之真实空间相关系数为0.91且侧链原子之真实空间相关系数为0.80。该模型不包含水分子。
CD40/BMS3h-56-5复合物之整体结构:
一个BMS3h-56-5dAb结合至一个CD40分子。如图1中所示,BMS3h-56-5结合至不同于抗体Chi220之抗原决定基,其在N末区中结合。CD40残基(SEQ ID NO:1)显示为绿色,抗原决定基残基除外。Chi220之CD40抗原决定基残基显示为蓝色;BMS3h-56-5dAb抗原决定基残基显示为青色。Chi220Fab及BMS3h-56-5β-股显示为红色,CDR残基显示为洋红色,且其他环显示为橙色。具有硫原子之CD40、Chi220及BMS3h-56-5分子之双硫键显示为黄色。
I222晶形含有4个结晶学独立CD40/BMS3h-56-5复合物,且C2晶体含有3个结晶学独立CD40/BMS3h-56-5复合物。CD40分子具有一定量之可挠性,且结构域以7种唯一复合物型式不同地排列,但在所有情况下均保留相互作用之总体性质。
BMS3h-56-5dAb抗原决定基残基:
BMS3h-56-5之最小CD40抗原决定基定义为含有至少一个与BMS3h-56-5原子之凡得瓦尔或氢键接触之原子的CD40残基。所有复合物中之最小抗原决定基含有以下关于SEQ ID NO:1之CD40残基:Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162。在一些复合物中以下其他残基以凡得瓦尔或氢键接触:Pro85、Asn86、Leu87、Gly88、Glu106、Glu107、Gly108、His110、Thr112、Cys119、Val120、Gln133、Ile134、 Ala135、Thr136、Ser155、Lys160。
最大CD40抗原决定基定义为含有藉由探针球内埋之原子的残基。此等残基包括以上所有残基加所有复合物中之Val154。在一些复合物中,其他内埋残基为:Ser118、Arg123、Thr141、Phe151、Asp153、Cys161及Pro163。
具有接触残基之BMS3h-56-5之表面的描述示于图2中。显示接触BMS3h-56-5残基。亦显示内埋残基。CD40表示为用橙色表示非重复二级结构且用洋红色表示抗原决定基残基之草图。亦显示为棒(呈青色之碳原子)的是CD40残基Trp109、Ala115、Leu121、Ser126及His162,其为人类与食蟹猕猴(长尾猕猴)之间不同之七种残基中之五者。Ala115及Ser126位于CD40之BMS3h-56-5结合位点之相对侧。Trp109及Leu121在位于CDR-3与FR-2(BMS-3h-56-5残基Leu45及Arg47)之间的BMS-h-56-5之间隙中结合。CD40之His162与BMS3h-56-5dAb之CDR-2之Arg56相互作用。Trp109之突变会显著降低或消除BMS3h-56-5活性。
视结晶学独立复合物而定,660至之CD40表面积由16至21个接触残基(更精确地表示为46至67个接触原子)内埋。对于BMS3h-56-5,660至 之表面积由14至17个接触残基(更精确地表示为48至62个接触原子)内埋。视结晶学独立复合物而定,此等接触产生3至7个氢键及111至142凡得瓦尔作用力。
实施例11
鉴别CD40上之dAb结合抗原决定基
为了鉴别CD40上之dAb结合抗原决定基,针对七种在残基76、109或121处含有特定氨基酸残基取代之CD40-Fc融合蛋白测试dAb结合。此等CD40-Fc融合蛋白包括野生型人类CD40(wt-hCD40)、野生型食蟹猕猴CD40(wt-cCD40)及特定氨基酸残基突变为来自食蟹猕猴CD40(M1、M2、M4、M5)或黑猩猩CD40(M3)之序列之相应残基的五种突变型人类CD40蛋白(M1至M5)。氨基酸取代列于表26中。
野生型人类CD40细胞外域(1至193)之序列系来自REFSEQ:寄存编号NM_001250.3。在表26所示之位置使用野生型序列之定点突变诱发产生猕猴及突变型构筑体。细胞外域与凝血酶可裂解连接符DPGGGGGRLVPRGFGTGDP(SEQ ID NO:1273)融合,该凝血酶可裂解连接符与人类IgG1Fc融合。该等蛋白质表现于用TIG-pYD7-GATE Durocher表现 载体转染之HEK-293-6E细胞中。五天之后收集上清液。使用蛋白质A速流层析自条件培养基纯化各CD40蛋白质。管柱用PBS(20mM磷酸钠、0.15MNaCl,pH7.2)洗涤,且接着使用80mM乙酸钠(pH3)溶离至五分之一体积之1M Tris-HCl(pH8)中。溶离液于PBS中流过Superdex-200管柱。
表26
分析来自3h217、3h37、3h38及3h56谱系之代表性dAb与表26中所列之CD40-Fc融合蛋白的结合。用BioRad ProteOn XPR36SPR仪器执行分析。SPR表面系藉由在乙醇胺阻断下使用标准乙基(二甲基胺基丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学反应,将8μg/ml抗人类IgG(Fc)抗体(Biacore/GE Healthcare)于10mM乙酸钠(pH4.5)中之混合物固定于BioRad GLC传感器芯片上来制备。用于固定及动力学结合分析之操作缓冲液为10mM磷酸钠、130mM氯化钠、0.05%吐温20,pH7.1。在此等表面上经由Fc尾在垂直方向上捕捉浓度为20μg/ml之CD40-Fc融合蛋白,且将缺乏CD40-Fc蛋白之参比表面用于参比减去。藉由在25℃下,使用240秒缔合时间及420秒解离时间,以30μl/min之流速使405、135、45、15及5nM dAb分析物水平方向流经捕捉之CD40-Fc表面来执行动力学实验。该等表面用30秒脉冲之3M MgCl2,随后用操作缓冲液以60μl/min流过在水平与垂直方向再生。双重参比传感器图谱数据,且接着使用BioRad ProteOn Manager V.2.1.0.38软件拟合成1:1朗缪尔模型,以测定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)及平衡解离常 数(KD)。
发现3h-37、3h-38及3h-56谱系之所有dAb以高亲和力(KD<10-8M)结合至含有人类CD40残基W109及L121之CD40-Fc融合蛋白,但与具有来自食蟹猕猴CD40(L109、P121)或黑猩猩CD40(R109)之相应残基之CD40-Fc融合蛋白的结合显著降低或不可侦测到。此情况指示来自3h37、3h38及3h56-谱系各者之dAb特异性结合至包括人类CD40之残基109及121之抗原决定基。相反,3h-217谱系之所有测试成员以类似亲和力结合至所有所测试CD40-Fc融合蛋白,指示3h-217谱系之成员结合至不包括残基76、109或121之CD40上之位点。因此,3h-217谱系结合至与3h-37、3h-38及3h-56谱系不同之抗原决定基。表27概示使用SPR用ProteOn XPR36仪器针对dAb结合至CD40-Fc融合蛋白所测定之KD值。表27中之“X”意谓没有任何证据表明在此等条件下存在结合。
表27
表28显示使用SPR用ProteOn XPR36仪器针对dAb结合至CD40-Fc融合蛋白所测定之缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)及平衡解离常数(KD)。表28中之“X”意谓没有任何证据表明在此等条件下存在结合。
表28
实施例12
构筑Fc融合多肽
如本文所揭示,可构筑各种组态之包含dAb之抗体多肽。在此实施例中,各种dAb与Fc域融合产生抗人类CD40可变域构筑体之Fc融合多肽,诸如3h37-202、3h37-235、3h37-258及3h37-202。
在一个代表性实施例中,dAb BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)与经修饰之IgG1(IgG1*)Fc域(SEQ ID NO:1284)融合。在dAb-IgG1*Fc域融合多肽中,dAb BMS3h-56-269之C端融合至具有序列Ala-Ser-Thr之连接符三肽,其又与IgG1*Fc域(SEQ ID NO:1284)融合。IgG1*Fc域含有修饰C5S,系指SEQ ID NO: 1284中之位置编号。IgG1 Fc域之C5通常与IgG分子之轻链中之Cys残基形成双硫键。IgG1*Fc域亦含有C11S及C14S突变以消除IgG1铰链区中之链间双硫键。最终,IgG1*Fc域含有P23S突变以降低Fc域效应功能。dAb-IgG1*Fc融合多肽具有以下序列,其中Ala-Ser-Thr连接符呈粗体且Fc域之修饰呈粗斜体:
SEQ ID NO:1286中所示之dAb-IgG1*Fc融合多肽为计算分子量为39,127Da之单体。其可形成计算分子量为78,254Da之二聚体。
或者,dAb BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)与人类IgG4 Fc域(SEQ ID NO: 1285)融合。dAb BMS3h-56-269之C端又融合至Ala-Ser-Thr连接符,该Ala-Ser-Thr连接符与IgG4 Fc域(SEQ ID NO:1285)融合。IgG4 Fc域含有修饰S10P,系指SEQ ID NO:1285中之位置编号。BMS3h-56-269-IgG4 Fc融合多肽具有以下序列,其中Ala-Ser-Thr连接符呈粗体且S10P修饰呈粗斜体:
SEQ ID NO:1287中所示之BMS3h-56-269-IgG4 Fc融合多肽为计算分子量为38,867Da之单体。其可形成计算分子量为77,734Da之二聚体。
下文比对BMS3h-56-269 (SEQ ID NO:417)、BMS3h-56-269-IgG1*Fc融合多肽(SEQ ID NO:1286)及BMS3h-56-269-IgG4 Fc融合多肽(SEQ ID NO:1287)之序列,其中Fc域之起始用箭头标出:
使用实施例11中所揭示之细胞培养方法表现Fc融合多肽。管柱用PBS(20mM磷酸钠、0.15M NaCl,pH7.2)洗涤,且接着使用80mM乙酸钠(pH3)溶离至五分之一体积之1M Tris-HCl(pH8)中。溶离液于PBS中流过Superdex-200管柱。
实施例13
CD40Fc融合多肽活性分析
功能上分析抗人类CD40Fc融合多肽拮抗CD40活性之能力。所测试之CD40活性为藉由hCD40L驱动之初级人类单核细胞源性树突状细胞(DC)活化发生之B细胞增殖及细胞激素产生。使用实施例6中所揭示之分析量测B细胞增殖及细胞激素产生。除非另外说明,否则所有分析均在补充有10%胎牛血清(FCS)之RPMI培养基中执行。dAb-Fc域融合多肽展示CD40依赖性活化之有效抑制作用(亦即拮抗作用)。注意到在任何人类CD40特异性dAb-Fc域融合多肽中无促效特性。使用各种分析得到之结果示于表29中。使用实施例11中所揭示之分析来分析3h56-269-IgG4与固定之人类CD40之结合。对于3h56-269-IgG4,在30pM、25℃下及在40pM、37℃下量测结合固定之人类-CD40的表观亲合力影响之Kd值。
表29
尽管已根据上文实施例详细描述了本发明实施例,但应了解在不背离此等实施例之精神的情况下可作出各种修改,且将易于为习此相关技艺之人士所知。
Claims (32)
1.一种包含第一可变域之抗体多肽,其中该抗体多肽特异性结合人类CD40之抗原决定基,其中该抗体多肽与域抗体(domain antibody,dAb)BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)竞争结合于CD40,其中CD40包含SEQ IDNO:1之氨基酸序列,且其中该抗原决定基包含至少一个选自由Trp109、Leu121、His122、Ser124、Ser156、Ala157、Phe158、Glu159及His162组成之群的CD40氨基酸残基。
2.如权利要求1之抗体多肽,其中该第一可变域包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h-56及BMS3h-198组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列,且其中该第一可变域之表观结合常数为1pM至100nM。
3.如权利要求1至2中任一项之抗体多肽,其中该第一可变域包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列,且其中该第一可变域之hIZCD40L驱动之人类B细胞增殖EC50为0.01nM至100.0nM。
4.如权利要求1之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列包含:
(a)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR1区有至多两个氨基酸不同的CDR1区,
(b)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区,
(c)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区,
(d)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR1区有至多两个氨基酸不同的FR1区,
(e)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR2区有至多两个氨基酸不同的FR2区,
(f)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR3区有至多两个氨基酸不同的FR3区,及
(g)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之FR4区有至多两个氨基酸不同的FR4区。
5.如权利要求1之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列包含:
(a)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR1区有至多两个氨基酸不同的CDR1区,
(b)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区,
(c)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区。
6.如权利要求1之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有至多10个氨基酸不同。
7.如权利要求6之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有至多5个氨基酸不同。
8.如权利要求7之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有两个氨基酸不同。
9.如权利要求8之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列有一个氨基酸不同。
10.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-56之谱系群,且其中该第一可变域之氨基酸序列进一步包含:
(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp(SEQ ID NO:1274)之CDR1区,其中X1为Asp或Gly,且Y1为Met或Leu;
(b)具有序列Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ IDNO:1275)之CDR2区,其中X2为Gln、Tyr、Pro、Trp或Ala,Y2为Thr、Ser、Asn、Gly、Met或Gln,Z2为Arg、Leu、Tyr、His或Phe,且A2为Lys或Met;及
(c)具有序列X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3(SEQ ID NO:1276)之CDR3区,其中X3为Leu或Pro,Y3为Phe、Gln、Thr或Met,Z3为Tyr、Pro、Leu、Thr、Ile、Phe或Met,A3为Gln、His、Asp、Ser、Lys、Glu或Gly,且B3为Glu、Asp或Tyr。
11.如权利要求10之抗体多肽,其中该第一可变域之氨基酸序列包含:
(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1(SEQ ID NO:1277)之FR1区,其中X1为Leu或Arg,且Y1为Arg或Ala;
(b)具有序列Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser(SEQ IDNO:1278)之FR2区,其中X2为Gln或Arg,Y2为Lys或Arg,且Z2为Gly或Val;
(c)具有序列Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys(SEQ ID NO:1279)之FR3区,其中X3为Thr或Met,Y3为Glu或Asp,Z3为Ala或Ser,A3为Tyr或His,且B3为Ala或Thr;及
(d)具有序列X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4(SEQ ID NO:1280)之FR4区,其中X4为Trp或Arg,Y4为Gln或Pro,且Z4为Ser或Asn。
12.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽,其中该第一可变域包含BMS3h-56-258(SEQ ID NO:10)或BMS3h-56-269(SEQ ID NO:417)之氨基酸序列。
13.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-37之谱系群,其中该第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-X1-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1281);且
其中X1为Gln或Arg;Y1为Glu或Gly;Z1为Ala、Leu或Glu;A1为Phe或Tyr;且B1为Trp或Arg。
14.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-38之谱系群,其中该第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Ile-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-Ile-Ser-Z1-A1-Gly-B1-C1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1282);且
其中X1为Thr或Pro;Y1为Ala或Ser;Z1为Arg或Gly;A1为Arg、Ser、Asn、Gln、Gly、His或Leu;B1为Tyr、Phe、Trp或Gly;C1为Ser或Gly;且D1为Arg、Met或Pro。
15.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽选自BMS3h-198之谱系群,其中该第一可变域包含序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y1-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-Cys-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1283);且
其中X1为Met或Leu;Y1为Val或Phe;Z1为Asp或Asn;A1为Ser或Thr;B1为Tyr或His;C1为Lys或Arg;D1为Asp或Glu;E1为Tyr或Phe;F1为Trp或Arg;G1为Gly或Arg;且H1为Gln或His。
16.如权利要求1至15中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽为域抗体(dAb)。
17.如权利要求1至16中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽为包含该第一可变域及Fc域之融合多肽。
18.如权利要求17之融合多肽,其中该融合多肽包含IgG4Fc域。
19.如权利要求18之融合多肽,其中该融合多肽包含IgG1Fc域。
20.如权利要求17至19中任一项之融合多肽,其中该融合多肽包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列,且其中该融合多肽之hIZCD40L驱动之人类B细胞增殖EC50为0.001nM至100.0nM。
21.如权利要求1至20中任一项之抗体多肽,其中该抗体多肽进一步包含特异性结合第二抗原之第二可变域,其中该第二抗原为除人类CD40以外之抗原。
22.如权利要求21之抗体多肽,其中该第二抗原为分化簇(cluster ofdifferentiation,CD)分子或主要组织兼容性复合体(Major HistocompatibilityComplex,MHC)II类分子。
23.如权利要求21之抗体多肽,其中该第二抗原为血清白蛋白(SA)。
24.一种核酸,其编码如权利要求1至23中任一项之抗体多肽。
25.一种载体,其包含如权利要求24之核酸。
26.一种经分离之宿主细胞,其包含如权利要求25之载体。
27.一种医药组合物,其包含治疗有效量之如权利要求1之抗体多肽及医药学上可接受之载剂。
28.如权利要求27之医药组合物,其进一步包含免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂。
29.一种治疗需要该治疗之患者的免疫疾病之方法,其包含向该患者投与治疗有效量之如权利要求27之医药组合物。
30.如权利要求29之方法,其中该医药组合物系与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。
31.如权利要求29之方法,其中该免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。
32.如权利要求29之方法,其中该免疫疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病(Addison's disease)、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病(包括1型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病(Graves'disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群(Sjogren's syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象(Arthus'sphenomenon)、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
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