JP5566374B2 - 形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬 - Google Patents

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Description

本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に関する新たな知見を提供する。より詳細には、本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に有効な新たな標的分子に関する知見を提供する。本発明は、そのような知見に基づく、新たな形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬及び治療方法に関する。また、本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に有効な成分のスクリーニング方法に関する。更に、本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患のモニタリング用試薬又はキットに関する。
形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患とは、骨髄に存在する形質細胞が癌化し、単クローン性に増殖する疾患である。かかる疾患の代表例である多発性骨髄腫の場合、異常な形質細胞（骨髄腫細胞）が体中の骨髄に広がり、全身の骨髄の至るところで増殖する。異常な形質細胞（骨髄腫細胞）が増えることにより、骨が破壊されるなど、様々な症状が現れる。骨髄腫細胞からは、異常免疫グロブリンであるＭタンパク質が産出され、血中のＭタンパク質濃度が上昇することにより、血液が粘稠になる。Ｍタンパク質は、体内に侵入した病原体などの異物を認識するという本来の抗体としては機能しないため、免疫力の低下をも引き起こす。これらが多くの臓器に影響を与え、様々な徴候が生じる。代表的な徴候は、骨の痛みと損傷、高カルシウム症、腎障害や腎不全、貧血等である。
多発性骨髄腫は、全ての癌のおよそ１％を占め、全ての血液学的悪性腫瘍の10％強を占める。よって、その有効な治療薬が求められている。現在、多発性骨髄腫の治療として、メルファランとプレドニゾンとの併用やサリドマイド等の化学療法や造血幹細胞移植が主に行われている。しかし、骨髄腫細胞は、ほとんどの場合、やがてこれらの化学療法剤に対して抵抗性を獲得する。このため、現在の治療手段では、発症後の平均生存期間は３〜５年程度であり、骨髄腫患者の予後は厳しいのが現実である。また、これらの治療薬は、標的とする腫瘍細胞にだけ特異的に作用するものではないため、正常な細胞に対しても毒性を示し、結果として重篤な副作用を伴うという問題がある。
多発性骨髄腫等の形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患が非常に難治性である一つの理由として、骨髄腫形質細胞の前駆体である骨髄腫幹細胞が治療によって排除されないことが考えられている（非特許文献１及び２）。骨髄腫幹細胞はCD19+細胞分画に存在するため、CD19と同様のパターンで高発現しているCD20に対する抗体（リツキシマブ）を用いた多発性骨髄腫の治療が試みられているが、現在までに十分な治療効果が得られたという報告はない（非特許文献３）。この他にも抗体を利用した多発性骨髄腫の治療法の開発が試みられてきた。例えば、ＩＬ−６は多発性骨髄腫細胞の主要な増殖因子であると考えられており（非特許文献４及び５）、ＩＬ−６シグナル伝達系を阻止することを目的として、ＩＬ−６又はＩＬ−６レセプターに対する中和抗体を用いた多発性骨髄腫の治療薬の開発が試みられた。しかし、形質細胞白血病化した患者において骨髄腫細胞の増殖抑制が観察されたものの、腫瘍が再発し臨床的な有効性は得られていない（非特許文献６及び７）。さらに、いくつかの抗原分子（例えば、CD19（非特許文献８）、CD20（非特許文献９）、CD38（非特許文献１０））、CD54 （非特許文献１１）、CD138（非特許文献１２）、Ｍｕｃ−１（非特許文献１３）等）が抗体治療における有効な標的となり得るという報告もなされているが、実用的な治療薬の開発には至っていない。
Matsui, W., et al., Blood，2004．103:2332-6． Matsui, W., et al., Cancer Res, 2008. 68:190-7. Kapoor, P., et al., Br J Haematol., 2008. 141:135-48 Kawano et al., Nature., 1988. Vol.332: 83 Klein et al., Bloold., 1991. Vol.73: 517 Bataille et al., Blood., 1995. Vol.86: 68 Van Zaanen et al., Br J Haematol., 1998 Vol.102:783 Grossbard et al., Br J Haematol., 1998. Vol.102:509 Hussein et al., Blood., 1999. Blood., 1999, Vol.94 [Suppl.1]：313 Maloney et al., Semin Hematol., 1999 Vol.36［Suppl.］:30 Huang et al., Cancer Res., 1995 Vol.55: 610 Wijdenes et al., Br J Haematol., 1996 Vol. 94: 318 Treon et al., Blood., 1999 Vol.93: 1287
本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に有効な新たな治療薬を提供することを目的とする。また、本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に関する新たな知見を提供することを目的とする。
本発明者らは、上述する現状の下、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の根治的な治療を実現すべく多発性骨髄腫を代表例としてその治療方法について鋭意検討を重ねた結果、後述する実施例３及び４に示すように、ヒトCD48が骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞の細胞表面に一貫して発現しており、且つ、造血幹細胞では発現していない分子であることを見出した。また、ヒトCD48は、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞だけでなく成熟骨髄腫形質細胞にいたるまで、高発現し続けていることを見出した。この知見に基づいて、本発明者らはさらに研究を重ね、細胞傷害活性を有し、ヒトCD48を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成し、当該抗体を骨髄腫細胞を移植した動物に投与することにより、骨髄腫細胞の増殖が抑制出来ることを確認した。斯かる結果により、ヒトCD48を発現する細胞を標的として当該細胞を死滅させるかまたはその増殖を抑制することにより、多発性骨髄腫をはじめとする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の根治的な治療が可能であることを確認した。本発明は、以上のような知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明は、以下の態様の発明を包含する。
Ｉ．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬
（I-1）ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を含み、ヒトCD48を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有することを特徴とする、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬。
（I-2）上記ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（抗ヒトCD48モノクローナル抗体）そのものが細胞傷害活性を有するものである、（I-1）に記載の治療薬。
（I-3）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、細胞傷害活性を有する物質を結合してなるものである、（I-1）に記載の治療薬。
（I-4）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する物質が結合したものを有効成分として含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬。
（I-5）細胞傷害活性を有する物質及びその運搬体として抗ヒトCD48モノクローナル抗体を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬。
（I-6）細胞傷害活性を有する物質が、抗がん作用を有する物質である（I-3）乃至（I-5）のいずれかに記載する治療薬。
（I-7）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(a)〜(c)のいずれかの抗体である（I-1）乃至(I-6)のいずれかに記載する治療薬：
（a）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（b）（a）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（c）配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
（I-8）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(d)〜(f)のいずれかの抗体である（I-1）乃至(I-6)のいずれかに記載する治療薬：
（d）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（e）（d）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（f）上記（d）に記載するモノクローナル抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
（I-9）形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患が多発性骨髄腫である（I-1）乃至（I-8）のいずれかに記載する治療薬。
II．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分をスクリーニングする方法
（II-1）以下の工程：
（１）ヒトCD48に特異的に結合する物質を選別する工程；及び
（２）細胞傷害活性を有する物質を選別する工程；
を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分をスクリーニングする方法。
III．腫瘍性形質細胞の同定方法
（III-1）形質細胞の腫瘍増殖をきたす疾患に罹患した患者から採取した試料に、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（抗ヒトCD48モノクローナル抗体）を作用させる工程を含む、腫瘍性形質細胞を同定する方法。
（III-2）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(a)〜(c)のいずれかの抗体である（III-1）に記載する方法：
（a）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（b）（a）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（c）配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
（III-3）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(d)〜(f)のいずれかの抗体である（III-1）または(III-2)に記載する方法：
（d）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（e）（d）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（f）上記（d）に記載するモノクローナル抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
IV．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の進行または治療効果のモニタリング用試薬又はキット
（IV-1）ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（抗ヒトCD48モノクローナル抗体）を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患のモニタリング用試薬又はキット。
（IV-2）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(a)〜(c)のいずれかの抗体である（III-1）に記載する試薬又はキット：
（a）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（b）（a）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（c）配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
（IV-3）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、下記(d)〜(f)のいずれかの抗体である（IV-1）または(IV-2)に記載する試薬又はキット：
（d）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体、
（e）（d）に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
（f）上記（d）に記載するモノクローナル抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
V．抗ヒトCD48モノクローナル抗体
（V-1）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（抗ヒトCD48モノクローナル抗体）。
（V-2）上記(V-1)に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識することを特徴とする抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（V-3）配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（V-4）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
（V-5）上記(V-4)に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識することを特徴とする抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（V-6）上記（V-4）に記載するモノクローナル抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体。
VI．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療方法
（VI-1）（I-1）〜（I-9）のいずれかに記載する治療薬を形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患に罹患した患者に投与する工程を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療方法。
（VI-2）形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患が多発性骨髄腫である（VI-1）に記載する治療方法。
VII．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療のための使用
（VII-1）形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を治療するために使用される、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（抗ヒトCD48モノクローナル抗体）。
（VII-2）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体である、（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-3）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、上記(VII-2)に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体である（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-4）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体である、（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-5）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖定常領域、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体である、（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-6）上記抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、上記(VII-5)に記載するモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体である（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-7）上記（VII-5）に記載するモノクローナル抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る重鎖可変領域及び配列番号３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域を有し、ヒトCD48に対して特異的結合性を有するモノクローナル抗体である、（VII-1）に記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-8）上記ヒトCD48モノクローナル抗体が、細胞傷害活性を有するものである、（VII-1）乃至（VII-7）のいずれかに記載する抗ヒトCD48モノクローナル抗体。
（VII-9）形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬を製造するための、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体の使用。
本発明の治療薬及び治療方法によると、CD48を標的とすることにより、成熟した骨髄腫細胞だけでなく、将来的に骨髄腫細胞へと分化する蓋然性の高い未分化な一連の骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞を標的とすることができる。そして、それらの標的細胞を死滅及び／又は増殖抑制することにより、骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞から骨髄腫細胞への新たな分化を遮断することができる。さらにCD48は成熟骨髄腫形質細胞にも発現しているため、本発明の治療薬及び治療方法によれば、成熟骨髄腫形質細胞も死滅及び／又は増殖抑制することができる。よって、本発明の治療薬は、多発性骨髄腫をはじめとする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療、特に根治的治療に有効に用いることが出来る。また、本発明の治療薬は、造血幹細胞に対する親和性が低いため、造血幹細胞が攻撃されることに起因する安全性の問題も緩和されている。
本発明のスクリーニング方法によると、ヒトCD48に対する結合性及び細胞傷害活性を指標とすることにより、簡便に形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療に有効な成分を効率的に得ることが可能である。また、本発明の方法により、簡便且つより正確に腫瘍性形質細胞を同定することができ、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患のモニタリングを行うことも可能である。
骨髄腫幹細胞分画、骨髄腫前駆細胞分画、および成熟骨髄腫細胞分画に含まれる細胞の形態的特徴をMay-Giemsa染色にて示す。 フローサイトメトリー・セルソーティングによる、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞の分離、およびそれらに共通して高発現する細胞表面分子の同定のストラテジーを示す。 CD48分子及びMMSC2〜MMSC4分子の骨髄腫幹細胞分画及び骨髄腫前駆細胞分画におけるmRNAレベルでの発現比率を示す。 CD48分子及びMMSC2〜MMSC4分子の骨髄腫幹細胞分画、骨髄腫前駆細胞分画、骨髄腫形質細胞分画、および造血幹／前駆細胞分画におけるタンパク質レベルでの発現解析結果を示す。 骨髄腫患者10症例（UPN4〜13）由来の各細胞分画（骨髄腫幹細胞分画、骨髄腫前駆細胞分画、造血幹細胞分画、および造血前駆細胞分画）におけるCD48分子の発現パターンを示す。 抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）の重鎖可変部領域の塩基配列及びアミノ酸配列並びにCDR1〜3の位置を示す。 抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）の軽鎖（κ鎖）可変部領域の塩基配列及びアミノ酸配列並びにCDR1〜3の位置を示す。 骨髄腫細胞株OPM2及びU266におけるCD48分子の発現を示す。Isotype（マウスIgG2a）での染色によるシグナルを対照として示している。 抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）の骨髄腫細胞株OPM2及びU266に対する補体依存性細胞傷害活性を示す。 Rag2-/-cγ-/-マウス（抗CD48抗体投与群、コントロールIgG投与群）に皮下移植した骨髄腫細胞株が形成する腫瘤の体積変化を示す。 Rag2-/-cγ-/-マウス（抗CD48抗体投与群、コントロールIgG投与群）の１２日目の腫瘍の大きさを示す。矢印は腫瘍の幅を示す。 Rag2-/-cγ-/-マウス（抗CD48抗体投与群、コントロールIgG投与群）について、抗CD48抗体またはマウスIgGの投与前後での骨髄腫細胞のキメリズムの変化を示す。 健常人由来骨髄細胞各分画でCD48発現レベルを比較した結果を示す。 抗CD48抗体（1B4）あるいはマウスIgGと補体の存在下に、健常人由来CD34陽性造血前駆細胞を培養して得られた各種のコロニー形成細胞の数を示す。 骨髄腫患者における骨髄腫細胞同定のためのCD48及びCD38共染色フローサイトメトリー解析結果を示す。
骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞の分類及び定義
本明細書において、骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞とは、成熟した骨髄腫形質細胞（腫瘍性形質細胞）に分化する前段階であり、且つ、後に骨髄腫形質細胞へと分化する性質を有する細胞を意味する。骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞は、その分化の段階に応じて分類することができる。図１に、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞、及び成熟した骨髄腫形質細胞をMay-Giemsa染色した写真を示す。骨髄腫幹細胞となった骨髄B細胞は、後に骨髄腫前駆細胞を経た後、成熟骨髄腫形質細胞となる。
「骨髄腫幹細胞（CD19+骨髄腫幹細胞）」は、表面抗原分子であるCD19の発現によって特徴付けられる。よって、本明細書において、骨髄腫幹細胞は「CD19+細胞」と表記される場合もある。
「骨髄腫前駆細胞（CD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞）」は、CD19+骨髄腫幹細胞から分化して骨髄腫形質細胞に分化する直前の段階の前駆細胞であり、CD38が強発現しているが、成熟形質細胞に特異的なマーカーであるCD138の発現がないことによって特徴付けられる。一方、CD19の発現は見られない。よって、骨髄腫前駆細胞は、「CD19−CD38＋＋CD138−細胞」と表記される場合もある。
「骨髄腫形質細胞」は、一般には骨髄腫細胞とも呼ばれ、異常免疫グロブリンであるＭタンパクを産生する細胞である。骨髄腫形質細胞では、CD38の強発現に加え、CD138が発現している。一方で、CD19の発現は見られない。よって、骨髄腫形質細胞は、「CD19−CD38＋＋CD138+細胞」と表記される場合もある。本明細書において、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞とは、各々多発性骨髄腫以外の形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患における腫瘍幹細胞、腫瘍前駆細胞、腫瘍性形質細胞をも意味する。
「造血幹細胞」は、あらゆる血球系細胞へと分化可能な細胞である。造血幹細胞は、CD34の発現によって特徴付けられる。よって、本明細書において造血幹細胞は、「CD34＋細胞」と表記される場合もある。
本発明において、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患とは、異常な形質細胞の腫瘍性増加とそれらより分泌される異常蛋白の増加によって特徴づけられる疾患である。形質細胞の腫瘍性増殖の具体例としては、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、形質細胞腫、H鎖病、全身性AL型アミロイドーシスを挙げることが出来る。本発明の治療薬の治療対象となる疾患は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患であれば特に制限されないが、好ましくは、多発性骨髄腫である。
I．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬及び治療方法
本発明の形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬は、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を含み、ヒトCD48を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有することを特徴とする。
I−I．ヒトCD48に対するモノクローナル抗体
ヒトCD48に対するモノクローナル抗体（以下、「抗ヒトCD48モノクローナル抗体」と称する場合もある。）とは、ヒトCD48に対して特異的に結合するモノクローナル抗体である。ヒトCD48は、後述する実施例３及び４で示されるように、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞の細胞表面に一貫して発現しているが、造血幹細胞ではその発現は全くないか僅かである。よって、ヒトCD48を標的とすることにより、正常なリンパ球等を供給する造血幹細胞を標的とすることなく、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を標的とすることができる。抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトCD48に対して特異的に結合する抗体であるため、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を特異的に認識し、結合することができる。従って、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、多発性骨髄腫をはじめとする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療、好ましくは根治的治療において、処置されるべき細胞の標的化に好適な抗体である。即ち、抗ヒトCD48モノクローナル抗体と細胞傷害活性とを組み合わせることによって、当該活性を骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞に特異的に作用させることができる。
このようにヒトCD48に対する親和性により、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を認識し、結合するという性質を有する限り、本発明が対象とする抗ヒトCD48モノクローナル抗体には各種の抗体が含まれる。例えば、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒト化抗体等の改変型抗体であってもよく、またそのフラグメント（例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びscFv等）であってもよい。
好ましい抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、例えば、後述する実施例４で作製されたモノクローナル抗体（以下、「1B4抗体」と呼ぶ場合もある。）であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖定常領域のアミノ酸配列として配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域のアミノ酸配列として配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する。1B4抗体は、その配列情報を元に当該技術分野において公知の遺伝子工学的手法又は化学的なペプチド合成法を用いて製造することができる。
他の好ましいモノクローナル抗体は、1B4モノクローナル抗体と同一のエピトープを認識する抗体、特に同一のエピトープに結合することができるモノクローナル抗体である。ある抗体が他の抗体と同一のエピトープを認識するか否かは、両者のエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、競合結合アッセイによって評価することができ、その手段として酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光エネルギー転移測定法（FRET）や蛍光微量測定技術（FMAT(登録商標)）などが挙げられる。抗原に結合した該抗体の量は、同一のエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被検抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち、同一のエピトープに対する被検抗体の量や親和性が大きくなるほど、該抗体の抗原への結合量は低下し、抗原への被検抗体の結合量は増加する。具体的には、抗原に対し、適当な標識をした該抗体と評価すべき抗体を同時に添加し、標識を利用して結合している該抗体を検出する。抗原に結合した該抗体量は、該抗体を予め標識しておくことで、容易に測定できる。この標識は特には制限されないが、手法に応じた標識方法を選択する。標識方法は、具体的には蛍光標識、放射標識、酵素標識などが挙げられる。
例えば、ヒトCD48を固相化したビーズに蛍光標識した該抗体と、非標識の該抗体あるいは被検抗体を同時に添加し、標識された該抗体を蛍光微量測定技術によって検出する。
ここでいう「同一のエピトープを認識する抗体」とは、標識該抗体に対して、非標識の該抗体の結合により結合量を50％低下させる濃度（IC50）に対して、被検抗体が非標識該抗体のIC50の通常、100倍、好ましくは80倍、さらに好ましくは50倍、さらに好ましくは30倍、より好ましくは10倍高い濃度で少なくとも50％、標識該抗体の結合量を低下させることができる抗体である。
このようなモノクローナル抗体の例として、例えば、以下（Ａ）及び（Ｂ）の抗体を挙げることができる。
（Ａ）抗体：1B4抗体を構成するアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる抗体
（Ｂ）抗体：1B4抗体全体を構成するアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる抗体。
上記（Ａ）抗体において、複数のアミノ酸とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個、より更に好ましくは２又は３個である。アミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加される位置は、抗体が1B4抗体と同一のエピトープを特異的に認識する限り制限されないが、好ましくは図６及び７に示される重鎖及び軽鎖の各CDR1〜CDR3以外の領域であり、より好ましくは、定常領域である。1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加は、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されるような公知の方法に従って行うことができる。
上記（Ｂ）抗体のアミノ酸配列の同一性は、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上である。好適な一実施形態において、上記（Ｂ）抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する重鎖可変領域を有し、また配列番号３のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する軽鎖可変領域を有する。更に他の好適な実施形態において、上記（Ｂ）抗体は、重鎖及び軽鎖の各CDR1〜CDR3について1B4抗体と同一のアミノ酸配列を有する。
アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、いずれのイムノグロブリンクラス及びサブクラスに属する抗体であってもよいが、好ましくはヒトイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体である。好ましいクラス及びサブクラスはイムノグロブリンＧ（IgG）であり、より好ましくはヒトIgG1である。
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されるような公知の方法に従って作製することができる。具体的な製造方法については後述する。また、幾つかの抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、商業的に入手することが可能であり、それらを適宜選択・調製して使用することも可能である。
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトに対する抗原性を軽減するという観点から、好ましくはヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物抗体の可変領域（又は超過変領域）以外の部分をヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列に置き換えたキメラ抗体であり、ヒトCD48に対する親和性を保持しつつ、ヒトに対する抗原性が軽減された抗体である。ヒト化モノクローナル抗体は、公知の手法に従って作製することができる。
抗ヒトCD48モノクローナル抗体の製造方法
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトCD48を用いて動物を免疫することによって作製できる。以下、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体の製造方法を具体的に示す。
（１）ヒトCD48の取得
まず、ヒトCD48をコードするcDNAを含むDNA断片を適当な発現ベクターに挿入し、組換えベクターを作成する。これを発現ベクターに適合した宿主細胞に導入して、形質転換体を得る。ヒトCD48をコードするDNAは公知であり（例えば、データベースNCBI Genbank、アクセッション番号NM_001778.2）、また商業的に入手することもできる。宿主細胞としては、ヒトCD48を発現可能である限り、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の任意の細胞を使用することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞中でCD48をコードするDNAを転写することができる適当なプロモーターを有するものであれば、任意の発現ベクターを使用できる。組換えベクターの宿主への導入は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の公知の方法を適宜選択して行うことが出来る。
得られた形質転換体を適当な培地で培養し、ヒトCD48を発現させ、それを採取することによりヒトCD48を得ることができる。ヒトCD48に対する抗体を作製するための免疫原としては、ヒトCD48そのものだけでなく、ヒトCD48を発現する形質転換細胞をそのまま用いてもよく、必要に応じて単離・精製して使用してもよい。
また、ヒトCD48は、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）や Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）などの化学合成法を用いて製造することもできる。
（２）ヒトCD48を用いた免疫
上記のようにして得られたヒトCD48を抗原として動物を免疫し、脾臓やリンパ節から抗体産生細胞を採取する。被免疫動物の種類は特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、サル、ブタ、ウマ等から適宜選択することができる。免疫は、動物の皮下、静脈内、又は腹腔内にヒトCD48抗原を投与することにより行うことができる。抗原と共に適当なアジュバントを添加して、被免疫動物の抗原への免疫応答性を高めてもよい。免疫は、通常一度目の抗原投与の後、4日〜2週間の間隔をあけて2〜5回行う。各抗原投与後3〜7日目に眼底静脈叢から採血し、その血清を用いてヒトCD48との反応性を測定し、十分な抗体価を示した被検動物を抗体産生細胞の供給源として用いることができる。
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを作成し、これを培養することによって得ることができる。抗体産生細胞は、十分な抗体価を示すことが確認された動物の脾臓から得ることができる。骨髄腫細胞の由来は特に制限されないが、被免疫動物と同種の動物を使用することが好ましい。例えば、マウスを被免動物として抗体産生細胞を得た場合、マウス由来の株化細胞（例えば、BALB /cマウス由来骨髄腫細胞株）を使用することが好ましい。
（３）細胞融合
細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法（PEG法）、センダイウイルスを用いる方法及び電気融合装置を用いる方法等の公知の方法を用いて行うことができる。PEG法を用いる場合、約30〜60％のPEG（平均分子量1000〜6000）を含む適当な培地又は緩衝液中に抗体産生細胞と骨髄細胞を、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝5〜10：1となるように混合し、約25〜37℃、ｐH6〜8の条件下で約30秒〜3分間反応させることにより融合させることができる。
ハイブリドーマの選抜は、融合後の細胞を選択培地で培養することにより行うことができる。選択培地としては、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖し得る培地であれば特に限定されない。通常は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）が使用される。細胞融合反応終了後、細胞を洗浄し、PEG溶液を除いた後、選択培地培養で2または3日毎に培地交換を繰り返しながら培養することでハイブリドーマの選抜が可能である。
最後に、選抜したハイブリドーマについて、下記のような方法により、ヒトCD48に対する親和性を検定し、抗ヒトCD48モノクローナル抗体を得ることができる。
（４）ヒトCD48に対する親和性の測定
モノクローナル抗体及びそのフラグメントのCD48に対する親和性は、当該技術分野において公知の任意の方法によって測定することが可能である。例えば、次のような方法で測定することができる。まず、ヒトCD48を発現している細胞とヒトCD48を発現していない細胞という二種類の細胞を用意する。これら二種類の細胞は、ヒトCD48の発現の有無を除いて同一である。次いで、各細胞に蛍光標識した被検抗体又はそのフラグメントを与え、細胞と抗体又はそのフラグメントとの結合の有無をフローサイトメトリーを用いて測定する。ヒトCD48を発現する細胞にのみ結合する抗体は、ヒトCD48に対する特異的な親和性を有し、そうでない抗体はヒトCD48に対する特異的親和性がないか低い抗体である。また、フローサイトメトリーで検出する蛍光シグナルの強弱により、モノクローナル抗体のCD48に対する親和性の程度を測定することができる。
フローサイトメトリーを用いる方法の他、免疫学的測定法を用いて、親和性を測定することもできる。この場合、精製ヒトCD48をマイクロタイタープレートにコートし、各ウェルに被検抗体又はそのフラグメントを第一抗体として添加し、反応させる。次いで、第一抗体を認識可能であり、且つ、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、又はビオチン等で標識した抗体（第二抗体）を添加し、第一抗体と反応させる。その後、第二抗体の標識を指標として、被検抗体又はそのフラグメントとヒトCD48との親和性を測定することができる。
（５）ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトに対する抗原性を軽減するという観点から、好ましくはヒト化抗体である。ヒト化抗体（ヒト化抗ヒトCD48モノクローナル抗体）は、当該技術分野に公知である任意の方法に従って作成することが可能である。例えば、まずヒトCD48に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをヒト以外の動物細胞を用いて作成する。次いで、当該ハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域（又は超過変領域）のアミノ酸配列をコードするDNA断片を取得する。これを任意のヒト由来抗体の可変領域（又は超過変領域）以外のアミノ酸配列をコードするDNAと結合させてヒト化抗体をコードするDNAを作成する。最後にこのDNAを適切な動物細胞発現用ベクターを用いて動物細胞中で発現させることによって得ることが出来る。
より具体的には、配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードするcDNA断片と配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードするcDNA断片を、キメラ抗体作製用ベクター（例えば、Reff ME et. al. Blood 83 435-445, 1994に記載の発現用ベクター）に挿入し、CHO細胞に遺伝子導入し発現させることにより、抗ヒトCD48キメラ化抗体の作製が可能である。このようなヒト化に使用できる具体的なヒトIgH gamma1抗体のＨ鎖定常部及びＬ鎖定常部のアミノ配列の例を以下に示す。
ヒトIgH gamma1抗体のＨ鎖定常部のアミノ酸配列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号７）。
ヒトIgH gamma1抗体のＬ鎖定常部のアミノ酸配列：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号８）
定常領域だけでなく超可変領域（CDR1,2,3）以外の部分をすべてヒト由来の配列に置換することにより、より抗原性の低いヒト化抗体の作製も可能である。
（６）抗ヒトCD48モノクローナル抗体のフラグメントの取得方法
抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトCD48に対する親和性を有する限りそのフラグメントであってもよい。抗ヒトCD48モノクローナル抗体のフラグメントとしては、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びscFv等を挙げることが出来る。
Fabフラグメントとは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、L鎖とH鎖とがジスルフィド結合によって結合した断片である。よって、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のFabフラグメントは、抗ヒトCD48モノクローナル抗体をパパインで処理することによって得ることができ、また抗ヒトCD48モノクローナル抗体のFabフラグメント部分をコードするDNAを任意の発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞にて発現させることによって得ることができる。
F(ab’)2フラグメントは、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理することによって得られる、２個のFabフラグメントがヒンジ領域のジスルフィド結合で結合したフラグメントであり、抗原に対する親和性を保持している。よって、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のF(ab’)2フラグメントは、抗ヒトCD48モノクローナル抗体をペプシンで処理することによって得ることができる。
Fab’フラグメントは、上記F(ab’)2フラグメントのヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断することによって得られる、完全長の軽鎖とN末端からヒンジ領域までの重鎖とがジスルフィド結合によって結合したフラグメントであり、抗原に対する親和性を保持している。よって、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のFab’フラグメントは、上記F(ab’)2フラグメントを、例えば、ジチオスレイトール等の還元剤で処理してヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得ることができる。また、Fab’フラグメントをコードするDNAを任意の発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞にて発現させることによって得ることもできる。
scFvフラグメントは、軽鎖と重鎖の可変領域をペプチドリンカーを用いて結合させたフラグメントであり、抗原に対する親和性を保持しているフラグメントである。よって、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のFab’フラグメントは、抗ヒトCD48モノクローナル抗体をコードするcDNAからscFvフラグメントをコードするDNAを、リンカーの長さが好ましくは８アミノ酸以下となるように構築し、これを任意の発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞にて発現させることによって得ることが出来る。
以上のようにして得られる抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を認識することができる。そこで、抗ヒトCD48モノクローナル抗体が、当該認識能力に加えて、細胞傷害活性を有することができれば、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を死滅及び／又は増殖抑制することができ、骨髄腫を代表とする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分として有効に用いることができる。
このような細胞認識能力と細胞傷害活性との組み合わせは、（１）それ自体が細胞傷害活性を有する抗ヒトCD48モノクローナル抗体を用いるか、又は（２）抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する別の物質を結合させことによって可能である。以下、それぞれの実施形態について説明する。
I−II．細胞傷害活性を有する抗ヒトCD48モノクローナル抗体を含む治療薬
一実施形態において、本発明は、ヒトCD48に対する抗体そのものが細胞傷害活性を有するモノクローナル抗体（以下、「抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体」とも称する。）を有効成分として含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬である。
I−II−I．抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体
抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体は、前述する抗ヒトCD48モノクローナル抗体であり、且つ、細胞傷害活性を有する抗体である。ここで、「細胞傷害活性」とは、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を死滅及び／又は増殖抑制することができる性質を意味する。よって、そのような効果が奏される限り、その作用・機構は特に制限されない。例えば、当該活性は、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ADCC）、アポトーシス誘導作用、およびリガンド結合の遮断による生存シグナルの阻害等のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせにより奏される。
本発明が対象とする抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体には、それが細胞傷害活性及びCD48に対する親和性を有する限り、各種の抗体が含まれる。例えば、ヒト化抗体等の改変型抗体であってもよく、またそのフラグメント（例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びscFv等）であってもよい。好ましい抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体の例としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖定常領域のアミノ酸配列として配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖定常領域のアミノ酸配列として配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を挙げることができる。他の好ましいモノクローナル抗体は、1B4モノクローナル抗体と同一のエピトープを認識する抗体、特に当該抗体と同一のエピトープに結合することができるモノクローナル抗体であり、具体的には、上記I−Iに記載するモノクローナル抗体を挙げることができる。
抗体が細胞傷害活性を有するか否かは、公知の方法に従って測定することができる。例えば、以下の方法で補体依存性細胞傷害活性又は抗体依存性細胞傷害活性を測定することができる。
I−II−II．補体依存性細胞傷害活性（CDC）の測定方法
補体依存性細胞傷害活性は、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って行うことができる。例えば、標的細胞となる骨髄腫細胞を10％FCS添加のRPMI1640培地にて培養し、細胞数が0.5×10４〜1.0×10４個となるように調製する。これに適量のNa2 51CrO4を加え、37℃で1時間反応させ、細胞を51Crでラベル化し、洗浄したものを標的細胞とする。ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁した被検抗体又はコントロールとなるアイソタイプ抗体を終濃度0.5〜50μg/mLとなるように96ウェルプレートに加え、次いで前記標的細胞と補体とを加えて1.5時間反応させる。反応液を遠心分離し、上清に放出された51Crをγ−カウンターにて測定する。CDC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。

CDC活性＝｛（[実験に用いた細胞からの51Cr 放出]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
I−II−III．抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）の測定方法
抗体依存性細胞傷害活性は、Brunner K.T.らの方法（Brunner, K.T., et al., Immunology, 1968. 14:181-96）に従って行うことができる。例えば、標的細胞は上記補体依存性細胞傷害活性の測定の場合と同じ51Crで標識された骨髄腫関連細胞を使用することが出来る。エフェクター細胞としては、SCID マウスの骨髄細胞を10％のFBS、10ng/mlのマウスGM-CSF、及び40IU/mlのヒトIL2を添加したRPMI1640中で６日間培養したもの等を使用することができる。96ウェルプレートに抗体又はコントロールとなるそのアイソタイプ抗体を終濃度0.05〜10μg/mLとなるように添加し、さらに標的細胞（1.0×10４個）及びエフェクター細胞（5×10５個）を添加する。37℃で4時間反応させ、遠心分離後、上清に放出された５１Crをγ−カウンターにて測定する。ADCC活性は、以下の式に基づいて求めることが出来る。
ADCC活性＝｛（[実験に用いた細胞からの51Cr 放出]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
細胞傷害活性を有するヒトCD48に対する抗体は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体を作製し、上記方法を用いて細胞傷害活性の有無を評価し、当該活性を有する抗体を選抜することによって得ることが出来る。
抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体は、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞に特異的に結合することができ、且つ、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を死滅及び／又は増殖抑制することが可能であるため、多発性骨髄腫を代表とする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬、特に根治的治療薬の有効成分として有用である。
本実施形態における本発明の治療薬は、有効成分として、抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体のみを含有してもよいが、必要に応じて、薬学的に許容される１種以上の添加剤、例えば、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、付形剤及び担体のうち１種又は複数を更に含んでいてもよい。また、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。適切な担体には、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに当該分野において周知であるアミノ酸、糖類、界面活性剤等の安定化剤、表面への吸着防止剤を含んでいてもよい。製剤の形態としては、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
本発明の治療薬の投与経路は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療効果が奏される限り、経口投与及び非経口投与（例えば、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内）のいずれを用いてもよい。有効成分に抗体を含有するため、非経口投与が好ましく、更に好ましくは静脈内投与である。よって好ましい投与形態は、注射剤である。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
本発明の治療薬の投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、多発性骨髄腫を罹患した成人患者に対して、１日当たり通常50μg〜0.5mg/kgの割合で投与することができる。
I−III．抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する物質が結合したものを含む治療薬
一実施形態において、本発明は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する物質が結合したものを有効成分として含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬である。
本実施形態における治療薬の有効成分は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する物質が結合したものである。上述するように、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を特異的に認識する。よって、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に、細胞傷害活性を有する物質を結合させることによって、当該物質を骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞に運搬し、これらの細胞に特異的に作用させることが可能である。換言すれば、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に細胞傷害活性を有する物質を結合することにより、当該物質が非特異的に作用することを防止することができる。従って、本発明により、細胞傷害活性を有する物質が上記細胞以外の細胞に非特異的に作用することに起因する副作用を回避しながら、多発性骨髄腫を代表とする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を治療することが可能である。
本実施形態において使用される抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトCD48に対する親和性を有するものであれば特に制限されず、上述するような各種のモノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体等の改変型抗体やそのフラグメント）が含まれる。発明の性質上、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、それ自体が細胞傷害活性を有する必要はないが、細胞傷害活性を有するモノクローナル抗体であってもよい。
I−III−I．細胞傷害活性を有する物質
細胞傷害活性を有する物質は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に結合して骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫細胞に向けて運搬された場合に、これらの細胞を死滅及び／又は増殖抑制することができる性質を有する物質である。骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞への標的化ないし運搬は、当該抗体によって為されるため、細胞傷害活性を有する物質は、細胞傷害活性を有する限り、それ自体が骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫細胞に特異的に作用するものでなくてもよい。ここで、細胞傷害活性とは、細胞を死滅及び／又は増殖抑制することができる性質を意味する。このような作用が奏される限り、その機序は特に制限されず、任意の物質を使用することができるが、代表的な細胞傷害活性を有する物質は、抗がん剤として知られる化合物である。具体的には、シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブを挙げることができる。これらの中でも、好ましくは、カリケアマイシン、メルファラン、ビンクリスチン硫酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、プレドニゾロン、デキサメサゾン、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブであり、より好ましくは良好な抗体への結合の実績のあるカリケアマイシンである。上記に列挙した細胞傷害活性を有する物質は、いずれも商業的に入手可能である。細胞傷害活性を有する物質は、１種又は２種以上の物質を選択し、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に結合させて使用することができる。
あるいは、放射性同位元素、例えば、90-Ittrium等を抗ヒトCD48モノクローナル抗体に結合させて使用することも可能である。
I−III−II．細胞傷害活性を有する物質と抗体との結合方法
細胞傷害活性を有する物質と抗ヒトCD48モノクローナル抗体とは、当該物質の細胞傷害活性及び当該抗体のCD48に対する親和性とを損なわない限り、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて結合することができる。当該物質と抗体とは、直接的に結合されてもよく、リンカー等を介して間接的に結合してもよい。結合は、共有又は非共有結合（例えばイオン結合）のいずれでもよい。例えば、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）又は配位性基を利用し、該反応性基と反応して結合を形成しうる官能基（細菌毒素、化学療法剤の場合） 又は該配位性基との間で錯体を形成しうるイオン性基（放射性核種の場合） をもつ細胞傷害活性物質と抗体とを接触させることによって結合することができる。また、複合体の形成に際してビオチン及びアビジンを利用することも可能である。細胞傷害活性物質がタンパク質又はペプチドである場合は、遺伝子工学的手法により抗体と前記タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として生産することも可能である。抗体の親和性を維持する観点から、例えば、Fcフラグメントに存在するアミノ酸を介して抗体と細胞傷害活性を有する物質とを結合することが好ましい。
このようにして細胞傷害活性を有する物質と抗ヒトCD48抗体とを結合させることによって本発明の治療薬の有効成分が得られる。本発明の治療薬は、細胞傷害活性物質と抗ヒトCD48抗体のみからなるものであっても良いが、必要に応じて、薬学的に許容される１種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、上記I−II．に記載のものを使用することができる。また、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。担体等についても前記I−II．に記載のものを使用することができる。製剤の形態としては、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
本発明の治療薬の投与経路は、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療効果が奏される限り、経口投与及び非経口投与（例えば、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内）のいずれを用いてもよい。有効成分に抗体を含有するため、非経口投与が好ましく、更に好ましくは静脈内投与である。よって好ましい投与形態は、注射剤である。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。本発明の治療薬の投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患に罹患した成人患者に対して、例えば、１日当たり1〜9 mg/m2体表面積）の割合で投与することができる。
II．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分をスクリーニングする方法
一実施形態において、本発明は、（１）ヒトCD48に特異的に結合する物質を選別する工程、及び（２）細胞傷害活性を有する物質を選別する工程を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬の有効成分をスクリーニングする方法である。本発明の方法で探索取得される物質は、ヒトCD48に対し特異的に結合することが可能であり、且つ、細胞傷害活性を有する。従って、当該物質は、多発性骨髄腫を代表とする形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患に罹患した患者に投与されることによって、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を特異的に認識し、細胞傷害作用を及ぼすことにより、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を治療することが出来ると期待される。
本発明のスクリーニング対象となる物質は、工程（１）及び（２）によって選抜され得るものであれば特に制限されないが、好ましくは抗体である。
（１）の工程は、ヒトCD48を特異的に認識し、これに結合する物質を選別する工程であり、上記「抗ヒトCD48モノクローナル抗体の製造方法」の（４）に記載の方法に準じて行うことが出来るがこれらに限定されるものではない。
以下に具体的な方法を例示する。ヒトCD48を発現している細胞とヒトCD48を発現していない細胞の二種類の細胞を用意する。これら二種類の細胞は、ヒトCD48の発現の有無を除いて同一である。次いで、各細胞に蛍光標識した被検物質を与え、細胞と被検物質との結合の有無をフローサイトメトリーを用いて測定する。ヒトCD48を発現する細胞にのみ結合する物質は、ヒトCD48に対して特異的な親和性を有し、そうでない抗体はヒトCD48に対して特異的親和性がないか低い抗体である。フローサイトメトリーで検出する蛍光シグナルの強弱により、抗体のCD48に対する親和性の程度を測定することができる。
フローサイトメトリーを用いる方法の他、免疫学的測定法を用いて、親和性を測定することもできる。この場合、精製ヒトCD48をマイクロタイタープレートにコートし、各ウェルに被検物質を添加し、反応させる。次いで、当該物質を認識することができ、且つ、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、又はビオチン等で標識した抗体を添加し、当該物質と反応させる。その後、当該抗体の標識を指標として、被検物質とヒトCD48との親和性を測定することができる。
これらの方法によりヒトCD48に対する親和性を測定することができる限り被検物質は特に制限されないが、好ましくは抗体である。
（２）の工程は、細胞傷害活性を有する物質を選抜する工程であり、上記I−II−II．及びI−II−III．に記載の補体依存性細胞傷害活性（CDC）の測定方法及び抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）の測定方法を用いて測定することができる。
このようにして選別された候補物質は、さらに形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の病態非ヒト動物を用いて薬効試験、安定性試験等を行うことにより、より実用的な多発性骨髄腫の治療薬の有効成分として更に選抜され得る。
III．腫瘍性形質細胞の同定方法
一実施形態において、本発明は、形質細胞の腫瘍増殖をきたす疾患に罹患した患者から採取した試料に、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を作用させる工程を含む、腫瘍性形質細胞を同定する方法である。上述するように、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、ヒトCD48に対して特異的に結合することにより、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を特異的に認識する抗体である。そこで、抗ヒトCD48モノクローナル抗体を、腫瘍性形質細胞を含む試料に作用させ、CD48を発現する細胞と結合した抗体を検出することにより、試料中の腫瘍性形質細胞を同定することが可能である。ここで、試料とは、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を罹患した患者から採取した腫瘍性形質細胞を含む試料（例えば、骨髄、血液、腫瘤）であり、好ましくは、体液、更に好ましくは血液である。検出を容易にするため、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、蛍光色素や放射性同位元素によって修飾されていてもよい。骨髄腫形質細胞の同定は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のみを用いて行ってもよく、他の抗体（例えば、抗ヒトCD38モノクローナル抗体）と組み合わせて行ってもよい。例えば、骨髄腫患者の骨髄から採取した試料を蛍光標識した抗ヒトCD48モノクローナル抗体及び抗ヒトCD38モノクローナル抗体で共染色し、フローサイトメトリーにて試料中の細胞をCD38とCD48について分離することによって、容易に骨髄腫細胞集団を同定することができる。これらのモノクローナル抗体を使用した場合、骨髄腫形質細胞は、CD38及びCD48について強陽性である細胞として同定することができる（例えば、実施例９参照）。
IV．形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の進行又は治療効果のモニタリング用試薬又はキット
一実施形態において、本発明は、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の進行又は治療効果をモニタリングするための試薬又はキットに関する。上述するように、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は、骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞を特異的に認識することができるため、これらの細胞を同定することが出来る。よって、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患を罹患した患者について、例えば、血液中の骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞の濃度（数）を、抗ヒトCD48モノクローナル抗体を用いて測定し、当該疾患の進行状況又はその治療の効果をモニタリングすることができる。本発明のモニタリング用試薬は、抗ヒトCD48モノクローナル抗体のみを含んでもよく、必要に応じてその他モニタリングに必要な任意の成分を含んでいてもよい。本発明のモニタリング用キットは、抗ヒトCD48モノクローナル抗体に加え、他の成分（例えば、他の抗体、緩衝液、蛍光色素等）器具、及びマニュアル等を含んでいてもよい。本発明に従ってモニタリングすることによって、治療計画の決定に役立てることができる。
試験方法：フローサイトメトリー及びソーティング
以下の実施例において、細胞の選別のために用いたフローサイトメトリー・ソーティングは下記の要領で行った。インフォームドコンセントを得た骨髄腫患者の腸骨から採取した骨髄単核球をACK 液(150mM NH4Cl, 10mM KHCO3)に浮遊し、３分間、４℃で 静置することにより、赤血球を除去した。2％胎児ウシ血清を添加したPBS (Phosphate-buffered saline)で洗浄したのち、非特異的な抗体の結合を防ぐため、10％ヒトAB型血清を含んだPBS中で、20分間、４℃でブロッキングを行った。その後、蛍光色素でラベルされた各抗体（下記参照）を加え、30分間、４℃で染色を行い、PBSで洗浄したのち、1μg/ml propidium iodide (PI)を含んだPBS中に浮遊し、フローサイトメトリー解析に供した。解析およびセルソーティングはFACS Aria セルソーター(Becton Dickinson Immunocytometry System社製)を用いて行った。
細胞の染色には、次のモノクローナル抗体を適宜選択して使用した。
APC or Cy7PE-conjugated CD34 (BD Pharmingen社製)、Cy7PE or Cy7APC-conjugated CD19 (BD pahrmingen社製)、FITC-conjugated CD38 (eBioscoiences社製)、APC-conjugated CD38 (BD pharmingen社製)、PE-conjugated CD138 (BD pharmingen社製)、Biotin-conjugatged CD3 (BD pharmingen社製)、Biotin-conjugated CD14 (ebiosciences社製)、Cy5PE-conjugated streptoavidin (ebiosciences社製)、Cy5PE-conjugated CD235 (Biolegend社製)、FITC-conjugated CD48 (eBiosciences社製)、Cy7-PE conjugated mouse CD45 (ebioscience社製)。
実施例１
多発性骨髄腫の根治的治療に適した標的分子のスクリーニング
多発性骨髄腫の根治的治療には、骨髄腫形質細胞に分化する前の段階の骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞を標的とすることが重要である。一方で、正常なB細胞や形質細胞の産生に必要な造血幹細胞を標的から除外することも重要である。造血幹細胞を標的から外しつつ、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞を標的とするためには、造血幹細胞には発現していないが、骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞の細胞表面に共通して発現している分子を見つけ出し、それを標的細胞の指標とすることが望ましい。そこで、そのような分子を見つけるべく、以下のスクリーニングを行った。
一次スクリーニング
まず、以下の３通りの手法(A)〜(C)を用いて、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞に発現している分子をコードする遺伝子を同定した。
（A）第一手法：signal sequencing trap法を用いた骨髄腫前駆細胞で発現する遺伝子の同定
多発性骨髄腫患者から骨髄腫前駆細胞（CD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞）を取得し、これらの細胞において発現している遺伝子のうち細胞表面蛋白をコードするものを同定した。
まず、フローサイトメトリー・セルソーティングによって多発性骨髄腫患者由来の骨髄細胞から骨髄腫前駆細胞を分離した。この細胞からTrizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてtotal RNA を採取した。次に、そのすべてのRNAよりPCR cDNA synthesis kit (SMART: Clontech, Palo Alto, CA) を用いてcDNAを作成し、これをPCRで増幅してｃDNAライブラリーを得た。ライブラリーのcDNAを制限酵素RsaI で切断した後、BstXI adaptorを結合した。そして、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、0.5kb 〜2.0kb の大きさのcDNAをゲルから切り出し、精製したのち、pMX-SST vector (東京大学医科学研究所、北村俊雄先生から供与)に挿入した。このようにして作製されたSST-REX libraryについて、北村らの報告（Kojima, T. and T. Kitamura , A signal sequence trap based on a constitutively active cytokine receptor. Nat Biotechnol, 1999. 17(5): p. 487-90）に記載のsignal sequencing trap法に従って、BaF3細胞に導入したのち、スクリーニングし、cDNAライブラリーに含まれる細胞表面蛋白をコードするcDNAを網羅的に分離した。分離したcDNAについて遺伝子解析を行い、遺伝子配列より遺伝子名を同定した。同定した遺伝子を、骨髄腫前駆細胞において発現している遺伝子として以下の表１に示す。
Figure 0005566374
（B）第二手法：Gene Chipを用いた骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞に共通に高発現する遺伝子の同定
上記第一手法で細胞を取得した患者とは異なる多発性骨髄腫患者から骨髄腫幹細胞（CD19+細胞）及び骨髄腫前駆細胞（CD19−CD38++CD138−細胞）を取得し、これらの細胞において発現している遺伝子を同定した。
フローサイトメトリー・ソーティングによって、別の骨髄腫患者由来の骨髄細胞から骨髄腫幹細胞（CD19＋細胞）及び骨髄腫前駆細胞（CD19−CD38++CD138−細胞）を分離した（図２参照）。次いで、分離したそれぞれの細胞画分から、Micro RNeasy kit (Qiagen社製)を用いてtotal RNA を採取した。20ngのtotal RNA からGeneChip Two-Cycle cDNA Synthesis Kit（Affymetrix社製) を用いて、cDNAを作製した後、MEGAscript T7 Kit(Ambion社製)を用いて1st cycle cRNA を作成し、さらにIVT Labeling Kit(Affymetrix社製)を用いてBiotinylated cRNA を作成した。Fragmentationを行った後、11.25μg のcRNA を16 時間 、45℃で GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayにハイブリダイズさせた。このGeneChipsをAffymetrix Fluidics Station 450で洗浄し、染色した後、GeneChip Scanner 3000 7G.を用いてscanした。結果はMicroarray Suite version 5.0 (MAS5.0) を用いて行い、標準化法としてglobal scaling を用いた。このようにして、同定した遺伝子のうち、骨髄腫幹細胞及び骨髄腫前駆細胞の両方において高発現が見られた分子を選抜した。選抜した遺伝子を表２に示す。
Figure 0005566374
（C）第三手法：文献情報に基づく候補分子をコードする遺伝子の探索
文献において骨髄腫細胞での発現が報告されている分子の中から、抗体療法の標的となりうる可能性を持つタンパク質をコードする遺伝子を選抜した。すなわち、PubMED(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)で検索可能な文献（例えば、Claudio, J.O.,et al., Blood, 2002. 100:2175-86.）において、骨髄腫細胞での発現が報告されている細胞表面分子のうち、公開されている遺伝子発現データベース（Gene Card (http://www.genecards.org/)において、多くの臓器での広汎な発現を見ない分子であり、かつ、CD34陽性造血幹細胞分画での発現が明らかでないものを選択した。選抜した遺伝子を表３に示す。
Figure 0005566374
二次スクリーニング
上記の一次スクリーニングによって得られた候補遺伝子の中から、複数の患者由来の骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞で実際に高発現している遺伝子をスクリーニングした。まず、上記表１〜３に示される候補遺伝子の中から、遺伝子発現データベースの検索により、多臓器でのユビキタスな発現が予想される分子（例えば、Niemann-Pick disease, type C2 (NPC2)やCD9 molecule）を除いた。残る各遺伝子についてPCR primerを作製した。一方で、３人の異なる骨髄腫患者由来の骨髄腫幹細胞（CD19+細胞）及び骨髄腫前駆細胞（CD19−CD38++CD138−細胞）を採取し、A）第一手法と同様にcDNAを作成した。得られた候補分子のそれぞれに対して作成したPrimerを用いて定量的PCRを行った。定量的RT-PCR はSYBRGreen 法により、ABI 7700 real-time PCR machine (Applied Biosystems社製) を用いて行った。各遺伝子の発現レベルはβ-actin の発現レベルによって標準化した。骨髄腫幹細胞分画における発現の低い可能性が高い分子（β-actinとのCt値の差が10以上）を除外したのち、骨髄腫前駆細胞分画において骨髄腫幹細胞分画と同等の発現レベルが見られる分子を選択したところ、CD48およびMMSC2〜MMSC4の計４分子が得られた（図３）。
以上の結果から、CD48及びMMSC2〜MMSC4分子が骨髄腫幹細胞分画および骨髄腫前駆細胞分画に共通して発現して発現していることが確認され、理想的な標的分子となり得る可能性が示唆された。
実施例２
骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞及び造血幹細胞における各分子の発現パターンの測定
市販されている抗CD48抗体（eBioscience社）及びMMSC2〜MMSC4に対する抗体を用いて、骨髄幹細胞、骨髄腫前駆細胞、骨髄腫形質細胞及び造血幹細胞の細胞表面におけるCD48及びMMSC2〜MMSC4の発現の有無を測定した。
多発性骨髄腫患者由来の骨髄細胞をAPC-conjugated CD34 (BD Pharmingen社製)、Cy7APC-conjugated CD19 (BD pahrmingen社製)、Cy7PE-conjugated CD38 (eBioscoiences社製)、PE-conjugated CD138 (BD pharmingen社製)、Biotin-conjugatged CD3 (BD pharmingen社製)、Biotin-conjugated CD14 (ebiosciences社製)、Cy5PE-conjugated CD235 (Biolegend社製)、FITC-conjugated CD48 (eBiosciences社製)（あるいはFITC-conjugated MMSC2〜MMSC4）を用いて染色し、洗浄したのち、さらにCy5PE-conjugated streptoavidin (ebiosciences社製)にて二次染色を行った。Isotype controlとして、FITC-conjugated CD48およびMMSC2〜MMSC4の代わりに、FITC-conjugated mouse IgGを加えたサンプルを同時に用意した。それらをフローサイトメトリーを用いて解析することにより、CD19+骨髄腫幹細胞分画、CD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞分画、CD138+成熟骨髄腫形質細胞、CD34+造血幹/前駆細胞分画におけるタンパク質レベルでの、CD48分子及びMMSC2〜MMSC4分子の発現分布を測定した。
骨髄腫患者３症例の検体を用いてスクリーニングを行った。その結果の一例を図４に示す。図４に示される各ヒストグラムについて、Y軸は、細胞数を示し、X軸はCD48あるいはMMSC2〜MMSC4の発現強度を示す。図４に示される結果から、CD48はCD19+骨髄腫幹細胞分画、CD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞分画、CD138+成熟骨髄腫形質細胞のいずれにおいても高いレベルで発現しており、且つ、CD34+造血幹/前駆細胞分画では発現レベルが低いことが確認された。一方、MMSC2分子は、CD34+造血幹/前駆細胞分画においても比較的高レベルで発現していることが確認された。MMSC3分子及びMMSC4分子についてはCD19+骨髄腫幹細胞分画とCD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞分画における発現がないか比較的低いことが確認された。この結果、CD48のみが、全ての骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞の細胞表面に発現しており、且つ、造血細胞における発現レベルが十分に低いことが分かる。よって、CD48分子は、多発性骨髄腫の根治的治療において、治療対象とすべき細胞を示す理想的な標的分子となり得ることが強く示唆された。一方、MMSC2について、造血幹細胞における発現が見られるため、多発性骨髄腫の治療のため標的細胞を示す指標としては理想的ではないことが示唆された。また、MMSC3及びMMSC4については、骨髄腫幹細胞及び／又は骨髄腫前駆細胞の細胞表面における発現が低いため、多発性骨髄腫の治療のための標的細胞を示す理想的な指標ではないことが示唆された。
実施例３
複数の患者由来の細胞を用いたCD48の発現分布の確認
実施例３で確認されたCD48の発現分布が、他の患者由来の細胞においても同様であるかを確認するため、複数の患者から骨髄細胞を採取し、実施例３と同様に各細胞画分におけるCD48の発現を測定した。10症例の骨髄腫患者骨髄検体を解析した結果を図５に示す。図５に示された結果より、抗CD48抗体が実施例３の結果と同様のパターンで他の患者由来の細胞画分に対しても結合することが明らかとなった。即ち、CD48分子は、骨髄腫幹細胞分画及び骨髄腫前駆細胞分画のいずれにおいても高いレベルで発現しており、且つ、造血幹細胞及び造血前駆細胞分画における発現レベルは低いことが確認された。
以上、実施例３及び４の結果から、CD48は、多発性骨髄腫患者由来の骨髄腫幹細胞、骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞の細胞表面において高度に発現しており、且つ造血幹細胞においては全く発現していないか、発現レベルが非常に低いことが確認された。よって、CD48を指標とすることにより、CD19+骨髄腫幹細胞分画からCD19−CD38++CD138−骨髄腫前駆細胞分画までの一連の細胞を標的としつつ、造血幹細胞を標的から外すことが可能であるため、CD48は、多発性骨髄腫の根治的治療のための理想的な指標となる分子であることが強く示唆された。
実施例４
CD48に対するモノクローナル抗体の作成
CD48分子自体が多発性骨髄腫の根治的治療のための標的として適切であるかを検討するため、CD48に対するモノクローナル抗体を作成した。まず、ヒトCD48cDNA (FLJクローン、東洋紡績社製)をMSCV-ires-GFPベクターに挿入し、レトロウィルスを用いて、BaF3細胞に導入することにより、ヒトCD48発現マウス細胞を作製した。この細胞をBalb/cマウスのFoot padに４回免疫したのち、リンパ節を取り出し、マウスミエローマ細胞SP2/0と細胞融合を行うことにより、ハイブリドーマを作製した。融合に供した細胞をHAT培地にて培養した。増殖の有無により選択されたハイブリドーマをマイクロタイタープレート上で培養し、その上清についてCD48を発現したBaF3細胞に対する結合性をフローサイトメトリーで観察することによりスクリーニングを行い、CD48抗体産生ハイブリドーマを得た。このような１回の細胞融合より、抗ヒトCD48モノクローナル抗体を産生する４クローンのハイブリドーマが得られた。そのうち２クローン（1B4、2E2）がIgG2aサブクラスであることを確認した。サブクラスの確認はIsotyping kit (Roche社)を用いて行った。
さらに、ハイブリドーマ1B4および2E2が産生する抗体分子の可変部領域の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。配列決定の方法は、すでに報告されているColomaらの方法（Coloma MJ et al. Journal of Immunological Methods 152, 89-104, 1992）に従って行った。すなわち、各ハイブリドーマ由来RNAから作製したcDNAを鋳型にして、PCR反応によりH鎖、κ鎖可変部領域のｃDNA断片を増幅し、その塩基配列を解読した。解読したＨ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）及び塩基配列（配列番号２）並びに超過変領域（CDR1〜3）を図６に示す。解読したＬ鎖（κ鎖）可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）及び塩基配列（配列番号４）並びに超過変領域（CDR1〜3）を図７に示す。また、1B4から得られた配列は2E2由来の配列と完全一致したので、この２クローンは全く同じ配列の抗体を産生していることが明らかになった。
実施例５
抗ヒトCD48モノクローナル抗体の細胞傷害活性の測定
実施例４で作成した抗ヒトCD48モノクローナル抗体についてin vitroでの細胞傷害活性の有無を調べた。試験は、IgG2aサブクラスに属することが確認された1B4が産生するモノクローナル抗体について、クロミウム遊離法を用いて補体依存性細胞傷害（CDC）活性の有無を調べることにより行った。Baby rabbit complement (Cedarene)を補体として用いた。骨髄腫細胞としては、骨髄腫細胞株OPM2及びU266を用いた。OPM2細胞株及びU266細胞株は、図８に示されるようにCD48分子を高発現している。各骨髄腫細胞株を51Cr で2時間ラベルし、３回洗浄した。標識された細胞（1 x 104cells）を、96-wellU-bottomed plates (1 x 104 cells) において、抗ヒトCD48モノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール(10 μg/ml in final) 及び25%のbaby rabbit complementを添加したRPMI1640+ウシ胎児血清160μL中で培養した。 37℃、5％CO2の条件にて９０分間培養した後、上清に放出された51Crをカウントした。特異的細胞傷害活性を以下のように計算した。
CDC活性＝｛（[実験に用いた細胞からの51Cr 放出]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）／（[１% Triton X-100添加による最大51Cr放出量]−[抗体の存在しない状態での自発的51Cr放出]）｝× 100
測定した結果を図９に示す。図９に示されるように、1B4モノクローナル抗体は、骨髄腫細胞株OPM2及びU266に対して明らかな細胞傷害活性を有することが確認された。この結果は、1B4モノクローナル抗体及びこれと同一のエピトープを認識する抗体が多発性骨髄腫の治療の有効成分となり得ること、並びにこれらのモノクローナル抗体を用いてin vivoでの多発性骨髄腫に対する治療効果を調べることにより、CD48を発現する細胞をターゲットとして多発性骨髄腫を治療することの有効性を調べることが可能であることを示す。
実施例６
抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体によるin vivo骨髄腫細胞増殖抑制効果
実施例５において細胞傷害活性を有することが確認された抗ヒトCD48モノクローナル抗体を用いて、in vivoでの多発性骨髄腫に対する治療効果を調べた。
2Gyの放射線照射を行ったRag2−／−γc−／−マウスの皮下に骨髄腫細胞株OPM2細胞（1×107個）を移植した。腫瘍体積が10mm3を超えた時点（腫瘍を移植して１０日後）で、マウスをCD48抗体投与群とコントロールIgG投与群に分け、10 mg/kg の抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）又はコントロールIgGを 週３回（隔日）投与した。腫瘍体積の計測は週３回（隔日）行い、体積は以下の近似値で表現した：長径×短径×高さ／２。移植した骨髄腫細胞株OPM2が形成する腫瘤の体積が10mm3を超えた時点をday0とし、その日からの腫瘍体積の変化を図１０に示す。また、day12におけるコントロール（IgG投与）マウスおよび１B4抗体投与マウスでの腫瘍の大きさを図１１に示す。矢印は腫瘍の幅を示す。
図１０及び１１に示されるように、コントロールIgGを投与した場合は、骨髄腫細胞が指数関数的に増殖しているのに対し、細胞傷害活性を有する抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）を投与した場合は、骨髄腫細胞の増殖がほぼ完全に抑制された。
実施例７
骨髄内移植した骨髄腫細胞に対する抗ヒトCD48細胞傷害活性モノクローナル抗体による治療効果
より生理的環境下での骨髄腫細胞に対する効果を見るため、骨髄内に移植した骨髄腫細胞に対する抗体投与の効果を検討した。2Gyの放射線照射を行ったRag2−／−ｃγ−／−マウスの骨髄内に骨髄腫細胞株OPM2細胞3X105個を移植したのち、10日目に骨髄穿刺を行い、hCD38発現細胞の頻度によりヒト骨髄腫細胞のキメリズムを解析した。また11日、13日及び15日目にCD48抗体あるいはコントロールとしてマウスIgG 5mg/kgを静脈投与した。その後、抗体の効果を検討するため、16日目に再度骨髄におけるヒト骨髄腫細胞のキメリズムを解析した。
コントロールIgG抗体投与群ではいずれも、著明に骨髄腫細胞のキメリズムの増加が見られたのに対して、CD48抗体では骨髄腫細胞のキメリズムが減少した(図１２)。これらの実験結果から、抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）及びこれと同一のエピトープを認識する抗体はCD48を発現する骨髄腫細胞に対し、非常に強い細胞傷害活性を有することが明らかとなった。CD48を標的とすることにより、骨髄腫形質細胞だけでなく、骨髄腫幹細胞および骨髄腫前駆細胞も標的とすることができるので、抗ヒトCD48モノクローナル抗体は多発性骨髄腫の根治的治療のために有効である可能性が強く示唆された。さらに、ヒトCD48を指標として、それを発現する細胞を特異的に死滅させることが多発性骨髄腫の根治的治療に有効なのであるから、ヒトCD48を特異的に認識する物質（例えば、モノクローナル抗体）と細胞傷害活性を有する別の物質とを組み合わせることによっても多発性骨髄腫の根治的治療に有効な治療薬となることが示唆された。
実施例８
正常骨髄造血前駆細胞におけるCD48の発現レベルの検討および抗CD48抗体の造血前駆細胞に対するCDC活性の検討
図５に示されるように、CD48は造血幹細胞（CD34+CD38−）及びCD34+CD38−造血前駆細胞において、僅かながら発現が見られる。健常人由来の骨髄細胞についても、実施例３と同様にCD48の発現レベルを調べたところ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の画分であるCD34＋細胞において、極めて低レベルであるがCD48の発現が確認された（図１３）。そこで、このような低レベルのCD48の発現によって、造血幹細胞及び造血前駆細胞が抗CD48抗体による細胞傷害作用を受けるかについて検討した。
CD34MACSビーズ（ミルテニー社）を用いて純化した正常CD34+細胞をCDC活性の測定と同じ方法で、抗ヒトCD48モノクローナル抗体（1B4）および補体と反応させたのち、メチルセルロース培地（Methocult H4334（Stem Cell Technologies））中で培養し、14日後に各種のコロニー形成細胞の数をカウントした。その結果、抗CD48抗体および補体と共培養しても、正常造血前駆細胞から形成されるコロニーの数に全く変化はなかった(図１４)。この結果は、造血前駆細胞は抗CD48抗体により惹起される細胞傷害を受けないことを示しており、抗CD48抗体の医薬品としての安全性を示唆する。
以上より、抗ヒトCD４８モノクローナル抗体を用いて多発性骨髄腫の治療における標的細胞を標的化することは、安全性の面でも有効であると考えられる。
実施例９
CD48の発現レベルをマーカーにした骨髄腫形質細胞の同定
図４及び５から明らかなようにCD48の発現レベルは骨髄腫前駆細胞及び骨髄腫形質細胞において非常に高い。CD48がCD38強陽性の骨髄腫細胞に強陽性であるということは新たな知見である。これを利用し、骨髄腫患者骨髄において、CD48とCD38を共染色したのち、フローサイトメトリーにて解析することにより、骨髄腫細胞集団を同定することが非常に容易である。その解析法の一例を図１５に示す。図１５のように、一般に骨髄腫細胞のマーカーとして用いられているCD38とともにCD48をマーカーとして使うことによって、非常に容易に骨髄腫細胞集団を同定できる。通常CD38強陽性細胞を骨髄腫細胞として同定しているが、どのレベルまでを強陽性とするかは恣意的である。一方、CD48をマーカーに加えることにより、骨髄腫細胞集団はCD38,CD48ともに強陽性の均一な細胞集団としてとらえることができる。このようにして同定される骨髄腫細胞集団の骨髄中における頻度を測定することにより、骨髄腫の進行度を知ることができる。

Claims (7)

  1. ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を含み、ヒトCD48を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有することを特徴とする、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬。
  2. 上記モノクローナル抗体そのものが細胞傷害活性を有するものである、請求項１に記載の治療薬。
  3. 上記モノクローナル抗体が、細胞傷害活性を有する物質を結合してなるものである、請求項１に記載の治療薬。
  4. 上記形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患が多発性骨髄腫である、請求項１〜３のいずれかに記載の治療薬。
  5. 形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患に罹患した患者から採取した試料に、ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を作用させる工程を含む、腫瘍性形質細胞を同定する方法。
  6. ヒトCD48に対するモノクローナル抗体を含む、形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患のモニタリング用試薬又はキット。
  7. 上記形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患が多発性骨髄腫である、請求項６に記載のモニタリング用試薬又はキット。
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