JPH07133298A

JPH07133298A - ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子

Info

Publication number: JPH07133298A
Application number: JP4104947A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Sugamura; 和夫菅村; Toshiichi Takeshita; 敏一竹下; Hironobu Asao; 裕信浅尾; Masataka Nakamura; 正孝中村; Toshiaki Shimamura; 俊朗嶌村; Manabu Suzuki; 学鈴木; Junji Hamuro; 淳爾羽室
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-04-23
Filing date: 1992-04-23
Publication date: 1995-05-23
Anticipated expiration: 2017-02-12
Also published as: DE69331175T2; DE69331175D1; US5889160A; EP0578932A3; US5705608A; EP0578932A2; EP0578932B1; JP3255699B2; US5510259A

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明はＩＬ−２レセプターγ鎖分子、ＩＬ
−２レセプターγ鎖分子をコ−ドする遺伝子、該遺伝子
を有するベクター、該ベクタ−で形質転換された細胞、
該細胞を培養してＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造す
る方法、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を含有する免疫反
応調節剤及びＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対する抗体
についてのものである。【効果】ＩＬ−２レセプターγ鎖分子及びＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子に対する抗体はいずれも免疫反応調節
剤として極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は（１）ヒトＩＬ−２のシ
グナルの伝達を司るヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、
（２）ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコードする遺
伝子、（３）該遺伝子を有するベクター、（４）該ベク
タ−で形質転換された細胞、（５）該細胞を培養して得
られるＩＬ−２レセプターγ鎖分子の製造方法、（６）
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を含有する免疫反応調
節剤、（７）ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコード
する遺伝子の検出又は定量法、（８）ヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子に結合活性を有する抗体、（９）該抗体
を含有する免疫反応調節剤及び（１０）該抗体を用いる
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の検出、定量法に関す
る。尚、本ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、本発明によ
り初めてその存在が直接示された分子であり、ＩＬ−２
／ＩＬ−２レセプターシステムの解明、免疫異常による
疾患の治療法、診断法を開発するために有用な物質であ
る。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産生さ
れる蛋白質であり、生体内においてキラーＴ細胞の増殖
や分化誘導を始め、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラ
ルキラー（ＮＫ）細胞、及びリンホカイン活性化キラー
（ＬＡＫ）細胞などの種々の免疫担当細胞にも作用する
ことが知られている生体防御上非常に重要な因子である
（Science、２４０巻、１１６９頁、１９８８年）。ま
た、自己成分に対する抗体や自己に対して攻撃するＴ細
胞の出現により、自己成分が自己の持つ免疫機構により
攻撃されることを特徴とする自己免疫疾患と総称される
疾患の殆どは、原因が全く不明の難病であることが知ら
れているが、その自己免疫疾患の中には、ＩＬ−２の過
剰産生や無秩序な産生が、病態を悪化させる大きな要因
の一つと目されているものも少なくない。更に、臓器移
植の際、拒絶反応を抑制できるか否かが移植の成否の分
かれ目となっているが、拒絶反応はＩＬ−２により活性
化されたキラーＴ細胞が移植片に対して攻撃することが
主なメカニズムと考えられている（Transplantation Pr
oceedings、１５巻、２６４頁、１９８３年）。

【０００３】さて、ＩＬ−２の生理活性は、エフェクタ
ー細胞の表面上に存在するＩＬ−２と特異的に結合する
レセプターを介して発揮されることが知られている。活
性化Ｔ細胞上のＩＬ−２レセプターは、ＩＬ−２との結
合親和力の違いから、高親和性（Ｋｄ＝１０¹¹／Ｍ）、
中親和性（Ｋｄ＝１０⁹／Ｍ）、及び低親和性（Ｋｄ＝
１０⁸／Ｍ）結合の３つの型が存在することが知られて
いた。１９８４年に、現在α鎖と称している５５ｋｄの
レセプター分子の遺伝子が単離された（Nature、３１１
巻、６２６頁、１９８４年；Nature、３１１巻、６３１
頁、１９８４年）。本レセプターのｃＤＮＡの真核細胞
への遺伝子導入実験により、α鎖単独で低親和性のレセ
プターとなりうること、機能的な高親和性のレセプター
の形成に必須の分子であることが明らかとなった（Natu
re、３１８巻、４６７頁、１９８５年； Journal of E
xperimental Medicine、１６２巻、３６３頁、１９８６
年； Nature、３２０巻、７５頁、１９８６年）。しか
し、単離されたα鎖ｃＤＮＡには、シグナル伝達領域が
存在しないことから高親和性のレセプターの形成、及び
シグナル伝達に関与する別の分子の存在が推察されるよ
うになった。

【０００４】その後、現在β鎖と称している７５ｋｄの
レセプター分子の遺伝子が単離され（Science、２４４
巻、５５１頁、１９８９年）、リンパ球系細胞への遺伝
子導入実験により、β鎖単独で機能的な中親和性レセプ
ターが、またα鎖とβ鎖を同時に導入すると機能的な高
親和性レセプターがそれぞれ形成されることが確認され
た。これらの結果より、α鎖単独で低親和性のレセプタ
ーが、β鎖単独で中親和性のレセプターが、そしてα鎖
とβ鎖が非共有結合的に会合して高親和性結合のレセプ
ターが形成され、このうちシグナル伝達は中親和性、及
び高親和性のレセプターが構成された場合に生じると考
えられるようになった。

【０００５】ＩＬ−２レセプターのβ鎖ｃＤＮＡの配列
から推定されるβ鎖の構造には、細胞質内領域が２８６
アミノ酸残基というシグナル伝達を担うには充分足りう
る大きさが存在するものの、チロシンキナーゼなどの既
存のシグナル伝達分子との構造上の関連を示唆するアミ
ノ酸配列の相同性は見いだされなかった。また、遺伝子
導入実験をリンパ球系細胞の代りに非リンパ球系細胞で
ある線維芽細胞を用いて行うと、ＩＬ−２レセプターβ
鎖遺伝子を単独に導入して細胞表面に発現させてもＩＬ
−２の結合は生じなかったこと（Science、２４４巻、
５５１頁、１９８９年）、α鎖とβ鎖の遺伝子を同時に
導入すると、確かにリンパ球系の細胞の場合と同様に高
親和性レセプターは形成されるものの、ＩＬ−２の取り
込みは生じず、機能的に完全なレセプターは形成されな
かった（Journal of Immunology、１４５巻、２１７７
頁、１９９０年）。これらの事実は、β鎖が単独でＩＬ
−２の結合能を獲得したり、シグナル伝達能を獲得し機
能的に完全なレセプターを形成するためには、β鎖自身
が何らかの修飾を受けるか、あるいはα鎖及びβ鎖以外
の分子が存在してβ鎖に何らかの相互作用を及ぼすこと
が必要であることを示している。同時にリンパ球系の細
胞では細胞に固有の成分によりその条件が満たされてい
るが、非リンパ球系の細胞である線維芽細胞においては
満たされていないということを示している。

【０００６】最近の研究により、ＩＬ−２治療を行った
患者の末梢血中のＮＫ細胞において、ＩＬ−２の中親和
性結合のサイト数とＩＬ−２レセプターのβ鎖の発現サ
イト数を比較すると、ＩＬ−２結合サイト数ははるかに
少ないこと（Journal of Experimental Medicine、１７
２巻、１１０１頁、１９９０年）、高親和性のＩＬ−２
レセプターを発現している細胞を用いてのＩＬ−２との
化学的架橋実験において、分子量が２２ｋｄ、４０ｋｄ
の分子（Proceedings of the National Academy of Sci
ences USA、８７巻１１頁、１９９０年）、６４ｋｄの
分子（International Immunology、２巻、４７７頁、１
９９０年）、７０ｋｄの分子（Proceedings of the Nat
ional Academy of Sciences USA、８４巻、２００２
頁、１９８７年、Nature、３２７巻、５１８頁、１９８
７年）、９５ｋｄの分子（Proceedings of the Nationa
l Academy of Sciences USA、８４巻、７２４６頁、１
９８７年）、１００ｋｄの分子（Proceedings of the N
ational Academy of SciencesUSA、８７巻、４８６９
頁、１９９０年）、そして９５−１１０ｋｄの分子（Jo
urnal of Immunology、１４５巻、１５５頁、１９９０
年）などのＩＬ−２と複合体を形成しうる様々な分子が
報告され、α鎖、及びβ鎖以外の分子の存在は混沌と
し、真に第三の分子が存在するか否かも不明な状態とな
り、ＩＬ−２の機能の化学的解釈が不可能となった。

【０００７】さて、免疫反応において中心的役割を果た
しているＩＬ−２のシグナル伝達機構を研究し正しく理
解することは、前述の疾患の発症メカニズムの解明、治
療のためにも必須である。そのためには、まずＩＬ−２
レセプターの構成分子として、シグナル伝達を司る第三
のＩＬ−２レセプター分子（以下、ＩＬ−２レセプター
γ鎖分子と称する。）が存在するか否かを明確にしたう
えで、ＩＬ−２／ＩＬ−２レセプターシステムを間接的
に分子レベルで明らかにする必要がある。しかし、現在
までＩＬ−２レセプターγ鎖分子の存在を示唆する報告
はなされているが、ＩＬ−２レセプターγ鎖の本体につ
いては諸説が存在し、分子量すら確定せず、本来同分子
が存在するか否かすら全く不明であり、ましてＩＬ−２
の機能発揮におけるこの第三の分子の役割は全く不明で
ある。従って、その遺伝子を単離し、蛋白分子を発現さ
せて、同分子の機能解析を行い、もってγ鎖分子の存在
を直接証明することが世界的に競われている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は（１）ヒトＩＬ−２のシグナルの伝達を司るヒトＩＬ
−２レセプターγ鎖分子、（２）ヒトＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子をコードする遺伝子、（３）該遺伝子を有す
るベクター、（４）該ベクタ−で形質転換された細胞、
（５）該細胞を培養して得られるＩＬ−２レセプターγ
鎖分子の製造方法、（６）ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖
分子を含有する免疫反応調節剤、（７）ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子をコードする遺伝子の検出又は定量
法、（８）ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合活性
を有する抗体、（９）該抗体を含有する自己免疫疾患の
治療や移植拒絶反応防止に有効な免疫反応調節剤及び
（１０）該抗体を用いるヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分
子の検出、定量法の提供である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下の方法によ
り、目的とするヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子、該ヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコードする遺伝子、該
遺伝子を有するプラスミドベクター、該ベクターで形質
転換された細胞、該形質転換細胞を培養して得られるヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子を製造する方法、及びヒ
トＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合活性を有する抗体
を見いだし、本発明を完成した。以下に本発明を詳細に
説明する。

【００１０】まず、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を細胞
表面上より分離精製するために、ＩＬ−２レセプターα
鎖、及びβ鎖は発現していないが、γ鎖分子を高発現し
ていると考えられるヒトＴリンパ球細胞株ＭＯＬＴ４細
胞を用いる。次に、本ＭＯＬＴ４細胞に、真核細胞発現
用のベクターによりβ鎖のｃＤＮＡを形質導入した細胞
を調製する（以下、ＭＯＬＴβ細胞と称する）。尚、Ｉ
Ｌ−２レセプターγ鎖分子を分離精製するためには、Ｉ
Ｌ−２レセプターβ鎖、及びγ鎖分子を細胞表面上に発
現しているヒト細胞である限りいかなる細胞を用いても
良い。従って、上述したようにγ鎖のみを発現している
ヒト細胞に、発現ベクターによりβ鎖のｃＤＮＡを形質
導入してβ鎖も高発現させた細胞を用いても良い。念の
為に申し述べるが、γ鎖のみを発現しているヒト細胞と
してはＭＯＬＴ４細胞以外を用いても何の問題もない。
さて、形質導入の方法としては、エレクトロポレーショ
ン法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン
法、リポフェクション法など、目的とする遺伝子が形質
導入される限りいかなる方法を用いても良い（Molecula
r Cloning 第三版）。エレクトロポレーション法を用い
た場合には、効率よくβ鎖のｃＤＮＡを形質導入するこ
とができたことより、本方法を用いるのが好ましい。

【００１１】次に、ＭＯＬＴβ細胞にヒトリコンビナン
トＩＬ−２を反応させた後、細胞を可溶化する。可溶化
剤としては、ノニデットＰ−４０やトライトンＸ−１０
０などの界面活性剤を用いれば良い。もちろん、他の界
面活性剤を用いても良い。この可溶化した細胞画分よ
り、ＩＬ−２分子、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及び
γ鎖分子の三者により形成される複合体を分離する。分
離方法としては、如何なる方法を用いても良いが、通常
アフィニティークロマトグラフィーにて分離するのが好
ましい。アフィニティークロマトグラフィーは、抗ヒト
ＩＬ−２抗体、あるいは抗ヒトＩＬ−２レセプターβ鎖
抗体を結合したゲルビーズを用いて行なえる。その場
合、抗ヒトＩＬ−２抗体、あるいは抗ヒトＩＬ−２レセ
プターβ鎖抗体は、それぞれ互いの結合を妨げないも
の、すなわち結合部位そのものを認識しない抗体である
必要がある。また、抗体の由来する動物種は問わない。
更に、抗体としてはポリクロナール抗体でも良いが、望
ましくはモノクローナル抗体を用いる方が良い。抗体を
結合させる支持体としては、アガロースゲルやポリアク
リルアミドゲルなどを使用し、活性化剤として臭化シア
ン（アガロースゲルの場合）やグルタールアルデヒド
（ポリアクリルアミドゲルの場合）を使用すれば良い。
もちろん、上記支持体、活性化剤は一例であって、他の
支持体を用いてもかまわない。

【００１２】我々は、鋭意研究を行い、多数のモノクロ
ーナル抗ＩＬ−２レセプターβ鎖抗体を調製した。この
中から、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターβ鎖への結合を
阻害しない抗体を選択した。次に、その選択したものの
中からＩＬ−２分子、ＩＬ−２レセプターβ鎖分子、及
びγ鎖分子の三者により形成される複合体を分離精製す
るために最も適する抗体を選択して、アフィニティーク
ロマトグラフィーに供することにより、十分量の複合体
を分離精製する事が可能となり、本発明を完成すること
ができた訳である。

【００１３】さて、実際には抗体結合ビーズと可溶化細
胞画分とを混合し反応させた後、ビーズを十分洗浄し、
ビーズに結合しているＩＬ−２分子、ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖分子、及びγ鎖分子の三者を溶出する。溶出剤と
しては、酸、アルカリ、蛋白変性剤、高濃度の塩、イオ
ン性界面活性剤、有機溶媒などが使用できるが、溶出後
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により三者を分離する
ため、電気泳動に影響を与えにくいもの、例えば尿素な
どを用いるのが望ましい。次に、溶出液を電気泳動にか
け、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を分離する。電気泳動
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動や等電点電気
泳動など三者が分離できる限りいかなる方法を用いても
かまわないが、より完全に分離するために、二次元の電
気泳動（１次元目は等電点電気泳動で２次元目はＳＤＳ
電気泳動）を行うのが良い。

【００１４】次に、電気泳動後、ポリアクリルアミドゲ
ル中のＩＬ−２レセプターγ鎖分子を含む蛋白質をポリ
ビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ電気的に転
写し、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子が転写された部位を
切り出す。この場合、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子が転
写される部位を同定するために、同じ条件で作製したゲ
ルを用い、同じ条件で溶出画分の一部を電気泳動し、蛋
白染色して位置を決定しておくと良い。この後、ＩＬ−
２レセプターγ鎖分子が転写されている切り出した膜を
気相アミノ酸シークエンサーにかけ、ＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子のＮ末端からのアミノ酸配列を決定する。
尚、このアミノ酸分析からの情報及びｃＤＮＡ配列から
の情報から最終的に決定したＩＬ−２レセプターγ鎖分
子のＮ末端アミノ酸配列は配列表の配列番号８に記載さ
れている。また、本発明において、世界で初めてヒト由
来の他の蛋白質を実質的に含有しないヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子を精製でき、そのＮ末端付近のアミノ酸
配列を決定できたわけである。

【００１５】得られたアミノ酸配列より、その配列に相
当する考えられ得るすべてのＤＮＡ配列を推測し、図１
に示すようなＮ末端側（５’側）１７ｍｅｒのＤＮＡオ
リゴマー混合物４種（図１中のオリゴマ−Ｎｏ１から４
に対応）とＣ末端側（３’側）１５ｍｅｒのＤＮＡオリ
ゴマー（Ｃ末端側は相補的配列、図１中のオリゴマ−Ｎ
ｏ１から２に対応）混合物２種をデザインし、ＤＮＡ合
成機を用いて合成する。なお、デザインするオリゴマ
ーの部位はこの限りでなく、オリゴマー同士に挟まれる
部分がある程度（１５ｍｅｒ程度）の距離をもっていさ
えいれば、如何なる部位でもよく、オリゴマーの長さは
１５ｍｅｒ以上であれば如何なる長さでも良い。但し、
３’側プライマーは本来の配列の相補的配列を３’側か
ら５’側の方向にデザインしなければならない。

【００１６】また、これとは別にＭＯＬＴβ細胞からメ
ッセンジャーＲＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）、若し
くはランダムヘキサマーをプライマーとしてｃＤＮＡ、
及びｃＤＮＡライブラリーを作製する。メッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取する細胞は、ヒトのＩＬ−２
レセプターγ鎖分子を発現している細胞である限りいか
なる細胞でも構わない。また、メッセンジャーＲＮＡの
調製は、チオシアン酸グアニジン法（Biochemistry、１
３巻、２６３３頁、１９７４年）などにより総ＲＮＡ画
分を得た後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムなどを用
いて行える。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、λｇｔ１
０，λｇｔ１１、λＺＡＰＩＩなどのファージベクター
やｐＢＲ、ｐＵＣなどのプラスミドベクターを使用すれ
ば良い。作製したｃＤＮＡを用い、上述の合成したＤＮ
Ａオリゴマーをプライマーとして、Taqポリメラーゼに
よるPolymerase Chain Reaction（ＰＣＲ）を行い（Sci
ence、２３０巻、１３５０頁、１９８５年）、増幅され
たｃＤＮＡを回収した。更にこのように回収したｃＤＮ
Ａを³²Ｐ標識してプローブとし、上述のｃＤＮＡライブ
ラリーよりＩＬ−２レセプターγ鎖のｃＤＮＡを含むク
ローンを得、その塩基配列をdideoxy法（Science、２１
４巻、１２０５頁、１９８１年）により決定した。

【００１７】その塩基配列、及びこの塩基配列より導き
出されるＩＬ−２レセプターγ鎖分子の構造は配列表の
配列番号３の通りである。本ＩＬ−２レセプターγ鎖分
子は、オープンリーディングフレームが３６９個のアミ
ノ酸からなり、うちシグナル配列が２２個のアミノ酸
で、成熟型ポリペプチド配列が３４７個のアミノ酸から
なることが明らかとなった。即ち、配列表の配列番号３
記載の配列において−２２番目のＭｅｔから−１番目の
Ｇｌｙがシグナルペプチドに該当する。シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子は−２２番のＭｅｔに対応するＡ
ＴＧから−１番目のＧｌｙに対応するＧＧＧまでであ
る。また、成熟型ポリペプチドは配列表の配列番号３記
載の配列において、１番目のＬｅｕから３４７番目のＴ
ｈｒまである。成熟型ポリペプチドをコ−ドする遺伝子
は１番目のＬｅｕに対応するＣＴＧから３４７番目のＴ
ｈｒに対応するＡＣＣである。尚、成熟型ポリペプチド
にシグナルがついたプレ体のアミノ酸配列及び対応する
塩基配列は配列表の配列番号４に、成熟型ポリペプチド
のアミノ酸配列及び対応する塩基配列は配列表の配列番
号５に示されている。

【００１８】配列表の配列番号３において、成熟型ポリ
ペプチドの内、１番目のＬｅｕから２３２番目のＡｓｎ
までが細胞外領域、２３３番目のＰｒｏから２６１番目
のＬｅｕまでが細胞膜貫通領域、２６２番目のＧｌｕか
ら３４７番目のＴｈｒまでが細胞内領域であることを明
らかにした。

【００１９】さて、得られたＩＬ−２レセプターγ鎖の
ｃＤＮＡが機能的なＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコー
ドするｃＤＮＡであることを確認するために、本ｃＤＮ
Ａを真核細胞で発現するべく発現ベクターに連結した後
に、ＩＬ−２レセプターα鎖、β鎖、及びγ鎖を発現し
ていないヒト細胞に、（１）ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃ
ＤＮＡ単独、（２）β鎖単独、（３）γ鎖及びβ鎖を同
時、（４）α鎖及びβ鎖を同時、又は（５）ＩＬ−２レ
セプターγ鎖、α鎖、β鎖を同時に形質導入した。発現
ベクターとしては、真核細胞で発現する限りいかなるベ
クターを用いても良いが、例えばSimian Virus 40初期
プロモーター系のベクターを用いれば良い。

【００２０】形質導入する細胞はマウスＬ９２９を使用
したが、もちろんそれ以外の細胞を使用しても良い。形
質導入の方法は前述の通りである。なお、ＩＬ−２レセ
プターγ鎖のｃＤＮＡを導入したマウスＬ９２９細胞
（Ｌγ−４と称する）は微工研に寄託されている（寄託
番号は、ＦＥＲＭＰ−１２９２７である）。次に、そ
れぞれのｃＤＮＡを導入した細胞のＩＬ−２結合能、結
合親和力、及び細胞内取り込み能をそれぞれ測定し、本
遺伝子産物の機能解析を行ったところ、β鎖ｃＤＮＡの
単独導入では、ＩＬ−２との結合能を示さないが、β鎖
とγ鎖のｃＤＮＡを同時に導入することにより、ＩＬ−
２との結合が中親和性の結合を示すとともにＩＬ−２の
取り込みが生ずること、更にα鎖とβ鎖のｃＤＮＡの導
入では偽高親和性の結合を示し、ＩＬ−２の取り込みは
生じないのに対し、α、β、γ鎖を同時に導入すること
により、ＩＬ−２との結合が高親和性の結合を示すとと
もにＩＬ−２の取り込みが生ずることが示された。すな
わち、ＩＬ−２レセプターは５５ｋｄのα鎖、７５ｋｄ
のβ鎖以外に、本発明で初めて見いだしたＩＬ−２のシ
グナル伝達に関与するγ鎖によって構成されることが立
証され、本遺伝子産物がＩＬ−２レセプターγ鎖分子と
してＩＬ−２の機能発現に不可欠な分子であることが初
めて見いだされたわけである。

【００２１】次に、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子の遺伝
子工学による生産法について記載する。本ＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子を生産するためには、ＣＨＯ細胞、マウ
スＬ９２９細胞等の真核生物又は大腸菌等の原核生物を
宿主として発現させれば良い。尚、ベクタ−としてはそ
れぞれの宿主で発現可能なベクターを適宜選択して用い
れば良い。通常、原核生物を宿主として用いるより、真
核生物を宿主とするほうがＩＬ−２レセプターγ鎖分子
の発現には適している。

【００２２】さて、配列表の配列番号５記載のアミノ酸
配列を有する成熟型ＩＬ−２レセプターγ鎖分子をＣＨ
Ｏ、マウスＬ９２９細胞等の真核生物で生産する時に
は、配列表の配列番号４に記載されているアミノ酸配列
に対応する遺伝子を用いれば良い。より詳細には配列表
の配列番号４記載に記載されている−２２番目のＭｅｔ
から３４７番目のＴｈｒまでのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子に適当なストップコドンがついた遺伝子を用い
れば良い。この場合、配列表の配列番号４記載のアミノ
酸配列をコードする遺伝子であれば如何なる塩基配列の
ものを用いても良い。従って、天然の配列（ｃＤＮＡ配
列）でなくても良い。合成で作成した遺伝子であっても
良い。しかし、配列表の配列番号４記載の遺伝子を用い
るのが好ましい。尚、配列表の配列番号４記載の遺伝子
はＩＬ−２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡでる。念の為
に申し述べるが、配列表の配列番号４記載の遺伝子配列
はＴＧＡというストップコドンが入っているので問題無
いが、合成遺伝子を用いる場合は３４７番目のＴｈｒに
対応するコドン後にストップコドンを忘れずにつける点
に留意する必要がある。

【００２３】配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列を
有する成熟型ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を大腸菌等の
原核生物で生産させる場合は、開始コドンＡＴＧと適当
なストップコドンの間に、配列表の配列番号５記載のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入して用いれば良
い。もちろん、この場合も配列表の配列番号５記載のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子であれば、配列表の配列
番号５に記載されている天然の配列でなくても良い。し
かし、好ましくは配列表の配列番号５記載の天然の配列
を用いるのが良い。

【００２４】水溶液に可溶性なＩＬ−２レセプターγ鎖
分子（本発明においては成熟型ＩＬ−２レセプターγ鎖
分子から膜貫通領域及び細胞質内を削除したものをい
う、以後可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子と称する）
及び可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコードする遺
伝子も世界で初めて調製した。

【００２５】さて、可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子
を生産するためには、ＩＬ−２レセプターγ鎖の細胞外
領域をコードする部位の３’末端付近にｓｔｏｐコドン
に変異させたｃＤＮＡを作成して、同様に発現ベクター
に組み入れＣＨＯ細胞、マウスＬ９２９細胞等の真核生
物又は大腸菌等の原核生物にて発現させれば良い。宿主
細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれでも用い
れるが、好ましくは真核生物を用いるのが良い。

【００２６】本発明において、可溶性ＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子をコードする遺伝子としては２３０番目のＬ
ｙｓをコードするＡＡＡの後にストップコドンＴＡＧを
つけて調製した（配列表の配列番号６記載の塩基配列参
照）。可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子のアミノ酸配
列は配列表の配列番号７に記載されている。また、シグ
ナルペプチドが結合した前駆体のアミノ酸配列は配列表
の配列番号６に記載されている。念の為に申し述べる
と、前駆体の−２２番目のＭｅｔから−１番目のＧｌｙ
までがシグナルペプチドであり、１番目のＬｅｕから２
３０番目のＬｙｓまでが本体となる。

【００２７】ＣＨＯ細胞、マウスＬ９２９細胞等の真核
生物を用いて、可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を生
産する為には、配列表の配列番号６に記載されているア
ミノ配列をコードする遺伝子に適当なストップコドンを
連結させた遺伝子を用いれば良い。配列表の配列番号６
に記載されているアミノ配列をコードする遺伝子であれ
ば、如何なる塩基配列の遺伝子を用いても良い。従っ
て、クローニングした天然に存在する遺伝子に拘る必要
はない。しかし、配列表の配列番号６記載の塩基配列、
すなわち天然に存在する遺伝子配列を用いるのが好まし
い。

【００２８】大腸菌等の原核生物を用いて、可溶性ＩＬ
−２レセプターγ鎖分子を生産する場合は、開始コドン
ＡＴＧと適当なストップコドンの間に、配列表の配列番
号７記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入して
用いれば良い。もちろん、この場合も配列表の配列番号
７記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子であれば、配
列表の配列番号７に記載されている天然の配列でなくて
も良い。しかし、好ましくは配列表の配列番号７記載の
天然の配列を用いるのが良い。

【００２９】さて、宿主を培養して、目的とするＩＬ−
２レセプターγ鎖分子又は可溶性ＩＬ−２レセプターγ
鎖分子を製造する時の培地条件、培養条件は従来からよ
く行われている方法を用いれば良い。具体的には、大腸
菌等の原核生物を宿主とするときはＬ培地等を用いれば
よい。培養条件は通常３７℃で１２−１６時間程度培養
すれば良い。また、ＣＨＯ細胞、マウスＬ９２９細胞等
の真核生物を宿主とするときは、１０％牛胎児血清を含
むダルベッコ変法イーグル培地等を用いれば良い。培養
条件は特にこだわらないが、通常５％ＣＯ₂存在下、３
７ ℃で３−４日間培養すれば良い。

【００３０】このようにして得られたＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子又は可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を精
製するのだが、精製法は通常よく用いられている方法を
用いれば良い。精製の一例としては、イオン交換クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォ
−カシング、ゲル濾過、ＳＤＳ電気泳動等の方法を単独
又は組み合わせて用いれば良い。このようにして、ヒト
由来の他の蛋白質を実質的に含有しない組換え型ヒトＩ
Ｌ−２レセプターγ鎖分子を得ることができる。このヒ
ト由来の他の蛋白質を実質的に含有しない組換え型ヒト
ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は後述するように免疫反応
調節剤等の医薬品として利用できる。

【００３１】本発明においてヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子とは、配列表の配列番号５及び７記載のアミノ酸
配列に示されるものに限定されず、ヒトＩＬ−２レセプ
ターγ鎖分子活性を有する全てのポリペプチドを含む。
従って、ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子活性を有する
限り、配列表の配列番号５又は７記載のアミノ酸配列の
一部を変換、置換又はＮ若しくはＣ末端に１若しくは複
数個のアミノ酸が付加されたものも本発明のヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子に含まれる。更に、ヒトＩＬ−２
レセプターγ鎖分子活性を有する限り、ポリペプチド鎖
にポリエチレン付加、アセチル化、又はアミド化処理を
処理を施したものも、本発明におけるヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子に含まれる。ヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子の製造法も遺伝子組換え法に拘るものではない、
即ち固相法等の化学合成法を用いても構わない。

【００３２】さて、本発明のＩＬ−２レセプターγ鎖分
子を免疫反応調節剤として使用できる。即ち、本発明は
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を治療上有効量含有う
してなる免疫反応調節剤である。ＩＬ−２レセプターγ
鎖分子を含有する免疫反応調節剤中のヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子の添加量は免疫反応調節剤１００重量％
あたり、通常０．１−１００重量％、好ましくは０．５
−７０重量％である。必要に応じて、マンニトール等の
安定化剤、賦形剤を添加してもよい。本免疫反応調節剤
の投与方法は経口投与でもよいが、好ましくは静脈注射
等による非経口投与の方が好ましい。従って、非経口投
与として用いる場合は非経口投与にてきする形態に調製
するのが望ましい。投与量は通常ヒト成人１日あたり、
通常０．００１−１０００ｍｇ、好ましくは０．０１−
１０ｍｇ投与すればよい。もちろん、上記投与量は一応
の目安にすぎず、病状、体重等により、適宜選択すれば
よい。本発明のＩＬ−２レセプターγ鎖分子を含有する
免疫調節剤が適応される疾患としては、例えば慢性関節
リウマチ、臓器移植時の拒絶反応等を挙げることができ
る。もちろん、上記疾患には拘るものではない。

【００３３】また、本ＩＬ−２レセプターγ鎖のｃＤＮ
Ａは、細胞や組織等に存在しているＩＬ−２レセプター
γ鎖の遺伝子を検出、定量にも利用できる。具体的に
は、本ｃＤＮＡを³²Ｐなどのアイソトープ、あるいはビ
オチン標識したものをプローブとして用い、ＤＮＡの検
出定量の場合には、いわゆるサザンブロット法（Journa
l of Molecular Biology、98巻、503頁、1975年）によ
り、またＲＮＡの場合にはノーザンブロット法（Procee
dings of the National Academy of Sciences USA、77
巻、5201頁、1980年）などにより行うことができる。

【００３４】また、本ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖に対
する抗体を作成するためには、上述の方法により分離精
製したヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を免疫原として
もよいが、ヒト以外の免疫に用いる種と同じ種由来の細
胞に、本ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖のｃＤＮＡを形質
導入した細胞を免疫原として用いると効率よく抗体が作
成できる。特に、モノクローナル抗体を作成する場合に
はスクリーニングが容易である。更に、ヒトＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子のＮ末端配列に相当する配列表の配列
番号８記載の配列よりなるペプチドを例えばペプチド合
成機を用いて合成し、ウシ血清アルブミンなど他のキャ
リアー蛋白質に結合させたものを免疫原として用いても
良い。また、配列表の配列番号５又は７記載のアミノ酸
配列中の一部に当たる配列をペプチド合成機を用いて合
成し、同様にキャリアー蛋白質に結合させたものも免疫
原にできる。もちろん、配列表の配列番号５又は７記載
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原にしても
良い。このようにして作成された抗ヒトＩＬ−２レセプ
ターγ鎖抗体は、¹²⁵Ｉなどのアイソトープ又は酵素若
しくはビオチン標識することにより、細胞表面や体液中
に存在するヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子の検出、定
量に使用することができる。この場合抗体はポリクロ−
ナル抗体でも良いが、好ましくはモノクロ−ナル抗体の
ほうが良い。

【００３５】更に、抗ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖抗体
のうち、ＩＬ−２レセプターβ鎖とγ鎖との結合を阻害
し、ＩＬ−２のシグナル伝達を阻害する活性を有する抗
体はＩＬ−２の過剰産生、無秩序な産生が病態を悪化さ
せていると考えられている疾患の診断や治療、臓器移植
の際の拒絶反応の抑制などを目的とした薬剤として使用
することができる。即ち、本発明はＩＬ−２レセプター
γ鎖分子に結合活性を有する抗体を治療上有効量含有し
てなる免疫反応調節剤でもある。抗体はポリクロ−ナル
抗体でも良いが、好ましくはモノクロ−ナル抗体を用い
る方が良い。

【００３６】ＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結合活性を
有する抗体を含有する免疫反応調節剤中の抗ヒトＩＬ−
２レセプターγ鎖分子抗体の含有量は免疫反応調節剤１
００重量％あたり、通常０．１−１００重量％、好まし
くは０．５−７０重量％である。必要に応じて、マンニ
トール等の安定化剤、賦形剤を添加してもよい。本免疫
反応調節剤の投与方法は経口投与でもよいが、好ましく
は静脈注射等による非経口投与の方が好ましい。従っ
て、非経口投与として用いる場合は非経口投与にてきす
る形態に調製するのが望ましい。また、投与量は通常ヒ
ト成人１日あたり、通常０．００１−１０００ｍｇ、好
ましくは０．０１−１０ｍｇ投与すればよい。もちろ
ん、上記投与量は一応の目安にすぎず、病状、体重等に
より、適宜選択すればよい。本発明の抗ＩＬ−２レセプ
ターγ鎖分子抗体を含有する免疫反応調節剤が適応され
る疾患としては、例えば慢性関節リウマチ、臓器移植時
の拒絶反応等を挙げることができる。もちろん、上記疾
患には拘るものではない。

【００３７】ヒトへの適応のために、抗ＩＬ−２レセプ
ターγ鎖抗体を人工的に改変したもの、例えば定常領域
（Ｃ領域）をヒト抗体のＣ領域へと置き換えた抗体、co
mplimentarity determining region以外をヒト抗体へと
置き換えた抗体、可変領域（Ｖ領域）のみを一本鎖にし
て作成した抗体、抗体を酵素消化して作成したフラグメ
ントなども同様の目的の薬剤として使用できるし、更に
はこれらの抗体やフラグメントに他の機能を有する蛋白
質、例えば毒素などを化学的にあるいは遺伝子組換えに
より結合させたものなども使用することができる。以下
本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。

【００３８】

【実施例１】（実施例１、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子の分離精製、
及びＮ末端のアミノ酸配列の決定）４Ｘ１０¹⁰個のＭＯ
ＬＴβ細胞ペレットに、３０ｎＭのヒトリコンビナント
ＩＬ−２（味の素社製）と１０％牛胎児血清（ハイクロ
ン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）を
８００ｍｌ加え、３７℃にて１時間インキュベートし
た。次に、細胞を遠心して（２２０ｇｘ１０分）ペレッ
トとし、８００ｍｌの細胞溶解用緩衝液（０．１４ＭＮ
ａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％アプロチニンを含む２０ｍＭトリス
塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．５）を加えて４℃、１時間イン
キュベートすることにより細胞を可溶化した。

【００３９】その後、マウスモノクローナル抗ＩＬ−２
レセプターβ鎖抗体であるＴＵ１１（International Im
munology、１巻、３７３頁、１９８９年）をゲル１ｍｌ
当たり１０ｍｇ結合させたアフィゲル１０（バイオラッ
ト社製）を１ｍｌつめたカラムに、可溶化した細胞画分
を４℃にて約５０ｍｌ／分の速度で加えた。カラムをま
ず３００ｍｌの洗浄液Ａ（０．１４ＭＮａＣｌ、１％Ｎ
Ｐ−４０、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１％デオ
キシコール酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸塩緩
衝液、ｐＨ７．５）にて洗浄した。次に、３００ｍｌの
洗浄液Ｂ（０．５ＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０を含む２
０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．５）にて洗浄し
た。最後に５０ｍｌの洗浄液Ｃ（２０ｍＭトリス塩酸塩
緩衝液、ｐＨ７．５）にて洗浄した。

【００４０】洗浄したカラムに２ｍｌの８Ｍ尿素を加え
て、カラムに結合しているＩＬ−２／ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖／ＩＬ−２レセプターγ鎖を溶出した。溶出液を
透析チューブ（三光純薬社製）に入れ、減圧下に放置し
て０．４ｍｌまで濃縮し、０．３９ｍｌと０．０１ｍｌ
に分割してそれぞれ二次元のポリアクリルアミド電気泳
動（一次元目は等電点電気泳動、二次元目はＳＤＳ電気
泳動）を行った。０．３９ｍｌの溶出液を泳動したゲル
の方は、泳動された蛋白質を電気的にゲルからイモビロ
ンＰ膜（ミリポア社製）へと転写した。０．０１ｍｌの
溶出液を泳動したゲルの方は、銀染色（第一化学薬品社
製）して、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子の泳動される位
置を確認した。ＩＬ−２レセプターγ鎖分子が転写され
ている部位に当たるイモビロンＰ膜を切り出し、アミノ
酸シークエンサー４７０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）により、以下に示すＮ末端２０アミノ酸残基を決
定した。なお、（）に示した配列は一方に特定できな
かった配列であり、Xは特定できなかった配列を示す。 (Leu,Ile)-(Asn,Cys)-(Thr,Phe)-(Thr,Phe)-Ile-Leu-Th
r-Pro-Asn-Gly-Asn-Glu-(Asp,Arg)-(Thr,Ala)-X-Ala-(A
sp,Gly)-Phe-Phe-Leu

【００４１】（実施例２、ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤ
ＮＡの単離）５Ｘ１０⁶個のＭＯＬＴβ細胞からＲＮＡ
抽出キット（ファルマシア社製）を用いて総ＲＮＡを分
離した。更にｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社製）
を用いて、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡを材
料に、オリゴｄＴをプライマーとしてリバーストランス
クリプターゼ（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを合成し
た。実施例１で得られたＩＬ−２レセプターγ鎖分子の
Ｎ末端アミノ酸配列から、図１に示すような６種類のオ
リゴヌクレオチド（図１においてプライマーＮｏ１−６
に該当）をデザインして、ＤＮＡ合成機３８０Ａ（アプ
ライドバイオシステム社製）により合成し、それらのオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして、合成したｃＤＮ
Ａをサーマルサイクラー（パーキンエルマーシータス社
製）を用い、Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）によるＰ
ＣＲ（変性９４℃、アニール５０℃、合成７２℃、３０
サイクル）を行った。

【００４２】ＰＣＲにより増幅されたｃＤＮＡをＭＥＲ
ＭＡＩＤキット（バイオ１０１社製）により精製した。
あらかじめランダムヘキサマーをプライマーとして、Ｍ
ＯＬＴβ細胞から調製したｃＤＮＡをλＺＡＰＩＩベク
ター（ストラタジーン社製）にクローニングすることに
より作成したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＣＲにより
増幅し精製したｃＤＮＡをランダムプライマー標識キッ
ト（宝酒造社製）を用いて³²Ｐ標識したものをプローブ
とし、プラークハイブリダイゼーションにより１種のｃ
ＤＮＡクローン（ｐＩＬ−２Ｒγ１）を得、７−ＤＥＡ
ＺＡシークエンシングキット（宝酒造社製）により塩基
配列を決定した。この配列は配列表の配列番号１に示し
た。

【００４３】本ｐＩＬ−２Ｒγ１は３’側が欠失してい
たため、更に^３２Ｐ標識したｐＩＬ−２Ｒγ１をプロー
ブとして用い、オリゴｄＴをプライマーとして同様に作
製したｃＤＮＡライブラリーから３種の３’側を完全に
有しているｃＤＮＡクローン（ｐＩＬ−２Ｒγ２、ｐＩ
Ｌ−２Ｒγ３、ｐＩＬ−２Ｒγ４）を得、同様に塩基配
列を決定した（配列表の配列番号２）。なお、ｐＩＬ−
２Ｒγ２、ｐＩＬ−２Ｒγ３、ｐＩＬ−２Ｒγ４はいず
れも同じ塩基配列であったため、５’端が最も長い配列
であったｐＩＬ−２Ｒγ２のみ配列表の配列番号２に掲
載した。

【００４４】このようにして得られたｐＩＬ−２Ｒγ１
とｐＩＬ−２Ｒγ２の配列と併せ、ＩＬ−２レセプター
γ鎖分子の全塩基配列を決定した。ＩＬ−２レセプター
γ鎖分子のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号３に示し
た。更に得られた塩基配列よりアミノ酸配列を推定し、
そのアミノ酸配列も配列表の配列番号３に記載した。そ
の結果、本ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、オープンリ
ーディングフレームが３６９個のアミノ酸からなり、う
ちシグナル配列が２２個のアミノ酸で、成熟型蛋白配列
が３４７個からなることが明らかとなった。即ち、配列
表の配列番号３記載の配列において−２２番目のＭｅｔ
から−１番目のＧｌｙがシグナルペプチドに該当する。
シグナルペプチドをコードする遺伝子は−２２番のＭｅ
ｔに対応するＡＴＧから−１番目のＧｌｙに対応するＧ
ＧＧまでである。また、成熟型ポリペプチドは配列表の
配列番号３記載の配列において、１番目のＬｅｕから３
４７番目のＴｈｒまである。成熟型ポリペプチドをコ−
ドする遺伝子は１番目のＬｅｕに対応するＣＴＧから３
４７番目のＴｈｒに対応するＡＣＣである。尚、ＩＬ−
２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡ、即ち配列表の配列番
号３記載の配列を含むベクターで形質転換された大腸菌
は微工研に寄託されている（寄託番号はＡＪ１２７０
６，ＦＥＲＭＰ−１２９２８である）。

【００４５】更に、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子のうち
細胞外領域が２３２個、細胞膜貫通領域が２９個、細胞
内領域が８６個であることも明らかになった。即ち、配
列表の配列番号３において、成熟型ポリペプチドの内、
１番目のＬｅｕから２３２番目のＡｓｎまでが細胞外領
域、２３３番目のＰｒｏから２６１番目のＬｅｕまでが
細胞膜貫通領域、２６２番目のＧｌｕから３４７番目の
Ｔｈｒまでが細胞内領域である。

【００４６】（実施例３、ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤ
ＮＡ導入細胞へのＩＬ−２の結合）実施例２で得られた
ｃＤＮＡクロ−ンｐＩＬ−２Ｒγ１を制限酵素ＸｂａＩ
及びＮｃｏＩ（共に宝酒造社製）により切断し得た０．
９ｋｂのｃＤＮＡフラグメントと、ｐＩＬ−２Ｒγ２を
同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＮｃｏＩにより切断して得
た０．７ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩによ
り切断後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を
用いて末端を脱リン酸化したｐｃＤＳＲαベクター（Mo
lecular Cellular Biology、８巻、４６６頁、１９８８
年）とそれぞれ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を用いてライゲーションし、発現ベクターｐＳＲＧ
１を構築した（図２）。同様の方法でＩＬ−２レセプタ
ーα鎖のｃＤＮＡを組み入れた発現ベクターｐＳＲＡ
４、ＩＬ−２レセプターβ鎖のｃＤＮＡを組み入れた発
現ベクターｐＳＲＢ５も構築した。

【００４７】ネオマイシン耐性遺伝子とともに、ジーン
パルサー（バイオラッド社製）を用いてｐＳＲＢ５を単
独、ｐＳＲＡ４とｐＳＲＢ５を同時、ｐＳＲＢ５とｐＳ
ＲＧ１を同時、ｐＳＲＡ４、ｐＳＲＢ５、ｐＳＲＧ１を
同時に、それぞれマウスＬ９２９細胞に遺伝子導入して
（５０μｇ／１Ｘ１０⁷個、１５００Ｖ、２５μＦ）、
１ｍｇ／ｍｌの濃度のネオマイシン（ギブコ社製）及び
１０％牛胎児血清を含むダルベッコの変法イーグル培地
（ギブコ社製）にて３週間培養するとともに、限界希釈
法により目的の遺伝子が導入された細胞をそれぞれクロ
ーニングし、Ｌβ−１細胞（ＩＬ−２レセプターβ鎖発
現Ｌ９２９細胞）、Ｌβγ−９細胞（ＩＬ−２レセプタ
ーβ鎖、γ鎖発現Ｌ９２９細胞）、Ｌαβ−２細胞（Ｉ
Ｌ−２レセプターα鎖、β鎖発現Ｌ９２９細胞）、Ｌα
βγ−４細胞（ＩＬ−２レセプターα鎖、β鎖、γ鎖発
現Ｌ９２９細胞）をそれぞれ得た。

【００４８】２ｘ１０⁶個のＬβ−１細胞、Ｌβγ−９
細胞、Ｌαβ−２細胞、Ｌαβγ−４細胞にそれぞれ３
μＭの非標識ＩＬ−２存在下、又は非存在下でクロラミ
ンＴ法により¹²⁵Ｉ標識したＩＬ−２（４ｘ１０⁶ｄｐｍ
／ｐｍｏｌｅ）を種々の濃度でそれぞれ添加して４℃、
１．５時間反応させた。細胞に結合した¹²⁵Ｉ−ＩＬ−
２と結合しなかった¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２の放射活性をそれ
ぞれ測定し、非標識ＩＬ−２を添加した場合の結合放射
活性をバックグラウンドとして差し引き、結合量を計算
するとともに、スキャッチャードプロットをとることに
より、レセプターへのＩＬ−２の結合能、並びに結合親
和力を求めた。

【００４９】図３にスキャッチャードプロットの結果
を、また表１にスキャッチャードプロットのグラフの傾
きより求めた結合親和力を示した。非リンパ球系細胞で
あるマウスＬ９２９細胞に、ヒトＩＬ−２レセプターβ
鎖を単独に発現させたＬβ−１細胞においてはＩＬ−２
は結合しなかったが、γ鎖を同時に発現させたＬβγ−
９細胞においてはリンパ球系細胞の場合と同じようにＩ
Ｌ−２の結合親和力が４．６ｎＭの中親和性の結合を示
した。また、ＩＬ−２レセプターα鎖、及びβ鎖を発現
させたＬαβ−２細胞においては、結合親和力が６００
ｐＭの偽高親和性の結合しか示さなかったが、更にγ鎖
を同時に発現させたＬαβγ−４細胞においてはリンパ
球系細胞の場合と同様に二相性の結合となり、そのうち
高親和性の結合は、７７ｐＭと、リンパ球系細胞のそれ
にほぼ匹敵する値となった。すなわち単離したｃＤＮＡ
は、ヒトのリンパ球系細胞に存在するＩＬ−２レセプタ
ーγ鎖分子をコードするｃＤＮＡそのものであることが
証明された。

【００５０】

【表１】

【００５１】（実施例４、ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤ
ＮＡ導入細胞のＩＬ−２取り込み）２Ｘ１０⁶個のＬβ
γ−９細胞、Ｌαβ−２細胞、Ｌαβγ−４細胞に、１
０ｎＭの¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２を添加し、０℃１時間反応さ
せた後、０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）にて洗浄することにより細胞
に結合しなかった¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２を除いた。次に、細
胞懸濁液を３７℃にて経時的にインキュベートし、直ち
に冷やした０．２Ｍグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．
８）に懸濁して１０分間放置し、溶液中にはがれ落ちた
¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２を細胞膜上のレセプターに結合してい
た¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２量、細胞に残存している¹²⁵Ｉ−ＩＬ
−２を細胞内に取り込まれた¹²⁵Ｉ−ＩＬ−２量として
求めた。その結果、図４に示すように、Ｌαβ−２細胞
では、時間が経ても細胞内へのＩＬ−２の取り込みは生
じなかったが、Ｌβγ−９細胞、及びＬαβγ−４細胞
においては、経時的にＩＬ−２の取り込みが生ずること
が明らかとなった。すなわち、この結果からＩＬ−２レ
セプターγ鎖分子が存在することによりＩＬ−２の細胞
への取り込みが生じるようになり、本分子がＩＬ−２の
シグナル伝達に関与し、ＩＬ−２の機能発現に不可欠な
分子であることが立証された。

【００５２】（実施例５、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子
Ｎ末端ペプチド、及びＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対
する抗体の作成）ＩＬ−２レセプターγ鎖のＮ末端配列
である配列表の配列番号８に当たるペプチドをペプチド
合成機（アプライドバイオシステム社製）を用いて合成
した。合成したペプチド５ｍｇをｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ピアス社
製）により１０ｍｇのＫＬＨ（keyhole limpet hemocya
nin；和光純薬社製）に結合させ、フロインド完全アジ
ュバント（ディフコ社製）と１：１の割合で混合してエ
マルジョンとして、ウサギの場合には１羽当たりその６
分の１量を、マウスの場合には一匹当たりその１２分の
１量をそれぞれ筋肉注射することにより免疫した。同じ
操作を２週間おきに２回行い、ウサギのポリクローナル
を調製する場合には最終免疫より７日後、採血して血清
を分離した。更に血清を４０％飽和硫安により塩析を行
い、プロテインＡセファロース（ファルマシア社製）を
用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧ
画分を得た。血清５０ｍｌより、２７０ｍｇのＩｇＧ画
分が得られた。

【００５３】次に、マウスのモノクローナル抗体を調製
する場合には最終免疫の３日後、マウスの脾臓細胞とマ
ウスミエローマ（P3X63Ag8.653）とを１０：１の割合で
混合し、ポリエチレングリコール＃４０００（フロー社
製）存在下で融合させ、ＨＡＴ溶液（フロー社製）、１
０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて融合細胞
を選択する。融合細胞の培養上清を、１０μｇ／ｍｌの
濃度に調製したペプチドをコートしたフレキシブル９６
穴平底プレート（ファルコン社製）に反応させ、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０と０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、¹²⁵Ｉ標識抗
マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）を反応
させて、同様の方法で洗浄し、各穴に結合した放射活性
を測定することにより、ペプチドに対するマウスモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを選択する。あらかじ
め１週間前にプリスタン（和光純薬社製）を１匹当たり
０．５ｍｌ腹腔内注射したＢａｌｂ／ｃマウスに、更に
ハイブリドーマを１匹当たり１Ｘ１０⁷個腹腔内注射
し、その７〜１０日後腹水を採取する。腹水を４０％飽
和硫安により塩析を行い、プロテインＡセファロースを
用いたアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を
得た。抗体は腹水１０ｍｌから３５ｍｇ回収できる。

【００５４】また、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対す
る抗体を作成する場合には、実施例３に示したような方
法により、Balb/3T3細胞にＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤ
ＮＡを導入して、細胞表面にＩＬ−２レセプターγ鎖分
子を発現させた細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当たり
１Ｘ１０⁷個腹腔内注射して免疫した。更に同様の操作
を２週おきに２度繰り返し、ポリクローナル抗体を得る
場合には、その７日後、採血して血清を分離し、更に血
清を４０％飽和硫安により塩析を行い、プロテインＡセ
ファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー
によりＩｇＧ画分を得た。

【００５５】モノクローナル抗体を得る場合には、最終
免疫の３日後、上述の方法と同様にして融合細胞を得
る。その培養上清をＭＯＬＴ４細胞に反応させ、１０％
牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、¹²⁵Ｉ
標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマシャム社製）
を反応させて、同様の方法で洗浄し、細胞に結合した放
射活性を測定することにより、ＩＬ−２レセプターγ鎖
分子に対するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを選択する。抗体は上述の方法と同様にして得た。
ポリクローナル抗体は血清１ｍｌより４ｍｇ回収でき、
モノクローナル抗体は腹水１０ｍｌ当たり、２３〜３８
ｍｇ得ることができる。

【００５６】（実施例６、可溶性ＩＬ−２レセプターγ
鎖の調製）細胞外領域の３’端にｓｔｏｐコドンを持つ
ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを調製するため、ＤＮ
Ａ合成機３８０Ａにより合成したそれぞれ内部にＸｈｏ
Ｉサイトを有するオリゴマー5'-AGCTCGAGCGCCATGTTGAAG
CCAT-3'と5'-AACTCGAGAGGATTCTATTTTGAAGTAT-3'をプラ
イマーとし、実施例３で作成したｐＳＲＧ１を鋳型とし
てサーマルサイクラーを用い、Taqポリメラーゼによる
ＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２
０サイクル）を行った。約０．８ｋｂの増幅されたバン
ドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）にて切断後、Ｘ
ｈｏＩで切断しアルカリフォスファターゼにて末端を脱
リン酸化したｐＳＤ（Ｘ）ベクター（Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅ
ｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ、８５巻、２４
３４頁、１９８８年）とライゲーションし、正方向に挿
入されているものを選択しｐＳＤ−Ｇ１を構築した。発
現ベクタ−ｐＳＤ−Ｇ１の構築図は図６に示した。すな
わち、この操作により配列表の配列番号６記載のよう
に、２３０番目のＬｙｓをコードするＡＡＡコドンの後
にストップコドンＴＡＧが挿入された配列を調製するこ
とができたわけである。

【００５７】１．５Ｘ１０^５個の対数増殖期のＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞株を６ｃｍシャーレ（ファルコン社
製）に撒き、１０％ＦＣＳ、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ
₃、及び１００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン（明治製
菓社製）を含むαＭＥＭ（ギブコ社製）にて３７℃、２
４時間培養し、リン酸カルシウム法（Molecular Clonin
g、第２版、１９８９年）によりプラスミドｐＳＤ−Ｇ
１を導入する。その後、一晩培養し、更に培地を交換し
て２４時間培養して、細胞を分注し更に２４時間培養し
た。次に、上記の培地より核酸を除去した培地に置換し
て、７〜１０日間培養することにより、ｄｈｆｒ⁺細胞
を選択する。その培養上清を、実施例５で作成したモノ
クローナル抗体１０μｇ／ｍｌをコートした９６穴フレ
キシブルプレートに反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０と０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で洗浄後、クロラミンＴ法により¹²⁵Ｉ
標識したモノクローナル抗体（コーティングに用いた抗
体とは異なる抗体）を添加し、同様の方法で洗浄して各
穴に結合した放射活性を測定することにより、可溶性Ｉ
Ｌ−２レセプターγ鎖発現細胞を選択する。

【００５８】可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を高発
現する細胞株の培養上清１５Ｌを、ホロファイバー（ア
ミコン社製）により１５００ｍｌまで濃縮し、実施例５
で作成した抗ＩＬ−２レセプターγ鎖抗体を結合したセ
ファロース４Ｂ、５ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ；ファルマシア
社製）に添加する。１００ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄
後、結合した可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を、
０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．１）により溶出後、直ちに１Ｍ
トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）により中和し、０．
１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ
８．０）に対して透析し、可溶性ＩＬ−２レセプターγ
鎖分子を溶出する。本操作により可溶性ＩＬ−２レセプ
ターγ鎖分子は約１０，０００倍に濃縮され、回収率は
約７０％である。

【００５９】この溶出画分をＯＤＳカラム（山村科学社
製）を用いた逆相ＨＰＬＣにより高純度に精製する。溶
出画分１０ｍｌを０．１％トリフルオロ酢酸（ｐＨ２．
０；ナカライテスク社製）で平衡化したＯＤＳカラムに
添加し、吸着蛋白質を０．１％トリフルオロ酢酸を含む
０〜８０％のアセトニトリルの直線濃度勾配により溶出
して、可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子を分離精製す
る。本操作により、可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子
は約２５，０００倍に濃縮され、最終的な回収率は４５
％である。回収した可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子
のアミノ酸配列をアミノ酸分析機で分析すると配列表の
配列番号７記載のアミノ酸配列を有する。

【００６０】

【発明の効果】本発明のＩＬ−２レセプターγ鎖分子及
び可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子はＩＬ−２／ＩＬ
−２レセプターシステムの解明、免疫反応調節剤等とし
て広く利用可能な有用な物質である。また、本発明の
（１）ヒトＩＬ−２受容体γ鎖分子をコードする遺伝子
及び（２）可溶性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコード
する遺伝子は遺伝子工学の手法を用いることにより、有
用な（１）ＩＬ−２レセプターγ鎖分子及び（２）可溶
性ＩＬ−２レセプターγ鎖分子の生産に供し得る有用な
物質である。更に、ＩＬ−２レセプターγ鎖分子に対す
る抗体も、免疫反応調節剤等に利用可能な有用な物質で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】プライマ−Ｎｏ．１−６の構造を示す。

【図２】発現ベクターｐＳＲＧ１の構築工程を示す図面
である。

【図３】各種細胞上のレセプターへのＩＬ−２の結合状
態を示すスキャッチャードプロットである。

【図４】各種細胞内へのＩＬ−２の取り込みを示す図面
である。

【図５】発現ベクターｐＳＤ−Ｇ１の構築図である。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1062 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ヒトＴリンパ球細胞配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 GAAGAGCAAG CGCCATGTTG AAGCCATCAT TACCATTCAC ATCCCTCTTA TTCCTGCAGC 60 TGCCCCTGCT GGGAGTGGGG CTGAACACGA CAATTCTGAC GCCCAATGGG AATGAAGACA 120 CCACAGCTGA TTTCTTCCTG ACCACTATGC CCACTGACTC CCTCAGCGTT TCCACTCTGC 180 CCCTCCCAGA GGTTCAGTGT TTTGTGTTCA ATGTCGAGTA CATGAATTGC ACTTGGAACA 240 GCAGCTCTGA GCCCCAGCCT ACCAACCTCA CTCTGCATTA TTGGTACAAG AACTCGGATA 300 ATGATAAAGT CCAGAAGTGC AGCCACTATC TATTCTCTGA AGAAATCACT TCTGGCTGTC 360 AGTTGCAAAA AAAGGAGATC CACCTCTACC AAACATTTGT TGTTCAGCTC CAGGACCCAC 420 GGGAACCCAG GAGACAGGCC ACACAGATGC TAAAACTGCA GAATCTGGTG ATCCCCTGGG 480 CTCCAGAGAA CCTAACACTT CACAAACTGA GTGAATCCCA GCTAGAACTG AACTGGAACA 540 ACAGATTCTT GAACCACTGT TTGGAGCACT TGGTGCAGTA CCGGACTGAC TGGGACCACA 600 GCTGGACTGA ACAATCAGTG GATTATAGAC ATAAGTTCTC CTTGCCTAGT GTGGATGGGC 660 AGAAACGCTA CACGTTTCGT GTTCGGAGCC GCTTTAACCC ACTCTGTGGA AGTGCTCAGC 720 ATTGGAGTGA ATGGAGCCAC CCAATCCACT GGGGGAGCAA TACTTCAAAA GAGAATCCTT 780 TCCTGTTTGC ATTGGAAGCC GTGGTTATCT CTGTTGGCTC CATGGGATTG ATTATCAGCC 840 TTCTCTGTGT GTATTTCTGG CTGGAACGGA CGATGCCCCG AATTCCCACC CTGAAGAACC 900 TAGAGGATCT TGTTACTGAA TACCACGGGA ACTTTTCGGC CTGGAGTGGT GTGTCTAAGG 960 GACTGGCTGA GAGTCTGCAG CCAGACTACA GTGAACGACT CTGCCTCGTC AGTGAGATTC 1020 CCCCAAAAGG AGGGGCCCTT GGGGAGGGGC CTGGGGCCTC CC 1062 配列番号：2 配列の長さ：1393 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ヒトＴリンパ球細胞配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 GGGCTGAACA CGACAATTCT GACGCCCAAT GGGAATGAAG ACACCACAGC TGATTTCTTC 60 CTGACCACTA TGCCCACTGA CTCCCTCAGC GTTTCCACTC TGCCCCTCCC AGAGGTTCAG 120 TGTTTTGTGT TCAATGTCGA GTACATGAAT TGCACTTGGA ACAGCAGCTC TGAGCCCCAG 180 CCTACCAACC TCACTCTGCA TTATTGGTAC AAGAACTCGG ATAATGATAA AGTCCAGAAG 240 TGCAGCCACT ATCTATTCTC TGAAGAAATC ACTTCTGGCT GTCAGTTGCA AAAAAAGGAG 300 ATCCACCTCT ACCAAACATT TGTTGTTCAG CTCCAGGACC CACGGGAACC CAGGAGACAG 360 GCCACACAGA TGCTAAAACT GCAGAATCTG GTGATCCCCT GGGCTCCAGA GAACCTAACA 420 CTTCACAAAC TGAGTGAATC CCAGCTAGAA CTGAACTGGA ACAACAGATT CTTGAACCAC 480 TGTTTGGAGC ACTTGGTGCA GTACCGGACT GACTGGGACC ACAGCTGGAC TGAACAATCA 540 GTGGATTATA GACATAAGTT CTCCTTGCCT AGTGTGGATG GGCAGAAACG CTACACGTTT 600 CGTGTTCGGA GCCGCTTTAA CCCACTCTGT GGAAGTGCTC AGCATTGGAG TGAATGGAGC 660 CACCCAATCC ACTGGGGGAG CAATACTTCA AAAGAGAATC CTTTCCTGTT TGCATTGGAA 720 GCCGTGGTTA TCTCTGTTGG CTCCATGGGA TTGATTATCA GCCTTCTCTG TGTGTATTTC 780 TGGCTGGAAC GGACGATGCC CCGAATTCCC ACCCTGAAGA ACCTAGAGGA TCTTGTTACT 840 GAATACCACG GGAACTTTTC GGCCTGGAGT GGTGTGTCTA AGGGACTGGC TGAGAGTCTG 900 CAGCCAGACT ACAGTGAACG ACTCTGCCTC GTCAGTGAGA TTCCCCCAAA AGGAGGGGCC 960 CTTGGGGAGG GGCCTGGGGC CTCCCCATGC AACCAGCATA GCCCCTACTG GGCCCCCCCA 1020 TGTTACACCC TAAAGCCTGA AACCTGAACC CCAATCCTCT GACAGAAGAA CCCCAGGGTC 1080 CTGTAGCCCT AAGTGGTACT AACTTTCCTT CATTCAACCC ACCTGCGTCT CATACTCACC 1140 TCACCCCACT GTGGCTGATT TGGAATTTTG TGCCCCCATG TAAGCACCCC TTCATTTGGC 1200 ATTCCCCACT TGAGAATTAC CCTTTTGCCC CGAACATGTT TTTCTTCTCC CTCAGTCTGG 1260 CCCTTCCTTT TCGCAGGATT CTTCCTCCCT CCCTCTTTCC CTCCCTTCCT CTTTCCATCT 1320 ACCCTCCGAT TGTTCCTGAA CCGATGAGAA ATAAAGTTTC TGTTGATAAT CATCAAAAAA 1380 AAAAAAAAAA AAA 1393 配列番号：3 配列の長さ：1470 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ヒトＴリンパ球細胞配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１５．．１１２４特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１５．．８０特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：８１．．１１２４配列 GAAGAGCAAG CGCC ATG TTG AAG CCA TCA TTA CCA TTC ACA TCC CTC TTA 50 Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu -20 -15 TTC CTG CAG CTG CCC CTG CTG GGA GTG GGG CTG AAC ACG ACA ATT CTG 98 Phe Leu Gln Leu Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu -10 -5 1 5 ACG CCC AAT GGG AAT GAA GAC ACC ACA GCT GAT TTC TTC CTG ACC ACT 146 Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr 10 15 20 ATG CCC ACT GAC TCC CTC AGC GTT TCC ACT CTG CCC CTC CCA GAG GTT 194 Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val 25 30 35 CAG TGT TTT GTG TTC AAT GTC GAG TAC ATG AAT TGC ACT TGG AAC AGC 242 Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser 40 45 50 AGC TCT GAG CCC CAG CCT ACC AAC CTC ACT CTG CAT TAT TGG TAC AAG 290 Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys 55 60 65 70 AAC TCG GAT AAT GAT AAA GTC CAG AAG TGC AGC CAC TAT CTA TTC TCT 338 Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser 75 80 85 GAA GAA ATC ACT TCT GGC TGT CAG TTG CAA AAA AAG GAG ATC CAC CTC 386 Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu 90 95 100 TAC CAA ACA TTT GTT GTT CAG CTC CAG GAC CCA CGG GAA CCC AGG AGA 434 Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg 105 110 115 CAG GCC ACA CAG ATG CTA AAA CTG CAG AAT CTG GTG ATC CCC TGG GCT 482 Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala 120 125 130 CCA GAG AAC CTA ACA CTT CAC AAA CTG AGT GAA TCC CAG CTA GAA CTG 530 Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu 135 140 145 150 AAC TGG AAC AAC AGA TTC TTG AAC CAC TGT TTG GAG CAC TTG GTG CAG 578 Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln 155 160 165 TAC CGG ACT GAC TGG GAC CAC AGC TGG ACT GAA CAA TCA GTG GAT TAT 626 Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr 170 175 180 AGA CAT AAG TTC TCC TTG CCT AGT GTG GAT GGG CAG AAA CGC TAC ACG 674 Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr 185 190 195 TTT CGT GTT CGG AGC CGC TTT AAC CCA CTC TGT GGA AGT GCT CAG CAT 722 Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His 200 205 210 TGG AGT GAA TGG AGC CAC CCA ATC CAC TGG GGG AGC AAT ACT TCA AAA 770 Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys 215 220 225 230 GAG AAT CCT TTC CTG TTT GCA TTG GAA GCC GTG GTT ATC TCT GTT GGC 818 Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly 235 240 245 TCC ATG GGA TTG ATT ATC AGC CTT CTC TGT GTG TAT TTC TGG CTG GAA 866 Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu 250 255 260 CGG ACG ATG CCC CGA ATT CCC ACC CTG AAG AAC CTA GAG GAT CTT GTT 914 Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val 265 270 275 ACT GAA TAC CAC GGG AAC TTT TCG GCC TGG AGT GGT GTG TCT AAG GGA 962 Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly 280 285 290 CTG GCT GAG AGT CTG CAG CCA GAC TAC AGT GAA CGA CTC TGC CTC GTC 1010 Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val 295 300 305 310 AGT GAG ATT CCC CCA AAA GGA GGG GCC CTT GGG GAG GGG CCT GGG GCC 1058 Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala 315 320 325 TCC CCA TGC AAC CAG CAT AGC CCC TAC TGG GCC CCC CCA TGT TAC ACC 1106 Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr 330 335 340 CTA AAG CCT GAA ACC TGAACCCCAA TCCTCTGACA GAAGAACCCC AGGGTCCTGT 1161 Leu Lys Pro Glu Thr 345 AGCCCTAAGT GGTACTAACT TTCCTTCATT CAACCCACCT GCGTCTCATA CTCACCTCAC 1221 CCCACTGTGG CTGATTTGGA ATTTTGTGCC CCCATGTAAG CACCCCTTCA TTTGGCATTC 1281 CCCACTTGAG AATTACCCTT TTGCCCCGAA CATGTTTTTC TTCTCCCTCA GTCTGGCCCT 1341 TCCTTTTCGC AGGATTCTTC CTCCCTCCCT CTTTCCCTCC CTTCCTCTTT CCATCTACCC 1401 TCCGATTGTT CCTGAACCGA TGAGAAATAA AGTTTCTGTT GATAATCATC AAAAAAAAAA 1461 AAAAAAAAA 1470 配列番号：４配列の長さ：１１１０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１１１０特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．６６特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：６７．．１１１０配列 ATG TTG AAG CCA TCA TTA CCA TTC ACA TCC CTC TTA TTC CTG CAG CTG 48 Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu -20 -15 -10 CCC CTG CTG GGA GTG GGG CTG AAC ACG ACA ATT CTG ACG CCC AAT GGG 96 Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly -5 1 5 10 AAT GAA GAC ACC ACA GCT GAT TTC TTC CTG ACC ACT ATG CCC ACT GAC 144 Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp 15 20 25 TCC CTC AGC GTT TCC ACT CTG CCC CTC CCA GAG GTT CAG TGT TTT GTG 192 Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val 30 35 40 TTC AAT GTC GAG TAC ATG AAT TGC ACT TGG AAC AGC AGC TCT GAG CCC 240 Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 45 50 55 CAG CCT ACC AAC CTC ACT CTG CAT TAT TGG TAC AAG AAC TCG GAT AAT 288 Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn 60 65 70 GAT AAA GTC CAG AAG TGC AGC CAC TAT CTA TTC TCT GAA GAA ATC ACT 336 Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 75 80 85 90 TCT GGC TGT CAG TTG CAA AAA AAG GAG ATC CAC CTC TAC CAA ACA TTT 384 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 95 100 105 GTT GTT CAG CTC CAG GAC CCA CGG GAA CCC AGG AGA CAG GCC ACA CAG 432 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 110 115 120 ATG CTA AAA CTG CAG AAT CTG GTG ATC CCC TGG GCT CCA GAG AAC CTA 480 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 125 130 135 ACA CTT CAC AAA CTG AGT GAA TCC CAG CTA GAA CTG AAC TGG AAC AAC 528 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 140 145 150 AGA TTC TTG AAC CAC TGT TTG GAG CAC TTG GTG CAG TAC CGG ACT GAC 576 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 155 160 165 170 TGG GAC CAC AGC TGG ACT GAA CAA TCA GTG GAT TAT AGA CAT AAG TTC 624 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 175 180 185 TCC TTG CCT AGT GTG GAT GGG CAG AAA CGC TAC ACG TTT CGT GTT CGG 672 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 190 195 200 AGC CGC TTT AAC CCA CTC TGT GGA AGT GCT CAG CAT TGG AGT GAA TGG 720 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 205 210 215 AGC CAC CCA ATC CAC TGG GGG AGC AAT ACT TCA AAA GAG AAT CCT TTC 768 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe 220 225 230 CTG TTT GCA TTG GAA GCC GTG GTT ATC TCT GTT GGC TCC ATG GGA TTG 816 Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu 235 240 245 250 ATT ATC AGC CTT CTC TGT GTG TAT TTC TGG CTG GAA CGG ACG ATG CCC 864 Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro 255 260 265 CGA ATT CCC ACC CTG AAG AAC CTA GAG GAT CTT GTT ACT GAA TAC CAC 912 Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His 270 275 280 GGG AAC TTT TCG GCC TGG AGT GGT GTG TCT AAG GGA CTG GCT GAG AGT 960 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser 285 290 295 CTG CAG CCA GAC TAC AGT GAA CGA CTC TGC CTC GTC AGT GAG ATT CCC 1008 Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro 300 305 310 CCA AAA GGA GGG GCC CTT GGG GAG GGG CCT GGG GCC TCC CCA TGC AAC 1056 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn 315 320 325 330 CAG CAT AGC CCC TAC TGG GCC CCC CCA TGT TAC ACC CTA AAG CCT GAA 1104 Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu 335 340 345 ACC TGA 1110 Thr 配列番号：５配列の長さ：１０４４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の特徴特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．１０４４配列 CTG AAC ACG ACA ATT CTG ACG CCC AAT GGG AAT GAA GAC ACC ACA GCT 48 Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala 1 5 10 15 GAT TTC TTC CTG ACC ACT ATG CCC ACT GAC TCC CTC AGC GTT TCC ACT 96 Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr 20 25 30 CTG CCC CTC CCA GAG GTT CAG TGT TTT GTG TTC AAT GTC GAG TAC ATG 144 Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met 35 40 45 AAT TGC ACT TGG AAC AGC AGC TCT GAG CCC CAG CCT ACC AAC CTC ACT 192 Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr 50 55 60 CTG CAT TAT TGG TAC AAG AAC TCG GAT AAT GAT AAA GTC CAG AAG TGC 240 Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys 65 70 75 80 AGC CAC TAT CTA TTC TCT GAA GAA ATC ACT TCT GGC TGT CAG TTG CAA 288 Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln 85 90 95 AAA AAG GAG ATC CAC CTC TAC CAA ACA TTT GTT GTT CAG CTC CAG GAC 336 Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp 100 105 110 CCA CGG GAA CCC AGG AGA CAG GCC ACA CAG ATG CTA AAA CTG CAG AAT 384 Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn 115 120 125 CTG GTG ATC CCC TGG GCT CCA GAG AAC CTA ACA CTT CAC AAA CTG AGT 432 Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser 130 135 140 GAA TCC CAG CTA GAA CTG AAC TGG AAC AAC AGA TTC TTG AAC CAC TGT 480 Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys 145 150 155 160 TTG GAG CAC TTG GTG CAG TAC CGG ACT GAC TGG GAC CAC AGC TGG ACT 528 Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr 165 170 175 GAA CAA TCA GTG GAT TAT AGA CAT AAG TTC TCC TTG CCT AGT GTG GAT 576 Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp 180 185 190 GGG CAG AAA CGC TAC ACG TTT CGT GTT CGG AGC CGC TTT AAC CCA CTC 624 Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu 195 200 205 TGT GGA AGT GCT CAG CAT TGG AGT GAA TGG AGC CAC CCA ATC CAC TGG 672 Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp 210 215 220 GGG AGC AAT ACT TCA AAA GAG AAT CCT TTC CTG TTT GCA TTG GAA GCC 720 Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala 225 230 235 240 GTG GTT ATC TCT GTT GGC TCC ATG GGA TTG ATT ATC AGC CTT CTC TGT 768 Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys 245 250 255 GTG TAT TTC TGG CTG GAA CGG ACG ATG CCC CGA ATT CCC ACC CTG AAG 816 Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys 260 265 270 AAC CTA GAG GAT CTT GTT ACT GAA TAC CAC GGG AAC TTT TCG GCC TGG 864 Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp 275 280 285 AGT GGT GTG TCT AAG GGA CTG GCT GAG AGT CTG CAG CCA GAC TAC AGT 912 Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser 290 295 300 GAA CGA CTC TGC CTC GTC AGT GAG ATT CCC CCA AAA GGA GGG GCC CTT 960 Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu 305 310 315 320 GGG GAG GGG CCT GGG GCC TCC CCA TGC AAC CAG CAT AGC CCC TAC TGG 1008 Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp 325 330 335 GCC CCC CCA TGT TAC ACC CTA AAG CCT GAA ACC TGA 1044 Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr 340 345 配列番号：６配列の長さ：７５９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．７５９特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．６６特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：６７．．７５９配列 ATG TTG AAG CCA TCA TTA CCA TTC ACA TCC CTC TTA TTC CTG CAG CTG 48 Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu -20 -15 -10 CCC CTG CTG GGA GTG GGG CTG AAC ACG ACA ATT CTG ACG CCC AAT GGG 96 Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly -5 1 5 10 AAT GAA GAC ACC ACA GCT GAT TTC TTC CTG ACC ACT ATG CCC ACT GAC 144 Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp 15 20 25 TCC CTC AGC GTT TCC ACT CTG CCC CTC CCA GAG GTT CAG TGT TTT GTG 192 Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val 30 35 40 TTC AAT GTC GAG TAC ATG AAT TGC ACT TGG AAC AGC AGC TCT GAG CCC 240 Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 45 50 55 CAG CCT ACC AAC CTC ACT CTG CAT TAT TGG TAC AAG AAC TCG GAT AAT 288 Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn 60 65 70 GAT AAA GTC CAG AAG TGC AGC CAC TAT CTA TTC TCT GAA GAA ATC ACT 336 Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 75 80 85 90 TCT GGC TGT CAG TTG CAA AAA AAG GAG ATC CAC CTC TAC CAA ACA TTT 384 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 95 100 105 GTT GTT CAG CTC CAG GAC CCA CGG GAA CCC AGG AGA CAG GCC ACA CAG 432 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 110 115 120 ATG CTA AAA CTG CAG AAT CTG GTG ATC CCC TGG GCT CCA GAG AAC CTA 480 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 125 130 135 ACA CTT CAC AAA CTG AGT GAA TCC CAG CTA GAA CTG AAC TGG AAC AAC 528 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 140 145 150 AGA TTC TTG AAC CAC TGT TTG GAG CAC TTG GTG CAG TAC CGG ACT GAC 576 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 155 160 165 170 TGG GAC CAC AGC TGG ACT GAA CAA TCA GTG GAT TAT AGA CAT AAG TTC 624 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 175 180 185 TCC TTG CCT AGT GTG GAT GGG CAG AAA CGC TAC ACG TTT CGT GTT CGG 672 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 190 195 200 AGC CGC TTT AAC CCA CTC TGT GGA AGT GCT CAG CAT TGG AGT GAA TGG 720 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 205 210 215 AGC CAC CCA ATC CAC TGG GGG AGC AAT ACT TCA AAA TAG 759 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys 220 225 230 配列番号：７配列の長さ：６９３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の特徴特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．６９３配列 CTG AAC ACG ACA ATT CTG ACG CCC AAT GGG AAT GAA GAC ACC ACA GCT 48 Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala 1 5 10 15 GAT TTC TTC CTG ACC ACT ATG CCC ACT GAC TCC CTC AGC GTT TCC ACT 96 Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr 20 25 30 CTG CCC CTC CCA GAG GTT CAG TGT TTT GTG TTC AAT GTC GAG TAC ATG 144 Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met 35 40 45 AAT TGC ACT TGG AAC AGC AGC TCT GAG CCC CAG CCT ACC AAC CTC ACT 192 Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr 50 55 60 CTG CAT TAT TGG TAC AAG AAC TCG GAT AAT GAT AAA GTC CAG AAG TGC 240 Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys 65 70 75 80 AGC CAC TAT CTA TTC TCT GAA GAA ATC ACT TCT GGC TGT CAG TTG CAA 288 Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln 85 90 95 AAA AAG GAG ATC CAC CTC TAC CAA ACA TTT GTT GTT CAG CTC CAG GAC 336 Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp 100 105 110 CCA CGG GAA CCC AGG AGA CAG GCC ACA CAG ATG CTA AAA CTG CAG AAT 384 Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn 115 120 125 CTG GTG ATC CCC TGG GCT CCA GAG AAC CTA ACA CTT CAC AAA CTG AGT 432 Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser 130 135 140 GAA TCC CAG CTA GAA CTG AAC TGG AAC AAC AGA TTC TTG AAC CAC TGT 480 Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys 145 150 155 160 TTG GAG CAC TTG GTG CAG TAC CGG ACT GAC TGG GAC CAC AGC TGG ACT 528 Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr 165 170 175 GAA CAA TCA GTG GAT TAT AGA CAT AAG TTC TCC TTG CCT AGT GTG GAT 576 Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp 180 185 190 GGG CAG AAA CGC TAC ACG TTT CGT GTT CGG AGC CGC TTT AAC CCA CTC 624 Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu 195 200 205 TGT GGA AGT GCT CAG CAT TGG AGT GAA TGG AGC CAC CCA ATC CAC TGG 672 Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp 210 215 220 GGG AGC AAT ACT TCA AAA TAG 693 Gly Ser Asn Thr Ser Lys 225 230 配列番号：８配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＬｅｕＡｓｎＴｈｒＴｈｒＩｌｅＬｅｕＴｈｒＰｒｏＡｓｎ
ＧｌｙＡｓｎＧｌｕＡｓｐＴｈｒＴｈｒＡｌａ１５
１０１５ＡｓｐＰｈｅＰｈｅＬｅｕ２０

【手続補正書】

【提出日】平成４年５月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年４月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】得られたアミノ酸配列より、その配列に相
当する考えられ得るすべてのＤＮＡ配列を推測し、図１
に示すようなＮ末端側（５’側）１７ｍｅｒのＤＮＡオ
リゴマー混合物４種（図１中のオリゴマ−Ｎｏ１から４
に対応）とＣ末端側（３’側）２２ｍｅｒのＤＮＡオリ
ゴマー（Ｃ末端側は相補的配列、図１中のオリゴマ−Ｎ
ｏ５から６に対応）混合物２種をデザインし、ＤＮＡ合
成機を用いて合成する。なお、デザインするオリゴマ
ーの部位はこの限りでなく、オリゴマー同士に挟まれる
部分がある程度（１５ｍｅｒ程度）の距離をもっていさ
えいれば、如何なる部位でもよく、オリゴマーの長さは
１５ｍｅｒ以上であれば如何なる長さでも良い。但し、
３’側プライマーは本来の配列の相補的配列を３’側か
ら５’側の方向にデザインしなければならない。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２０】形質導入する細胞はマウスＬ９２９を使用
したが、もちろんそれ以外の細胞を使用しても良い。形
質導入の方法は前述の通りである。なお、ＩＬ−２レセ
プターγ鎖のｃＤＮＡを導入したマウスＬ９２９細胞
（Ｌγ−４と称する）は微工研に寄託されている（寄託
番号は、ＦＥＲＭＢＰ−４１９９（ＦＥＲＭＰ−１
２９２７より移管））。次に、それぞれのｃＤＮＡを導
入した細胞のＩＬ−２結合能、結合親和力、及び細胞内
取り込み能をそれぞれ測定し、本遺伝子産物の機能解析
を行ったところ、β鎖ｃＤＮＡの単独導入では、ＩＬ−
２との結合能を示さないが、β鎖とγ鎖のｃＤＮＡを同
時に導入することにより、ＩＬ−２との結合が中親和性
の結合を示すとともにＩＬ−２の取り込みが生ずるこ
と、更にα鎖とβ鎖のｃＤＮＡの導入では偽高親和性の
結合を示し、ＩＬ−２の取り込みは生じないのに対し、
α、β、γ鎖を同時に導入することにより、ＩＬ−２と
の結合が高親和性の結合を示すとともにＩＬ−２の取り
込みが生ずることが示された。すなわち、ＩＬ−２レセ
プターは５５ｋｄのα鎖、７５ｋｄのβ鎖以外に、本発
明で初めて見いだしたＩＬ−２のシグナル伝達に関与す
るγ鎖によって構成されることが立証され、本遺伝子産
物がＩＬ−２レセプターγ鎖分子としてＩＬ−２の機能
発現に不可欠な分子であることが初めて見いだされたわ
けである。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４４】このようにして得られたｐＩＬ−２Ｒγ１
とｐＩＬ−２Ｒγ２の配列と併せ、ＩＬ−２レセプター
γ鎖分子の全塩基配列を決定した。ＩＬ−２レセプター
γ鎖分子のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号３に示し
た。更に得られた塩基配列よりアミノ酸配列を推定し、
そのアミノ酸配列も配列表の配列番号３に記載した。そ
の結果、本ＩＬ−２レセプターγ鎖分子は、オープンリ
ーディングフレームが３６９個のアミノ酸からなり、う
ちシグナル配列が２２個のアミノ酸で、成熟型蛋白配列
が３４７個からなることが明らかとなった。即ち、配列
表の配列番号３記載の配列において−２２番目のＭｅｔ
から−１番目のＧｌｙがシグナルペプチドに該当する。
シグナルペプチドをコードする遺伝子は−２２番のＭｅ
ｔに対応するＡＴＧから−１番目のＧｌｙに対応するＧ
ＧＧまでである。また、成熟型ポリペプチドは配列表の
配列番号３記載の配列において、１番目のＬｅｕから３
４７番目のＴｈｒまである。成熟型ポリペプチドをコ−
ドする遺伝子は１番目のＬｅｕに対応するＣＴＧから３
４７番目のＴｈｒに対応するＡＣＣである。尚、ＩＬ−
２レセプターγ鎖分子のｃＤＮＡ、即ち配列表の配列番
号３記載の配列を含むベクターで形質転換された大腸菌
は微工研に寄託されている（寄託番号はＡＪ１２７０
６、ＦＥＲＭＢＰ−４２００（ＦＥＲＭＰ−１２９
２８より移管））。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５６】（実施例６、可溶性ＩＬ−２レセプターγ
鎖の調製）細胞外領域の３’端にｓｔｏｐコドンを持つ
ＩＬ−２レセプターγ鎖ｃＤＮＡを調製するため、ＤＮ
Ａ合成機３８０Ａにより合成したそれぞれ内部にＸｈｏ
Ｉサイトを有するオリゴマー5'-AGCTCGAGCGCCATGTTGAAG
CCAT-3'と5'-AACTCGAGAGGATTCTATTTTGAAGTAT-3'をプラ
イマーとし、実施例３で作成したｐＳＲＧ１を鋳型とし
てサーマルサイクラーを用い、Taqポリメラーゼによる
ＰＣＲ（変性９４℃、アニール５５℃、合成７２℃、２
０サイクル）を行った。約０．８ｋｂの増幅されたバン
ドを回収して、ＸｈｏＩ（宝酒造社製）にて切断後、Ｘ
ｈｏＩで切断しアルカリフォスファターゼにて末端を脱
リン酸化したｐＳＤ（Ｘ）ベクター（Proceedings of t
he National Academy of Sciences USA、８５巻、２４
３４頁、１９８８年）とライゲーションし、正方向に挿
入されているものを選択しｐＳＤ−Ｇ１を構築した。発
現ベクタ−ｐＳＤ−Ｇ１の構築図は図５に示した。すな
わち、この操作により配列表の配列番号６記載のよう
に、２３０番目のＬｙｓをコードするＡＡＡコドンの後
にストップコドンＴＡＧが挿入された配列を調製するこ
とができたわけである。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年９月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】発現ベクターｐＳＤ−Ｇ１の構築図である。

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成５年４月８日

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所

【旧受託番号】微工研菌寄第１２９２８号

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所

【新受託番号】微工研条寄第４２００号

【書類名】受託番号変更届

【旧受託番号】微工研菌寄第１２９２７号

【新受託番号】微工研条寄第４１９９号

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＢＤＣ０７Ｋ 16/28 8318−4ＨＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｐ (72)発明者中村正孝宮城県仙台市青葉区柏木３−１−150 (72)発明者嶌村俊朗神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者鈴木学神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者羽室淳爾神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有し
ないヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子。
【請求項２】ヒト由来の他の蛋白質を実質的に含有し
ない組換え型ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子。
【請求項３】Ｎ末端配列が配列表の配列番号８記載の
アミノ酸配列を有するものである請求項１又は２記載の
ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子。
【請求項４】水溶液に可溶性である請求項１又は２記
載のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
【請求項５】配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列
を有する請求項１又は２記載のヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子。
【請求項６】配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列
を有する請求項１又は２記載のヒトＩＬ−２レセプター
γ鎖分子。
【請求項７】配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列
の一部を変換、削除、又はアミノ酸を付加した請求項１
又は２記載のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子。
【請求項８】配列表の配列番号５記載のアミノ酸配列
の一部を変換、削除、又はアミノ酸を付加した請求項１
又は２記載のヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子。
【請求項９】ポリペプチド鎖にポリエチレン付加、ア
セチル化、又はアミド化処理を施したものである請求項
１乃至８記載のポリペプチド。
【請求項１０】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコ
ードする遺伝子。
【請求項１１】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が水
溶液に可溶性なものである請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１２】配列表の配列番号７記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子を有する請求項１０記載の遺伝
子。
【請求項１３】配列表の配列番号７記載の塩基配列を
有する請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１４】配列表の配列番号６記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子を有する請求項１０記載の遺伝
子。
【請求項１５】配列表の配列番号６記載の塩基配列を
有する請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１６】配列表の配列番号５記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子を有する請求項１０記載の遺伝
子。
【請求項１７】配列表の配列番号５記載の塩基配列を
有する請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１８】配列表の配列番号４記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子を有する請求項１０記載の遺伝
子。
【請求項１９】配列表の配列番号４記載の塩基配列を
有する請求項１０記載の遺伝子。
【請求項２０】配列表の配列番号４，５，６及び７記
載のアミノ酸配列の一部を変換、削除、又はアミノ酸を
付加して得られたものをコードする請求項１０記載の遺
伝子。
【請求項２１】請求項１０及至２０記載の遺伝子を有
する組換え発現ベクター。
【請求項２２】組換え発現ベクターが真核生物で発現
させるものである請求項８記載の組換え発現ベクター。
【請求項２３】組換え発現ベクターが原核生物で発現
させるものである請求項８記載の組換え発現ベクター。
【請求項２４】請求項２１，２２又は２３記載の発現
ベクターで形質転換された細胞。
【請求項２５】細胞がＣＨＯ細胞である請求項２４記
載の細胞。
【請求項２６】細胞がマウスＬ９２９細胞である請求
項２４記載の細胞。
【請求項２７】細胞が大腸菌である請求項２４記載の
細胞。
【請求項２８】請求項２５，２６又は２７記載の細胞
を培養してヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を生産さ
せ、培養液中から当該ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子
を採取することを特徴とするヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子の製造方法。
【請求項２９】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を治
療上有効量含有してなる免疫反応調節剤。
【請求項３０】非経口投与に適する形態にある請求項
２９記載の免疫反応調節剤。
【請求項３１】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子が請
求項１乃至９記載のものである請求項２９記載の免疫反
応調節剤。
【請求項３２】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子をコ
ードする遺伝子を用いたサンプル中のヒトＩＬ−２レセ
プターγ鎖分子をコードする遺伝子の定量又は検出法。
【請求項３３】請求項１０乃至２０記載の遺伝子を用
いることを特徴とする請求項３２記載の検出又は定量
法。
【請求項３４】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結
合活性を有する抗体。
【請求項３５】配列表の配列番号５又は７記載のアミ
ノ酸配列を有するヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子を免
疫することにより作成される請求項３４記載の抗体。
【請求項３６】抗体が配列表の配列番号８記載のアミ
ノ酸配列からなるペプチドを免疫することにより作成さ
れる請求項３４記載の抗体。
【請求項３７】抗体がモノクローナル抗体である請求
項３４記載の抗体。
【請求項３８】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結
合活性を有する抗体を治療上有効量含有してなる免疫反
応調節剤。
【請求項３９】ヒトＩＬ−２レセプターγ鎖分子に結
合活性を有する抗体を用いたヒトＩＬ−２レセプターγ
鎖分子の検出又は定量法。