CN103261226A - 抗cd48抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与CD48结合的抗体以及使用所述抗体的方法。根据本发明的某些实施方案，所述抗体是与人CD48结合的全人抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体阻断CD48与一种或更多种CD48受体的结合。本发明的抗体尤其可用于治疗与一种或更多种CD48生物活性相关的疾病和病症，包括治疗变应性病症和其他炎性病症。

Description

抗CD48抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对人CD48特异的抗体及其抗原结合片段。
背景技术
CD48是GPI锚定蛋白，其以膜结合和可溶性两种形式存在。CD48是2B4的高亲和配体和CD2的低亲和配体。CD48在科学文献中也被称作“TCT.1”(Mami-Chouaib等，J.Exp.Med.172：1071-1082(1990))、“B-LAST 1”(Thorley-Lawson等，Cell 30：415-425(1982))和SLAMF2(Detre等，Semin.Immunopathol.32：157-171(2010))。已显示CD48与2B4之间的相互作用引起NK细胞活化。还显示CD48在体外刺激T细胞活化，并且CD48基因敲除小鼠表现出受损的T细胞增殖应答。
某些证据表明CD48在哮喘进展和炎性肠病(IBD)中的作用。例如，已显示CD48在实验性哮喘(例如，卵清蛋白和曲霉菌诱导的变应性嗜酸粒细胞气道炎症模型)中上调。参见，例如Munitz等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.175：911-918(2007)。另外，CD48敲除小鼠在IBD的过继转移模型中不发生炎性结肠炎。而且，证明CD48拮抗在之前建立的结肠炎中产生有利影响。
在例如US 2007/0212353和WO 97/35614中提到了CD48拮抗剂用于治疗目的的用途。虽然如此，在本领域中依然需要可用于治疗CD48介导的疾病和病症的新CD48调节剂，包括抗CD48抗体。
发明概述
本发明提供了与人CD48结合的抗体。本发明的抗体尤其可用于抑制CD48介导的信号转导和治疗由CD48活性和/或信号转导引起的或与其相关的疾病和病症。
本发明的抗体阻断CD48与CD48受体(例如，2B4和/或CD2)之间的相互作用，和/或抑制原代人外周血单核细胞(PBMC)的活化。根据某些实施方案，本发明的抗体结合人CD48的第一免疫球蛋白结构域内的表位。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能，例如，清除残留的效应子功能(Reddy等，2000，J.Immunol.164：1925-1933)。
本发明提供了包含这样的重链可变区(HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、162、178、192、208、212、228、232、248、252、268、272、288、292、308、312、328、332、348、352和368的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
本发明还提供了包含这样的轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、146、154、170、180、182、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、372和380的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
本发明还提供了包含选自以下的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对的抗体或其抗原结合片段：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/180、162/182、178/190、192/200、208/210、212/220、228/230、232/240、248/250、252/260、268/270、272/280、288/290、292/300、308/310、312/320、328/330、332/340、348/350、352/360、368/370，352/372和368/380。
本发明还提供了包含这样的重链CDR3(HCDR3)结构域和轻链CDR3(LCDR3)结构域的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链CDR3结构域具有选自SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、168、198、218、238、258、278、298、318、338和358的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列，所述轻链CDR3结构域具有选自SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、152、160、176、188、206、226、246、266、286、306、326、346、366和378的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
在某些实施方案中，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含选自以下的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对：SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、168/176、168/188、198/206、218/226、238/246、258/266、278/286、298/306、318/326、338/346、358/366和358/378。
本发明还提供了还包含这样的重链CDR1(HCDR1)结构域、重链CDR2(HCDR2)结构域、轻链CDR1(LCDR1)结构域和轻链CDR2(LCDR2)结构域的抗体或其片段，所述重链CDR1结构域具有选自SEQID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、164、194、214、234、254、274、294、314、334和354的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；所述重链CDR2结构域具有选自SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、166、196、216、236、256、276、296、316、336和356的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；所述轻链CDR1结构域具有选自SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、148、156、172、184、202、222、242、262、282、302、322、342、362和374的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；所述轻链CDR2结构域具有选自SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、150、158、174、186、204、224、244、264、284、304、324、344、364和376的氨基酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
本发明的某些非限制性示例性抗体和抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16(例如，H2M1707N)；20-22-24-28-30-32(例如，H2M1709N)；36-38-40-44-46-48(例如，H2M1710N)；52-54-56-60-62-64(例如，H2M1712N)；68-70-72-76-78-80(例如，H2M1713N)；84-86-88-92-94-96(例如，H2M1763N)；100-102-104-108-110-112(例如，H2M1764N)；116-118-120-124-126-128(例如，H2M1811N)；132-134-136-140-142-144(例如，H2M1766N)；164-166-168-172-174-176(例如，H4H1769N-a)；164-166-168-184-186-188(例如，H4H1769N-b)；194-196-198-202-204-206(例如，H4H1770N)；214-216-218-222-224-226(例如，H4H1771N)；234-236-238-242-244-246(例如，H4H1772N)；254-256-258-262-264-266(例如，H4H1774N)；274-276-278-282-284-286(例如，H4H1775N)；294-296-298-302-304-306(例如，H4H1778N)；314-316-318-322-324-326(例如，H4H1779N)；334-336-338-342-344-346(例如，H4H1781N)；354-356-358-362-364-366(例如，H4H1789Na和Pa)；和354-356-358-374-376-378(例如，H4H1789Nb和Pb)。
本发明还包括这样的抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有以下氨基酸序列的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：HCDR1＝GFTFSNYG(SEQ ID NO：254)；HCDR2＝IWYDDSXK，其中X是S或N(SEQ ID NO：381)；HCDR3＝ARDRWTYSHXFEY，其中X是Y或F(SEQ ID NO：382)；LCDR1＝QXISSW，其中X是D或G(SEQ ID NO：383)；LCDR2＝AAS(SEQ ID NO：264)；和LCDR3＝QQANSFPRT(SEQ ID NO：266)。具有这些序列特征的本发明非限制性示例性抗体包括：H4H1774N、H4H1775N、H4H1778N、H4H1779N和H4H1781N。
在一个相关实施方案中，本发明包括与CD48特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的重链和轻链序列中所含的重链和轻链CDR结构域：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、162/170、178/180、162/182、178/190、192/200、208/210、212/220、228/230、232/240、248/250、252/260、268/270、272/280、288/290、292/300、308/310、312/320、328/330、332/340、348/350、352/360、368/370、352/372和368/380。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可用于鉴定本文所公开的具体HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。可用于确定CDR边界的示例性常规方法包括例如：Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义基于序列变化，Chothia定义基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法的折中。参见，例如Kabat，″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；和Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
在另一方面，本发明提供了编码抗CD48抗体或其片段的核酸分子。携带本发明的核酸的重组表达载体和引入了这样的载体的宿主细胞以及在允许抗体产生的条件下培养宿主细胞和回收所产生的抗体的方法也涵盖在本发明内。
在一个实施方案中，本发明提供了包含这样的HCVR的抗体或其片段，所述HCVR由选自SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、161、177、191、207、211、227、231、247、251、267、271、287、291、307、311、327、331、347、351和367的核酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码。
本发明还提供了包含这样的LCVR的抗体或其片段，所述LCVR由选自SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、145、153、169、179、181、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、371和379的核酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的基本相同序列编码。
本发明还提供了包含这样的HCDR3结构域和LCDR3结构域的抗体或抗体的抗原结合片段，所述HCDR3结构域由选自SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、167、197、217、237、257、277、297、317、337和357的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码，所述LCDR3结构域由选自SEQID NO：15、31、47、63、79、95、111、127、143、151、159、175、187、205、225、245、265、285、305、325、345、365和377的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码。
本发明还提供了还包含这样的HCDR1结构域、HCDR2结构域、LCDR1结构域和LCDR2结构域的抗体或其片段，所述HCDR1结构域由选自SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、163、193、213、233、253、273、293、313、333和353的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码，所述HCDR2结构域由选自SEQ ID NO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、165、195、215、235、255、275、295、315、335和355的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码，所述LCDR1结构域由选自SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、147、155、171、183、201、221、241、261、281、301、321、341、361和373的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码，所述LCDR2结构域由选自SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、149、157、173、185、203、223、243、263、283、303、323、343、363和375的核苷酸序列或与其有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同序列编码。
根据某些实施方案，所述抗体或其片段包含由以下核酸序列编码的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NO：SEQ ID NO：1和9(例如，H2M1707N)、17和25(例如，H2M1709N)、33和41(例如，H2M1710N)、49和57(例如，H2M1712N)、65和73(例如，H2M1713N)、81和89(例如，H2M1763N)、97和105(例如，H2M1764N)、113和121(例如，H2M1811N)、129和137(例如，H2M1766N)、161和169(例如，H4H1769N-a)、177和179(例如，H4H1769P-a)、161和181(例如，H4H1769N-b)、177和189(例如，H4H1769P-b)、191和199(例如，H4H1770N)、207和209(例如，H4H1770P)、211和219(例如，H4H1771N)、227和229(例如，H4H1771P)、231和239(例如，H4H1772N)、247和249(例如，H4H1772P)、251和259(例如，H4H1774N)、267和269(例如，H4H1774P)、271和279(例如，H4H1775N)、287和289(例如，H4H1775P)、291和299(例如，H4H1778N)、307和309(例如，H4H1778P)、311和319(例如，H4H1779N)、327和329(例如，H4H1779P)、331和339(例如，H4H1781N)、347和349(例如，H4H1781P)、351和359(例如，H4H1789Na)、367和369(例如，H4H1789Pa)、351和371(例如，H4H1789Nb)或367和379(例如，H4H1789Pb)。
本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CD48抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体(见Shield等(2002)JBC 277：26733)。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含与CD48特异性结合的重组人抗体或其片段以及可药用载剂。在一个相关方面，本发明提供了为CD48抑制剂与第二治疗剂的组合的组合物。在一个实施方案中，所述CD48抑制剂是抗体或其片段。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与CD48抑制剂组合的任意试剂。可有利地与CD48抑制剂组合的示例性试剂包括但不限于抑制CD48活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰CD48上游或下游信号转导的试剂。
在另一方面，本发明提供了使用本发明的抗CD48抗体或抗体的抗原结合部分来抑制CD48的活性的方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗疾病是通过除去、抑制或降低CD48活性来改善、减轻、抑制或预防的任意疾病或病症。本发明的抗CD48抗体或抗体片段可通过阻断CD48与CD48受体(例如，2B4和/或CD2)之间的相互作用或以其他方式抑制CD48的信号转导活性来起作用。
本发明还包括本发明的抗CD48抗体或抗体的抗原结合部分在制造用于治疗患者中与CD48活性相关或由其引起之疾病或病症的药物中的用途。
通过接下来的发明详述的论述，其他实施方案将变得明显。
附图说明
图1：人CD48多肽(SEQ ID NO：384)的线性图。由氨基酸1-26表示的部分是信号序列；由氨基酸29-127表示的部分是Ig结构域1；由氨基酸132-212表示的部分是Ig结构域2；SEQ ID NO：384中对应于氨基酸60-68(YTFDQKIVE)和107-125(YIMRVLKKTGNE QEWKIKL)的区域表示对名称为H4H1789Pa的示例性抗体确定的表位(见实施例4)
图2：抗CD48抗体在移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)的小鼠模型中的处理效果的图示(见实施例9)。图A示出在经处理和对照动物中观察到的体重减轻；图B示出经处理和对照动物的存活百分比。对于两个图，(●)表示未处理；(▲)表示hIgG4同种型对照处理；(■)表示利用示例性抗CD48抗体H4H1789Pa处理。
发明详述
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这样的方法和实验条件可以不同。还应理解本文所使用术语仅旨在描述具体实施方案，而不是意在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外定义，否则本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员的通常理解相同的意思。如本文所使用的，当涉及具体列举数值时，术语“约”意思是指与所列举值可相差不大于1％的值。例如，如本文所使用的，表达“约100”包括99和10i以及其间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管在本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些，但是现在描述优选的方法和材料。
定义
本文使用的词“CD48”和“CD48片段”是指人CD48蛋白或片段，除非特别指出来源于非人物种(例如“小鼠CD48”、“小鼠CD48片段”、“猴CD48”“猴CD48片段”等)。人CD48具有SEQ ID NO：384的氨基酸序列。来源于非人物种(例如，小鼠、猴、兔、狗、猪等)的CD48分子的氨基酸序列可得自公共资源，例如GenBank(例如，GenBank登录号BAE96326.1(小鼠)；DAA31966.1(牛)；EDL94663.1(大鼠)等)。
本文使用的术语“CD48受体”意思是指与人CD48蛋白相互作用以在体内传递生物信号的蛋白质。术语“CD48受体”包括人2B4和人CD2。本文使用的术语“人2B4”是指包含SEQ ID NO：390的氨基酸序列的蛋白质或其能够与CD48相互作用的部分。本文使用的术语“人CD2”是指包含SEQ ID NO：392的氨基酸序列的蛋白质或其能够与CD48相互作用的部分。
本文使用的术语“抗体”旨在指包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(本文中简写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3这三个结构域。各轻链包含轻链可变区(本文中简写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区还可以细分成称为互补决定区(CDR)的超变区，其间具有称为框架区(FR)的较保守区域。各VH和VL由3个CDR和4个FR构成，它们从氨基端到羧基端按照以下顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一些不同实施方案中，抗CD48抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系(germline)序列相同，或可以是天然的或人工修饰的。可基于两个或更多个CDR的并排分析来确定氨基酸共有序列。
本文使用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然的、可酶促得到的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术(如涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的蛋白裂解消化或DNA重组基因工程技术)来源于例如完整抗体分子。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到或可以被合成。可对DNA进行测序以及使用化学方法或通过使用分子生物学技术对DNA进行操作，例如以将一个或更多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构造或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基(例如，分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)或限制的(constrained)FR3-CDR3-FR4肽组成的最小识别单位。另一些经改造分子也涵盖本发明所使用的词“抗原结合片段”内，例如：结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、微小抗体(minibodies)、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型免疫药物(small modularimmunopharmaceutical，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以是任意大小或氨基酸组成的，并且一般包含至少一个CDR，其与一个或更多个框架序列相邻或与它们同框(in frame)。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，可变区可以是二聚的并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价链接的至少一个可变结构域。可在本发明抗体的抗原结合片段中存在的可变结构域和恒定结构域的非限制示例性构造包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构造中(包括以上所列任意示例性构造)，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可通过完整或部分铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其形成单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。另外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含以上列出的任何可变结构域和恒定结构域构造的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，它们彼此之间和/或与一个或更多个单体VH或VL结构域非共价连接(例如通过二硫键)。
对于完整抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中各可变结构域能够与分离的抗原或同一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域可利用的常规技术将任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)适用于本发明抗体的抗原结合片段的背景中。
本发明的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来起作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体的存在下本发明的抗体裂解抗原表达细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体从而导致靶细胞的裂解。可使用本领域周知且可利用的测定测量CDC和ADCC(例如，见U.S.5,500,362和5,821,337，以及Clynes等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力很重要。因此，可根据是否期望抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。
本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可在例如CDR并且尤其是CDR3中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或体外位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体，所述抗体中来源于其他哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列被移植到人框架序列上。
本文使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下文中进一步描述)、分离自重组的组合人抗体文库的抗体(在下文中进一步描述)、分离自人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)的抗体(见例如，Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列进行剪接的任意其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外突变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时为体内体细胞突变)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为这样的序列：来源于人种系VH和VL序列并且与其相关，同时可以不天然存在于体内人抗体种系库内。
人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的4个链结构，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体未通过链间二硫键连接并且形成约75-80kDa的分子，其由共价连接的轻链和重链构成(半抗体)。这些形式及难以分离，即使是在亲和纯化后也是如此。
第二种形式在多种完整IgG同种型中的出现频率是由于(但不限于)与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区的单个氨基酸替换可使第二种形式的出现显著降低(Angal等(1993)MolecularImmunology30：105)至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区具有一个或更多个突变的抗体，其可以是期望的，例如在生产中提高期望抗体形式的产量。
本文使用的“分离的抗体”是指已经被鉴定并且与其自然环境的至少一种成分分离和/或回收的抗体。例如，已经与有机体的至少一种组分或天然存在或天然产生抗体的组织或细胞分离或从中取出的抗体是本发明的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞中的原位抗体。分离的抗体是已经进行了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。确定抗体与抗原是否特异性结合的方法是本领域周知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，本发明上下文中所使用的与人CD48“特异性结合”的抗体包括以小于约1000nM、小于约500nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM或小于约0.5nM的KD(如在表面等离子体共振试验中测量的，例如，见本文的实施例3)与人CD48或其部分结合的抗体。但是，与人CD48特异性结合的分离的抗体可与其他抗原(例如，来源于其他(非人)物种的CD48分子)具有交叉反应性。
本文使用的“中和”或“阻断”抗体旨在表示与CD48结合(i)干扰CD48或CD48片段与CD48受体(例如，2B4和/或CD2)之间的相互作用，和/或(ii)导致CD48的至少一种生物学功能的抑制的抗体。CD48中和抗体或阻断抗体引起的抑制不需要是完全的，只要可使用合适的测定可检测即可。本文描述了检测CD48抑制的示例性测定。
与抗体来源的相应种系序列相比，本文公开的抗CD48抗体可在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区包含一个或更多个氨基酸替换、插入和/或缺失。这样的突变可通过将本文公开的氨基酸序列与可得自例如公共抗体序列数据库的种系序列进行比较来容易地确定。本发明包括来源于本文公开的任意氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中一个或更多个框架区和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸被突变成抗体来源的种系序列的相应残基，或突变成另一人种系序列的相应残基，或突变成相应种系残基的保守氨基酸替换(本文将这样的序列改变统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发可容易地产生包含一个或更多个单独种系突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域中的全部框架和/或CDR残基被突变回抗体来源的最初种系序列中存在的残基。在另一些实施方案中，仅某些残基被突变回最初的种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸中存在突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内存在突变残基。在另一些实施方案中，一个或更多个框架和/或CDR残基被突变成不同种系序列(例如，与抗体最初来源的种系序列不同的种系序列)的相应残基。另外，本发明的抗体可包含框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单个残基被突变成特定种系序列的相应残基，而与最初种系序列不同的某些其他残基被保留或被突变成不同种系序列的相应残基。一旦得到，可容易地检测包含一个或更多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一个或更多个期望性质，例如结合特异性提高、结合亲和力增加、拮抗或竞争生物学特性(根据具体情况)的提高或增强、免疫原性降低等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包括这样的抗CD48抗体，其包含具有一个或更多个保守替换的任何本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。例如，本发明包括具有这样的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗CD48抗体，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个以下、8个以下、6个以下、4个以下等的保守氨基酸替换。
本文使用的术语“表面等离子共振”是指允许例如使用BIAcoreTM系统(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。
本文使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中特定抗原结合部位(被称为互补位(paratope))相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有不止一个表位。因此，不同抗体可结合于抗原上的不同区域且可具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由线性多肽链不同区段的在空间上邻接的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些环境下，表位可包含抗原上的糖、磷酸基或磺酰基部分。
当提及核酸或其片段时，术语“基本一致”或“基本相同”表示当与另一核酸(或其互补链)以合适的核苷酸插入或缺失最佳比对时，在至少约95％，更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中有核苷酸序列同一性(如使用任何周知的序列同一性算法(例如下文公开的FASTA、BLAST或Gap)测量的)。在某些情况下，与参考核酸分子基本相同的核酸分子可编码具有与参考核酸分子编码之多肽相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似”或“基本相似”是指当最佳比对时(例如通过使用默认缺口重量的程序GAP或BESTFIT)，两种多肽序列具有至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％或99％的序列同一性。优选地，不一致的残基位点因保守氨基酸替换而不同。“保守氨基酸替换”是氨基酸残基被有具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)之侧链(R基)的另一氨基酸残基替换。通常，保守氨基酸替换基本不改变蛋白质的功能特性。当两个或更多个氨基酸序列因保守替换而彼此不同时，可向上调节序列同一性百分比或相似性程度以符合替换的保守特性。用于这种调节的方法是本领域技术人员周知的。例如，见Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。有具有相似化学特性之侧链的氨基酸的组包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸：(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换的组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等(1992)Science 256：1443-1445公开的PAM250对数概似矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中具有正值的任何改变。“适度保守(moderately conservative)”替换是在PAM250对数概似矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性(也称作序列同一性)通常使用序列分析软件测量。蛋白质分析软件使用分配给多种替换、缺失和其他改变(包括保守氨基酸替换)的相似性计量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含程序如Gap和Bestfit，其可用缺省参数来确定密切相关的多肽(例如来源于不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG 6.1版。也可用使用缺省或推荐参数的FASTA(GCG 6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询序列与研究序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。当将本发明的序列与包含大量来源于不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一优选算法是使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
抗体的生物学特性
本发明的抗体阻断人CD48与至少一种CD48受体之间的相互作用。如本文所使用的，表述“阻断人CD48与至少一种CD48受体之间的相互作用”是指在可检测和/或定量CD48与CD48受体(例如，人2B4和/或人CD2)之间的物理相互作用的测定中，添加本发明的抗体使CD48与受体之间的相互作用降低至少50％。在本文的实施例5中描述了可用于确定抗体是否阻断人CD48与CD48受体(例如，人2B4)之间的相互作用的非限制性示例性测定。在该实施例中，将抗体与CD48蛋白质混合，然后将抗体/CD48混合物施加到包被有2B4蛋白质的表面上。在冲走未结合分子后，测量与2B4包被表面结合的CD48的量。通过在该测定形式中使用不同量的抗体，可计算阻断50％的CD48与2B4的结合所需的抗体的量并且表示为IC50值。本发明包括在上述CD48/CD48受体结合测定或基本相似的测定中测试时具有小于约400pM的IC50的抗CD48抗体。例如，本发明包括在上述CD48/CD48受体结合测定或基本相似的测定中测试时具有小于约400、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1pM的IC50的抗CD48抗体。
本发明的抗体还能够抑制原代人外周血单核细胞(PBMC)的活化。如本文所使用的，表述“抑制原代人外周血单核细胞的活化”是指在可检测和/或定量PBMC活化的测定(例如，通过测量IFN-γ或其他细胞因子的释放)中，添加本发明的抗体使得IFN-γ(或其他细胞因子)的释放量降至少50％。在本文的实施例6和7中描述了可用于确定抗体是否抑制PBMC活化的非限制性示例性测定。在一个实施例中，将抗CD48抗体添加到分离的人PBMC中，之后使用激动剂抗CD3和抗CD28抗体活化PBMC。在孵育一段时间后，测量IFN-γ的释放量。通过在该测定形式中使用不同量的抗体，可以计算抑制50％的最大IFN-γ释放所需的抗体的量并且表示成IC50值。本发明包括在上述PBMC活化测定或基本相似的测定中测试时具有小于约500pM的IC50的抗CD48抗体。例如，本发明包括在上述PBMC活化测定或基本相似的测定中测试时具有小于约500、400、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1pM的IC50的抗CD48抗体。
表位作图和相关技术
人CD48蛋白质包含两个免疫球蛋白样结构域，在本文中称作“Ig结构域1”和“Ig结构域2”。Ig结构域1是由SEQ ID NO：384的氨基酸29至127表示的氨基酸序列，Ig结构域2是由SEQ ID NO：384的氨基酸132至212表示的氨基酸序列(见图1)。
本发明包括与人CD48的Ig结构域1内的表位特异性结合的抗CD48抗体。所述表位可由位于CD48的Ig结构域1内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的单个连续序列组成。或者，所述表位可由位于CD48的Ig结构域1内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。根据本发明的某些实施方案，提供了与位于SEQ ID NO：384的氨基酸60至125中的一个或更多个氨基酸相互作用的抗CD48抗体。例如，本发明包括与位于SEQ ID NO：384的氨基酸60至68和/或107至125中的一个或更多个氨基酸相互作用的抗CD48抗体。
可使用多种本领域一般技术人员已知的技术来确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或更多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括：例如，常规交叉阻断测定(例如，在Antibodies，Harlow and Lane(Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harb.，NY)描述的)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke，2004，Methods Mol Biol 248：443-463)和肽切割分析。另外，可使用方法如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer，2000，Protein Science9：487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是通过质谱检测的氢/氘交换(参见，例如本文的实施例4)。一般来说，氢/氘交换方法涉及用氘标记目标蛋白质，之后使抗体与氘标记的蛋白质结合。接着，将蛋白质/抗体复合物转移到水中使得在除受抗体保护的残基(其保持氘标记)以外的全部残基上进行氢氘交换。在抗体解离后，对靶蛋白质进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
本发明还包括与本文描述的任何特定示例性抗体(例如，H4H1789Pa、H4H1763N、H2M1707N、H2M1709N、H4H1770N、H4H1771N等)结合相同表位的抗CD48抗体。同样地，本发明还包括与本文描述的任何特定示例性抗体(例如，H4H1789Pa、H4H1763N、H2M1707N、H2M1709N、H4H1770N、H4H1771N等)竞争结合CD48或CD48片段的抗CD48抗体。
可使用本领域已知的常规方法容易地确定抗体是否与参照抗CD48抗体结合相同表位或与参照抗CD48抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗CD48抗体结合相同表位，在饱和条件下使参照抗体与CD48蛋白质或肽结合。接下来，评价测试抗体与CD48分子结合的能力。如果测试抗体在CD48在与参照抗CD48抗体饱和结合后还能够与CD48结合，那么可推断测试抗体与参照抗CD48抗体结合于不同表位。另一方面，如果测试抗体在CD48与参照抗CD48抗体饱和结合后不能与CD48分子结合，那么测试抗体可结合于与本发明的参照抗CD48抗体结合的表位相同的表位。然后可进行另外的常规测定(例如，肽突变和结合分析)以确定所观察到测试抗体没有结合确实是由于与参照抗体结合相同表位，或者是否是立体阻断(或其他现象)导致了所观察到的没有结合。这种实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域可利用的任何其他定量或定性抗议结合测定来进行。根据本发明的某些实施方案，如果例如1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合(如在竞争性结合测定中测量的(参见，例如Junghans等，Cancer Res.1990：50：1495-1502))，那么两种抗体结合相同(或重叠)的表位。或者，如果抗原中基本所有降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变均降低或消除另一种抗体的结合，那么认为这两种抗体结合相同的表位。如果仅一部分降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体具有“重叠表位”。
为了确定抗体是否与参照抗CD48抗体竞争结合，以两个方向实施上述结合方法：在第一方向，使参照抗体在饱和条件下与CD48分子结合，之后评估测试抗体与CD48分子的结合。在第二方向，使测试抗体在饱和条件下与CD48分子结合，之后评估参照抗体与CD48分子的结合。如果在两个方向下，仅第一(饱和)抗体能够与CD48分子结合，那么推断测试抗体与参照抗体竞争结合CD48。如本领域一般技术人员将理解的，与参照抗体竞争结合的抗体未必与参照抗体结合相同的表位，而是也可以通过结合重叠或相邻表位立体阻断参照抗体的结合。
人抗体的制备
产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法是本领域中已知的。可将任何这样的已知方法用于本发明的背景中来制备与人CD48特异性结合的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或其他任何已知方法产生单克隆抗体，最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的CD48高亲和性嵌合抗体。如在下文实验部分中所述，对抗体进行表征并且根据期望特性(包括亲和性、选择性、表位等)进行选择。将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区以产生本发明的全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管所选择的恒定区可根据特定用途而不同，但是高亲和的抗原结合和靶标特异性特征存在于可变区。
生物等效性
本发明的抗CD48抗体和抗体片段涵盖这样的蛋白质，其具有与所描述抗体不同的氨基酸序列，但是保持与人CD48结合的能力。当与亲本序列比较时，这样的变体抗体和抗体片段包含一个或更多个氨基酸添加、缺失或替换，但是具有与所描述抗体基本等效的生物活性。同样地，本发明的编码抗CD48抗体的DNA序列涵盖这样的序列，当与所公开的序列比较时，其包含一个或更多个核苷酸的添加、缺失或替换，但是其编码与本发明的抗CD48抗体或抗体片段基本生物等效的抗CD48抗体或抗体片段。上面讨论了这样的变体氨基酸和DNA序列的实例。
例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是药学等效物或在药学替代物(pharmaceutical alternative)(在相似实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时，它们的吸收速率和程度不具有显著差异)，那么认为它们是生物等效的。如果一些抗体在吸收程度上等效但是在吸收速率上不同，将认为它们是等效物或药物替代物，并且也可认为是生物等效的，因为吸收速率中这样的差异是有意的并且反应在标记上，而且在例如长期使用时对达到有效机体药物浓度不是必需的，并且认为对于所研究的特定药物是医学不显著的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和效力上没有临床上有意义的差异，那么它们就是生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者可以在参照产品与生物产品之间切换一次或更多次且与持续治疗而不切换相比没有预计的副作用风险增加(包括免疫原性的临床显著变化)或效力降低，那么认为这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件方面通过对共同的作用机理来起作用(在这样的机理是已知的程度内)，那么认为它们是生物等效的。
可通过体内和体外方法证明生物等效性。生物等效性的测量包括：例如(a)人或其他哺乳动物的体内测试，其中测量作为时间的函数的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)已经与人体内生物利用度数据相关联并且对其有合理的预测性的体外测定；(c)人或其他哺乳动物的体内测试，其中测量作为时间的函数的抗体(或其靶标)的适当急性药理效果；和(d)建立抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性的良好控制的临床实验。
可通过例如进行残基或序列的多种替换或缺失对于生物活性不必须的末端或内部残基或序列来构建本发明抗CD48抗体的生物等效变体。例如，缺失对生物活性不必须的半胱氨酸残基或替换成其他氨基酸，以防止通过复性形成不需要的或错误的分子内二硫键。在另一些情况下，生物等效抗体可包括抗CD48抗体的变体，其包含改变抗体的糖基化特性的氨基酸改变，例如消除或除去糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案，抗CD48抗体与人CD48结合但是不与其他物种的CD48结合。本发明还包括与人CD48以及一种或更多种非人物种的CD48结合的抗CD48抗体。例如，本发明的抗CD48抗体可与人CD48结合，并且可根据情况与以下一种或更多种物种的CD48结合或不结合：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、cynomologous(食蟹猴)、绒猴、猕猴或黑猩猩。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分(例如，细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素)缀合的抗CD48单克隆抗体(免疫缀合物)。细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。用于形成免疫缀合物的合适细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的(参见，例如WO 05/103081)。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位有特异性，或可包含特异性针对多于一种靶多肽的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等，1991，J.Immunol.147：60-69；Kufer等，2004，Trends Biotechnol.22：238-244。本发明的抗CD48抗体可与另一功能分子(如另一肽或蛋白质)连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一个或更多个其他分子实体(例如其他抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价连接等)以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括这样的双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对于人CD48或其片段是特异的，而免疫球蛋白的另一条臂对于第二治疗靶标是特异性的或与治疗部分(例如，胰蛋白酶抑制剂)缀合。
可在本发明的情况下使用的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与没有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸的差异降低双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域与蛋白质A结合，第二Ig CH3结构域包含降低或消除与蛋白质A的结合的突变，例如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；通过EU编号的H435R)。第二CH3还可包含Y96F修饰(通过IMGT，通过EU的Y436F)。可在第二CH3中存在的另一些修改包括：IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT；通过EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；通过EU的N384S、K392N和V422D；和IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT；通过EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422D。本发明的范围中涵盖了上述双特异性抗体形式的变体。
治疗制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗CD48抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的治疗组合物用改善转移、递送、耐受性等的合适载体、赋形剂和其他试剂配制。可在所有药剂师已知的处方中发现大量的合适制剂：Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA。这些制剂包括例如：粉剂、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡状物、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(emulsionscarbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等″Compendium of excipients for parenteralformulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
向患者施用的抗体的剂量可根据以下因素而不同：患者的年龄和体型、目标疾病、状况、施用途径等。通常根据体重或身体表面积计算优选的剂量。当使用本发明的抗体治疗成年患者中与CD48活性相关的病症或疾病时，可有利的是通常以约0.01至约20mg/kg体重，更优选约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的抗体。根据病症的严重程度，可调节治疗的频率和持续时间。可凭经验确定施用CD48抗体的有效剂量和时间安排；例如，可通过周期性评价来监测患者的进展情况，并且相应地调节剂量。另外，可使用本领域周知的方法(例如，Mordenti等，1991，Pharmaceut.Res.8：1351)进行剂量的物种间推定(interspecies scaling)。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞(参见，例如Wu等，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括但不限于：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可通过任何方便的途径施用组合物，例如，通过输注或团注，通过上皮或粘膜层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
可利用标准针和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，对于皮下递送，已容易地将笔型递送装置应用于递送本发明的药物组合物。这样的笔型递送装置可以是可重复利用或一次性的。可重复利用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物可替换药筒(cartridge)。一旦药筒中的全部药物组合物被施用而且药筒为空的，可容易地丢弃空药筒并且替换成含有药物组合物的新药筒。然后可重新利用笔型递送装置。在一次性笔型递送装置中，没有可替换药筒。一次性笔型递送装置预装填有容纳在装置内容器中的药物组合物。一旦容器内没有药物组合物，就丢弃整个装置。
多种可重复利用的笔型和自动注射递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTMI，II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM笔(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)等。用于本发明药物组合物的皮下递送的一次性笔型递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen，Thousand Oaks，CA)、PENLETTM(Haselmeier， Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.E)和HUMIRATM笔(Abbott Labs，AbbottPark IL)等。
在某些情况下，可在受控的释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一些实施方案中，可使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise编，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。在又一实施方案中，受控释放系统可放置在组合物的目标附近，从而仅需要一部分系统剂量(参见，例如Goodson，1984，in Medical Applications of Controlled Release，supra，第2卷，第115-138页)。在Langer，1990，Science 249：1527-1533的综述中讨论了另一些受控释放系统。
可注射制剂可包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可通过例如将上述抗体或其盐在通常用于注射的无菌水介质或油介质中溶解、悬浮或乳化来制备可注射制剂。对于用于注射的水介质，有例如生理盐水，包含葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液等，其可与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。对于油介质，使用例如芝麻油、豆油等，其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。如此制备的注射剂优选装填在合适的安瓿瓶中。
有利地，将用于上述口服或胃肠外使用的药物组合物制备成符合活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓶)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般为每单位剂量剂型约5至约500mg；尤其在注射的形式下，优选包含前述抗体约5至约100mg和约10至约250mg(对于其他剂型)。
抗体的治疗用途
本发明的抗体尤其可用于治疗、预防和/或改善与CD48活性相关或由其介导的或者可通过阻断CD48与CD48受体之间的相互作用来治疗的任何疾病或病症。可使用本发明的抗CD48抗体治疗的示例性疾病和病症包括例如：哮喘、过敏、特应性皮炎、结膜炎、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎)、乳糜泻(celiac disease)和癌症(例如，血细胞癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌等)。还可向患者施用本发明的抗CD48抗体以治疗银屑病。另一些可通过本发明的抗CD48抗体治疗的疾病和病症包括例如：系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GvHD)(例如，慢性GvHD和急性GvHD)和移植物排斥。
联合治疗
本发明包括这样的治疗性施用方案，其包括施用与至少一种另外的治疗活性组分组合的本发明抗CD48抗体。该另外的治疗活性组分的非限制性实例包括：另外的CD48拮抗剂(例如，第二抗CD48抗体或CD48的小分子抑制剂)、细胞因子抑制剂(例如，白介素1(IL-1)抑制剂(例如，列洛西普(rilonacept)或阿那白滞素(anakinra)、小分子IL-1拮抗剂或抗IL-1抗体)；IL-18抑制剂(例如，小分子IL-18拮抗剂或抗IL-18抗体)；IL-4抑制剂(例如，小分子IL-4拮抗剂、抗IL-4抗体或抗IL-4受体抗体)；IL-6抑制剂(例如，小分子IL-6拮抗剂、抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体)；阿司匹林；NSAID；类固醇(例如，强的松、氨甲蝶呤等)；低剂量环孢霉素A；肿瘤坏死因子(TNF)或TNF受体抑制剂(例如，小分子TNF或TNFR拮抗剂或抗TNF或TNFR抗体)；尿酸合成抑制剂(例如，别嘌呤醇)；尿酸排泄促进剂(例如，丙磺舒、磺吡酮(sulfinpyrazone)、苯溴马隆(benzbromarone)等)；其他炎症抑制剂(例如，胱天蛋白酶1、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig等的抑制剂)；和/或皮质类固醇。另外的治疗活性组分可以在施用本发明的抗CD48抗体之前、同时或之后施用(为了本公开的目的，这样的给药方案被认为是与本发明的治疗活性组分“联合”施用抗CD48抗体)。
抗体的诊断用途
本发明的抗CD48抗体还可用于检测和/或测量样品中的CD48，例如为了诊断目的。例如，抗CD48抗体或其片段可用于诊断特征为CD48的异常表达(例如，过表达、表达不足、不表达等)的病症或疾病。CD48的示例性诊断测定可包括例如：使获得自患者的样品与本发明的抗CD48抗体接触，其中抗CD48抗体标记有可检测标记或报告分子。或者，可将未标记的抗CD48抗体与本身被可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，例如荧光素、异硫氰酸酯或若丹明；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测量样品中的CD48的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可用于根据本发明的CD48诊断测定的样品包括可获得自患者的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下包含可检测量的CD48蛋白或其片段。一般而言，测量获得自健康患者(例如，未患有与异常CD48水平或活性相关疾病或病症的患者)的特定样品中的CD48水平以初始地建立CD48的基线或标准水平。然后可将CD48的基线水平与在获得自被怀疑患有CD48相关疾病或病症之个体的样品中测量的CD48水平进行比较。
实施例
提出以下实施例以向本领域一般技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并且不旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已经尽力确保所使用数值(例如，数量、温度等)的精确度，但是可能有一些实验误差和偏差。除非另外明确指出，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1人CD48的人抗体的产生
将包含人CD48的外部结构域(SEQ ID NO：384的氨基酸27-220)的免疫原与刺激免疫应答的佐剂一起直接施用给小鼠，所述
Figure BDA00003171669700252
小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA。通过CD48特异性免疫测定监测抗体的免疫应答。当实现期望的免疫应答时，收集脾细胞并且与小鼠骨肿瘤细胞融合以保存其生存力并且形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生CD48特异性抗体的细胞系。使用该技术得到多种抗CD48嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以这种方法产生的示例性抗体名称如下：H2M1707N、H2M1709N、H2M1710N、H2M1712N、H2M1713N、H2M1763N、H2M1811N、H3M1766N、H2M1798N和H2M1711N。
如在U.S.2007/0280945A1中的描述，也直接从抗原阳性B细胞中分离抗CD48抗体而不与骨髓瘤细胞融合。使用该方法得到若干全人抗CD48抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)；以这种方法产生的示例性抗体名称如下：H4H1769Na、H4H1769Pa、H4H1769Nb、H4H1769Pb、H4H1770N、H4H1770P、H4H1771N、H4H1771P、H4H1772N、H4H1772P、H4H1774N、H4H1774P、H4H1775N、H4H1775P、H4H1778N、H4H1778P、H4H1779N、H4H1779P、H4H1781N、H4H1781P、H4H1789Na、H4H1789Pa、H4H1789Nb、H4H1789Pb。
根据本实施例的方法产生的示例性抗CD48抗体的生物学特性详细描述在以下的实施例中给出。
实施例2重链和轻链可变区的氨基酸序列
表1给出了所选择的抗CD48抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标识。N、P和G名称是指具有相同的CDR序列但是在CDR序列之外的区域(即，在框架区内)中有序列改变的重链和轻链的抗体。因此，特定抗体的N、P和G变体在其重链和轻链可变区内具有相同的CDR序列，但其框架区彼此不同。本文使用的抗体名称上的前缀H2M、H3M、H4H等是指抗体的具体Fc区。例如，“H2M”抗体具有小鼠IgG2 Fc，而“H4H”抗体具有人IgG4 Fc。如本领域一般技术人员将理解的，H2M或H3M抗体可以转化成H4H抗体，反之亦然，但是可变结构域(包括CDR)保持不变。
表1
Figure BDA00003171669700261
实施例3通过表面等离子共振确定抗体与可溶性CD48的结合
在25℃和37℃两种温度下通过表面等离子共振确定人单克隆抗hCD48抗体与人和猴可溶性重组CD48(CD48的单体和二聚体构造)结合的结合亲和力和动力学常数。在T100-2 BIACORETM仪(Biacore LifeSciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)上进行测量。通过抗Fc芯片表面捕捉抗体(具有小鼠Fc[名称为“H2M”或“H3M”]或人IgG4Fc[名称为“H4H”]，并且使单体(表达有myc-myc-六组氨酸C末端标签[mmH])或二聚体(表达有C末端Fc融合[mFc])形式的CD48流过表面。在本实施例中使用的试剂的氨基酸序列标识在表2中给出。
表2
构建体 SEQ ID NO：
单体人CD48-mmH 385
单体猴CD48-mmH 386
二聚体人CD48-mFc 387
二聚体猴CD48-mFc 388
将可溶性CD48以不同浓度单独注射应用于流动细胞，并且通过使用Biacore软件拟合动力学结合数据来确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数计算结合分解平衡常数和解离半数时间(dissociation half-time)：KD＝kd/ka；t1/2＝(ln2/kd)(单位：ka＝M-1＊s-1；kd＝s-1；KD＝M；T1/2＝分钟)(表3-6)。
表3(25℃)
Figure BDA00003171669700271
Figure BDA00003171669700281
表4(37℃)
Figure BDA00003171669700291
表5(25℃)
Figure BDA00003171669700301
表6(37℃)
Figure BDA00003171669700302
Figure BDA00003171669700311
如表3-6所示，本实施例中测试的示例性抗体表现出与人和猴CD48可溶性蛋白质两者结合的高亲和力。与单价CD48相比，当使用二价CD48作为溶液相分析物时，观察到结合亲和力显著增加。
实施例4通过H/D交换对与CD48结合的H4H1789Pa进行表位作图
进行实验以确定与H4H1789Pa相互作用的CD48氨基酸残基。为了该目的，进行H/D交换表位作图。在例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry 267(2)：252-259；和Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A中给出了H/D交换方法的一般性描述。
为了通过H/D交换对与H4H1789Pa结合的CD48表位进行作图，使用重组人CD48-myc-myc-his融合构建体(″hCD48-mmH″；SEQ IDNO：391)。首先，使用PNGase F(New England BioLabs)使自然条件下的hCD48-mmH去糖基化。然后通过交联剂BS3(Thermo Scientific)使H4H1789Pa共价连接在抗人IgG琼脂糖珠(Sigma)上。
在“上-溶液/下-珠(on-solution/off-beads)”(在溶液中进行上-交换(on-exchange)，之后在珠上进行下-交换(off-exchange))实验中，将配体(去糖基化hCD48-mmH)在用D2O制备的PBS缓冲液中氘化5分钟或10分钟，然后在2分钟的孵育过程中与H4H1789Pa珠结合。将CD48结合的珠用PBS水性缓冲液(由H2O制备)洗涤并且孵育上-交换时间的一半。在下-交换后，使用冰冷的低pH TFA溶液将结合的CD48从珠上洗脱。然后将洗脱的CD48用固定化胃蛋白酶(Thermo Scientific)消化5分钟。使用色谱吸头分离所得肽并且立即通过UltrafleXtreme基质辅助激光吸附电离飞行时间(MALDI-TOF)-TOF质谱(MS)进行分析。
在“上-珠/下-珠(on-beads/off-beads)”(在珠上进行上-交换，之后在珠上进行下-交换)实验中，首先使CD48与H4H1789Pa珠结合，然后在D2O中孵育5分钟或10分钟进行上-交换。按照“上-溶液/下-珠”方法的描述进行接下来的步骤(下-交换、胃蛋白酶消化和MS分析)。计算全部检测到的肽的质心值并且对这两组实验进行比较。
结果归纳在表7a中，其提供了在H/D交换和胃蛋白酶消化处理之后通过液相色谱-基质辅助激光吸附电离(LC-MALDI)MS鉴定的全部检测肽的质心质荷比的定量比较。尽管上-溶液/下-珠和上-珠/下-珠这两个实验所观察的大部分胃酶解肽具有相似的质心质荷比，但是在“上-溶液/下-珠”实验中，对应于SEQ ID NO：384的残基60-76的三个不同胃酶解肽和对应于SEQ ID NO：384的残基107-125的七个肽具有一致的较高质心值(即较高的氘保留)。对于本实施例的目的，至少0.20的正差异(Δ)表明氨基酸受抗体结合的保护。这样的残基在表7a中用粗体和星号(＊)表示。
表7a H4H1789Pa与hCD48-mmH的结合
Figure BDA00003171669700331
归纳在表7a中的H/D交换结果表明，在上-交换以后通过H4H1789Pa与CD48的这些特定表位结合，保护这两个区域(对应于SEQ ID NO：384的氨基酸60-76和107-125)的质子不被下-交换。由于对应于残基69-76的肽未示出显著的质量差异，所以N端表位区域可减小为SEQ ID NO：384的残基60-68。因此，CD48上的两个区段(对应于SEQ ID NO：384的氨基酸60-76和107-125)通过H/D交换方法定义为用于使抗体H4H1789Pa与可溶性人CD48蛋白结合的非连续表位。抗体相互作用的这些区域位于CD48的Ig结构域1内并且用图示描述在图1中。
为了验证前述表位作图测定的正确性和精确度，使用具有前述定义表位的对照抗体进行另外的实验。具体地，使用上述CD48-mmH构建体(SEQ ID NO：391)和抗Myc抗体9E10进行H/D交换实验。Myc表位对应于SEQ ID NO：391的氨基酸195-216。
这些验证实验的全部实验程序与上述H4H1789Pa实验相同，不同之处在于使用抗Myc抗体9E10作为测试抗体。抗Myc验证实验的结果归纳在表7b中(应注意表7b第一列所示残基编号对应于hCD48-mmH构建体[SEQ ID NO：391]的实际氨基酸编号，而表7a第一列所示残基编号已经调整为对应于全长人CD48多肽[SEQ ID NO：384]的氨基酸编号)。同上，至少0.20的正差异(Δ)表示氨基酸受抗体结合的保护。这样的残基在表7b中用粗体和星号(＊)表示。
表7b：9E10与hCD48-mmH的结合
Figure BDA00003171669700341
如预期的，被9E10识别的表位被鉴定为在SEQ ID NO：391的氨基酸199-222定义的区域内。因此，归纳在表7b中的结果证实在本实施例中使用的H/D方法可用于正确地并且精确地鉴定多肽抗原上与抗体相互作用的氨基酸残基。
实施例5通过ELISA测量CD48-2B4相互作用的抗体阻断
使用竞争性夹心ELISA测量人抗CD48单克隆抗体阻断人CD48和猴CD48与人同源(cognate)配体人2B4的结合的能力(表8)。用不同量的抗体分别滴定恒定量的表达为融合有小鼠IgG2a Fc的生物素化二聚体人CD48蛋白(“bio-hCD48-mFc”[SEQ ID NO：387])或表达为具有由2个myc和1个6-His表位组成之标记的单体猴CD48(“mfCD48-mmH”[SEQ ID NO：386])。孵育这些抗体-蛋白质复合物(1小时，25℃)，之后转移到微量滴定板中，所述微量滴定板包被有表达融合了人IgG1的人2B4受体(h2B4-hFc[R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，Cat.No.1039-2B])或融合了小鼠IgG2a Fc的人2B4受体(h2B4-mFc[SEQ IDNO：389)的二聚体构建体。在25℃1小时后，冲洗孔并且用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素检测结合的人CD48，用缀合有抗myc多克隆抗体的HRP检测猴CD48。使用TMB溶液进行ELISA以产生比色反应并且用硫酸淬灭，之后在Victor X5读板器上在450nm阅读吸光度。使用PrismTM软件将S形剂量响应曲线拟合于数据。将计算的IC50值(定义为阻断50％ hCD48或mfCD48与2B4结合所需的抗体的浓度)用作阻断效力的指标(表8和9，NB＝未观察到结合)。
表8
表9
Figure BDA00003171669700352
Figure BDA00003171669700361
如表8和9所示，全部测试样品都有效阻断CD48与2B4之间的相互作用。
实施例6抗体阻断原代人PBMC中的IFN-γ释放
使用IFNγ释放测定测量本发明的人抗CD48单克隆抗体阻断原代人外周血单核细胞(PBMC)之活化的能力。通过在Ficoll-Hypaque梯度上的离心从多个供体的白细胞浓缩物(Leukopak，New York Blood Center，New York，NY)中分离人PBMC。将细胞重悬在补加有终浓度为1百万/ml的10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中并且在96孔微量滴定板上铺板(每孔200μl)。将细胞与不同量的CD48特异性抗体一起孵育(1小时，37℃)，之后添加预混合有蛋白质G(终浓度0.8mg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat#P4689)的激动剂抗CD3(B&D Pharmingen，San Jose，California，Cat#555336)和抗CD28(B&D Pharmingen，San Jose，California，Cat#555725)抗体(两者终浓度都为40ng/ml)。在37℃和5％CO2下48小时后，收集上清液并且使用ELISA试剂盒(B&D BIosciences，San Jose，California，Cat#555142)按照制造商的方案确定IFNγ浓度。使用PrismTM软件将S形剂量响应曲线拟合于数据。将计算的IC50值(定义为阻断50％的最大IFNγ释放所需的抗体的浓度)用作阻断效力的指标(表10至12，NB＝未观察到结合；ND＝未检测；NC＝数据不趋同)。
表10
Figure BDA00003171669700371
表11
表12
Figure BDA00003171669700381
如表10、11和12所示，大部分测试抗体都有效阻断原代人PBMC中IFNγ的释放。
实施例7原代人混合淋巴细胞反应(MLR)测定中IFNγ释放的抗体阻断
使用混合淋巴细胞反应测定测量人抗CD48单克隆抗体阻断原代人外周血单核细胞(PBMC)之活化的能力(表13和14)。通过在Ficoll-Hypaque梯度上离心从白细胞浓缩物(Leukopak，New York BloodCenter，New York，NY)或全血样品(通过内部血液采集方法获得)中分离人PBMC。将细胞重悬在以补加有终浓度为1百万/ml的10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。将新分离的细胞与来自不同供体的预照射细胞以10∶1的比率混合并且在96孔微量滴定板上铺板(每孔200μl)。在细胞铺板之后，立即添加终浓度0.01nM至10nM的抗体。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育7天。收集上清液并且使用ELISA试剂盒(B&DBIosciences、San Jose、California、Cat#555142)按照制造商的方案确定IFNγ的浓度。使用PrismTM软件将S形剂量响应曲线与数据拟合。IFNγ阻断水平定义为通过剂量响应数据拟合的曲线的最大值与最小值之间的差异，用最大值归一化(表13和14中的“％阻断”；“nb”＝未观察到结合；NC＝数据不趋同)。将计算的IC50值(定义为阻断50％的最大IFNγ释放所需的抗体的浓度)用作阻断效力的指标(表14)。
表13
Figure BDA00003171669700391
表14
Figure BDA00003171669700392
如表13和14所示，全部测试抗体都有效阻断原代人混合淋巴细胞反应(PBMC MLR)中IFNγ的释放。如实施例6和7所证明的，候选抗CD48抗体有效阻断原代人PBMC中IFNγ释放的能力表明这些抗体可用于阻断例如以下的疾病和病症中不适当的自身免疫反应：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、炎性肠病、过敏症、乳糜泻、银屑病、哮喘等。
实施例8用人造血干细胞重建的Rag2-/-γc -/-小鼠中人细胞因子释放的抗体阻断
使用以人造血干细胞重建的免疫缺陷Rag2-/-γc -/-小鼠组成的嵌合动物模型测量在体内人抗CD48单克隆抗体阻断人免疫细胞活化的能力。在动物出生不久，使用人干细胞进行重建，并且通过流式细胞术对重建进行验证。给全部重建动物(12至16周龄)腹膜内注射5mg/kg CD48特异性抗体或合适的同种型对照(自主生产的人IgG4(S108P)抗体)，24小时之后利用激动剂小鼠抗人CD3抗体(OKT3，1μg/动物，IP注射，BioLegend，SanDiego，California，Cat#317315)或同种型对照(自主生产的小鼠IgG2a抗体)进行处理。刺激后24小时采集血液样品并且使用MSD多重试剂盒(Human Proinflammatory 9-Plex Ultra-Sensitive Kit，MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，Maryland，Cat#K15007C-2)按照制造商的方案测量9种人细胞因子的血清水平。所测试的两种抗体都抑制人细胞因子的产生(表15和16)。
表15
Figure BDA00003171669700401
表16
Figure BDA00003171669700411
如表15和16所示，两种测试抗体都有效阻断嵌合体内系统(用人造血干细胞重建的Rag2-/-γc -/-小鼠)中通过人免疫细胞的多克隆刺激物诱导的细胞因子的释放。
实施例9：移植物抗宿主病(GvHD)的异种模型中重量减轻的抗体抑制和存活的延长
使用移植物抗宿主病(GvHD)的异种动物模型确定人抗CD48单克隆抗体H4H1789Pa阻断体内人免疫细胞之活化的能力，所述异种动物模型在植入有人外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷NOD/scid/-/-γc -/-(NSG)小鼠中建立。给8周龄的小鼠静脉内注射从健康正常志愿者新分离的PBMC(第0天)。根据PBMC注射后第3天外周血中人CD45细胞表面标志物阳性的细胞的百分比(通过流式细胞术检测)评估植入成功率。在用人PBMC诱导之前24小时，施用单次腹膜内剂量的H4H1789Pa(10mg/kg)完全抑制的人细胞的植入物(淋巴细胞门中＜10％细胞，相比之下用同种型对照处理的小鼠血液中为～99％)。
在100％的未处理动物中，在PBMC注射后第7-8天，观察到成功植入人细胞导致GvHD症状的发生(重量减轻、蜷缩的姿态、毛皮褶皱、虚弱等)。在第3天通过单次腹膜内剂量的H4H1789Pa(10mg/kg)处理小鼠，表现为重量减轻延迟(在第10天为统计学显著的)和生存延长的趋势(图2)。另外，使用MSD多重试剂盒(Human Proinflammatory 9-PlexUltra-Sensitive Kit，MesoScale Discovery，Gaithersburg，MD，Cat.No.K15007C-2)按照制造商的方案测量获自末端出血的血清中的人细胞因子水平(第13天或更早)。通过H4H1789Pa处理导致人IL-8(55.2±21.3pg/ml，相比于同种型对照组中的142.7±22.2pg/ml)、IL-10(85.4±2.6pg/mlvs171.8±44.2pg/ml)、IL-6(20.5±12.3pg/ml对比30.0±8.9pg/ml)和TNF(35.3±4.5pg/ml对比51.6±1.1pg/ml)的水平降低。未观察到人GM-CSF(554.9±131.8pg/ml对比348.9±20.7pg/ml)和IFNγ(4.8±0.9ng/ml对比5.0±0.5ng/ml)水平的降低。人IL-1β、IL-2和IL-12p70的水平低于检测限。
如图2所示，在GvHD的异种模型(植入有人PBMC的NSG小鼠)中，抗CD48抗体H4H1789Pa使得重量减轻延迟(p＜0.05，Dunnett多相比较测定)和存活延长。这些结果证实抗CD48疗法在治疗GvHD中的功效。
实施例10抗CD48抗体对于治疗乳糜泻的临床实验
乳糜泻是慢性HLA-DQ2或DQ8限制的CD4+T细胞介导的肠病，其由响应于源自小麦、大麦和黑麦之特定膳食去酰胺麸质肽的干扰素γ分泌造成，其对于这些特异性HLA II类分子具有高亲和力。
进行6周双盲安慰剂对照的机理证明研究，以评估抗CD48抗体在治疗口服麸质引起的生物活检证实的静止乳糜泻中的效力、安全性和耐受性。12名患者接受(3∶1随机)单次静脉内输注12mg/kg本发明的抗CD48抗体(例如，H4H1789Pa)或安慰剂。
本研究所包括患者已经接受无麸质饮食至少2年(日麸质摄入≤5mg)，未患麸质不耐症8周，具有阳性HLA-DQ2基因型，具有阴性的抗谷氨酰胺转移酶抗体(抗TGA)和阴性的响应麦角蛋白孵育的PBMC干扰素γELISpot。
在安慰剂对照治疗2周后，全部患者以摄入混合橘子汁或豆奶的面浆的形式每天接受16g麦麸剂量(相当于每天约4片面包)，持续3天。
以日症状日志的方式记录乳糜泻症状，从使用麦麸刺激两周之前开始，持续整个过程并且直到刺激后两周，记录恶心、腹胀、腹痛、昏睡、呕吐、腹泻或其他症状的出现及严重程度(在三点标度(three-point scale)上)。
随机化后两周和口服麦麸刺激后2周，从十二指肠的第二部分取小肠生物活检进行mRNA、组织学、免疫组织化学、绒毛高度/隐窝深度(Vh/Cd)的确定和上皮内淋巴细胞计数(IEL)。通过改进的Marsh分类对小肠黏膜的总体结构进行评价。正常黏膜(Marsh0)、具有上皮内淋巴细胞增多的低度炎症(Marsh I)、具有上皮内淋巴细胞增多和隐窝增生的低度炎症(Marsh II)以及建立乳糜泻诊断的具有上皮内淋巴细胞增多和隐窝增生和绒毛萎缩的金标准(Marsh III)。
口服麦麸刺激之前以及刺激1和2周后，从患者(全部HLA-DQ2或DQ8)中对周血取样并且将纯化的T淋巴细胞与去酰胺和对照麦胶蛋白肽(α-麦胶蛋白57-73阴性和Q65E变体)一起孵育。通过以下对这些对象的T细胞应答进行定量：测量对去酰胺和天然α-麦胶蛋白57-73肽的不同IFN-γELISpot应答，并且归一化为对泛HLA-DR流感肽血凝素肽HA307-319的IFN-γELISpot应答，其预期在麦麸刺激后不改变。
通过身体检查、临床实验检测和不良事件报告来评价安全性和耐受性。
主要终点(primary endpoint)(麦麸刺激后2周)是中值Vh/Cd指数的提高。次要终点(secondary endpoint)包括总体Marsh肠生物活检组织评分的提高，日腹部症状评分的降低和响应α-麦胶蛋白57-73肽刺激的PBMC干扰素γELISpot的降低。探索性终点(exploratory endpoint)包括组织和WB mRNA、外周T细胞表现型、组织中值IEL计数和通过ELISA测量的血清细胞因子的改变。
实施例11抗CD48抗体对于治疗系统性红斑狼疮(SLE)的临床实验
SLE是自身免疫疾病，其特征为多种免疫系统异常，包括对凋亡的内源核酸产生自身抗体，这可导致炎症和组织损伤。体液和细胞免疫系统都被激活。包含自身抗体的免疫复合物和慢性病毒感染刺激I型干扰素产生自身免疫的自维持循环，所述I型干扰素调节包括T细胞、B细胞、树突细胞和NK细胞的先天免疫系统和获得性免疫系统。
进行12周双盲安慰剂对照的机理验证研究以评价使用抗CD48抗体治疗稳定的轻度至中度至重度SLE的效力、安全性和耐受性。12名患者接受(4∶1随机)单次静脉内输注12mg/kg的本发明抗CD48抗体(例如，H4H1789Pa)或安慰剂。基于Safety of Estrogens and LupusErythematosus National Assessment(雌激素和红斑狼疮国家评价)(SELENA)-系统性红斑狼疮疾病活性指数(SLEDAI)、SLE Flare Index(SLE斑指数)和Physician’s Global Disease Assessment(PGA)(医生的整体疾病评价)对患者进行定期评价。生物标志物评价包括：(i)CD20+B细胞和CD138+浆细胞样细胞、CD40L+T细胞、抗-dsDNA、ANA、免疫球蛋白(IgG、IgM、IgE和IgA)以及补体成分C1q、C3、C4和C5a；(ii)通过ELISA的细胞因子的水平，包括干扰素α、干扰素γ、IL-10、IL-6、IL-15、IL-21和BLyS；(iii)通过FACS分析具有表面标志物的循环T、B、NK和调节性T细胞的总数；和(iv)全血中白细胞数量的变化(例如，白细胞减少的归一化)和所涉及皮肤mRNA基因调节的测量。实验室测量还包括系列PK和抗药抗体。
关键研究入选/排除标准包括：(i)18至70岁的成年人；(ii)筛选之前稳定SLE疾病活动至少两个月；和(iii)保持未用药物治疗或低剂量强的松、抗疟疾药、NSAID、硫唑嘌呤或霉酚酸酯的药物的稳定治疗。
本研究所选择患者将具有可测量的抗dsDNA、抗Smith、抗RNP或抗Sjogren′s抗体。排除具有急性狼疮肾炎需要血液透析、环磷酰胺或高剂量强的松的患者。排除在4周之内具有严重感染史的患者。
通过基线与抗CD48治疗4周之间抗dsDNA抗体的减少和补体C3和C4的增加来评价效力。改善的探索性终点包括SELENA-SLEDAI、PGA、和SLE斑指数。通过身体检查、临床测定检测和不良事件报告来评价安全性和耐受性。
实施例12抗CD48抗体对银屑病治疗的临床实验
银屑病的病理生理学涉及异常免疫介导的Th1和Th17淋巴细胞炎症应答，其导致分泌可活化和增殖角质形成细胞的细胞因子、趋化因子和生长因子。这些过程导致大量白细胞浸润和表皮增厚，其特征为银屑病斑块的标志性病理。
进行12周双盲安慰剂对照的概念验证研究以评价使用本发明的抗CD48抗体(例如，H4H1789Pa)治疗中度至重度银屑病的效力、安全性和耐受性。12名患者接受(4∶1随机)单次静脉内输注12mg/kg抗CD48抗体或安慰剂。通过银屑病面积和严重程度指数(PASI)记分、医生全面评价(PGA)记分、DLQ、影像、临床观察以及包括PK和抗药抗体的实验室测量对患者定期进行评价。
通过基线与抗CD48治疗8周之间PASI的改变来评价效力。主要终点是从基线到第8周PASI记分提高75％。次要终点包括从基线到第8周之间PASI、PGA和DLQ提高50％。通过身体检查、临床实验检测和不良事件报告来评价安全性和耐受性。
关键研究入选/排除标准包括：(i)18至70岁的成年人；(ii)持续至少6个月的慢性斑块状银屑病；(iii)BSA参与≥10％；(iv)PASI≥12；(v)系统性或光疗法的候选；(vi)当前未使用系统性治疗或在特定的清除期内使用；和/或(vii)之前未因为缺乏效力而停止对银屑病的生物治疗。
实施例13.抗CD48抗体对于治疗溃疡性结肠炎的临床实验
溃疡性结肠炎的病理生理学特征在于直接针对肠共生菌群的肠壁中高反应性CD4+T细胞获得性免疫应答。活化Th1和Th17淋巴细胞释放促炎性趋化因子和细胞因子，其造成中性粒细胞和单核细胞募集到肠。通过抗CD48共同刺激阻断具有预防微生物活化的APC与幼稚辅助T细胞相互作用(其增强和维持慢性粘膜炎症应答)的潜力。
进行12周双盲安慰剂对照的概念验证研究以评价使用抗CD48抗体治疗4周具有中度至重度溃疡性结肠炎症状的患者的效力、安全性和耐受性。70名患者在基线以单次静脉内输注接受(1∶1随机)本发明的抗CD48抗体(例如，H4H1789Pa)或安慰剂。本研究所包括的患者为18-70岁年龄，并且在筛选时已经诊断具有疾病活动指数记分(12点标度)6-10(包括端点)的溃疡性结肠炎。患者在筛选之前已经摄取氨基水杨酸药物至少1个月，在随机化之前具有稳定剂量至少2周。如果患者在进行研究之前摄取了任何其他针对溃疡性结肠炎的药物，那么在随机化之前使这些药物的剂量稳定至少1个月。对于摄取硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤的患者，仅将在筛选之前已经摄取这些药物至少3个月的患者包括在本研究内。
主要效力分析评价从基线开始至第4周的作为治疗组分配的函数的溃疡性结肠炎疾病活动指数记分的平均改变。在5％显著性水平每治疗组35名对象的样品大小(在第4周每组29名具有可评估数据)具有至少80％功效，以检测安慰机组和积极治疗组之间的差异，假设治疗组之间的平均差异至少3点，具有4以下的共同SD。
次级效力分析将评价从基线开始至第4周疾病活动指数记分降低3点及以上的患者的比例(应答者)。假设安慰剂响应率不超过60％，而积极组中的响应率比安慰剂组至少高40％(例如，安慰剂组30％应答者对比积极组≥70％应答者)，在5％显著性水平每组35名对象的样品大小(在第4周每组29名具有可评估数据)具有至少80％功效，以检测安慰剂组与积极治疗组之间的差异。
次级效力终点(大便次数改变、直肠出血、排便节制、内窥镜表现、研究者的整体评价、患者的整体评价)也作为基线至第4周的治疗组的函数进行比较。另外，获取肠组织生物活检以对白细胞侵润(T细胞、活化巨噬细胞)进行定量并且通过使用免疫组织化学表面标志物分析的细胞表型进行确认。
本发明不局限于本文所述具体实施方案的范围。实际上，通过前述描述以及附图，除本所描述的之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员将变得明显。这样的修改旨在包含在所附权利要求的范围内。
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Claims (18)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其与人CD48(SEQ ID NO：384)特异性结合并且阻断人CD48与CD48受体之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CD48受体是人CD2(SEQ ID NO：392)。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CD48受体是人2B4(SEQ ID NO：390)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在体外抑制原代人外周血单核细胞(PBMC)的活化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人CD48Ig结构域1(SEQ ID NO：384的29至127位氨基酸)中的表位结合。
6.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与位于SEQ ID NO：384之60至125位氨基酸中的一个或更多个氨基酸相互作用。
7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与位于SEQ ID NO：384之60至68位氨基酸和/或SEQ IDNO：384之107至125位氨基酸中的一个或更多个氨基酸相互作用。
8.根据权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与位于SEQ ID NO：384之60至68位氨基酸中的一个或更多个氨基酸和位于SEQ ID NO：384之107至125位氨基酸中的一个或更多个氨基酸相互作用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：368的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)和具有SEQ ID NO：370的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR。
10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：354、356、358、362、364和366的氨基酸序列的重链和轻链CDR。
11.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：368的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO：370的氨基酸序列的LCVR。
12.分离的抗体或其抗原结合片段，其与参照抗体竞争与包含人CD48Ig结构域1(SEQ ID NO：384的29至127位氨基酸)之多肽的结合，其中所述参照抗体是权利要求1至11中任一项所定义的抗体或抗原结合片段。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及可药用载体或稀释剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗患有、被诊断为患有或有风险患可通过阻断CD48与CD48受体之间的相互作用来治疗的疾病或病症的患者。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述可通过阻断CD48与CD48受体之间的相互作用来治疗的疾病或病症是选自以下的疾病或病症：乳糜泻、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎和银屑病。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段或根据权利要求13所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患有、被诊断为患有或有风险患可通过阻断CD48与CD48受体之间的相互作用来治疗的疾病或病症的患者。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述可通过阻断CD48与CD48受体之间的相互作用来治疗的疾病或病症是选自以下的疾病或病症：乳糜泻、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎和银屑病。
18.用于治疗乳糜泻、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎或银屑病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者权利要求13所述的药物组合物。
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