KR20140014067A - 항-cd48 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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브렌단 제이. 클라손
아나 코스틱
순바오 두안
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리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CD48에 결합하는 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 항체는 인간 CD48에 결합하는 완전한 인간 항체이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 상기 항체는 CD48이 하나 이상의 CD48 수용체에 결합하는 것을 차단한다. 본 발명의 항체는 그 중에서도 알레르기 질환 및 다른 염증성 증상의 치료를 포함하는 하나 이상의 CD48의 생물학적 활성과 연관된 질환 및 질병의 치료에 유용하다.

Description

항-CD48 항체 및 그의 용도{ANTI-CD48 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 CD48에 특이적인 항체 및 그의 항원-결합 절편(fragment)에 관한 것이다.
CD48은 막-결합 및 가용성 형태 모두로 존재하는 GPI-고정된 단백질이다. CD48은 2B4에 대한 고-친화성 리간드(ligand)이고 CD2에 대한 저-친화성 리간드이다. 또한, CD48은 과학 문헌에서는 "TCT.1"(Mami-Chouaib et al., J. Exp. Med. 172:1,071-1,082 (1990)), "B-LAST 1"(Thorley-Lawson et al., Cell 30:415-425 (1982)) 및 SLAMF2(Detre et al., Semin, Immunopathol. 32:157-171 (2010))로 불려지고 있다. CD48과 2B4 사이의 상호작용은 NK 세포 활성화를 초래하는 것으로 나타나 있다. 또한, CD48은 시험관내에서 T-세포 활성화를 촉진하고, CD48-낙아웃(knockout) 마우스는 손상된 T-세포 증식 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다.
특정한 계열의 증거들은 천식 진행 및 염증성 장 질환(IBD)에서의 CD48의 역할을 제시한다. 예를 들면, CD48은 실험적 천식(예컨대, 오브알부민- 및 아스퍼질러스-유도성 알레르기성 호산구 기도 염증 모델)에서 상향조절(upregulation)되는 것으로 나타났다(예컨대, Munitz et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175:911-918 (2007) 참조). 아울러, CD48 낙아웃 마우스는 IBD의 입양성(adoptive) 전달 모델에서 염증성 대장염을 발생시키는데 실패하였다. 아울러, CD48 길항작용(antagonism)은 종래 확립된 대장염에서 유익한 효과를 생성하는 것으로 나타났다.
치료학적 목적으로 CD48 길항제(antagonist)를 사용하는 것은, 예컨대 US 2007/0212353 및 WO 97/35614에 언급되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 기술분야에서는 CD48-매개성 질환 및 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있는 항-CD48 항체를 포함하는 신규한 CD48 조절제에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 인간 CD48에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 그 중에서도 CD48-매개성 신호전달(signaling)을 억제하고, CD48 활성 및/또는 신호전달에 의해 초래되거나 이와 연관되는 질환 및 질병을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 항체는 CD48과 CD48 수용체(예컨대, 2B4 및/또는 CD2) 사이의 상호작용을 차단하거나, 및/또는 원발성(primary) 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 활성화를 억제한다. 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 CD48의 제1 면역글로불린 도메인 내의 에피토프(epitope)에 결합한다.
본 발명의 항체는 완전한-길이(full-length)(예를 들면, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 항원-결합 부위(예를 들면, Fab, F(ab')2 또는 scFv 절편)만을 포함할 수 있고, 예컨대 잔류 작용기(effector) 기능을 제거하기 위해 기능성에 영향을 미치도록 변형될 수 있다(Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1,925-1,933).
본 발명은 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 162, 178, 192, 208, 212, 228, 232, 248, 252, 268, 272, 288, 292, 308, 312, 328, 332, 348, 352 및 368, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(identity)을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 146, 154, 170, 180, 182, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 372 및 380, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/180, 162/182, 178/190, 192/200, 208/210, 212/220, 228/230, 232/240, 248/250, 252/260, 268/270, 272/280, 288/290, 292/300, 308/310, 312/320, 328/330, 332/340, 348/350, 352/360, 368/370, 352/372 및 368/380으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(LCVR/LCVR) 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 168, 198, 218, 238, 258, 278, 298, 318, 338 및 358, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 152, 160, 176, 188, 206, 226, 246, 266, 286, 306, 326, 346, 366 및 378, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 제공한다.
어떤 구현예에서, 상기 항체 또는 항체의 항원-결합 부위는 서열번호 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 168/176, 168/188, 198/206, 218/226, 238/246, 258/266, 278/286, 298/306, 318/326, 338/346, 358/366 및 358/378로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 164, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 314, 334 및 354, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 166, 196, 216, 236, 256, 276, 296, 316, 336 및 356, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 148, 156, 172, 184, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362 및 374, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 150, 158, 174, 186, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364 및 376, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이와 실질적으로 유사한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 절편을 제공한다.
본 발명의 어떤 비제한적인 예시적 항체 및 항원-결합 절편은 각각 서열번호 4-6-8-12-14-16(예컨대, H2M1707N); 20-22-24-28-30-32(예컨대, H2M1709N); 36-38-40-44-46-48(예컨대, H2M1710N); 52-54-56-60-62-64(예컨대, H2M1712N); 68-70-72-76-78-80(예컨대, H2M1713N); 84-86-88-92-94-96(예컨대, H2M1763N); 100-102-104-108-110-112(예컨대, H2M1764N); 116-118-120-124-126-128(예컨대, H2M1811N); 132-134-136-140-142-144(예컨대, H2M1766N); 164-166-168-172-174-176(예컨대, H4H1769N-a); 164-166-168-184-86-188(예컨대, H4H1769N-b); 194-196-198-202-204-206(예컨대, H4H1770N); 214-216-218-222-224-226(예컨대, H4H1771N); 234-236-238-242-244-246(예컨대, H4H1772N); 254-256-258-262-264-266(예컨대, H4H1774N); 274-276-278-282-284-286(예컨대, H4H1775N); 294-296-298-302-304-306(예컨대, H4H1778N); 314-316-318-322-324-326(예컨대, H4H1779N); 334-336-338-342-344-346(예컨대, H4H1781N); 354-356-358-362-364-366(예컨대, H4H1789Na 및 Pa); 및 354-356-358-374-376-378(예컨대, H4H1789Nb 및 Pb)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함한다.
또한, 본 발명은 각각 HCDR1 = GFTFSNYG(서열번호 254); HCDR2 = IWYDDSXK(상기에서, X 는 S 또는 N)(서열번호 381); HCDR3 = ARDRWTYSHXFEY(상기에서, X는 Y 또는 F)(서열번호 382); LCDR1 = QXISSW(상기에서, X는 D 또는 G)(서열번호 383); LCDR2 = AAS(서열번호 264); 및 LCDR3 = QQANSFPRT(서열번호 266)의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 포함한다. 이러한 서열 특성을 갖는 본 발명의 비제한적인 예시적 항체는 H4H1774N, H4H1775N, H4H1778N, H4H1779N 및 H4H1781N을 포함한다.
연관된 구현예에서, 본 발명은 CD48에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 포함하며, 상기 항체 또는 절편은 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 162/170, 178/180, 162/182, 178/190, 192/200, 208/210, 212/220, 228/230, 232/240, 248/250, 252/260, 268/270, 272/280, 288/290, 292/300, 308/310, 312/320, 328/330, 332/340, 348/350, 352/360, 368/370, 352/372 및 368/380으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 서열 내에 함유되는 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하는 방법 및 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명에 개시된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하기 위해 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 종래기술은, 예컨대 Kabat 정의(definition), Chothia 정의 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 용어로서, 상기 Kabat 정의는 서열 가변성(sequence variability)에 기초하고, 상기 Chothia 정의는 구조 루프 영역의 위치에 기초하며, AbM 정의는 상기 Kabat과 Chothia 접근법의 절충안(compromise)이다(Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9,268-9,272 (1989) 참조). 또한, 항체 내의 CDR 서열을 확인하기 위하여 공개된 데이터베이스를 이용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-CD48 항체 또는 그의 절편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명의 핵산을 운반하는 재조합 발현 벡터 및 그 내부로 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포뿐만 아니라, 항체의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양함으로써 상기 항체를 생산하는 방법 및 생산된 항체를 회수하는 방법도 본 발명에 의해 포괄된다.
한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 161, 177, 191, 207, 211, 227, 231, 247, 251, 267, 271, 287, 291, 307, 311, 327, 331, 347, 351 및 367, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성(homology)을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 HCVR을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 145, 153, 169, 179, 181, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 371 및 379, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 LCVR을 포함하는 항체 또는 그의 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 167, 197, 217, 237, 257, 277, 297, 317, 337 및 357, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 HCDR3 도메인; 및 서열번호 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 151, 159, 175, 187, 205, 225, 245, 265, 285, 305, 325, 345, 365 및 377, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 LCDR3 도메인을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 163, 193, 213, 233, 253, 273, 293, 313, 333 및 353, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 HCDR1 도메인; 서열번호 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 195, 215, 235, 255, 275, 295, 315, 335 및 355, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 HCDR2 도메인; 서열번호 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 147, 155, 171, 183, 201, 221, 241, 261, 281, 301, 321, 341, 361 및 373, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 LCDR1 도메인; 및 서열번호 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 149, 157, 173, 185, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363 및 375, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 LCDR2 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 절편을 제공한다.
어떤 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 절편은 서열번호 1 및 9(예컨대, H2M1707N), 17 및 25(예컨대, H2M1709N), 33 및 41(예컨대, H2M1710N), 49 및 57(예컨대, H2M1712N), 65 및 73(예컨대, H2M1713N), 81 및 89(예컨대, H2M1763N), 97 및 105(예컨대, H2M1764N), 113 및 121(예컨대, H2M1811N), 129 및 137(예컨대, H2M1766N), 161 및 169(예컨대, H4H1769N-a), 177 및 179(예컨대, H4H1769P-a), 161 및 181(예컨대, H4H1769N-b), 177 및 189(예컨대, H4H1769P-b), 191 및 199(예컨대, H4H1770N), 207 및 209(예컨대, H4H1770P), 211 및 219(예컨대, H4H1771N), 227 및 229(예컨대, H4H1771P), 231 및 239(예컨대, H4H1772N), 247 및 249(예컨대, H4H1772P), 251 및 259(예컨대, H4H1774N), 267 및 269(예컨대, H4H1774P), 271 및 279(예컨대, H4H1775N), 287 및 289(예컨대, H4H1775P), 291 및 299(예컨대, H4H1778N), 307 및 309(예컨대, H4H1778P), 311 및 319(예컨대, H4H1779N), 327 및 329(예컨대, H4H1779P), 331 및 339(예컨대, H4H1781N), 347 및 349(예컨대, H4H1781P), 351 및 359(예컨대, H4H1789Na), 367 및 369(예컨대, H4H1789Pa), 351 및 371(예컨대, H4H1789Nb) 또는 367 및 379(예컨대, H4H1789Pb)의 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-CD48 항체를 포함한다. 어떤 적용분야에서, 원하지 않는 글리코실화 위치를 제거하는 변형, 또는 예를 들면, 항체 의존성 세포의 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 기능을 증가시키기 위하여 올리고사카라이드 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티(moiety)가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield et al., (2002) JBC 277:26733 참조).
다른 측면에서, 본 발명은 CD48에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 그의 절편 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 연관된 측면에서, 본 발명은 CD48 억제제와 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 상기 CD48 억제제는 항체 또는 그의 절편이다. 한 구현예에서, 상기 제2 치료제는 CD48 억제제와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. CD48 억제제와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는 CD48 활성을 억제하는 다른 제제(다른 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 펩티드 억제제, 소분자 길항제 등을 포함) 및/또는 CD48 상류(upstream) 또는 하류(downstream) 신호전달을 간섭하는 제제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD48 항체 또는 항체의 항원-결합 부위를 이용하여 CD48 활성을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 치료 방법은 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 절편을 포함하는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 질병은 CD48 활성의 제거, 억제 또는 감소에 의해 향상, 개선, 억제 또는 방지되는 임의의 질환 또는 증상이다. 본 발명의 항-CD48 항체 또는 항체 절편은 CD48과 CD48 수용체(예컨대, 2B4 및/또는 CD2) 사이의 상호작용을 차단하거나, 또는 달리 CD48의 신호전달 활성을 억제하는 기능을 할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항-CD48 항체 또는 항체의 항원 결합 부위를 환자에서 CD48 활성과 연관되거나 이것에 의해 초래되는 질환 또는 질병을 치료하기 위한 약물의 제조에 사용하는 용도를 포함한다.
다른 구현예들은 하기 상세한 설명의 검토로부터 명확해질 것이다.
본 발명을 개시하기 전에, 본 발명은 개시된 특정한 방법 및 실험 조건에 한정되는 것이 아님이 이해되어야 하며, 그 이유는 이러한 방법 및 조건은 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어는 특정 구현예를 개시하기 위한 목적일 뿐이고, 제한할 의도가 아님이 이해되어야 하며, 그 이유는 본 발명의 범위는 부속하는 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
달리 정의하지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 특정 인용된 수 값과 관련하여 사용될 때 상기 값이 상기 인용된 값으로부터 1%보다 많지 않게 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본 발명에서 사용된 바와 같이, "약 100"이란 표현은 99 및 101과 그 사이의 모든 값(예컨대, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 발명에 개시된 것과 동일하거나 동등한 임의의 방법 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질들이 이제 개시된다.
정의
본 발명에서 사용된 바와 같이, "CD48" 및 "CD48 절편"이란 표현은 비-인간 종 유래임을 특정하지 않는 한(예컨대, "마우스 CD48", "마우스 CD48 절편", "원숭이 CD48", "원숭이 CD48 절편" 등) 인간 CD48 단백질 또는 절편을 나타낸다. 인간 CD48은 서열번호 384의 아미노산 서열을 갖는다. 비-인간 종(예컨대, 마우스, 원숭이, 토끼, 개, 돼지 등) 유래 CD48 분자의 아미노산 서열은 유전자은행(예컨대, GenBank 접근 번호 BAE96326.1(마우스); DAA31966.1(소); EDL94663.1(토끼); 등)과 같은 공공 공급원(public source)으로부터 이용가능하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "CD48 수용체"란 용어는 상기 인간 CD48 단백질이 생체내에서 생물학적 신호를 전달하기 위해 상호작용하는 단백질을 의미한다. "CD48 수용체"란 용어는 인간 2B4 및 인간 CD2를 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "인간 2B4"란 용어는 서열번호 390의 아미노산 서열 또는 CD48과 상호작용할 수 있는 그의 일부를 포함하는 단백질을 의미한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "인간 CD2"란 용어는 서열번호 392의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 CD48과 상호작용할 수 있는 그의 일부를 포함하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 이황화 결합에 의해 상호결합된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)의 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 그의 멀티머(multimer)(예컨대, IgM)를 나타내기 위한 의도이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(variable region)(본 발명에서 HCVR 또는 VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역(constant region)을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 발명에서 LCVR 또는 VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역은 보다 보존되고 뼈대 영역(framework region, FR)으로 명명된 영역 내에 배치되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 명명되는 초가변성(hypervariability) 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기의 순서로 배열되는 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항-CD48 항체(또는 그의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식선(germline) 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인위적으로 변형될 수 있다. 아미노산 보존 서열은 2 이상의 CDR을 함께 분석한 것에 기초하여 정의될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 완전한 항체 분자의 항원-결합 절편을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부위", 항체의 "항원-결합 절편"이란 용어 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 자연적으로 발생하는, 효소적으로 얻을 수 있는, 합성의, 또는 유전공학적으로 가공된 임의의 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 절편은, 예컨대, 항체의 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 취급 및 발현을 포함하는 단백질분해성 소화 또는 재조합 유전공학 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 이용하여 완전한 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있거나, 및/또는, 예컨대 상업적 공급원, DNA 라이브러리(library)(예컨대, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 손쉽게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. 상기 DNA는 화학적으로 또는, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 형상(configuration)으로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 추가 또는 삭제하는 등의 분자 생물학 기술을 이용함으로써 서열확인(sequencing) 및 취급될 수 있다.
항원-결합 절편의 비제한적인 예는 (ⅰ) Fab 절편; (ⅱ) F(ab')2 절편; (ⅲ) Fd 절편; (ⅳ) Fv 절편; (ⅴ) 단쇄(single-chain) Fv(ScFv) 분자; (ⅵ) dAb 절편; 및 (ⅶ) 항체의 초가변 영역을 흉내내는 아미노산 잔기(예컨대, CDR3 펩티드와 같은 단리된(isolated) 상보성 결정 영역(CDR)) 또는 제한된(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어지는 최소 인식 단위를 포함한다. 또한, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-삭제된 항체, 키메라(chimera) 항체, CDR-이식된 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody)(예컨대, 1가(monovalent) 나노바디, 2가(divalent) 나노바디 등), 소형 모듈성 면역제제(small modular immunopharmaceuticals, SMIPs), 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 가공된 분자가 본 발명에서 사용된 바와 같은 "항원-결합 절편"이란 표현 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 절편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 뼈대 서열과 인접하거나 뼈대 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연관된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 도메인에서, 상기 VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들면, 상기 가변 영역은 다이머(dimer)일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 다이머를 함유할 수 있다. 다른 한편으로, 항체의 항원-결합 절편은 모노머성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
어떤 구현예에서, 항체의 항원-결합 절편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 절편 내에 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적인 형상은 (ⅰ) VH-CH1; (ⅱ) VH-CH2; (ⅲ) VH-CH3; (ⅳ) VH-CH1-CH2; (ⅴ) VH-CH1-CH2-CH3; (ⅵ) VH-CH2-CH3; (ⅶ) VH -CL; (ⅷ) VL-CH1; (ⅸ) VL-CH2; (ⅹ) VL-CH3; (ⅹⅰ) VL-CH1-CH2; (ⅹⅱ) VL-CH1-CH2-CH3; (ⅹⅲ) VL-CH2-CH3; 및 (ⅹⅳ) VL-CL을 포함한다. 상기 나열된 임의의 예시적인 형상을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 형상에 있어서, 상기 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 결합되거나, 또는 전체 또는 부분 힌지(hinge) 또는 결합 영역에 의해 결합될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자 내의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연성(flexible) 또는 반-유연성 결합을 형성하는 적어도 2개(예컨대, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 아울러, 본 발명의 항체의 항원-결합 절편은 서로 및/또는 하나 이상의 모노머성 VH 또는 VL 도메인과 비-공유결합되는(예컨대, 이황화 결합(들)에 의해) 상기 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 형상의 호모-다이머 또는 헤테로-다이머(또는 다른 멀티머)를 포함할 수 있다.
완전한 항체 분자와 같이, 항원-결합 절편은 단일특이적(monospecific) 또는 다중특이적(multispecific)(예컨대, 양특이적(bispecific))일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 절편은 전형적으로 각각의 가변 도메인이 별도의(separate) 항원 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이다. 본 발명에 개시된 예시적인 양특이적 항체 포맷(format)을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷이 본 기술분야에서 이용가능한 일상적인(routine) 기술을 이용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 절편의 맥락(context)에 사용되기 위해 채용될 수 있다.
본 발명의 항체는 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존성 세포독성(CDC)"은 보체의 존재 하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 나타낸다. "항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC)"은 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예컨대, 자연 살상(Natural Killer, NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하여 상기 표적 세포를 용해시키는 세포-매개성 반응을 나타낸다. CDC 및 ADCC는 본 기술분야에 잘 알려지고 이용가능한 분석을 이용함으로써 측정될 수 있다(예컨대, 미국 제5,500,362호 및 제5,821,337호) 및 Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 참조). 항체의 불변 영역은 항체를 보체에 고정하고 세포-의존성 세포독성을 매개하는 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 아형(isotype)은 상기 항체가 세포독성을 매개하는데 바람직한지 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"란 용어는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 의도이다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들면, CDR 내, 특히 CDR3 내에 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내에서 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이에 의해, 또는 생체내에서 체세포성(somatic) 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"란 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식선 유래의 CDR 서열이 인간 뼈대 서열에 이식된 항체를 포함하기 위한 의도는 아니다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "재조합 인간 항체"란 용어는 숙주 세포 내로 전달감염(transfection)된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현되는 항체(아래에 추가로 기재됨), 재조합, 조합적(combinatorial) 인간 항체 라이브리로부터 단리된 항체(아래에 추가로 기재됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식되는 동물(예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체(예컨대, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6,287-6,295 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체를 포함하기 위한 의도이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 어떤 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이(또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자이식되는 동물이 사용될 때에는 생체내 체세포성 돌연변이)를 겪고, 따라서 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 연관되지만, 생체내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이질성(heterogeneity)으로 연관되는 2가지 형태로 존재할 수 있다. 한 형태에서, 면역글로불린 분자는 사슬간(interchain) 중쇄 이황화 결합에 의해 다이머가 함께 고정되는 대략 150-160 kDa의 안정한 4개의 사슬 구조체(construct)를 포함한다. 제2 형태에서, 상기 다이머는 사슬간 이황화 결합을 통해 결합되지 않으며, 공유결합으로 커플링된 경쇄 및 중쇄로 이루어지는 약 75-80 kDa의 분자가 형성된다(반(half)-항체). 상기 형태는 심지어 친화 정제 후에도 분리하기가 매우 어렵다.
다양한 온전한(intact) IgG 아형 내에서 상기 제2 형태가 출현하는 빈도는 상기 항체의 힌지 영역 아형과 연관되는 구조적 차이로 인한 것이지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역 내의 1개 아미노산이 치환되면, 상기 제2 형태의 출현을 전형적으로 인간 IgG1 힌지를 이용하여 관찰되는 레벨(level)까지 현저하게 감소시킬 수 있다(Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105). 본 발명은, 예를 들면, 생산시 원하는 항체 형태의 수율을 개선하기 위하여 상기 힌지, CH2 또는 CH3 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포괄한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 그 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 확인 및 분리되거나 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 예를 들면, 생물(organism)의 적어도 하나의 성분, 또는 상기 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리 또는 제거된 항체는 본 발명의 목적을 위하여 "단리된 항체"이다. 또한, 상기 단리된 항체는 재조합 세포 내의 제자리(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 어떤 구현예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
"특이적으로 결합하는" 등의 용어는 항체 또는 그의 항원-결합 절편이 항원과 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정한 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 항체가 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같이, 인간 CD48에 "특이적으로 결합하는" 항체는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때 인간 CD48 또는 그의 일부에 약 1,000 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 300 nM 이하, 약 200 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.5 nM 이하의 Kd로 결합하는 항체를 포함한다(예컨대, 본 발명의 실시예 3 참조). 그러나, 인간 CD48에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 (비-인간) 종의 CD48 분자와 같은 다른 항원에 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "중성화" 또는 "차단" 항체는 CD48에 결합하면 (ⅰ) CD48 또는 CD48 절편과 CD48 수용체(예컨대, 2B4 및/또는 CD2) 사이의 상호작용을 간섭하거나, 및/또는 (ⅱ) CD48의 적어도 하나의 생물학적 기능을 억제하게 되는 항체를 나타내기 위한 의도이다. CD48 중성화 또는 차단 항체에 의해 초래되는 억제는 적절한 분석을 이용하여 검출가능하는 한 완전할 필요는 없다. CD48 억제를 검출하기 위한 예시적인 분석은 본 발명에 개시되어 있다.
본 발명에 개시된 항-CD48 항체는 상기 항체가 유래되는 대응하는 생식선 서열과 비교하여 뼈대 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 삭제를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본 발명에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들면, 공공 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식선 서열과 비교함으로써 손쉽게 알아낼 수 있다. 본 발명은 항체, 본 발명에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유래되는 그의 항원-결합 절편을 포함하며, 하나 이상의 뼈대 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산이 상기 항체가 유래되는 생식선 서열의 대응하는 잔기(들), 또는 다른 인간 생식선 서열의 대응하는 잔기(들), 또는 대응하는 생식선 잔기(들)의 보존된 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본 발명에서 집합적으로 "생식선 돌연변이"라 나타냄). 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 이용하여 개별 생식선 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는 다양한 항체 및 항원-결합 절편을 용이하게 생성할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 뼈대 및/또는 VH 및/또는 VL 도메인 내의 CDR 잔기는 모두 상기 항체가 유래되는 원래의(original) 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 특정 잔기들만 상기 원래의 생식선 서열로 다시 돌연변이되며, 예컨대 상기 돌연변이된 잔기는 FR1의 처음 8개 아미노산 내, 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서만 발견되거나, 상기 돌연변이된 잔기는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서만 발견된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 뼈대 및/또는 CDR 잔기(들)가 상이한 생식선 서열(즉, 상기 항체가 원래 유래되는 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 대응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 아울러, 본 발명의 항체는 상기 뼈대 및/또는 CDR 영역 내에 2 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있으며, 예컨대 어떤 개별 잔기는 특정 생식선 서열의 대응하는 잔기로 돌연변이되고, 상기 원래의 생식선 서열과 상이한 어떤 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식선 서열의 대응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 입수되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 절편은 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선된 또는 향상된 길항제성 또는 작용제성 생물학 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 용이하게 테스트될 수 있다. 상기 일반적인 방식에 의해 얻어진 항체 및 항원-결합 절편은 본 발명 내에 포괄된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 보존성(conservative) 치환을 갖는 본 발명에 개시된 임의의 상기 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체(variant)를 포함하는 항-CD48 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 예컨대 본 발명에 개시된 임의의 상기 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 대해 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존성 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-CD48 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "표면 플라스몬 공명"이란 용어는, 예를 들면, BIAcore™ 시스템(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스(biosensor matrix) 내의 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 상호작용을 분석하도록 하는 선택적인 현상을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "KD"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 나타내기 위한 의도이다.
"에피토프"란 용어는 파라토프(paratope)로 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역 내의 특이적 항원 결합 위치와 상호작용하는 항원성 결정부(determinant)를 나타낸다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체가 항원의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체적(conformational) 또는 선형일 수 있다. 입체적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 세그먼트(segment) 유래의 공간적으로 병치된(juxtaposed) 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성되는 것이다. 어떤 환경에서, 에피토프는 상기 항원 상의 사카라이드, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다.
핵산 또는 그의 절편을 나타낼 때의 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"이란 용어는, 적합한 뉴클레오티드가 삽입 또는 삭제되어 다른 핵산(또는 그 상보적 가닥(strand))과 최적으로 배열될 때, 아래에 논의된 바와 같이 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 서열 동일성의 임의의 잘 알려진 알고리즘에 의해 측정될 때 상기 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성이 있는 것을 나타낸다. 어떤 경우, 참조 핵산 분자와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자는 상기 참조 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
폴리펩티드에 적용될 때, "실직적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"이란 용어는, GAP 또는 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 이용하는 BESTFIT와 같은 프로그램에 의해 최적으로 배열될 때, 2개의 폴리펩티드 서열이 적어도 95%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 달라진다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하 또는 소수성도(hydrophobicity))의 측쇄(R 기)를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 보존성 치환에 의해 2 이상의 아미노산 서열이 서로 상이한 경우, 서열 동일성 또는 유사성 정도의 백분율은 상기 치환의 보존성 본성(nature)을 수정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(예컨대, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331 참조). 유사한 화학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산 기의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신; (2) 지방족-히드록시 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파라긴산 및 글루탐산, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존성 아미노산 치환기는 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파라긴산 및 아스파라긴-글루타민이다. 다른 한편으로, 보존성 교체는 곤넷 등의 문헌(Gonnet et al. (1992) Sciences 256:1,443-1,445)에 개시되어 있는 PAM250 로그-유사 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중등도적(moderately) 보존성" 교체는 상기 PAM250 로그-유사 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 나타내는 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 삭제 및 다른 변형으로 할당된 유사성의 측정을 이용하여 유사한 서열을 일치시킨다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는 디폴트 파라미터(default parameter)와 함께 사용되어 생물의 상이한 종들 유래 상동성 폴리펩티드 또는 야생형 단백질과 그 돌연변이단백질(mutain) 사이와 같은 매우 연관된 폴리펩티드 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정할 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 함유한다(예컨대, GCG Version 6.1 참조). 또한, 폴리펩티드 서열은 GCG Version 6.1 내의 프로그램인 디폴트 또는 추천된 파라미터를 이용하는 FASTA를 이용하여 비교될 수 있다. FASTA(예컨대, FASTA2 및 FASTA3)는 질의(query) 및 검색 서열 사이의 최적 중첩 영역을 배열하고 서열 동일성 백분율을 제공한다(Pearson (2000), 전술함). 본 발명의 서열과 상이한 생물 유래의 많은 수의 서열을 함유하는 데이터베이스를 비교할 때의 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 디폴트 파리미터를 이용하는 BLASTP 또는 TBLASTN이다(예컨대, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3,389-3,402 참조).
항체의 생물학적 특성
본 발명의 항체는 인간 CD48과 적어도 하나의 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "인간 CD48과 적어도 하나의 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단하는" 이란 표현은 CD48과 CD48 수용체(예컨대, 인간 2B4 및/또는 인간 CD2) 사이의 물리적 상호작용이 검출 및/또는 정량화될 수 있는 분석에서 본 발명의 항체를 첨가하면 CD48과 상기 수용체 사이의 상호작용을 적어도 50% 감소시키는 것을 의미한다. 항체가 인간 CD48과 CD48 수용체(예컨대, 인간 2B4) 사이의 상호작용을 차단하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 비제한적인 예시적 분석은 본 발명의 실시예 5에 예시되어 있다. 상기 실시예에서, 항체는 CD48 단백질과 혼합된 후, 상기 항체/CD48 혼합물이 2B4 단백질로 코팅된 표면에 적용된다. 비결합 분자를 세척해낸 후, 상기 2B4-코팅된 표면에 결합된 CD48의 양이 측정된다. 상기 분석 포맷에서 다양한 양의 항체를 사용함으로써 2B4에 대한 CD48의 결합을 50% 차단하는데 필요한 항체의 양이 계산될 수 있고, IC50 값으로 표현된다. 본 발명은 전술한 바와 같은 CD48/CD48 수용체 결합 분석 또는 실질적으로 유사한 분석에서 테스트될 때 약 400 pM 이하의 IC50을 나타내는 항-CD48 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 전술한 바와 같은 CD48/CD48 수용체 결합 분석 또는 실질적으로 유사한 분석에서 테스트될 때 약 400, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 pM 이하의 IC50을 나타내는 항-CD48 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체는 원발성 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 활성화를 억제할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "원발성 인간 말초혈 단핵구 세포의 활성화를 억제하는" 이란 표현은 (예컨대, IFN-감마 또는 다른 사이토카인(cytokine)의 방출을 측정함으로써) PBMC의 활성화가 검출 및/또는 정량화될 수 있는 분석에서 본 발명의 항체를 첨가하면 방출되는 IFN-감마(또는 다른 사이토카인)의 양을 적어도 50% 감소시키는 것을 의미한다. 항체가 PBMC의 활성화를 억제하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 비제한적인 예시적 분석은 본 발명의 실시예 6 및 실시예 7에 예시되어 있다. 한 예에서, 작용제인 항-CD3 및 항-CD28 항체로 PBMC를 활성화하기 전에 항-CD48 항체를 첨가하여 인간 PBMC를 단리한다. 인큐베이션(incubation) 기간 후, 방출된 IFN-감마의 양이 측정된다. 상기 분석 포맷에서 다양한 양의 항체를 이용함으로써 최대 IFN-감마 방출을 50% 억제하기 위해 필요한 항체의 양이 계산될 수 있고, IC50 값으로 표현된다. 본 발명은 전술한 바와 같은 PBMC 활성화 분석 또는 실질적으로 유사한 분석에서 테스트될 때 약 500 pM 이하의 IC50을 나타내는 항-CD48 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 전술한 바와 같은 PBMC 활성화 분석 또는 실질적으로 유사한 분석에서 테스트될 때 약 500, 400, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 pM 이하의 IC50을 나타내는 항-CD48 항체를 포함한다.
에피토프 맵핑 ( mapping ) 및 연관 기술
인간 CD48 단백질은 본 발명에서 "Ig 도메인 1" 및 "Ig 도메인 2"로 나타내는 2개의 면역글로불린-유사 도메인을 함유한다. Ig 도메인 1은 서열번호 384의 아미노산 29 내지 127에 의해 나타내는 아미노산 서열이고, Ig 도메인 2는 서열번호 384의 아미노산 132 내지 212에 의해 나타내는 아미노산 서열이다(도 1 참조).
본 발명은 인간 CD48의 Ig 도메인 1 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-CD48 항체를 포함한다. 상기 에피토프는 CD48의 Ig 도메인 1 내에 위치하는 3개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상) 아미노산의 단일한 근접(contiguous) 서열로 이루어질 수 있다. 다른 한편으로, 상기 에피토프는 CD48의 Ig 도메인 1 내에 위치하는 복수의 비-근접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 서열번호 384의 아미노산 60 내지 125 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-CD48 항체가 제공된다. 예를 들면, 본 발명은 서열번호 384의 아미노산 60 내지 68 및/또는 107 내지 125 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-CD48 항체를 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 기술을 사용하여 항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지 여부를 결정할 수 있다. 예시적인 기술은, 예컨대 문헌(Antibodies, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) 및 펩티드 절단 분석에 개시된 것과 같은 일상적인 교차-차단(cross-blocking) 분석을 포함한다. 아울러, 에피토프 절제(excision), 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 도입될 수 있다(Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). 항체와 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 질량 분광광도법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다(예컨대, 본 발명의 실시예 4 참조). 일반적인 용어로서, 상기 수소/중수소 교환 방법은 관심있는 단백질을 중수소-표지한 후 상기 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 상기 단백질/항체 복합체를 물에 전달하여 상기 항체에 의해 보호되는 잔기(중수소-표지로 남아 있음)를 제외한 모든 잔기에 수소-중수소 교환이 일어나도록 한다. 항체를 해리한 후, 상기 표적 단백질을 프로테아제(protease)로 절단하고 질량 분광광도법 분석을 수행함으로써 상기 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 해당하는 중수소-표지된 잔기를 밝힌다(예컨대, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A 참조).
본 발명은 본 발명에서 개시된 임의의 특정 예시적인 항체(예컨대, H4H1789Pa, H4H1763N, H2M1707N, H2M1709N, H4H1770N, H4H1771N 등)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD48 항체를 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 본 발명에서 개시된 임의의 특정 예시적인 항체(예컨대, H4H1789Pa, H4H1763N, H2M1707N, H2M1709N, H4H1770N, H4H1771N 등)와 CD48 또는 CD48 절편에 결합하기 위해 경쟁하는 항-CD48 항체를 포함한다.
항체가 참조 항-CD48 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합을 위해 경쟁하는지 여부는 본 기술분야에 알려진 일상적인 방법을 이용함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 테스트 항체가 본 발명의 참조 항-CD48 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여, 상기 참조 항체를 포화 조건 하에 CD48 단백질 또는 펩티드에 결합하도록 한다. 다음으로, 테스트 항체가 상기 CD48 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 상기 테스트 항체가 상기 참조 항-CD48 항체와 포화 결합한 후 CD48에 결합할 수 있다면, 상기 테스트 항체는 상기 참조 항-CD48 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론내릴 수 있다. 다른 한편으로, 상기 테스트 항체가 상기 참조 항-CD48 항체와 포화 결합한 후 CD48 분자에 결합할 수 없다면, 상기 테스트 항체는 본 발명의 상기 참조 항-CD48 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 이후, 추가적인 일상적 실험(예컨대, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 상기 관찰된 테스트 항체의 결합 부재가 실제로 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하기 때문인지 또는 관찰된 결합 부재가 공간적 차단(또는 다른 현상)으로 인한 것인지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 부류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 분석(flow cytometry) 또는 본 기술분야에 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 경쟁적 결합 분석에서 측정할 때, 예컨대 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 한 항체가 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제하면, 2가지 항체는 동일한(또는 중첩하는) 에피토프에 결합한다(예컨대, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1,495-1,502). 다른 한편으로, 필수적으로 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 상기 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하면, 2가지 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 상기 아미노산 돌연변이의 서브세트(subset)만이 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하면, 2가지 항체는 "중첩하는 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-CD48 항체와 결합을 위해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위하여 전술한 결합 방법론이 2가지 방향으로 수행될 수 있다: 제1 방향에서, 상기 참조 항체를 포화 조건 하에 CD48 분자에 결합하도록 한 후, 상기 CD48 분자에 대한 테스트 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 상기 테스트 항체를 포화 조건 하에 CD48 분자에 결합하도록 한 후, 상기 CD48 분자에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 양쪽 방향에서, 제1 (포화) 항체만이 상기 CD48 분자에 결합할 수 있다면, 상기 테스트 항체 및 참조 항체는 CD48에 대한 결합을 위해 경쟁하는 것으로 결론낸다. 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 예측되는 바와 같이, 참조 항체와 결합을 위해 경쟁하는 항체는 필수적으로 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수 있으며, 중첩하는 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 상기 참조 항체의 결합을 공간적으로 차단할 수 있다.
인간 항체의 제조
완전한 인간 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체의 생성 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 인간 CD48에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하기 위하여 임의의 이러한 알려진 방법이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
단일클론 항체를 생성하기 위한 VELOCIMMUNE™ 기술 또는 임의의 다른 알려진 방법을 사용함으로써, 먼저 CD48에 대한 높은 친화도의 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 키메라 항체가 단리된다. 하기 실험 섹션(section)에서와 같이, 상기 항체는 친화도, 특이성, 에피토프 등을 포함하는 원하는 특성에 대해 특정 및 선택된다. 상기 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역으로 교체되어 본 발명의 완전한 인간 항체, 예를 들면, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성한다. 상기 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 변할 수 있지만, 높은 친화도의 항원-결합 및 표적 특이도 특성이 상기 가변 영역 내에 존재한다.
생물등가물( bioequivalent )
본 발명의 항-CD48 항체 및 항체 절편은 상기 개시된 항체의 서열로부터 변하지만 인간 CD48에 결합하는 능력은 유지하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포괄한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 절편은 양친(parent) 서열과 비교할 때 하나 이상의 아미노산의 추가, 삭제 또는 치환을 포함하지만 상기 개시된 항체의 경우와 필수적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 상기 항-CD48 항체를 코딩하는 본 발명의 DNA 서열은 상기 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오티드의 적어도 하나의 추가, 삭제 또는 치환을 포함하지만 본질적으로 본 발명의 항-CD48 항체 또는 항체 절편과 생물등가적 항-CD48 항체 또는 항체 절편을 코딩하는 서열을 포괄한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기에 개시되어 있다.
2가지 항원-결합 단백질 또는 항체는, 예를 들면, 이들이 유사한 실험 조건 하에 단일 용량(single dose) 또는 다중 용량(multiple dose)에서 동일한 몰 용량으로 투여될 때 흡수 속도 및 정도가 현저한 차이를 보이지 않는 약학적 등가물 또는 약학적 대안물(alternative)이라면 생물등가물인 것으로 간주된다. 어떤 항체들은 이들이 그 흡수 정도에 있어서 등가적이지만 그 흡수 속도에 있어서는 아닐 때 등가물 또는 약학적 대안물인 것으로 간주될 것이지만, 흡수 속도에서의 이러한 차이는 의도적인 것이고, 상기 표지에 반영되어 있으며, 예컨대 만성적인 사용시 효과적인 체내 약물 농도로 성취하는데 필수적이지 않고, 또한 연구된 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 중요하지 않은 것으로 간주되기 때문에 생물등가물로 간주될 수 있다.
한 구현예에서, 2가지 항원-결합 단백질은 그 안전성, 순도 및 효능에 있어서 임상적으로 의미있는 차이가 없으면 생물등가물이다.
한 구현예에서, 2가지 항원-결합 단백질은 면역원성에서의 임상적으로 의미있는 변화나 효능의 감소를 포함하는 부작용 위험의 증가가 예상되지 않으면서 참조 제품과 생물학적 제품 사이를 교체없이 지속적으로 치료한 경우와 비교할 때 환자가 1회 이상 교체할 수 있으면 생물등가물이다.
한 구현예에서, 2가지 항원-결합 단백질은 사용 증상 또는 증상들에 대해 이러한 메커니즘이 알려진 정도까지 공통의 작용 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해 작용하면 생물등가물이다.
생물등가성은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물등가성 측정은, 예컨대 (a) 상기 항체 또는 그 대사물의 농도가 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 생물학적 유체 내에서 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트; (b) 인간 생체내 생체이용성(bioavailability) 데이터와 연관되고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 테스트; (c) 상기 항체(또는 그 표적)의 적절한 급성 약물학적(pharmacological) 효과가 시간의 함수로서 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용성 또는 생물등가성을 확립하는 잘-조절된 임상 시험을 포함한다.
본 발명의 항-CD48 항체의 생물등가적 변이체는, 예를 들면, 생물학적 활성에 필요하지 않은 잔기 또는 서열을 다양하게 치환하거나 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 삭제함으로써 구축될 수 있다. 예를 들면, 복원(renaturation)시 불필요하거나 올바르지 않은 분자간 이황화 브리지(bridge)의 형성을 방지하기 위하여 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 삭제되거나 다른 아미노산으로 교체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생물등가적 항체는 상기 항체의 글리코실화(glycosylation) 특성을 변경하는 아미노산 변화, 예컨대 글리코실화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항-CD48 항체 변이체를 포함할 수 있다.
종 특이성 및 종 교차-반응성
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 항-CD48 항체는 인간 CD48에는 결합하지만 다른 종의 CD48에는 결합하지 않는다. 또한, 본 발명은 인간 CD48 및 하나 이상의 비-인간 종의 CD48에 결합하는 항-CD48 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-CD48 항체는 인간 CD48에 결합할 수 있지만, 경우에 따라 하나 이상의 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 저빌(gerbil), 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰로구스(cynomologous), 마모셋(marmoset), 레수스(rhesus) 또는 침팬지 CD48에는 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
면역접합체
본 발명은 사이토톡신, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사성동위원소와 같은 치료학적 모이어티에 접합된 항-CD48 단일클론 항체("면역접합체")를 포괄한다. 세포독성 제제는 세포에 해로운 임의의 제제를 포함한다. 면역접합체를 형성하기에 적합한 세포독성 제제 및 화학치료 제제의 예는 본 기술분야에 알려져 있다(예를 들면, WO 05/103081 참조).
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 단특이적, 양특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 한 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다(예컨대, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244 참조). 본 발명의 항-CD48 항체는 다른 기능성 분자, 예컨대 다른 펩티드 또는 단백질에 결합되거나 동시-발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 그의 절편은 다른 항체 또는 항체 절편과 같은 하나 이상의 다른 분자 엔티티(entity)에 (예컨대, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유적 연합 등에 의해) 기능적으로 결합되어 제2 결합 특이성을 갖는 양특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 면역글로불린의 한 팔(arm)은 인간 CD48 또는 그 절편에 특이적이고 상기 면역글로불린의 다른 팔은 제2 치료용 표적에 특이적이거나 트립신 억제제와 같은 치료학적 모이어티에 접합되는 양특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 양특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인과 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 포함하며, 상기 제1 및 제2 CH3 도메인은 적어도 한 아미노산에 의해 서로 상이하고, 적어도 한 아미노산의 차이는 아미노산 차이가 없는 양특이적 항체와 비교할 때 단백질 A에 대한 양특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구현예에서, 상기 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 상기 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링(numbering)에 의함; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이를 함유한다. 상기 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함, EU에 의해서는 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 CH3 내에 발견될 수 있는 추가적인 변형은 IgG1 항체의 경우에는 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우에는 N44S, K52N 및 V82I(IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에는 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I)를 포함한다. 전술한 양특이적 항체 포맷의 변동(variation)은 본 발명의 범위 내에 고려된다.
치료학적 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 항-CD48 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 담체, 부형제 및 개선된 전달, 운반, 내성(tolerance) 등을 제공하는 다른 제제와 제형화된다. 다수의 적합한 제형이 모든 약학적 화학자에게 알려진 처방집(formulary) 내에 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 상기 제형은, 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소낭(vesicle)(예컨대, LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀전, 에멀전 카르보왁스(carbowax)(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다(또한, Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311 참조).
환자에게 투여되는 항체의 용량은 환자의 연령 및 크기, 표적 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 본 발명의 항체가 성인 환자에서 CD48 활성과 연관된 w으상이나 질환을 치료하기 위해 사용될 때, 본 발명의 항체를 보통 약 0.01 내지 약 20 ㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 ㎎/㎏ 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하면 유리할 수 있다. 증상의 심각성에 따라 치료 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. CD48 항체를 투여하기 위한 효과적인 복용량(dosage) 및 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있다; 예를 들면, 환자의 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있고, 상기 용량은 이에 따라 조정된다. 아울러, 복용량의 종간(interspecies) 스케일링(scaling)은 본 기술분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예컨대, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
다양한 운반 시스템, 예컨대 리포좀 내에서 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개성 엔도사이토시스(endocytosis)가 알려져 있으며, 본 발명의 약학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4,429-4,432 참조). 도입 방법은 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하내, 비강내, 경막외(epidural) 및 경구 경로를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들면, 수액(infusion) 또는 볼루스(bolus) 주사, 상피 또는 점막피부 내벽(예컨대, 경구 점막, 직장 및 내장 점막 등)에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하 또는 정맥으로 운반될 수 있다. 아울러, 피하 운반과 관련하여, 펜 운반 장치가 손쉽게 본 발명의 약학적 조성물의 운반에 적용될 수 있다. 이러한 펜 운반 장치는 재사용가능하거나 1회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 운반 장치는 일반적으로 약학적 조성물을 함유하는 교체가능한 카트리지를 이용한다. 상기 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되고 상기 카트리지가 비게 되면, 상기 빈 카트리지는 손쉽게 버려지고 상기 약학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 이후, 상기 펜 운반 장치는 재사용될 수 있다. 1회용 펜 운반 장치에는 교체가능한 카트리지가 없다. 대신, 1회용 펜 운반 장치는 상기 장치 내의 저장소에서 고정된 약학적 조성물로 미리 채워져 있다. 상기 저장소에 약학적 조성물이 비워지면, 전체 장치가 버려진다.
많은 재사용가능한 펜 및 자가주사 운반 장치가 본 발명의 약학적 조성물의 피하 운반에 적용될 수 있다. 예로는, 몇 가지만 예를 들자면, AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ 및 OPTICLIK™(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물의 피하 운반에 적용가능한 1회용 펜 운반 장치의 예로는, 몇 가지만 예를 들자면, SOLOSTAR™ 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) 및 KWIKPEN™(Eli Lilly), SURECLICK™ 자가주사기(Autoinjector)(Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA™ 펜(AbbottLabs, Abbott Park IL)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
어떤 상황에서, 상기 약학적 조성물은 조절된 방출 시스템에서 운반될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer, 전술함; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 참조). 다른 구현예에서, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida 참조). 또 다른 구현예에서, 조절된 방출 시스템은 상기 조성물의 표적 근방에 위치하며, 따라서 상기 전신성 용량의 일부만 필요로 할 수 있다(예컨대, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 참조). 다른 조절된 방출 시스템은 랑거에 의한 리뷰(review)에 개시되어 있다(Langer, 1990, Science 249:1,527-1,533).
상기 주사가능한 제조물은 정맥내, 피하, 피내 및 극육내 주사, 점적 주입(drip infusion) 등을 위한 제형을 포함할 수 있다. 상기 주사가능한 제조물은 공공에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 주사가능한 제조물은, 예컨대 전술한 항체 또는 그 염을 주사를 위해 종래 사용되는 멸균 수성 매질 또는 오일성 매질 내에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들면, 생리식염수, 글루코오스 및 다른 보조 제제 등을 함유하는 등장 용액이 있으며, 알코올(예컨대, 에탄올), 폴리알코올(예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예컨대, 폴리솔베이트 80, HCO-50(수소화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 ㏖) 부가물)] 등과 같은 적절한 가용화제(solubilizing agent)와의 조합으로 사용될 수 있다. 오일성 매질로서, 예컨대 참기름, 콩기름 등이 도입되며, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 제조된 주사물은 바람직하게는 적절한 앰풀(ampoule) 내에 채워진다.
유리하게는, 전술한 경구용 또는 비경구용의 약학적 조성물은 상기 활성 성분의 용량에 적합하게 맞춘 단위 용량 내의 제형으로 제조된다. 이러한 단위 용량 내의 제형은, 예를 들면, 정제, 알약, 캡슐, 주사물(앰풀), 좌약 등을 포함한다. 함유되는 전술한 항체의 양은 일반적으로 단위 용량 내의 제형 당 약 5 내지 약 500 ㎎이다; 특히, 주사 형태에 있어서는 전술한 항체가 약 5 내지 약 100 ㎎으로 함유되고, 다른 제형의 경우에는 약 10 내지 약 250 ㎎ 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료학적 용도
본 발명의 항체는 그 중에서도 CD48 활성과 연관 또는 매개되거나 CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 치료가능한 임의의 질환 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해 유용하다. 본 발명의 항-CD48 항체로 치료될 수 있는 예시적인 질환 및 질병은, 예컨대 천식, 알레르기, 아토피성 피부염, 결막염, 염증성 장 질환(예컨대, 궤양성 대장염), 셀리악병(celiac disease) 및 암(예컨대, 혈액세포암, 뇌암, 유방암, 결장암, 두경부암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암 등)을 포함한다. 또한, 본 발명의 항-CD48 항체는 건선을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항-CD48 항체로 치료될 수 있는 다른 질환 및 질병은, 예컨대 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis, SLE), 류마티스성 관절염, 이식편-대-숙주 질환(GvHD)(예컨대, 만성 GvHD 또는 급성 GvHD) 및 이식 거부를 포함한다.
조합 치료
본 발명은 본 발명의 항-CD48 항체를 적어도 하나의 추가적인 치료학적으로 활성인 성분과 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 치료학적 투여 요법(regimen)을 포함한다. 이러한 추가적인 치료학적으로 활성인 성분의 비제한적인 예로는 다른 CD48 길항제(예컨대, 제2 항-CD48 항체 또는 CD48의 소분자 억제제), 사이토카인 억제제(예컨대, 인터루킨-1(IL-1) 억제제(예컨대, 릴로나셉트(rilonacept) 또는 아나킨라(anakinra), 소분자 IL-1 길항제 또는 항-IL-1 항체); IL-18 억제제(예컨대, 소분자 IL-18 길항제 또는 항-IL-18 항체); IL-4 억제제(예컨대, 소분자 IL-4 길항제, 항-IL-4 항체 또는 항-IL-4 수용체 항체); IL-6 억제제(예컨대, 소분자 IL-6 길항제, 항-IL-6 항체 또는 항-IL-6 수용체 항체); 아스피린; NSAID; 스테로이드(예컨대, 프레드니손, 메토트렉세이트 등); 저용량 시클로스포린 A; 종양 괴사 인자(TNF) 또는 TNF 수용체 억제제(예컨대, 소분자 TNF 또는 TNFR 길항제 또는 항-TNF 또는 TNFR 항체); 요산 합성 억제제(예컨대, 알로푸리놀); 요산 배출 촉진제(예컨대, 프로베네시드, 설핀피라존, 벤즈브로마론 등); 다른 염증 억제제(예컨대, 카스파아제(caspase)-1, p38, IKK1/2, CTLA-4Ig 등의 억제제); 및/또는 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 포함한다. 추가적인 약학적으로 활성인 성분(들)은 본 발명의 항-CD48 항체의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다(본 발명의 목적을 위하여, 이러한 투여 요법은 본 발명의 치료학적으로 활성인 성분과 "조합으로" 항-CD48 항체가 투여되는 것으로 간주된다).
항체의 진단 용도
또한, 본 발명의 항-CD48 항체는, 예컨대 진단 목적으로 샘플 내의 CD48을 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-CD48 항체 또는 그의 절편은 CD48의 비정상(aberrant) 발현(예컨대, 과발현, 저발현, 발현 부재 등)에 의해 특정되는 증상 또는 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다. CD48에 대한 예시적인 진단 분석은, 예컨대 환자로부터 얻은 샘플을 본 발명의 항-CD48 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 항-CD48 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터(reporter) 분자로 표지된다. 다른 한편으로, 비표지된 항-CD48 항체는 그 자체가 검출가능하게 표지된 제2 항체와의 조합으로 진단 적용분야에 사용될 수 있다. 상기 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성동위원소; 플루오레신(fluorescein), 이소티오시아네이트 또는 로다민(rhodamine)과 같은 형광 또는 화학발광 모이어티; 알칼린 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 고추냉이 퍼옥시다아제 또는 루시페라아제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 내의 CD48을 검출 또는 측정하기 위해 사용될 수 있는 특정 예시적 분석은 효소-결합 면역흡수 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA) 및 형광-활성화 셀 분류법(fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 포함한다.
본 발명에 따른 CD48 진단 분석에서 사용될 수 있는 샘플은 정상 또는 감염성 조건 하에 검출가능한 양의 CD48 단백질 또는 그의 절편을 함유하는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 먼저 CD48의 기준선(baseline) 또는 표준 레벨을 확립하기 위하여, 건강한 환자(예컨대, 이상(abnormal) CD48 레벨 또는 활성과 연관된 질환 또는 증상을 앓지 않는 환자)로부터 얻어진 특정 샘플 내의 CD48의 레벨이 측정될 것이다. 이후, 상기 CD48의 기준선 레벨을 CD48 연관성 질환 또는 증상을 갖는 것으로 의심되는 개인으로부터 얻은 샘플에서 측정된 CD48의 레벨과 비교할 수 있다.
도 1은 인간 CD48 폴리펩티드(서열번호 384)를 선형으로 나타낸 것이다. 아미노산 1-26에 의해 나타낸 부분은 신호 서열이다; 아미노산 29-127에 의해 나타낸 부분은 Ig 도메인 1이다; 아미노산 132-212에 의해 나타낸 부분은 Ig 도메인 2이다; 아미노산 60-68(YTFDQKIVE) 및 107-125(YIMRVLKKTGNEQEWKIKL)에 대응하는 서열번호 384의 영역은 H4H1789Pa로 나타낸 예시적인 항체에 의해 결정된 에피토프이다(실시예 4 참조).
도 2는 이식편-대-숙주(graft-versus-host) 질환의 마우스 모델에서 항-CD48 항체 처리 효과를 그래프로 나타낸 것이다(실시예 9 참조). 패널 A는 치료 및 대조군 동물에서 관찰되는 체중 감소를 보여준다; 패널 B는 치료 및 대조군 동물의 생존 백분율을 보여준다. 양쪽 패널에 있어서, (●)는 치료하지 않은 것을 나타낸다; (▲)는 hIgG4 아형의 대조군 치료를 나타낸다; 및 (■)는 예시적인 항-CD48 항체인 H4H1789Pa로 치료한 것을 나타낸다.
하기 실시예는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위한 것이며, 본 발명의 발명자들이 그 발명이라고 간주하는 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다. 사용된 수(예컨대, 양, 온도 등)에 관해 정확성을 보증하기 위한 노력을 수행하였지만, 일부 실험적인 오차나 편차가 있을 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1. 인간 CD48 에 대한 인간 항체의 생성
인간 CD48의 엑토(ecto)-도메인(서열번호 384의 아미노산 27-220)을 포함하는 면역원을 보조제(adjuvant)와 함께 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파(kappa) 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에 직접 투여하여 면역 반응을 자극하였다. 상기 항체 면역 반응을 CD48-특이적 면역분석에 의해 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 달성될 때, 비장세포를 수확하였고, 그 생존력을 보존하기 위해 마우스 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마(hybridoma) 세포주를 형성하였다. 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝 및 선별하여 CD48-특이적 항체를 생산하는 세포주를 확인하였다. 상기 기술을 이용하여 항-CD48 키메라 항체(즉, 인간 가변 도메인과 마우스 불변 도메인을 갖는 항체)를 얻었다; 상기 방식으로 생성된 예시적인 항체는 다음과 같이 나타내었다: H2M1707N, H2M1709N, H2M1710N, H2M1712N, H2M1713N, H2M1763N, H2M1811N, H3M1766N, H2M1798N 및 H2M1711N.
또한, US 2007/0280945A1에 개시된 바와 같이 골수종 세포와의 융합없이 항원-양성인 B 세포로부터 항-CD48 항체를 직접 단리하였다. 상기 방법을 이용하여 몇 가지 완전한 인간 항-CD48 항체(즉, 인간 가변 도메인과 인간 불변 도메인을 갖는 항체)를 얻었다; 상기 방식에 의해 생성된 예시적인 항체는 다음과 같이 나타내었다: H4H1769Na, H4H1769Pa, H4H1769Nb, H4H1769Pb, H4H1770N, H4H1770P, H4H1771N, H4H1771P, H4H1772N, H4H1772P, H4H1774N, H4H1774P, H4H1775N, H4H1775P, H4H1778N, H4H1778P, H4H1779N, H4H1779P, H4H1781N, H4H1781P, H4H1789Na, H4H1789Pa, H4H1789Nb, H4H1789Pb.
본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-CD48 항체의 생물학적 특성은 하기 실시예들에 상세히 개시되어 있다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
표 1은 선택된 항-CD48 항체 및 그 대응하는 항체 식별자(identifier)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 쌍을 나타낸다. N, P 및 G로 나타낸 것은 CDR 서열은 동일하지만 상기 CDR 서열 밖에 속하는 영역(즉, 뼈대 영역)에서는 서열이 다른 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 나타낸다. 따라서, 특정 항체의 N, P 및 G 변이체는 그 중쇄 및 경쇄 영역 내에 동일한 CDR 서열을 갖지만 그 뼈대 영역의 서열은 서로 상이하다. 본 발명에서 사용된 항체 표시에 있어서 H2M, H3M, H4M 등의 접두사는 상기 항체의 특정 Fc 영역을 나타낸다. 예를 들면, "H2M" 항체는 마우스 IgG2 Fc를 갖지만, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는다. 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, H2M 또는 H3M 항체는 H4H 항체로 변환될 수 있고, 또 그 반대도 가능하지만, 상기 가변 도메인(상기 CDR을 포함함)은 동일하게 남아있을 것이다.
서열번호
항체 표시 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H2M1707N 2 4 6 8 10 12 14 16
H2M1709N 18 20 22 24 26 28 30 32
H2M1710N 34 36 38 40 42 44 46 48
H2M1712N 50 52 54 56 58 60 62 64
H2M1713N 66 68 70 72 74 76 78 80
H2M1763N 82 84 86 88 90 92 94 96
H2M1764N 98 100 102 104 106 108 110 112
H2M1811N 114 116 118 120 122 124 126 128
H3M1766N 130 132 134 136 138 140 142 144
H4H1769Na 162 164 166 168 170 172 174 176
H4H1769Pa 178 164 166 168 180 172 174 176
H4H1769Nb 162 164 166 168 182 184 186 188
H4H1769Pb 178 164 166 168 190 184 186 188
H4H1770N 192 194 196 198 200 202 204 206
H4H1770P 208 194 196 198 210 202 204 206
H4H1771N 212 214 216 218 220 222 224 226
H4H1771P 228 214 216 218 230 222 224 226
H4H1772N 232 234 236 238 240 242 244 246
H4H1772P 248 234 236 238 250 242 244 246
H4H1774N 252 254 256 258 260 262 264 266
H4H1774P 268 254 256 258 270 262 264 266
H4H1775N 272 274 276 278 280 282 284 286
H4H1775P 288 274 276 278 290 282 284 286
H4H1778N 292 294 296 298 300 302 304 306
H4H1778P 308 294 296 298 310 302 304 306
H4H1779N 312 314 316 318 320 322 324 326
H4H1779P 328 314 316 318 330 322 324 326
H4H1781N 332 334 336 338 340 342 344 346
H4H1781P 348 334 336 338 350 342 344 346
H4H1789Na 352 354 356 358 360 362 364 366
H4H1789Pa 368 354 356 358 370 362 364 366
H4H1789Nb 352 354 356 358 372 374 376 378
H4H1789Pb 368 354 356 358 380 374 376 378
실시예 3. 표면 프라스몬 공명에 의해 결정된 가용성 CD48 에 대한 항체 결합
인간 및 원숭이 가용성 재조합 CD48에 결합하는 인간 단일클론 항-CD48 항체의 결합 친화도와 운동성 상수(kinetic constant)를 25℃ 및 37℃ 모두에서 모노머성 및 다이머성 형상의 CD48 모두에 대해 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다. 측정은 T100-2 BIACORE™ 기기(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)로 수행하였다. 항-Fc 칩 표면을 통해 항체(마우스 Fc["H2M" 또는 "H3M"으로 나타냄] 또는 인간 IgG4 Fc["H4H"로 나타냄] 중 하나)를 포획하였고, CD48을 모노머성(myc-myc-hexa-히스티딘 C-말단 태그[mmH]와 함께 발현된 가용성 CD48) 또는 다이머성(C-말단 Fc 융합[mFc]과 함께 발현된 가용성 CD48) 포맷의 표면 위에 흘렸다. 본 실시예에서 사용된 시약의 아미노산 서열 식별자는 표 2에 나타나 있다.
구조체 서열번호
모노머성 인간 CD48-mmH 385
모노머성 원숭이 CD48-mmH 386
다이머성 인간 CD48-mFc 387
다이머성 원숭이 CD48-mFc 388
상기 가용성 CD48을 상이한 농도에서 별도의 주사로 유동 세포(flow cell)에 적용하였고, Biacore 소프트웨어를 이용하여 상기 운동 결합 데이터를 맞춤으로써 운동성 결합(ka) 및 해리(kd) 속도 상수를 결정하였다. 상기 운동성 속도 상수로부터 다음과 같이 결합 해리 평형 상수 및 해리 하프-타임(half-time)을 계산하였다: KD = kd/ka; t1 /2 = (ln2/kd)(단위: ka = M-1*s-1; kd = s-1; KD = M; T1 /2 = 분)(표 3 내지 표 6).
25℃
모노머성 인간 CD48 다이머성 인간 CD48
항체 ka kd K D T½ ka kd K D T½
H2M1707N 1.31E+05 6.42E-04 4.92E-09 18 7.14E+05 6.59E-05 9.23E-11 175
H4H1707N 1.68E+05 6.01E-04 3.57E-09 19 3.85E+05 2.83E-05 7.36E-11 408
H2M1709N 2.92E+05 5.80E-03 1.98E-08 2 9.28E+05 2.88E-04 3.11E-10 40
H2M1710N 3.73E+04 1.46E-03 3.91E-08 8 1.12E+05 9.38E-05 8.41E-10 123
H2M1711N 6.92E+05 1.13E-03 1.64E-09 10 1.64E+06 1.02E-04 6.23E-11 113
H2M1712N 5.24E+05 6.19E-03 1.18E-08 2 1.84E+06 5.30E-04 2.88E-10 22
H2M1713N 1.61E+05 2.17E-04 1.35E-09 53 8.26E+05 1.11E-05 1.34E-11 1043
H4H1713N 1.94E+05 1.74E-04 8.93E-10 67 8.94E+05 1.90E-05 2.12E-11 609
H2M1763N 5.48E+05 6.48E-03 1.18E-08 2 1.95E+06 4.99E-04 2.56E-10 23
H4H1763N 7.69E+05 6.31E-03 8.20E-09 2 2.05E+06 5.48E-05 2.68E-11 211
H2M1764N 1.21E+05 2.85E-03 2.35E-08 4 2.59E+05 2.66E-04 1.03E-09 43
H4H1764N 1.05E+05 2.48E-03 2.36E-08 5 2.68E+05 6.05E-05 2.26E-10 191
H3M1766N 6.34E+04 1.77E-04 2.79E-09 65 1.29E+05 6.57E-05 5.10E-10 176
H4H1769P 1.93E+05 7.79E-05 4.03E-10 148 9.69E+05 1.08E-05 1.11E-11 1071
H4H1770P 5.89E+05 1.53E-04 2.59E-10 76 1.71E+06 5.54E-06 3.25E-12 2084
H4H1771P 8.05E+05 2.09E-04 2.60E-10 55 2.07E+06 1.52E-05 7.36E-12 759
H4H1772P 1.27E+05 1.76E-04 1.38E-09 66 3.76E+05 1.29E-05 3.44E-11 894
H4H1774P 1.04E+05 4.72E-05 4.54E-10 245 3.11E+05 4.65E-06 1.49E-11 2486
H4H1775P 1.45E+05 4.92E-05 3.40E-10 235 7.34E+05 1.31E-05 1.79E-11 881
H4H1778P 9.86E+04 4.69E-05 4.76E-10 246 2.94E+05 8.95E-06 3.04E-11 1291
H4H1779P 1.58E+05 3.90E-05 2.46E-10 296 7.74E+05 1.17E-05 1.51E-11 990
H4H1781P 1.70E+05 3.30E-05 1.94E-10 351 8.54E+05 1.23E-05 1.44E-11 940
H4H1789Pa 1.43E+05 4.58E-04 3.20E-09 25 3.82E+05 3.66E-05 9.58E-11 315
H2M1798N 9.14E+05 2.47E-03 2.70E-09 5 2.05E+06 2.71E-04 1.32E-10 43
H2M1811N 5.00E+04 8.49E-04 1.70E-08 14 1.44E+05 2.30E-04 1.60E-09 50
37℃
모노머성 인간 CD48 다이머성 인간 CD48
항체 ka kd K D T½ ka kd K D T½
H2M1707N 2.14E+05 3.14E-03 1.47E-08 4 9.20E+05 2.27E-04 2.47E-10 51
H4H1707N 2.84E+05 2.73E-03 9.63E-09 4 9.81E+05 6.42E-05 6.54E-11 180
H2M1709N 1.14E+06 4.00E-02 3.51E-08 0 1.52E+06 3.77E-04 2.48E-10 31
H2M1710N 3.40E+04 5.20E-03 1.53E-07 2 4.81E+05 4.26E-04 8.85E-10 27
H2M1711N 9.26E+05 3.02E-03 3.26E-09 4 2.08E+06 2.39E-04 1.15E-10 48
H2M1712N 8.46E+05 1.40E-02 1.66E-08 1 2.72E+06 6.85E-04 2.52E-10 17
H2M1713N 2.35E+05 6.44E-04 2.74E-09 18 1.25E+06 8.27E-05 6.63E-11 140
H4H1713N 2.86E+05 6.36E-04 2.23E-09 18 1.26E+06 4.53E-05 3.60E-11 255
H2M1763N 1.49E+06 2.01E-02 1.35E-08 1 3.02E+06 8.83E-04 2.93E-10 13
H4H1763N 1.33E+06 1.69E-02 1.27E-08 1 2.35E+06 6.28E-05 2.67E-11 184
H2M1764N 1.69E+05 1.60E-02 9.47E-08 1 7.02E+05 4.12E-04 5.86E-10 28
H4H1764N 1.05E+05 1.14E-02 1.09E-07 1 3.01E+05 9.94E-05 3.30E-10 116
H3M1766N 1.61E+05 6.20E-04 3.84E-09 19 9.49E+05 3.24E-04 3.42E-10 36
H4H1769P 2.25E+05 3.14E-04 1.40E-09 37 1.21E+06 3.63E-05 3.01E-11 319
H4H1770P 8.04E+05 5.33E-04 6.62E-10 22 2.23E+06 3.08E-05 1.38E-11 375
H4H1771P 1.12E+06 5.47E-04 4.88E-10 21 2.89E+06 4.81E-05 1.66E-11 240
H4H1772P 1.72E+05 1.02E-03 5.94E-09 11 9.20E+05 5.98E-05 6.50E-11 193
H4H1774P 1.30E+05 1.07E-04 8.24E-10 108 3.63E+05 1.60E-05 4.39E-11 724
H4H1775P 1.77E+05 9.48E-05 5.36E-10 122 5.22E+05 2.27E-05 4.34E-11 509
H4H1778P 1.35E+05 1.13E-04 8.37E-10 102 4.73E+05 3.53E-05 7.46E-11 327
H4H1779P 2.07E+05 1.02E-04 4.95E-10 113 7.72E+05 4.59E-05 5.94E-11 252
H4H1781P 2.26E+05 1.01E-04 4.48E-10 114 8.12E+05 4.89E-05 6.03E-11 236
H4H1789Pa 1.99E+05 1.79E-03 8.97E-09 6 2.21E+05 3.57E-05 1.61E-10 324
H2M1798N 1.41E+06 8.35E-03 5.94E-09 1 2.91E+06 2.17E-04 7.47E-11 53
H2M1811N 1.30E+05 2.95E-03 2.27E-08 4 2.65E+05 2.56E-04 9.66E-10 45
25℃
모노머성 인간 CD48 다이머성 인간 CD48
항체 ka kd K D T½ ka kd K D T½
H4H1707N 2.89E+05 3.62E-04 1.25E-09 32 8.05E+05 1.19E-03 1.48E-09 10
H4H1713N 3.15E+05 2.65E-04 8.43E-10 44 8.61E+05 2.42E-04 2.81E-10 48
H4H1763N 5.27E+05 1.24E-03 2.34E-09 9 1.33E+06 6.88E-05 5.19E-11 168
H4H1764N 8.77E+04 2.06E-04 2.34E-09 56 2.51E+05 1.32E-04 5.25E-10 88
H4H1769P 5.88E+05 3.93E-04 6.69E-10 29 4.82E+05 2.56E-05 5.31E-11 451
H4H1770P 7.20E+05 2.15E-04 2.98E-10 54 8.58E+05 1.13E-04 1.31E-10 103
H4H1771P 1.05E+06 4.77E-04 4.53E-10 24 9.39E+05 5.51E-05 5.87E-11 210
H4H1772P 4.61E+05 5.08E-04 1.10E-09 23 5.19E+05 5.02E-05 9.68E-11 230
H4H1774P 2.63E+05 7.63E-05 2.89E-10 151 3.95E+05 2.07E-05 5.25E-11 558
H4H1775P 2.91E+05 4.07E-05 1.40E-10 284 4.88E+05 6.60E-06 1.35E-11 1750
H4H1778P 2.76E+05 8.98E-05 3.25E-10 129 3.84E+05 1.77E-05 4.60E-11 654
H4H1779P 3.01E+05 1.13E-04 3.75E-10 102 5.22E+05 3.17E-05 6.06E-11 364
H4H1781P 2.98E+05 7.80E-05 2.62E-10 148 5.99E+05 2.13E-05 3.56E-11 542
H4H1789Pa 4.16E+05 1.38E-03 3.31E-09 8 6.51E+05 2.76E-04 4.23E-10 42
37℃
모노머성 인간 CD48 다이머성 인간 CD48
항체 ka kd K D T½ ka kd K D T½
H4H1707N 3.27E+05 1.22E-03 3.72E-09 9 1.64E+06 5.24E-03 3.20E-09 2
H4H1713N 3.20E+05 3.82E-04 1.19E-09 30 1.72E+06 5.16E-04 3.00E-10 22
H4H1763N 5.34E+05 1.33E-03 2.49E-09 9 2.42E+06 1.14E-04 4.70E-11 101
H4H1764N 2.13E+05 6.20E-04 2.91E-09 19 1.92E+05 1.42E-03 7.40E-09 8
H4H1769P 2.80E+05 1.10E-03 3.92E-09 11 6.97E+05 9.80E-05 1.41E-10 118
H4H1770P 3.96E+05 1.74E-04 4.40E-10 66 1.53E+06 1.39E-04 9.11E-11 83
H4H1771P 6.57E+05 8.77E-04 1.34E-09 13 1.64E+06 1.02E-04 6.21E-11 113
H4H1772P 3.20E+05 1.45E-03 4.53E-09 8 7.72E+05 7.31E-05 9.47E-11 158
H4H1774P 1.97E+05 2.67E-04 1.36E-09 43 5.08E+05 5.40E-05 1.07E-10 214
H4H1775P 2.60E+05 1.29E-04 4.98E-10 90 6.69E+05 3.97E-05 5.93E-11 291
H4H1778P 1.89E+05 2.53E-04 1.34E-09 46 5.25E+05 3.60E-05 6.86E-11 321
H4H1779P 2.77E+05 2.89E-04 1.04E-09 40 7.21E+05 5.98E-05 8.29E-11 193
H4H1781P 3.50E+05 3.07E-04 8.75E-10 38 8.75E+05 6.61E-05 7.55E-11 175
H4H1789Pa 4.37E+05 2.06E-03 4.71E-09 6 9.90E+05 7.68E-04 7.76E-10 15
표 3 내지 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예에서 테스트된 예시적인 항체들은 인간 및 마우스 CD48 가용성 단백질 모두에 대해 높은 친화도 결합을 나타내었다. 1가의 CD48과 비교하여 2가의 CD48이 상기 용액-상 분석물(analyte)로서 사용될 때 결합 친화도에서의 현저한 증가가 관찰되었다.
실시예 4. H/D 교환에 의한 CD48 에 대한 H4H1789Pa 결합의 에피토프 맵핑
H4H1789Pa와 상호작용하는 CD48의 아미노산 잔기를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 목적을 위하여, H/D 교환 에피토프 맵핑을 수행하였다. 상기 H/D 교환 방법의 일반적인 설명은, 예컨대 Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; 및 Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A에 기재되어 있다.
H/D 교환을 통해 H4H1789Pa 결합에 대한 CD48의 에피토프를 맵핑하기 위하여, 재조합 인간 CD48-myc-myc-his 융합 구조체("hCD48-mmH"; 서열번호 391)를 사용하였다. 먼저, PNGase F(New England BioLabs)를 이용하여 자연 조건 하에 hCD48-mmH를 탈글리코실화시켰다. 이후, H4H1789Pa를 가교결합제 BS3(Thermo Scientific)에 의해 항-인간 IgG-아가로오즈 비드(Sigma)에 공유적으로 부착시켰다.
'온-용액/오프-비드(on-solution/off-bead)' (용액 내에서의 온-교환 후의 비드 상에서의 오프-교환) 실험에서, 상기 리간드(탈글리코실화된 hCD48-mmH)를 D2O로 제조된 PBS 버퍼 내에서 5분 또는 10분 동안 중수소화한 후, 2분의 인큐베이션 동안 H4H1789Pa 비드에 결합시켰다. 상기 CD48-결합된 비드를 PBS 수성 버퍼(H2O로 제조됨)로 세척하였고, 상기 온-교환 시간의 절반 동안 인큐베이션하였다. 오프-교환 후, 얼음으로 냉각된 낮은 pH의 TFA 용액을 이용하여 비드로부터 상기 결합된 CD48을 용출하였다. 이후, 상기 용출된 CD48을 고정화된 펩신(Thermo Scientific)을 이용하여 5분 동안 소화시켰다. 결과물인 펩티드를 ZipTip® 크로마토그래피 피펫 팁을 이용하여 단리하였고, 울트라플렉스트림(UltrafleXtreme) MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization time of flight)-TOF 질량 분광광도법(MS)에 의해 즉시 분석하였다.
'온-비드/오프-비드'(비드 상의 온-교환 후의 비드 상의 오프-교환) 실험에서, 먼저 CD48을 H4H1789Pa 비드에 결합시킨 후, 온-교환을 위해 D2O에서 5분 또는 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후의 단계들(오프-교환, 펩신 소화 및 MS 분석)을 상기 '온-용액/오프-비드' 절차에서 개시한 바와 같이 수행하였다. 모든 검출된 펩티드의 중심값(centroid value)을 계산하였고, 상기 2가지 세트의 실험 간에 비교하였다.
그 결과는 표 7에 요약되어 있으며, 상기 H/D 교환 및 펩신 소화 절차 후 LC-MALDI(liquid chromatography-matrix assisted laser desorption ionization) MS에 의해 확인된 모든 검출된 펩티드에 대한 중심 질량-대-전하 비의 정량적인 비교를 제공한다. 관찰된 펩신 펩티드의 대부분은 상기 온-용액/오프-비드 및 온-비드/오프-비드 실험 모두에 대해 유사한 중심 질량-대-전하 비를 나타내었지만, 서열번호 384의 잔기 60-76에 대응하는 3개의 상이한 펩신 펩티드 및 서열번호 384의 잔기 107-125에 대응하는 7개의 펩티드는 상기 '온-용액/오프-비드' 실험에서 지속적으로 더 높은 중심값(즉, 더 높은 중수소 보유(retention))을 나타내었다. 본 발명의 실시예의 목적을 위하여, 적어도 0.20의 양의 차이(Δ)는 항체 결합에 의해 보호된 아미노산을 나타낸다. 이러한 잔기는 표 7에서 굵은 글씨 및 별표(*)로 나타낸다.
hCD48-mmH에 대한 H4H1789Pa의 결합
5분 온- / 2.5분 오프 -교환 10분 온- / 5분 오프 -교환
(서열번호 384의) 잔기 온-용액/
오프 - 비드 		온- 비드 /
오프 - 비드 		Δ 온-용액/
오프 - 비드 		온- 비드 /
오프 - 비드 		Δ
27 - 33 804.97 804.95 0.03 804.93 804.98 -0.05
32 - 50 2001.88 2001.78 0.11 2001.68 2001.77 -0.09
45 - 59 1856.18 1856.19 -0.01 1856.37 1856.32 0.04
53 - 59 986.77 986.75 0.02 986.26 986.15 0.12
60 - 68* 1143.72 1143.33 0.39 1143.78 1143.41 0.37
60 - 76* 2195.08 2194.74 0.34 2195.13 2194.82 0.31
63 - 76* 1783.45 1783.24 0.21 1783.51 1783.26 0.25
69 - 76 1070.35 1070.29 0.06 1070.30 1070.29 0.01
77 - 94 2036.78 2036.65 0.13 2036.73 2036.87 -0.13
95 - 106 1413.74 1413.70 0.03 1413.64 1413.65 -0.01
95 - 107 1576.79 1576.86 -0.07 1576.83 1576.84 -0.02
107 - 120* 1711.01 1710.73 0.28 1710.97 1710.73 0.24
107 - 125* 2379.65 2379.19 0.47 2379.64 2379.33 0.31
108 - 120* 1547.48 1547.04 0.44 1547.38 1547.12 0.26
108 - 125* 2216.50 2216.02 0.48 2216.54 2216.15 0.39
110 - 120* 1303.49 1303.23 0.26 1303.46 1303.24 0.22
110 - 121* 1489.25 1488.79 0.46 1489.22 1488.89 0.34
110 - 125* 1972.12 1971.70 0.42 1972.10 1971.77 0.33
161 - 175 1902.09 1902.05 0.04 1902.07 1902.05 0.02
161 - 178 2257.67 2257.70 -0.02 2257.70 2257.92 -0.22
161 - 181 2557.23 2557.13 0.10 2557.09 2557.35 -0.27
163 - 175 1688.45 1688.40 0.05 1688.31 1688.29 0.01
163 - 181 2343.05 2343.03 0.02 2342.94 2343.22 -0.28
166 - 181 1893.07 1892.97 0.10 1892.89 1893.21 -0.33
168 - 181 1672.12 1672.13 -0.02 1672.14 1672.21 -0.07
225 - 236 1318.53 1318.53 -0.01 1318.51 1318.63 -0.12
225 - 248 2828.26 2828.14 0.12 2828.09 2828.30 -0.21
228 - 248 2498.76 2498.69 0.07 2498.71 2498.83 -0.12
237 - 248 1528.63 1528.56 0.07 1528.49 1528.58 -0.08
상기 표 7에 요약되어 있는 H/D 교환 결과는 온-교환 후 H4H1789Pa의 결합에 의한 CD48 상의 상기 특정 에피토프에 대한 양성자 오프-교환으로부터 상기 2개의 영역(서열번호 384의 아미노산 60-76 및 107-125에 대응함)이 보호된다는 것을 나타낸다. 잔기 69-76에 대응하는 펩티드는 현저한 질량 차이를 나타내지 않기 때문에, 상기 N-말단 에피토프 영역은 서열번호 384의 잔기 60-68로 감소될 수 있다. 따라서, CD48 상의 2개의 세그먼트(segment)(서열번호 384의 아미노산 60-76 및 107-125에 대응함)는 상기 H/D 교환 방법에 의해 상기 가용성 인간 CD48 단백질에 대한 항체 H4H1789Pa 결합을 위한 불연속 에피토프로서 정의된다. 항체 상호작용의 상기 영역들은 CD48의 Ig 도메인 1 내에 위치하며, 도 1에 도해로서 묘사되어 있다.
전술한 에피토프 맵핑 분석의 타당성 및 정확성을 확인하기 위하여, 이전에 정의된 에피토프를 갖는 대조군 항체를 이용한 추가적인 실험을 수행하였다. 특히, 전술한 CD48-mmH 구조체(서열번호 391) 및 항-Myc 항체 9E10을 이용하여 H/D 교환 실험을 수행하였다. 상기 Myc 에피토프는 서열번호 391의 아미노산 195-216에 대응한다.
상기 확인용 실험에 대한 모든 실험 절차는 항-Myc 항체 9E10이 테스트 항체로 사용된 것을 제외하고는 전술한 H4H1789Pa 실험의 경우와 동일하였다. 상기 확인용 항-Myc 실험의 결과는 표 8에 요약되어 있다(표 8의 첫 번째 칼럼에 나타낸 잔기 넘버링은 hCD48-mmH 구조체(서열번호 391)의 실제 잔기 넘버링에 대응하지만, 표 7의 첫 번째 칼럼에 나타낸 잔기 넘버링은 완전한 길이의 인간 CD48 폴리펩티드(서열번호 384)의 아미노산 수에 대응하도록 조정되었음을 유의해야 함). 이전과 마찬가지로, 적어도 0.20의 양의 차이(Δ)는 항체 결합에 의해 보호된 아미노산을 나타낸다. 이러한 잔기는 표 8에서 굵은 글씨 및 별표(*)로 나타낸다.
hCD48-mmH에 대한 9E10의 결합
5분 온- / 2.5분 오프 -교환 10분 온- / 5분 오프 -교환
(서열번호 391의) 잔기 온-용액/
오프 - 비드 		온- 비드 /
오프 - 비드 		Δ 온-용액/
오프 - 비드 		온- 비드 /
오프 - 비드 		Δ
1 - 7 804.93 804.91 0.02 804.99 804.95 0.04
19 - 33 1856.16 1856.24 -0.09 *** ***
34 - 50 2194.74 2194.68 0.06 2194.75 2194.64 0.10
37 - 50 1783.23 1783.21 0.02 1783.27 1783.19 0.08
43 - 50 1070.04 1070.07 -0.03 1070.09 1070.08 0.01
51 - 68 2036.51 2036.52 0.00 2036.53 2036.50 0.02
69 - 80 1413.96 1413.89 0.07 1413.78 1413.80 -0.02
69 - 81 1576.94 1577.07 -0.13 1577.05 1577.09 -0.04
81 - 94 1710.59 1710.62 -0.02 1710.59 1710.57 0.03
81 - 99 2379.16 2379.23 -0.07 2379.26 2379.24 0.02
82 - 94 1546.91 1546.84 0.07 1546.90 1546.84 0.06
82 - 99 2215.89 2215.89 0.00 2215.88 2215.87 0.00
84 - 94 1303.32 1303.34 -0.02 1303.29 1303.20 0.09
84 - 99 1972.13 1972.14 -0.02 1972.21 1972.11 0.10
135 - 155 2556.75 2556.64 0.12 2556.71 2556.66 0.05
137 - 145 1186.27 1186.33 -0.06 1186.27 1186.29 -0.02
137 - 155 2342.71 2342.93 -0.22 2342.99 2342.94 0.05
140 - 155 1891.85 1891.90 -0.05 1891.90 1891.92 -0.02
199 - 210 1318.80 1318.57 0.22 1318.59 1318.61 -0.02
199 - 222* 2830.27 2828.66 1.61 2829.99 2828.63 1.36
202 - 222* 2500.60 2499.30 1.30 2500.31 2499.28 1.03
211 - 220* 1255.00 1254.38 0.62 1254.86 1254.38 0.48
211 - 222* 1529.30 1528.69 0.60 1529.21 1528.76 0.45
예상되는 바와 같이, 9E10에 의해 인식되는 에피토프는 서열번호 391의 아미노산 199-222에 의해 정의되는 영역에 있는 것으로 확인된다. 따라서, 표 8에 요약되어 있는 결과는 본 실시예에서 사용된 H/D 방법론이 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 항원 상의 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 손쉽고 정확하게 사용될 수 있음을 확인한다.
실시예 5. ELISA 에 의해 측정된 CD48 -2B4 상호작용의 항체 차단
인간 CD48 및 원숭이 CD48이 인간 동족(cognate) 리간드인 인간 2B4에 결합하는 것을 차단하는 인간 항-CD48 단일클론 항체의 능력을 경쟁 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다(표 9). 일정한 양의 마우스 IgG2a Fc와의 융합으로 발현되는 바이오틴화 다이머성 인간 CD48 단백질("bio-hCD48-mFc"(서열번호 387)) 또는 2개의 myc 및 1개의 6-His 에피토프로 이루어지는 태그와 함께 발현되는 모노머성 원숭이 CD48("mfCD48-mmH"(서열번호 386))을 다양한 양의 항체를 이용하여 별도로 적정하였다. 상기 항체-단백질 복합체를 인큐베이션한 후(1시간, 25℃), 인간 IgG1(h2B4-hFc(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, Cat. No. 1039-2B)) 또는 마우스 IgG2a Fc(h2B4-mFc(서열번호 389)) 중 하나와 융합된 인간 2B4 수용체를 발현하는 다이머성 구조체로 코팅된 미세적정(microtiter) 플레이트로 전달하였다. 25℃에서 1시간 후, 상기 웰을 세척하였고, 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)와 접합된 스트렙트아비딘을 이용하여 결합된 인간 CD48을 검출하고, 항-myc 폴리클론 항체와 접합된 HRP를 이용하여 원숭이 CD48을 검출하였다. TMB 용액을 이용해 상기 ELISA를 현상하여 발색 반응을 생성하였고, 황산을 이용하여 퀀치(quench)한 후, Victor X5 플레이트 판독기 상에서 450 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. Prism™ 소프트웨어를 이용하여 S자형(sigmoidal) 용량 반응 커브를 상기 데이터에 맞추었다. 2B4에 대한 hCD48 또는 mfCD48의 결합을 50% 차단하기 위해 요구되는 항체의 농도로서 정의되는 계산된 IC50 값을 차단 효능의 지표(indicator)로 사용하였다(표 9 및 표 10, NB = 결합이 관찰되지 않음).
항체 h2B4 - hFc + bio - hCD48 - mFc
IC 50 ( molar ) 		h2B4 - hFc + mfCD48 - mmH
IC 50 ( molar )
H2M1707N 2.2E-11 2.3E-11
H2M1709N 4.5E-11 1.2E-10
H2M1710N 5.8E-10 3.7E-10
H2M1711N 5.9E-12 2.9E-11
H2M1712N 1.4E-11 1.7E-11
H2M1713N 2.6E-11 2.4E-11
H2M1763N 8.8E-12 1.3E-11
H2M1764N 6.4E-11 2.4E-10
H3M1766N NB NB
H2M1798N 5.0E-12 NB
H2M1811N 4.9E-10 2.2E-10
항체 h2B4 - mFc + bio - hCD48 - mFc
IC 50 ( molar ) 		h2B4 - mFc + mfCD48 - mmH
IC 50 ( molar )
H2M1707N 8.6E-12 4.9E-12
H4H1707N 2.2E-11 4.5E-11
H2M1710N 4.9E-10 2.6E-10
H2M1711N 4.1E-12 7.7E-13
H2M1713N 2.2E-11 2.5E-12
H4H1713N 1.8E-11 3.4E-12
H2M1763N 5.5E-12 2.3E-12
H4H1763N 7.4E-12 7.2E-12
H2M1764N 2.9E-11 6.2E-11
H4H1764N 7.6E-11 1.6E-10
H4H1769P 1.5E-11 1.8E-11
H4H1770P 2.0E-11 2.2E-11
H4H1771P 9.9E-12 2.2E-12
H4H1772P 1.4E-11 4.4E-12
H4H1774P 2.5E-11 1.6E-11
H4H1775P 4.4E-11 4.3E-11
H4H1778P 5.6E-11 8.4E-12
H4H1779P 1.6E-11 5.7E-12
H4H1781P 1.8E-11 8.1E-12
H4H1789Pa 5.3E-11 3.8E-11
표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 테스트된 모든 항체들은 효과적으로 CD48과 2B4 사이의 상호작용을 차단하였다.
실시예 6. 원발성 인간 PBMC 내의 IFN -감마 방출의 항체 차단
본 발명의 인간 항-CD48 단일클론 항체가 원발성 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 활성화를 차단하는 능력을 IFN-γ 방출 분석을 이용하여 측정하였다. 몇 명의 공여자(donor)의 백혈구 세포 농축물(Leukopak, New York Blood Center, New York, NY)로부터 Ficoll-Hypaque 구배 상의 원심분리에 의해 인간 PBMC를 단리하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)으로 보충된 RPMI-1640 배지 내에 1백만/㎖의 최종 농도로 재부유시키고, 96-웰 미세적정 플레이트에 분주하였다(200 ㎕/웰). 다양한 양의 CD48-특이적 항체로 세포를 인큐베이션한 후(1시간, 37℃), 단백질 G(최종 농도 0.8 ㎎/㎖, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat# P4689)로 미리 혼합된 작용제 항-CD3(B&D Pharmingen, San Jose, California, Cat# 555336) 및 항-CD28(B&D Pharmingen, San Jose, California, Cat# 555725) 항체(모두 최종 농도 40 ng/㎖)를 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 후, 상등액을 수집하였고, ELISA 키트(B&D Biosciences, San Jose, California, Cat# 555142)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 IFN-γ의 농도를 결정하였다. Prism™ 소프트웨어를 이용하여 S자형 용량 반응 커브를 상기 데이터에 맞추었다. 최대 IFN-γ 방출을 50% 차단하기 위해 요구되는 항체의 농도로서 정의되는 계산된 IC50 값을 차단 효능의 지표로 사용하였다(표 11 내지 표 13; NB = 결합이 관찰되지 않음; ND = 측정되지 않음; NC = 데이터가 수렴하지 않음).
IFN -감마 방출의 억제 IC 50 ( Molar )
항체 공여자 1 공여자 2 공여자 3 공여자 4 공여자 5
H2M1707N 4.9E-11 3.0E-11 1.1E-10 1.7E-10 1.5E-11
H2M1709N 4.8E-11 5.7E-11 1.2E-10 1.1E-10 3.2E-11
H2M1763N 4.9E-11 3.4E-11 1.3E-10 7.5E-11 1.9E-11
H2M1798N 4.3E-11 3.4E-11 9.5E-11 5.7E-10 6.0E-11
H2M1764N 2.7E-11 1.1E-10 1.9E-10 9.5E-11 1.9E-11
H2M1711N NB NB NB NB NB
H2M1710N 7.8E-10 1.9E-10 1.1E-06 1.5E-09 2.7E-10
H2M1712N 2.0E-11 2.8E-11 7.2E-11 4.8E-11 1.1E-11
H3M1766N NB NB NB NB NB
H2M1811N 9.1E-11 4.6E-10 8.3E-11 4.8E-10 9.4E-11
H2M1713N 2.1E-11 7.6E-11 NB 1.1E-10 1.1E-11
IFN -감마 방출의 억제 IC 50 ( Molar )
항체 공여자 6 공여자 7
H2M1707N 9.3E-12 1.9E-11
H2M1763N 2.6E-11 1.8E-11
H2M1764N 1.0E-10 테스트하지 않음
H2M1710N 5.0E-11 1.4E-10
H2M1713N 2.2E-11 1.0E-10
H4H1769Pa NB NC
H4H1770P NB NB
H4H1771P NB NB
H4H1772P 2.0E-12 2.2E-11
H4H1774P 2.5E-11 9.5E-12
H4H1775P NC 5.1E-12
H4H1778P 9.8E-12 NC
H4H1779P 1.7E-12 1.5E-11
H4H1781P 3.6E-11 1.5E-11
H4H1789Pa 1.2E-11 1.8E-11
IFN-감마 방출의 억제 IC 50 (Molar)
항체 공여자 8 공여자 9 공여자 10 공여자 11
H4H1707N NC 5.10E-11 NC NC
H4H1763N 8.60E-12 9.30E-12 1.00E-12 3.40E-12
H4H1764N 5.30E-12 3.10E-11 5.10E-12 2.30E-11
H4H1769Pa NB 5.70E-12 NB 1.90E-11
H4H1771P NC NB NB 1.50E-11
H4H1772P NB NC 1.40E-12 8.60E-11
H4H1775P 3.10E-12 2.30E-12 2.00E-11 NC
H4H1789Pa 3.70E-11 1.60E-11 1.30E-11 1.30E-11
표 11 내지 표 13에 나타낸 바와 같이, 테스트된 항체들 대부분은 원발성 인간 PBMC에서 IFN-γ 방출을 효과적으로 차단하였다.
실시예 7. 원발성 인간 혼합된 림프구 반응( Mixed Lymphocyte Reaction , MLR) 분석에서 IFN -감마 방출의 항체 차단
인간 항-CD48 단일클론 항체가 원발성 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 활성화를 차단하는 능력을 혼합된 림프구 반응 분석을 이용하여 측정하였다(표 14 및 표 15). 백혈구 세포 농축물(Leukopak, New York Blood Center, New York, NY) 또는 전혈 샘플(사내 혈액 수집 프로그램을 통해 얻음)로부터 Ficoll-Hypaque 구배 상의 원심분리에 의해 인간 PBMC를 단리하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지 내에 1백만/㎖의 최종 농도로 재부유시켰다. 신선하게 단리된 세포를 상이한 공여자 유래의 미리 조사된(irradiated) 세포와 10:1의 비로 혼합하였고, 96-웰 미세적정 플레이트에 분주하였다(200 ㎕/웰). 세포를 플레이팅한 후, 즉시 항체를 0.01 nM 내지 10 nM 범위의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 상등액을 수집하였고, ELISA 키트(B&D Biosciences, San Jose, California, Cat# 555142)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 IFN-γ의 농도를 결정하였다. Prism™ 소프트웨어를 이용하여 S자형 용량 반응 커브를 상기 데이터에 맞추었다. IFN-γ 차단 레벨은 최대값에 의해 표준화된(normalized) 상기 용량 반응 데이터를 통해 맞추어진 커브의 최대값과 최소값 사이의 차이로서 정의되었다(표 14 및 표 15에서 "% 차단"; "nb" = 결합이 관찰되지 않음; NC = 데이터가 수렴하지 않음). 최대 IFN-γ 방출을 50% 차단하기 위해 요구되는 항체의 농도로서 정의되는 계산된 IC50 값을 차단 효능의 지표로 사용하였다(표 15).
항체 9명의 개별 공여자( D1 - D9 )에 대한 % 차단
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9
H4H1769Pa nb 60 39 nb 43 60 51 40 nb
H4H1771P 78 79 88 nb 47 50 36 nb 32
H4H1772P nb 65 62 39 62 63 58 25 59
H4H1775P 42 77 87 37 70 72 69 22 60
H4H1789Pa 65 66 88 36 89 82 75 65 66
H4H1707N 66 87 78 20 62 77 62 42 60
H4H1763N 59 89 68 52 63 75 48 30 53
H4H1764N 69 46 80 nb 75 59 48 nb nb
Orencia® nb 52 nb nb 68 80 53 58 75
Amevive® 54 53 76 66 78 40 79 nb nb
belatacept 81 77 74 90 82 83 80 64 66
공여자 H4H1763N H4H1789Pa
% 차단 IC 50 (M) % 차단 IC 50 (M)
D1 59 ∼1.0×10-11 65 ∼1.4×10-12
D2 89 NC 66 ∼9.3×10-12
D3 68 ∼6.4×10-12 88 NC
D4 52 2.1×10-10 36 2.3×10-10
D5 63 ∼2.7×10-11 89 ∼9.0×10-11
D6 75 2.3×10-11 82 2.8×10-12
D7 48 NC 75 NC
D8 30 ∼3.7×10-9 65 2.9×10-11
D9 53 ∼4.1×10-9 66 1.8×10-10
D10 79 ∼8.4×10-11 77 ∼5.0×10-11
D11 72 7.3×10-11 80 ∼9.2×10-11
D12 79 ∼5.6×10-11 55 ∼3.0×10-10
D13 72 9.2×10-11 64 ∼9.6×10-11
D14 90 6.3×10-11 83 2.0×10-10
D15 82 ∼5.9×10-14 95 ∼2.7×10-12
D16 90 7.6×10-12 85 ∼1.2×10-11
표 14 및 표 15에 나타낸 바와 같이, 테스트된 모든 항체는 원발성 인간 혼합된 림프구 반응(PBMC MLR)에서 IFN-γ의 방출을 효과적으로 차단하였다. 실시예6 및 실시예 7에서 나타낸 바와 같이, 후보 항-CD48 항체가 원발성 인간 PBMC에서 IFN-γ 방출을 효과적으로 차단하는 능력은 상기 항체가 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 염증성 장 질환, 알레르기, 셀리악병, 건선, 천식 등과 같은 질환 및 증상에서 부적절한 자가면역 반응을 차단하는데 유용함을 제시한다.
실시예 8. 인간 조혈 줄기 세포로 재구성된 Rag2 -/- γ c -/- 마우스에서의 인간 사이토카인 방출의 항체 차단
인간 조혈 줄기 세포로 재구성된 면역결핍 Rag2-/-γc -/- 마우스로 이루어지는 키메라 동물 모델을 이용하여 인간 항-CD48 단일클론 항체가 생체내에서 인간 면역 세포의 활성화를 차단하는 능력을 측정하였다. 태어난 직후 동물들을 인간 줄기 세포로 재구성하였고, 재구성은 유세포 분석에 의해 확인하였다. 작용제 마우스 항-인간 CD3 항체(OKT3, 1 ㎍/동물, IP 주사, BioLegent, San Diego, California, Cat#317315) 또는 아형 항체(사내 제조된 마우스 IgG2a 항체)를 처리하기 24시간 전에 완전히 재구성된 동물(12-16 주령)에 5 ㎎/㎏의 CD48-특이적 항체 또는 적절한 아형 대조군(사내 제조된 인간 IgG4(S108P) 항체)을 복강내 주사하였다. 자극 후 24시간에 혈액 샘플을 얻었고, MSD 멀티플렉스 키트(Human Proinflammatory 9-Plex Ultra-Sensitive Kit, MesoScale Discovery, Gaithersburg, Maryland, Cat#K15007C-2)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 9가지 인간 사이토카인의 혈청 레벨을 측정하였다. 테스트된 2가지 항체는 인간 사이토카인의 생성을 억제하였다(표 16 및 표 17).
처리군 혈청 사이토카인 레벨( pg /㎖)
IFN γ IL -6 IL -10 TNF α IL -2
IgG2a +
hIgG4mut		 206.5±30.1 145.9±18.5 394.0±37.8 261.0±25.6 173.2±21.4
IgG2a +
H4H1763N		 166.3±9.8 153.9±13.7 343.8±15.0 301.2±16.8 194.7±11.5
IgG2a +
H4H1789Pa		 185.6±14.5 169.1±13.1 380.1±11.5 326.3±27.3 184.9±15.5
OKT3 8383.1±425.8 1144.1±120.6 21128.3±1276.0 1457.4±69.4 2900.6±209.7
OKT3 +
hIgG4mut		 5967.7±1659.4 1124.4±190.1 3853.8±742.3 2668.4±555.6 521.6±85.9
OKT3 +
H4H1763N		 493.9±55.4 180.2±12.4 536.2±34.0 497.1±56.6 295.1±35.3
OKT3 +
H4H1789Pa		 617.0±116.9 249.0±38.8 460.9±30.2 339.4±20.7 244.4±15.3
처리군 혈청 사이토카인 레벨( pg /㎖)
IL -8 IL -12 p70 IL -1β GM - CSF
IgG2a +
hIgG4mut		 2186.8±885.4 202.7±7.3 490.7±37.7 177.7±14.8
IgG2a +
H4H1763N		 5808.0±926.0 217.9±10.4 437.4±26.7 175.6±10.3
IgG2a +
H4H1789Pa		 2740±651 213.4±11.4 408.8±15.9 172.3±7.7
OKT3 5241.8±1237.0 225.6±13.0 445.0±8.8 1107.7±90.9
OKT3 +
hIgG4mut		 19899.0±3138.1 279.0±18.2 603.9±41.4 676.3±59.2
OKT3 +
H4H1763N		 3381.0±1169.0 182.1±10.5 410.4±22.4 243.3±10.4
OKT3 +
H4H1789Pa		 1585.7±269.2 206.3±4.2 395.0±16.4 559.3±76.8
표 16 및 표 17에 나타낸 바와 같이, 테스트된 2가지 항체는 키메라 생체내 시스템(인간 조혈 줄기 세포로 재구성된 Rag2-/-γc -/- 마우스)에서 인간 면역 세포의 폴리클론 자극에 의해 유도되는 사이토카인의 방출을 효과적으로 차단하였다.
실시예 9. 이식편 -대-숙주 질환( GvHD )의 이종성 ( xenogenic ) 모델에서 체중 감소와 연장된 생존의 항체 억제
인간 항-CD48 단일클론 항체인 H4H1789Pa가 생체내에서 인간 면역 세포의 활성화를 차단하는 능력을 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로 이식된 면역결핍 NOD/scid-/-γc -/-(NSG) 마우스에서 확립된 이식편-대-숙주 질환(GvHD)의 이종성 동물 모델을 이용하여 결정하였다. 8 주령의 마우스에 건강한 보통의 자원자로부터 신선하게 단리된 PBMC를 정맥 주사하였다(0일). 상기 PBMC 주사 후 3일에 말초혈에서 인간 CD45 세포 표면 마커(유세포 분석에 의해 검출됨)에 양성인 세포의 백분율로서 이식 성공률을 평가하였다. 인간 PBMC로 유도하기 24시간 전에 단일 복강내 용량으로 H4H1789Pa(10 ㎎/㎏)을 투여하면 인간 세포의 이식을 완전히 억제하였다(아형 대조군으로 처리된 마우스 유래 혈액에서는 ∼99%인 것과 대조적으로 림프구 게이트에서는 <10%의 세포임).
치료되지 않은 동물에서는 상기 PBMC 주사 후 7-8일에 인간 세포의 성공적인 이식이 100% 관찰되어 GvHD 증상(체중 감소, 구부린 위치, 주름진 털, 약함 등)이 발생하였다. 3일에 H4H1789Pa가 단일 복강내 용량(10 ㎎/㎏)으로 처리된 마우스는 지연된 체중 감소(10일에 통계학적으로 유의미함)와 생존율 중가 경향을 보였다(도 2). 아울러, 마지막 출혈(13일 또는 그 이전)로부터 얻은 혈청에서 MSD 멀티플렉스 키트(Human Proinflammatory 9-Plex Ultra-Sensitive Kit, MesoScale Discovery, Gaithersburg, MD, Cat. No. K15007C-2)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 인간 사이토카인 레벨을 측정하였다. H4H1789Pa를 처리하면 인간 IL-8(아형 대조군에서의 142.7±22.2 pg/㎖과 비교하여 55.2±21.3 pg/㎖), IL-10(85.4±2.6 pg/㎖ 대 171.8±44.2 pg/㎖), IL-6(20.5±12.3 pg/㎖ 대 30.0±8.9 pg/㎖) 및 TNF-α(35.3±4.5 pg/㎖ 대 51.6±1.1 pg/㎖) 레벨이 감소되었다. 인간 GM-CSF(554.9±131.8 pg/㎖ 대 348.9±20.7 pg/㎖) 및 IFN-γ(4.8±0.9 ng/㎖ 대 5.0±0.5 ng/㎖) 레벨은 감소되지 않았다. 인간 IL-1β, IL-2 및 IL-12p70의 레벨은 검출값 이하(below detection)였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 항-CD48 항체인 H4H1789Pa는 GvHD의 이종성 모델(인간 PBMC로 이식된 NSG 마우스)에서 체중 감소를 지연시키고(p<0.05, Dunnett's multiple comparison test) 생존을 연장시켰다. 상기 결과는 GvHD 치료에서의 항-CD48 치료의 유용성을 확인한다.
실시예 10. 셀리악병의 치료를 위한 항- CD48 항체의 임상 시험
셀리악병은 특정 HLA 클래스 Ⅱ 분자에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 밀, 보리 및 호밀 유래의 특정 식이성 디아민화 글루텐(gluten) 펩티드에 대한 반응으로 인터페론-γ가 방출된 결과로서 생기는 만성 HLA-DQ2 또는 DQ8 제한된(restricted) CD4+ T 세포 매개성 장질환이다.
6주의, 이중-맹검의(double-blind), 플라시보-조절된(placebo-controlled), 메카니즘이 증명된(proof-of-mechanism) 연구를 수행하여 경구 글루텐으로 시도(challenge)된 생검-입증된(biopsy-proven) 진행중단성(quiescent) 셀리악병에서 항-CD48 항체 처리의 효능, 안정성 및 내성을 평가한다. 12명의 환자가 12 ㎎/㎏의 본 발명의 항-CD48 항체(예컨대, H4H1789Pa) 또는 플라시보의 단일 정맥내 수액을 받는다(3:1 무작위배정(randomization)).
본 연구에 포함되는 환자들은 적어도 2년 동안 글루텐 제거 식이를 하고 있고(1일 글루텐 섭취 ≤ 5 ㎎), 8주 동안 글루텐 과민증(intolerance)이 없으며, HLA-DQ2 유전자형에 양성이고, 항-트랜스글루타미나아제 항체(항-TGA)에 음성이며, 글리아딘(gliadin) 인큐베이션에 대한 반응시 PBMC 인터페론-γ ELISpot 반응에 음성일 것이다.
플라시보 조절된 치료 2주 후에 모든 환자는 3일 동안 16 g/일 용량(대략 1일 4장의 빵과 동등함)의 글루텐을 받았고, 오렌지 주스 또는 두유와 혼합된 밀가루 슬러리로서 소비하였다
글루텐 시도 2주전부터 시작하여, 시도하는 동안 및 2주 후까지 매일 증상을 일기로 셀리악병 증상을 기록하고, 메스꺼움, 복부팽창, 복통, 무기력, 구토 설사 또는 다른 증상의 존재 및 증세를 (3점(three-point) 규모로) 기록하였다.
mRNA, 조직학, 면역조직화학, 융모의 길이/크립트(crypt)의 깊이(Vh/Cd)의 결정 및 상피내 림프구(IEL)의 계수를 위하여 무작위배정 후 2주 및 경구 글루텐 시도 후 2주에 십이지장의 2번째 부위에서 소장 생검을 취할 것이다. 변형된 마쉬(Marsh) 분류에 의해 소장 점막의 전체적인 구조를 평가할 것이다. 보통의 점막(마쉬 0), 상피내 림프구를 갖는 낮은 등급의 염증(마쉬 Ⅰ), 상피내 림프구 및 크립트과다형성(crypthyperplasia)을 갖는 낮은 등급의 염증(마쉬 Ⅱ) 및 상피내 림프구 및 크립트과다형성 및 융모 위축을 갖는 셀리악병 진단을 확립하기 위한 금 표준(gold standard)(마쉬 Ⅲ).
경구 글루텐 시도 전 및 시도 1주 및 2주 후, 말초혈을 환자(모두 HLA-DQ2 또는 DQ8)로부터 샘플링할 것이고, 정제된 T 림프구를 탈아민화 및 조절된 글리아딘 펩티드(자연형의 α-글리아딘57 -73 및 Q65E 변이체)로 인큐베이션할 것이다. 상기 탈아민화 대 자연형 α-글리아딘57 -73 펩티드에 대한 INF-γ ELISpot 반응의 차이를 측정함으로써 상기 대상에서의 T 세포 반응을 정량화하고, 글루텐 시도후 변경될 것으로 예상되지 않는 범(pan)-HLA-DR 인플루엔자 펩티드인 헴아글루티닌(hemaglutinin) 펩티드인 HA307 -319에 대한 IFN-γ ELISpot 반응으로 표준화할 것이다.
물리적 검사, 임상적 실험실 테스트 및 부작용 보고서에 의해 안정성과 내성을 평가할 것이다.
글루텐 시도 2주 후의 1차 종말점(endpoint)에서는 중앙(median) Vh/Cd 지수가 개선될 것이다. 2차 종말점에서는 전체적인 마쉬 내장 생검 조직 점수에서의 개선, 1일 셀리악 증상 점수의 감소 및 α-글리아딘57 -73 펩티드 시도에 대한 PBMC 인터페론-γ ELISpot 반응의 감소를 포함할 것이다. 탐사적인(exploratory) 종말점에서는 조직 및 WB mRNA, 말초 T 세포 외형(phenotype), 조직의 중앙 IEL 카운트 및 ELISA에 의해 측정된 혈청 사이토카인에서의 변화를 포함할 것이다.
실시예 11. 전신성 홍반성 낭창( SLE )의 치료를 위한 항- CD48 항체의 임상 시험
SLE는 염증과 조직 손상을 유도할 수 있는 아폽토시스(apoptosis)의 내인성(endogenous) 핵산에 대한 자가항체(autoantibody)의 생성을 포함하는 다중 면역 시스템 이상으로 특정되는 자가면역 질환이다. 체액성 및 세포성 면역 시스템 모두 활성화된다. 자가항체를 함유하는 면역 복합체와 만성 바이러스 감염은 자가면역의 자기-영구적(self-perputuating) 사이클을 생성하는 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포를 포함하는 본태성(innate) 및 적응성(adaptive) 면역 시스템을 조절하는 타입 Ⅰ 인터페론을 자극한다.
12주의, 이중-맹검의, 플라시보-조절된, 메카니즘이 증명된 연구를 수행하여 안정한 경도(mild)-내지-중등도(moderate) 내지 중증(severe) SLE에서 항-CD48 항체 처리의 효능, 안정성 및 내성을 평가한다. 20명의 환자가 12 ㎎/㎏의 본 발명의 항-CD48 항체(예컨대, H4H1789Pa) 또는 플라시보의 단일 정맥내 수액을 받는다(4:1 무작위배정). 환자들은 SELENA(Safety of Estrogens and Lupus Erythematosus National Assessment)-SLEDAI(Systemic Lupus Erythemato년 Disease Activity Index), SLE Flare Index 및 PGA(Physician's Global Disease Assessment)를 이용하여 규칙적으로 평가된다. 생물학적 마커 평가는 (ⅰ) CD20+ B 세포 및 CD138+ 혈장세포(plasmacytoid cell), CD40L+ T 세포, 항-dsDNA, ANA, 면역글로불린(IgG, IgM, IgE 및 IgA) 및 보체 성분인 C1q, C3, C4 및 C5a; (ⅱ) ELISA에 의한 인터페론-α 및 인터페론-γ, IL-10, IL-6, IL-15, IL-21 및 BLyS를 포함하는 사이토카인의 레벨; (ⅲ) FACS에 의한 표면 마커 분석을 이용한 순환하는 T, B, NK 및 T-조절성 세포의 총 수; 및/또는 (ⅳ) 전혈 내의 백혈구 수에서의 변화(예컨대, 백혈구감소증(leukopenia)의 표준화) 및 수반되는 피부 mRNA 유전자 조절의 측정을 포함한다. 또한, 실험실적 측정은 순차적인(serial) PK 및 항-약물 항체를 포함할 수 있다.
주요한 연구 포함/배제 기준은 (ⅰ) 18 내지 70의 성인 연령; (ⅱ) 스크리닝 전에 적어도 2개월 동안의 안정한 SLE 질환 활성; 및 (ⅲ) 투약(medication) 없이, 또는 저-용량 프레드니손, 항말라리아제, NSAID, 아자티오프린 또는 미클로프놀레이트 모페틸(myclopnolate mofetil)을 이용한 안정한 치료 요법으로 유지하는 것을 포함한다.
본 연구를 위해 선택된 환자들은 측정가능한 항-dsDNA, 항-스미스(Smith), 항-RNP 또는 항-쇼그렌(Sjogren) 항체를 가질 것이다. 혈액투석, 시클로포스파미드 또는 고용량의 프레드니손을 필요로 하는 활성 낭창성 신염을 갖는 환자들은 배제된다. 4주 내에 심각한 감염의 이력을 갖는 환자들은 배제된다.
기준선 및 항-CD48 치료 4주 후 사이의 항-dsDNA 항체의 감소와 보체 C3 및 C4의 증가에 의해 효능을 평가한다. 개선의 탐사적인 종말점은 SELENA-SLEDAI, PGA 및 SLE Flare Index를 포함한다. 물리적 검사, 임상적 실험실 테스트 및 부작용 보고서에 의해 안정성과 내성을 평가한다.
실시예 12. 건선의 치료를 위한 항- CD48 항체의 임상 시험
건선의 병리생리학(pathophysiology)은 각질세포를 활성화 및 증식시킬 수 있는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 방출을 유도하는 비정상 면역 매개성 Th1 및 Th17 림프구 염증 반응과 연관된다. 상기 과정은 건선성 플라크의 홀마크(hallmark) 병리학을 특정하는 상당한(substantial) 백혈구 침윤(infiltration)과 상피의 두께증가(epidermal thickening)를 유도한다.
12주의, 이중-맹검의, 플라시보-조절된, 메카니즘이 증명된 연구를 수행하여 중등도 내지 중증 건선에서 본 발명의 항-CD48 항체(예컨대, H4H1789Pa) 처리의 효능, 안정성 및 내성을 평가한다. 20명의 환자가 12 ㎎/㎏의 항-CD48 항체 또는 플라시보의 단일 정맥내 수액을 받는다(4:1 무작위배정). 환자들은 PASI(Psoriasis Area and Severity Index) 점수, PGA(Physician Global Assessment) 점수, DLQ, 사진촬영술, 임상적 관찰 및 PK 및 항-약물 항체를 포함하는 실험실적 측정을 이용하여 규칙적으로 평가되었다.
기준선 및 항-CD48 치료 8주 후 사이의 PASI에서의 변화에 의해 효능을 평가한다. 1차 종말점에서는 기준선으로부터 8주까지 PASI 점수가 75% 개선된다. 2차 종말점에서는 기준선과 8주 사이에 PASI, PGA 및 DLQ의 50% 개선을 포함한다. 물리적 검사, 임상적 실험실 테스트 및 부작용 보고서에 의해 안정성과 내성을 평가한다.
주요한 연구 포함/배제 기준은 (ⅰ) 18 내지 70의 성인 연령; (ⅱ) 적어도 6개월 동안의 만성 플라크 건선; (ⅲ) ≥ 10%의 BSA 개선; (ⅳ) ≥ 12의 PASI; (ⅴ) 전신성 또는 광치료용 후보물질; (ⅵ) 현재 전신성 치료에 사용되지 않거나 특정한 워시아웃(washout) 기간 내에 사용; 및/또는 (ⅶ) 효능 부재로 인해 건선에 대한 생물학적 치료를 이전에 중단하지 않는 것을 포함한다.
실시예 13. 궤양성 대장염의 치료를 위한 항- CD48 항체의 임상 시험
궤양성 대장염의 병리생리학은 창자 공생 균총(intestinal commensal florae)에 대한 창자 벽에서의 과반응성 CD4+ T 세포 적응성 면역 반응에 의해 특정된다. 활성화된 Th1 및 Th17 림프구는 호중구 및 단핵구가 창자에 소집되도록 하는 전-염증성 케모카인과 사이토카인을 방출한다. 항-CD48에 의한 동시자극의 차단은 미생물적으로 활성화된 APC가 만성 점막성 염증 반응을 강화 및 유지하는 미접촉(naive) T 헬퍼 세포와 상호작용하는 것을 방지할 잠재력(potential)을 갖는다.
12주의, 이중-맹검의, 플라시보-조절된, 메카니즘이 증명된 연구를 수행하여 경도-내지-중등도 증상의 궤양성 대장염을 갖는 환자에서 항-CD48 항체를 이용한 4주 치료의 효능, 안정성 및 내성을 평가한다. 70명의 환자가 기준선에서 단일 정맥내 수액으로서 본 발명의 항-CD48 항체(예컨대, H4H1789pa) 또는 플라시보를 받을 것이다(1:1 무작위배정). 본 연구에 포함되는 환자들은 18-70세의 연령이고, 스크리닝시 6-10의 포괄적인(inclusive) 질환 활성 지수 점수(12점 규모)의 궤양성 대장염으로 진단될 것이다. 환자들은 스크리닝 전 적어도 1개월 동안 아미노-살리실레이트 투약을 받고, 무작위배정 전에 적어도 2주 동안 안정한 용량으로 받을 것이다. 환자가 본 연구 전에 궤양성 대장염에 대해 임의의 다른 투약을 받는다면, 이러한 투약의 용량은 무작위배정 전 적어도 1개월 동안 안정할 것이다. 아자티오프린 또는 6-메르캅토푸린을 투여한 환자의 경우, 스크리닝 전 적어도 3개월 동안 상기 투약(들)을 받아온 환자들만 본 연구에 포함된다.
1차 효능 분석은 치료군 할당의 함수로서 기준선으로부터 4주까지 궤양성 대장염 질환 활성 지표 점수에서의 평균 변화를 평가할 것이다. 치료군들 사이에 4 이하의 보통의 SD로 적어도 3 점의 평균값차(mean difference)를 가정하면, 치료군 당 35명 환자의 샘플 크기(4주에 군 당 29명의 평가가능한 데이터를 가짐)는 5%의 유의 수준에서 상기 플라시보 군과 활성 치료군 사이의 차이를 검출하기 위한 적어도 80% 검정력(power)을 갖는다.
2차 효능 분석은 기준선으로부터 4주까지 질환 활성 지표 점수에서 3점 이상의 감소를 갖는 환자의 비율을 평가할 것이다(반응자). 상기 플라시보 반응률이 60%를 넘지 않고, 활성화 군에서의 반응률이 상기 플라시보군에서보다 적어도 40% 이상(예컨대, 30% 플라시보군 반응자 대 ≥70% 활성화 군 반응자)이라고 가정하면, 군 당 35명의 동일한 크기(4주에 군 당 29명의 평가가능한 데이터를 가짐)는 5%의 유의 수준에서 상기 플라시보 군과 활성 치료군 사이의 차이를 검출하기 위한 적어도 80%의 검정력을 갖는다.
또한, 상기 2차 효능 종말점(대변 빈도에서의 변화, 직장 출혈, 배변 억제, 내시경적 출현(endoscopic appearance), Investigator's Global Assessment 및 Patient's Global Assessment)을 기준선에서부터 4주까지 치료군의 함수로서 비교한다. 아울러, 백혈구 침윤(T 세포, 활성화된 대식세포)의 정량을 위해 내장 조직 생검을 수확하고, 면역조직화학 표면 마커 분석을 이용한 세포 외형에 의해 확인한다.
본 발명은 본 발명에 개시된 특정 구현예에 의해 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 확실히, 본 발명에 개시된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형들이 전술한 기재 및 첨부된 도면으로부터 본 기술분야의 기술자에게 자명해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 하는 의도이다.
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> ANTI-CD48 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 2013-FPA-5884 <150> US 61/386,746 <151> 2010-09-27 <150> US 61/475,280 <151> 2011-04-14 <150> US 61/515,490 <151> 2011-08-05 <160> 392 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaggggcagc tgttggaatc tgggggaggc ttggcacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaat cacctttggc agatatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcactt ataagtggca gtggtggtag cacataccac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactatat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gatctacaat 300 aactacaact ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Gly Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser 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ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcaatgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 380 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 380 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 381 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = Ser or Asn <400> 381 Ile Trp Tyr Asp Asp Ser Xaa Lys 1 5 <210> 382 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Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln 195 200 205 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 210 215 220 <210> 392 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 100 105 110 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 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Claims (18)

  1. 인간 CD48(서열번호 384)에 특이적으로 결합하고 인간 CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 절편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 CD48 수용체는 인간 CD2(서열번호 392)인 항체 또는 항원-결합 절편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 CD48 수용체는 인간 2B4(서열번호 390)인 항체 또는 항원-결합 절편.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 절편은 원발성 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 활성화를 시험관내에서 억제하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 인간 CD48의 Ig 도메인 1(서열번호 384의 아미노산 29 내지 127) 내의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 384의 아미노산 60 내지 125 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 384의 아미노산 60-68 및/또는 서열번호 384의 아미노산 107 내지 125 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 384의 아미노산 60-68 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산 및 서열번호 384의 아미노산 107 내지 125 내에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 368의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 370의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR을 포함하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 354, 356, 358, 362, 364 및 366의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 절편은 서열번호 368의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 서열번호 370의 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는 항체 또는 항원-결합 절편.
  12. 인간 CD48의 Ig 도메인 1(서열번호 384의 아미노산 29 내지 127)을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합을 위하여 참조 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 절편으로서, 상기 참조 항체는 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에서 정의된 항체 또는 항원-결합 절편인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 절편.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 절편 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 질병을 앓거나, 진단되거나, 앓을 위험성이 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 셀리악병, 전신성 홍반성 낭창, 궤양성 대장염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 질병인 약학적 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 항원-결합 절편 또는 청구항 13의 약학적 조성물을 CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 질병을 앓거나, 진단되거나, 앓을 위험성이 있는 환자의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하는 용도.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 CD48과 CD48 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 셀리악병, 전신성 홍반성 낭창, 궤양성 대장염 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 질병인 용도.
  18. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 절편 또는 청구항 13의 약학적 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 셀리악병, 전신성 홍반성 낭창, 궤양성 대장염 또는 건선의 치료 방법.
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