JPH06269293A - マウスｃｄ４８に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
マウスｃｄ４８に対するモノクローナル抗体Info
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- JPH06269293A JPH06269293A JP5060087A JP6008793A JPH06269293A JP H06269293 A JPH06269293 A JP H06269293A JP 5060087 A JP5060087 A JP 5060087A JP 6008793 A JP6008793 A JP 6008793A JP H06269293 A JPH06269293 A JP H06269293A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 マウスＣＤ４８に対するモノクローナル抗体
を提供する。 【構成】 マウスＴ細胞株ＭＢＬ-２で免疫感作した動
物の脾細胞とマウスのミエローマ細胞から、ＭＢＬ細胞
とＣＤ２分子の反応性を阻害する抗体を生産するハイブ
リドーマを作成し、このハイブリドーマが産出する抗体
がマウスＣＤ４８と特異的に反応してこれを免疫沈降さ
せることを立証した。
を提供する。 【構成】 マウスＴ細胞株ＭＢＬ-２で免疫感作した動
物の脾細胞とマウスのミエローマ細胞から、ＭＢＬ細胞
とＣＤ２分子の反応性を阻害する抗体を生産するハイブ
リドーマを作成し、このハイブリドーマが産出する抗体
がマウスＣＤ４８と特異的に反応してこれを免疫沈降さ
せることを立証した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体に関
し、さらに詳しくは、マウスの細胞表面分子であるＣＤ
４８に特異的に反応するモノクローナル抗体、該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび該ハイブ
リドーマの製造方法、ならびに、免疫関連細胞の解析に
おけるこの抗体の使用に関するものである。
し、さらに詳しくは、マウスの細胞表面分子であるＣＤ
４８に特異的に反応するモノクローナル抗体、該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび該ハイブ
リドーマの製造方法、ならびに、免疫関連細胞の解析に
おけるこの抗体の使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】免疫の応答機構は多種類の細胞および調
節因子が複雑に相互作用を行うことにより機能してお
り、この機構を解明することにより、免疫関係疾患の発
症機構が明らかなるとともに、その治療への応用が期待
される。この免疫応答機構は、免疫系の細胞がその細胞
の表面分子を介して細胞どうしで結合することが第１段
階となる。その後、互いに細胞がその結合によるシグナ
ル伝達により活性化され、種々の調節因子の産生や新た
な細胞表面分子の発現が惹起される。この第１段階にお
ける細胞間の結合に重要な役割を担うのが、接着分子と
総称される細胞膜表面上の機能分子である。これらの分
子についての解説は、ＦＡＳＥＢ Ｊournalvol.４,１９
９０やＡnnual Ｒeview of Ｉmmunology vol.８,１９９
０等多くの文献に記載されている。これらの分子は、大
きく分けると免疫グロブリンスーパーファミリーとイン
テグリンファミリーに分けることができる。
節因子が複雑に相互作用を行うことにより機能してお
り、この機構を解明することにより、免疫関係疾患の発
症機構が明らかなるとともに、その治療への応用が期待
される。この免疫応答機構は、免疫系の細胞がその細胞
の表面分子を介して細胞どうしで結合することが第１段
階となる。その後、互いに細胞がその結合によるシグナ
ル伝達により活性化され、種々の調節因子の産生や新た
な細胞表面分子の発現が惹起される。この第１段階にお
ける細胞間の結合に重要な役割を担うのが、接着分子と
総称される細胞膜表面上の機能分子である。これらの分
子についての解説は、ＦＡＳＥＢ Ｊournalvol.４,１９
９０やＡnnual Ｒeview of Ｉmmunology vol.８,１９９
０等多くの文献に記載されている。これらの分子は、大
きく分けると免疫グロブリンスーパーファミリーとイン
テグリンファミリーに分けることができる。
【０００３】免疫グロブリン(Ｉｇ)は免疫応答の中核を
なす物質で、約１００残基のアミノ酸より構成される基
本ドメイン構造を有している。このドメイン構造には約
６０残基は離れたシステインにより形成されるループ構
造とβシート構造の存在が示されており、このドメイン
構造は免疫グロブリン以外にもＴ細胞抗原レセプター、
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２等、多くの蛋白質に保持されて
おり、免疫グロブリンスーパーファミリーと称される。
なす物質で、約１００残基のアミノ酸より構成される基
本ドメイン構造を有している。このドメイン構造には約
６０残基は離れたシステインにより形成されるループ構
造とβシート構造の存在が示されており、このドメイン
構造は免疫グロブリン以外にもＴ細胞抗原レセプター、
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２等、多くの蛋白質に保持されて
おり、免疫グロブリンスーパーファミリーと称される。
【０００４】ＣＤ２は２つのＩgのＣドメイン構造を持
った分子量約５０kＤaの糖蛋白で、Ｔ細胞、ＮＫ細胞な
ど広範に分布する。ＣＤ２は当初、ヒツジ赤血球とロゼ
ットを形成するＴ細胞上のレセプターとして同定された
が、ＡＰＣ(antigen presenting cell：抗原提示細胞)
上の同じＩgスーパーファミリーに属するＬＦＡ(Ｌymph
ocyte function-associated antigen)−３をリガンドと
して結合し、抗原非依存性の細胞間接着分子として働
く。また、ＣＤ２はＴＣＲ／ＣＤ３を介さないＴ細胞活
性化の代替経路としても知られており、この現象から、
ＣＤ２はＴＣＲ／ＣＤ３複合体が発現する以前の未熟胸
腺細胞の増殖において中心的役割を果たしていると考え
られている。このようにＣＤ２は、生体内においてリガ
ンドであるＬＦＡ−３と会合してＴ細胞−抗原提示細
胞、あるいはキラー細胞−ターゲット細胞の結合を強固
にするだけではなく、細胞内にシグナル伝達をし得る機
能的分子であることが明らかになってきた。
った分子量約５０kＤaの糖蛋白で、Ｔ細胞、ＮＫ細胞な
ど広範に分布する。ＣＤ２は当初、ヒツジ赤血球とロゼ
ットを形成するＴ細胞上のレセプターとして同定された
が、ＡＰＣ(antigen presenting cell：抗原提示細胞)
上の同じＩgスーパーファミリーに属するＬＦＡ(Ｌymph
ocyte function-associated antigen)−３をリガンドと
して結合し、抗原非依存性の細胞間接着分子として働
く。また、ＣＤ２はＴＣＲ／ＣＤ３を介さないＴ細胞活
性化の代替経路としても知られており、この現象から、
ＣＤ２はＴＣＲ／ＣＤ３複合体が発現する以前の未熟胸
腺細胞の増殖において中心的役割を果たしていると考え
られている。このようにＣＤ２は、生体内においてリガ
ンドであるＬＦＡ−３と会合してＴ細胞−抗原提示細
胞、あるいはキラー細胞−ターゲット細胞の結合を強固
にするだけではなく、細胞内にシグナル伝達をし得る機
能的分子であることが明らかになってきた。
【０００５】またＣＤ２は、マウスにおいてはＴ細胞、
ＮＫ細胞の他、Ｂ細胞にも発現していることが明らかに
なっている。さらには、ＣＤ２のリガンドは従来ＬＦＡ
−３のみと考えられていたが、ＣＤ４８分子もＣＤ２の
リガンドであるという報告がなされている。
ＮＫ細胞の他、Ｂ細胞にも発現していることが明らかに
なっている。さらには、ＣＤ２のリガンドは従来ＬＦＡ
−３のみと考えられていたが、ＣＤ４８分子もＣＤ２の
リガンドであるという報告がなされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＣＤ２のリガンドであ
るＬＦＡ−３、ＣＤ４８の探索および解析は、ヒトにお
いてはＬＦＡ−３遺伝子、抗ＬＦＡ−３抗体、ＣＤ４８
遺伝子等の取得により in vitro での解析が進んでい
た。しかしマウスにおいては、これらのリガンドの遺伝
子はもとより、モノクローナル抗体の取得もできておら
ず、そのためマウスにおけるＣＤ２の役割については、
in vitro、in vivo ともに解析ができていなかった。
るＬＦＡ−３、ＣＤ４８の探索および解析は、ヒトにお
いてはＬＦＡ−３遺伝子、抗ＬＦＡ−３抗体、ＣＤ４８
遺伝子等の取得により in vitro での解析が進んでい
た。しかしマウスにおいては、これらのリガンドの遺伝
子はもとより、モノクローナル抗体の取得もできておら
ず、そのためマウスにおけるＣＤ２の役割については、
in vitro、in vivo ともに解析ができていなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者等は上記課題に対し種々検討した結果、マウスの
ＣＤ４８に対するモノクローナル抗体を作製すれば、Ｃ
Ｄ２−ＣＤ４８を介した細胞間相互作用についての解析
が進むのではないかと考え、鋭意検討を重ねた結果、Ｃ
Ｄ４８に反応するモノクローナル抗体および該抗体を産
生するハイブリドーマの取得に成功し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明はマウスＣＤ４８に特
異的に反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマおよび該ハイブリドーマ
の製造方法に関するものである。
発明者等は上記課題に対し種々検討した結果、マウスの
ＣＤ４８に対するモノクローナル抗体を作製すれば、Ｃ
Ｄ２−ＣＤ４８を介した細胞間相互作用についての解析
が進むのではないかと考え、鋭意検討を重ねた結果、Ｃ
Ｄ４８に反応するモノクローナル抗体および該抗体を産
生するハイブリドーマの取得に成功し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明はマウスＣＤ４８に特
異的に反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマおよび該ハイブリドーマ
の製造方法に関するものである。
【０００８】本発明に係るマウスＣＤ４８に対するモノ
クローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、以下のようにして製造することがで
きる。すなわち、 ＣＤ４８を発現していると考えられるマウスＴ細胞
株（ＭＢＬ−２)(順天堂大学医学部免疫学教室より入手
可能)を抗原として、ハムスターを免疫感作し、 ハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させて、ＭＢＬ−２細胞とＣＤ２との反応を阻害す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、 上記で得たハイブリドーマを適当な条件下で培養
してモノクローナル抗体を回収し、このモノクローナル
抗体を用いてＣＤ４８を発現している細胞のＣＤ４８分
子と反応することを免疫沈降により特定し、さらに免疫
沈降後のサンプルのアミノ酸シークエンスを行うことに
より、最終的にＣＤ４８に対するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選択し、 上記で得たハイブリドーマを培養することにより
該モノクローナル抗体を生産し、これを回収する。
クローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、以下のようにして製造することがで
きる。すなわち、 ＣＤ４８を発現していると考えられるマウスＴ細胞
株（ＭＢＬ−２)(順天堂大学医学部免疫学教室より入手
可能)を抗原として、ハムスターを免疫感作し、 ハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを
融合させて、ＭＢＬ−２細胞とＣＤ２との反応を阻害す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、 上記で得たハイブリドーマを適当な条件下で培養
してモノクローナル抗体を回収し、このモノクローナル
抗体を用いてＣＤ４８を発現している細胞のＣＤ４８分
子と反応することを免疫沈降により特定し、さらに免疫
沈降後のサンプルのアミノ酸シークエンスを行うことに
より、最終的にＣＤ４８に対するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選択し、 上記で得たハイブリドーマを培養することにより
該モノクローナル抗体を生産し、これを回収する。
【０００９】
【発明の効果】本発明のＣＤ４８に対するモノクローナ
ル抗体は、マウスＣＤ４８と特異的に反応することか
ら、以下に述べるような種々の用途が考えられる。すな
わち、ＣＤ２を発現している細胞と、そのリガンドであ
るＣＤ４８を発現している細胞との相互作用を、本発明
のモノクローナル抗体を用いて解析することによって、
ＣＤ２−ＣＤ４８を介したＴ細胞の活性化機序、あるい
はＢ細胞の機能発現を理解することができる。
ル抗体は、マウスＣＤ４８と特異的に反応することか
ら、以下に述べるような種々の用途が考えられる。すな
わち、ＣＤ２を発現している細胞と、そのリガンドであ
るＣＤ４８を発現している細胞との相互作用を、本発明
のモノクローナル抗体を用いて解析することによって、
ＣＤ２−ＣＤ４８を介したＴ細胞の活性化機序、あるい
はＢ細胞の機能発現を理解することができる。
【００１０】また、近年Ｔ細胞の活性化のメカニズムは
Ｔ細胞抗原レセプターに抗原・ＭＨＣの結合以外に第２
の系路が必要とされており、この第２の系路が欠如した
状態で抗原刺激が起きるとＴ細胞の不活化からトレラン
ス(寛容)が誘導されると考えられている。本発明の抗体
は、その第２の系路である可能性の高いＣＤ２−ＣＤ４
８の系を阻害することが可能であるので、トレランス誘
導のメカニズムを解明するのに役立つと同時に、拒絶反
応を防止する新たな免疫抑制剤開発のための有効な武器
となる。
Ｔ細胞抗原レセプターに抗原・ＭＨＣの結合以外に第２
の系路が必要とされており、この第２の系路が欠如した
状態で抗原刺激が起きるとＴ細胞の不活化からトレラン
ス(寛容)が誘導されると考えられている。本発明の抗体
は、その第２の系路である可能性の高いＣＤ２−ＣＤ４
８の系を阻害することが可能であるので、トレランス誘
導のメカニズムを解明するのに役立つと同時に、拒絶反
応を防止する新たな免疫抑制剤開発のための有効な武器
となる。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を示すがＣＤ２の調製は(１)及
び(１)’のどちらでもよい。 (１)可溶性ＣＤ２(ＣＤ２−Ｒg)の調製 ベクターの構築 ヒトＩgＧのＦc部分をコードするＣＤＮＡが組み込まれ
たＣＤＭ８ベクター(ハーバード大学 Ｄr．Ｂ．Ｓeed
より供与)５μgを制限酵素ＢamＨＩ ５単位、ＸbaＩ
５単位と３７℃で１時間反応させることにより切断し、
得られたＦcフラグメント(Ｒg)をpＢlueuscript II Ｓ
Ｋ(＋)(Stratagene製)のＢamＨＩ、ＸbaＩサイトに挿入
した。これをＸhoＩ、ＢamＨＩサイトで切断し、pＢlue
uscript ＩＩ ＳＫ(＋)−ＲgのＸhoＩ、ＢamＨＩフラグ
メントを作製した。一方マウスＣＤ２については、ＣＤ
２ cＤＮＡ(順天堂大学医学部免疫学教室から入手可能)
５μgを制限酵素ＨpaＩで切断した後、ＢamＨＩメチラ
ーゼを用いてＨpaＩフラグメントのＢamＨＩサイトをメ
チル化した。その後、ＨpaＩフラグメントの両端にＢam
ＨＩアダプターを付与した。その後、制限酵素ＸhoＩ、
ＢamＨＩ切断によりＣＤ２フラグメントを調製した。こ
うして得られたＸhoＩ、ＢamＨＩ ＣＤ２フラグメント
を pＢlueuscriptＩＩ ＳＫ(＋)−ＲgのＸhoＩ、ＢamＨ
Ｉフラグメントに挿入した。その後、ＸhoＩ、Ｎotで切
断し、生じたＣＤ２−Ｒgフラグメントを、ＸhoＩ、Ｎo
tで切断したＢＣＭＧＳneo(順天堂大学医学部免疫学教
室から入手可能)に挿入し、マウスＣＤ２−Ｒg発現ベク
ターの構築を終了した。
び(１)’のどちらでもよい。 (１)可溶性ＣＤ２(ＣＤ２−Ｒg)の調製 ベクターの構築 ヒトＩgＧのＦc部分をコードするＣＤＮＡが組み込まれ
たＣＤＭ８ベクター(ハーバード大学 Ｄr．Ｂ．Ｓeed
より供与)５μgを制限酵素ＢamＨＩ ５単位、ＸbaＩ
５単位と３７℃で１時間反応させることにより切断し、
得られたＦcフラグメント(Ｒg)をpＢlueuscript II Ｓ
Ｋ(＋)(Stratagene製)のＢamＨＩ、ＸbaＩサイトに挿入
した。これをＸhoＩ、ＢamＨＩサイトで切断し、pＢlue
uscript ＩＩ ＳＫ(＋)−ＲgのＸhoＩ、ＢamＨＩフラグ
メントを作製した。一方マウスＣＤ２については、ＣＤ
２ cＤＮＡ(順天堂大学医学部免疫学教室から入手可能)
５μgを制限酵素ＨpaＩで切断した後、ＢamＨＩメチラ
ーゼを用いてＨpaＩフラグメントのＢamＨＩサイトをメ
チル化した。その後、ＨpaＩフラグメントの両端にＢam
ＨＩアダプターを付与した。その後、制限酵素ＸhoＩ、
ＢamＨＩ切断によりＣＤ２フラグメントを調製した。こ
うして得られたＸhoＩ、ＢamＨＩ ＣＤ２フラグメント
を pＢlueuscriptＩＩ ＳＫ(＋)−ＲgのＸhoＩ、ＢamＨ
Ｉフラグメントに挿入した。その後、ＸhoＩ、Ｎotで切
断し、生じたＣＤ２−Ｒgフラグメントを、ＸhoＩ、Ｎo
tで切断したＢＣＭＧＳneo(順天堂大学医学部免疫学教
室から入手可能)に挿入し、マウスＣＤ２−Ｒg発現ベク
ターの構築を終了した。
【００１２】 ＣＤ２−Ｒgの調製 セルポレーター(ＢＲＬ製)を用いたエレクトロポレーシ
ョン法を用いて、マウスミエローマＰ３Ｕ１(ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７)にＣＤ２−Ｒg発現ベクターを、導入
した。Ｇ４１８(ギブコ製)耐性の細胞を選別後、遺伝子
導入細胞を培養し、その培養上清を回収し、これをＣＤ
２−Ｒg溶液とした。
ョン法を用いて、マウスミエローマＰ３Ｕ１(ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９７)にＣＤ２−Ｒg発現ベクターを、導入
した。Ｇ４１８(ギブコ製)耐性の細胞を選別後、遺伝子
導入細胞を培養し、その培養上清を回収し、これをＣＤ
２−Ｒg溶液とした。
【００１３】 ＣＤ２−Ｒgの解析１ 上記で調製したＣＤ２−Ｒgの活性をＦＡＣＳ(蛍光細胞
分析分離装置)で調べた。ＭＢＬ−２細胞１０6個に対
し、ＣＤ２−Ｒg溶液１mlを添加し、４℃で１時間反応
させた。その後、ＰＢＳで２回穏やかに遠心洗浄した
後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩgＧ(カルタゴ製)で染色し
た。４℃３０分間の反応の後、２回穏やかに遠心洗浄
し、次いでＰＢＳ ２００μlと合わせ、ＦＡＣＳcan
(Ｂ.Ｄ.製)(フローサイトメーター)にて細胞の蛍光強度
を測定したところ、図１の(ａ)に示すように染色される
ことがわかった。
分析分離装置)で調べた。ＭＢＬ−２細胞１０6個に対
し、ＣＤ２−Ｒg溶液１mlを添加し、４℃で１時間反応
させた。その後、ＰＢＳで２回穏やかに遠心洗浄した
後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩgＧ(カルタゴ製)で染色し
た。４℃３０分間の反応の後、２回穏やかに遠心洗浄
し、次いでＰＢＳ ２００μlと合わせ、ＦＡＣＳcan
(Ｂ.Ｄ.製)(フローサイトメーター)にて細胞の蛍光強度
を測定したところ、図１の(ａ)に示すように染色される
ことがわかった。
【００１４】 ＣＤ２−Ｒgの解析２ また、得られたものがＣＤ２の可溶性キメラタンパク質
であることを確認するためにマウスＣＤ２に対する抗体
を用いて阻害実験を試みた。と同様、マウスＭＢＬ−
２細胞１０6個に対し、マウスＣＤ２に対する抗体であ
るＲＭ２−１抗体(生化学工業製)とあらかじめインキュ
ベートしておいたＣＤ２−Ｒg溶液１mlを加え、４℃で
１時間反応させた。その後、と同様、ＦＬＴＣ−抗ヒ
トＩgＧと反応させ、ＦＡＣＳcanにて細胞の蛍光強度を
測定したところ、図１の(ｂ)に示すように、ＭＢＬ−２
細胞とＣＤ２−Ｒgの反応を完全に阻害し、調製したタ
ンパク質が目的のＣＤ２−Ｒgであることを確認した。
であることを確認するためにマウスＣＤ２に対する抗体
を用いて阻害実験を試みた。と同様、マウスＭＢＬ−
２細胞１０6個に対し、マウスＣＤ２に対する抗体であ
るＲＭ２−１抗体(生化学工業製)とあらかじめインキュ
ベートしておいたＣＤ２−Ｒg溶液１mlを加え、４℃で
１時間反応させた。その後、と同様、ＦＬＴＣ−抗ヒ
トＩgＧと反応させ、ＦＡＣＳcanにて細胞の蛍光強度を
測定したところ、図１の(ｂ)に示すように、ＭＢＬ−２
細胞とＣＤ２−Ｒgの反応を完全に阻害し、調製したタ
ンパク質が目的のＣＤ２−Ｒgであることを確認した。
【００１５】(１)’ＣＤ２分子の調製 ＣＤ２分子の精製 マウスＣＤ２を発現しているＭＢＬ−２細胞から抗ＣＤ
２抗体(ＲＭ２−１：生化学工業)を用いてＣＤ２分子を
精製した。具体的には、まず、マウスＭＢＬ−２細胞を
１×１０10個培養し、１５００rpmで５分間の遠心分離
によりＭＢＬ−２を回収した後、ＰＢＳにて１回遠心洗
浄した。上清吸引後、ＭＢＬ−２のペレットに５mlの溶
菌緩衝液(１％ＮＰ−４０、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１５０mM ＮａＣｌ、２mM ＣａＣｌ2、２mM ＭｇＣ
ｌ2、１０μM Ａ−ＰＭＳＦ、５０μg／ml トリプシン
インヒビター)を加え、よく撹拌した後、氷上にて３０
分間放置した。その後、１５０００rpmで１０分間遠心
した後、上澄液を回収した。ラットＩｇＧをＣＮＢｒ活
性化セファロースゲル(ファルマシア製)に結合したもの
５００μlに対し、回収した上澄液４mlを入れ、４℃で
一晩反応させ、非特異的結合タンパク質を除去した。そ
の後、１２０００rpmで１分間の遠心分離によりゲルを
沈降させ、上清を回収した。回収した上清を、抗ＣＤ２
抗体をＣＮＢｒ活性化セファロースゲルに結合したもの
１mlに混合した。これを４℃で一晩反応させ、ＣＤ２分
子と抗ＣＤ２抗体を結合させた。洗浄液(０.５％ＮＰ−
４０、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.６M ＮａＣｌ)で
２回洗浄した後、溶出液(０.１％ ＮＰ−４０、１５０m
M ＮａＣｌ、５０mMグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３.０)でＣ
Ｄ２分子を溶出させた。溶出させたＣＤ２の純度は１０
〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル(第一化学製)を用いた
電気泳動にて確認した。１×１０10個のＭＢＬ−２細胞
より２μｇのＣＤ２分子を回収することができた。
２抗体(ＲＭ２−１：生化学工業)を用いてＣＤ２分子を
精製した。具体的には、まず、マウスＭＢＬ−２細胞を
１×１０10個培養し、１５００rpmで５分間の遠心分離
によりＭＢＬ−２を回収した後、ＰＢＳにて１回遠心洗
浄した。上清吸引後、ＭＢＬ−２のペレットに５mlの溶
菌緩衝液(１％ＮＰ−４０、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１５０mM ＮａＣｌ、２mM ＣａＣｌ2、２mM ＭｇＣ
ｌ2、１０μM Ａ−ＰＭＳＦ、５０μg／ml トリプシン
インヒビター)を加え、よく撹拌した後、氷上にて３０
分間放置した。その後、１５０００rpmで１０分間遠心
した後、上澄液を回収した。ラットＩｇＧをＣＮＢｒ活
性化セファロースゲル(ファルマシア製)に結合したもの
５００μlに対し、回収した上澄液４mlを入れ、４℃で
一晩反応させ、非特異的結合タンパク質を除去した。そ
の後、１２０００rpmで１分間の遠心分離によりゲルを
沈降させ、上清を回収した。回収した上清を、抗ＣＤ２
抗体をＣＮＢｒ活性化セファロースゲルに結合したもの
１mlに混合した。これを４℃で一晩反応させ、ＣＤ２分
子と抗ＣＤ２抗体を結合させた。洗浄液(０.５％ＮＰ−
４０、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.６M ＮａＣｌ)で
２回洗浄した後、溶出液(０.１％ ＮＰ−４０、１５０m
M ＮａＣｌ、５０mMグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３.０)でＣ
Ｄ２分子を溶出させた。溶出させたＣＤ２の純度は１０
〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル(第一化学製)を用いた
電気泳動にて確認した。１×１０10個のＭＢＬ−２細胞
より２μｇのＣＤ２分子を回収することができた。
【００１６】 ＣＤ２分子の解析 上記(１)’ので得られたものがＣＤ２分子であること
を確認するために、マウスＣＤ２に対する抗体を用いて
阻害実験を試みた。マウスＭＢＬ−２細胞１０6個に対
し、ＣＤ２分子１００ngを添加し、４℃で１時間反応さ
せた。その後ＦＩＴＣ−標識抗マウスＣＤ２抗体で染色
した。４℃で３０分間の反応の後、２回穏やかに遠心洗
浄し、次いでＰＢＳ２００μｌとあわせ、ＦＡＣＳ(フ
ローサイトメーター)にて蛍光強度を測定したところ、
染色されず、ＣＤ２分子に間違いないことを確認した。
図２は精製したＣＤ２分子とＭＢＬ−２細胞の反応をＦ
ＡＣＳで調べた図であり、(ａ)はＭＢＬ−２とＣＤ２に
対する抗体の反応をみたもの、(ｂ)は(ａ)の反応を今回
得たＣＤ２分子で阻害した結果である。
を確認するために、マウスＣＤ２に対する抗体を用いて
阻害実験を試みた。マウスＭＢＬ−２細胞１０6個に対
し、ＣＤ２分子１００ngを添加し、４℃で１時間反応さ
せた。その後ＦＩＴＣ−標識抗マウスＣＤ２抗体で染色
した。４℃で３０分間の反応の後、２回穏やかに遠心洗
浄し、次いでＰＢＳ２００μｌとあわせ、ＦＡＣＳ(フ
ローサイトメーター)にて蛍光強度を測定したところ、
染色されず、ＣＤ２分子に間違いないことを確認した。
図２は精製したＣＤ２分子とＭＢＬ−２細胞の反応をＦ
ＡＣＳで調べた図であり、(ａ)はＭＢＬ−２とＣＤ２に
対する抗体の反応をみたもの、(ｂ)は(ａ)の反応を今回
得たＣＤ２分子で阻害した結果である。
【００１７】(２)免疫感作 アルメニアンハムスターにＴ細胞リンホーマＭＢＬ−２
を１匹当り１×１０7個腹腔内に接種した。次いで、１
０日後から１０日間間隔で４回同一ハムスターにＭＢＬ
−２細胞を接種することにより、免疫感作した。
を１匹当り１×１０7個腹腔内に接種した。次いで、１
０日後から１０日間間隔で４回同一ハムスターにＭＢＬ
−２細胞を接種することにより、免疫感作した。
【００１８】(３)融合 最終免疫の３日後に上記ハムスターから脾臓を取り出し
た。取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地に浮遊させ、脾細胞を１×１０8個得
た。この脾細胞とマウス由来の８−アザグアニン耐生株
(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株)ＰＡ−Ｉ(２×１０7個)(順天堂大学医学
部免疫学教室より入手可能)とを約５:１の割合で混合
し、遠心した(１５００rpm、５分)。得られた細胞のペ
レットに、５０％ポリエチレングリコール４０００(メ
ルク製)／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の温水
中で撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭ
Ｉ１６４０液１５mlを撹拌しながら６分間要して加え、
細胞融合を行った。融合後、大量(約４０ml)のＲＰＭＩ
１６４０液を加え、遠心分離(１５００rpm、５分)して
上清を除去した。次いで、ヒポキサンチン(１００μ
Ｍ)、アミノプテリン(０．４μＭ)、チミジン(１０μ
Ｍ)を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地(ＨＡＴ
培地)を用いて、脾細胞が１×１０6個／mlになるように
調製した。
た。取り出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地に浮遊させ、脾細胞を１×１０8個得
た。この脾細胞とマウス由来の８−アザグアニン耐生株
(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ欠損株)ＰＡ−Ｉ(２×１０7個)(順天堂大学医学
部免疫学教室より入手可能)とを約５:１の割合で混合
し、遠心した(１５００rpm、５分)。得られた細胞のペ
レットに、５０％ポリエチレングリコール４０００(メ
ルク製)／ＲＰＭＩ１６４０溶液２mlを、３７℃の温水
中で撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭ
Ｉ１６４０液１５mlを撹拌しながら６分間要して加え、
細胞融合を行った。融合後、大量(約４０ml)のＲＰＭＩ
１６４０液を加え、遠心分離(１５００rpm、５分)して
上清を除去した。次いで、ヒポキサンチン(１００μ
Ｍ)、アミノプテリン(０．４μＭ)、チミジン(１０μ
Ｍ)を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地(ＨＡＴ
培地)を用いて、脾細胞が１×１０6個／mlになるように
調製した。
【００１９】(４)ハイブリドーマの選択 上記(３)で調製した細胞浮遊液を９６ウェルマイクロプ
レート５枚に２００μlずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ2
下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１週
間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成して、
増殖していることが確認できた。
レート５枚に２００μlずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ2
下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養した。１週
間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形成して、
増殖していることが確認できた。
【００２０】(５)抗体のスクリーニング 得られたハイブリドーマが産生する抗体がＣＤ４８分子
を発現しているマウスＭＢＬ−２とマウスＣＤ２−Ｒg
との反応を阻害するか否かをＦＡＣＳで調べた。ＭＢＬ
−２を回収後、フィッシャーチューブに細胞を１×１０
6個ずつ入れ、培養上清およびマウスＣＤ２−Ｒgを２０
０μl入れ、氷上で２０分反応させ、ＰＢＳで遠心洗浄
(３０００rpm、１分、３回)し、ＦＩＴＣ−抗ヒトＩgＧ
(Ｆc)(カルタゴ製)(１００倍希釈)を１００μl入れ、氷
上で２０分反応させ、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行い、Ｐ
ＢＳ２００μlに懸濁後、ＦＡＣＳcanで測定した。な
お、上記(１)'で調製したＣＤ２分子を使用する場合に
は、上記ＦＩＴＣ-抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃ)に代えて、ＦＩ
ＴＣ-抗マウスＣＤ２抗体(ＲＭ２-１)(生化学工業)を用
いる。
を発現しているマウスＭＢＬ−２とマウスＣＤ２−Ｒg
との反応を阻害するか否かをＦＡＣＳで調べた。ＭＢＬ
−２を回収後、フィッシャーチューブに細胞を１×１０
6個ずつ入れ、培養上清およびマウスＣＤ２−Ｒgを２０
０μl入れ、氷上で２０分反応させ、ＰＢＳで遠心洗浄
(３０００rpm、１分、３回)し、ＦＩＴＣ−抗ヒトＩgＧ
(Ｆc)(カルタゴ製)(１００倍希釈)を１００μl入れ、氷
上で２０分反応させ、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行い、Ｐ
ＢＳ２００μlに懸濁後、ＦＡＣＳcanで測定した。な
お、上記(１)'で調製したＣＤ２分子を使用する場合に
は、上記ＦＩＴＣ-抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃ)に代えて、ＦＩ
ＴＣ-抗マウスＣＤ２抗体(ＲＭ２-１)(生化学工業)を用
いる。
【００２１】(６)クローニング (５)で選択したウェルで増殖しているハイブリドーマを
限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が１
個／ウェルとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４
０培地で希釈し、９６ウェルプレートに２００μlずつ
分注した。約１週間後、ハイブリドーマの増殖が認めら
れ、コロニーがある程度の大きさになってから、上記
(５)の方法で再度抗体の検出を行った。この操作を２回
繰り返し、安定にＭＢＬ−２細胞とマウスＣＤ２−Ｒg
の反応を阻害する抗体を産生するクローンを１種得るこ
とができた。このクローンをＨＭ４８−１と命名し、免
疫沈降を行うことにより、マウスＣＤ４８分子に対する
モノクローナル抗体かどうかチェックした。
限界希釈法でクローニングした。希釈後の細胞濃度が１
個／ウェルとなるように１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４
０培地で希釈し、９６ウェルプレートに２００μlずつ
分注した。約１週間後、ハイブリドーマの増殖が認めら
れ、コロニーがある程度の大きさになってから、上記
(５)の方法で再度抗体の検出を行った。この操作を２回
繰り返し、安定にＭＢＬ−２細胞とマウスＣＤ２−Ｒg
の反応を阻害する抗体を産生するクローンを１種得るこ
とができた。このクローンをＨＭ４８−１と命名し、免
疫沈降を行うことにより、マウスＣＤ４８分子に対する
モノクローナル抗体かどうかチェックした。
【００２２】(７)免疫沈降 ＭＢＬ−２細胞、ＣＴＬＬ−２細胞(ＡＴＣＣ ＴＩＢ
２１４)を７５cm2培養フラスコ中で１０％ＦＣＳ-ＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて１×１０7個培養した。１５００r
pm、５分の遠心分離によりＭＢＬ−２およびＣＴＬＬ−
２を回収した後、ＰＢＳにて１回遠心洗浄した。その
後、ＨＢＳＳ(ハンクス緩衝液)で３回遠心洗浄した。
２１４)を７５cm2培養フラスコ中で１０％ＦＣＳ-ＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて１×１０7個培養した。１５００r
pm、５分の遠心分離によりＭＢＬ−２およびＣＴＬＬ−
２を回収した後、ＰＢＳにて１回遠心洗浄した。その
後、ＨＢＳＳ(ハンクス緩衝液)で３回遠心洗浄した。
【００２３】 細胞のビオチン化 上澄液吸引後、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ(ヘペス)緩衝液(p
Ｈ８．０)含有の生理食塩水２mlに懸濁した。その後、
１０mg／mlのＳulfo ＮＨＳ−ビオチンを２０μl入
れ、４０分室温でローテーターを用いて反応させた。そ
の後、４℃に冷却したＲＰＭＩ１６４０溶液にて３回遠
心洗浄した。
Ｈ８．０)含有の生理食塩水２mlに懸濁した。その後、
１０mg／mlのＳulfo ＮＨＳ−ビオチンを２０μl入
れ、４０分室温でローテーターを用いて反応させた。そ
の後、４℃に冷却したＲＰＭＩ１６４０溶液にて３回遠
心洗浄した。
【００２４】 細胞の溶解 ビオチン化した細胞のペレットに４００μlの溶菌緩衝
液(１％ＮＰ−４０、２０mＭ、Ｔris−ＨＣl、１５０m
Ｍ、ＮaＣl、２mＭ ＣaＣl2、２mＭ ＭgＣl2、１０μ
Ｍ Ａ−ＰＭＳＦ(フェニルメチルスルホニルクロライ
ド)、５０μg／mlトリプシンインヒビター)を加え、よ
く撹拌した後、氷上にて３０分間放置した。その後、１
５０００rpmで１０分間遠心した後、上澄液を回収し
た。これを２００μlずつ２本に分けた。
液(１％ＮＰ−４０、２０mＭ、Ｔris−ＨＣl、１５０m
Ｍ、ＮaＣl、２mＭ ＣaＣl2、２mＭ ＭgＣl2、１０μ
Ｍ Ａ−ＰＭＳＦ(フェニルメチルスルホニルクロライ
ド)、５０μg／mlトリプシンインヒビター)を加え、よ
く撹拌した後、氷上にて３０分間放置した。その後、１
５０００rpmで１０分間遠心した後、上澄液を回収し
た。これを２００μlずつ２本に分けた。
【００２５】 プレクリアー(preclear) 正常ハムスターＩgＧをＣＮＢｒ活性化セファロースゲ
ル(ファルマシア製)に結合させたビーズ１００μlを回
収した上澄液２００μlに入れ、４℃で一晩反応させ、
非特異的結合タンパク質を除去した。その後、１２００
０rpm、１分間の遠心分離によりゲルを沈降させ、上清
を回収した。
ル(ファルマシア製)に結合させたビーズ１００μlを回
収した上澄液２００μlに入れ、４℃で一晩反応させ、
非特異的結合タンパク質を除去した。その後、１２００
０rpm、１分間の遠心分離によりゲルを沈降させ、上清
を回収した。
【００２６】 免疫沈降 回収した上清１本目には、今回樹立したハイブリドーマ
ＨＭ４８−１が産生する抗体をＣＮＢｒ活性化セファロ
ースゲル(ファルマシア製)に結合したビーズ１００μl
を、もう１本には、マウスおよびラットの血清をＣＮＢ
ｒ活性化セファロースゲルに結合したビーズ１００μl
を入れ、４℃で２時間反応させた。洗浄液(０．５％Ｎ
Ｐ−４０、２０mＭ Ｔris−ＨＣl、０．６Ｍ ＮaＣl)
で３回遠心洗浄した後、ゲルに２％ＳＤＳを含むサンプ
ル緩衝液(１０％グリセロール、５％ ２−メルカプトエ
タノール、２％ＳＤＳ、０．６２５Ｍ Ｔris−ＨＣl(p
Ｈ６．８)、ＢＰＢ(ブロモ・フェノール・ブルー)１mg
／１００ml)を２０μl入れ、５分間煮沸した。その後、
４％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(第１化薬製)を用
い電気泳動した。電気泳動後、トランスブロットシステ
ム(バイオラッド製)を用いてニトロセルロース膜(ミリ
ポア製)に移した。
ＨＭ４８−１が産生する抗体をＣＮＢｒ活性化セファロ
ースゲル(ファルマシア製)に結合したビーズ１００μl
を、もう１本には、マウスおよびラットの血清をＣＮＢ
ｒ活性化セファロースゲルに結合したビーズ１００μl
を入れ、４℃で２時間反応させた。洗浄液(０．５％Ｎ
Ｐ−４０、２０mＭ Ｔris−ＨＣl、０．６Ｍ ＮaＣl)
で３回遠心洗浄した後、ゲルに２％ＳＤＳを含むサンプ
ル緩衝液(１０％グリセロール、５％ ２−メルカプトエ
タノール、２％ＳＤＳ、０．６２５Ｍ Ｔris−ＨＣl(p
Ｈ６．８)、ＢＰＢ(ブロモ・フェノール・ブルー)１mg
／１００ml)を２０μl入れ、５分間煮沸した。その後、
４％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(第１化薬製)を用
い電気泳動した。電気泳動後、トランスブロットシステ
ム(バイオラッド製)を用いてニトロセルロース膜(ミリ
ポア製)に移した。
【００２７】 発色反応 ニトロセルロースをブロックエース(大日本製薬製)に浸
し、１時間放置し、ブロッキングした。その後、ＡＢＣ
溶液(アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ混合液)
(ベクター社、Ｖectastain ＡＢＣキット)に浸し、３
０分間反応させた。０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳに
て３回洗浄(１０分インキュベート×３)した。その後、
アマシャムのＥＣＬウェスタンブロッティングディテク
ションシステムの発色キットを用いて反応させた。その
後、Ｘ線フィルムで露光し、ハイブリドーマＨＭ４８−
１と反応するタンパク質を検出した。その結果ＨＭ４８
−１は、還元下で５０,０００、非還元下で４５,０００
のバントを示した。この結果を図３に示す。
し、１時間放置し、ブロッキングした。その後、ＡＢＣ
溶液(アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ混合液)
(ベクター社、Ｖectastain ＡＢＣキット)に浸し、３
０分間反応させた。０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳに
て３回洗浄(１０分インキュベート×３)した。その後、
アマシャムのＥＣＬウェスタンブロッティングディテク
ションシステムの発色キットを用いて反応させた。その
後、Ｘ線フィルムで露光し、ハイブリドーマＨＭ４８−
１と反応するタンパク質を検出した。その結果ＨＭ４８
−１は、還元下で５０,０００、非還元下で４５,０００
のバントを示した。この結果を図３に示す。
【００２８】(８)シークエンシング このＨＭ４８−１ハイブリドーマが産生する抗体が免疫
沈降する物質がＣＤ４８分子であるかどうかを調べるた
めにタンパク質のＮ末端のアミノ酸のシークエンスを行
った。
沈降する物質がＣＤ４８分子であるかどうかを調べるた
めにタンパク質のＮ末端のアミノ酸のシークエンスを行
った。
【００２９】まず、ＭＢＬ−２細胞１×１０10個から
(７)の免疫沈降の手順に従って得られた物質を、４％〜
２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。このゲ
ルをポリビニルジン・ジフルオリド(ＰＶＤＦ)膜にトラ
ンスファーした。その後、クマシーブリリアントブルー
染色液にてタンパク質を染色した後、クリーンレーザー
を用いて、タンパク質のバンドがある膜をカットした。
カットした膜は、プロテインシーケンサー(ＡＢＩ製、
４７７Ａモデル)を用いてシークエンスした。その結
果、図４に示すように、その配列はマウスＣＤ４８分子
とＮ末端から１７番までにおいて１３個一致し、マウス
ＣＤ４８分子であることを確認した。
(７)の免疫沈降の手順に従って得られた物質を、４％〜
２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した。このゲ
ルをポリビニルジン・ジフルオリド(ＰＶＤＦ)膜にトラ
ンスファーした。その後、クマシーブリリアントブルー
染色液にてタンパク質を染色した後、クリーンレーザー
を用いて、タンパク質のバンドがある膜をカットした。
カットした膜は、プロテインシーケンサー(ＡＢＩ製、
４７７Ａモデル)を用いてシークエンスした。その結
果、図４に示すように、その配列はマウスＣＤ４８分子
とＮ末端から１７番までにおいて１３個一致し、マウス
ＣＤ４８分子であることを確認した。
【００３０】この結果、ＨＭ４８−１は、ＣＤ４８を免
疫沈降することができ、本抗体はマウスＣＤ４８に対す
る抗体であることを確認した。なお、本抗体産生株ＨＭ
４８−１は微生物工業技術研究所に寄託されている(受
託日：平成５年２月１６日，受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ-１
３４３３)。
疫沈降することができ、本抗体はマウスＣＤ４８に対す
る抗体であることを確認した。なお、本抗体産生株ＨＭ
４８−１は微生物工業技術研究所に寄託されている(受
託日：平成５年２月１６日，受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ-１
３４３３)。
【図１】 ＣＤ２−ＲｇとＭＢＬ−２の反応をＦＡＣＳ
で調べた結果を示すグラフである。
で調べた結果を示すグラフである。
【図２】 ＣＤ２分子とＭＢＬ−２の反応をＦＡＣＳで
調べた結果を示すグラフである。
調べた結果を示すグラフである。
【図３】 ＨＭ４８−１により沈降されるＣＤ４８分子
の電気泳動写真の模写図である。
の電気泳動写真の模写図である。
【図４】 ＨＭ４８−１により沈降されるＣＤ４８分子
のアミノ酸配列である。
のアミノ酸配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 八木田 秀雄 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内 (72)発明者 奥村 康 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内 (72)発明者 中田 元巳 大阪府大阪市此花区島屋一丁目１番３号 住友電気工業株式会社大阪製作所内
Claims (5)
- 【請求項１】 マウスの細胞表面分子であるＣＤ４８分
子に特異的に反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ＩgＧ型のハムスター抗体である請求項
１のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 次の各段階： (i) 齧歯類動物をマウスＴ細胞株(ＭＢＬ−２)で免疫感
作し; (ii) 該齧歯類動物から脾臓を摘出して脾細胞の懸濁液
を調製し; (iii) 該脾細胞の懸濁液をマウスのミエローマ細胞と融
合促進剤の存在下で混合して両細胞を融合し; (iv) 融合した細胞を、未融合のミエローマ細胞を支持
しない媒質中で希釈して培養し; (v) ハイブリドーマを含有する各ウェルの上清液につい
て、ＭＢＬ細胞とＣＤ２分子の反応性を阻害する抗体の
存在を確認し; (vi) 所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択した
後、限界希釈法により単一クローンにし; (vii) その単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からなる抗体を回収する;からなることを特徴とする、
請求項１のモノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項４】 該齧歯類動物がアルメニアンハムスター
に属し、該ミエローマ細胞がＰＡ−Iである請求項３の
製造法。 - 【請求項５】 マウスの細胞表面に存在するＣＤ４８分
子に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマＨＭ４８−１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5060087A JPH06269293A (ja) | 1993-03-19 | 1993-03-19 | マウスｃｄ４８に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5060087A JPH06269293A (ja) | 1993-03-19 | 1993-03-19 | マウスｃｄ４８に対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06269293A true JPH06269293A (ja) | 1994-09-27 |
Family
ID=13131958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5060087A Pending JPH06269293A (ja) | 1993-03-19 | 1993-03-19 | マウスｃｄ４８に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06269293A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014203A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de preparation d'une fraction de cellule contenant des cellules souches hematopoietiques |
| US7510877B2 (en) | 2003-09-26 | 2009-03-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| WO2010117059A1 (ja) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 国立大学法人大阪大学 | 形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬 |
-
1993
- 1993-03-19 JP JP5060087A patent/JPH06269293A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014203A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de preparation d'une fraction de cellule contenant des cellules souches hematopoietiques |
| US7510877B2 (en) | 2003-09-26 | 2009-03-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| US7919316B2 (en) | 2003-09-26 | 2011-04-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| US8383404B2 (en) | 2003-09-26 | 2013-02-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| WO2010117059A1 (ja) * | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 国立大学法人大阪大学 | 形質細胞の腫瘍性増殖をきたす疾患の治療薬 |
| US9097717B2 (en) | 2009-04-10 | 2015-08-04 | Osaka University | Methods of killing myeloma stem and precursor cells by administering anti-CD48 antibodies |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |