TWI507416B - 抗ｃｄ４８抗體及其用途 - Google Patents

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TWI507416B TW100134591A TW100134591A TWI507416B TW I507416 B TWI507416 B TW I507416B TW 100134591 A TW100134591 A TW 100134591A TW 100134591 A TW100134591 A TW 100134591A TW I507416 B TWI507416 B TW I507416B
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Description

抗CD48抗體及其用途
本發明係關於對人類CD48具專一性之抗體及其抗原結合片段。
CD48為一種以膜結合和可溶性二種形式存在之GPI-錨定蛋白。CD48為2B4之高親和力配體及CD2之低親和力配體。CD48在科學文獻中亦指「TCT.1」(Mami-Chouaib等人，J. Exp. Med. 172:1071-1082(1990))、「B-LAST 1」(Thorley-Lawson等人，Cell 30:415-425(1982))及SLAMF2(Detre等人，Semin. Immunopathol. 32:157-171(2010))。CD48和2B4間之交互作用顯示造成了NK細胞活化。CD48亦顯示在活體外激發T-細胞活化，及在CD48-剔除小鼠中展現T細胞增生反應障礙。
特定的證據顯示CD48在氣喘進程和發炎性腸疾病(IBD)中之角色。例如，在試驗的氣喘中(例如卵白蛋白和麴菌引發的過敏性嗜酸性細胞氣道發炎模型)顯示C48被上調。參見，例如Munitz等人，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175:911-918(2007)。再者，在IBD之過繼轉移模型中CD48剔除小鼠無法產生發炎性結腸炎。再者，CD48拮抗作用在之前建立的結腸炎中顯示產生有利的效應。
例如在US 2007/0212353和WO 97/35614中提及CD48拮抗劑做為治療目的之用途。然而，本項技術對於新穎的CD48調節劑，包括可用於治療CD48媒介的疾病和症狀之抗-CD48抗體仍有需求。
本發明係提供與人類CD48結合之抗體。本發明之抗體可用於，尤其是，抑制CD48媒介的訊號傳遞以及治療藉由或與CD48活性相關及/或訊號傳遞所造成的疾病和病症。
本發明之抗體阻斷了CD48和CD48受體(例如2B4及/或CD2)間之交互作用，及/或抑制初級人類週邊血液單核細胞(PBMC)之活化。根據特定的實例，本發明之抗體係與人類CD48之第一免疫球蛋白區內的抗原決定位結合。
本發明之抗體可為全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或可僅包括一抗源結合部分(例如，Fab、F(ab’)2 或scFv片段)及可經修飾影響功能性，例如消除殘基效應子功能(Reddy等人，2000，J. Immunol. 164: 1925-1933)。
本發明係提供包括一重鏈可變區(HCVR)之抗體或抗體之抗原結合片段，其中該重鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、162、178、192、208、212、228、232、248、252、268、272、288、292、308、312、328、332、348、352和368或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈可變區(LCVR)之抗體或抗體之抗原結合片段，其中該輕鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、146、154、170、180、182、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、372及380，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列。
本發明亦提供包括HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對之抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR和LCVR序列對係由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/180、162/182、178/190、192/200、208/210、212/220、228/230、232/240、248/250、252/260、268/270、272/280、288/290、292/300、308/310、312/320、328/330、332/340、348/350、352/360、368/370、352/372和368/380。
本發明亦提供抗體或抗體之抗原結合片段，其係包括具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)區：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、168、198、218、238、258、278、298、318、338和358，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列；及具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)區：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、152、160、176、188、206、226、246、266、286、306、326、346、366和378，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列。
在特定的實施例中，抗體或抗體之抗原結合部分係包括由下列組成之群中選出之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、168/176、168/188、198/206、218/226、238/246、258/266、278/286、298/306、318/326、338/346、358/366和358/378。
本發明亦提供一抗體或其片段，其係進一步包括具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)區：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、164、194、214、234、254、274、294、314、334和354，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列；具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)區：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、166、196、216、236、256、276、296、316、336和356，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列；具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)區：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、148、156、172、184、202、222、242、262、282、302、322、342、362及374，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列；及具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR2(LHCDR2)區：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、150、158、174、186、204、224、244、264、284、304、324、344、364和376，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其類似序列。
特定的非限制、示例性之本發明抗體和抗原結合片段係包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區，其分別係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：EQ ID NO：4-6-8-12-14-16(例如H2M1707N)；20-22-24-28-30-32(例如H2M1709N)；36-38-40-44-46-48(例如H2M1710N)；52-54-56-60-62-64(例如H2M1712N)；68-70-72-76-78-80(例如H2M1713N)；84-86-88-92-94-96(例如H2M1763N)；100-102-104-108-110-112(例如H2M1764N)；116-118-120-124-126-128(例如H2M1811N)；132-134-136-140-142-144(例如H2M1766N)；164-166-168-172-174-176(例如H4H1769N-a)；164-166-168-184-186-188(例如H4H1769N-b)；194-196-198-202-204-206(例如H4H1770N)；214-216-218-222-224-226(例如H4H1771N)；234-236-238-242-244-246(例如H4H1772N)；254-256-258-262-264-266(例如H4H1774N)；274-276-278-282-284-286(例如H4H1775N)；294-296-298-302-304-306(例如H4H1778N)；314-316-318-322-324-326(例如H4H1779N)；334-336-338-342-344-346(例如H4H1781N)；354-356-358-362-364-366(例如H4H1789Na和Pa)；及354-356-358-374-376-378(例如H4H1789Nb例如Pb)。
本發明亦包括抗體或其抗原結合片段，其係包含分別具有下列胺基酸序列之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區：HCDR1=GFTFSNYG(SEQ ID NO：254)；HCDR2=IWYDDSXK，其中X為S或N(SEQ ID NO：381)；HCDR3=ARDRWTYSHXFEY，其中X為Y或F(SEQ ID NO：382)；LCDR1=QXISSW，其中X為D或G(SEQ ID NO：383)；LCDR2=AAS(SEQ ID NO：264)；及LCDR3=QQANSFPRT(SEQ ID NO：266)。具有這些序列特性之本發明非限定的示例性抗體包括H4H1774N、H4H1775N、H4H1778N、H4H1779N和H4H1781N。
在一相關的實施例中，本發明包括與CD48專一性結合之抗體或抗原結合片段，其中此抗體或片段係包括含有由下列組成之群中選出之重鏈和輕鏈序列的重鏈和輕鏈CDR：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/180、162/182、178/190、192/200、208/210、212/220、228/230、232/240、248/250、252/260、268/270、272/280、288/290、292/300、308/310、312/320、328/330、332/340、348/350、352/360、368/370、352/372和368/380。辨識HCVR和LCVR胺基酸序列中之CDR的方法和技術已為本項技術所熟知，並可用於辨識文中所揭示之專一性HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於辨識CDR界限之示例習用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。一般而言，Kabat定義係以序列變異性為基準，Chothia定義係以結構環區域之位置為基準，而AbM定義為介於Kabat和Chothia法之折衷。參見，例如Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health，Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J. Mol. Biol. 273：927-948(1997)；及Martin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：9268-9272(1989)。公開的資料庫亦可取得供辨識抗體內的CDR序列。
在另一方面，本發明係提供編碼抗-CD48抗體或其片段之核酸分子。攜帶本發明核酸之重組的表現載體及已導入此等載體之宿主細胞亦涵蓋在本發明中，藉由在能產生抗體的條件下，培養此等宿主細胞，並回收所產生的抗體，作為製造抗體之方法。
在一實施例中，本發明提供一包括HCVR之抗體或其片段，其中該HCVR係由下列組成之群中選出之核酸序列所編碼：SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、161、177、191、207、211、227、231、247、251、267、271、287、291、307、311、327、331、347、351和367，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列。
本發明亦提供一包括LCVR之抗體或其片段，其中該LCVR係由下列組成之群中選出之核酸序列所編碼：SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、145、153、169、179、181、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、371和379，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列。
本發明亦提供一抗體或抗體之抗原結合片段，其係包括由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的HCDR3區：SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、167、197、217、237、257、277、297、317、337和357，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列；及由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的LCDR3區：SEQ ID NO：15、31、47、63、79、95、111、127、143、151、159、175、187、205、225、245、265、285、305、325、345、365和377，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列。
本發明亦提供一抗體或其片段，其進一步係包括由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的HCDR1區：SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、163、193、213、233、253、273、293、313、333和353，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列；由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的HCDR2區：SEQ ID NO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、165、195、215、235、255、275、295、315、335和355，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列；由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的LCDR1區：SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、147、155、171、183、201、221、241、261、281、301、321、341、361和373，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列；及由下列組成之群中選出之核苷酸序列所編碼的LCDR2區：SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、149、157、173、185、203、223、243、263、283、303、323、343、363和375，或實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%其同源性之相同序列。
根據特定的實施例，抗體或其片段係包括由下列SEQ ID NO之核酸序列所編碼的重鏈和輕鏈CDR序列：SEQ ID NO：1和9(例如H2M1707N)、17和25(例如H2M1709N)、33和41(例如H2M1710N)、49和57(例如H2M1712N)、65和73(例如H2M1713N)、81和89(例如H2M1763N)、97和105(例如H2M1764N)、113和121(例如H2M1811N)、129和137(例如H2M1766N)、161和169(例如H4H1769N-a)、177和179(例如H4H1769P-a)、161和181(例如H4H1769N-b)、177和189(例如H4H1769P-b)、191和199(例如H4H1770N)、207和209(例如H4H1770P)、211和219(例如H4H1771N)、227和229(例如H4H1771P)、231和239(例如H4H1772N)、247和249(例如H4H1772P)、251和259(例如H4H1774N)、267和269(例如H4H1774P)、271和279(例如H4H1775N)、287和289(例如H4H1775P)、291和299(例如H4H1778N)、307和309(例如H4H1778P)、311和319(例如H4H1779N)、327和329(例如H4H1779P)、331和339(例如H4H1781N)、347和349(例如、H4H1781P)、351和359(例如H4H1789Na)、367和369(例如H4H1789Pa)、351和371(例如H4H1789Nb)或367和379(例如H4H1789Pb)。
本發明包括具有修飾糖基化模式之抗-CD48抗體。在某些應用中，移除不欲的糖基化位置之修飾作用可能為有用的，或在寡糖鏈上缺乏海藻糖基之抗體，例如，用以增加抗體依賴的細胞毒殺(ADCC)功能(參見Shield等人(2002) JBC 277：26733)。在其他的應用上，可進行半乳糖基化之修飾作用以修改補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)。
在另一方面，本發明係提供一醫藥組成物，其包括與CD48專一結合之重組的人類抗體或片段以及醫藥上可接受之載劑。在一相關的方面，本發明之特徵為一組合物，其為CD48抑制劑和第二治療劑之組合物。在一實施例中，CD48抑制劑為一抗體或其片段。在一實施例中，此第二治療劑為任何與CD48抑制劑有利地組合之藥劑。可有利地與CD48抑制劑組合之示例性藥劑包括(不限於)抑制CD48活性之其他藥劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、胜肽抑制劑、小分子拮抗劑等)，及/或干擾CD48上游或下游訊號傳遞之藥劑。
又在另一方面，本發明係提供使用本發明之抗-CD48抗體或抗體之抗原結合部分抑制CD48活性之方法，其中該治療方法係包括投予一治療上有效量之包含本發明抗體或抗體之抗原結合片段的醫藥組成物。所治療的病症為任何藉由移除、抑制或減低CD48活性而加以改進、改善、抑制或防止之疾病或症狀。本發明之抗-CD48抗體或抗體片段可用於阻斷CD48和CD48受體(例如2B4及/或CD2)間的交互作用，或另外抑制CD48之訊號傳遞活性。
本發明亦包括本發明之抗-CD48抗體或抗體之抗原結合部分於製造醫藥品供治療病患中與CD48活性有關或由其所造成的疾病或病症之用途。
從檢閱確切的詳細說明，其他的實施例將變得更顯見。
詳細說明
在敘述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解的相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於參照特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明中可使用任何該等與文中所述的方法和物質類似或相當者，但較佳的方法和物質為目前所描述。
定義
如文中所用，詞語「CD48」和「CD48片段」，除非另有說明為來自非人類物種，否則係指人類CD48蛋白或片段(例如「小鼠CD48」、「小鼠CD48片段」、「猴子CD48」、「猴子CD48片段」等)。人類CD48具有SEQ ID NO：384之胺基酸序列。來自非人類物種(例如小鼠、猴子、兔、狗、豬等)之CD48分子的胺基酸序列可得自公開資的來源例如GenBank(例如GenBank登錄號BAE96326.1(小鼠)；DAA31966.1(牛)；EDL94663.1(大鼠)；等)。
術語「CD48受體」，如文中所用，係指在活體內與人類蛋白交互作用以傳遞生物訊息之蛋白。術語「CD48受體」包括人類2B4和人類CD2。術語「人類2B4」，如文中所用，係指包括SEQ ID NO：390胺基酸序列或其能與CD48交互作用之部分的蛋白。術語「人類CD2」，如文中所用，係指包括SEQ ID NO：392胺基酸序列或其能與CD48交互作用之部分的蛋白。
術語「抗體」，如文中所用，希望係指包括由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈、二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈以及其多聚體之免疫球蛋白分子(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH )及一重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個區CH 1、CH 2和CH 3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL )及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個區(CL 1)。VH 和VL 區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為架構區(FR)。各VH 和VL 係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本發明不同的實施例中，抗-CD48抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖細胞序列相同，或經自然或人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一性結合形成複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何標準的技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及操控和表現編碼抗體可變區和視需要恆定區的DNA之重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可取得的，例如購自市面、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)或可經合成的。此DNA可經定序和以化學或藉由使用分子生物技術操控，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的構形，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，如CDR3胜肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地係包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括至少一個與架構序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VL 區與VH 區結合之抗原結合片段中，VH 和VL 區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH -VH 、VH -VL 或VL -VL 二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單體VH 或VL 區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之示例性組態的非限定實例包括：(i)VH -CH 1；(ii)VH -CH 2；(iii)VH -CH 3；(iv)VH -CH 1-CH 2；(v)VH -CH 1-CH 2-CH 3；(vi)VH -CH 2-CH 3；(vii)VH -CL；(viii)VL -CH 1；(ix)VL -CH 2；(x)VL -CH 3；(xi)VL -CH 1-CH 2；(xii)VL -CH 1-CH 2-CH 3；(xiii)VL -CH 2-CH 3；及(xiv)VL -CL 。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結之胺基酸所組成。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單體VH 或VL 區相連結之任何上列的可變和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
因帶有全抗體分子，抗原結合片段可為單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體之多專一性抗原結合片段典型地應包括至少二個不同的可變區，其中一個可變區能專一地與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的抗原決定位結合。任何多專一性抗體模式，包括文中所揭示之示例的雙專一性抗體模式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
本發明之抗體可經由補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)或抗體依賴細胞媒介的細胞毒殺作用(ADCC)來起作用。「補體依賴的細胞毒殺作用」(CDC)係指抗原表現細胞在補體的存在下被本發明抗體解離。「抗體依賴細胞媒介的細胞毒殺作用」(ADCC)係指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒殺細胞(例如天然的殺手(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)辨識目標細胞上的結合抗體並據此使目標細胞解離。CDC和ADCC可使用本項技術熟知及可取得的分析來測量。(參見，例如U.S. 5,500,362和5,821,337，以及Clynes等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 95：652-656)。抗體之恆定區對於抗體固定補體和媒介細胞依賴的細胞毒殺之能力很重要。因此，抗體之同型可依其是否為抗體所欲的媒介細胞毒殺作用為基準加以選擇。
術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列之可變和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖細胞的CDR序列已稼接在人類架構序列上之抗體。
術語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括由重組方法，例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)分離出之抗體，分離自經人類免疫球蛋白基因所轉殖之動物(例如小鼠)的抗體(參見，例如Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20：6287-6295)，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列拼接之方法所製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。然而，在特定的實施例中，此等重組的人類抗體係在活體外經誘變(或當使用以人類Ig序列基因轉殖之動物時，為活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH 和VL 區的胺基酸序列(當衍生自人類生殖細胞VH 和VL 序列或與其有關時)係為可能並非天然存在於活體內人類抗體生殖細胞庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式，包括約150-160 kDa之安定的四鏈結構之免疫球蛋白分子，其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體並非經由雙硫鍵相連接且此約75-80 kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現的頻率係因(但不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal等人(1993) Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋在絞鏈CH 2或CH 3區中具有一或多個突變之抗體，該突變例如在生產上可能為所欲的，用以增進所欲的抗體形式之產率。
「單離抗體」，如文中所用，係指經辨識和分離及/或從其天然環境的至少一組份中回收之抗體。例如，從生物體之至少一組成份，或從其中該抗體為天然存在或天然產生之組織或細胞中分離或移出之抗體，係為一本發明目的之「單離抗體」。單離抗體亦包括在重組細胞內之原位抗體。單離抗體為經歷至少一個純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例，單離抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
術語「專一結合」或其類似詞，係指抗體或其抗原結合片段與抗原形成一複合物，其在生理狀況下為相當穩定的。測定抗體是否與抗原專一結合之方法已為本項技術所熟知，並包括，例如平衡透析、表面電漿共振及其類似方法。例如，與人類CD48專一結合之抗體，如本發明內文中所用，係包括與人類CD48或其一部分相結合之抗體，其以表面電漿共振測量具有低於約1000 nM、低於約500 nM、低於約300 nM、低於約200 nM、低於約100 nM、低於約90 nM、低於約80 nM、低於約70 nM、低於約60 nM、低於約50 nM、低於約40 nM、低於約30 nM、低於約20 nM、低於約10 nM、低於約5 nM、低於約4 nM、低於約nM、低於約2 nM、低於約1 nM、低於約0.5 nM之KD 。(參見，例如文中之實例3)。然而，與人類CD48專一結合之抗體可具有與其他抗原之交叉反應性，例如來自其他(非人類)物種之CD48分子。
「中和」或「阻斷」抗體，如文中所用，希望係指抗體與CD48之結合：(i)干擾CD48或CD48片段及CD48受體(例如2B4及/或CD2)間之交互作用，及/或(ii)使得至少一種CD48之生物功能受到抑制。由CD48中和或阻斷抗體所造成之抑制作用不需要完全，只要使用適當的分析可偵測到即可。偵測CD48抑制作用之示例性分析係描述於本文中。
相較於可從其衍生抗體之對應的生殖細胞序列，在重鏈和輕鏈可變區之架構及/或CDR區中，文中所揭示之抗-CD48抗體可包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自公開的抗體序列資料庫之生殖細胞序列相比較，加以容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個架構及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成衍生抗體之生殖細胞序列的對應殘基，或另一種人類生殖細胞序列之對應殘基(此序列之改變在文中共同稱為生殖細胞突變)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖細胞突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，V H 及/或V L 區內的所有架構及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖細胞序列的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖細胞序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個架構及/或CDR殘基係突變成不同生殖細胞序列之對應殘基(亦即與最初衍生抗體之生殖細胞序列不同的生殖細胞序列)。再者，本發明之抗體在架構及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖細胞突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖細胞序列之對應殘基，而與原始生殖細胞序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖細胞序列之對應殘基。一旦獲得後，含有一或多個生殖細胞突變之抗體和抗原結合片段可容易地試驗其一或多種所欲的性質，例如結合專一性改善、結合親和力增加、拮抗或促效性生物性質改善或增進(視情況而定)、致免疫力降低等。以此通用方法所得的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-CD48抗體，其係包括具有一或多個保守取代之任何文中所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括抗-CD48抗體，相對於任何任何文中所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，其係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「表面電漿共振」，如文中所用，係指一種能藉由偵測生物感測器基質內蛋白濃度之改變進行即時相互作用分析之光學現象，例如使用BIAcoreTM 系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
術語「KD 」，如文中所用，希望係指特定抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
術語「抗原決定位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的抗原決定位。因此，不同的抗體可與抗原的不同區域結合並可具有不同的生物效應。抗原決定位可為構型或線性。構型抗原決定位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性抗原決定位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，抗原決定位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基或磺醯基。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最適化對齊時，以任何熟知的序列一致性演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測量，有至少約95%，及更佳地至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列一致性。與參考核酸分子具有實質上一致性的核酸分子，在特定情況下，可編碼與參考核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列之多肽。
如用於多肽，術語「實質上類似」係指二胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用缺位重量最適化對齊時，享有至少95%序列一致性，甚佳地至少98%或99%序列一致性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可調高序列一致性之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson(1994) Methods Mol. Biol. 24：307-331。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸胺酸-胺酸。另外，保守性置換為任何在Gonnet等人(1992) Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之變換。「中度保守性」置換為任何在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之變化。
多肽之序列類似性，亦指序列一致性，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，可用於內定參數，測定密切相關的多肽間(例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間)之序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，GCG Version 6.1內的程式，來作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列一致性百分比(Pearson(2000) supra)。當本發明序列與含有較大量來自不同物種的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215：403-410及Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25：3389-402。
抗體之生物特性
本發明之抗體阻斷了人類CD48和至少一種CD48受體間之交互作用。如文中所用，「阻斷人類CD48和至少一種CD48受體間之交互作用」一詞係指在一分析中，其中CD48和CD48受體(例如人類2B4及/或人類CD2)間的物理性交互作用可被偵測及/或定量出，添加本發明抗體降低了CD48和受體間的交互作用至少50%。可用於測定抗體是否阻斷人類CD48和CD48受體(例如人類2B4)間的交互作用之非限定示例性分析係說明於文中實例5。在此實例中，抗體係與CD48蛋白混合，及然後將抗體/CD48混合物施予在塗覆有2B4蛋白之表面。洗掉未結合的分子後，測量CD48與塗覆2B4表面結合之量。於此分析模式中藉由使用不同量的抗體，可計算出阻斷50%的CD48與2B4結合所需之抗體量並以IC50 值表示。本發明包括(當以上述之CD48/CD48受體結合分析或大體上類似的分析試驗時)具有低於約400 pM之IC50 的抗-CD48抗體。例如，本發明包括(當以上述之CD48/CD48受體結合分析或大體上類似的分析試驗時)具有低於約400、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 pM之IC50 的抗-CD48抗體。
本發明之抗體亦能抑制初級的人類周邊血液單核細胞(PBMC)活化。如文中所用，「抑制初級的人類周邊血液單核細胞活化」一詞係指，在一分析中，其中PBMC之活化可被偵測及/或定量出(例如藉由測量IFN-γ或其他細胞激素之釋放)，添加本發明抗體降低了IFN-γ(或其他細胞激素)釋放量至少50%。可用於測定抗體是否抑制PBMC活化之非限定示例性分析係說明於文中實例6和7中。在一實施例中，係將抗-CD48抗體加到分離的人類PBMC中，之後以促效劑抗-CD3和抗-CD28抗體活化PBMC。培養一段時間後，測量所釋放的IFN-γ量。於此分析模式中藉由使用不同量的抗體，可計算出抑制50%的IFN-γ最大釋放量所需之抗體量並以IC50 值表示。本發明包括(當以上述之PBMC活化分析或大體上類似的分析試驗時)具有低於約500 pM之IC50 的抗-CD48抗體。例如，本發明包括(當以上述之PBMC活化分析或大體上類似的分析試驗時)具有低於約500、400、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 pM之IC50 的抗-CD48抗體。
抗原決定位定位及相關技術
人類CD48蛋白含有二個類免疫球蛋白區，文中稱為「Ig1區」和「Ig2區」。Ig1區為以SEQ ID NO：384之29至127胺基酸表示之胺基酸序列，Ig2區為以SEQ ID NO：384之132至212胺基酸表示之胺基酸序列(參見圖1)。
本發明包括與人類CD48之Ig1區內的抗原決定位專一結合之抗-CD48抗體。抗原決定位可由3或多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多)位於CD48 Ig1區內的胺基酸之單一緊鄰序列所組成。另外，抗原決定位可由多數個位於CD48 Ig1區內之非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。根據本發明特定實施例，係提供與位於SEQ ID NO：384之60至125胺基酸內的一或多個胺基酸相互作用之抗-CD48抗體。例如，本發明包括與位於SEQ ID NO：384之60至68及/或107至125胺基酸內的一或多個胺基酸相互作用之抗-CD48抗體。
各種本項技術之一般技術者已知的技術皆可用於測定抗體是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸交互作用」。示例的技術包括習用的交叉阻斷分析例如描述Antibodies，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)、丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke，2004，Methods Mol Biol 248：443-463)及胜肽裂解分析。此外，可使用例如抗原決定位切除、抗原決定位萃取及抗體之化學修飾等方法(Tomer，2000，Protein Science 9：487-496)。可用於辨識多肽內與抗體作用之胺基酸的方法係以質譜偵測氫/氘交換。(參見，例如文中之實例4)。一般而言，氫/氘交換方法係包括以氘標定有關的蛋白，接著讓抗體與氘標定的蛋白結合。之後，將蛋白/抗體複合物轉置於水中讓所有殘基發生氫/氘交換，但被抗體保護的殘基除外(仍保持氘標定)。解離抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體交互作用之專一性胺基酸的。參見，例如Ehring(1999) Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001) Anal. Chem. 73：256A-265A。
本發明進一步包括與任何文中所述之專一性示例抗體相同之抗原決定位相結合的抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa、H4H1763N、H2M1707N、H2M1709N、H4H1770N、H4H1771N等)。同樣地，本發明亦包括和任何文中所述之專一性示例抗體競爭與CD48或CD48片段相結合之抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa、H4H1763N、H2M1707N、H2M1709N、H4H1770N、H4H1771N等)。
藉由使用本項技術中已知的習用方法可容易地測定抗體是否與相同的抗原決定位結合，或與參考的抗-CD48抗體競爭結合。例如測定受試的抗體是否與本發明的參考抗-CD48抗體相同之抗原決定位結合，係讓此參考抗體與CD48蛋白或胜肽於飽和的條件下結合。接著，評估受試抗體與CD48分子結合之能力。若在與參考的抗-CD48抗體飽和結合後，受試抗體能與CD48結合，則可結論出受試抗體係與不同於參考抗-CD48抗體之抗原決定位結合。另一方面，若在與參考抗-CD48抗體飽和結合後，受試抗體不能與CD48結合，則受試抗體可能係與本發明之參考抗-CD48抗體結合抗原決定位相同之抗原決定位相結合。可進行另外的習用試驗(例如胜肽突變和結合分析)用以確定觀察到沒有結合的受試抗體事實上是否係因為與參考抗體相同的抗原決定位結合或是空間阻斷(或另外的現象)造成沒有觀察到結合。此類型之實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或任何其他本項技術可取得的定量或定性之抗體結合分析來進行。根據本發明之特定實施例，若如競爭結合分析中所測量，例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一種抗體之結合至少50%，但較佳的75%、90%或甚至99%，則二種抗體係與相同(或重疊)的抗原決定位結合(參見，例如Junghans等人，Cancer Res. 1990：50：1495-1502)。另外，若基本上在消除或降低一抗體結合之抗原中，所有的胺基酸突變係消除或降低另一種抗體之結合，則此二種抗體係視為與相同的抗原決定位結合。若僅消除或降低一抗體結合之一部分的胺基酸突變，降低或減少另一種抗體結合，則二種抗體係視為具有「覆蓋型抗原決定位(overlapping epitope)」。
就測定一抗體是否係與參考抗-CD48抗體競爭結合，係以二個方面來進行上述結合方法：第一方面，讓參考抗體於飽和的條件下與CD48分子結合，接著評估受試抗體與CD48分子之結合。第二方面，讓受試抗體於飽和的條件下與CD48分子結合，接著評估參考抗體與CD48分子之結合。若在此二方面中，僅第一(飽和)抗體能與CD48分子結合，則可結論出受試抗體係與參考抗體競爭與CD48結合。本項技術之一般技術者應了解，與參考抗體競爭結合之抗體可能不與參考抗體相同的抗原決定位結合，但可能藉由與重疊或相鄰的抗原決定位結合而於空間上阻斷參考抗體之結合。
人類抗體之製備
產生單株抗體(包括全長的人類單株抗體)之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法皆可用本發明之內文中，用以製造與人類CD48專一結合之人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM 技術或任何其他已知的製造單株抗體之方法，起初先分離對CD48具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。如下列實驗部分所示，抗體係經定性並以所欲的性質來選擇，包括親和力、選擇性、抗原決定位等。以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區產生本發明全人類抗體，例如野生型或修飾型IgG1或IgG4。根據專一用途所選的恆定區可不同，而高親和力抗原結合及目標專一性特性則係存在於可變區內。
生物等效性
本發明之抗-CD48抗體及抗體片段涵蓋具有與所述的抗體不同但保留與人類CD48結合能力之胺基酸序列的蛋白。此等變體抗體和抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體實質上相當之生物活性。同樣的，本發明之抗-CD48抗體編碼DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代，但其所編碼的抗-CD48抗體或抗體片段與本發明之抗-CD48抗體或抗體片段實質上為生物等效的。此等變異的胺基酸和DNA序列之實例係如上所論述。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等性或醫藥替代性，當於類似的實驗條件下以相同的莫耳劑量或單一劑量或多劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效性。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標定，對於達到(例如)長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品的研究上被認為是無醫療價值的。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，若相較於無此變更之持續治療，病患在無預期增加有害效應之風險下(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)可在參照產品和生物產品間作一或多次變更，則二種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物流體中隨時間變化之抗體濃度或其代謝物；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)已建立抗體之安全性、效力或生物可利用性和生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明之抗-CD48抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的酪胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效抗體可包括抗-CD48抗體變體，其係包含修飾抗體糖基化特性之胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據特定的本發明實施例，抗-CD48抗體係與人類CD48結合但不與其他物種CD48結合。本發明亦包括與人類CD48及來自一或多種非人類物種之CD48結合的抗-CD48抗體。例如本發明之抗-CD48抗體可與人類CD48結合，以及可與或不與(視情況而定)一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩CD48結合。
免疫接合物
本發明涵蓋與具療效成份，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗-CD48單株抗體(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知(參見，例如WO 05/103081)。
多專一性抗體
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的抗原決定位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，1991，J. Immunol. 147：60-69；Kufer等人，2004，Trends Biotechnol. 22：238-244。本發明之抗-CD48抗體可與其他的功能分子，例如另一胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或其片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有第二結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。例如，本發明包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係對人類CD48或其片段具專一性，而免疫球蛋白之另一臂係對第二治療目標具專一性，或係與具療效成份例如胰蛋白酶抑制劑接合。
可用於本發明內文中之示例的雙專一性抗體模式包括使用第一免疫球蛋白(Ig) CH 3區及第二Ig CH 3區，其中第一和第二Ig CH 3區至少有一胺基酸互不相同，且相較於無此胺基差異之雙專一性抗體，其中該至少一胺基酸差異降低了雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH 3區結合蛋白A而第二Ig CH 3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH 3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。在第二CH 3中可發現的另外修飾作用，就IgG1抗體而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗體而言係包括N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗體而言係包括Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之雙專一性抗體模式之變體係涵蓋在本發明之範圍內。
治療調配物和給藥
本發明係提供包括本發明之抗-CD48抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係與適合的載劑、賦形劑和其他提供改善轉移、運送、耐受性及類似性質之藥劑所調配。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical Sciences。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含囊泡之脂質(陽離子或陰離子)(例如LIPOFECTINTM )、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998) J Pharm Sci Technol 52：238-311。
投予病患之抗體劑量可依照病患的年齡和體型大小、標的疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。當本發明抗體係用於治療成人病患與CD48活性有關的症狀或疾病時，有利的一般可以靜脈給予約0.01至約20毫克/公斤，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3毫克/公斤體重之單一劑量的本發明抗體。依照症狀之嚴重度，治療之頻率和作用期可調整。給予CD48抗體之有效劑量和時程可依經驗來決定；例如可以定期評估來監看病患進步，並據此調整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項技術熟知的方法來進行(例如Mordenti等人，1991，Pharmaceut. Res. 8：1351).。
已知有各種遞送系統並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、媒介內吞作用之受體(參見，例如Wu等人，1987，J. Biol. Chem. 262：4429-4432)。導入之方法包括(但不限於)皮膚內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外或口服路徑。組成物可以任何方便的路徑給藥，例如輸注或團注、經由表皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並可與其他的生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部性。
本發明之醫藥組成物可以標準的針和注射器由皮下或靜脈內遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為再用型或拋棄型。再用型筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換內匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而內匣變空，空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之內匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的內匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一但醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多再用型筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM (Owen Mumford,Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM 筆(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)，HUMALOG MIX 75/25TM 筆、HUMALOGTM 筆、HUMALIN 70/30TM 筆(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTM I，II及III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM (Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM 筆(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，OPTIPENTM 、OPTIPEN PROTM 、OPTIPEN STARLETTM 及OPTICLIKTM (sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不限於)SOLOSTARTM 筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM (Novo Nordisk)及KWIKPENTM (Eli Lilly)、SURECLICKTM 自動注射器(Amgen，Thousand Oaks，CA)、PENLETTM (Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)及HUMIRATM 筆(Abbott Labs，Abbott Park IL)，僅提出一些。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,supra；Sefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14：201)。在另一實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。又在另一實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson，1984，於Medical Applications of Controlled Release，supra，第2冊，第115-138頁)。其他控制釋放系統係論述於Langer，1990，Science 249：1527-1533之概觀中。
可注射製備物可包括用於靜脈內、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。因此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般為每單位劑型約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的前述抗體係含有約5至約100毫，而其他劑型為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
本發明抗體可用於，尤其是，治療、預防及/或改善任何與CD48活性有關或由其媒介的疾病或病症，或可藉由阻斷CD48和CD48受體間的交互作用加以治療之疾病或病症。可以本發明之抗-CD48抗體治療的示例疾病和病症包括，例如氣喘、過敏、異位性皮膚炎、關節炎、發炎性腸疾病(例如潰瘍性結腸炎)、乳糜瀉和癌症(例如血液細胞癌症、腦癌、乳癌、大腸癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌等)。本發明之抗-CD48抗體亦可投予病患治療乾癬。可以本發明之抗-CD48抗體治療之其他疾病或病症包括，例如全身性紅斑性狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎、移植物抗宿主病(GvHD)(例如慢性GvHD或急性GvHD)及移植排斥。
組合治療
本發明包括治療性給藥療法，其係包括本發明之抗-CD48抗體與至少一種另外的治療活性組份組合給藥。此另外的治療活性組份之非限定實例包括其他的CD48拮抗劑(例如第二抗-CD48抗體或CD48之小分子抑制劑)、細胞激素抑制劑(例如，介白素-1(IL-1)抑制劑(如列洛西普(rilonacept)或阿那白滯素(anakinra)、小分子IL-1拮抗劑或抗-IL-1抗體)；IL-18抑制劑(例如小分子IL-18拮抗劑或抗-IL-18抗體)；IL-4抑制劑(例如小分子IL-4拮抗劑、抗-IL-4抗體或抗-IL-4受體抗體)；IL-6抑制劑(例如小分子IL-6拮抗劑、抗-IL-6抗體或抗-IL-6受體抗體)；阿斯匹靈(aspirin)；NSAID；類固醇(例如潑尼松(prednisone)、甲胺蝶呤(methotrexate)等)；低劑量環孢素A(cyclosporine A)；腫瘤凋亡因子(TNF)或TNF受體抑制劑(例如小分子TNF或TNFR拮抗劑或抗-TNF或TNFR抗體)；尿酸合成抑制劑(例如別嘌呤醇(allopurinol))；尿酸排泄促進劑(例如丙磺舒(probenecid)、苯磺唑酮(sulfinpyrazone)、苯溴香豆酮(benzbromarone)等)；其他的發炎抑制劑(例如胱冬酶-1(caspase-1)、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig等之抑制劑)；及/或皮質類固醇。另外的治療活性組份可在投予抗-CD48抗體之前、同時或之後給藥(就本揭示文之目的，此等給藥療法係被視為是抗-CD48抗體與本發明治療活性組份「組合」給藥)。
抗體之診斷用途
本發明之抗-CD48抗體亦可用於偵測或測量樣本中之CD48，例如供作診斷目的。例如抗-CD48抗體或其片段可用於診斷特徵為CD48異常表現(例如過度表現，表現不足，無表現等)之症狀或疾病。用於CD48之示例診斷分析包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-CD48抗體接觸，其中該抗-CD48抗體係以可偵測的標記或受體分子標定。另外，未標定的抗-CD48抗體可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合用於診斷用途。可偵測標記或受體分子可為放射性同位素，例如3 H、14 C、32 P、35 S或125 I；螢光或化學螢光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於偵測或測量樣本之CD48的特定示例分析包括酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)。
根據本發明可用於CD48診斷分析之樣本包括含有可偵測量之CD48蛋白或其片段，其在正常的生理條件下得自病患的任何組織或液體樣本。一般而言，最初係測量得自健康病患(例如未患有與異常CD48量或活性有關的疾病或症狀)之特定樣本中CD48的量作為基線。然後可將CD48之基線量與得自疑似患有CD48相關疾病或症狀之個人的樣本中所測量之CD48量作比較。
 實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明組合物之方法的完整揭示和說明，但不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍有某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數係為重量之份數，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1.產生抗人類CD48之人類抗體
於包括編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區之DNA的小鼠中直接投予包括人類CD48 ecto-區之免疫原(SEQ ID NO：384之27-220胺基酸)及佐劑，以刺激免疫反應。以CD48-專一性免疫分析監測抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，收取脾臟細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其生存力及形成雜交瘤細胞。篩選及選擇雜交瘤細胞株以辨識出產生CD48-專一性抗體之細胞株。使用此技術得到數種抗-CD48嵌合抗體(亦即，具有人類可變區和小鼠恆定區之抗體)；以此法產生之示例抗體名稱係如下：H2M1707N、H2M1709N、H2M1710N、H2M1712N、H2M1713N、H2M1763N、H2M1811N、H3M1766N、H2M1798N、及H2M1711N。
如U.S. 2007/0280945A1中所述，亦直接將抗-CD48抗體由未與骨髓瘤細胞融合之抗原陽性的B細胞分離出。使用此法，得到數種全人抗-CD48抗體(亦即，具有人類可變區和人類恆定區之抗體)；以此法產生之示例抗體名稱係如下：H4H1769Na、H4H1769Pa、H4H1769Nb、H4H1769Pb、H4H1770N、H4H1770P、H4H1771N、H4H1771P、H4H1772N、H4H1772P、H4H1774N、H4H1774P、H4H1775N、H4H1775P、H4H1778N、H4H1778P、H4H1779N、H4H1779P、H4H1781N、H4H1781P、H4H1789Na、H4H1789Pa、H4H1789Nb、H4H1789Pb。
依照此實例之方法所產生的示例性抗-CD48抗體之生物性質係詳述於下列所示的實例中。
實例2.重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列
表1係列出所選的抗-CD48抗體之重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列對及其對應的抗體識別符。N、P和G符號係指抗體具有包含相同CDR序列，但在超出CDR序列之區域(亦即，在架構區中)則含序列變異之重鏈和輕鏈。因此，特定抗體之N、P和G變體在其重鏈和輕鏈可變區中具有相同的CDR序列，但其架構區內則互不相同。在文中所用的抗體名稱中，H2M、H3M、H4H等字首係指抗體特定的Fc區。例如，「H2M」抗體具有小鼠IgG2 Fc，而「H4H」抗體則具有人類IgG4 Fc。本項技術之一般技術者應了解，H2M或H3M抗體可轉變為H4H抗體，但可變區(包括CDR)仍不變。
實例3.以表面電漿共振測定抗體與可溶性CD48之結合
人類單株抗-hCD48抗體與人類和猴子可溶性重組CD48結合之結合親和力和動力常數，係以表面電漿共振於25℃和37℃下對單體和二聚體構型CD48二者來測定。測量係於T100-2 BIACORETM 儀器(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)上進行。經由抗-Fc晶片表面捕捉抗體(含小鼠Fc[稱為"H2M"或"H3M"]或人類IgG4 Fc[稱為"H4H"])，並讓單體(以myc-myc-hexa-組胺酸C-端標籤[mmH]表現之可溶性CD48)或二聚體(以C-端Fc融合[mFc]表現之可溶性CD48)模式之CD48流過表面。用於此實例之試劑的胺基酸序列識別符係如表2所示。
表2
將可溶性CD48以不同濃度分別注射施予流式細胞，及藉由使用Biacore軟體與動力結合數據擬合，來測定動力結合(ka )和解離(kd )速率常數。從動力速率常數計算結合解離平衡常數和半解離期，如：KD =kd /ka ；t1/2 =(ln2/kd )(單位：ka=M-1 *s-1 ；kd=s-1 ；KD =M；T=min)(表3-6)。
如表3-6所示，在此實例中受試的示例抗體對人類和猴子CD48可溶性蛋白展現高結合親和力。當使用二價的CD48作為溶液相分析物時，相較於單價的CD48，觀察到結合親和力顯著增加。
實例4.以H/D交換之H4H1789Pa與CD48結合的抗原決定位定位
進行實驗測定與H4H1789Pa交互作用之CD48胺基酸殘基。就此目的，係進行H/D交換抗原決定位定位。H/D交換法之概要說明係列於，例如Ehring(1999) Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；及Engen and Smith(2001) Anal. Chem. 73：256A-265A中。
使用重組的人類CD48-myc-myc-his融合結構("hCD48-mmH"；SEQ ID NO：391)，經由H/D交換來定位CD48與H4H1789Pa結合之抗原決定位。首先將hCD48-mmH以PNGase F(New England BioLabs)於自然的條件下去糖基化。然後將H4H1789Pa以交聯劑BS3 (Thermo Scientific)共價黏附至抗-人類IgG-瓊脂糖微珠(Sigma)。
在「溶液中交換/微珠中脫離(on-solution/off-beads)」(於溶液中交換，接著於微珠中脫離交換)實驗中，配體(去糖基化hCD48-mmH)係於D2 O所製備的PBS緩衝液中氘化5分鐘或10分鐘，及然後培養2分鐘與H4H1789Pa結合。以PBS緩衝水溶液(以H2 O所製備)清洗CD48-結合微珠並培養半個交換時間。待脫離交換後，以冰冷的低pHTFA溶液從微珠中將結合的CD48溶離出。然後將溶離的CD48以固定化胃蛋白酶(Thermo Scientific)消化5分鐘。將生成的胜肽使用ZipTip層析吸量管分離，並立即以U1trafleXtreme基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間(MALDI-TOF)-TOF質譜儀分析(MS)。
在「微珠中交換/微珠中脫離(on-beads/off-beads)」(於微珠中交換，接著於微珠中脫離交換)實驗中，首先讓CD48與H4H1789Pa微珠結合，然後於D2 O中培養5分鐘或10分鐘進行交換。如「溶液中進行/微珠中脫離(on-solution/off-beads)」過程中所述，進行後續步驟。計算所有偵測到的胜肽之質心值並比較此二組實驗。
結果係概述於表7a中，該表係對所有以液相層析-基質輔助雷射脫附離子化(LC-MALDI)MS辨識出，接著以H/D交換和胃酶消化過程所偵測到的胜肽，提供中心質量-對-電荷比率之定量比較。就「溶液中交換/微珠中脫離」和「微珠中交換/微珠中脫離」二個實驗，在大部分觀察到的胜肽中得到類似的中心質量-對-電荷比率，而在「溶液中進行/微珠中脫離」實驗中，三種相當SEQ ID NO：384之60-76殘基的不同胃酶解胜肽，和七種相當於SEQ ID NO：384之107-125殘基的胜肽得到一致較高的質心值(亦即較高的氘保留)。就本實例之目的，至少0.20的正差值(Δ)係代表受抗體結合所保護的胺基酸。在表7a中，此等殘基係以黑體字及星號(*)表示。
表7a：H4H1789Pa與hCD48-mmH結合
概述於表7a之H/D交換結果係驗證二區(相當於SEQ ID NO：384之60-76和107-125胺基酸)受到保護而免於在交換後因H4H1789Pa與這些CD48上的專一性抗原決定位結合而使質子脫離交換。因為相當於69-76殘基之胜肽並無顯現明顯的質量差異，所以N-端抗原決定位區可降至SEQ ID NO：384之60-68殘基。因此，CD48上的二區域(相當於SEQ ID NO：384之60-76和107-125胺基酸)由H/D交換法係定義為供抗體H4H1789Pa與可溶性人類CD48蛋白結合之非連續的抗原決定位。這些抗體交互作用區域係位於CD48之Ig1區內且其圖解係如圖1所描繪。
為了確認前述抗原決定位定位分析之正確性和精確性，係使用具有前述定義抗原決定位之對照抗體進行另外的實驗。特言之，使用上述CD48-mmH結構(SEQ ID NO：391)及抗-Myc抗體9E10進行H/D交換實驗。Myc抗原決定位相當於SEQ ID NO：391之195-216胺基酸。
所有這些驗證實驗之實驗程序，除了使用抗-Myc抗體9E10作為試驗抗體外，係與上述H4H1789Pa實驗相同。驗證抗-Myc實驗之結果係概述於表7b中。(注意，表7b第一欄中所示的殘基編號係相當hCD48-mmH結構[SEQ ID NO：391]之實際胺基酸編號，然而表7a中第一欄所示的殘基編號已經過調整，對應全長人類CD48多肽[SEQ ID NO：384])之胺基酸編號。如前，至少0.20的正差值(Δ)係代表受抗體結合保護的胺基酸。在表7b中，此等殘基係以黑體字及星號(*)表示。
表7b：9E10與hCD48-mmH之結合
如所預期的，9E10所辨識之抗原決定位係鑑定為SEQ ID NO：391之199-222胺基酸所定義的區域。因此概述於表7b之結果確認了，用於此實例之H/D方法可確實地及精確地辨識與抗體相互作用之多肽抗原上的胺基酸殘基。
實例5.以ELISA測量抗體阻斷之CD48-2B4交互作用
人類抗-CD48單珠抗體阻斷人類CD48和猴子CD48與人類同源配體(人類2B4)結合之能力，係使用競爭性三明治ELISA(表8)來測定。將以含小鼠IgG2a Fc融合物表現之定量的生物素化二聚體人類CD48蛋白("bio-hCD48-mFc"[SEQ ID NO：387])或以含2個myc和1個6-His抗原決定位組成的標籤表現之單體猴子CD48("mfCD48-mmH"[SEQ ID NO：386])分別以不同量的抗體滴定。將這些抗體-蛋白複合物培養(1hr，25℃)，之後轉置於微量滴定盤中，其中該滴定盤係塗覆與人類IgG1(h2B4-hFc[R&D Systems,Inc.，Minneapolis，MN，型號1039-2B])或小鼠IgG2a Fc(h2B4-mFc[SEQ ID NO：389)融合之表現人類2B4受體的二聚體結構。於25℃下1小時後，清洗孔槽並以接合辣根過氧化酶(HRP)之鏈黴親和素(streptavidin)偵測結合的人類CD48，及以接合抗-myc多株抗體之HRP偵測猴子CD48。以TMB溶液建立ELISA以產生比色反應並以硫酸終止反應，之後於Victor X5盤式判讀儀上以450nm讀取吸收度。使用PrismTM 軟體將S形反應曲線與數據擬合。使用計算出的IC50值(定義為阻斷50%的hCD48或mfCD48與2B4結合所需的抗體濃度)作為阻斷效力之指標。(表8和9，NB=無觀察到結合)
如表8和9所示，所有受試的抗體皆有效地阻斷CD48和2B4間之交互作用。
實例6.抗體阻斷初級人類PBMC中IFN-γ釋放
本發明之人類抗-CD48單株抗體阻斷初級人類周邊血液單核細胞(PBMC)活化之能力，係使用IFNγ釋放分析來測量。以Ficoll-Hypaque梯度離心，從數個捐贈者的白血球濃厚液中(Leukopak，New York Blood Center，New York，NY)分離出人類PBMC。將細胞以1百萬/毫升之最終濃度再懸浮於添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中並置入96-孔的微量滴定盤(每孔200μl)。以不同量的CD48-專一性抗體培養細胞(1hr，37℃)，之後加入與蛋白G(最終濃度為0.8mg/ml，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，型號P4689)預先混合的促效劑抗-CD3(B&D Pharmingen，San Jose，California，型號555336)及抗-CD28(B&DPharmingen，San Jose，California，型號555725)抗體(二者之最終濃度皆為40 ng/ml)。於37℃及5%CO2 下48小時後，收集上清液並使用ELISA套組(B&D BIosciences，San Jose，California，型號555142)依製造商之說明測定IFNγ濃度。使用PrismTM 軟體將S形反應曲線與數據擬合。使用計算出的IC50 值(定義為阻斷50%的最大IFNγ釋放所需的抗體濃度)作為阻斷效力之指標。(表10-12；NB=無觀察到結合；ND=未測定；NC=數據非收斂)。
如表10、11和12所示，大多數的受試的抗體皆有效地阻斷初級人類PBMC中IFN-γ釋放。
實例7.抗體於初級人類混合淋巴細胞反應(MLR)分析中阻斷IFN-γ釋放
人類抗-CD48單株抗體阻斷初級人類週邊血液單核細胞(PBMC)活化之能力，係使用混合淋巴細胞反應分析來測量(表13和14)。以Ficoll-Hypaque梯度離心，從白血球濃厚液(Leukopak，New York Blood Center，New York，NY)或全血樣本(經由內部血液採集計畫所得來)分離出人類PBMC。將細胞以1百萬/毫升之最終濃度再懸浮於添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。將新鮮分離出的細胞與先前經放射線照射來自不同捐贈者之細胞以10：1比例混合並置入96-孔的微量滴定盤(每孔200μl)。細胞置入盤中後立即加入最終濃度範圍從0.01 nM置10 nM之抗體。將細胞於37℃和5%CO2 培養7天。收集上清液並使用ELISA套組(B&D BIosciences，San Jose，California，型號555142)依製造商之說明測定IFNγ濃度。使用PrismTM 軟體將S形反應曲線與數據擬合。IFNγ阻斷程度係定義為經由劑量反應數據擬合、以最大值正常化之曲線最大和最小值間的差值(表13和14中之「阻斷%」；nb=無觀察到結合；NC=數據非收斂)。使用計算出的IC50 值(定義為阻斷50%的最大IFNγ釋放所需的抗體濃度)作為阻斷效力之指標(表14)。
如表13和14所示，所有的受試的抗體在初級人類混合淋巴細胞反應(PBMC MLR)中皆有效地阻斷IFN-γ釋放。如實例6和7所驗證，候選的抗-CD48抗體在初級人類PBMC中有效地阻斷IFNγ釋放之能力顯示這些抗體可用於阻斷疾病和症狀，例如全身性紅斑性狼瘡、類風濕性關節炎、移植物抗宿主並、發炎性腸疾病、過敏、乳糜瀉、乾癬、氣喘等不適當的自體免疫反應。
實例8.抗體在以人類造血幹細胞重建的Rag2 -/- γ c -/- 小鼠中阻斷人類細胞激素釋放
人類抗-CD48單株抗體於活體內阻斷人類免疫細胞活化之能力，係使用由人類造血幹細胞重建的Rag2-/- γc -/- 小鼠所組成之嵌合動物模型來測量。將動物於出生後隨即以人類幹細胞重建並以流式細胞儀確認重建。在以拮抗劑小鼠抗-人類CD3抗體(OKT3，1μg/動物，IP注射，BioLegend，San Diego，California，型號317315)或同型對照組(自製的小鼠IgG2a抗體)治療前24 h，將完全重建之動物(12-16星期大)以腹腔內注射5mg/kg的CD48-專一性抗體或適當的同型對照組(自製的人類IgG4(S108P)抗體)。於激發24小時後取得血液樣本並使用MSD複合套組(人類促發炎9-Plex Ultra-敏感套組，MesoScale Discovery，Gaithersburg，Maryland，型號K15007C-2)依照製造商之說明測量血清之此九組人類細胞激素量。二種受試的抗體皆抑制人類細胞激素產生(表15和16)。
如表15和16所示，在活體系統內(以人類造血幹細胞重建的Rag2-/- γc -/ -小鼠)二種受試抗體皆有效地抑制人類免疫細胞之多株刺激所引發的細胞激素釋放。
實例9.抗體在異種移植物抗宿主病之模型(GvHD)中抑制體重減輕和並延長存活
人類抗-CD48單株抗體H4H1789Pa於活體內阻斷人類免疫細胞活化之能力，係使用建立在嫁接人類周邊血液單核細胞(PBMC)之免疫缺陷NOD/scid/-/- γc -/- (NSG)小鼠的異種移植物抗宿主病動物模型(GvHD)來測定。將八星期大的小鼠以靜脈注射剛分離自健康正常自願者的PBMC(第0天)。在PBMC注射後3天，以周邊血液中人類CD45細胞表面標記(以流式細胞儀偵測)陽性細胞之百分比評估嫁接成功率。在以完全抑制人類細胞嫁接之人類PBMC誘發前24小時，投予單一腹膜給劑之H4H1789Pa(10 mg/kg)(<10%的細胞在淋巴細胞門，相較於以同型對照組治療之小鼠的血液中~99%)。
在PBMC注射後7-8天，於100%未經治療的動物中，觀察到成功嫁接人類細胞，產生了GvHD癥狀(體重減輕、弓身、毛皮皺摺、虛弱等)。在第3天以H4H1789Pa單一腹膜給劑治療的小鼠，顯示體重減輕延遲(統計上顯著的係於第10天)及延長存活之傾向(圖2)。再者，人類細胞激素量係使用MSD複合套組(人類促發炎9-Plex Ultra-敏感套組，MesoScale Discovery，Gaithersburg，MD，型號K15007C-2)依製造商之說明於得自末端血流之血清中測量(第13天或更早)。以H4H1789Pa治療造成人類IL-8(55.2+21.3 pg/ml，相較於同型對照組之142.7+22.2 pg/ml)、IL-10(85.4+2.6 pg/ml對171.8+44.2 pg/ml)、IL-6(20.5+12.3 pg/ml對30.0+8.9 pg/ml)和TNF(35.3+4.5 pg/ml對51.6+1.1 pg/ml)量降低。觀察到人類GM-CSF(554.9+131.8 pg/ml對348.9+20.7 pg/ml)和IFN(4.8+0.9 ng/ml對5.0+0.5 ng/ml)之量並無下降。人類IL-1、IL-2和IL-12p70之量低於檢出下限。
如圖2所示，抗-CD48抗體H4H1789Pa，在異種GvHD(嫁接人類PBMC之NSG小鼠)之模型中延緩體重減輕(p<0.05，Dunnett’s多重比較檢定)並延長存活。這些結果確認了抗-CD48療法於GvHD治療中之功用。
實例10.抗-CD48抗體用於乳麋瀉治療之臨床試驗
乳糜瀉為慢性HLA-DQ2或DQ8限制CD4+ T細胞媒介的腸疾病，係因回應來自小麥、大麥和黑麥之特定飲食的脫醯胺麩胜肽(其對這些特定的HLA II類分子具有高親和力)，分泌干擾素-γ所造成。
進行一6-星期、雙盲、安慰劑對照、機制證明之研究，評估以抗-CD48抗體治療口服施予麩質之活檢驗證靜態乳糜瀉之效力、安全性和耐受性。十二位病患接受(3：1隨機)單一靜脈輸液之12 mg/kg的本發明抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa)或安慰劑。
包含在本研究之病患應至少進行2年無麩質飲食(每日麩質攝取5毫克)，缺乏麩質耐受性8星期，具有陽性HLA-DQ2基因型、具有陰性抗-轉麩醯胺酸酶抗體(抗-TGA)及對麥醇溶蛋白培養之PBMC干擾素-γELISpot反應為陰性。
安慰劑治療後二星期所有的病患皆接受每天16克的麩質給劑(相當約每天四片麵包)共3天，以麵粉漿液混合柳橙汁或豆奶進食。
從施予麩質前二週開始，於期間至施予後二週，以每日癥狀日記來記錄乳糜瀉癥狀，記錄噁心、脹氣、異常疼痛、昏睡、嘔吐或其他癥狀之出現和嚴重度(三級分度量表)。
從十二指腸的第二部分採集小腸活檢體用於mRNA、組織學、免疫組織化學、絨毛高度/隱窩深度(Vh/Cd)之測定及上皮內淋巴細胞(IEL)之計數，2星期的後-隨機化及2星期的後麩質施予。小腸黏膜的整體結構係以修改的Marsh分級來評估。正常黏膜(Marsh 0)，上皮內淋巴細胞增多之低程度發炎(Marsh I)，上皮內淋巴細胞增多和隱窩增生之低程度發炎(Marsh II)，及以上皮內淋巴細胞增多和隱窩增生及絨毛萎縮(Marsh III)建立乳糜瀉診斷之黃金標準。
在口服施予麩質前及施予後1和2星期，從病患採集周邊血液樣本(所有HLA-DQ2或DQ8)，並以脫醯胺及對照的麥醇溶蛋白胜肽(α-麥醇溶蛋白57-73 天然的及Q65E變體)培養純化的T細胞。受試者中T細胞之反應係藉由測量分化的IFN-γ ELISpot對脫醯胺及天然的α-麥醇溶蛋白57-73 胜肽之反應來定量，並將預期不會改變後續麩質施予之IFN-γ ELISpot對泛-HLA-DR流感胜肽血凝素胜肽HA C307-319 的反應正常化。
以生理檢驗、臨床實驗室試驗及不良的事件報告來評估安全性和耐受性。
主要療效指標，在麩質施予後2星期，中間數Vh/Cd指數應改善。第二療效指標應包括整體的Marsh腸活檢組織學得分之改善、每日乳靡瀉癥狀減少及PBMC干擾素-γELISpot對施予α-麥醇溶蛋白57-73 胜肽之反應減低。探測性療效指標應包括組織和WB mRNA、周邊T細胞表現型、組織中間數IEL數量及ELISA所測量的血清細胞激素之改變。
實例11.抗-CD48抗體用於全身性紅斑性狼瘡(SLE)治療之臨床試驗
SLE為一種免疫性疾病，其特徵為多重免疫系統異常，包括產生細胞凋亡之抗內生性核酸的自體抗體，其可導致發炎和組織損傷。體液和細胞免疫系統二者受到活化。含免疫複合物之自體抗體及慢性病毒感染激發了調節先天性和適應性免疫系統(包括T細胞、B細胞、樹突細胞及NK細胞)之I型干擾素，產生自身永久存的自體免疫循環。
進行一12-星期、雙盲、安慰劑對照、機制證明之研究，評估以抗-CD48抗體治療穩定的輕度-至-中度至重度SLE之效力、安全性和耐受性。十二位病患接受(4：1隨機)單一靜脈輸液之12 mg/kg的本發明抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa)或安慰劑。以雌激素安全性和紅班性狼瘡國家評估(SELENA)-全身性紅斑性狼瘡活性指數(SLEDAI)、SLE紅斑指數及醫師整體性評估(PGA)定期地對病患進行評估。生物標記評估包括：(i)CD20+ B細胞及CD138+漿樣細胞、CD40L+ T細胞、抗-dsDNA、ANA、免疫球蛋白(IgG、IgM、IgE和IgA)及補體組成份C1q、C3、C4和C5a；(ii)細胞激素之量，包括ELISA之干擾素-α和干擾素-γ、IL-10、IL-6、IL-15、IL-21和BLyS；(iii)以FACS之表面標記分析之循環中T、B、NK和T-調節細胞的總數；及/或(iv)評估全血中白細胞數目之變化(例如白血球減少之正常化)及包括皮膚mRNA基因調控。實驗室評量亦可包括連續PK及抗-藥物抗體。
主要研究的納入/排除標準包括：(i)年齡18至70歲之成人；(ii)篩選前至少二個月為穩定的SLE疾病活動性；及(iii)保持無藥物治療或以低劑量潑尼松(prednisone)、抗瘧疾藥、NSAID、硫唑嘌呤(azathioprine)或嗎替麥考酚酯(myclopnolate mofetil)療法穩定治療。
本研究所選擇之病患應具有可測量的抗-dsDNA、抗-史密斯、抗-RNP或抗-修格蘭氏抗體。排除具有活動性狼瘡腎炎，需要血液透析之病患。排除在四星期內具有嚴重感染病史之病患。
以基線和第4周抗-CD48治療間之抗-dsDNA抗體下降及補體C3和C4增加來評估效力。改善之探測性療效指標包括SELENA-SLEDAI、PGA和SLE紅斑指數。以生理檢驗、臨床實驗室試驗及不良的事件報告來評估安全性和耐受性。
實例12.抗-CD48抗體用於乾癬治療之臨床試驗
乾癬之病理生理學係與導致細胞激素、趨化激素和生長因子分泌之異常免疫媒介的Th1和Th17淋巴細胞發炎反應有關，其可活化和增生角質化細胞。這些過程導致了實質的白細胞浸潤及表皮增厚，成為乾癬班塊之標準病理特徵。
進行一12-星期、雙盲、安慰劑對照、觀點證明之研究，評估以本發明抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa)治療中度-至-重度乾癬之效力、安全性和耐受性。十二位病患接受(4：1隨機)單-一靜脈輸液之12 mg/kg的本發明抗-CD48抗體或安慰劑。以乾癬面積及嚴重程度指數(PASI)評分、醫師整體性評估(PGA)評分、DLQ、攝影、臨床觀察及包括PK和抗-藥物抗體之實驗室測量，定期地對病患進行評估。
以基線和第8周抗-CD48治療間之PASI變化來評估效力。主要療效指標為從基線至第8周間PASI得分改善75%。第二療效指標包括基線至第8周間PASI、PGA和DLQ改善50%。以生理檢驗、臨床實驗室試驗及不良的事件報告來評估安全性和耐受性。
主要研究的納入/排除標準包括：(i)年齡18至70歲之成人；(ii)至少六個月期間的慢性班塊乾癬；(iii)BSA改善10%；(iv) PASI的改善12；(v)全身和光照治療之候選人；(vi)目前沒有使用全身性治療或於特定的藥物廓清期內使用；及/或(vii)之前並沒有因為無功效而中止生物治療。
實例13.抗-CD48抗體用於潰瘍性結腸炎治療之臨床試驗
潰瘍性結腸炎之病理生理學特徵為腸壁中抗共生菌叢之CD4+T細胞適應性免疫反應過度反應。活化的Th1和Th17淋巴細胞釋放促發炎趨化激素和細胞激素，造成嗜中性細胞和單核細胞被招募至腸中。抗-CD48之共刺激阻斷係具有防止微生物性活化的APC與先天的T幫手細胞相互作用之潛力，其中活化的APC與先天的T幫手細胞之相互作用可能會造成及維持慢性的黏膜發炎反應。
進行一12-星期、雙盲、安慰劑對照、觀點證明之研究，評估以4星期的抗-CD48抗體治療中度-至-重度癥狀之潰瘍性結腸炎病患的效力、安全性和耐受性。七十位病患於基線時接受(1：1隨機)單一靜脈輸液之本發明抗-CD48抗體(例如H4H1789Pa)或安慰劑。在本研究中病患年齡為18-70歲，且經診斷已具有(經篩選，包括)6-10分之疾病活動指數評分(12級分度量表)的潰瘍性結腸炎。在篩選前病患應服用胺基水楊酸至少1個月，隨機化前以穩定劑量進行至少2星期。若病患在本研究前服用任何其他潰瘍性結腸炎藥物，則此藥物治療之劑量在隨機化前應為穩定的至少1個月。有關服用硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤之病患，僅在篩選前已進行這些藥物治療至少3個月之病患才可納入本研究。
主要的功效分析係評估從基線至第4星期之潰瘍性結腸炎活動指數得分之平均值變化，作為治療組分派之函數。每一治療組35位病患之樣本大小(在第4星期每組29位具可評估之數據)在5%顯著水準對偵測安慰劑組和活性劑治療間差異具有至少80%之檢定力，假設治療組間至少3分之平均差異，具4之正常SD或更低。
第二功效分析係評估從基線至第4星期疾病活動指數得分下降低3分或以上之病患(回應者)的比例。假設安慰劑回應比例不超過60%而活性劑組之回應比率比安慰劑組至少多40%(例如30%安慰劑回應者對照>70%活性劑組回應者)，每一組35位受試者之樣本大小(在第4星期每組29位具可評估之數據)在5%顯著水準對偵測安慰劑組和活性劑治療間的差異具有至少80%之檢定力。
亦比較第二功效的療效分析(大便頻率之改變、直腸出血、排便節制、內視鏡表徵、研究者的整體評估和病患的整體評估)作為基線至第4星期之治療組函數。此外，採取腸組織活檢體用於白細胞浸潤之定量(T細胞、活化地巨噬細胞)並使用免疫組織化學表面標記以細胞表型分析來確認。
本發明並不希望被限制於文中所述的特定實施例之範圍中。實際上，除了該等文中所述之外，由前述說明及伴隨的圖示，各種本發明之修改對熟習本項技術者為顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
圖1. 　人類CD48多肽(SEQ ID NO：384)之線性圖示。胺基酸1-26所代表之部分為單一序列；胺基酸29-127所代表之部分為Ig1區；胺基酸132-212所代表之部分為Ig2區。相當於胺基酸60-68(YTFDQKIVE)和107-125(YIMRVLKKTGNEQEWKIKL)之SEQ ID NO：384區域代表就稱為H4H1789Pa之示例抗體所測定的抗原決定位(參見實例4)。
圖2. 　以圖形表示之移植物抗宿主病的小鼠模型中抗-CD48抗體治療之效用(參見實例9)。A圖係顯示於治療組和對照組動物中所觀察到的體重減輕；B圖係顯示治療組和對照組動物之存活百分率。二圖中(●)係指無治療；(▲)係指hIgG4同型對照組治療；而(■)係指以示例的抗-CD48抗體H4H1789Pa治療。
<110>　Classon,Brendan
Kostic,Ana
Duan,xunbao
<120>　對CD48具高親和力之人類抗體
<130>　6350A
<140>　依分派
<141>　據此建檔
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<170>　FastsEQ for Windows Version 4.0
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<213>　智人
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Claims (15)

  1. 一種單離抗體或其抗原結合片段，其係與人類CD48(SEQ ID NO：384)專一性結合並阻斷人類CD48和CD48受體間之交互作用，其中該抗體或其抗原結合片段係包括含重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)的具有SEQ ID NO：368胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)及具有SEQ ID NO：370胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該CD48受體為人類CD2(SEQ ID NO：392)。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該CD48受體為人類2B4(SEQ ID NO：390)。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段在活體外抑制初級人類週邊血液單核細胞(PBMC)之活化。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係與人類CD48之Ig1區內(SEQ ID NO：384之29至127胺基酸)的抗原決定位結合。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體或抗原結合片段，其 中該抗體或抗原結合片段係與位於SEQ ID NO：384之60至125胺基酸內的一或多個胺基酸相互作用。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係與位於SEQ ID NO：384之60至68胺基酸及/或SEQ ID NO：384之107至125胺基酸內的一或多個胺基酸相互作用。
  8. 如申請專利範圍第7項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係與位於SEQ ID NO：384之60至68胺基酸內的一或多個胺基酸，及與位於SEQ ID NO：384之107至125胺基酸內的一或多個胺基酸相互作用。
  9. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係包括具有各為SEQ ID NO：354、356、358、362、364和366胺基酸序列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3之重鏈和輕鏈CDR。
  10. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係包括具有SEQ ID NO：368胺基酸序列之HCVR，及具有SEQ ID NO：370胺基酸序列之LCVR。
  11. 一種醫藥組成物，其係包括如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，其係用於治療患有、診斷有或具有罹患可藉由阻斷CD48和CD48受體間的交互作用加以治療之疾病或病症風險的病患。
  13. 如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該可藉由阻斷CD48和CD48受體間的交互作用而加以治療之疾病或病症為由下列組成之群中選出之疾病或病症：乳糜瀉、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性結腸炎和乾癬。
  14. 一種如申請專利範圍第1至10項中任一項之單離抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第11項之醫藥組成物於製造醫藥品之用途，該醫藥品供用於治療患有、診斷有或具有罹患可藉由阻斷CD48和CD48受體間的交互作用加以治療之疾病或病症風險的病患。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該可藉由阻斷CD48和CD48受體間的交互作用而加以治療之 疾病或病症為由下列組成之群中選出之疾病或病症：乳糜瀉、全身性紅斑性狼瘡、潰瘍性結腸炎和乾癬。
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