CN116479050A

CN116479050A - 人源化il2rb和/或il2rg基因改造动物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116479050A
Application number: CN202310585807.5A
Authority: CN
Inventors: 尚诚彰; 王琳琳; 赵素曼; 袁江峰
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd; Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd; Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2023-05-23
Publication date: 2023-07-25
Also published as: WO2023226987A1

Abstract

本发明提供了一种IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA蛋白、一种人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因、相关的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA蛋白，可以作为相关信号机理研究、炎症、肿瘤或自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

人源化IL2RB和/或IL2RG基因改造动物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL2RB、IL15、IL15RA和/或IL2RG基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

白细胞介素2受体(interleukin-2receptor，IL2R)是一个异源三聚体蛋白，由α链(IL2Ralpha，CD25)，β链(IL2R beta，CD122)和通用γ链(IL2R gamma，CD132)三条链组成。其中，γ链由IL2家族成员共享(IL4，IL7，IL9，IL15和IL21)；β和γ链参与结合后的信号转导。IL2R表达于一些免疫细胞如淋巴细胞表面，其主要生物学活性包括促进T细胞和NK细胞活化后增殖，促进抗原特异性记忆T细胞的维持等。

IL2RB又称IL15RB、IMD63和P70-75等，编码基因位于人22号染色体上，是一种I型跨膜蛋白，参与T细胞介导的免疫反应，也是形成IL-15受体的三个亚基之一，主要表达在CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg、NK细胞上，受体的激活增加了CD8+效应T细胞的增殖。MGI数据显示，小鼠敲除IL2RB基因后出现溶血性贫血，体内浸润性粒细胞增多，成年小鼠出现不孕不育症状，并于12周死亡。

IL2RG的编码基因位于人X染色体上，在T和B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和粒细胞上广泛表达，是Ig超家族中的64-70kd I型跨膜糖蛋白，也是多种重要免疫因子的共同受体亚基，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，因此被称为受体共同γ链(common gammachain，γc)。通常情况下，在Prkdc^SCID突变或Rag1/2敲除小鼠基础上敲除IL2RG，可使小鼠的T、B细胞进一步缺陷的同时，缺乏成熟的NK细胞，从而显著提高人源细胞和组织的移植效率。此外，在人体内γc突变可以导致X染色体连锁重症联合免疫缺陷(X-SCID)，表现为X染色体连锁隐性遗传，患者生长发育迟缓，极容易受变病原微生物感染。

IL15的编码基因位于人4号染色体上，是一种4α螺旋细胞因子超家族蛋白，受体由IL15RA、IL2RB和IL2RG亚基组成，具有激活T细胞、B细胞和NK细胞，并可介导这些细胞的增殖和存活的功能。此外，IL-15能激活、维持和扩增CD8+记忆性T细胞，而不激活调节性T淋巴细胞(Tregs，具有免疫抑制功能)。IL-15胎盘和骨骼肌表达含量最多，心脏、肺、肝和肾中也能检测到。临床前研究表明，IL-15还能延长NK细胞和CD8记忆T细胞的扩张和活化。这些观察结果导致IL-15的研究成为更好的治疗方法治疗癌症，IL-15在免疫治疗中的另一个特性是维持记忆性T细胞，从而对长期抗肿瘤活性中起到重要作用。

IL-15拥有四个α螺旋二级结构，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21结构相似。高亲和力的IL-15受体为异源三聚体，由α链、β链和γ链组成。其中β链是IL-15与IL-2共同受体亚基；γ链是IL-15与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21共同的受体亚基；而α链(CD215)是IL-15特异性的受体亚基。IL-15在T免疫应答中发挥了重要的作用，IL-15Rβ是开发治疗白癜风疾病药物和抗肿瘤药物以及免疫抑制剂的潜在靶点。但由于IL-15Rβ需要与另两个受体亚基IL-15Rα和IL-15Rγ结合才能激活下游信号通路，开发IL-15Rα人源化小鼠模型，构建模拟人IL-15信号通路的小鼠模型，用于筛选针对IL-15信号通路的抗体药物。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA信号通路在肿瘤、感染及自身免疫性疾病等治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种IL2RG基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包括人IL2RG基因1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部编码的氨基酸序列，或者，包含1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、115、116、117、118、119、120、150、170、200、207bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、50、70、90、97bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至编码胞外区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含SEQ ID NO：5或26编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：5或26编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或26编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含SEQ ID NO：29或84编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：29或84编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：29或84编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：29或84编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白胞外区至少150个连续氨基酸，例如包含至少150、170、190、200、230、231、232、233、234、235、240个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白胞外区包含SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白信号肽至少10个连续氨基酸，例如包含至少10、15、17、19、20、21、22个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白信号肽包含SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白跨膜区至少10个连续氨基酸，例如包含至少10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，包含人IL2RG蛋白胞质区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、86个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白胞质区包含SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：2第284-369位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第284-369位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含非人动物IL2RG蛋白的部分，进一步优选为非人动物IL2RG蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG蛋白还包含非人动物IL2RG蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：2或30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL2RG基因，进一步优选的，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的部分。

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含编码人IL2RG蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IL2RG蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人IL2RG蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人IL2RG蛋白胞外区至少150个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQID NO：2第23-256或23-262位氨基酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包含编码人IL2RG蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，包含编码人IL2RG蛋白信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2第1-22位氨基酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包含编码人IL2RG蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人IL2RG蛋白跨膜区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第263-283位氨基酸的核苷酸序列，优选的，包含编码人IL2RG蛋白胞质区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第284-369位氨基酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因编码人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的包含1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-8号外显子或1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、115、116、117、118、119、120、150、170、200、207bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、50、70、90、97bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至编码胞外区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的包含1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，可选地，还包含8号外显子下游至少1，2，3，4，5，10，30，50，60，61，62，63，64，65，70，90或100bp的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG基因包含SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包含非人动物IL2RG基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RG基因包含非人动物IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化IL2RG基因还包含非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分和8号外显子的部分，或者，1号外显子的部分、6号外显子的部分、7号至8号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG基因还包含编码SEQ IDNO：1第258-369或264-369位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第258-369或264-369位的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第258-369或264-369位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第258-369或264-369位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL2RG基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包括下列任一核苷酸序列：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

B)编码人IL2RG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人IL2RG蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL2RG蛋白的胞外区至少150个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL2RG蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL2RG蛋白的信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因的核苷酸序列；或，

D)人IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，包括人IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-8号外显子或1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、115、116、117、118、119、120、150、170、200、207bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、50、70、90、97bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至编码胞外区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列，优选的，包含SEQ IDNO：5或26所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。

优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入可能包括破坏非人动物内源IL2RG基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源IL2RG基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源IL2RG基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能在插入的目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL2RG蛋白不能正常表达。

其中，所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换。所述相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物IL2RG基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换例如用编码人IL2RG蛋白的胞外区的核苷酸序列替换编码非人动物IL2RG蛋白的胞外区的核苷酸序列，用编码人IL2RG蛋白的信号肽的核苷酸序列替换编码非人动物IL2RG蛋白的信号肽的核苷酸序列，用编码人IL2RG蛋白的信号肽和胞外区的核苷酸序列替换编码非人动物IL2RG蛋白的信号肽和胞外区的核苷酸序列。当然也可以相应外显子的替换例如用人IL2RG基因的1号至6号外显子的全部或部分替换非人动物1号至6号外显子的全部或部分。所述的不相应位置的替换包括外显子位置不相对应或不同功能区的替换，例如用人IL2RG基因1号的部分、2号至8号外显子的全部替换非人动物IL2RG基因的1号的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

优选的，所述的人或人源化IL2RG基因可操作连接到至少一条染色体上内源IL2RG基因的内源调控元件。

所述的人或人源化IL2RG基因在非人动物中通过调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人IL2RG基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物IL2RG基因。

优选的，所述的导入的位置位于IL2RG基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物IL2RG基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物IL2RG基因的1号至6号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO：1的第1-257或1-263位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

在本发明的另一个具体实施方式中，非人动物IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列被替换。

优选的，使用基因编辑技术进行IL2RG基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物IL2RG基因的编码框，将编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列或者人源化IL2RG基因的核苷酸序列插入非人动物IL2RG基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物IL2RG基因的编码框可以采用敲除非人动物IL2RG基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物IL2RG蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物IL2RG基因的编码框可以为敲除非人动物IL2RG基因的1号外显子至8号外显子的全部或部分，优选为敲除1号外显子的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分或敲除1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因的核苷酸序列；或，

D)人IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、115、116、117、118、119、120、150、170、200、207bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、50、70、90、97bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至编码胞外区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：5或26所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物IL2RG基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000086.8至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3、8、24或31所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物IL2RG基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000086.8至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4、9、25或32所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL2RG基因的1号至6号外显子上或1号至8号外显子上。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向IL2RG基因的sgRNA与靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物IL2RG基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL2RG基因上的靶序列上。

优选的，所述的sgRNA靶位点位于IL2RG基因的1号外显子至8号外显子序列上。

优选的，所述的sgRNA在IL2RG基因上的靶序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

在本发明的一个实施方式中，所述sgRNA的靶位点位于IL2RG基因的1号至6号外显子序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向IL2RG基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL2RG基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得IL2RG基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将IL2RG基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为IL2RB、IL15、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL2RB、IL15、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1蛋白中的至少一种，进一步优选的，其他基因为IL2RB、IL15和/或IL15RA。

优选的，所述的IL2RB基因为人源化IL2RB基因。

优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的1号至10号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的1号至10号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的2号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化IL2RB基因包含人IL2RB基因的2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含2-8号外显子之间的任一内含子。

优选的，所述的人源化IL2RB基因包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RB基因的核苷酸序列转录的mRNA为SEQ ID NO：38所示核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，转录的mRNA具有SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RB蛋白包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：39所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的IL15基因为人源化IL15基因。

优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的3号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含3-8号外显子之间的任一内含子，其中，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、70、90、100、110、111bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸，8号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、111、112、113、114、115、120、150、200、300、400、500、1000、1100、1200、1250bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的人源化IL15基因包含SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15基因的核苷酸序列转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：58所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：58所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，转录的mRNA具有SEQ ID NO：58所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：52所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：52所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的IL15RA基因为人源化IL15RA基因。

优选的，所述的人源化IL15RA基因包含人IL15RA基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL15RA基因包含人IL15RA基因的1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，所述的人源化IL15RA基因包含人IL15RA基因的2号至6号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化IL15RA基因包含人IL15RA基因的2号外显子的部分、3号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含2-6号外显子之间的任一内含子。

优选的，所述的人源化IL15RA基因包含SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15RA基因的核苷酸序列转录的mRNA为SEQ ID NO：49所示核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：49所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，转录的mRNA与SEQ ID NO：49所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，转录的mRNA具有SEQ ID NO：49所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15RA蛋白包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：50所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种IL2RG基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源IL2RG蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白跨膜区至少10个连续氨基酸，例如包含至少10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第263-283位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，包含人IL2RG蛋白胞质区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、86个连续氨基酸；所述的人源化IL2RG蛋白胞质区包含SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第284-369位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

A)SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IL2RG基因编码人源化IL2RG蛋白。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列；

优选的，所述人或人源化IL2RG基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性IL2RG基因的内源调控元件。

优选的，所述的非人动物通过将供体核苷酸序列导入非人动物IL2RG基因座构建。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列任一核苷酸序列：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因的核苷酸序列；或，

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL2RB、IL15、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种，进一步优选的，其他基因为IL2RB、IL15和/或IL15RA。

优选的，所述的IL2RB基因为人源化IL2RB基因。

优选的，所述的人源化IL2RB基因包含编码SEQ ID NO：39的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：39的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：39的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：39的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的IL15基因为人源化IL15基因。

优选的，所述的人源化IL15基因包含编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的IL15RA基因为人源化IL15RA基因。

优选的，所述的人源化IL15RA基因包含编码SEQ ID NO：50的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：50的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：50的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：50的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化IL2RG基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因的核苷酸序列；或，

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：6、7、27和/或28。

本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物IL2RG基因，其靶位点位于IL2RG基因的1号外显子至8号外显子序列上。

本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子和/或上述载体的细胞。

本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在IL2RG基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第九方面，提供了一种人源化IL2RG蛋白，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的全部或部分。

A)SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列；

本发明的第十方面，提供了一种人源化IL2RG基因，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的部分。

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因编码上述的人源化IL2RG蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL2RG基因还包含编码SEQ IDNO：1第258-369或264-369位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第258-369或264-369位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ IDNO：1第258-369或264-369位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第258-369或264-369位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列；

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第十一方面，提供了一种IL2RG基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源IL2RG基因的1号外显子至8号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，或者，1号外显子的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

本发明的第十二方面，提供了一种IL2RG基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。

本发明的第十三方面，提供了一种IL2RG基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IL2RG基因的1号外显子至8号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，或者，1号外显子的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

本发明的第十四方面，提供了一种IL2RG基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行IL2RG基因缺失的细胞的构建。

本发明的第十五方面，提供了一种IL15基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含人IL15蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含人IL15基因的1号至8号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL15蛋白包含人IL15基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更优选的，所述的人源化IL15蛋白包含人IL15基因的3号至8号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更进一步优选的，所述的人源化IL15蛋白包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、70、90、100、110、111bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸，8号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、111、112、113、114、115、120、150、200、300、400、500、1000、1100、1200、1250bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含SEQ ID NO：55编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：55编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含SEQ ID NO：58编码的氨基酸序列的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：58编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：58编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：58编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IL15蛋白包含SEQ ID NO：52所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：52所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：52所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：52所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化IL15基因，进一步优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL15基因包含SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15基因还包含非人动物IL15基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化IL15基因包含非人动物IL15基因的1号至8号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化IL15基因至少包含非人动物IL15基因的3号外显子的部分和/或8号外显子的部分，更进一步优选的，所述的人源化IL15基因还包含非人动物IL15基因的1号至2号外显子的全部或部分。

优选的，所述的人源化IL15基因包含编码人IL15蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL15基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：58所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：58所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：58所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL15基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化IL15蛋白的核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列；

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

C)人IL15基因的1号至8号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人IL15基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，包含人IL15基因的3号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含3-8号外显子之间的任一内含子，其中，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、70、90、100、110、111bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸，8号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、111、112、113、114、115、120、150、200、300、400、500、1000、1100、1200、1250bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子；进一步优选包含SEQ ID NO：55所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入可能包括破坏非人动物内源IL15基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源IL15基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源IL15基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能在插入的目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源IL15蛋白不能正常表达。

优选的，所述的人或人源化IL15基因可操作连接到至少一条染色体上内源IL15基因的内源调控元件。

所述的人或人源化IL15基因在非人动物中通过调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人IL15基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物IL15基因。

优选的，所述的导入的位置位于IL15基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物IL15基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物IL15基因的3号至8号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换。

在一个具体实施方式中，编码SEQ ID NO：51所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

优选的，使用基因编辑技术进行IL15基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物IL15基因的编码框，将编码人或人源化IL15蛋白的核苷酸序列或者人源化IL15基因的核苷酸序列插入非人动物IL15基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物IL15基因的编码框可以采用敲除非人动物IL15基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物IL15蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物IL15基因的编码框可以为敲除非人动物IL15基因的3号外显子至8号外显子的全部或部分。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

C)人IL15基因的1号至8号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人IL15基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，包含人IL15基因的3号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含3-8号外显子之间的任一内含子，其中，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、70、90、100、110、111bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸，8号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、111、112、113、114、115、120、150、200、300、400、500、1000、1100、1200、1250bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：55所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物IL15基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：53所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物IL15基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：54所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL15基因的1号至8号外显子上，进一步优选的，位于非人动物IL15基因的3号至8号外显子上。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向IL15基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物IL15基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的IL15基因上的靶序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向IL15基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IL15基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得IL15基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将IL15基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为IL2RG、IL2RB、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种基因。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL2RG、IL2RB、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1蛋白中的至少一种。

优选的，所述的IL2RG基因为人源化IL2RG基因，进一步优选的，所述IL2RG基因为上述人源化IL2RG基因。

优选的，所述人源化IL2RG蛋白为上述人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的IL2RB基因为人源化IL2RB基因。

优选的，所述的IL15RA基因为人源化IL15RA基因。

所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十六方面，提供了一种IL15基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源IL15蛋白表达降低或缺失。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；

优选的，所述人或人源化IL15基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性IL15基因的内源调控元件。

优选的，所述的非人动物通过将供体核苷酸序列导入非人动物IL15基因座构建。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL2RG、IL2RB、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种。

优选的，所述的IL2RB基因为人源化IL2RB基因。

优选的，所述的IL15RA基因为人源化IL15RA基因。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化IL15基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。

优选的，所述的人源化IL15基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

本发明的第十七方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：56和/或67。

本发明的第十八方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。

本发明的第十九方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在IL15基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第二十方面，提供了一种人源化IL15基因，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的部分。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；

优选的，所述的人源化IL15基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第二十一方面，提供了一种人源化IL15蛋白，所述的人源化IL15蛋白由上述的人源化IL15基因编码。

本发明的第二十二方面，提供了一种IL15基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源IL15基因的3号外显子至8号外显子的全部或部分，优选为3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

本发明的第二十三方面，提供了一种IL15基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行非人动物的制备。

本发明的第二十四方面，提供了一种IL15基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IL15基因的3号外显子至8号外显子的全部或部分，优选为3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

本发明的第二十五方面，提供了一种IL15基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体进行IL15基因缺失的细胞的构建。

本发明的第二十六方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；

II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因IL2RB、IL2、IL2RA、IL2RG、IL15、IL15RA、CTLA4、IL10RA、PD-1或PD-L1修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物或八基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源基因座的修饰均可以是纯合或杂合的。

本发明的第二十七方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化IL2RG蛋白、上述的人源化IL15蛋白、人源化IL2RB蛋白和/或人源化IL15RA蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化IL2RG基因、上述的人源化IL15基因、人源化IL2RB基因和/或人源化IL15RA基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十八方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化IL2RG蛋白、上述的人源化IL15蛋白、人源化IL2RB蛋白和/或人源化IL15RA蛋白。或者，所述的瘤组织的基因组包含上述的人源化IL2RG基因、上述的人源化IL15基因、人源化IL2RB基因和/或人源化IL15RA基因，或者，所述荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十九方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第三十方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第三十一方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第三十二方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明的第三十三方面，提供了一种IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化IL15蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人或人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因。

优选的，所述的细胞包含上述的人源化IL2RG基因。

优选的，所述的细胞包含上述的人源化IL15基因。

本发明的第三十四方面，提供了一种包含上述的人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因的构建体或者表达上述的人源化IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。

本发明的第三十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第三十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。

本发明的第三十七方面，提供了一种IL2RG基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人或人源化IL2RG基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化IL2RG蛋白的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL2RG基因为上述的人源化IL2RG基因。

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白为上述的人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL2RG基因座处用人IL2RG基因的基因组片段(优选编码人IL2RG的信号肽、跨膜区、胞外区和/或胞质区的全部或部分序列，或者，编码人IL2RG的信号肽和/或胞外区的全部或部分序列)，和/或，非人动物IL2RG基因的基因组片段(优选编码非人动物IL2RG的跨膜区、胞外区和/或胞质区的全部或部分序列)，导入非人动物IL2RG基因的基因组片段以形成经修饰的IL2RG基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL2RG基因座处用人源化IL2RG基因导入非人动物IL2RG基因的基因组片段以形成经修饰的IL2RG基因。

所述的经修饰的IL2RG基因编码人源化IL2RG蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的导入非人动物IL2RG基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物IL2RG基因的1号至8号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分、2号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，或者，1号外显子的部分、2号外显子至5号外显子的全部和6号外显子的部分被替换。

优选的，所述的经修饰的IL2RG基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明的第三十八方面，提供了一种IL15基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人或人源化IL15基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化IL15蛋白的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IL15基因为上述的人源化IL15基因。

优选的，所述的人源化IL15蛋白为上述的人源化IL15蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL15基因座处用人IL15基因的基因组片段，和/或，非人动物IL15基因的基因组片段，导入非人动物IL15基因的基因组片段以形成经修饰的IL15基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IL15基因座处用人源化IL15基因导入非人动物IL15基因的基因组片段以形成经修饰的IL15基因。

所述的经修饰的IL15基因编码人源化IL15蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的插入为插入非人动物IL15基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的替换为替换非人动物IL15基因的3号外显子的部分、4号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分。

优选的，所述的经修饰的IL15基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

本发明的第三十九方面，提供了一种上述的人源化IL2RG蛋白、上述的人源化IL2RG基因、上述的人源化IL15蛋白、上述的人源化IL15基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA相关的模型系统中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因功能，研究针对人IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA靶位点的药物、药效，研究与IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

优选的，所述应用包括疾病的治疗和/或诊断方法，或，非疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第四十方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA特异性调节剂的筛选。

本发明的第四十一方面，提供了一种人IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法包括治疗方法和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第四十二方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗方法和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。本发明所述的“炎症”包括感染，所述的感染是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于GVHD(移植物抗宿主病)、克罗恩病、动脉粥样硬化、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL2RG基因座”表示IL2RG基因1号至8号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被修饰的IL2RG基因座可以是IL2RG基因1号至8号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化IL2RG蛋白”，包含来源于人IL2RG蛋白的部分。其中，所述的“人IL2RG蛋白”同“人IL2RG蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人IL2RG蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IL2RG蛋白的部分”，为连续或间隔的5-369个(优选为10-256或10-369个)氨基酸序列与人IL2RG蛋白的氨基酸序列一致或与人IL2RG蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化IL2RG基因”，包含来源于人IL2RG基因的部分。其中，所述的“人IL2RG基因”同“人IL2RG基因的全部”，即其核苷酸序列与人IL2RG基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人IL2RG基因的部分”为连续或间隔的20-4225bp(优选为20-4200bp、20-2855bp、20-1560bp、20-1442bp或20-768bp)个核苷酸序列与人IL2RG核苷酸序列一致或与人IL2RG核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化IL15蛋白”，包含来源于人IL15蛋白的部分。其中，所述的“人IL15蛋白”同“人IL15蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人IL15蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IL15蛋白的部分”，为连续或间隔的5-162个(优选为10-162个)氨基酸序列与人IL15蛋白的氨基酸序列一致或与人IL15蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化IL15基因”，包含来源于人IL15基因的部分。其中，所述的“人IL15基因”同“人IL15基因的全部”，即其核苷酸序列与人IL15基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人IL15基因的部分”为连续或间隔的20-97405bp(优选为20-13384bp、20-2012bp或20-489bp)个核苷酸序列与人IL15核苷酸序列一致或与人IL15核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人IL2RG基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-207bp个，优选10-115bp个核苷酸序列与人IL2RG基因的1号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化IL2RG基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸。

本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“IL2RG蛋白”，例如“人IL2RG蛋白”、“非人动物IL2RG蛋白”或“人源化IL2RG蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

本发明有益效果：

利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的基因人源化动物模型，使其体内表达人源蛋白，作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。

利用基因人源化动物模型建立各种疾病模型，可以进行抗人抗体药物的药理药效评价。

优选的，考虑到IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA在信号通路上的功能相互关联，本发明设计出多个基因人源化的技术方案，使得包含上述人源化基因的非人动物能表达出多个人源化或人的相应蛋白，为筛选适合人的试剂提供更为人源化的微环境，从而筛选出的试剂效力更好。

优选的，为便于多个人源化基因的表达，本发明优化了导入的人的IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因的片段选择，以及导入位置的选择，人的IL2RG、IL2RB、IL15和/或IL15RA基因可以无随机插入的导入，并正确表达人源化或人的相应蛋白，可以稳定传代，同时不影响非人动物的其他功能。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠IL2RG基因座和人IL2RG基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠IL2RG基因座人源化改造示意图一(非按比例)；

图3：IL2RG基因打靶策略及靶向载体V1设计示意图(非按比例)；

图4：IL2RG基因打靶策略及靶向载体V2设计示意图(非按比例)；

图5：F0代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图6：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图7：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；

图8：小鼠IL2RG基因座人源化改造示意图二(非按比例)；

图9：IL2RG基因打靶策略及靶向载体V3设计示意图(非按比例)；

图10：IL2RG基因打靶策略及靶向载体V4设计示意图(非按比例)；

图11：小鼠IL2RB基因座和人IL2RB基因座对比示意图(非按比例)；

图12：小鼠IL2RB基因座人源化改造示意图(非按比例)；

图13：IL2RB/IL2RG基因人源化小鼠脾脏中免疫分型检测结果；

图14：IL2RB/IL2RG基因人源化小鼠淋巴结中免疫分型检测结果；

图15：IL2RB/IL2RG基因人源化小鼠血液中免疫分型检测结果；

图16：小鼠IL15RA基因座和人IL15RA基因座对比示意图(非按比例)；

图17：小鼠IL15RA基因座人源化改造示意图(非按比例)；

图18：IL15RA基因打靶策略示意图(非按比例)；

图19：小鼠IL15基因座和人IL15基因座对比示意图(非按比例)；

图20：小鼠IL15基因座人源化改造示意图(非按比例)；

图21：IL15基因打靶策略示意图(非按比例)；

图22：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；

图23：IL15基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图24：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图25：IL15蛋白表达检测结果示意图，其中，(A)为鼠IL15蛋白检测结果，(B)为人IL15蛋白检测结果，+/+为野生型小鼠，H/+为人源化杂合子小鼠；

图26：RT-PCR鉴定IL15/IL5RA基因人源化纯合子小鼠体内hIL15mRNA表达，+/+为野生型小鼠，H/H为人源化纯合子小鼠，H₂O为水对照；

图27：RT-PCR鉴定IL15/IL5RA基因人源化纯合子小鼠体内hIL15RAmRNA表达，+/+为野生型小鼠，H/H为人源化纯合子小鼠，H₂O为水对照；

图28：IL15蛋白表达检测结果示意图，其中，(A)为鼠IL15蛋白检测结果，(B)为人IL15蛋白检测结果，+/+为野生型小鼠，H/H为IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠；

图29：脾脏中白细胞亚群(A)和T细胞亚群占比的流式检测结果(B)，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠；

图30：血液中白细胞亚群(A)和T细胞亚群占比的流式检测结果(B)，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠；

图31：淋巴结中白细胞亚群(A)和T细胞亚群占比的流式检测结果(B)，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠；

图32：IL15蛋白表达检测结果示意图，其中，(A)为鼠IL15/IL15RA蛋白检测结果，(B)为人IL15蛋白检测结果，+/+为野生型小鼠，H/H为

IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图33：脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图34：脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图35：血液中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图36：血液中T细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图37：淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图38：淋巴结中T细胞亚群占比的流式检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠；

图39：IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠体内药效研究中各组小鼠体重统计图；

图40：IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠体内药效研究中各组小鼠体重变化统计图；

图41：IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠体内药效研究中各组小鼠银屑病样皮损处红疹评分统计图；

图42：IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠体内药效研究中各组小鼠银屑病样脱屑评分统计图；

图43：IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠体内药效研究中各组小鼠的PASI综合评分统计图。

具体实施方式

1、一种IL2RG基因人源化非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RG蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化IL2RG基因。

2、根据技术方案1所述的构建方法，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白的胞外区至少150个连续氨基酸；进一步优选的，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列同一性至少为70％以上，或者包含SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列，优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列同一性至少为70％的氨基酸序列，或者包含SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列。

3、根据技术方案1-2任一所述的构建方法，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的包含SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列；和/或，包含SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含与SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列同一性至少为70％，或者包含SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含非人动物IL2RG蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含与SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列同一性至少为70％，或者包含SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列同一性至少为70％；

C)与SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

4、根据技术方案1-3任一所述的构建方法，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为70％；

优选的，所述的人源化IL2RG基因还包含非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分和8号外显子的部分，或者，1号外显子的部分、6号外显子的部分、7号至8号外显子的全部；

优选的，所述的人源化IL2RG基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列的同一性至少为70％；

5、根据技术方案1-4任一所述的构建方法，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL2RG基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包括下列任一核苷酸序列：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

B)编码人IL2RG蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人IL2RG蛋白的胞外区至少150个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人IL2RG蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位氨基酸的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因；或，

D)人IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选的，包含SEQ ID NO：5或26所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为70％的核苷酸序列。

6、根据技术方案1-5任一所述的构建方法，所述人或人源化IL2RG基因可操作连接到至少一条染色体上内源IL2RG基因的内源调控元件。

7、根据技术方案5-6任一所述的构建方法，所述的导入非人动物IL2RG基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分被替换。

8、根据技术方案1-7任一所述的构建方法，所述的构建方法还包括将IL2RG基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自IL2RB、IL15、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种，进一步优选的，其他基因为IL2RB、IL15和/或IL15RA；

优选的，所述人或人源化IL2RG基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。

9、根据技术方案8所述的构建方法，所述的IL15基因为人源化IL15基因，优选的，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，进一步优选的，所述的人源化IL15基因包含编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

10、一种人源化IL2RG蛋白，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的全部或部分。

11、根据技术方案10所述的人源化IL2RG蛋白，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白的胞外区至少150个连续氨基酸；进一步优选的，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列同一性至少为70％以上，或者包含SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列，优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列同一性至少为70％的氨基酸序列，或者包含SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列。

12、根据技术方案10或11所述的人源化IL2RG蛋白，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：2第263-283位所示氨基酸序列；和/或，包含SEQ ID NO：2第284-369位所示氨基酸序列；

优选的，所述的人IL2RG蛋白包含与SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列同一性至少为70％，或者包含SEQ ID NO：2第1-256、1-262或1-369位所示氨基酸序列，

优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含非人动物IL2RG蛋白的部分，进一步优选的，包含与SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列同一性至少为70％，或者包含SEQ ID NO：1第258-369或264-369位所示氨基酸序列；优选的，所述的人源化IL2RG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列同一性至少为70％；

13、一种人源化IL2RG基因，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的部分，优选的，所述的人源化IL2RG基因包含编码技术方案10-12任一所述的人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列。

14、根据技术方案13所述的人源化IL2RG基因，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的1号外显子的部分、2号至8号外显子的全部，或者，1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分；

优选的，所述的人源化IL2RG基因包含SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或26所示的核苷酸序列的同一性至少为70％的核苷酸序列；

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：29或84所示核苷酸序列；

15、一种IL15基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化IL15基因。

16、根据技术方案15所述的构建方法，所述的人或人源化IL15蛋白包含SEQ IDNO：52所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：52所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

17、根据技术方案15-16任一所述的构建方法，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，

优选的，所述的人源化IL15基因包含SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

优选的，所述的人源化IL15基因至少包含非人动物IL15基因的3号外显子的部分和/或8号外显子的部分，进一步优选的，所述的人源化IL15基因还包含非人动物IL15基因的1号至2号外显子的全部或部分；

优选的，所述的人源化IL15基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；

18、根据技术方案15-17任一所述的构建方法，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL15基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

C)人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选的，包含SEQ ID NO：55所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

19、根据技术方案15-18任一所述的构建方法，所述人或人源化IL15基因可操作连接到至少一条染色体上内源IL15基因的内源调控元件。

20、根据技术方案18-19任一所述的构建方法，所述的导入非人动物IL15基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换。

21、根据技术方案15-20任一所述的构建方法，所述的构建方法还包括将IL15基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因为IL2RG、IL2RB、IL15RA、IL2、IL2RA、CTLA4、IL10RA、PD-1和PD-L1基因中的至少一种，进一步优选的，其他基因为IL2RG、IL2RB和/或IL15RA；

优选的，所述人或人源化IL15基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。

22、根据技术方案21所述的构建方法，所述的IL2RG基因为人源化IL2RG基因，优选的，所述IL2RG基因为技术方案13-14任一所述人源化IL2RG基因。

23、一种人源化IL15基因，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的部分。

24、根据技术方案23所述的人源化IL15基因，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的3号外显子的部分、4号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，

优选的，所述的人源化IL15基因包含SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，

优选的，所述的人源化IL15基因还包含非人动物IL15基因的3号外显子的部分和/或8号外显子的部分，进一步优选的，所述的人源化IL15基因还包含非人动物IL15基因的1号至2号外显子的全部或部分；

优选的，所述的人源化IL15基因包含编码人IL15蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：52所示氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：58所示核苷酸序列；

25、一种人源化IL15蛋白，所述的人源化IL15蛋白由技术方案23-24任一所述的人源化IL15基因编码。

26、一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含技术方案13-14任一所述的人源化IL2RG基因、技术方案23-24任一所述的人源化IL15基因、人源化IL2RB基因和/或人源化IL15RA基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达技术方案10-12任一所述的人源化IL2RG蛋白、技术方案25所述的人源化IL15蛋白、人源化IL2RB蛋白和/或人源化IL15RA蛋白，或者，技术方案1-9和15-22任一所述的构建方法获得的非人动物，优选的，所述的组织包括荷瘤后的瘤组织。

27、一种技术方案10-12任一所述的人源化IL2RG蛋白、技术方案13-14任一所述的人源化IL2RG基因、技术方案25所述的人源化IL15蛋白、技术方案23-24任一所述的人源化IL15基因或技术方案1-9和15-22任一所述的构建方法获得的非人动物或技术方案26所述的细胞、组织或器官的应用，所述的应用包含：

28、技术方案12所述的人源化IL2RG蛋白、技术方案14所述的人源化IL2RG基因、技术方案24所述的人源化IL15基因或技术方案1-9和15-22任一所述的构建方法获得的非人动物，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

BspHI酶、BglII酶、MfeI酶、XbaI酶、ScaI酶购自NEB，货号分别为R0517S、R0144S、R0589S、R0145S、R3122S；

C57BL/6小鼠和Flp转基因小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

TRIzol^TM Reagent购自Invitrogen，货号15596018；

Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，货号AttuneNxt；

BioTek Epoch Microplate Reader购自BioTeK，货号EROCH；

FITC anti-Mouse CD19购自Biolegend，货号115506；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain购自Biolegend，货号109228；

PE/Cy^TM 7Mouse anti-mouse NK1.1购自BD Pharmingen，货号552878；

PE anti-human CD132(commonγchain)购自Biolegend，货号338605；

APC anti-mouse CD132(commonγchain)购自Biolegend，货号132307；

APC anti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody购自Biolegend，货号105911；

PE anti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody(hIL2RB)购自Biolegend，货号339005；

Mouse IL-15ELISA Kit购自Abcam，货号ab100701；

Human IL-15Quantikine ELISA Kit购自R&D，货号D1500；

Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45Antibody购自Biolegend，货号103138；

BD Pharmingen^TM PE Rat Anti-Mouse CD215(IL-15Rα)购自bd，货号568235；

PE anti-human CD215(IL-15Rα)Antibody购自Biolegend，货号330207；

Brilliant Violet 711^TM anti-mouse CD11c Antibody购自Biolegend，货号117349；

APC Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400512；

PE Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody(Fc)购自Biolegend，货号402204；

Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号423106；

Purified anti-mouse CD16/32Antibody购自Biolegend，货号101302；

BioLegend PerCP anti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103130；

Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100559；

PE anti-mouse CD8a Antibody购自Biolegend，货号100708；

FOXP3 Monoclonal Antibody(FJK-16s),PerCP-eFluor^TM 710,eBioscience^TM购自Thermo Fisher，货号46-5773-82；

Brilliant Violet 421^TM anti-mouse NK-1.1Antibody购自Biolegend，货号108732；

BioLegend Brilliant Violet 785^TM anti-mouse/human CD11b Antibody购自Biolegend，货号101243；

BioLegend APC anti-mouse F4/80Antibody购自Biolegend，货号123116；

Brilliant Violet 650^TM anti-mouse Ly-6G Antibody购自Biolegend，货号127641；

PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody购自Biolegend，货号101916；

Alexa700anti-mouse CD3 Antibody购自Biolegend，货号100216；

FITC anti-mouse TCRβchain Antibody购自Biolegend，货号109205；

Brilliant Violet 421^TM anti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100438；

Brilliant Violet 711^TM anti-mouse CD8a Antibody购自Biolegend，货号100759；

PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400112；

PE Rat IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400608；

APC Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号402206；

IL-15/IL-15R Complex Mouse ELISA Kit购自Invitrogen，货号BMS6023；

Mouse IL-15ELISA Kit购自Abcam，货号ab275898；

Brilliant Violet 605^TM anti-mouse CD11c Antibody购自Biolegend，货号117334；

PE Rat IgG1,κIsotype Control购自BD，货号551979；

PE Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody(Fc，ICFC)购自Biolegend，货号400314；

eBioscience^TM Fixable Viability Dye eFluor^TM 780购自Thermo Fisher，货号65-0865-14；

Brilliant Violet 711^TM anti-mouse TCRβchain Antibody购自Biolegend，货号109243；

CST Phospho-Stat5(Tyr694)(D47E7)Rabbit mAb购自Cell SignalingTechnology，货号4322S；

APC anti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100412；

Alexa700anti-mouse CD8a Antibody购自Biolegend，货号100730；

PE anti-STAT5 Phospho(Tyr694)Antibody购自Biolegend，货号936904；

Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa488Conjugate)购自CellSignaling Technology，货号4412；

Human IL-2Protein,Tag Free购自Acro biosystems，货号IL2-H4113；

Biotinylated Mouse IL-2Protein购自恺佧生物，货号IL2-MM401B；

Human IL-15Protein,premium grade购自Acro biosystems，货号IL5-H4117；

Human IL-15R alpha/CD215 Protein,Fc Tag购自Acro biosystems，货号ILA-H5253；

Recombinant Mouse IL-15Protein购自R&D，货号447-ML-010；

Recombinant Mouse IL-15R alpha Fc Chimera Protein,CF购自R&D，货号551-MR-100。

实施例1 IL2RG基因人源化小鼠的构建方法一

小鼠IL2RG基因(NCBI Gene ID：16186，Primary source：MGI：96551，UniProt：P34902，位于X号染色体NC_000086.8的第100307991至100311861位，基于转录本NM_013563.4及其编码蛋白NP_038591.1(SEQ ID NO：1))和人IL2RG基因(NCBI GeneID:3561，Primary source：HGNC：6010，UniProt ID：P31785，位于X号染色体NC_000023.11的第71107404至71111631位，基于转录本NM_000206.2及其编码蛋白NP_000197.1(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL2RG基因座引入编码人IL2RG蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化IL2RG蛋白。具体来说，使用基因编辑技术，在小鼠内源IL2RG基因调节元件的控制下，将编码人IL2RG蛋白的核苷酸序列导入小鼠内源IL2RG基因座，例如将包含人IL2RG基因1-8号外显子的部分核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化IL2RG基因座示意图如图2所示，实现对小鼠IL2RG基因的人源化改造。

进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V1上含有上游同源臂(5’同源臂)和下游同源臂(3’同源臂)序列，以及包含编码人IL2RG蛋白的核苷酸序列A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100311776至100315845位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100304102至100308040位核苷酸序列相同；A1片段中包含的人IL2RG核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000023.11的第71107340至71111539位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。Neo盒5’端与人序列的连接设计为：5’-GAAGCCTGGGATGCAATGAGGGTGGGAGGGGAAGAAAAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTA-3’(SEQ ID NO：6)，其中序列“GAAA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列中的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠基因的连接设计为5’-TTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCGATATCATTCAACTGTTTCCAAATCAACAAGAAA-3’(SEQ ID NO：7)，其中序列“TATC”中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/>中的“A”是鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL2RG的mRNA序列如SEQ ID NO：84所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

此外，根据图2还可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图4所示的打靶策略示意图。图中显示了靶向载体V2上含有小鼠IL2RG基因的上、下游同源臂序列，以及编码人IL2RG蛋白的核苷酸序列的A2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：8)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100311776至100313491位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：9)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100306445至100308040位核苷酸序列相同；A2片段序列与NCBI登录号NC_000023.11的第71107340至71111539位相同(SEQ ID NO：5)。改造后的小鼠IL2RG的mRNA序列如SEQ ID NO：84所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。示例性靶序列如下所示：

sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：10)：5’-GTTGTTGAGAGGAAGGCTATGGG-3’

sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：11)：5’-TTTGGAAACAGTTGAATCATAGG-3’

在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT-IL2RG-1和pT-IL2RG-2。pT-sgRNA载体由质粒合成，公司合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA(SEQ ID NO：12)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将获得的表达载体pT-IL2RG-1和pT-IL2RG-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的IL2RG基因人源化小鼠品系。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的示例性鉴定结果见图5。结合PCR引物检测结果，并经测序进一步验证图5中编号为F0-01为阳性小鼠。PCR引物如表1所示：

表1F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

将F0鉴定为阳性的IL2RG基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图6，显示编号为F1-01、F1-02、F1-03和F1-04小鼠为阳性小鼠。PCR引物如表2所示:

表2F1代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

对PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BspHI酶或BglII酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表3。Southern blot检测结果见图7，综合3’探针和5’探针的结果表明，F1-01、F1-02、F1-03和F1-04鼠均无随机插入，这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的IL2RG基因人源化小鼠。

表3具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				BspHI	3’Probe	7.5kb	6.2kb
BglII	LR Probe	6.4kb	4.0kb

探针合成引物如下：

3’Probe：

3’Probe-F：5’-GAATGTAGGGGTGGGGCTAGCATAG-3’(SEQ ID NO：20)；

3’Probe-R：5’-CTAGTAGTCTGCTGGGCTCCACCAC-3’(SEQ ID NO：21)；

LR Probe:

LR Probe-F：5’-GTTGGCTGGATAAACAATTTCAGTAAA-3’(SEQ ID NO：22)；

LR Probe-R：5’-CTAACTAGTACTAACTTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO：23)；

通过常规方法例如流式细胞术检测IL2RG基因人源化小鼠体内IL2RG蛋白的表达情况。具体来说，选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和IL2RG基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏细胞，用鼠源T细胞标记抗体PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTCRb)、B细胞标记抗体FITC anti-Mouse CD19(mCD19)、NK细胞标记抗体PE-Cy^TM 7Mouseanti-mouse NK1.1(mNK1.1)、抗鼠CD132抗体APC anti-mouse CD132(common y chain)(mIL2RG)、抗人CD132抗体PE anti-human CD132(common y chain)(hIL2RG)识别染色后进行流式检测。数据显示，在野生型C57BL/6小鼠NK细胞(特征为mCD45+mTCRβ-mNK1.1+)中检测到鼠IL2RG(特征为mCD45+mTCRβ-mNK1.1+mIL2RG+)阳性细胞的比例为43.0％；在IL2RG基因人源化杂合子小鼠NK细胞中检测到鼠IL2RG的比例为2.37％，人IL2RG的比例为42.8％。结果表明，本方法制备的IL2RG基因人源化小鼠体内可成功表达人IL2RG蛋白。

实施例2 IL2RG基因人源化小鼠的构建方法二

为了达到本发明的目的，也可以将包含人IL2RG基因1-6号外显子部分编码序列替换小鼠相应的核苷酸序列，实现对小鼠IL2RG基因的人源化改造，得到人源化IL2RG基因座示意图如图8所示。

根据图8设计如图9所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V3上含有上游同源臂(5’同源臂)和下游同源臂(3’同源臂)序列，以及包含编码人IL2RG蛋白的核苷酸序列A3片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：24)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100311776至100317900位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：25)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100305674至100309321位核苷酸序列相同；A3片段上人IL2RG基因序列与NCBI登录号为NC_000023.11的第71108685至71111539位核苷酸序列相同(SEQ ID NO：26)。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与人的连接设计为5’-AATGTATAGGATTTCCCTGAAGCATTCCTAGAGAGC TTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCT-3’(SEQ ID NO：27)，其中，序列“GAGC”中的“C”是人的最后一个核苷酸，序列/>的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人的连接设计为5’-TAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCGATATC/>AAGGTGAAGATGGCTTTGGAACCAGCTG-3’(SEQ ID NO：28)，其中序列“TATC”中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/>的第一个“C”是人的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL2RG的mRNA序列如SEQ ID NO：29所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:30所示。

此外，根据图8还可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图10所示的打靶策略示意图。图中显示了靶向载体V4上含有小鼠IL2RG基因的上、下游同源臂序列，以及人IL2RG基因序列A4片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：31)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100311776至100313175位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：32)与NCBI登录号为NC_000086.8的第100307922至100309321位核苷酸序列相同；A4片段基因序列与NCBI登录号为NC000023.11的第71108685至71111539位核苷酸序列相同(SEQ ID NO：26)。改造后的小鼠IL2RG表达的蛋白序列如SEQ ID NO：30所示。

实施例3IL2RB基因人源化小鼠的构建

小鼠IL2RB基因(NCBI Gene ID：16185，Primary source：MGI：96550，UniProt：P16297，位于15号染色体NC_000081.6的第78479256至78511621位，基于转录本NM_008368.4及其编码蛋白NP_032394.1(SEQ ID NO：33))和人IL2RB基因(NCBI Gene ID:3560，Primary source：HGNC：6006，UniProt ID：P14784，位于22号染色体NC_000022.11的第37125838至37175118位，基于转录本NM_000878.5及其编码蛋白NP_000869.1(SEQ IDNO：34))。对比示意图如图11示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL2RB基因座引入编码人IL2RB蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL2RB蛋白。可以采取在小鼠内源IL2RB基因座上直接插入含有人IL2RB的基因序列的方法，例如含有人IL2RB的DNA序列或cDNA序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的小鼠内源IL2RB基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL2RB基因座上直接用人IL2RB的基因序列(例如，人IL2RB的DNA序列或cDNA序列)进行替换。本实施例将以DNA序列的原位替换策略来阐述如何对小鼠IL2RB基因进行人源化改造。

本实施例采用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源IL2RB基因座上用人IL2RB基因的序列替换特定小鼠IL2RB基因序列。在小鼠内源IL2RB基因座，用人2-8号外显子的部分核苷酸序列替换小鼠2-8号外显子的相应序列，改造后的人源化小鼠IL2RB基因座示意图如图12所示，

进一步的，设计打靶策略。其中IL2RB靶向载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：35)、3’同源臂(SEQ ID NO：36)以及人IL2RB DNA片段，其中5’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第78495191至78491766位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第78484605至78479760位核苷酸序列相同；人IL2RB DNA片段(SEQ ID NO：37)与NCBI登录号为NC_000022.11的第37144088至37135435位核苷酸序列相同。

改造后的人源化小鼠IL2RB的mRNA序列如SEQ ID NO：38所示，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO：39所示。

IL2RB靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。

其中，Neo盒上游与小鼠IL2RB基因座的连接设计为5’-ACTCTTGTCTAACCCTCCTTAGAGATTCCCC TGCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(SEQ ID NO：40)，其中序列“TCCCC”的最后一个“C”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列的“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒下游与小鼠IL2RB基因座的连接设计为5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCC/>ACCAGTCATACATCCTGACCCTTGAGGG-3’(SEQ ID NO：41)其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，/>的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。/>

通过流式细胞术确认小鼠体内人源化IL2RB蛋白的表达情况。选取6周龄的野生型C57BL/6小鼠(+/+)和IL2RB基因人源化杂合小鼠(H/+)各1只，腹腔注射7.5μg/200μL的mCD3，24小时后取脾脏细胞进行流式检测。染色方案如下：用抗鼠CD45抗体BrilliantViolet 510^TM anti-mouse CD45(mCD45)、PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse TCRβchainAntibody(mTCRβ)、Brilliant Violet 605^TM anti-mouse CD4 Antibody(mCD4)、BrilliantViolet 711^TM anti-mouse CD8a Antibody(mCD8)标记T细胞，PE-Cy^TM 7Mouse Anti-MouseNK-1.1(mNK1.1)标记NK细胞，再用抗鼠IL2RB抗体APC anti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody(mIL2RB)、或抗人IL2RB抗体PE anti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody(hIL2RB)识别染色后进行流式检测。

T细胞的特征为mCD45+mTCRβ+，其中鼠IL2RB阳性(mIL2RB+)T细胞特征为CD45+mTCRβ+mIL2RB+，人IL2RB阳性(hIL2RB+)T细胞的特征为mCD45+mTCRβ+hIL2RB+；NK细胞的特征为mCD45+mTCRβ-mNK1.1+，其中鼠IL2RB阳性NK细胞的特征为mCD45+mTCRβ-mNK1.1+mIL2RB+，人IL2RB阳性NK细胞的特征为mCD45+mTCRβ-mNK1.1+hIL2RB+。

流式分析结果如表4所示,与野生型C57BL/6小鼠相比，IL2RB基因人源化杂合小鼠体内检测到人源化IL2RB蛋白，而在C57BL/6小鼠体内未检测到人源化IL2RB蛋白。

表4 IL2RB基因人源化杂合小鼠IL2RB流式检测结果

实施例4 IL2RB/IL2RG双基因人源化鼠的制备

由于鼠IL2RB与IL2RG基因分别位于15号和X号染色体上，选择实施例1制备的IL2RG基因人源化小鼠与实施例3制备的IL2RB基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，得到IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠。

通过流式细胞术检测IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内IL2RB蛋白和IL2RG蛋白的表达情况。具体来说，分别选取9周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的9周龄雌性IL2RB/IL2RG双基因人源化纯合小鼠(H/H；H/H)各1只，腹腔注射7.5μg/200μL的mCD3，24小时后取脾脏细胞进行流式检测。使用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45 antibody(mCD45)、PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain antibody(mTCRβ)、APC anti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody(mIL2RB)、PE anti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody(hIL2RB)、PE anti-human CD132(common y chain)antibody(mIL2RG)、APCanti-mouse CD132(common y chain)antibody(hIL2RG)识别染色后进行流式检测，结果如表5所示。

T细胞中鼠IL2RB阳性(mIL2RB+)和IL2RG阳性(mIL2RG+)T细胞的特征分别为mCD45+mTCRβ+mIL2RB+和mCD45+mTCRβ+mIL2RG+，人IL2RB阳性(hIL2RB+)和IL2RG阳性(hIL2RG+)T细胞的特征分别为mCD45+mTCRβ+hIL2RB+和mCD45+mTCRβ+hIL2RG+。

表5 IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内IL2RB和IL2RG流式检测结果

组别	mIL2RB+	hIL2RB+	mIL2RG+	hIL2RG+
					+/+	10.6％	0.65％	14.4％	1.12％
H/H；H/H	0.12％	8.43％	0.68％	6.89％

结果显示，本实施例制备获得的IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内可成功表达人IL2RB和IL2RG蛋白。

进一步对野生型C57BL/6小鼠(+/+)、IL2RB/IL2RG双基因人源化杂合小鼠(H/+；H/+)体内免疫分型情况进行流式检测，各小鼠脾脏、淋巴结和血液中白细胞亚型(包括：T细胞、B细胞、NK细胞、粒细胞(Granulocyte)、树突细胞(Dendritic cells)巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes))和T细胞亚型(包括：CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞)检测结果结果分别如图13、图14和图15所示。数据显示，IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠脾脏、淋巴结和血液中白细胞亚型百分比和T细胞亚型百分比与野生型小鼠基本一致，表明IL2RB和IL2RG基因的人源化改造未影响IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内免疫细胞的整体发育、分化和分布。

通过流式细胞术对IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内IL2和IL15信号通路情况进行检测。具体来说，取6周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)、IL2RB/IL2RG双基因人源化杂合小鼠(H/+；H/+)和IL2RB/IL2RG双基因人源化纯合小鼠(H/H；H/H)各三只，取脾脏细胞，分别加入浓度为200U的人IL2(Human IL-2Protein,Tag Free)，或10ng/mL的人IL15/IL15 RA复合物(Human IL-15Protein,premium grade和Human IL-15R alpha/CD215 Protein,FcTag按体积比1:1混合获得)，或10ng/mL的鼠IL15/IL15 RA复合物(Recombinant Mouse IL-15Protein和Recombinant Mouse IL-15Ralpha Fc Chimera Protein,CF按体积比1:1混合获得)刺激30分钟，使用eBioscience^TM Fixable Viability Dye eFluor^TM 780、BrilliantViolet 711^TM anti-mouse TCRβchain Antibody、CST Phospho-Stat5(Tyr694)(D47E7)Rabbit mAb(一抗)和Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa/>488Conjugate)(二抗)固定染色后进行流式检测(相应的二抗对照组均不加一抗)，结果如表6所示，表明经人的IL2和IL15/IL15RA复合物，鼠的IL15/IL15RA复合物刺激后，野生型C57BL/6小鼠(+/+)、IL2RB/IL2RG双基因人源化杂合小鼠(H/+；H/+)和IL2RB/IL2RG双基因人源化纯合小鼠(H/H；H/H)脾细胞中均能检测到STAT5的磷酸化表达，说明在人IL2刺激以及人和鼠IL15/IL15RA复合物刺激下，可以诱导STAT5的磷酸化，表明经改造后IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内IL2和IL15信号通路功能正常。

表6小鼠T细胞pSTAT5表达流式检测结果

实施例5 IL15RA基因人源化小鼠的构建

小鼠IL15RA基因(NCBI Gene ID：16169，Primary source：MGI:104644，UniProtID：Q60819，位于2号染色体NC_000068.8的第11709992位至第11738796位，基于转录本NM_008358.2及其编码蛋白NP_032384.1(SEQ ID NO：42))和人IL15RA基因(NCBI Gene ID：3601，Primary source：HGNC：5978，UniProt ID：Q13261，位于10号染色体NC_000010.11的第5948897-5978741位，基于转录本NM_002189.4及其编码蛋白NP_002180.1(SEQ ID NO：43))。对比示意图如图16所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL15RA基因座引入编码人IL15RA蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL15RA蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源IL15RA基因座上用人IL15RA基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将包含小鼠IL15RA基因的2号外显子部分至6号外显子部分的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL15RA基因座(示意图如图17所示)，实现对小鼠IL15RA基因的人源化改造。

进一步设计如图18所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠IL15RA基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL15RA DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：44)与NCBI登录号为NC_000068.8第11717833至11723094位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：45)与NCBI登录号为NC_000068.8第11735827至11739583位核苷酸序列相同；人IL15RA DNA序列(SEQ ID NO：46)与NCBI登录号为NC_000010.11的第5956438至5966319位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与鼠的连接设计为5’-CATGTCAGCCTTGATTCTGTATTTCTAATAGCAGAA GAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGGT-3’(SEQ ID NO：47)，其中，序列“GCAGAA”的最后一个“A”是鼠的最后一个核苷酸，序列/>的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠的连接设计为5’-TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCC/>CAGCGCAGCTCACTCACCAGTTCCCTCCACTTCCTGACATTTCAGT-3’(SEQ ID NO：48)，其中序列“GGATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/>的第一个“A”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠IL15RA的mRNA序列如SEQ ID NO：49所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：50所示。

实施例6 IL15基因人源化小鼠的构建

小鼠IL15基因(NCBI Gene ID：16168，Primary source：MGI:103014，UniProt ID：P48346，位于8号染色体NC_000074.7的第83058253位至第83129883位，基于转录本NM_001254747.1及其编码蛋白NP_001241676.1(SEQ ID NO：51))和人IL15基因(NCBI GeneID：3600，Primary source：HGNC：5977，UniProt ID：P40933-1，位于4号染色体NC_000004.12的第141636583-141733987位，基于转录本NM_000585.5及其编码蛋白NP_000576.1(SEQ ID NO：52))。对比示意图如图19所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL15基因座引入编码人IL15蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL15蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源IL15基因座上用人IL15基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将包含小鼠IL15基因的起始密码子至终止密码子的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL15基因座(示意图如图20所示)，实现对小鼠IL15基因的人源化改造。

进一步设计如图21所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠IL15基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL15 DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：53)与NCBI登录号为NC_000074.7第83072241至83076085位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：54)与NCBI登录号为NC_000074.7第83053728至83057763位核苷酸序列相同；人IL15 DNA序列(SEQ ID NO：55)与NCBI登录号为NC_000004.12的第141719465至141732848位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与鼠的连接设计为5’-GTGATAGTCCTTCACGGAAAGTACAAGAATACACAGAA CGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTC-3’(SEQ ID NO：56)，其中，序列“CAGAA”的最后一个“A”是鼠的最后一个核苷酸，序列/>的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠的连接设计为5’-CTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCC/>CTGTTTACATTAGTCTTTCACG-3’(SEQ ID NO：57)，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/> 的第一个“A”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠IL15的mRNA序列如SEQ ID NO：58所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：52所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(酶、探针及目的片段长度如表7所示)检测，Southern Blot检测结果如图22所示，表明ES-01为阳性的克隆。

表7 Southern Blot酶和探针表

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				MfeI	5’Probe	--	14.6kb
XbaI	3’Probe	11.3kb	6.8kb
				ScaI	Neo Probe-5(3’)	--	8.7kb

探针合成引物如下：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-GGGCTTGGTATCAAGAATGAGGGGT-3’(SEQ ID NO：59)，

5’Probe-R：5’-ACCCCACAGAACCTCTACTGGGA-3’(SEQ ID NO：60)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-CCCCAAGTCATGTTTGCACCC-3’(SEQ ID NO：61)，

3’Probe-R：5’-GTCCTCCCTGAATCCTGCACCTG-3’(SEQ ID NO：62)；

Neo探针(Neo Probe-5(3’))：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：63)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：64)。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图23)后，再通过互相交配即可得到人源化IL15基因纯合子小鼠。示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图24，其中，编号为F1-01小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表8所示。结果表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的IL15人源化基因工程小鼠。

表8F1代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化IL15蛋白的表达情况，如ELISA等。选取6周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和14周龄雄性IL15基因人源化杂合子小鼠各2只，腹腔注射20ug/200uL LPS刺激2小时，取小鼠的肺研磨液，使用Mouse IL-15ELISA Kit和HumanIL-15Quantikine ELISA Kit进行蛋白表达检测，结果如图25所示，在C57BL/6小鼠体内可以检测到鼠IL15蛋白的表达，但未检测到人源化IL15蛋白的表达；在IL15人源化杂合子小鼠体内同时检测到鼠IL15蛋白和人源化IL15蛋白的表达，这表明经人源化改造后小鼠体内可正常表达人的IL15蛋白。

实施例7IL15/IL15RA双基因人源化鼠的制备

使用实施例5制备的IL15RA基因人源化小鼠与实施例6制备的IL15基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，得到IL15/IL15RA双基因人源化小鼠。可采用RT-PCR方法对IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠进行基因型鉴定，选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的8周龄雌性IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠(H/H)各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，使用表9引物进行RT-PCR检测，鉴定结果见图26和图27，在C57BL/6野生型小鼠脾细胞中仅可以检测到鼠的IL15和IL15RA mRNA，在IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠中仅可以检测到人的IL15和IL15RA mRNA。其中，人和鼠的IL15RAmRNA出现其他条带，推测可能是因为人和鼠的IL15RA存在多个转录本，所以会产生其他条带。

表9RT-PCR检测引物序列及重组片段大小

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可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人IL15蛋白的表达情况，如ELISA。具体来说，分别选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的8周龄雌性IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠(H/H)各3只，腹腔注射对乙酰氨基酚(350mg/kg)刺激24h后脱颈安乐死取血清，使用IL-15/IL-15R Complex Mouse ELISA Kit和Human IL-15Quantikine ELISA Kit进行检测，结果显示(图28)鼠的IL15蛋白仅在野生型C57BL/6小鼠中检测到，人的IL15蛋白仅在IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠中检测到，这表明经人源化改造后小鼠体内可正常表达人的IL15蛋白。

可采用流式细胞术检测IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠体内hIL15RA蛋白表达情况。具体来说，分别选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的7周龄雌性IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠(H/H)各1只，脱颈安乐死后取骨髓树突状细胞(DC细胞)，使用Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45、PE Rat Anti-Mouse CD215(IL-15Rα)、PE anti-human CD215(IL-15Rα)Antibody、Brilliant Violet 711^TM anti-mouseCD11c Antibody、APC Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody、PE Mouse IgG2b,κIsotypeCtrl Antibody(Fc)、Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit、Purified anti-mouse CD16/32识别染色后进行流式检测，结果显示，C57BL/6小鼠DC细胞中有2.53％hIL15RA阳性细胞，有19.0％mIL15RA阳性细胞，IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠DC细胞中有1.41％mIL15RA阳性细胞，有29.7％hIL15RA阳性细胞。综上，野生鼠C57BL/6小鼠检测到鼠源IL15RA的表达，没有检测到人或人源化IL15RA的表达，IL15/IL15RA双基因人源化纯合小鼠可以检测到人源化IL15RA的表达，没有检测到鼠IL15RA的表达。

进一步地，使用流式细胞术对C57BL/6野生型小鼠和IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠(H/H)的脾脏、淋巴结和血液组织进行免疫分型检测。具体的，分别取8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏、淋巴结血液组织使用Purified anti-mouse CD16/32Antibody、Zombie NIR^TM FixableViability Kit、BioLegend PerCP anti-mouse CD45 Antibody、Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8a Antibody、FOXP3 Monoclonal Antibody(FJK-16s),PerCP-eFluor^TM 710,eBioscience^TM、FITC anti-Mouse CD19、Brilliant Violet421^TM anti-mouse NK-1.1Antibody、BioLegend Brilliant Violet 785^TM anti-mouse/human CD11bAntibody、Brilliant Violet 711^TM anti-mouse CD11c Antibody、BioLegendAPC anti-mouse F4/80Antibody、Brilliant Violet 650^TM anti-mouse Ly-6G Antibody、PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody、Alexa700anti-mouse CD3 Antibody等抗体进行免疫分型检测，脾脏和血液中的白细胞和T细胞亚型检测结果分别如图29和图30所示，从图中可以看出IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠脾脏和血液中B细胞(BCells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+T细胞(CD8+Tcells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(Dendritic cells)、巨噬细胞(Macrophages)和单核细胞(Monocytes)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠相似(图29(A)和图30(A))，CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+T(CD8+T cells)细胞和Tregs细胞(Tregs)等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠相似(图29(B)和图30(B))。

淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图31(A)和图31(B)所示，从图中可以看出，IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠淋巴结中B细胞、T细胞、NK细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠相似，CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠相似。表明IL15/IL15RA双基因的人源化改造没有影响小鼠体内脾脏、淋巴结和血液中白细胞和T细胞的分化、发育和分布。

实施例8多基因人源化鼠的制备

以IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化小鼠为例，使用上述实施例制备的IL2RB/IL2RG双基因人源化鼠与IL15/IL15RA双基因人源化小鼠进行交配，经过多代筛选，获得IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化小鼠。

使用流式细胞术对C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化小鼠体内人或人源化IL2RB蛋白表达情况进行检测。具体来说，分别取10周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠各1只，腹腔注射Anti-mCD3e(7.5ug/200uL)刺激24h后脱颈安乐死取脾脏细胞，分别用鼠白细胞识别抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45(mCD45)、抗鼠TCRβ抗体FITC anti-mouse TCRβchain Antibody、鼠T细胞识别抗体Brilliant Violet 421^TM anti-mouse CD4、BrilliantViolet 711^TM anti-mouse CD8a、PE/Cy^TM 7Mouse anti-mouse NK1.1、抗鼠IL-2Rβ抗体APCanti-mouse CD122(IL-2Rβ)Antibody、抗人IL-2Rβ抗体PE anti-human CD122(IL-2Rβ)Antibody、APC Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody、PE Mouse IgG1,κIsotype CtrlAntibody、PE anti-human CD132(common y chain)、APC anti-mouse CD132(commonychain)、PE Rat IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody、APC Mouse IgG2b,κIsotype CtrlAntibody、Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit、Purified anti-mouse CD16/32识别染色后进行流式检测，检测人或人源化IL12RB蛋白的表达情况。

结果表明，C57BL/6小鼠脾脏中T细胞有0.78％hIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+hIL2RB+)，有11.0％mIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mIL2RB+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中T细胞有8.80％hIL2RB阳性细胞，有0.80％mIL2RB阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中CD4+T细胞有0.11％hIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD4+hIL2RB+)，有8.19％mIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD4+mIL2RB+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中CD4+T细胞有4.83％hIL2RB阳性细胞，有0.39％mIL2RB阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中CD8+T细胞有0.22％hIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD8+hIL2RB+)，有2.56％mIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD8+mIL2RB+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中CD8+T细胞有3.24％hIL2RB阳性细胞，有0.26％mIL2RB阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中NK细胞有0.74％hIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mNK1.1+hIL2RB+)，有1.71％mIL2RB阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mNK1.1+mIL2RB+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中NK细胞有1.84％hIL2RB阳性细胞，有0.72％mIL2RB阳性细胞。

与上述方法类似，选取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠各3只，腹腔注射Anti-mCD3e(7.5ug/200uL)刺激24h后脱颈安乐死取脾脏细胞，采用上述方法进行流式检测，检测人或人源化IL2RG蛋白的表达情况。

C57BL/6小鼠脾脏中T细胞有1.71％hIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+hIL2RG+)，有9.36％mIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mIL2RG+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中T细胞有1.30％hIL2RG阳性细胞，有0.94％mIL2RG阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中CD4+T细胞有0.68％hIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD4+hIL2RG+)，有5.43％mIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD4+mIL2RG+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中CD4+T细胞有1.50％hIL2RG阳性细胞，有0.46％mIL2RG阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中CD8+T细胞有0.94％hIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD8+hIL2RG+)，有3.15％mIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mCD8+mIL2RG+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中CD8+T细胞有2.49％hIL2RG阳性细胞，有0.45％mIL2RG阳性细胞。

C57BL/6小鼠脾脏中NK细胞有0.47％hIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mNK1.1+hIL2RG+)，有2.28％mIL2RG阳性细胞(特征为mCD45+mTCRβ+mNK1.1+mIL2RG+)，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏中NK细胞有1.40％hIL2RG阳性细胞，有0.94％mIL2RG阳性细胞。

可见，C57BL/6小鼠中只能检测到小鼠IL2RB和IL2RG蛋白表达，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠中可以检测到人源化IL2RB和IL2RG蛋白表达。

使用流式细胞术检测IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠体内hIL15RA蛋白表达情况。具体来说，分别取8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和8周龄雌性IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)，使用Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45、FITC anti-mouse TCRβchain Antibody、Brilliant Violet 605^TM anti-mouse CD11c、PE Rat Anti-Mouse CD215(IL-15Rα)、PE anti-human CD215(IL-15Rα)Antibody、PE Rat IgG1,κIsotype Control、PE Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody(Fc，ICFC)、Zombie NIR^TM Fixable ViabilityKit、Purified anti-mouse CD16/32识别染色后进行流式检测，检测人或人源化IL15RA蛋白的表达情况。

结果显示，在C57BL/6小鼠BMDC细胞有0.62％hIL15RA阳性细胞和52.3％mIL15RA阳性细胞，在IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠中有25.8％hIL15RA阳性细胞和0.26％mIL15RA阳性细胞。表明C57BL/6小鼠体内可以表达鼠的IL15RA蛋白，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠体内可以表达人的IL5RA蛋白。

进一步使用ELISA检测IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠体内hIL15蛋白表达情况，具体来说，分别取8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠各3只，腹腔注射对乙酰氨基酚(7mg/200uL/只)刺激24h后脱颈安乐死取血清，使用Human IL-15Quantikine ELISA Kit和IL-15/IL-15RComplex Mouse ELISA Kit进行检测，结果显示(图32)，在C57BL/6野生型小鼠中仅检测到mIL15/mIL15RA蛋白表达，在IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠中仅检测到hIL15蛋白表达，这表明经人源化改造后小鼠体内可正常表达人的IL15蛋白。

进一步地，使用流式细胞术对C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠的脾脏、淋巴结和血液组织进行免疫分型检测。具体的，分别取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏、淋巴结和血液组织使用Purified anti-mouse CD16/32Antibody、Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit、BioLegend PerCP anti-mouse CD45 Antibody、Alexa700anti-mouse CD3Antibody、PE anti-mouse CD8a Antibody、BrilliantViolet 510^TM anti-mouse CD4、PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody、FITC anti-Mouse CD19、FOXP3Monoclonal Antibody(FJK-16s),PerCP-eFluor^TM 710,eBioscience^TM、Brilliant Violet 421^TM anti-mouse NK-1.1Antibody、BioLegend Brilliant Violet785^TM anti-mouse/human CD11bAntibody、Brilliant Violet 711^TM anti-mouse CD11cAntibody、BioLegend APC anti-mouse F4/80Antibody、Brilliant Violet 650^TM anti-mouse Ly-6G Antibody等抗体进行免疫分型检测，脾脏和血液中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图33、34和图35、36所示，从图中可以看出，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠脾脏和血液中B细胞(B Cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+T细胞(CD8+T cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(Dendritic cells)、巨噬细胞(Macrophages)和单核细胞(Monocytes)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠相似(图33和图35)，CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+T(CD8+T cells)细胞和Tregs细胞(Tregs)等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠相似(图34和图36)。

淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图37和图38所示，从图中可以看出，IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合子小鼠淋巴结中B细胞、T细胞、NK细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致，CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致。表明IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因的人源化改造对小鼠体内脾脏、淋巴结和血液中白细胞和T细胞的分化、发育和分布影响不大。

通过流式细胞术对IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化小鼠体内IL2和IL15信号通路情况进行检测。与IL2RB/IL2RG双基因人源化小鼠体内IL2和IL15信号通路检测方法相似，区别在于分别使用10μg/mL的人IL2或鼠IL12(Biotinylated Mouse IL-2Protein)刺激小鼠脾细胞，然后用Brilliant Violet 421^TM anti-mouse NK-1.1Antibody、APCanti-mouse CD4 Antibody、Alexa700anti-mouse CD8a Antibody等抗体进行流式检测。结果如表10所示，表明经人或鼠的IL2蛋白刺激后，野生型C57BL/6小鼠(+/+)和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合小鼠(H/H)脾细胞中均能检测到STAT5的磷酸化表达。

表10小鼠T细胞和NK细胞pSTAT5表达流式检测结果

与上述方法类似，使用1μg/mL的人IL15/IL15 RA复合物，或1μg/mL的鼠IL15/IL15RA复合物刺激小鼠脾细胞后进行流式检测。结果如表11所示，表明经人或鼠的IL15/IL15RA复合物刺激后，野生型C57BL/6小鼠(+/+)和IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化纯合小鼠(H/H)脾细胞中均能检测到STAT5的磷酸化表达。表明在人和鼠IL2刺激以及人和鼠IL15/IL15RA复合物刺激下，可以诱导STAT5的磷酸化，表明经改造后IL2RB/IL2RG/IL15/IL15RA四基因人源化小鼠体内IL2和IL15信号通路功能正常。

表11小鼠T细胞pSTAT5表达流式检测结果

实施例9 IL15/IL15RA人源化小鼠体内药效

AMG-741是一种针对白细胞介素15(IL-15)的全人类单克隆抗体，由安进和Provention Bio公司联合研发，目前处于临床II期。通过阻断IL-15，AMG-714在多种炎症性疾病中具有治疗潜力，如银屑病、炎症性肠病(IBD)、狼疮、多发性硬化(MS)等。

选取6-7周龄雌性IL15/IL15RA双基因人源化纯合子小鼠15只，随机分组，设置对照组G1、造模组G2和给药组G3(n＝5)。实验开始前2天用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm×4cm的皮肤区域。实验开始第0-5天，造模组和给药组小鼠背部皮肤区域涂抹5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏(10mg/cm²)进行银屑病造模；对照组小鼠背部皮肤区域涂抹凡士林(10mg/cm²)，连续涂抹6天。实验过程中，G1组不给药处理，G2组腹腔注射PBS，G3组腹腔注射AMG-714analog(重链HC SEQ ID NO:82,轻链LCSEQ ID NO:83。G2-G3组小鼠在实验第0天和第3天给药，共给药2次，全部实验周期为9天。具体给药量和给药方式如表12所示：

表12给药方式

分组后每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红疹及脱屑。每项根据严重程度分为0-4分，PASI评分标准如下：0-无；1-轻度；2-中度；3-重度；4-极重度。对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。

从小鼠体重随时间的变化情况(图39-40)可知，对照组(G1)整个实验周期内体重平稳；造模组(G2)和给药组(G3)体重趋势一致，均从分组后0天开始先下降，2天左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图41-43所示的背部皮肤红疹、脱屑和综合PASI评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而造模组和给药组表现出不同程度的发病情况。对比造模组，给药组的小鼠皮肤PASI评分(总分)低于造模组，说明对银屑病模型小鼠给予AMG-714analog治疗对银屑病具有治疗作用。

上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人IL15/IL15RA信号通路的药物的体内药效和剂量筛选。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种IL2RG基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL2RG蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化IL2RG基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人IL2RG蛋白的胞外区至少150个连续氨基酸；进一步优选的，包含与SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列同一性至少为70％以上，或者包含SEQ ID NO：2第23-256或23-262位所示氨基酸序列，优选的，所述的人源化IL2RG蛋白还包含人IL2RG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列同一性至少为70％的氨基酸序列，或者包含SEQ ID NO：2第1-22位所示氨基酸序列，优选的，所述的人源化IL2RG蛋白包含SEQ ID NO：2或30所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL2RG基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包括下列任一核苷酸序列：

A)编码人或人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化IL2RG基因；或，

4.一种人源化IL2RG蛋白，其特征在于，所述的人源化IL2RG蛋白包含人IL2RG蛋白的全部或部分。

5.一种人源化IL2RG基因，其特征在于，所述的人源化IL2RG基因包含人IL2RG基因的部分，优选的，所述的人源化IL2RG基因包含编码权利要求4所述的人源化IL2RG蛋白的核苷酸序列。

6.一种IL15基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL15蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化IL15基因。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的人或人源化IL15蛋白包含SEQID NO：52所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：52所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

8.根据权利要求6-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物IL15基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

B)人或人源化IL15基因的核苷酸序列；或，

9.一种人源化IL15基因，其特征在于，所述的人源化IL15基因包含人IL15基因的部分。

10.一种权利要求4所述的人源化IL2RG蛋白、权利要求5所述的人源化IL2RG基因、人源化IL15蛋白、权利要求9所述的人源化IL15基因或权利要求1-3和6-8任一所述的构建方法获得的非人动物的应用，其特征在于，所述的应用包含：