CN115785251A - Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115785251A
CN115785251A CN202210831119.8A CN202210831119A CN115785251A CN 115785251 A CN115785251 A CN 115785251A CN 202210831119 A CN202210831119 A CN 202210831119A CN 115785251 A CN115785251 A CN 115785251A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tfr1
human
gene
humanized
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210831119.8A
Other languages
English (en)
Inventor
刘畅
尚诚彰
周小飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Publication of CN115785251A publication Critical patent/CN115785251A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70582—CD71
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种人源化TFR1蛋白、一种人源化TFR1基因、一种TFR1基因的靶向载体、一种TFR1基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人TFR1蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化TFR1蛋白，可以作为人TFR1信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

TFR1基因人源化非人动物及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种TFR1基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
转铁蛋白受体1(Transferrin receptor1，TFR1)，属于单次跨膜蛋白，主要通过结合转铁蛋白TF(Transferrin)，将Fe离子转运进入细胞内。TFR1在多种细胞中广泛表达，在血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的血管内皮细胞上高表达。TFR1的抗体可以通过结合TFR1，进入内皮细胞，并有部分抗体穿过内皮细胞进入脑部区域，并且，研究发现低亲和力进入BBB效率更高，通过构建双抗可以将BACE1抗体带入BBB，用于降低A-beta蛋白，治疗阿尔兹海默。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，例如，人和小鼠的TFR1同源度74％，再加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generationand utility of genetically humanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。
鉴于TFR1在骨质疏松等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化TFR1信号通路相关的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化TFR1蛋白，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的胞外区，优选的，包含至少100个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区，例如包含至少100、200、300、400、500、600、620、650、660、665、666、667、668、669、670、671、672个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区，进一步优选的，包含672个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区；所述的人源化TFR1蛋白包含SEQ ID NO：2第89-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述人源化TFR1蛋白包含至少100个连续氨基酸序列与人TFR1的相应氨基酸序列相同，优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含至少100个连续氨基酸序列来源于人TFR1蛋白的胞外区，其中所述非人动物表达所述人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1基因的全部或部分编码的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至19号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、130、150、160、165、166、167、168、169、170、180、190、196bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含170bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、200、220、230、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、250、270、300、500、700、1000、1300、1500、1700、2000、2200、2500、2700、2900、2901bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含243bp的核苷酸序列；优选的，19号外显子的部分包含编码氨基酸的核苷酸序列。最为优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含与SEQ IDNO：5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1蛋白还包含非人动物TFR1蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化TFR1蛋白还包含非人动物TFR1蛋白的跨膜区和/或胞质区。优选包含SEQ ID NO：1第1-88位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第1-88位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第1-88位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第1-88位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种人源化TFR1基因，所述的人源化TFR1基因包含人TFR1基因的部分。
优选的，所述的人源化TFR1基因编码上述的人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的人源化TFR1基因包含人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至19号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，优选还包含4-5号内含子和/或18-19号内含子，更优选的包含4-19号外显子之间的任一内含子，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、130、150、160、165、166、167、168、169、170、180、190、196bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含170bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、200、220、230、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、250、270、300、500、700、1000、1300、1500、1700、2000、2200、2500、2700、2900、2901bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含243bp的核苷酸序列；优选的，19号外显子的部分包含编码氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1基因包含编码人TFR1蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化TFR1基因包含编码人TFR1蛋白的胞外区核苷酸序列，其中，所述的人源化TFR1基因包含编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1基因还包含非人动物TFR1基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物TFR1基因的1号至3号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含部分4号外显子和/或部分19号外显子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1基因还包含编码非人动物TFR1蛋白全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化TFR1基因还包含编码非人动物TFR1蛋白的跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1基因还包含编码SEQ ID NO：1第1-88位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第1-88位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQID NO：1第1-88位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第1-88位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TFR1基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
E)包含SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TFR1蛋白的胞外区的核苷酸序列，进一步优选的，编码人TFR1蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，例如至少100、200、300、400、500、600、620、650、660、665、666、667、668、669、670、671、672个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区，更优选的，编码SEQ IDNO：2第89-760位的核苷酸序列；
C)人或人源化TFR1基因的核苷酸序列；或，
D)人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至19号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、130、150、160、165、166、167、168、169、170、180、190、196bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含170bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、200、220、230、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、250、270、300、500、700、1000、1300、1500、1700、2000、2200、2500、2700、2900、2901bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含243bp的核苷酸序列；优选的，19号外显子的部分包含编码氨基酸的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物TFR1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物TFR1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：6和/或7。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物TFR1基因的1号至19号外显子上，进一步优选位于非人动物TFR1基因的4号至19号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。
本发明的第六方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在TFR1基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第七方面，提供了一种TFR1基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源TFR1蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化TFR1基因，更优选包含上述的人源化TFR1基因。
优选的，所述人或人源化TFR1基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性TFR1基因座处的内源调控元件。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述TFR1基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的人源化TFR1基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第八方面，提供了一种TFR1基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化TFR1基因，更优选包含上述的人源化TFR1基因。
优选的，所述的非人动物为上述的TFR1基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TFR1基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列。
B)编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人TFR1蛋白的胞外区，进一步优选的，编码人TFR1蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，例如至少100、200、300、400、500、600、620、650、660、665、666、667、668、669、670、671、672个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区，更优选的，编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列；
C)人或人源化TFR1基因的核苷酸序列；或，
D)人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至19号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，优选还包含4-5号内含子和/或18-19号内含子，更优选的包含4-19号外显子之间的任一内含子，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、130、150、160、165、166、167、168、169、170、180、190、196bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含170bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、200、220、230、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、250、270、300、500、700、1000、1300、1500、1700、2000、2200、2500、2700、2900、2901bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含243bp的核苷酸序列；优选的，19号外显子的部分包含编码氨基酸的核苷酸序列。优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TFR1基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人TFR1蛋白的cDNA序列导入非人动物TFR1基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物TFR1基因。所述的外源性调控元件来自人TFR1基因。
所述的导入为替换或插入，具体地，所述的导入非人动物TFR1基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码内源TFR1蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO:1第89-763位的核苷酸序列。
优选的，非人动物TFR1基因的5号至18号外显子被替换，进一步优选地，还包含非人动物TFR1基因的4号外显子的部分和/或19号外显子的部分被替换。
优选的，使用基因编辑技术进行TFR1基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物TFR1基因的编码框，将编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列或者人源化TFR1基因的核苷酸序列插入非人动物TFR1基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物TFR1基因的编码框可以采用敲除非人动物TFR1基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物TFR1蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物TFR1基因的编码框可以为敲除非人动物TFR1基因的4号至19号外显子的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列或者人源化TFR1基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物TFR1基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得TFR1基因人源化的动物模型体内表达人TFR1蛋白，不表达非人动物TFR1蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向TFR1基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得TFR1基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将TFR1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73蛋白。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
本发明的第九方面，提供了一种TFR1基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。优选的，所述的非人动物缺失内源TFR1基因的4号至19号外显子的全部或部分。
本发明的第十方面，提供了一种TFR1基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行非人动物的制备。
本发明的第十一方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化TFR1蛋白。或者，所述的细胞、组织或器官的基因组包含上述的人源化TFR1基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述的细胞、组织或器官包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞、组织或器官。
本发明的第十二方面，提供了一种瘤组织，该瘤组织可以是荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化TFR1蛋白。或者，所述的瘤组织的基因组包含上述的人源化TFR1基因，或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第十三面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物(包括TFR1基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物)。
本发明的第十四方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十五方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十六方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十七方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症、神经退行性疾病、骨科疾病或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第十八方面，提供了一种TFR1基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人TFR1基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化TFR1基因。优选的，所述的细胞包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞。
本发明的第十九方面，提供了上述细胞的构建方法，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入细胞TFR1基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列。
B)编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TFR1蛋白的胞外区的核苷酸序列，进一步优选的，编码人TFR1蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，例如至少100、200、300、400、500、600、620、650、660、665、666、667、668、669、670、671、672个连续氨基酸的人TFR1蛋白胞外区，更优选的，编码SEQ IDNO：2第89-760位的核苷酸序列；
C)人或人源化TFR1基因的核苷酸序列；或，
D)人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至19号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，优选还包含4-5号内含子和/或18-19号内含子，更优选的包含4-19号外显子之间的任一内含子，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、130、150、160、165、166、167、168、169、170、180、190、196bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含170bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、200、220、230、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、250、270、300、500、700、1000、1300、1500、1700、2000、2200、2500、2700、2900、2901bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含243bp的核苷酸序列；优选的，19号外显子的部分包含编码氨基酸的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的导入细胞TFR1基因座为替换细胞TFR1基因的相应区域，优选为替换基因组中编码内源TFR1蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，替换细胞TFR1基因中编码SEQID NO:1第89-763位的核苷酸序列。
优选的，使用基因编辑技术进行TFR1基因人源化的细胞的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用上述的靶向载体进行细胞的构建。
本发明的第二十方面，提供了一种TFR1基因缺失的细胞，所述的细胞缺失TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分。优选缺失4号至19号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞缺失TFR1基因的4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分。优选的，所述的细胞包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞。
本发明的第二十一方面，提供了一种TFR1基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体进行TFR1基因缺失的细胞的构建。
本发明的第二十二方面，提供了一种包含上述人源化TFR1基因的构建体或者表达上述人源化TFR1蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。
本发明的第二十三方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
本发明的第二十五方面，提供了一种TFR1基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化TFR1基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化TFR1蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TFR1基因为上述的人源化TFR1基因。
优选的，所述的人源化TFR1蛋白为上述的人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TFR1基因座处用人TFR1基因的基因组片段(优选编码人TFR1的胞外区序列)，和/或，非人动物TFR1基因的基因组片段(优选非人动物TFR1的跨膜区和/或胞质区的全部或部分序列)，导入非人动物TFR1基因的基因组片段以形成经修饰的TFR1基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TFR1基因座处用人源化TFR1基因导入非人动物TFR1基因的基因组片段以形成经修饰的TFR1基因。
所述的经修饰的TFR1基因编码人源化TFR1蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物TFR1基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的经修饰的TFR1基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十六方面，提供了包含上述TFR1基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
本发明的第二十七方面，提供了一种上述的人源化TFR1蛋白、上述的人源化TFR1基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与TFR1相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TFR1相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TFR1相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人TFR1信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究TFR1基因功能，研究针对人TFR1靶位点的药物、药效，研究与TFR1相关的神经退行性疾病药物、骨科疾病药物、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。优选的，所述应用包括疾病和非疾病的治疗和诊断目的。
本发明的第二十八方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人TFR1特异性调节剂的筛选。
本发明的第二十九方面，提供了一种人TFR1特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗TFR1抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括向个体体内移植人肿瘤细胞，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的TFR1基因人源化的非人动物、上述的TFR1基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“神经退行性疾病”包括但不限于脑缺血、脑损伤或、癫痫、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化或脊髓小脑共济失调等。
本发明所述的“骨科疾病”包括但不限于骨折、骨骼退行性病变、关节炎、骨骼畸形、骨质疏松或股骨头坏死等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“TFR1基因座”表示TFR1基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的TFR1基因座可以是TFR1基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的TFR1基因座可以是TFR1基因3号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化TFR1蛋白”，包含来源于人TFR1蛋白的部分。
本发明所述的“人源化TFR1蛋白”，包含来源于人TFR1蛋白的部分。其中，所述的“人TFR1蛋白”同“人TFR1蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人TFR1蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人TFR1蛋白的部分”，为连续或间隔的5-760个(优选为10-672个)氨基酸序列与人TFR1蛋白的氨基酸序列一致或与人TFR1蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化TFR1基因”，包含来源于人TFR1基因的部分和非人TFR1基因的部分。其中，所述的“人TFR1基因”同“人TFR1基因的全部”，即其核苷酸序列与人TFR1基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人TFR1基因的部分”为连续或间隔的20-63430bp(优选为20-22158、20-5224bp或20-2016bp)个核苷酸序列与人TFR1核苷酸序列一致或与人TFR1核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“3号至4号外显子”包含3号外显子、3-4号内含子、4号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“3-4号内含子”表示3号外显子与4号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人TFR1基因的4号外显子的部分，包含连续或间隔的5-196bp个，优选10-170bp个核苷酸序列与人TFR1基因的4号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化TFR1基因”中包含的“4号外显子的部分”至少包括编码胞外区的核苷酸序列。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“TFR1蛋白”，例如“人TFR1蛋白”、“非人动物TFR1蛋白”或“人源化TFR1蛋白”，均包含胞外区、胞内区和/或跨膜区。
本发明所述的“胞外区”包含TFR1蛋白胞外的全部或部分，在本申请中，人TFR1蛋白胞外区包含人TFR1至少10、20、30、50aa、60aa、70aa、90aa、100aa、200aa、300aa、400aa、500aa、600aa、650aa、660aa、672aa和675aa，例如NP_035768.1第89-763位；鼠TFR1蛋白胞外区包含鼠TFR1蛋白至少10、20、30、50aa、60aa、70aa、90aa、100aa、200aa、300aa、400aa、500aa、600aa、650aa、660aa和672aa，例如NP_003225.2第89-760位。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：人和小鼠TFR1基因结构对比示意图(非按比例)；
图2：人源化TFR1基因座示意图(非按比例)；
图3：TFR1打靶策略示意图(非按比例)；
图4：重组后ES细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；
图5：人源化TFR1小鼠Flp-Frt重组过程示意图(非按比例)；
图6：F1代小鼠PCR结果，其中，PC为阳性对照，WT为野生型对照，H2O为水；
图7：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和TFR1基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中TFR1mRNA检测结果；
图8：抗人TFR1抗体在小鼠体内药代动力学检测结果，其中(A)为小鼠脑组织中hIgG和抗体Ab的浓度，(B)为小鼠血清中hIgG和抗体Ab的浓度，(C)为hIgG和抗体Ab在小鼠脑中和血清中的比；
图9：人的TFR1氨基酸序列(NP_003225.2；SEQ ID NO:2)和小鼠的TFR1氨基酸序列(NP_035768.1；SEQ ID NO：1)比对结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
DraIII、EcoRV、AseI酶购自NEB，货号分别为R3510V、R3195V、R0101M；
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody购自Biolegend，货号101302；
Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβAntibody购自Biolegend，货号109228；
FITC anti-Mouse CD19 Antibody购自Biolegend，货号115506；
Brilliant Violet 605TM anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody购自Biolegend，货号116239；
PE anti-mouse CD43 Antibody购自Biolegend，货号143205；
APC anti-human CD43 Antibody购自Biolegend，货号343205；
APC anti-human CD71 Antibody购自Biolegend，货号334107；
Zombie NIRTM Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号423106；
Brilliant Violet 605TM anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody购自Biolegend，货号116239；
PE anti-mouse CD71 Antibody购自Biolegend，货号113807。
实施例1 TFR1基因人源化小鼠的制备
本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化TFR1蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化TFR1蛋白。小鼠TFR1基因(NCBI Gene ID：22042，Primary source：MGI:98822，UniProt ID：Q62351，位于16号染色体NC_000082.7的第32427714位至第32451612位，基于转录本NM_011638.4及其编码蛋白NP_035768.1(SEQ ID NO：1))和人TFR1基因(NCBI Gene ID：7037，Primary source：HGNC：117631，UniProt ID：P02786，位于3号染色体NC_000003.12的第196018694-196082123位，基于转录本NM_003234.4及其编码蛋白NP_003225.2(SEQ ID NO：2))。对比示意图如图1所示，另外，人和小鼠TFR1氨基酸序列比对结果如图9所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源TFR1基因座引入编码人TFR1蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化TFR1蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源TFR1基因座上用人TFR1基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如人TFR1基因的编码胞外区核苷酸序列进行替换小鼠TFR1基因编码胞外区核苷酸序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠TFR1基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠TFR1基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人TFR1 DNA序列和NeoR的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000082.7第32429794至32434036位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000082.7第32449155至32453445位核苷酸序列相同；人TFR1 DNA序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000003.12的第196051942至196074099位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与人的连接设计为5’-TAGCCTCCTTTAGAATTTTAACCTTAGAAGATTAGCATTAGCCAATTGCATCTGGCGAATCGGACCCACAAGAGCACTGAGGTCGGAAGTTCCTATTCTCTAGAAA-3’(SEQ ID NO：6)，其中，序列“ATTAGC”的“C”是人的最后一个核苷酸，序列“CAATT”中的“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人的连接设计为5’-TCATCAGTCCAGGATACATAGATTACCACAACTCCGAGCCTGGTTCTCAGCATTCTTTTTTCCTTACTCTGCTATAGAAA-3’(SEQ ID NO：7)内，其中序列“CGAGC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CTGGT”的“C”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠TFR1的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：9所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR(PCR引物详见表1)和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用DraIIII或EcoRV或AseI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表2所示)检测，Southern Blot检测结果如图4所示，表明4个经PCR验证为阳性的胚胎干细胞(ES-1至ES-4)均为阳性的克隆，且无随机插入。
表1 PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure BDA0003748410590000131
表2 Southern Blot酶和探针表
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
AseI Neo(3’) — 12.9kb
DraIII A Probe — 15.4kb
EcoRV A Probe — 17.2kb
Southern Blot检测包括如下探针引物：
A Probe：
A Probe-F：5’-GGTGAGAAGAAACTAAACTATGCCA-3’(SEQ ID NO：14)，
A Probe-R：5’-TCTGGTTCACCCAGGTTAGAGC-3’(SEQ ID NO：15)；
Neo探针(Neo Probe)：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：18)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：19)。
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化TFR1基因纯合子小鼠。示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01至F1-02的小鼠均为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表3所示。
表3 PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure BDA0003748410590000132
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的TFR1人源化基因工程小鼠。
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化TFR1蛋白的表达情况，如流式细胞术检测(FACS)等。选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和TFR1基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾细胞，分别用抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32Antibody、抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45 Antibody、抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβAntibody、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19Antibody，抗鼠TER-119抗体Brilliant Violet 605TM anti-mouse TER-119/ErythroidCells Antibody，抗鼠CD43抗体PE anti-mouse CD43 Antibody、抗人CD43抗体APC anti-human CD43 Antibody(hCD43-PE)、抗鼠CD71抗体PE anti-mouse CD71 Antibody(mTFR1)或抗人CD71抗体APC anti-human CD71 Antibody(hTFR1)识别染色后进行流式检测。
结果表明，C57BL/6小鼠脾脏中B细胞(特征为mCD45+mCD19+)有50.6％mTFR1阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mTFR1+)，有0.20％hTFR1阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hTFR1+)，TFR1基因人源化杂合子小鼠脾脏中B细胞(特征为mCD45+mCD19+)有32.9％mTFR1阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mTFR1+)，有11.3％hTFR1阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hTFR1+)。
流式分析结果表明，在野生型小鼠脾细胞中检测到鼠TFR1的表达，但未检测到人源化TFR1的表达；在TFR1基因人源化杂合子小鼠体内检测到人源化TFR1的表达，也检测到鼠TFR1的表达。上述实验结果说明经人源化改造后小鼠体内TFR1可正常表达。
通过将F1代杂合小鼠互相交配获得F2代TFR1基因人源化纯合子鼠。使用RT-PCR确认纯合子小鼠体内mRNA的表达情况。具体来说，分别取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的TFR1基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取小鼠脾脏细胞，按照Trizol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测，检测结果如图7所示：在C57BL/6野生型小鼠中检测到鼠TFR1 mRNA，没有检测到人源化TFR1 mRNA；在TFR1基因人源化纯合子小鼠中仅检测到人源化TFR1 mRNA，没有检测到鼠TFR1 mRNA。
RT-PCR引物序列包括：
PCR-F1：5’-CTCTGCTTTGCAGCTATTGCAC-3’(SEQ ID NO：27)
PCR-R1：5’-CAGGATTCTCCACCAGGTAAACA-3’(SEQ ID NO：28)
PCR-F2：5’-GTTCGAGAGTCACCACGCTGAG-3’(SEQ ID NO：29)
PCR-R2：5’-GGCAACCCTGATGACTGAGATG-3’(SEQ ID NO：30)
GAPDH-F：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(SEQ ID NO：16)
GAPDH-R：5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：17)
采用流式细胞术检测TFR1基因人源化纯合子小鼠体内人源化TFR1蛋白的表达情况。选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和TFR1基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取骨髓细胞，分别用抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32Antibody、抗鼠TER-119抗体Brilliant Violet 605TM anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody、抗鼠CD71抗体PE anti-mouse CD71 Antibody(mTFR1)或抗人CD71抗体APC anti-human CD71Antibody识别染色后进行流式检测。数据显示，C57BL/6小鼠骨髓红系细胞(特征为mTer119+)中检测到14.2％mTFR1阳性细胞(特征为mTer119+mTFR1+)和0.087％hTFR1阳性细胞(特征为mTer119+hTFR1+)；TFR1基因人源化纯合子小鼠骨髓红系细胞检测到0.04％mTFR1阳性细胞和10.1％hTFR1阳性细胞。结果表明，经人源化改造后小鼠体内成功表达人源化TFR1蛋白。
进一步地，对野生型C57BL/6小鼠和TFR1人源化纯合子小鼠的脾脏、淋巴结和外周血中的白细胞和T细胞免疫分型情况进行流式检测，并进行血常规和血生化检测。结果显示，TFR1人源化纯合子小鼠各组织中白细胞亚型(包括B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte))和T细胞亚型(CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞)百分比及血常规、血生化结果与C57BL/6野生型小鼠基本一致，表明TFR1基因的人源化改造没有明显影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏、淋巴组织和外周血中的分布。
实施例2抗人TFR1抗体在小鼠体内药代动力学(PK)检测
本实施例检测了抗人TFR1抗体在小鼠脑组织和血清中的PK过程。选取TFR1基因人源化纯合子小鼠，随机分为对照组和治疗组。对照组注射10mg/kg的对照人IgG1(hIgG)，治疗组尾静脉注射等摩尔(10.9mg/kg)的抗人TFR1抗体Ab。收集脑组织和血清，使用抗FcELISA测量小鼠脑组织以及血清中抗人TFR1抗体Ab的浓度(检测结果见图8)。结果显示，治疗组小鼠脑组织中抗体Ab的浓度在测量时间内保持在较高水平(图8A)；血清中Ab的浓度随时间降低(图8B)；治疗组小鼠脑/血清比明显高于对照组(图8C)，表明TFR1基因人源化小鼠的大脑能够摄取静脉内施用的抗人TFR1抗体，可作为评估蛋白治疗药物对中枢神经系统(CNS)的有效递送及药效评价的动物模型。
实施例3体内药效验证
利用实施例1制得的TFR1人源化小鼠可以用于评估靶向人TFR1的调节剂的药效。例如，取TFR1人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人TFR1的药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
实施例4双基因或多基因人源化小鼠
利用本方法或制得的TFR1基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化TFR1小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得TFR1与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的TFR1小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到TFR1基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人TFR1和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (23)

1.一种人源化TFR1蛋白，其特征在于，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的部分。
2.根据权利要求1所述的人源化TFR1蛋白，其特征在于，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化TFR1蛋白包含人TFR1蛋白的胞外区，优选的，包含至少100个连续氨基酸的人TFR1蛋白的胞外区。
3.根据权利要求1或2所述的人源化TFR1蛋白，其特征在于，所述的人TFR1蛋白包含SEQID NO：2第89-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第89-760位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，
优选的，所述的人源化TFR1蛋白还包含非人动物TFR1蛋白的部分。
4.根据权利要求1-3任一所述的人源化TFR1蛋白，其特征在于，所述的人源化TFR1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.一种人源化TFR1基因，其特征在于，所述的人源化TFR1基因包含人TFR1基因的部分。
6.根据权利要求5所述的人源化TFR1基因，其特征在于，所述的人源化TFR1基因包含人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分，优选的，包含4号至19号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列。
7.根据权利要求5-6任一所述的人源化TFR1基因，其特征在于，所述的人TFR1基因包含编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；优选的，所述的人TFR1基因包含SEQID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
8.根据权利要求5-7任一所述的人源化TFR1基因，其特征在于，所述的人源化TFR1基因还包含非人动物TFR1基因的全部或部分，优选的，包含非人动物TFR1基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选还包含部分4号外显子和/或部分19号外显子的核苷酸序列。
9.根据权利要求5-8任一所述的人源化TFR1基因，其特征在于，所述的人源化TFR1基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
10.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TFR1蛋白的胞外区的核苷酸序列，进一步优选的，编码人TFR1蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列；
C)人或人源化TFR1基因的核苷酸序列；或，
D)人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分，优选的，人TFR1基因的4号至19号外显子的全部或部分，进一步优选的，人TFR1基因的4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
12.一种TFR1基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化TFR1蛋白。
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述人源化TFR1蛋白为权利要求1-4任一项所述的人源化TFR1蛋白。
14.根据权利要求12-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含权利要求5-9任一所述的人源化TFR1基因。
15.根据权利要求12-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TFR1基因座上。
16.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TFR1蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TFR1蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人TFR1蛋白的胞外区的核苷酸序列，进一步优选的，编码人TFR1蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，编码SEQ ID NO：2第89-760位的核苷酸序列；
C)人或人源化TFR1基因的核苷酸序列；或，
D)人TFR1基因的1号至19号外显子的全部或部分，优选的，人TFR1基因的4号至19号外显子的全部或部分，进一步优选的，人TFR1基因的4号外显子的部分、5号至18号外显子的全部和19号外显子的部分，其中，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，19号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过内源调控元件调控。
18.根据权利要求15-17任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，任选地，所述的导入非人动物TFR1基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物TFR1基因的5号至18号外显子被替换，进一步优选地，还包含非人动物TFR1基因的4号外显子的部分和/或19号外显子的部分被替换。
19.根据权利要求12-18任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求10-11任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。
20.根据权利要求12-19任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将TFR1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。
21.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官表达权利要求1-4任一所述的人源化TFR1蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官的基因组包含权利要求5-9任一所述的人源化TFR1基因，或者，权利要求12-20任一所述的构建方法获得的非人动物。
22.一种瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求1-4任一所述的人源化TFR1蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组包含权利要求5-9任一所述的人源化TFR1基因，或者，权利要求12-20任一所述的构建方法获得的非人动物。
23.一种权利要求1-4任一所述的人源化TFR1蛋白、权利要求5-9任一所述的人源化TFR1基因、权利要求12-20任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求21所述的细胞、组织或器官或权利要求22所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与TFR1相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TFR1相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TFR1相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人TFR1信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究TFR1基因功能，研究针对人TFR1靶位点的药物、药效，研究与TFR1相关的神经退行性疾病、骨科疾病、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
CN202210831119.8A 2021-07-16 2022-07-15 Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用 Pending CN115785251A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110808740 2021-07-16
CN2021108087408 2021-07-16
CN202111238943 2021-10-25
CN2021112389434 2021-10-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115785251A true CN115785251A (zh) 2023-03-14

Family

ID=84919001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210831119.8A Pending CN115785251A (zh) 2021-07-16 2022-07-15 Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240268361A1 (zh)
EP (1) EP4370539A1 (zh)
JP (1) JP2024525991A (zh)
KR (1) KR20240037269A (zh)
CN (1) CN115785251A (zh)
WO (1) WO2023284850A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020169022A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
AU2021283564A1 (en) 2020-06-02 2022-12-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
WO2024026488A2 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160208008A1 (en) * 2013-03-15 2016-07-21 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies to transferrin and transferrin receptor antigens, and uses thereof
CN110382526A (zh) * 2017-02-17 2019-10-25 戴纳立制药公司 转铁蛋白受体转基因模型
CN112458117A (zh) * 2021-02-02 2021-03-09 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd155基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN112501124A (zh) * 2020-11-27 2021-03-16 领诺(上海)医药科技有限公司 稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2953841B1 (fr) * 2009-12-16 2011-12-30 Centre Nat Rech Scient Anticorps diriges contre le recepteur de la transferrine et leurs utilisations pour l'immunotherapie des tumeurs qui dependent du fer
EP3476865B1 (en) * 2016-06-28 2023-09-13 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Method for constructing pd-1 gene-modified humanized animal model and use thereof
CN110996658B (zh) * 2017-06-27 2024-03-26 瑞泽恩制药公司 包含人源化asgr1基因座的非人动物
CN109735498B (zh) * 2018-12-14 2020-11-10 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种cd137基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
CN111304248B (zh) * 2018-12-25 2021-08-24 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用
CN112725379B (zh) * 2021-01-27 2024-08-13 上海南方模式生物科技股份有限公司 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160208008A1 (en) * 2013-03-15 2016-07-21 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies to transferrin and transferrin receptor antigens, and uses thereof
CN110382526A (zh) * 2017-02-17 2019-10-25 戴纳立制药公司 转铁蛋白受体转基因模型
CN112501124A (zh) * 2020-11-27 2021-03-16 领诺(上海)医药科技有限公司 稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用
CN112458117A (zh) * 2021-02-02 2021-03-09 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd155基因人源化的非人动物的构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU Y.J.等: "Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates", SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, pages 261 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4370539A1 (en) 2024-05-22
WO2023284850A1 (en) 2023-01-19
US20240268361A1 (en) 2024-08-15
KR20240037269A (ko) 2024-03-21
JP2024525991A (ja) 2024-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108588126B (zh) Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
US11279948B2 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
US11505806B2 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
CN107815467B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN115785251A (zh) Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN111793647B (zh) Cd226基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN113388640B (zh) Ccr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN112779284B (zh) Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN107955817B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN114751973B (zh) Siglec15基因人源化非人动物的构建方法和应用
CN113881681B (zh) Ccr8基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115011606A (zh) Cd37基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN112553252B (zh) Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN115010800B (zh) Pvrig基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN117384960B (zh) 一种tl1a基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115772541A (zh) Cd98hc基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN115948464A (zh) 一种trem1基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN115918611A (zh) Tgfbr2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
WO2022222958A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN115873876A (zh) Fap基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN115873902A (zh) 一种cd200和/或cd200r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
WO2024012578A1 (zh) 一种tlr7和/或tlr8基因人源化修饰的非人动物
CN116083483A (zh) Il21基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN116420680A (zh) Igf1r基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115997729A (zh) Nkp46基因人源化非人动物及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination