BR112015020470B1 - Anticorpo monoclonal humano isolado anti-il-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO ANTI-IL-33 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, SEUS USOS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece anticorpos que se ligam à interleucina-33 (IL-33) e métodos para usar os mesmos. A presente invenção inclui anticorpos que inibem ou atenuam a sinalização mediada por IL-33. Os anticorpos da invenção podem funcionar para bloquear a interação entre IL-33 e ST2. Alternativamente, certos anticorpos da invenção inibem ou atenuam a sinalização mediada por IL-33 sem bloquear a interação IL-33/ST2. De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos são anticorpos totalmente humanos que se ligam a IL-33 humana com alta afinidade. Os anticorpos da invenção são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios associados com sinalização IL-33 e/ou expressão celular de IL-33, como doenças inflamatórias, ou doenças alérgicas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são específicos para IL-33 humana, e métodos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES

[002] Interleucina-33 (IL-33) é um ligante para ST2, um membro da superfamília de receptor tipo toll/interleucina-1 que se associa a uma proteína acessória, IL-1RAcP (para revisões, ver, por exemplo, Kakkar and Lee, Nature Reviews - Drug Discovery 7(10):827-840 (2008), Schmitz et al., Immunity 23:479-490 (2005); Liew et al., Nature Reviews - Immunology 10:103-110 (2010); US 2010/0260770; US 2009/0041718). Após a ativação de ST2/IL-1RAcP por IL-33, uma cascata de sinalização é desencadeada através de moléculas a jusante como MyD88 (fator de diferenciação mieloide 88) e TRAF6 (fator 6 associado a receptores TNF), levando à ativação de NF-KB (fator nuclear-KB), entre outros. A sinalização de IL-33 está implicada como um fator em uma variedade de doenças e distúrbios. (Liew et al., Nature Reviews - Immunology 10:103-110 (2010)).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam à interleucina-33 humana ("IL-33"). Os anticorpos da invenção são úteis, nomeadamente, por inibição da sinalização mediada por IL-33 e para tratamento de doenças e distúrbios causados por ou relacionados com a atividade e/ou sinalização da IL-33.

[004] Os anticorpos da invenção podem ser inteiros (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem incluir somente uma porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv) e podem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

[005] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana são anticorpos monoclonais humanos totalmente isolados.

[006] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem ou atenuam sinalização mediada por IL- 33.

[007] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos bloqueiam a interação de IL-33 e ST2.

[008] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos bloqueiam a interação da IL-33 e ST2 com um valor de IC50 de menos de cerca de 10 nM, ou bloqueia mais de cerca de 50% da interação de IL-33 e ST2 como medido em um ensaio de ligação de receptor/ligante in vitro a 25°C.

[009] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos não bloqueiam, ou bloqueiam parcialmente a interação de IL-33 e ST2.

[0010] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos se ligam a IL-33 humana com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) de menos de cerca de 1 nM, conforme medido em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície a 37°C.

[0011] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos se ligam a IL-33 humana com uma meia-vida de dissociação (t7) de mais de cerca de 8 minutos, conforme medido em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície a 37°C.

[0012] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a degranulação mediada por IL-33 de basófilos humanos.

[0013] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a degranulação mediada por IL-33 de basófilos humanos com um IC50 de menos de cerca de 600 pM conforme medido em um teste de ativação de basófilo in vitro (BAT).

[0014] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a produção de INF-gama mediada por IL- 33 de PBMCs humanos.

[0015] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a produção de INF-gama mediada por IL- 33 de PBMCs humanos com um IC50 de menos de cerca de 25 nM conforme medido em um ensaio de produção de INF-gama de PBMC in vitro.

[0016] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a produção de INF-gama mediada por IL- 33 de PBMCs humanos com um IC50 de menos de cerca de 3 nM conforme medido em um ensaio de produção de INF-gama de PBMC in vitro.

[0017] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem a produção de INF-gama mediada por IL- 33 de PBMCs humanos com um IC50 de menos de cerca de 0,5 nM conforme medido em um ensaio de produção de INF-gama de PBMC in vitro.

[0018] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos reduzem a frequência de células T CD4+, eosinófilos e células ILC2 nos pulmões quando administrados em um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por alérgeno.

[0019] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos reduzem o nível de IL-4 e IL-5 nos pulmões quando administrados em um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por alérgeno.

[0020] Em uma modalidade, os anticorpos que se ligam especificamente à interleucina-33 humana, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, quando administrados em um modelo animal de inflamação pulmonar induzida por alérgeno, resultam em pelo menos uma redução de 4 vezes nos níveis de IL-4 e/ou pelo menos uma redução de 5 vezes nos níveis de IL-5 quando comparados aos animais desafiados com alérgeno recebendo um anticorpo controle de isotipo.

[0021] A presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290 e 308, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0022] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298 e 316, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0023] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo um par de sequências HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 e 308/316.

[0024] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio de cadeia pesada CDR3 (HCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 e 314, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de cadeia leve CDR3 (LCDR3), tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304 e 322 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0025] Em certas modalidades, o anticorpo ou parte de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende um par de sequências de aminoácidos HCDR3/LCDR3 selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304 e 314/322.

[0026] A presente invenção fornece também um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendo ainda um domínio de cadeia pesada CDR1 (HCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292 e 310, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de cadeia pesada CDR2 (HCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294 e 312 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de cadeia leve CDR1 (LCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300 e 318 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de cadeia leve CDR2 (LCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302 e 320 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0027] Determinados anticorpos não limitantes, exemplares e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção compreende domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 (por exemplo, H1M9559N); 20-22-24-28-30-32 (por exemplo, H1M9566N); 36-38-40-44-46-48 (por exemplo, H1M9568N); 52-54-56-60-62-64 (por exemplo, H4H9629P); 68-70-72-76-78-80 (por exemplo, H4H9633P); 84-86-88-92-94-96 (por exemplo, H4H9640P); 100-102-104-108-110-112 (por exemplo, H4H9659P); 116-118-120-124-126-128 (por exemplo, H4H9660P); 132134-136-140-142-144 (por exemplo, H4H9662P); 148-150-152-156 158-160 (por exemplo, H4H9663P); 164-166-168-172-174-176 (por exemplo, H4H9664P); 180-182-184-188-190-192 (por exemplo, H4H9665P); 196-198-200-204-206-208 (por exemplo, H4H9666P); 212214-216-220-222-224 (por exemplo, H4H9667P); 228-230-232-236238-240 (por exemplo, H4H9670P); 244-246-248-252-254-256 (por exemplo, H4H9671P); 260-262-264-268-270-272 (por exemplo, H4H9672P); 276-278-280-284-286-288 (por exemplo, H4H9675P); 292294-296-300-302-304 (por exemplo, H4H9676P); e 310-312-314-318320-322 (H1M9565N).

[0028] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a IL-33, em que o anticorpo ou fragmento compreende os domínios de CDR de cadeia pesada e leve contidos dentro das sequências da região variável da cadeia leve e pesada (HCVR/LCVR) selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298 e 308/316. Métodos e técnicas para a identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácidos HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usadas para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas aqui. Convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da sequência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de alça estruturais, e a definição de AbM é um compromisso entre as abordagens Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bases de dados públicas também estão disponíveis para a identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.

[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-IL-33 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Vetores de expressão recombinantes carregando os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras em que esses vetores foram introduzidos, também estão incluídos pela invenção, assim como métodos para produzir os anticorpos por cultivo de células hospedeiras em condições que permitam a produção de anticorpos, e recuperando os anticorpos produzidos.

[0030] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo um HCVR codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289 e 307, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia da mesma.

[0031] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo um LCVR codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297 e 315, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia da mesma.

[0032] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295 e 313, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia da mesma; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303 e 321, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia da mesma.

[0033] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento do mesmo que ainda compreende um domínio HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291 e 309, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia da mesma; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293 e 311, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299 e 317, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia; e um domínio LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301 e 319, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia da mesma.

[0034] De acordo com certas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende as sequências de CDR de cadeia pesada e leve codificada pelas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 1 e 9 (por exemplo, H1M9559N), 17 e 25 (por exemplo, H1M9566N), 33 e 41 (por exemplo, H1M9568N), 49 e 57 (por exemplo, H4H9629P), 65 e 73 (por exemplo, H4H9633P), 81 e 89 (por exemplo, H4H9640P), 97 e 105 (por exemplo, H4H9659P), 113 e 121 (por exemplo, H4H9660P), 129 e 137 (por exemplo, H4H9662P), 145 e 153 (por exemplo, H4H9663P), 161 e 169 (por exemplo, H4H9664P), 177 e 185 (por exemplo, H4H9665P), 193 e 201 (por exemplo, H4H9666P), 209 e 217 (por exemplo, H4H9667P), 225 e 233 (por exemplo, H4H9670P), 241 e 249 (por exemplo, H4H9671P), 257 e 265 (por exemplo, H4H9672P), 273 e 281 (por exemplo, H4H9675P), 289 e 297 (por exemplo, H4H9676P), ou 307 e 315 (H1M9565N).

[0035] A presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo desprovido de uma fração de fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0036] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo, que se liga especificamente a IL-33 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-IL-33 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-IL-33. Agentes exemplares que podem ser vantajosamente combinados com um anticorpo anti-IL-33 incluem, entre outros, outros agentes que inibem a atividade de IL-33 (incluindo outros anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, inibidores de peptídeo, antagonistas de pequenas moléculas, etc.) e/ou agentes, que não se ligam diretamente a IL-33, mas interferem, bloqueiam ou atenuam a sinalização mediada por IL-33. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em um anti-inflamatório não esteroide (NSAID), um corticosteroide, um dilatador brônquico, um anti- histamínico, epinefrina, um descongestionante, um antagonista de linfopoietina do estroma tímico (TSLP), um antagonista de IL-13, um antagonista de IL-4, um antagonista duplo de IL-4/IL-13, um antagonista de IL-5, um antagonista de IL-6, um antagonista de IL-12/23, um antagonista de IL-22, um antagonista de IL-25, um antagonista de IL-17, um antagonista de IL-31, um inibidor oral de PDE4 e outro antagonista de IL-33 ou um anticorpo diferente para IL-33.

[0037] Em certas modalidades, o antagonista de citocina pode ser um inibidor de pequena molécula (sintético ou derivado natural), ou uma proteína (por exemplo, um anticorpo) que interage com a própria citocina, ou a um receptor para a citocina, ou para um complexo compreendendo a citocina e seus receptores (por exemplo, um anticorpo para IL-4 ou IL-6, ou um anticorpo para o receptor para IL-4 ou IL-6). Terapias de combinação adicionais e coformulações envolvendo os anticorpos anti-IL-33 da presente invenção são divulgadas aqui em outro lugar.

[0038] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para inibir a atividade de IL-33 usando um anticorpo anti- IL-33 ou parte de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que é melhorada, amenizada, inibida ou prevenida pela remoção, inibição ou redução da atividade ou sinalização de IL-33. Os anticorpos anti-IL-33 ou fragmentos de anticorpos da invenção podem funcionar para bloquear a interação entre IL-33 e um parceiro de ligação de IL-33 (por exemplo, um componente do receptor de IL-33), ou inibir de outra forma a atividade de sinalização de IL-33.

[0039] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio inflamatório, ou pelo menos um sintoma associado com a doença ou distúrbio inflamatório, o método compreendendo administrar um anticorpo que se liga especificamente a IL-33, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a IL-33, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a um paciente em necessidade do mesmo, em que a doença ou distúrbio inflamatório é aliviado, ou reduzido em gravidade, duração ou frequência da ocorrência, ou pelo menos um sintoma associado com a doença ou distúrbio inflamatório é aliviado, ou reduzido em gravidade, duração, ou frequência de ocorrência.

[0040] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio inflamatório é selecionado do grupo que consiste em asma, dermatite atópica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, artrite, rinite alérgica, esofagite eosinofílica e psoríase.

[0041] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para tratar um paciente que demonstra uma sensibilidade a um alérgeno, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a IL-33, ou uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a IL-33, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a um paciente em necessidade do mesmo, em que o paciente demonstra uma sensibilidade reduzida para, ou uma reação alérgica diminuída contra o alérgeno, ou não experimenta qualquer sensibilidade ou alergia para, ou resposta anafilática para o alérgeno após a administração do anticorpo ou uma composição compreendendo o anticorpo.

[0042] Em uma modalidade, a invenção fornece para administrar uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico útil para aliviar a doença ou distúrbio inflamatório, ou pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio inflamatório, ou para diminuir uma resposta alérgica para um alérgeno. Como observado acima, o segundo agente terapêutico pode ser selecionado do grupo que consiste em um anti- inflamatório não esteroide (NSAID), um corticosteroide, um dilatador brônquico, um anti-histamínico, epinefrina, um descongestionante, um antagonista de linfopoietina do estroma tímico (TSLP), um antagonista de IL-13, um antagonista de IL-4, um antagonista de IL-5, um antagonista de IL-6, um antagonista de IL-25, um antagonista de IL-17, e outro antagonista de IL-33 ou um anticorpo diferente para IL-33.

[0043] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um anticorpo anti-IL-33 da invenção, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado a, ou causado por atividade de IL-33 em um paciente. Em uma modalidade, a doença ou distúrbio relacionado a, ou causado por atividade de IL-33 em um paciente é uma doença ou distúrbio inflamatório, em que a doença ou distúrbio inflamatório é selecionado do grupo que consiste em asma, dermatite atópica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, artrite, rinite alérgica, esofagite eosinofílica e psoríase.

[0044] A presente invenção também inclui o uso de um anticorpo anti-IL-33 ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado a, ou causado por atividade de IL-33 em um paciente. Em uma modalidade, a doença ou distúrbio relacionado a, ou causado por atividade de IL-33 em um paciente é uma doença ou distúrbio inflamatório, em que a doença ou distúrbio inflamatório é selecionado do grupo que consiste em asma, dermatite atópica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, artrite, rinite alérgica, esofagite eosinofílica e psoríase.

[0045] Outras modalidades se tornarão aparentes a partir uma revisão da descrição detalhada que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0046] Figura 1. Competição Cruzada entre Anticorpos Anti-IL-33 para IL-33 Humana

[0047] Figura 2. Competição Cruzada entre Anticorpos Anti-IL-33 para IL-33 de Macaco Recombinante

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0048] Antes de a presente invenção ser mais descrita, deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos métodos particulares e condições experimentais descritas, uma vez que esses métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas, e não pretende limitar, já que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0049] Salvo se determinado de maneira diferente, todos os termos científicos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um dos especialistas na técnica a que pertence esta invenção. Como usado aqui, o termo "cerca de," quando usado em referência a um valor numérico recitado particular, significa que o valor pode variar do valor recitado em não mais que 1%. Por exemplo, como usado aqui, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0050] Embora todos os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e os materiais preferenciais são agora descritos.

Definições

[0051] As expressões "interleucina-33," "IL-33" e afins, como usadas aqui, referem-se a uma proteína IL-33 humana tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:307. Todas as referências para proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteína aqui se destinam a referir-se à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína salvo se explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana (por exemplo, "IL-33 de camundongo," "IL- 33 de macaco," etc.).

[0052] Como usado aqui, "um anticorpo que se liga a IL-33" ou um "anticorpo anti-IL-33" inclui anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se liga a um fragmento solúvel de uma proteína IL-33. Moléculas solúveis de IL-33 incluem proteínas IL-33 naturais, bem como variantes de proteína IL-33 recombinantes, como, por exemplo, constructos monoméricos e diméricos de IL-33.

[0053] O termo "anticorpo", como usado aqui, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade que se liga especificamente ou interage com um antígeno particular (por exemplo, IL-33). O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas de regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, organizados da região amino-terminal para carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, os FRs do anticorpo anti-IL-33 (ou parte de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser idênticos às sequências de linhagem germinativa do genoma, ou pode ser modificada natural ou artificialmente. Uma sequência de consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de dois ou mais CDRs.

[0054] O termo "anticorpo", como usado aqui, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo completo. Os termos "parte de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e afins, conforme usado aqui, incluem quaisquer polipeptídeos ou glicoproteínas de ocorrência natural, enzimaticamente obteníveis, sintéticas ou geneticamente modificadas que se ligam especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completo usando qualquer técnica padrão adequada como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia de recombinação genética que envolve a manipulação e a expressão de DNA que codifica anticorpo variável e opcionalmente domínios constantes. Esse DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de anticorpo de fago) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pelo uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína de, modificar, adicionar ou deletar os aminoácidos, etc.

[0055] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consiste em resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas projetadas, como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio deletado anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados de CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofármacos modulares pequenos (SMIPs), e domínios variáveis de tubarão IgNAR, também estão incluídos dentro da expressão "fragmento de ligação ao antígeno", como usado aqui.

[0056] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo normalmente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e incluirá geralmente pelo menos um CDR que é adjacente a ou em quadro com uma ou mais sequências de estrutura. Nos fragmentos de ligação ao antígeno tendo um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.

[0057] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações não limitantes, exemplares de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL- CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados uns aos outros, ou podem ser ligados por uma região de dobradiça ou ligante total ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios adjacentes variáveis e/ou constantes em uma molécula de polipeptídeo única. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) em qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínio VH ou VL monomérico (por exemplo, por ligações dissulfeto).

[0058] Como com moléculas de anticorpo completas, fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo normalmente compreenderá pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de ligar especificamente para um antígeno separado ou um epítopo diferente sobre o mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplares divulgados aqui, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis.

[0059] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar através de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). "Citotoxicidade dependente de complemento" (CDC) se refere à lise das células que expressam antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento. "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas inespecíficas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpos ligados em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. CDC e ADCC podem ser medidos usando ensaios que são conhecidos e disponíveis na técnica. (Ver, por exemplo, Patente US 5.500.362 e 5.821.337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652656). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo fixar o complemento e mediar a citotoxicidade dependente de célula. Assim, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base na necessidade de o anticorpo mediar a citotoxicidade.

[0060] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-IL- 33 da invenção são anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, destina-se a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos fornecidos aqui podem incluir os resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagêneses aleatórias ou sítio específicas in vitro ou por mutações somáticas in vivo), por exemplo, nos CDRs e, em particular, no CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, não pretende incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana.

[0061] Os anticorpos da invenção podem ser, em algumas modalidades, anticorpos humanos recombinantes. O termo "anticorpo humano recombinante", conforme usado aqui, destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio de recombinação, como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (mais descrito abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória (mais descrito abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve o processamento de sequências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas e relacionadas às sequências de linhagem germinativa humana VH e VL, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa humana in vivo.

[0062] Anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade da dobradiça. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um constructo de quatro cadeias estável de aproximadamente 150-160 kDa em que os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada intercadeias. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados através de ligações dissulfeto intercadeia e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composto por uma cadeia leve e pesada covalentemente acoplada (meio anticorpo). Estas formas foram extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação de afinidade.

[0063] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isotipos de IgG intactos é devido a, mas não limitada a diferenças estruturais associadas com o isotipo da região de dobradiça do anticorpo. Uma única substituição de aminoácido na região de dobradiça da dobradiça de IgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) aos níveis normalmente observados usando uma dobradiça de IgG1 humana. A presente invenção inclui anticorpos tendo uma ou mais mutações na dobradiça, região CH2 ou CH3 que pode ser desejável, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[0064] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um "anticorpo isolado", como usado aqui, significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula em que o anticorpo naturalmente existe ou é produzido naturalmente, é um "anticorpo isolado" para fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

[0065] A presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33neutralizantes e/ou de bloqueio. Um anticorpo "neutralizante" ou "de bloqueio", como usado aqui, se destina a se referir a um anticorpo cuja ligação para IL-33: (i) interfere com a interação entre IL-33 ou um fragmento de IL-33 e um componente de receptor de IL-33 (por exemplo, ST2, IL-1RAcP, etc.); e/ou (ii) resulta em inibição de pelo menos uma função biológica de IL-33. A inibição causada por um anticorpo neutralizante ou de bloqueio de IL-33 não precisa ser completo, desde que seja detectável usando um ensaio apropriado. Ensaios exemplares para detectar a inibição de IL-33 são descritos nos Exemplos de trabalho aqui.

[0066] Os anticorpos anti-IL-33 divulgados aqui podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve, em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes das quais os anticorpos são derivados. Essas mutações podem ser facilmente verificadas comparando as sequências de aminoácidos divulgadas aqui com sequências de linhagem germinativa disponíveis de, por exemplo, bancos de dados de sequência de anticorpo públicos. A presente invenção inclui anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de quaisquer sequências de aminoácidos divulgadas aqui, em que um ou mais aminoácidos dentro de um ou mais estrutura e/ou regiões de CDR são uma mutação para o resíduo correspondente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi derivado, ou para os resíduos correspondentes de outra sequência de linhagem germinativa humana, ou para uma substituição de aminoácido conservadora do resíduo de linhagem germinativa correspondente (essas mudanças de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Um especialista na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia pesada e leve divulgadas aqui, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linhagem germinativas individuais ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, toda a estrutura e/ou resíduos de CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência de linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, somente determinados resíduos são mutados de volta para a sequência de linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutantes encontrados dentro de CDR1, CDR2 e CDR3. Em outras modalidades, um ou mais das estruturas e/ou resíduos de CDR são mutados para os resíduos correspondentes de uma sequência de linhagem germinativa diferente (ou seja, uma sequência de linhagem germinativa diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões de CDR, por exemplo, em que determinados resíduos individuais são mutados ao resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa particular enquanto determinados outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados para um ou mais propriedade desejadas, como, especificidade de ligação melhorada, propriedades biológicas agonistas ou antagonistas melhoradas ou potencializadas (como o caso pode ser), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos dessa maneira geral são incluídos dentro da presente invenção.

[0067] A presente invenção também inclui anticorpos anti-IL-33 compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR divulgadas aqui tendo uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 tendo sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservadoras em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas aqui.

[0068] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia de polipeptídeos. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir frações de sacarídeos, grupos fosforil, ou grupos sulfonil no antígeno.

[0069] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), existe identidade de sequência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 95%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% da base de nucleotídeo, como medido por qualquer conhecido algoritmo de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico tendo identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos igual ou substancialmente semelhante ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0070] Como aplicado para polipeptídeos, o termo "semelhança substancial" ou "substancialmente semelhante" significa que duas sequências de peptídeo, quando idealmente alinhadas, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservadoras. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é um em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não irá mudar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. No caso em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservadoras, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de semelhança pode ser ajustada para cima para corrigir para a natureza conservadora da substituição. Meios para preparar este ajuste são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais alifática-hidroxila: Serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos preferenciais conservadores são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, um substituto conservador é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 14431445. Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.

[0071] Semelhança de sequência de polipeptídeos, que é também referida como identidade de sequência, é normalmente medida usando software de análise de sequência. Software de análise de proteína combina sequências semelhantes usando medidas de semelhanças atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, o software GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos estreitamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Ver, por exemplo, GCG Version 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pearson (2000), supra). Outro algoritmo preferencial quando se compara uma sequência da invenção a um banco de dados que contém um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

[0072] Uma "doença ou distúrbio inflamatório", como usado aqui, refere-se a uma doença, distúrbio ou condição patológica, onde a patologia resulta, no todo ou em parte, de, por exemplo, uma mudança no número, mudança na taxa de migração, ou mudança na ativação de células do sistema imune. Células do sistema imune incluem, por exemplo, células T, células B, monócitos ou macrófagos, células apresentadoras de antígenos (APCs), células dendríticas, micróglia, células NK, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos ou qualquer outra célula especificamente associada com a imunologia, por exemplo, células endoteliais ou epiteliais produtoras de citocina. Como usado aqui, em uma modalidade, a "doença ou distúrbio inflamatório" é um distúrbio imune ou condição selecionada do grupo que consiste em asma, (incluindo asma resistente a esteroide, asma sensível a esteroide, asma eosinofílica ou asma não eosinofílica, alergia, anafilaxia, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerosa), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD, que pode ou não pode estar relacionado com, ser causada em parte por, ou resultante de, exposição à fumaça de cigarro de primeira ou segunda mão), lúpus, dermatite atópica, psoríase, esclerodermia e outras doenças fibróticas, síndrome de sjogren, vasculite (doença de Behçet, arterite de células gigantes, púrpura de Henoch-Schonlein e síndrome de Churg Strauss) e artrite. Em outra modalidade, a artrite é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, osteoartrite e artrite psoriática. Em outra modalidade, a "doença ou distúrbio inflamatório" é um distúrbio ou condição imune que compreende uma resposta tipo TH1 ou uma resposta tipo TH2.

[0073] A frase "inibe ou atenua a sinalização mediada por IL-33", como usado aqui, refere-se ao grau em que IL-33 estimula a transdução de sinal através de ST2 e IL-1RAcP, que é diminuída na presença de um antagonista, como um anticorpo IL-33 conforme descrito aqui, em relação ao grau em que IL-33 estimula a transdução de sinal através de ST2 e IL-1RAcP na ausência do antagonista como um anticorpo IL-33 como aqui descrito. Para examinar a extensão da inibição, uma amostra é tratada com um inibidor/antagonista potencial e é comparada a uma amostra de controle sem o inibidor/antagonista. Amostras de controle, ou seja, não tratadas com antagonista, recebem um valor de atividade relativa de 100%. A inibição é alcançada quando o valor da atividade em relação ao controle é cerca de 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% ou 20% ou menos. Um ponto de extremidade na inibição pode compreender uma quantidade ou porcentagem pré-determinada de, por exemplo, um indicador de inflamação, ou degranulação, secreção ou ativação celular como a liberação de uma citocina. A inibição da transdução de sinal de IL-33 através de ST2 e IL-1RAcP pode ser determinada por análise por transdução de sinal de IL-33 em um ensaio in vitro, como o aqui descrito no Exemplo 6. Além disso, os ensaios in vivo podem ser usados para determinar se uma molécula é um antagonista de IL-33. Por exemplo, um ensaio in vivo como descrito nos Exemplos 11 e 12 pode ser utilizado para avaliar o efeito de um anticorpo para IL-33 na inflamação pulmonar em animais sensibilizados com alérgenos que são homozigotos para expressão de IL-33 humana. Após a sensibilização dos animais com o alérgeno, um subconjunto dos animais é tratado com um anticorpo anti- IL-33 da invenção ou um anticorpo controle de isotipo negativo. Depois, os animais são sacrificados e os pulmões são colhidos para avaliação de infiltração celular, bem como medições de citocinas (IL-4 e IL-5). Um anticorpo IL-33 que é eficaz como um antagonista deve demonstrar uma tendência para a redução de células inflamatórias no pulmão, bem como uma tendência para a redução de citocinas como IL-4 e IL-5.

Características Biológicas dos Anticorpos

[0074] A presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a IL-33 humana e inibe ou atenua a sinalização mediada por IL-33. Um anticorpo anti-IL- 33 é considerado para "inibir ou atenuar a sinalização mediada por IL- 33" se, por exemplo, o anticorpo apresenta uma ou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em: (1) inibição da sinalização mediada por IL-33 em um bioensaio baseado em célula; (2) inibição da degranulação induzida por IL-33 de basófilos humanos; (3) inibição da produção de IFNY induzida por IL-33 de PBMC humano; (4) redução dos níveis de citocinas que são elevados em um mamífero como resultado de exposição ao alérgeno, por exemplo, IL-4 ou IL-5; e (5) inibição da inflamação pulmonar resultante da exposição aguda ou crônica de um alérgeno (por exemplo, ácaros de poeira de casa (HDM).

[0075] Inibição da sinalização mediada por IL-33 em um bioensaio baseado em célula significa que um anticorpo anti-IL-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz o sinal produzido nas células que expressam um receptor IL-33 e um elemento de repórter que produz um sinal detectável em resposta à ligação de IL-33, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 6 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que bloqueiam a sinalização mediada por IL-33 nas células que expressam ST2 humana, com um IC50 de menos de cerca de 2 nM, menos de cerca de 1 nM, menos de cerca de 900 pM, menos de cerca de 800 pM, menos de cerca de 700 pM, menos de cerca de 600 pM, menos de cerca de 500 pM, menos de cerca de 400 pM, menos de cerca de 350 pM, menos de cerca de 300 pM, menos de cerca de 250 pM, menos de cerca de 200 pM, menos de cerca de 150 pM, menos de cerca de 100 pM, menos de cerca de 90 pM, menos de cerca de 80 pM, menos de cerca de 70 pM, menos de 60 pM, menos de 50 pM, menos de cerca de 40 pM , menos de cerca de 30 pM, menos de cerca de 20 pM ou menos de cerca de 10 pM, como medido em um bioensaio de bloqueio baseado em célula, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 5 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0076] A inibição da degranulação induzida por IL-33 de basófilos humanos significa que um anticorpo anti-IL-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a extensão da degranulação de basófilos induzida por IL 33 in vitro, por exemplo, como medido usando o sistema de ensaio do Exemplo 7 ou um ensaio substancialmente semelhante. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que inibem a degranulação de basófilos humanos na presença de IL-33 humana (por exemplo, cerca de concentração final de 100 pM), com um IC50 de menos de cerca de menos de cerca de 500 pM, menos de cerca de 400 pM, menos de cerca de 350 pM, menos de cerca de 300 pM, menos de cerca de 250 pM, menos de cerca de 200 pM, menos de cerca de 150 pM, menos de cerca de 100 pM, menos de cerca de 90 pM, menos de cerca de 80 pM, menos de cerca de 70 pM, menos de 60 pM, menos de 50 pM, menos de cerca de 40 pM , menos de cerca de 30 pM, menos de cerca de 20 pM ou menos de cerca de 10 pM, como medido em um ensaio de degranulação de basófilo humano in vitro, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 7 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0077] Inibição da produção de IFNY induzida por IL-33 de PBMCs humana significa que um anticorpo anti-IL-33 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou reduz a quantidade IFNY liberado de PBMCs tratados com IL-33 humano na presença de IL-12 humana, por exemplo, como medido usando o sistema de ensaio de Exemplo 8 ou um ensaio substancialmente semelhante. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que inibem a liberação de IFNy induzida por IL-33, na presença de IL-12 humana, com um IC50 de menos de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 20 nM, menos de cerca de 15 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM , menos de cerca de 1 nM, menos de cerca de 900 pM, menos de cerca de 800 pM, menos de cerca de 700 pM, menos de cerca de 600 pM, menos de cerca de 500 pM, menos de cerca de 400 pM ou menos de cerca de 300 pM, como medido em um ensaio de liberação de IFNY induzida por IL-33, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0078] Em certas modalidades, os anticorpos anti-IL-33 e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção bloqueiam a ligação de IL-33 a um receptor de IL-33 (por exemplo, ST2). Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 que bloqueiam a ligação de IL-33 a ST2 in vitro, com um valor de IC50 de menos de cerca de 15 nM, conforme medido por um imunoensaio baseado em ELISA, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 4 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção bloqueiam a ligação de IL-33 a ST2 in vitro com um valor de IC50 de menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 900 pM, menos de cerca de 800 pM, menos de cerca de 700 pM, menos de cerca de 600 pM, menos de cerca de 500 pM , menos de cerca de 400 pM, menos de cerca de 300 pM, menos de cerca de 280 pM, menos de cerca de 260 pM, menos de cerca de 250 pM, menos de cerca de 240 horas, menos de cerca de 230 pM, menos de cerca de 220 pM, menos de cerca de 200 pM, menos de cerca de 180 pM, menos de cerca de 160 pM, ou menos de cerca de 150 pM , como medido por um imunoensaio baseado em ELISA, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 4 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0079] Em outras modalidades, no entanto, certos anticorpos anti- IL-33 e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção, apesar de terem a capacidade de inibir ou atenuar a sinalização mediada por IL-33, não bloqueiam ou bloqueiam apenas parcialmente a interação de IL-33 e ST2. Esses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser referidos como "bloqueadores indiretos". Sem estar vinculado pela teoria, acredita-se que os bloqueadores indiretos da invenção funcionam por ligação a IL-33 em um epítopo que se sobrepõe, ou se sobrepõe apenas parcialmente, com o domínio de ligação de ST2 da IL-33, mas interfere com a sinalização mediada por IL-33 sem bloquear a interação IL-33/ST2 diretamente.

[0080] A presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a moléculas solúveis de IL-33 com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam a IL-33 (por exemplo, a 25°C ou 37°C) com um KD de menos de cerca de 10 nM, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui. Em certa modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção se ligam a IL-33 com um KD de menos de cerca de 5 nM, menos de cerca de 2 nM, menos de cerca de 1 nM, menos de cerca de 800 pM, menos de cerca de 600 pM, menos de cerca de 500 pM, menos de cerca de 400 pM, menos de cerca de 300 pM , menos de cerca de 200 pM, menos de cerca de 180 pM, ou menos de cerca de 160 pM, como medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0081] A presente invenção também inclui anticorpos anti-IL-33 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a IL-33 com uma meia-vida dissociativa (t ^) de mais de cerca de 10 minutos, como medido por ressonância de plasmon de superfície a 25°C ou 37°C, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção se liga a IL-33 com um t^ maior que cerca de 20 minutos, maior que cerca de 30 minutos, maior que cerca de 40 minutos, maior que cerca de 50 minutos, maior que cerca de 60 minutos, maior que cerca de 70 minutos, maior que cerca de 80 minutos, maior que cerca de 90 minutos, maior que cerca de 100 minutos, como medido por ressonância de plasmon de superfície a 25°C ou 37°C, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.

[0082] Os anticorpos da presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas acima mencionadas, ou qualquer combinação das mesmas. Outras características biológicas dos anticorpos da presente invenção serão evidentes para um especialista na técnica a partir de uma revisão da presente divulgação incluindo os Exemplos de trabalho aqui.

Anticorpos Anti-IL-33 Compreendendo Variantes Fc

[0083] De acordo com certas modalidades da presente invenção, anticorpos anti-IL-33 são fornecidos compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que potencializam ou diminuem a ligação de anticorpo para o receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 compreendendo uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que as mutações aumentam a afinidade do domínio do Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossomo onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mutações podem resultar em um aumento na meia-vida no soro do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitantes dessas modificações de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428/433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) ou 434 (H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação em 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação em 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação em 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação em 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação em 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação em 307 ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Ainda em outra modalidade, a modificação compreende uma modificação em 265A (por exemplo, D265A) e/ou uma modificação em 297A (por exemplo, D297A).

[0084] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-IL- 33 compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionados do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações de domínio Fc acima mencionadas, e outras mutações dentro dos domínios variáveis de anticorpo divulgadas aqui, são contempladas no escopo da presente invenção.

[0085] A presente invenção também inclui anticorpos anti-IL-33 compreendendo uma região constante de cadeia pesada quimérica (CH), em que região CH quimérica compreende segmentos derivados das regiões CH de mais de um isotipo de imunoglobulina. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem compreender uma região CH quimérica compreendendo a parte ou a totalidade de um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com parte ou a totalidade de um domínio CH3 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com certas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região CH quimérica tendo uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos de "dobradiça superior" (resíduos de aminoácidos das posições 216 a 227 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior" (resíduos de aminoácidos das posições 228 a 236 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com certas modalidades, a região de dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça superior de IgG1 humana ou IgG4 humana e resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça inferior de IgG2 humana. Um anticorpo compreendendo uma região CH quimérica como aqui descrito pode, em certas modalidades, apresentar funções efetoras de Fc modificadas sem afetar negativamente as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas do anticorpo. (Ver, por exemplo, Ped. Provisório US 61/759,578, depositado em 1 de fevereiro de 2013).

Mapeamento de Epítopo e Tecnologias Relacionadas

[0086] A presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 que interagem com um ou mais aminoácidos da IL-33. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-IL-33 que interagem com um ou mais aminoácidos localizados dentro do domínio de interação de ST2 da IL-33. O epítopo para o qual os anticorpos se ligam pode consistir em uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos da IL-33. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) da IL- 33.

[0087] Várias técnicas conhecidas pelos especialistas podem ser usadas para determinar se um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina como o descrito em Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análise mutacional de varredura de alanina, análise de blots de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) e análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com os quais um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve marcação de deutério da proteína de interesse, seguido por ligação do anticorpo para a proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para a água para permitir que a troca de hidrogênio-deutério ocorra em todos os resíduos, exceto os resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem de protease e análise de espectrometria de massa, revelando assim os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.

[0088] A presente invenção ainda inclui anticorpos anti-IL-33 que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui (por exemplo, H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N, H4H9629P, H4H9633P, H4H9640P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P, H4H9676P, H1M9565N, etc.). Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticorpos anti-IL-33 que competem para ligação para IL-33 com qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui (por exemplo, H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N, H4H9629P, H4H9633P, H4H9640P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P, H4H9676P, H1M9565N, etc.).

[0089] É possível determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como, ou compete para ligação com um anticorpo anti- IL-33 de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica e exemplificados aqui. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-IL-33 de referência da invenção, o anticorpo de referência é permitido para ligar a uma proteína IL-33. Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste para se ligar à molécula de IL-33 é avaliada. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar a IL-33 após ligação de saturação com o anticorpo anti-IL-33 de referência, pode-se concluir que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do que o anticorpo anti-IL-33 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar à molécula de IL-33 após a ligação de saturação com o anticorpo anti-IL-33 de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo do epítopo ligado pelo anticorpo anti-IL-33 de referência da invenção. Experimentação de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação e ligação de peptídeo) pode então se realizada para confirmar se a observada falta de ligação do anticorpo de teste é, na verdade, devido à ligação para o mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experiências deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica. Em conformidade com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam para o mesmo (ou sobrepondo) epítopo se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferencialmente 75%, 90% ou mesmo 99% como medido em um ensaio de ligação competitivo (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados para se ligar ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos do antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos são considerados como tendo "epítopos de sobreposição" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduz ou elimina a ligação de um anticorpo reduz ou elimina a ligação do outro.

[0090] Para determinar se um anticorpo compete para ligação (ou compete de forma cruzada para ligação) com um anticorpo anti-IL-33 de referência, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é permitido para se ligar a uma proteína IL-33 sob condições de saturação seguidas de avaliação de ligação do anticorpo de teste para a molécula de IL-33. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é permitido para se ligar a uma molécula de IL-33 sob condições de saturação seguidas de avaliação de ligação do anticorpo de referência para a molécula de IL-33. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (saturação) é capaz de se ligar à molécula de IL-33, então, conclui-se que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem para a ligação com IL-33. Como será apreciado por um especialista na técnica, um anticorpo que compete para a ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epítopo do anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência se ligando a um epítopo sobreposto ou adjacente. Preparação de Anticorpos Humanos

[0091] Métodos para gerar anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais totalmente humanos, são conhecidos na técnica. Qualquer um desses métodos conhecidos pode ser usado no contexto da presente invenção para preparar anticorpos humanos que se ligam especificamente a IL-33 humana.

[0092] Usando tecnologia VELOCIMMUNE™, por exemplo, ou qualquer outro método conhecido por gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos, anticorpos quiméricos de alta afinidade para IL-33 são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionadas para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. Se necessário, regiões constante de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada, por exemplo, IgG1 ou IgG4 modificada ou de tipo selvagem, para gerar um anticorpo anti-IL-33 completamente humano. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, a ligação ao antígeno de alta afinidade e as características de especificidade do alvo residem na região variável. Em certos casos, anticorpos anti-IL-33 totalmente humanos são isolados diretamente a partir de células B positivas para antígeno.

Bioequivalentes

[0093] Os anticorpos anti-IL-33 e fragmentos de anticorpos da presente invenção incluem proteínas tendo sequências de aminoácidos que variam daqueles dos anticorpos descritos, mas que mantêm a capacidade de se ligar a IL-33 humana. Esses anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparado à sequência parente, mas apresentam atividade biológica que é essencialmente equivalente a dos anticorpos descritos. Da mesma forma, as sequências de DNA que codificam anticorpo anti-IL-33 da presente invenção incluem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência divulgada, mas que codificam um anticorpo anti-IL-33 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-IL-33 ou fragmento de anticorpo da invenção. Exemplos dessas sequências de DNA e aminoácidos variantes são discutidos acima.

[0094] Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são considerados bioequivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão da absorção não mostram uma diferença significativa quando administrado na mesma dose molar sob condições experimentais semelhantes, em dose única ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se são equivalentes na extensão da sua absorção, mas não em sua taxa de absorção, e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque essas diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para a realização das concentrações de droga eficaz do corpo no, por exemplo, uso crônico, e são consideraram clinicamente insignificante para o produto de droga particular estudado.

[0095] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não existem diferenças clinicamente significativas em suas seguranças, purezas e potências.

[0096] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se um paciente pode ser trocado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um esperado aumento do risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficácia diminuída, em comparação com a terapia continuada sem essa mudança.

[0097] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, na medida em que esses mecanismos são conhecidos.

[0098] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração de anticorpo ou dos seus metabolitos é medida no sangue, plasma, soro ou outros fluidos biológicos em função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado com e é razoavelmente preditivo de dados humanos de biodisponibilidade in vivo; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido em função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabelece a segurança, eficácia, ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0099] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-IL-33 da invenção podem ser construídas, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos internos ou terminais ou sequências não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para evitar a formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após renaturalização. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo anti-IL-33 compreendendo mudanças de aminoácidos que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.

Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada de Espécies

[00100] A presente invenção, de acordo com certas modalidades, fornece anticorpos anti-IL-33 que se ligam a IL-33 humana, mas não a IL-33 de outras espécies. A presente invenção também inclui anticorpos anti-IL-33 que se ligam a IL-33 humana e a IL-33 de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-IL-33 da invenção podem se ligar a IL-33 humana e podem se ligar ou não ligar, como o caso pode ser, a um ou mais de IL-33 de camundongo, rato, cobaia, hamster, gerbil, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, macaco cinomolgo, sagui ou chimpanzé. De acordo com certas modalidades exemplares da presente invenção, anticorpos anti-IL-33 são fornecidos que se ligam especificamente a IL-33 humana e IL-33 de macaco cinomolgo (por exemplo, Macaca fascicularis).

Imunoconjugados

[00101] A invenção inclui anticorpos monoclonais anti-IL-33 conjugados com uma fração terapêutica ("imunoconjugado"), como uma citotoxina, uma droga quimioterápica, um imunossupressor ou um radioisótopo. Agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial às células. Exemplos de agentes citotóxicos adequados e agentes quimioterápicos para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica, (ver, por exemplo, WO 05/103081).

Anticorpos Multiespecíficos

[00102] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos do polipeptídeo alvo ou podem conter os domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Ver, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-IL-33 da presente invenção podem ser ligados a ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outro) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina é específico para IL-33 humana ou um fragmento da mesma, e o outro braço a imunoglobulina é específico para um segundo alvo terapêutico ou é conjugado a uma fração terapêutica.

[00103] Um formato de anticorpo biespecífico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, em que os primeiros e segundos domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico para Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole a ligação de Proteína A, como uma modificação de H95R (pela numeração de éxon de IMGT; H435R pela numeração de EU). O segundo CH3 ainda pode incluir uma modificação de Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG4. Variações sobre o formato de anticorpo biespecífico descritas acima são contempladas no escopo da presente invenção.

[00104] Outros formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, entre outros, por exemplo, formatos com base em scFv ou diacorpo biespecíficos, fusões IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, knobs-into- holes, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com knobs- into-holes, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de ação dupla (DAF)-IgG, e formatos biespecíficos de Mab2 (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 111, e referências citadas no mesmo, para uma revisão dos formatos acima). Anticorpos biespecífico também podem ser construídos usando conjugação de peptídeo/ácido nucleico, por exemplo, em que aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar os conjugados anticorpo-oligonucleotídeo específicos de sítio que passam por automontagem em complexos multiméricos com composição, valência e geometria definidas. (Ver, por exemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

LIGAÇÃO DEPENDENTE DE pH

[00105] A presente invenção fornece anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a IL-33 em uma maneira dependente de pH. Por exemplo, um anticorpo anti-IL-33 da invenção pode apresentar ligação reduzida a IL-33 em pH ácido, em comparação com pH neutro. Alternativamente, um anticorpo anti-IL-33 da invenção pode apresentar ligação potencializada a seu antígeno em pH ácido, em comparação com pH neutro.

[00106] Em certos casos, "ligação reduzida a IL-33 em pH ácido, em comparação com pH neutro" é expresso em termos de uma razão entre o valor de KD da ligação de anticorpo a IL-33 em pH ácido para o valor de KD da ligação de anticorpo a IL-33 em pH neutro (ou vice-versa). Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser considerado como apresentando "ligação reduzido a IL-33 em pH ácido, em comparação com pH neutro" para fins da presente invenção, se o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo apresenta uma razão de KD ácido/neutro de cerca de 3,0 ou superior. Em certas modalidades exemplares, a razão de KD ácido/neutro para um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser cerca de 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ou superior.

[00107] Anticorpos com características de ligação dependentes de pH podem ser obtidos, por exemplo, triando uma população de anticorpos para ligação reduzida (ou potencializada) para um antígeno particular em pH ácido, em comparação com pH neutro. Adicionalmente, as modificações do domínio de ligação ao antígeno no nível do aminoácido podem produzir anticorpos com características dependentes de pH. Por exemplo, substituindo um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, dentro de um CDR) com um resíduo de histidina, um anticorpo com a ligação ao antígeno reduzida em pH ácido em relação ao pH neutro pode ser obtido. Neste documento, a expressão "pH ácido" representa um pH de 6,0 ou menos, cerca de 5,5 ou menos, ou cerca de 5,0 ou menos. A expressão "pH ácido" inclui valores de pH de cerca de 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0, ou menos. Como usado aqui, a expressão "pH neutro" significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de cerca de 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, e 7,4. Formulação Terapêutica e Administração

[00108] A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-IL-33 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que fornecem melhor transferência, liberação, tolerância e afins. Uma infinidade de formulações adequadas pode ser encontrada no formulário conhecido a todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo de lipídios (catiônicas ou aniônicas) (como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Ver também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[00109] A dose de anticorpo administrado a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença alvo, condições, via de administração, e afins. A dose preferencial é normalmente calculada de acordo com o peso do corpo ou da área de superfície corporal. Quando um anticorpo da presente invenção é usado no tratamento de uma condição ou doença associada com a atividade de IL-33 em paciente adulto, pode ser vantajoso administrar por via intravenosa o anticorpo da presente invenção normalmente em uma única dose de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Doses e horários eficazes para a administração de anticorpos anti-IL-33 podem ser determinados empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado pela avaliação periódica, e a dose ajustada em conformidade. Além disso, escala interespécies de dosagens podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[00110] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos para introduzir incluem, entre outras, vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, peridurais e orais. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser local ou sistêmica.

[00111] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser liberada por via subcutânea ou por via intravenosa com seringa e agulha padrão. Além disso, no que diz respeito à liberação subcutânea, um dispositivo de liberação de caneta prontamente tem aplicações na liberação de uma composição farmacêutica da presente invenção. Esse dispositivo de liberação de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de liberação de caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode facilmente ser descartado e substituído com um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de liberação de caneta então pode ser reutilizado. Em um dispositivo de liberação de caneta descartável, não há nenhum cartucho substituível. Pelo contrário, o dispositivo de liberação de caneta descartável vem pré-carregado com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.

[00112] Numerosas canetas reutilizáveis e dispositivos de liberação de autoinjetor têm aplicações na liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Os exemplos incluem, entre outros, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), para citar apenas alguns. Exemplos de dispositivos de liberação de caneta descartáveis tendo aplicações na liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, entre outros, caneta SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), a FLEXPEN™ (Novo Nordisk), e a KWIKPEN™ (Eli Lilly), a SURECLICKTM Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), a PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), a EPIPEN (Dey, L.P.), e a caneta HUMIRATM (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar apenas alguns.

[00113] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533).

[00114] As preparações injetáveis podem incluir formas farmacêuticas para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões de gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou seu sal descrito acima em meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente utilizado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existe, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que pode ser utilizado em combinação com um agente solubilizante adequado como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), tensoativo não iônico [por exemplo, Polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que pode ser utilizado em combinação com um agente solubilizante como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preenchida preferencialmente em uma ampola apropriada.

[00115] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas farmacêuticas em uma unidade de dose adequada para caber em uma dose dos ingredientes ativos. Essas formas farmacêuticas em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo citado contida é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma farmacêutica de uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferencial que o anticorpo citado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas farmacêuticas.

Usos Terapêuticos dos Anticorpos

[00116] Experimentos utilizando sistemas de modelo de camundongo, conduzidos pelos presentes inventores, contribuíram para a identificação de várias doenças e condições que podem ser tratadas, prevenidas e/ou amenizadas pelo antagonismo de IL-33. Por exemplo, liberação hidrodinâmica de DNA da IL-33 de camundongo resultou na indução de acúmulo de muco no pulmão e aumento de IgE no soro total em camundongos. Além disso, a liberação de DNA de mIL-33 resultou na regulação para cima de ST2 e várias citocinas a jusante como medido por análise de microarranjo. Experimentos conduzidos pelos presentes inventores usando camundongos nocaute de IL-33 também revelaram vários potenciais benefícios terapêuticos do antagonismo da IL-33. Por exemplo, pontuação macroscópica e infiltrações de pele demonstraram ser comparáveis entre camundongos de tipo selvagem e camundongos IL-33-/- em um modelo de psoríase induzida por IMQ. Além disso, camundongos IL-33-/- mostraram redução na eosinofilia e acúmulo de muco residual em um modelo de inflamação pulmonar induzida por alérgeno.

[00117] Os anticorpos da invenção são úteis, nomeadamente, para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de qualquer doença ou distúrbio associado com ou mediado pela expressão, sinalização ou atividade da IL-33, ou tratável bloqueando a interação entre IL-33 e um ligante de IL- 33 (por exemplo, ST2) ou inibindo de outra forma a atividade e/ou sinalização da IL-33. Por exemplo, a presente invenção fornece métodos para tratar asma (por exemplo, asma alérgica, asma não alérgica, asma grave refratária, exacerbações da asma, asma resistente a esteroide, asma sensível a esteroide, asma eosinofílica ou asma não eosinofílica, etc), dermatite atópica, psoríase, outros distúrbios inflamatórios, alergia, anafilaxia, doença cardiovascular, doença do sistema nervoso central, dor, artrite (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática, etc.), arterite de células gigantes, vasculite (doença de Behçet e síndrome de Churg Strauss), Púrpura de Henoch- Schonlein, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerosa), lúpus e síndrome de Sjogren.

[00118] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para tratar, prevenir e/ou melhorar uma ou mais doenças fibróticas. Doenças fibróticas exemplares que são tratáveis através da administração de anticorpos anti-IL-33 da invenção incluem fibrose pulmonar (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por amianto e síndrome de bronquiolite obliterante), asma crônica, fibrose associada com lesão pulmonar aguda e insuficiência respiratória aguda (por exemplo, pneumonia bacteriana induzida por fibrose, fibrose induzido por trauma, fibrose induzida por pneumonia viral, fibrose induzida por ventilador, fibrose induzida por sepse não pulmonar e fibrose induzida por aspiração), silicose, fibrose induzida por radiação, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC, que pode ou não pode estar relacionado a causa da, em parte por, ou resultante de, exposição à fumaça de cigarro de primeira ou segunda mão), esclerodermia, fibrose ocular, fibrose de pele (por exemplo, esclerodermia), fibrose hepática (por exemplo, cirrose, fibrose hepática induzida pelo álcool, esteatohepatite não alcoólica (NASH), lesão do ducto biliar, cirrose biliar primária, fibrose do fígado induzida por infecção ou vírus, hepatite autoimune, fibrose de rim (renal), fibrose cardíaca, aterosclerose, reestenose de stent e mielofibrose.

[00119] No contexto dos métodos de tratamento descritos aqui, o anticorpo anti-IL-33 pode ser administrado como monoterapia (ou seja, como o único agente terapêutico) ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (exemplos dos quais são descritos em outro lugar aqui).

Terapias de Combinação e Formulações

[00120] A presente invenção inclui composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-IL-33 aqui descritos em combinação com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais, e métodos para tratar compreendendo administrar essas combinações para sujeitos em necessidade dos mesmos.

[00121] Os anticorpos anti-IL-33 da presente invenção podem ser coformulados com e/ou administrados em combinação com, por exemplo, inibidores de citocinas, incluindo inibidores de citocina de pequenas moléculas, e anticorpos que se ligam a citocinas como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL- 21, IL-23, IL-25, IL-26, ou antagonistas dos seus respectivos receptores.

[00122] Os anticorpos anti-IL-33 da invenção podem também ser administrados e/ou coformulados em combinação com medicamentos antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteroides, esteroides, oxigênio, antioxidantes, quelantes de metais, IFN-gama e/ou NSAIDs.

[00123] Os componentes terapeuticamente ativos adicionais podem ser administrados apenas antes de, simultaneamente com, ou logo após a administração de um anticorpo anti-IL-33 da presente invenção; (para fins da presente divulgação, esses esquemas de administração são considerados na administração de um anticorpo anti-IL-33 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional). A presente invenção inclui composições farmacêuticas em que um anticorpo anti-IL-33 da presente invenção é coformulado com um ou mais dos componentes terapeuticamente ativos adicionais, conforme descrito em outro lugar aqui.

Esquemas de Administração

[00124] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de um anticorpo anti-IL-33 (ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-IL- 33 e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais mencionados aqui) podem ser administrados para um sujeito em um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administrar sequencialmente para um sujeito várias doses de um anticorpo anti-IL-33 da invenção. Como usado aqui, "administrar sequencialmente" significa que cada dose de anticorpo anti-IL-33 é administrada ao sujeito em um ponto diferente no tempo, por exemplo, em dias diferentes, separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma dose inicial única de um anticorpo anti-IL-33, seguido por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-IL-33, e opcionalmente seguido por uma ou mais doses terciários do anticorpo anti-IL-33.

[00125] Os termos "dose inicial," "doses secundárias" e "doses terciárias", referem-se à sequência temporal de administração do anticorpo anti-IL-33 da invenção. Assim, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do esquema de tratamento (também referida como "dose de linha basal"); as "doses secundárias" são as doses que são administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses que são administradas após as doses secundárias. As doses iniciais, secundárias e terciárias, podem todas conter a mesma quantidade de anticorpo anti-IL-33, mas geralmente podem diferir entre si em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, no entanto, a quantidade de anticorpo anti-IL-33 contido nas doses inicial, secundária ou terciária varia de uma para a outra (por exemplo, ajustado para cima ou para baixo conforme o caso) durante o curso do tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do esquema de tratamento como "doses de carregamento" seguidas por doses subsequentes que são administrados de forma menos frequente (por exemplo, "doses de manutenção").

[00126] Em certas modalidades exemplares da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26% ou mais) semanas após a dose imediatamente anterior. A frase "a dose imediatamente anterior", como usado aqui, significa, em uma sequência de várias administrações, a dose de anticorpo anti-IL-33 que é administrada a um paciente antes da administração da dose seguinte na sequência com nenhuma dose intermediária.

[00127] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podem incluir a administração a um paciente de qualquer número de doses secundárias ou terciárias de um anticorpo anti-IL-33. Por exemplo, em certas modalidades, apenas uma dose secundária única é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Da mesma forma, em certas modalidades, apenas uma dose terciária única é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.

[00128] Em modalidades que envolvem doses secundárias múltiplas, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas, ou 1 a 2 meses após a dose imediatamente anterior. Da mesma forma, em modalidades que envolvem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 12 semanas após a dose imediatamente anterior. Em certas modalidades da invenção, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas ao paciente pode variar ao longo do esquema de tratamento. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso de tratamento por um médico, dependendo das necessidades do paciente individual seguindo exame clínico.

[00129] A presente invenção inclui esquemas de administração em que 2 a 6 doses de carregamento são administradas a um paciente em uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, etc.), seguidas pela administração de duas ou mais doses de manutenção para o paciente com menos frequência. Por exemplo, de acordo com este aspecto da invenção, se as doses de carregamento são administradas em uma frequência de uma vez por mês, então as doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, etc.

Usos Diagnósticos dos Anticorpos

[00130] Os anticorpos anti-IL-33 da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir IL-33, ou células expressando IL-33 em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-IL-33, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão anormal (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de IL-33. Ensaios de diagnósticos exemplares para IL-33 podem compreender, por exemplo, contatar uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti- IL-33 da invenção, em que o anticorpo anti-IL-33 é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-IL-33 não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário, que é em si um marcado. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma fração fluorescente ou quimioluminescente como isotiocianato de fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima como a fosfatase alcalina, beta- galactosidase, peroxidase de rábano, ou luciferase. Ensaios exemplares específicos que podem ser usados para detectar ou medir IL-33 em uma amostra incluem ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células ativado por fluorescência (FACS).

[00131] As amostras que podem ser usadas em ensaios de diagnóstico de IL-33 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecidos ou fluidos obteníveis de um paciente que contém quantidades detectáveis de proteína IL-33, ou fragmentos da mesma, em condições normais ou patológicas. Geralmente, os níveis de IL-33 em uma amostra particular obtidos de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afetado por uma doença ou condição associada a níveis ou atividades anormais de IL-33) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de linha basal, ou padrão, de IL-33. Este nível de linha basal de IL-33 pode então ser comparado com os níveis de IL-33 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de terem uma doença ou condição relacionada a IL-33.

EXEMPLOS

[00132] Os exemplos a seguir são colocados adiante a fim de fornecer para os especialistas na técnica uma divulgação e descrição completa de como preparar e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Esforços foram realizados para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser contabilizados. Salvo indicação contrária, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão é ou está próxima a da atmosférica. Exemplo 1. Geração de Anticorpos Humanos para IL-33 humana

[00133] Um imunógeno composto por IL-33 humana foi administrado diretamente, com um adjuvante para estimular a resposta imune, para um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia pesada e kappa leve de imunoglobulina humana. A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico para IL-33. Quando uma resposta imune desejada foi alcançada, esplenócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar a sua viabilidade e formar linhagens de células de hibridoma. As linhagens de células de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linhas de células que produzem anticorpos específicos para IL-33. Usando esta técnica, vários anticorpos anti-IL-33 quiméricos (ou seja, possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta forma foram designados como segue: H1M9559N, H1M9566N, H1M9568N e H1M9565N. Os domínios variáveis humanos de anticorpos quiméricos foram posteriormente clonados em domínios constantes humanos para preparar anticorpos anti-IL-33 totalmente humanos, conforme descrito aqui.

[00134] Anticorpos anti-IL-33 também foram isolados diretamente das células B positiva de antígeno sem fusão para células de mieloma, conforme descrito em US 2007/0280945A1. Usando este método, vários anticorpos anti-IL-33 totalmente humanos (ou seja, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta forma foram designados como segue: H4H9629P, H4H9633P, H4H6940P, H4H9659P, H4H9660P, H4H9662P, H4H9663P, H4H9664P, H4H9665P, H4H9666P, H4H9667P, H4H9670P, H4H9671P, H4H9672P, H4H9675P e H4H9676P.

[00135] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-IL-33 exemplares gerados em conformidade com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos estabelecidos abaixo. Exemplo 2. Sequências de Aminoácidos de Região Variável de Cadeia Pesada e Leve

[00136] A Tabela 1 estabelece os pares de sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e leve, e sequências de CDR, de anticorpos anti-IL-33 selecionados e seus identificadores de anticorpo correspondentes.

[00137] Os anticorpos são normalmente referidos aqui de acordo com a seguinte nomenclatura: Prefixo de Fc (por exemplo, "H1M" ou "H4H"), seguido por um identificador numérico (por exemplo, "9559", "9566", ou "9629" conforme mostrado na Tabela 1), seguido por um sufixo "P", ou "N". Assim, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser referido aqui como, por exemplo, "H1M9559N," "H1M9566N", "H4H9629P", etc. Os prefixos H1M e H4H nas designações de anticorpo usados aqui indicam o isotipo de região Fc particular do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo "H1M" tem um Fc de IgG1 de camundongo, enquanto um anticorpo "H4H" tem um Fc de IgG4 humana. Como será apreciado por uma especialista na técnica, um anticorpo tendo um isotipo Fc particular pode ser convertido em um anticorpo com um isotipo Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um Fc de IgG1 de camundongo pode ser convertido a um anticorpo com um IgG4 humano, etc), mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo os CDRs) - que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1 - permanecerão iguais, e as propriedades de ligação são esperadas que sejam idênticas ou semelhantes independentemente da natureza do domínio Fc. Exemplo 3. Ligação de Anticorpo para IL-33 Humana conforme Determinado Pela Ressonância de Plasmon de Superfície

[00138] Constantes de dissociação de equilíbrio (valores de KD) para ligação de IL-33 para os anticorpos monoclonais anti-IL-33 purificados foram determinadas utilizando um biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real usando um instrumento Biacore 4000. A superfície do sensor Biacore foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com um anticorpo anti-camundongo de coelho policlonal (GE, # BR-1008-38) ou com um anticorpo de Fc anti-humano de camundongo monoclonal (GE, # BR-1008-39) para capturar os anticorpos monoclonais anti-IL-33 expressos com regiões constantes de IgG4 de camundongo ou humanas, respectivamente. Todos os estudos de ligação Biacore foram realizados em 0,01M ADA pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, e 0,05% v/v Tensoativo Tween-20 (tampão de corrida ABS- ET). Diferentes concentrações de IL-33 humana (hIL-33; R&D Systems, # 3625-IL-010/CF) ou IL-33 de macaco cinomolgos expressa com um tag de hexahistidina C-terminal (MfIL-33-6His; SEQ ID NO:xx) preparadas em tampão de corrida ABS-ET (variando de 100nM a 3,7nM, diluições de 3 vezes) foram injetadas sobre a superfície de captura de anticorpo monoclonal anti-IL-33 capturado em uma taxa de fluxo de 30μL/minuto. A associação de hIL-33 ou MfIL-33-6His para o anticorpo monoclonal capturado foi monitorada por 4 minutos e sua dissociação em tampão de corrida ABS-ET foi monitorada por 10 minutos. O efeito do pH reduzido sobre a ligação de cada anticorpo anti-IL-33 para hIL-33 ou MfIL-33-6His foi estudado usando um formato de ensaio de perseguição de pH em linha em 0,01M ADA pH 6,0, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, e 0,05% v/v Tensoativo Tween-20 (tampão pH6 ABS-ET). Para alcançar isso, associação de hIL-33 ou MfIL-33-6His para o anticorpo monoclonal capturado foi monitorada por 4 minutos em tampão de corrida ABS-ET. Após 30 segundos de dissociação de hIL-33 ou MfIL- 33-6His em tampão de corrida ABS-ET, tampão pH6 ABS-ET foi injetado por 3 minutos, e a dissociação de analito sob as condições de baixo pH foi medida. Todos os experimentos de cinética de ligação foram realizados em 25°C e 37°C. Constantes de associação (ka) e dissociação (kd) cinética foram determinadas por ajuste do sensorgramas em tempo real para um modelo de ligação 1:1 usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. Constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meia-vida dissociativa (t^) foram calculadas a partir das constantes de taxas cinéticas como:

[00139] KD (M) = kd/ka

[00140] e

[00141] t1/2 (min) = ln(2)/(60*kd)

[00142] Parâmetros cinéticos de ligação para a ligação de hIL-33 e MfIL-33-6His com diferentes anticorpos monoclonais anti-IL-33 a 25°C e 37°C são mostrados nas Tabelas 2 a 5. A 25°C, hIL-33 se ligaram aos anticorpos anti-IL-33 com valores de KD que variam de 78pM a 757pM, conforme mostrado na Tabela 2. A 37°C, hIL-33 se ligaram aos anticorpos anti-IL-33 com valores de KD que variam de 411pM a 2,03nM, conforme mostrado na Tabela 3. A 25°C e 37°C, um anticorpo anti-IL- 33 demonstrou ligação fraca e, portanto, seus parâmetros cinéticos de ligação não puderam ser ajustados estar usando um modelo de ligação 1:1. A 25°C, MfIL-33-6His se ligaram aos anticorpos anti-IL-33 com valores de KD que variam de 333pM a 38nM, conforme mostrado na Tabela 4. A 37°C, MfIL-33-6His se ligaram aos anticorpos anti-IL-33 com valores de KD que variam de 1nM a 48.6nM, conforme mostrado na Tabela 55. Tabela 2: Parâmetros cinéticos de ligação de anticorpos monoclonais anti-IL-33 se ligando a IL-33 humana a 25°C. *IC: inconclusivos uma vez que ligação muito fraca foi observada nas condições experimentais e a ligação em tempo real de dados pode não se ajustar de forma confiável no modelo de ligação 1:1. ** Nas condições experimentais, nenhuma dissociação de IL33 do anticorpo monoclonal capturado foi observado', portanto, o valor de kd foi fixado para 1,00E-05, e os valores de KD e t½ derivados representam limites superiores e inferiores, respectivamente. Tabela 3: Parâmetros cinéticos de ligação de anticorpos monoclonais anti-IL-33 se ligando a IL-33 humana a 37°C. *IC: inconclusivos uma vez que ligação muito fraca foi observada nas condições experimentais e a ligação em tempo real de dados pode não se ajustar de forma confiável no modelo de ligação 1:1. Tabela 4: Parâmetros cinéticos de ligação de anticorpos monoclonais anti-IL-33 se ligando à MfIL-33-6His a 25°C. Tabela 5: Parâmetros cinéticos de ligação de anticorpos monoclonais anti-IL-33 se ligando à MfIL-33-6His a 37°C. *FT: t½ rápido de forma que a ligação de MfIL-33-6His ao anticorpo monoclonal anti-IL-33 capturado foi Exemplo 4. Anticorpos Anti-IL-33 Bloqueiam a Ligação de IL-33 ao Receptor ST2 Humano

[00143] A capacidade de anticorpos anti-IL-33 de bloquear a ligação de IL-33 humana (hIL-33) ou IL-33 de macaco cinomolgos ao receptor ST2 humano foi medido usando um ELISA sanduíche de competição. Uma porção do ectodomínio da proteína ST2 humana que foi expressa com um tag de Fc de IgG1 humana C-terminal (hFc-hST2; SEQ ID NO:306), foi revestida em uma concentração de 1 μg/mL de tampão PBS em uma placa de microtitulação de 96 poços durante a noite a 4 °C. Sítios de ligação não específica foram posteriormente bloqueados usando uma solução 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Concentrações constantes de 30 pM proteína hIL-33 biotinilada (R&D systems, Cat #3625-IL/CF) (biotina-hIL-33) ou 150 pM IL-33 de macaco cinomolgos expressa com tag de hexahistidina (MfIL-33-6His; SEQ ID NO:305) foram adicionados separadamente para diluições em série de anticorpos para que as concentrações finais de anticorpos variassem de 0 a 100 nM. As misturas de anticorpo/IL-33 foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente antes de serem transferidas para as placas de microtitulação revestidas com hST2-hFc. Após incubação por 1 hora em temperatura ambiente, os poços foram então lavados, e biotina-hIL- 33 ligada à placa foi detectada com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) (Thermo Scientific, Cat # N200) e MfIL-33- 6His ligada à placa foi detectada com um anticorpo monoclonal anti-His conjugado com HRP (Qiagen, #34460). Todas as amostras foram desenvolvidas com uma solução TMB (BD biosciences, # 51-2607KC) para produzir uma reação colorimétrica e então interrompida por acidificação com 1M ácido sulfúrico antes de medir a absorbância a 450nm em um leitor de placa Victor X5. A análise dos dados foi realizada utilizando um modelo sigmoidal de dose-resposta dentro do software Prism™. O valor calculado de IC50, definido como a concentração de anticorpo necessária para reduzir em 50% de sinal máxima a ligação de biotina-hIL-33 ou MfIL-33-6His para hST2-hFc revestido na placa, foi usado como um indicador de bloqueio de potência. O percentual de bloqueio foi calculado como a razão da redução de sinal observada na presença de anticorpos em relação à diferença entre o sinal com IL-33 sozinho e de fundo (sinal de anticorpo secundário conjugado com HRP ou estreptavidina sozinha). A absorbância medida para a concentração constante de biotina-hIL-33 ou MfIL-33-6His sozinho é definida como 0% de bloqueio e a absorbância medida para IL-33 não adicionada é definida como 100% de bloqueio. Os valores de absorbância dos poços contendo a concentração máxima para cada anticorpo foram usados para determinar o percentual máximo de bloqueio. Tabela 6: Bloqueio de ELISA de ligação de biotina-hIL-33 ou MfIL-33- 6His para hST2-hFc por anticorpos anti-IL-33 N/A= não aplicável NBl= não bloqueador *= Experimento realizado em um dia separado

[00144] Experimentos de ligação para 20 anticorpos foram realizadas em dois dias separados, conforme indicado na Tabela 6. Todas os 20 anticorpos anti-IL-33 bloquearam a ligação de biotina-hIL-33 para hST2- hFc com valores de IC50 variando de 140pM a 22nM e porcentagem de bloqueio máximo variando de 46% a 88%. Dezoito dos 20 anticorpos anti-IL-33 bloquearam a ligação de MfIL-33-6His para hST2-hFc com valores de IC50 variando de 220 pM a 13nM e percentual de bloqueio máximo variando de 38% a 92%, conforme mostrado na Tabela 6. Dois dos anticorpos testados, H4H9629P e H4H9633P, não demonstraram bloqueio mensurável de ligação de MfIL-33-6His para hST2-hFc. Exemplo 5. Inibição da ligação de IL-33 para anticorpo monoclonal anti- IL-33 por ST2 como demonstrado pela Análise Biacore

[00145] A capacidade de anticorpos anti-IL-33 para se ligar a um complexo pré-formado de IL-33 com ST2 foi testada usando o instrumento Biacore T-200 equipado com um biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real. O experimento foi realizado a 25°C com um tampão de corrida composto de 0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, e 0,05% v/v Tensoativo Tween-20 (HBS-ET). A superfície do sensor Biacore foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina a um anticorpo monoclonal específico de tag anti-myc (Clone# 9E10), e sobre este sensor derivatizado foi capturado aproximadamente 160 unidades de resposta (RU) da proteína ST2 humana expressa com um tag de myc-myc-hexahistadina C-terminal (hST2-MMH; SEQ ID NO: 323). A superfície hST2-MMH capturada foi então saturada por injeção de 100nM de IL-33 humana (hIL-33; R&D Systems, # 3625-IL-010/CF) por 3 minutos seguidos por uma injeção de 3 minutos de uma solução de 100nM do anticorpo monoclonal anti-IL- 33. A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante todo o curso do experimento, e a resposta de ligação observada em 3 minutos após a injeção do anticorpo anti-IL-33 ao complexo pré-formado de hIL- 33 e hST2-MMH capturado foi gravada e tabulada e mostrada na Tabela 7. Nenhuma ligação não específica de anticorpo monoclonal anti-IL-33 para a superfície de captura do tag anti-myc foi observada. Conforme mostrado na Tabela 7, 17 dos anticorpos testados não apresentaram ligação mensurável à hIL-33 depois que foi pré-complexado com hST2- MMH, enquanto três anticorpos (H1M9565N, H1M9566N e H1M9568N) se ligaram à hIL-33 depois que foi pré-complexado com hST2-MMH. Tabela 7: Ligação de anticorpos anti-IL-33 a um complexo pré-formado de hIL-33 e hST2-MMH Exemplo 6. Inibição da Sinalização de Receptor Mediada por IL-33 por Anticorpos Anti-IL-33

[00146] Interleucina-33 (IL-33) é um ligante para ST2, um membro da superfamília de receptor tipo toll/interleucina-1 que associa a uma proteína acessória, IL-1RAcP (para revisão, ver Kakkar and Lee, 2008). Após a ativação de ST2/IL-1RAcP por IL-33, uma cascata de sinalização é desencadeada através de moléculas a jusante como MyD88 (fator de diferenciação mieloide 88) e TRAF6 (fator 6 associado a receptores TNF), levando à ativação de NFKB (fator nuclear-KB), entre outros. Para desenvolver um sistema de bioensaio biologicamente relevante para testar os anticorpos anti-IL-33, células de rim humano embrionário (HEK293) foram transfectadas de forma estável para expressar o ST2 humano (aminoácidos 1-556 de número de adesão NP_057316) junto com um repórter de luciferase [elemento de resposta NFKB (5x)- luciferase-IRES-GFP] (linhagem de células HEK293/hST2/NFkB- luciferase). A linhagem de células HEK293 expressa IL-1RAcP endogenamente e a ativação de NFKB por IL-33 em células HEK293 foi mostrada anteriormente (Schmitz et al., Immunity 23:479-490 (2005)). A linhagem de célula estável foi isolada e mantida em 10% FBS, DMEM, NEAA, penicilina/estreptomicina e G418.

[00147] Para o bioensaio, células HEK293/hST2/NFkB-luciferase foram propagadas em placas de 96 poços de ensaio em 10.000 células por poço em meio de baixo soro contendo 0,1% p/v FBS e OPTIMEM (Invitrogen, #31985-070) e então incubada a 37°C em 5% CO2 durante a noite. No dia seguinte, para determinar a resposta de dose de IL-33, IL-33 humana (hIL-33; R&D Systems, #3625-IL) ou IL-33 de macaco cinomolgo expressa com um tag de hexahistidina C-terminal (MfIL-33- 6His; SEQ ID NO:305) foram serialmente diluídas a 1:3 e adicionadas às células a partir de 10 nM e variando até 0,0002 nM, além de uma amostra de controle não contendo IL-33. Para medir a inibição, anticorpos foram serialmente diluídos e adicionados às células seguidas pela adição de concentrações constantes de IL-33 (10 pM hIL-33 para o ensaio de humano e 5 pM MfIL-33-6His para o ensaio de macaco). Diluições em série de três vezes de anticorpo foram realizadas antes de adicionar às células, a partir de 100 pM e variando até 0,002 nM ou a partir de 10 nM e variando até 0,0002 nM. Além da série de diluição de anticorpo, um poço contendo a concentração constante de IL-33, mas sem qualquer anticorpo também foi incluído. Após 5,5 horas de incubação a 37°C em 5% CO2, a atividade de luciferase foi detectada usando um leitor de placas Victor X (Perkin Elmer), e os resultados foram analisados usando regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com Prism 5. Os resultados são vistos na Tabela 8. Tabela 8: Inibição da IL-33 humana e ativação da IL-33 de macaco de células HEK293/hST2/ NFkB -luciferase por anticorpos anti-IL33

[00148] Dezoito dos 20 anticorpos anti-IL33 bloquearam a estimulação da IL-33 humana das células HEK293/hST2/NFkB - luciferase com valores de IC50 que variam de 7,5pM a 29nM, conforme mostrado na Tabela 8. Dois dos anticorpos testados, H1M9566N e H1M9568N, inibiram parcialmente hIL-33 com uma inibição máxima de 48% e 66%, com valores de IC50 de 950 pM e 250 pM, respectivamente. Dezoito dos 20 anticorpos anti-IL33 bloquearam a estimulação de MfIL- 33-6His das células HEK293/hST2/NFkB -luciferase com valores de IC50 que variam de 660pM a 130nM, conforme mostrado na Tabela 8. Dois dos anticorpos testados, H1M9566N e H1M9568N, inibiram parcialmente MfIL-33-6His com uma inibição máxima de 61% e 34%, com valores de IC50 de 1,5 nM e 3,5 nM, respectivamente. Exemplo 7. Inibição da Degranulação induzida por IL-33 de Basófilos Humanos por Anticorpos Anti-IL-33

[00149] Para avaliar as características in vitro de anticorpos anti-IL- 33 selecionados da invenção, suas capacidades de bloquear degranulação de basófilos induzida por IL-33 foi medida. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram purificadas de sangue total fresco de dois diferentes doadores humanos por centrifugação de gradiente de densidade. Sangue total de EDTA K2 foi diluído 1:1 em RPMI 1640, cuidadosamente em camadas sobre Ficoll- Paque (GE Healthcare, # 17-1440-03) e centrifugado para separar PBMC. A camada de interfase contendo PBMC foi aspirada, transferida para um tubo novo, e lavada duas vezes com tampão MACS que era composto de uma diluição 1:20 da solução de BSA MACS (Militenyi Biotec, #130-091-376) em solução de lavagem MACS (Militenyi Biotec, #130-091-222). A PBMC purificada foram então plaqueadas em uma placa de 96 poços de fundo em v a uma concentração final de ~3,0x106 células/mL em 100 μL de tampão MACS. Para iniciar os basófilos contidos dentro da população de PBMC, 1 ng de IL-3 (Sigma, # H7166- 10UG) em 50 μl de Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco sem Ca++ ou Mg++ (DPBS) foi adicionada à suspensão de células, e então incubada a 37°C por 10 minutos.

[00150] Diluições em série (1:3) de dois diferentes anticorpos anti-IL- 33 exemplares da invenção (H4H9675P e H4H9659P) ou um anticorpo controle isotipo foram feitas, variando de 10 nM a 4,6 pM, mais um controle sem anticorpos. As soluções foram misturadas com uma concentração fixa de 100 pM (concentração final) de IL-33 humana (R&D Systems, # 6325-IL/CF) ou nenhum controle negativo de IL-33 antes de adicionar para PBMC. Todas as condições foram testadas em duplicata.

[00151] Após a adição da IL-33 humana e anticorpos para as células, as células foram incubadas a 37°C por 20 minutos para facilitar a degranulação de basófilos. A degranulação então foi interrompida por resfriamento das placas de ensaio no gelo molhado por 5 minutos. Para habilitar a análise da população de basófilos usada para medir a degranulação, 20 μL cada (conforme as instruções do fabricante) de anti-HLA-DR-FITC (Beckman Coulter, # IM0463U), anti-CD123-APC (BD, # 560087) e anti-CD203c-PE (Beckman Coulter, # IM3575) foram adicionados para cada amostra, e as amostras foram mantidas a 4°C por 20 minutos no escuro. As células foram então centrifugadas, lavadas com DPBS, e ressuspensas em 2% de formaldeído (tampão de fixação) a 4°C. No dia seguinte, as células fixas foram analisadas em um BD FACSCanto II para determinar níveis de degranulação de basófilos. Os resultados estão resumidos nas Tabelas 9 e 10. Tabela 9: Degranulação percentual de basófilos humanos induzida por desafio de IL-33 humana Tabela 10: Anticorpo anti-IL-33 bloqueando IL-33 humana induziu degranulação de basófilos humanos

[00152] Como mostrado na Tabela 9, a 1 00 pM, IL-33 humana induziu degranulação de basófilos em dois diferentes doadores com uma porcentagem de degranulação média de 68,8% para doador 655687 e 61,6% para doador 655688.

[00153] Como mostrado na Tabela 10, um anticorpo anti-IL33, H4H9675P, bloqueou a degranulação de basófilos induzida por desafio de 100 pM IL-33 humana com um valor de IC50 de 132,9 pM para doador 655687, e um valor de IC50 de 97,12 pM para doador 655688. Outro anticorpo anti-IL33, H4H9659P, bloqueou a degranulação de basófilos induzida pelo desafio de 100 pM IL-33 humana com um valor de IC50 de 578,6 pM para doador 655687, e um valor de IC50 de 446,5 pM para doador 655688. Em contraste, o controle de isotipo não bloqueou degranulação de basófilos de qualquer um dos doadores testados. Exemplo 8. Inibição de IFN-gama induzida por IL 33 de PBMCs Humanas por Anticorpos Anti-IL-33

[00154] Para caracterizar ainda mais os anticorpos anti-IL-33 da invenção, um ensaio baseado em célula primário usando células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foi utilizado. O ensaio usado neste Exemplo foi baseado nos resultados publicados por Smithgall et al. em International Immunology, 2008, vol. 20 (8) pp. 1019-1030. Para este ensaio, PBMCs foram purificadas de sangue total fresco de três diferentes doadores por centrifugação de gradiente de densidade. Brevemente, sangue total de EDTA K2 foi diluído duas vezes em RPMI 1640, cuidadosamente em camadas sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare, # 17-1440-03) e centrifugado por 20 minutos. A camada de interfase contendo as PBMCs foi aspirada, transferida para um tubo novo, e lavada duas vezes com PBS. As PBMCs isoladas foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo redondo em uma concentração final de 5 x 105 células/mL em RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. As células foram então incubadas com 50 g/mL de IL- 12 humana (hIL-12; R&D Systems, #219-IL-025/CF) e uma diluição serial de IL-33 humana (hIL-33; R&D Systems, #3625-IL-010/CF) sozinha de 10 nM a 0,64 pM, ou com 260 pM de hIL-33 em combinação com diluições seriais dos anticorpos de 100 nM a 6,4 pM. O volume final foi 200 μL por poço. Cada condição foi testada em triplicata. Quando os anticorpos estavam presentes, os mesmos foram adicionados às células após 30 minutos de pré-incubação com hIL-33.

[00155] As células foram incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% CO2, e então os níveis de IFNY no sobrenadante de cultura foram medidos por ELISA (R&D Systems, #DY285). Para o ELISA, placas de 96 poços de fundo plano foram revestidas com anticorpo de captura, de acordo com as instruções do fabricante. Depois de lavar e bloquear, 100 μL do sobrenadante de cultura não diluído foi adicionado às placas e incubado por 2 horas. Lavagens e detecções subsequentes foram feitas seguindo as instruções do fabricante.

[00156] IL-33 humana, na presença de hIL-12, induziu a liberação de IFNy de PBMC total humano de três diferentes doadores testados, com valores de EC50 entre 274pM a 39pM como mostrado na Tabela 11. Onze anticorpos anti-IL-33 foram testados usando PBMC de doadores #603486 e #603487, enquanto 3 anticorpos anti-IL-33 foram testados com PBMC do doador #603491. Todos os 11 anticorpos anti-IL-33 testados em doadores #603486 e #603487 bloquearam a liberação de IFNY de PBMC humana induzida por 260 pM IL-33, com valores de IC50 variando de 175 pM a 22 nM, conforme mostrado na Tabela 12. Nenhum dos três anticorpos IL-33 testados no doador #603491 bloqueou a liberação de IFNY de PBMC humana induzida por 260 pM hIL-33 e, em vez disso, causou um aumento de liberação de IFNY com val ores de EC50 entre 56,1pM e 189nM. Tabela 11: hIL-33 induziu a liberação de IFNY de PBMC humana de três doadores. Tabela 12: Anticorpos anti-IL-33 bloqueando liberação de IFN-Y induzida por IL-33 de PBMC humana de doador #603486 e #603487 Tabela 13: Anticorpos anti-IL-33 bloqueando liberação de IFN-Y induzida por IL-33 de PBMC humana de doador #603491.

[00157] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção, além das descritas aqui, serão evidentes para especialistas na técnica a partir da descrição que precede e das figuras que acompanham. Estas modificações destinam-se a se enquadrar no escopo das reivindicações anexas. Exemplo 9. Competição cruzada de IL-33 humana usando interferometria de biocamada

[00158] A competição de ligação entre um painel de anticorpos monoclonais anti-IL-33 diferentes foi determinada usando um ensaio de interferometria em tempo real, livre de marcador biocamada em um biossensor Octet® HTX (ForteBio, A Division of Pall Life Sciences). O experimento foi realizado a 25°C, usando um tampão de 0,01 M HEPES pH7.4, 0,15 M NaCl, 0,05% v/v Tensoativo Tween-20, e 0,1 mg/ml BSA (tampão de cinética HBS-ET) com placa agitando a uma velocidade de 1000rpm. Para avaliar se dois anticorpos foram capazes de competir com outro para a ligação com IL-33 humana, um formato de ensaio pré- mistura foi usado onde 100nM de IL-33 humana (R&D Systems; # 3625- IL-010/CF) foi pré-misturado com 500nM de diferentes anticorpos monoclonais anti-IL-33 (posteriormente referido como mAb-2) por pelo menos 2 horas antes da corrida do ensaio de competição de ligação. Biossensores de octeto revestidos com um anticorpo policlonal de Fc anti-camundongo (Pall ForteBio Corp., # 18-5088; posteriormente denominado com AMC) ou com um anticorpo policlonal de Fc anti- humano (Pall ForteBio Corp., # 18-5060; posteriormente denominado AHC) foram primeiro submersos em poços com 20μg/mL dos anticorpos monoclonais anti-IL-33 individuais por 3 minutos para capturar os anticorpos monoclonais anti-IL-33 expressos com Fc de camundongo ou com Fc de humano, respectivamente (posteriormente referido como mAb-1). Após a etapa de captura, anticorpo policlonal de FC anti- camundongo e anticorpo policlonal de Fc anti-humano Fc sobre os biossensores Octet foram saturadas submergindo os mesmos por 4 minutos em poços contendo 200μg/mL de um anticorpo monoclonal não específico com um Fc de camundongo ou com um Fc de humano, respectivamente. Finalmente, os biossensores Cctet foram imersos por 4 minutos em poços contendo as amostras pré-misturadas de 100nM de IL-33 humana e 500nM de mAb-2. No final de cada ciclo, os anticorpos anti-IL-33 capturados não covalentemente junto com o pré- complexo ligado de IL-33 humana e mAb-2 foram removidos dos biossensores usando três imersões de 20 segundos alternadas em 10mM HCl seguido por submersão em tampão de cinética HBS-ET. Os biossensores foram lavados em tampão de cinética HBS-ET entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante os eventos de ligação, e a resposta de ligação (em unidades de nm) no final de cada etapa foi gravada. Durante a análise, o sinal de ligação do autofundo para um determinado mAb-2 (onde mAb- 1 = mAb-2, ou seja, na diagonal da matriz) foi subtraído do sinal observado para todos os eventos de ligação de mAb-2 (através de uma coluna na matriz de competição cruzada), e os resultados corrigidos de fundo são mostrados na Figura 1. A resposta da ligação de mAb-1 para o pré-complexo de IL-33 humana e cada uma das diferentes amostras de mAb-2 foram medidas para determinar o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais anti- IL-33 em relação uns aos outros.

[00159] Como mostrado na Figura 1, caixas cinza claro com fonte preta representam resposta de ligação para autocompetição. Anticorpos competindo uns com os outros em ambas as direções, independentes da ordem de ligação, são representados com caixas pretas e fonte branca. As células destacadas em cinza escuro com fonte preta representam o anticorpo monoclonal anti-IL-33 que se liga fracamente a IL-33 humana, resultando em uma competição cruzada unidirecional observada. Os controles de isotipo usados no experimento são representados por caixas cinza escuro com fonte branca. Caixas brancas com fonte preta representam nenhuma competição entre anticorpos, o que sugere que cada anticorpo possui um epítopo de ligação distinto. Exemplo 10. Competição cruzada de IL-33 de macaco usando interferometria de biocamada

[00160] A competição de ligação entre um painel de anticorpos monoclonais anti-IL-33 diferentes foi determinada usando um ensaio de interferometria em tempo real, livre de marcador biocamada em um biossensor Octet® HTX (ForteBio, A Division of Pall Life Sciences). O experimento foi realizado a 25°C usando um tampão de 0,01 M HEPES pH7,4, 0,15 M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v Tensoativo Tween-20, e 0,1 mg/ml BSA (tampão de cinética HBS-ET) com placa agitando a uma velocidade de 1000rpm. Para avaliar se dois anticorpos foram capazes de competir com outro para a ligação com Il-33 de macaco recombinante expressa com um tag de hexahistidina C-terminal (MfIL- 33-6His; SEQ ID: xx), aproximadamente 0,15nm unidades de ligação de MfIL-33-6His foi primeiro capturada para biossensores Octet revestidos com anticorpo anti-penta-His (Fortebio Inc, # 18-5079) submergindo os biossensores por 85 segundos em poços contendo 2μg/mL de MfIL-33- 6His. Os biossensores de captura de antígeno então foram saturadas com um primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-33 (posteriormente referido como mAb-1) por imersão em poços contendo 50μg/mL solução de mAb-1 por 5 minutos. Os biossensores então foram mergulhados em poços contendo uma solução de 50μg/mL de um segundo anticorpo monoclonal anti-IL-33 (posteriormente referido como mAb-2) por 4 minutos. Os biossensores foram lavados em tampão de cinética HBS- ET entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante o experimento, e a resposta de ligação máxima para cada etapa de ligação foi gravada. A resposta da ligação de mAb-2 para o pré-complexo de MfIL-33-6His humana com mAb-1 foi medida, e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais anti-IL-33 em relação uns aos outros foi determinado.

[00161] Como mostrado na Figura 2, caixas cinza claro com fonte preta (ao longo de uma diagonal) representam autocompetição (onde mAb- 1=mAb-2). Anticorpos competindo em ambas às direções, independentes da ordem de ligação, são representados com caixas pretas e fonte branca. Caixas brancas com fonte preta representam nenhuma competição entre anticorpos, o que sugere que cada anticorpo possui um epítopo de ligação distinto. Caixas cinza escuro com fonte branca representam o controle de isotipo usado no experimento. EXEMPLO 11. Teste de mAb em modelo in vivo; Modelo de inflamação pulmonar aguda induzida por HDM para estudar o papel de IL-33 em inflamação pulmonar

[00162] Para determinar o efeito de um anticorpo anti-IL-33, H4H9675P, em um modelo in vivo relevante, um estudo de inflamação pulmonar aguda induzida por HDM foi conduzido em camundongos que foram homozigotos para a expressão de IL-33 humana no lugar de IL- 33 de camundongo (camundongos HumIn IL-33).

[00163] Camundongos HumIn IL-33 foram administrados por via intranasal em 50μg de extrato de ácaro de poeira de casa (HDM; Greer, #XPB70D3A2.5) diluído em 20μL de 1X solução salina de fosfato (PBS) (n=17) ou 20μL de 1X PBS (n=3) por 5 dias por semana por 2 semanas. Um subconjunto do camundongo desafiado com HDM foi injetado por via subcutânea com 25 mg/kg de um anticorpo anti-IL-33, H4H9675, (n=6) ou anticorpo de isotipo de controle (n=6) iniciando três dias antes da primeira administração de HDM e então duas vezes por semana até o final do desafio HDM. No dia 15, após o primeiro HDM intranasal, todos os camundongos foram sacrificados e seus pulmões foram colhidos. Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos são mostrados na Tabela 14. Tabela 14: Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos Colheita de pulmão para análise de citocinas:

[00164] Após a sangria, os lóbulos cranianos e médios do pulmão direito de cada camundongo foram removidos e colocados em tubos contendo uma solução de reagente de extração de proteína de tecido (1X T-PER reagente; Pierce, #78510) suplementado com coquetel de inibidor de protease 1X Halt (Pierce, #78430). Todas as outras medidas foram realizadas no gelo. O volume de Reagente T-PER (contendo o coquetel de inibidor de protease) foi ajustado para cada amostra para coincidir com um tecido 1:8 (p/v) para razão T-PER. Amostras de pulmão foram homogeneizadas manualmente nos tubos, usando macacos descartáveis (Kimble Chase, # 749625-0010). Os lisados resultantes foram centrifugados para detritos de pellet. Os sobrenadantes contendo os extratos de proteína solúvel foram transferidos para tubos frescos e armazenados a 4°C até posterior análise.

[00165] O teor de proteínas totais nos extratos de proteína de pulmão foi medido usando um ensaio de Bradford. Para o ensaio, 10μL de amostras de extrato diluído foram plaqueadas em placas de 96 poços em duplicatas e misturados com 200μL de 1X Reagente Corante (Biorad, #500-0006). Diluições em série de albumina de soro bovino (Sigma, #A7979), começando com 700μg/mL em reagente 1X T-Per foram usados como um padrão para determinar a concentração de proteína exata dos extratos. Após uma incubação de 5 minutos em temperatura ambiente, absorbância a 595nm foi medida em um leitor de placa Molecular Devices SpectraMax M5. A análise de dados para determinar o teor de proteína total foi realizada usando software GraphPad Prism™.

[00166] Concentrações de citocinas em extratos de proteína de pulmão foram medidas usando um kit de imunoensaio multiplex Proinflammatory painel 1 (camundongo) (MesoScale Discovery, # K15048D-2), de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 50 μL/poço de calibradores e amostras (diluídas em Diluente 41) foram adicionados para placas pré-revestidas com anticorpos de captura e incubados em temperatura ambiente com agitação a 700 rpm por 2 horas. As placas foram então lavadas 3 vezes com 1X PBS contendo 0,05% (p/v) Tween-20, seguido pela adição de 25μL de Solução de Anticorpo de Detecção diluída em Diluente 45. Após mais 2 horas de incubação em temperatura ambiente com agitação, a placa foi lavada 3 vezes, e 150 μL de 2 X Tampão de leitura foi adicionado para cada poço. Eletroquimioluminescência foi imediatamente lida em um instrumento MSD Spector®. A análise de dados foi realizada usando software GraphPad Prism™.

[00167] Cada concentração de citocina nos extratos de proteína total de pulmão de todos os camundongos em cada grupo foi normalizada para o teor de proteínas total dos extratos medidos pelo ensaio de Bradford e expressa para cada grupo como pg média de citocina por mg de proteínas de pulmão totais (pg/mg proteína de pulmão, ± SD) como mostrado na Tabela 15. Colheita de pulmão para análise de citocinas:

[00168] O nível das citocinas IL-4 e IL-5 liberadas nos pulmões de camundongos HumIn IL-33 recebendo HDM por 2 semanas foi significativamente superior do que em camundongos HumIn IL-33 desafiados com tampão salino. Em contraste, houve uma tendência para os níveis de IL-4 e IL-5 reduzidos nos pulmões de camundongos HumIn IL-33 tratados com anticorpo anti-IL-33 durante o curso do desafio HDM agudo em comparação com camundongos HumIn IL-33 administrados com HDM sem tratamento ou com controle de isotipo. Tabela 15: Concentração de citocinas em extratos de proteínas de pulmão Nota: Significância estai tística determinada pelo teste de Kruskal-Wallis One-Way ANOVA com teste post-hoc de comparação múltipla de Dunn é indicado (*= p<0,05, **= p<0,01, em comparação com Grupo 1: camundongo HumIn IL33, Desafio de Solução Salina). Colheita de pulmão para análise de infiltrado de células pulmonares

[00169] Após a sangria, o lobo caudal do pulmão direito de cada camundongo foi removido, picado em cubos que foram cerca de 2 a 3 mm em tamanho, e então colocados em um tubo contendo uma solução de 20 μg/mL DNAse (Roche, #10104159001) e 0,7 U/mL Liberase TH (Roche, #05401151001) diluído em Solução de Sal equilibrada com Hank (HBSS) (Gibco, #14025), que foi incubada em banho-maria a 37°C por 20 minutos e agitada a cada 5 minutos. A reação foi interrompida pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (Gibco, #15575) em uma concentração final de 10mM. Cada pulmão foi posteriormente dissociado usando um dissociador gentleMACS ® (Miltenyi Biotec, #130- 095-937), em seguida filtrado através de um filtro de 70 μm e centrifugado. O pellet de pulmão resultante foi ressuspenso em 1 mL de 1X tampão de lise de célula de sangue vermelho (Sigma, #R7757) para remover as células vermelhas do sangue. Após a incubação por 3 minutos em temperatura ambiente, 3 mL de 1 X DMEM foi adicionado para desativar o tampão de lise de células vermelhas do sangue. As suspensões de células foram então centrifugadas, e os pellets de células resultantes foram ressuspensos em 5 mL de tampão de MACS (Tampão de Corrida autoMACS; Miltenyi Biotec, #130-091-221). As amostras ressuspensas foram filtradas através de um filtro de 70 μm e 1 x 106 células por poço foram plaqueadas em uma placa de 96 poços de fundo em V. As células foram então centrifugadas e os pellets foram lavados em 1X PBS. Após uma segunda centrifugação, os pellets de célula foram ressuspensos em 100 μL de LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain (Life Technologies, #L34957) diluído a 1:1000 em 1X PBS para determinar a viabilidade celular e incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente enquanto protegido da luz. Após uma lavagem em 1X PBS, as células foram incubadas em solução de tampão MACS contendo 10μg/mL de Bloco Fc CD16/CD32 anti-camundongo de rato purificado (Clone: 2.4G2; BD Biosciences, #553142) por 10 minutos a 4°C. As células foram lavadas uma vez e então incubadas na mistura de anticorpo apropriada (descrita na Tabela 16) diluída em tampão MACS por 30 minutos a 4°C enquanto protegidas da luz. Após a incubação do anticorpo, as células foram lavadas duas vezes em tampão MACS, ressuspensas em BD cytofix (BD Biosciences, #554655) e então incubadas por 15 minutos a 4°C enquanto protegidas da luz. As células foram posteriormente lavadas, ressuspensas em tampão MACS, e então transferidas para tubos BD FACS (BD Biosciences, #352235) para análise de eosinófilos, células linfoides inata tipo 2 (ILC2) e linfócitos por citometria de fluxo.

[00170] Células T CD4 ativadas foram definidas como células que foram vivas, CD45+, SSCLo, FSCLo, CD3+, CD19-, CD4+, CD8-, e CD69+. Células B ativadas foram definidas como células que foram vivas, CD45+, SSCLo, FSCLo, CD3-, CD19+, e CD69+. Eosinófilos foram definidos como vivos, CD45+, GR1-, CD11clo, SiglecFhi. Células ILC2 foram definidas como vivas, CD45+, Linhagem- (Linhagem: CD19, CD3, CD11b, CD11c, F4/80), CD127+, Sca-1+, ST2+. Os dados para células CD4 ativadas, expressas em frequência de células ativadas (CD69+) dentro da população parente (CD4, ± SD), são mostrados na Tabela 17. Tabela 16: Anticorpos Usados para Análise de Citometria de Fluxo Análise de infi trado de células pulmonares:

[00171] Como mostrado na Tabela 17, a frequência de células T CD4+ ativadas, eosinófilos e ILC2 nos pulmões de camundongos HumIn IL-33 recebendo HDM por 2 semanas foi significativamente maior do que em camundongos HumIn IL-33 desafiados com 1X controle de PBS. Em contraste, uma tendência para uma frequência reduzida desses infiltrados foi observada em camundongos HumIn IL-33 quando tratados com anticorpo anti-IL-33 durante o curso do desafio HDM agudo em comparação com camundongos HumIn IL-33 administrados com HDM sem tratamento ou com controle de isotipo.

[00172] Uma tendência para um aumento na frequência de células B ativadas foi observada nos pulmões de camundongos HumIn IL33 desafiados com HDM por 2 semanas em comparação com camundongos Humin IL33 desafiados com 1X controle de PBS. Após tratamento com anticorpo anti-IL-33, uma redução significativa na frequência de células B ativadas pulmonares nos pulmões de camundongos HumIn IL33 desafiados com HDM foi observada, em comparação com camundongos HumIn IL-33 administrados HDM sem tratamento ou com controle de isotipo. Tabela 17: Frequência de infiltrado de célula pulmonar como determinado por citometria de fluxo Nota: Significância estatística determinada pelo teste de Kruskal-Wallis One-Way ANOVA com teste post-hoc de comparação múltipla de Dunn é indicado (*= p<0,05, **= p<0,01, em comparação com grupos 1: camundongos HumIn IL33, Desafio solução salina; tp<0,05, comparado ao grupo 3: camundongos Humin IL33, desafio HDM 2 semanas + Anticorpo de isotipo de controle). EXEMPLO 12: Teste de mAb em modelo in vivo; Modelo de fibrose induzida por HDM crônica e inflamação pulmonar grave para estudar o papel de IL-33 em inflamação pulmonar

[00173] Para determinar o efeito de um anticorpo anti-IL-33, H4H9675P, em um modelo in vivo relevante, um estudo de fibrose induzida por HDM e inflamação pulmonar grave foi conduzido em camundongos que foram homozigotos para a expressão de IL-33 humana no lugar de IL-33 de camundongo (camundongos HumIn IL-33).

[00174] Camundongos HumIn IL-33 foram administrados por via intranasal em 50μg de extrato de ácaro de poeira de casa (HDM; Greer, #XPB70D3A2.5) diluído em 20μL de 1X solução salina de fosfato (PBS) ou 20μL de 1X PBS por 5 dias por semana por 12 semanas. Um segundo grupo de controle de camundongos HumIn IL33 foi administrado com 50μg extrato HDM diluído em 20μL de 1X PBS por 5 dias por semana por 4 semanas, para avaliar a gravidade da doença no início do tratamento de anticorpo. Dois grupos de camundongos desafiados com HDM foram injetados por via subcutânea com 25 mg/kg de um anticorpo anti-IL-33, H4H9675P, ou um anticorpo de isotipo de controle começando após 4 semanas de desafio HDM e então duas vezes por semana até o final do desafio HDM (8 semanas de tratamento com anticorpo). No dia 85 do estudo, todos os camundongos foram sacrificados e seus pulmões foram colhidos. Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos são mostrados na Tabela 18. Tabela 18: Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos Colheita de pulmão para análise de citocinas:

[00175] Após a sangria, os lóbulos cranianos e médios do pulmão direito de cada camundongo foram removidos e colocados em tubos contendo uma solução de reagente de extração de proteína de tecido (1X T-PER reagente; Pierce, #78510) suplementado com coquetel de inibidor de protease 1X Halt (Pierce, #78430). Todas as outras medidas foram realizadas no gelo. O volume de Reagente T-PER (contendo o coquetel de inibidor de protease) foi ajustado para cada amostra para coincidir com um tecido 1:8 (p/v) para razão T-PER. Amostras de pulmão foram homogeneizadas manualmente nos tubos, usando macacos descartáveis (Kimble Chase, # 749625-0010). Os lisados resultantes foram centrifugados para detritos de pellet. Os sobrenadantes contendo os extratos de proteína solúvel foram transferidos para tubos frescos e armazenados a 4°C até posterior análise.

[00176] O teor de proteínas totais nos extratos de proteína de pulmão foi medido usando um ensaio de Bradford. Para o ensaio, 10μL de amostras de extrato diluído foram plaqueadas em placas de 96 poços em duplicatas e misturados com 200μL de 1X Reagente Corante (Biorad, #500-0006). Diluições em série de albumina de soro bovino (BSA; Sigma, #A7979), começando com 700μg/mL em reagente 1X T-Per foram usados como um padrão para determinar a concentração de proteína dos extratos. Após uma incubação de 5 minutos em temperatura ambiente, absorbância a 595nm foi medida em um leitor de placa Molecular Devices SpectraMax M5. A análise de dados para determinar o teor de proteína no extrato de pulmão com base no padrão BSA total foi realizada usando software GraphPad Prism™.

[00177] Concentrações de citocinas em extratos de proteína de pulmão foram medidas usando um kit de imunoensaio multiplex Proinflammatory painel 1 (camundongo) (MesoScale Discovery, # K15048D-2), de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 50 μL/poço de calibradores e amostras (diluídas em Diluente 41) foram adicionados para placas pré-revestidas com anticorpos de captura e incubados em temperatura ambiente com agitação a 700 rpm por 2 horas. As placas foram então lavadas 3 vezes com 1X PBS contendo 0,05% (p/v) Tween-20, seguido pela adição de 25μL de Solução de Anticorpo de Detecção diluída em Diluente 45. Após mais 2 horas de incubação em temperatura ambiente com agitação, a placa foi lavada 3 vezes, e 150 μL de 2 X Tampão de Leitura foi adicionado para cada poço. Eletroquimioluminescência foi imediatamente lida em um instrumento MSD Spector®. A análise de dados foi realizada usando software GraphPad Prism.

[00178] Cada concentração de citocina nos extratos de proteína total de pulmão de todos os camundongos em cada grupo foi normalizada para o teor de proteínas total dos extratos medidos pelo ensaio de Bradford, e expressa para cada grupo como pg média de citocina por mg de proteínas de pulmão totais (pg/mg proteína de pulmão, ± SD) como mostrado na Tabela 19. Tabela 19: Concentração de citocinas em extratos de proteínas de pulmão Nota: Significância estatística determinada pelo teste de Kruskal-Wallis One-Way ANOVA com teste post-hoc de comparação múltipla de Dunn é indicado (*= p<0,05, **= p<0,01, em comparação com grupos 1: camundongo HumIn IL33, Desafio de Solução Salina). Análise de citocinas de pulmão:

[00179] O nível das citocinas IL-4 e IL-5 liberadas nos pulmões de camundongos HumIn IL-33 recebendo HDM por 4 e 12 semanas foi significativamente superior do que em camundongos HumIn IL-33 desafiados com 1X PBS. Em contraste, houve uma tendência para os níveis de IL-4 e IL-5 reduzidos nos pulmões de camundongos HumIn IL- 33 tratados com anticorpo anti-IL-33 durante o curso do desafio HDM crônico em comparação com camundongos HumIn IL-33 administrados com HDM sem tratamento ou com controle de isotipo.

Claims (12)

1. Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à interleucina humana 33 (IL- 33), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou atenua a sinalização mediada por IL-33 e compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs)HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 276278-280-284-286-288, respectivamente.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 274; e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 282.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG1 ou IgG4.

4. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido na reivindicação 2 ou 3, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 273 que codifica a HCVR e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 281 que codifica a LCVR.

5. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 4.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

7. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença ou distúrbio inflamatório, ou pelo menos um sintoma associado com a doença ou distúrbio inflamatório, a um paciente em necessidade do mesmo, e/ou para tratar um paciente que demonstra uma sensibilidade a um alérgeno.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio inflamatório é selecionado do grupo que consiste em asma, alergia, anafilaxia, dermatite atópica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, artrite, rinite alérgica, esofagite eosinofílica e psoríase.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio inflamatório é asma, opcionalmente sendo que: (a) a asma é asma eosinofílica ou não eosinofílica; e/ou (b) a asma é resistente a esteroide ou sensível a esteroide.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a asma inclui uma exacerbação da asma.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio inflamatório é doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), opcionalmente em que a COPD resulta de, ou é causada em parte pela fumaça de cigarro.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para uso em combinação com um segundo agente terapêutico útil para aliviar a doença ou distúrbio inflamatório, ou pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio inflamatório, ou para diminuir uma resposta alérgica para um alérgeno, opcionalmente sendo que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em um anti-inflamatório não esteroide (NSAID), um corticosteroide, um dilatador brônquico, um anti-histamínico, epinefrina, um descongestionante, um antagonista de linfopoietina do estroma tímico (TSLP), um antagonista de IL-13, um antagonista de IL-4, um antagonista duplo de IL-4/IL-13, um antagonista de IL-5, um antagonista de IL-6, um antagonista de IL-12/23, um antagonista de IL-22, um antagonista de IL-25 , um antagonista de IL- 17, um antagonista de IL-31, um inibidor oral de PDE4 e outro antagonista de IL-33 ou um anticorpo diferente para IL-33.