CN115873902A

CN115873902A - 一种cd200和/或cd200r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN115873902A
Application number: CN202211520467.XA
Authority: CN
Inventors: 吕锐利; 李冲; 沈志远
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-03-31
Also published as: WO2023098729A1

Abstract

本发明提供了一种CD200和/或CD200R基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化CD200和/或CD200R蛋白、一种人源化CD200和/或CD200R基因、一种CD200和/或CD200R基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CD200和/或CD200R蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CD200和/或CD200R蛋白，可以作为人CD200和/或CD200R信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

一种CD200和/或CD200R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD200和/或CD200R基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

CD200(也叫作OX-2)是Ig超家族(IgSF)的一员，具有与B7家族类似的结构。CD200在包括胸腺细胞、活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、肺泡内皮细胞、肾小球细胞、平滑肌以及滋养层细胞等多种细胞上表达，同时也是慢性淋巴细胞白血病、恶性黑色素瘤以及中枢神经系统相关肿瘤高表达的标记物。

CD200R是CD200的受体，同时也发现了多个与CD200R高度同源的家族分子(如CD200RLa等)。CD200R的表达相对局限性较高，主要是髓系细胞，例如巨噬细胞，单核细胞，DC细胞等。

CD200/CD200R相互作用向髓系细胞发出抑制信号，抑制干扰素-γ诱导的一氧化氮(NO)、白细胞介素5、白细胞介素13以及白细胞介素6的增殖、活化和分泌。有关肿瘤方面研究表明，骨髓来源抑制细胞MDSCs等高表达CD200R能够抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤生长，因此采用抗体阻断CD200/CD200R二者的相互作用是一种潜在的免疫治疗手段。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，CD200的人鼠同源性仅为76％，CD200R的人鼠同源性仅为58.18％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于CD200/CD200R复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发CD200/CD200R相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CD200基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD200蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CD200蛋白包含人CD200蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD200蛋白包含人CD200蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD200蛋白包含人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、69bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、10、20、50、70、100、300、500、700、900、1000、1200、1270bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200蛋白包含人CD200蛋白的信号肽和胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个氨基酸的人CD200蛋白信号肽和胞外区，例如包含至少100、150、170、190、200、230、250、255、256、257个氨基酸的人CD200蛋白的信号肽和胞外区；所述的人源化CD200蛋白信号肽和胞外区包含SEQ ID NO：2第1-257位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-257位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、9

7％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-257位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-257位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200蛋白还包含人CD200蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含至少10个氨基酸的人CD200蛋白跨膜区，例如包含至少10、15、16、17、18、19、20、25、26、27个氨基酸的人CD200蛋白跨膜区；所述的人源化CD200蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第258-284位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第258-284位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第258-284位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第258-284位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200蛋白还包含人CD200蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少1个氨基酸的人CD200蛋白胞质区，例如包含至少1、5、6、7、8、9、10个氨基酸的人CD200蛋白胞质区；所述的人源化CD200蛋白胞质区包含SEQ IDNO：2第285-294位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：2第285-294位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第285-294位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第285-294位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CD200蛋白包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化CD200基因，进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的部分。

优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子，更优选的包含1-7号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、69bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、10、20、50、70、100、300、500、700、900、1000、1200、1270bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200基因包含编码人CD200蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含编码人CD200蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列的全部或部分，所述的人源化CD200基因包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200基因还包含非人动物CD200基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物CD200基因的1号至6号外显子的全部或部分，更优选包含非人动物CD200基因1号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

E)包含SEQ ID NO：16和/或17所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD200基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

B)编码人或人源化CD200蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、69bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、10、20、50、70、100、300、500、700、900、1000、1200、1270bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CD200蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列导入非人动物CD200基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物CD200基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为替换或插入。

优选的，所述的人或人源化CD200基因可操作连接到至少一条染色体上内源CD200基因的内源调控元件。

优选的，所述的人或人源化CD200基因在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。

优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物CD200基因。所述的外源性调控元件来自人CD200基因。

优选的，所述的导入的位置位于CD200基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的导入为替换或插入，进一步优选的，所述的导入非人动物CD200基因座为替换非人动物相应区域，更优选的，非人动物CD200基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选地，非人动物的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO:1所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

优选的，使用基因编辑技术进行CD200基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物CD200基因的编码框，将编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列或者人源化CD200基因的核苷酸序列插入非人动物CD200基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物CD200基因的编码框可以采用敲除非人动物CD200基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物CD200蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物CD200基因的编码框可以为敲除非人动物CD200基因的1号外显子至5号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、69bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、10、20、50、70、100、300、500、700、900、1000、1200、1270bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物CD200基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ IDNO：3所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物CD200基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎干细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，培养该囊胚，然后将培养后的囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD200基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CD200基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为CD200R、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的CD200R、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73蛋白中的至少一种。

优选的，所述其它基因为CD200R基因，所述CD200R基因为人源化CD200R基因，进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分。更优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或4-5号内含子，更优选的包含2-5号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、60、66bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、100、109bp的核苷酸序列；优选的，5号外显子的部分包含5号外显子中编码胞外区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R基因包含SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合的。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为杂合的。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种CD200基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD200蛋白表达降低或缺失。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200蛋白还包含人CD200蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少1个氨基酸的人CD200蛋白胞质区，例如包含至少1、5、6、7、8、9、10个氨基酸的人CD200蛋白胞质区；所述的人源化CD200蛋白胞质区包含SEQ IDNO：2第285-294位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第285-294位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、9

4％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第285-294位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ IDNO：2第285-294位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化CD200基因，进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的部分。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：16和/或17所示的核苷酸序列。

优选的，所述人或人源化CD200基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CD200基因的内源调控元件。

优选的，所述的非人动物是本发明如上所述的构建方法构建的。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自CD200R、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CD200基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CD200基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为杂合。

优选的，所述的人源化CD200基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：16、17、18和/或19。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CD200基因的1号至5号外显子上。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在CD200基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第六方面，提供了一种人源化CD200基因，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的部分。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：16和/或17所示的核苷酸序列。

本发明的第七方面，提供了一种人源化CD200蛋白，所述的人源化CD200蛋白是由上述的人源化CD200基因编码的。

本发明的第八方面，提供了一种CD200R基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD200R蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更优选的，包含2号至5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、60、66bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、100、109bp的核苷酸序列；优选的，5号外显子的部分包含5号外显子中编码胞外区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人CD200R蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含至少100、150、170、190、200、210、211、212、213、214、215个连续氨基酸。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白部分包含SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ IDNO：8第29-243位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白还包含非人动物CD200R蛋白的全部或部分，进一步优选为非人动物CD200R蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R蛋白还包含非人动物CD200R蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：15所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：15所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：15所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化CD200R基因，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的部分。

优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更优选的，包含2号至5号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或4-5号内含子，更优选的包含2-5号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、60、66bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、100、109bp的核苷酸序列；优选的，5号外显子的部分包含5号外显子中编码胞外区的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200R基因包含编码人CD200R蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人CD200R蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人CD200R蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含编码至少100、150、170、190、200、210、211、212、213、214、215个连续氨基酸的核苷酸序列。其中，所述的人源化CD200R基因包含编码SEQ ID NO：8第29-243位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ IDNO：8第29-243位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：8第29-243位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：8第29-243位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200R基因还包含非人动物CD200R基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分，更优选包含非人动物CD200R基因1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号至7号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R基因还包含编码SEQ IDNO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：14所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：14所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

E)包含SEQ ID NO：35和/或36所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200R基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD200R基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

B)编码人CD200R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人CD200R蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人CD200R蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码SEQ ID NO：8第29-243位的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、60、66bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、100、109bp的核苷酸序列；优选的，5号外显子的部分包含5号外显子中编码胞外区的核苷酸序列。进一步优选的，包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人或人源化CD200R基因可操作连接到至少一条染色体上内源CD200R基因的内源调控元件。

优选的，所述的人或人源化CD200R基因在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。

优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物CD200R基因，所述的外源性调控元件来自人CD200R基因。

优选的，所述的导入的位置位于CD200R基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的导入为替换或插入，进一步优选的，所述的导入非人动物CD200R基因座为替换非人动物相应区域，更优选的，非人动物CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选地，非人动物的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO:7的第26-238位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

优选的，使用基因编辑技术进行CD200R基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物CD200R基因的编码框，将编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列或者人源化CD200R基因的核苷酸序列插入非人动物CD200R基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物CD200R基因的编码框可以采用敲除非人动物CD200R基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物CD200R蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物CD200R基因的编码框可以为敲除非人动物CD200R基因的2号外显子至5号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、60、66bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子中编码胞外区的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、25、26、27、28、29、30、50、70、100、109bp的核苷酸序列；优选的，5号外显子的部分包含5号外显子中编码胞外区的核苷酸序列。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物CD200R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ IDNO：9或11所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物CD200R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10或12所示。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向CD200R基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CD200R基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD200R基因上的靶序列上。

优选的，所述的sgRNA靶位点位于CD200R基因的2号外显子至5号外显子序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CD200R基因的2号外显子和/或5号外显子序列上。

优选的，所述的sgRNA在CD200R基因上的靶序列如SEQ ID NO：41或42所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向CD200R基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD200R基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CD200R基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为CD200、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的CD200、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73蛋白中的至少一种。

优选的，所述其它基因为CD200基因，所述CD200基因为人源化CD200基因，进一步优选的，所述的人源化CD200基因如上述的人源化CD200基因。

本发明的第九方面，提供了一种CD200R基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CD200R蛋白表达降低或缺失。

A)SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；

优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化CD200R基因，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD200R基因还包含编码SEQIDNO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：7第1-25、239-326位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：14所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：35和/或36所示的核苷酸序列。

优选的，所述人或人源化CD200R基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CD200R基因的内源调控元件。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自CD200、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CD200R基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CD200R基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为杂合。

优选的，所述的人源化CD200R基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

本发明的第十方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：35、36、37和/或38。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CD200R基因的2号至5号外显子上。

本发明的第十一方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CD200R基因，其靶位点位于CD200R基因的2号外显子至5号外显子序列上。

本发明的第十二方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ IDNO：58和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO:45，SEQ ID NO：59和SEQ ID NO:47，或者，SEQ ID NO：46和SEQ ID NO:48。

本发明的第十三方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。

本发明的第十四方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。

本发明的第十五方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在CD200R基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第十六方面，提供了一种人源化CD200R蛋白，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的全部或部分。

A)SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；

本发明的第十七方面，提供了一种编码上述的人源化CD200R蛋白的人源化CD200R基因，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的部分。

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：14所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：35和/或36所示的核苷酸序列。

本发明的第十八方面，提供了一种CD200R基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源CD200R基因的2号外显子至5号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。

本发明的第十九方面，提供了一种CD200R基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。

本发明的第二十方面，提供了一种CD200R基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CD200R基因的2号外显子至5号外显子的全部或部分，优选为2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。

本发明的第二十一方面，提供了一种CD200R基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行CD200R基因缺失的细胞的构建。

本发明的第二十二方面，提供了一种CD200和CD200R基因修饰非人动物的构建方法，所述的多基因修饰包括多基因人源化，优选的，所述的多基因修饰非人动物表达人源化CD200蛋白和人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的构建方法包括：

将非人动物之间进行交配或体外授精；

或者非人动物进行基因编辑获得多基因修饰非人动物。

优选的，所述的人源化CD200蛋白选自上述的人源化CD200蛋白，

所述的人源化CD200R蛋白选自上述的人源化CD200R蛋白，

本发明的第二十三方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：

(一)提供上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

本发明的第二十四方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化CD200蛋白和/或上述的人源化CD200R蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化CD200基因和/或上述的人源化CD200R基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十五方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化CD200蛋白和/或上述的人源化CD200R蛋白。或者，所述的瘤组织的基因组中包含上述的人源化CD200基因和/或上述的人源化CD200R基因。或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十六方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第二十七方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第二十八方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第二十九方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明的第三十方面，提供了一种CD200和/或CD200R基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CD200和/或CD200R蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化CD200蛋白和/或上述的人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CD200和/或CD200R基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化CD200基因和/或上述的人源化CD200R基因。

本发明的第三十一方面，提供了一种包含上述的人源化CD200基因和/或上述的人源化CD200R基因的构建体或者表达上述的人源化CD200蛋白和/或上述的人源化CD200R蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。

本发明的第三十二方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第三十三方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第三十四方面，提供了一种CD200基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人或人源化CD200基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化CD200蛋白的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200基因为上述的人源化CD200基因。

优选的，所述的人源化CD200蛋白为上述的人源化CD200蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源CD200基因座处用人CD200基因的基因组片段(优选编码人CD200的信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分序列)，和/或，非人动物CD200基因的基因组片段，导入非人动物CD200基因的基因组片段以形成经修饰的CD200基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源CD200基因座处用人源化CD200基因导入非人动物CD200基因的基因组片段以形成经修饰的CD200基因。

所述的经修饰的CD200基因编码人源化CD200蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的导入非人动物CD200基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物CD200基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物CD200基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。

优选的，所述的经修饰的CD200基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明的第三十五方面，提供了一种CD200R基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人或人源化CD200R基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化CD200R蛋白的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD200R基因为上述的人源化CD200R基因。

优选的，所述的人源化CD200R蛋白为上述的人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源CD200R基因座处用人CD200R基因的基因组片段(优选编码人CD200R的胞外区的全部或部分序列)，和/或，非人动物CD200R基因的基因组片段，导入非人动物CD200R基因的基因组片段以形成经修饰的CD200R基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源CD200R基因座处用人源化CD200R基因导入非人动物CD200R基因的基因组片段以形成经修饰的CD200R基因。

所述的经修饰的CD200R基因编码人源化CD200R蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的插入为插入非人动物CD200R基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的替换为替换非人动物CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。

优选的，所述的经修饰的CD200R基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

本发明的第三十六方面，提供了包含上述CD200和/或CD200R基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。

优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。

本发明的第三十七方面，提供了一种上述的人源化CD200蛋白、上述的人源化CD200R蛋白、上述的人源化CD200基因和/或上述的人源化CD200R基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与CD200/CD200R相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CD200/CD200R相关的模型系统中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CD200/CD200R相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人CD200/CD200R信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究CD200/CD200R基因功能，研究针对人CD200/CD200R靶位点的药物、药效，研究与CD200/CD200R相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

优选的，所述应用包括疾病的治疗和/或诊断方法，或，非疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第三十八方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人CD200/CD200R特异性调节剂的筛选。

本发明的第三十九方面，提供了一种人CD200/CD200R特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗CD200和/或CD200R抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法包括治疗和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第四十方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于克隆恩病、银屑病、强直性脊柱炎、结节病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CD200基因座”表示CD200基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CD200基因座可以是CD200基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CD200蛋白”，包含来源于人CD200蛋白的部分。其中，所述的“人CD200蛋白”同“人CD200蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CD200蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CD200蛋白的部分”，为连续或间隔的5-294个(优选为10-294个)氨基酸序列与人CD200蛋白的氨基酸序列一致或与人CD200蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CD200基因”，包含来源于人CD200基因的部分和非人CD200基因的部分。其中，所述的“人CD200基因”同“人CD200基因的全部”，即其核苷酸序列与人CD200基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CD200基因的部分”为连续或间隔的20-30240bp(优选为20-28362bp、20-2204bp或20-882bp)个核苷酸序列与人CD200核苷酸序列一致或与人CD200核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CD200R蛋白”，包含来源于人CD200R蛋白的部分。其中，所述的“人CD200R蛋白”同“人CD200R蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CD200R蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CD200R蛋白的部分”，为连续或间隔的5-325个(优选为10-215个)氨基酸序列与人CD200R蛋白的氨基酸序列一致或与人CD200R蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CD200R基因”，包含来源于人CD200R基因的部分和非人CD200R基因的部分。其中，所述的“人CD200R基因”同“人CD200R基因的全部”，即其核苷酸序列与人CD200R基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CD200R基因的部分”为连续或间隔的20-53899bp(优选为20-5990bp、20-3696bp或20-645bp)个核苷酸序列与人CD200R核苷酸序列一致或与人CD200R核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CD200基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-232bp个，优选10-186bp个核苷酸序列与人CD200基因的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化CD200基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸。

本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“CD200蛋白”、“CD200R蛋白”，例如“人CD200蛋白”、“非人动物CD200R蛋白”或“人源化CD200R蛋白”，均包含全部蛋白或包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.NO:4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

有益效果：

利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的基因人源化动物模型，使其体内表达人源蛋白，作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。

利用基因人源化动物模型建立各种疾病模型，可以进行抗人抗体药物的药理药效评价。

优选的，考虑到CD200和/或CD200R在信号通路上的功能相互关联，本发明设计出多个基因人源化的技术方案，使得包含上述人源化基因的非人动物能表达出多个人源化或人的相应蛋白，为筛选适合人的试剂提供更为人源化的微环境，从而筛选出的试剂效力更好。

优选的，为便于多个人源化基因的表达，本发明优化了导入的人的CD200和/或CD200R基因的片段选择，以及导入位置的选择，人的CD200和/或CD200R基因可以无随机插入的导入，并正确表达人源化或人的相应蛋白，可以稳定传代，同时不影响非人动物的其他功能。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠CD200基因座和人CD200基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠CD200基因人源化改造部分示意图(非按比例)；

图3：CD200基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4：Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型；

图5：CD200基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图6：CD200基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水，PC为对照，M为Marker；

图7：小鼠CD200R基因座和人CD200R基因座对比示意图(非按比例)；

图8：小鼠CD200R基因人源化改造部分示意图(非按比例)；

图9：CD200R基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图10：CD200R基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图11：CD200R基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图12：CD200R基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水，M为Marker；

图13：Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得

BglII、DraIII、EcoRV、BspHI、StuI酶购自NEB，货号分别为R0144S、R3510S、R3195S、R0517S、R0187S；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；

PerCP anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody购自Biolegend，货号108426；

FITC anti-mouse F4/80购自Biolegend，货号123108；

V450 Rat Anti-mouse CD11b购自BD Horizon，货号560455；

APC anti-mouse CD200R(OX2R)Antibody购自Biolegend，货号123915；

PE anti-human CD200R Antibody购自Biolegend，货号329305；

Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号423106；

Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号101302；

FITC anti-Mouse CD19购自Biolegend，货号115506；

CD200 Monoclonal Antibody(OX90),PE,eBioscience^TM购自Invitrogen，货号12-5200-82；

CD200 Monoclonal Antibody(OX104),APC,eBioscience^TM购自Invitrogen，货号17-9200-41；

PerCP anti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103130；

Alexa

700anti-mouse CD3Antibody购自Biolegend，货号100216；

BioLegend Brilliant Violet 785^TM anti-mouse/human CD11b Antibody购自Biolegend，货号101243；

Brilliant Violet 650^TM anti-mouse Ly-6G Antibody购自Biolegend，货号127641；

PE/Cyanine7 anti-mouse F4/80Antibody购自Biolegend，货号123114；

Rat IgG2a kappa Isotype Control(eBR2a),PE,eBioscience^TM购自Invitrogen，货号12-4321-80；

APC Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400220；

PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400112；

Mouse IgG1 kappa Isotype Control(P3.6.2.8.1),APC,eBioscience^TM购自Invitrogen，货号17-4714-82。

实施例1 CD200基因人源化小鼠的制备

小鼠CD200基因(NCBI Gene ID：17470，Primary source：MGI：1196990，UniProtID：Q80VX2，位于16号染色体NC_000082.7的第45202474至45229567位，基于转录本NM_010818.3及其编码蛋白NP_034948.3(SEQ ID NO:1))和人CD200基因(NCBI Gene ID：4345，Primary source：HGNC:7203，UniProt ID：P41217-3，位于3号染色体NC_000003.12的第112332573至112362812位，基于转录本NM_001004196.4及其编码蛋白NP_001004196.2(SEQID NO:2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CD200基因座引入编码人CD200蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CD200蛋白。具体来说，用基因编辑技术在小鼠CD200基因调节元件的控制下，用包含人CD200基因的1号外显子部分序列至7号外显子部分序列约28.3kb替换小鼠1号外显子的部分序列至5号外显子的部分序列约16.6kb，得到人源化CD200基因座示意图如图2所示，实现对小鼠CD200基因的人源化改造。

设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠CD200基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CD200 DNA片段的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:3)与NCBI登录号为NC_000082.7的第45229231至45232783位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:4)与NCBI登录号为NC_000082.7的第45208864至45212611位核苷酸序列相同。人CD200的DNA片段核苷酸序列(SEQ ID NO:5)与NCBI登录号为NC_000003.12的第112333213至112361547位核苷酸序列相同；A片段序列上游与小鼠的连接设计为：5’-GGTGTCTAGCTGCGGCCCAGAGCAAGGATGGAGAGGCTGGTGAGCGGGGCCGGGGCTTGGGA-3’(SEQ ID NO:16)，其中序列“AAGG”中最后一个“G”是小鼠最后一个核苷酸，序列“ATGG”中的“A”是人第一个核苷酸。A片段序列下游与小鼠的连接设计为：5’-TAATACCTTGTTTTTCTTTTATCCAGAGCCCTAAGGTAAAAATTCCTTTCTTTATAAT-3’(SEQ ID NO:17)，其中序列“GCCC”中的最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列“TAAG”中的“T”是小鼠序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与人基因的连接设计为：5’-CTAAGATTACACAGAGAGTGAGAGGTGGTGCCAAATCATCTGGCGAATCGGACC CACAAGAGCACTGAGGTCGGAAGTTCCTATTCTCTAGAA-3’(SEQ ID NO:18)，其中序列“CCAA”中最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“ATCA”的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人基因的连接设计为：5’-ATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCCAGGATACATAGATTACCACAACTCC GAGCCGATAAAATTCCAAGTCTTTTACTTCATCGTCT-3’(SEQ ID NO:19)，其中序列“AGCC”中最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“GATA”中的“G”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CD200的mRNA序列如SEQ ID NO:6所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

鉴于人CD200具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。

其中，PCR测定包括下述引物：

WT-F：5’-GTCTCTTCCTCCACACTAGAGGAGC-3’(SEQ ID NO:28)，

Mut-R：5’-GAGGATGCGCCAGCTTCGTCAGC-3’(SEQ ID NO:30)；

经PCR鉴定为阳性的部分细胞进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。分别用BglII、DraIII、EcoRV、BspHI酶消化细胞DNA并使用4个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示，检测结果如图4所示：ES-02、ES-03、ES-04、ES-06、ES-09和ES-10均为阳性克隆且无随机插入。

表1具体探针及目的片段的长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				BglII	LR Probe	6.1kb	7.0kb
DraIII	Neo Probe	--	11.7kb
				EcoRV	A1 Probe	--	16.5kb
BspHI	A Probe	--	19.0kb

探针合成引物如下：

LR Probe-F(SEQ ID NO:20)：5’-TAAGGATCCCGTGGTTCCCATGC-3’，

LR Probe-R(SEQ ID NO:21)：5’-CTTATAGATGGCATTTCATAAGTATGC-3’；

Neo Probe-F(SEQ ID NO:22)：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’，

Neo Probe-R(SEQ ID NO:23)：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’；

A1 Probe-F(SEQ ID NO:24)：5’-CTAAACCCCGGTGCCCTGACCTC-3’，

A1 Probe-R(SEQ ID NO:25)：5’-CATTCAGAGGAATTAATGCAATTGGCC-3’；

A Probe-F(SEQ ID NO:26)：5’-CTCGCTTTCTCCGGGAGAGCTCC-3’，

A Probe-R(SEQ ID NO:27)：5’-CCGCCTGTTTATGTGTAAAACGAGG-3’；

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到CD200基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03和F1-04的小鼠为阳性杂合小鼠,证明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的CD200人源化基因工程小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。

表2引物名称及具体序列

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人CD200蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。具体来说，分别取8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和8周龄雌性CD200基因人源化杂合子小鼠各1只，取小鼠脾脏B细胞，分别用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45(mCD45)、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19(mCD19)、抗鼠CD200抗体CD200Monoclonal Antibody(OX90),PE,eBioscience^TM(mCD200)、抗人CD200抗体CD200Monoclonal Antibody(OX104),APC,eBioscience^TM(hCD200)、Zombie NIR^TM FixableViability Kit、Purified anti-mouse CD16/32等识别染色后进行流式检测，检测CD200蛋白的表达情况。

结果表明，C57BL/6小鼠脾脏B细胞(特征为mCD45+mCD19+)有0.32％hCD200阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hCD200+)，有42.6％mCD200阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mCD200+)，CD200人源化杂合子小鼠脾脏B细胞(特征为mCD45+mCD19+)有31.6％hCD200阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hCD200+)，有50.2％mCD200阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mCD200+)，说明在野生型C57BL/6小鼠体内只能检测到鼠CD200蛋白，不能检测到人CD200蛋白；人CD200蛋白只能在CD200人源化杂合子小鼠体内检测到。

实施例2CD200R基因人源化小鼠的制备

小鼠CD200R基因(NCBI Gene ID：57781，Primary source：MGI：1889024，UniProtID：Q9ES57，位于16号染色体NC_000082.7的第44586099至44615340位，基于转录本NM_021325.3及其编码蛋白NP_067300.1(SEQ ID NO:7))和人CD200R基因(NCBI Gene ID：131450，Primary source：HGNC：24235，UniProt ID：Q8TD46，位于3号染色体NC_000003.12的第112921205至112975103位，基于转录本NM_170780.3及其编码蛋白NP_740750.1(SEQID NO:8))对比示意图如图7所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CD200R基因座引入编码人CD200R蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CD200R蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠CD200R基因调节元件的控制下，用包含人CD200R基因的2号外显子部分序列至5号外显子部分序列约6kb替换小鼠2号外显子的部分序列至5号外显子的部分序列约4.0kb，得到人源化CD200R基因座示意图如图8所示，实现对小鼠CD200R基因的人源化改造。

进一步设计如图9所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠CD200R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CD200R DNA片段的A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:9)与NCBI登录号为NC_000082.7的第44605076至44609119位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:10)与NCBI登录号为NC_000082.7的第44613110至44616609位核苷酸序列相同。人CD200R的DNA片段核苷酸序列(SEQ ID NO:13)与NCBI登录号为NC_000003.12的第112925165至112931154位核苷酸序列相同；A1片段序列上游与小鼠的连接设计为：5’-GTATTTAAATATTTTCTAGGGTCAAGTTGTATGGATGAAAAACAGATTACACAGAACTACTCGAAA-3’(SEQ ID NO:35)，其中序列“TTGT”中最后一个“T”是小鼠最后一个核苷酸，序列“ATGG”中的“A”是人第一个核苷酸。A1片段序列下游与小鼠的连接设计为5’-TATAGTTCCAGGTGCCAAAAAATCAGCAAAATTATATATTCCATACATCATACCATCAATTATC-3’(SEQ ID NO:36)，其中序列“ATTA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“TATA”中第一个“T”是小鼠序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(NEO CASSETTE)。其中Neo盒5’端与人基因的连接设计为：5’-GCTCTACCCCTGTCTTTCCAAC CGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTA-3’(SEQ ID NO:37)，其中序列“AACC”中最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列“GTCG”的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人基因的连接设计为：5’-ATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCCAATTGCCATCTCCATTAAACTCCC-3’(SEQ ID NO:38)，其中序列“ATCC”中最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CAAT”中的“C”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CD200R的mRNA序列如SEQ ID NO:14所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:15所示。

鉴于人CD200R具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定(引物如表3所示)为阳性的克隆，再进行Southern Blot检测确认无随机插入后，再进一步测序验证正确的克隆进行下一步实验。

表3引物名称及具体序列

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图10)后，再通过互相交配即可得到CD200R基因人源化纯合子小鼠。

此外，还可引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，设计如图11所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠CD200R基因上游和下游的同源臂序列，以及人CD200RDNA片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:11)与NCBI登录号为NC_000082.7的第44607693至44609119位核苷酸序列一致性为99.93％，突变位置为NCBI登录号为NC_000082.7的第44608624位由“C”突变为“G”,下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:12)与NCBI登录号为NC_000082.7的第44613110至44614556位核苷酸序列相同。人CD200R DNA片段核苷酸序列(SEQ ID NO:13)与NCBI登录号为NC_000003.12的第112925165至112931154位核苷酸序列相同；人CD200R DNA片段序列上游与小鼠的连接序列为SEQ ID NO:35，人CD200R DNA片段序列下游与小鼠的连接序列为SEQ ID NO:36，改造后的人源化小鼠CD200R的mRNA序列如SEQ ID NO:14所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:15所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，各sgRNA在CD200R基因上的靶序列如下：

sgRNA1靶位点：5’-GAGTTAGAGGAGTGATACCCAGG-3’(SEQ ID NO:41)；

sgRNA2靶位点：5’-GACCGGTACCACCTCTCCTCCGG-3’(SEQ ID NO:42)；

利用UCA试剂盒检测确认sgRNA的活性，随后在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表4)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CD200R-1和pT7-CD200R-2。

表4sgRNA1和sgRNA2序列列表

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:49)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-CD200R-1和pT7-CD200R-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的CD200R基因人源化小鼠品系。可通过PCR鉴定F0代小鼠体细胞的基因型(引物如表5所示)，经PCR鉴定为阳性的小鼠，再进行Southern Blot检测确认无随机插入后，再进一步测序验证正确的克隆进行下一步实验。

表5引物名称及具体序列

可通过多数方法鉴定上述方法制备的小鼠是否成功。例如，可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表6所示)，示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图12，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04、F1-05、F1-06和F1-07的小鼠为阳性杂合小鼠。

表6引物名称及具体序列

对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用StuI酶或BspHI酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表7，示例性检测结果如图13所示：F1-01和F1-02均为阳性的小鼠且无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的CD200R基因人源化小鼠。最后再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。

Southern Blot检测包括如下探针引物：

A Probe(5’)-F：5’-GTTCTTGCTTGTCTCTGAACCTTTG-3’(SEQ ID NO:54)，

A Probe(5’)-R：5’-CTGAGAGGTGATTAGTCCACCAAAG-3’(SEQ ID NO:55)；

3’Probe-F：5’-CAAGGATGAAATGCAGCCTTATGC-3’(SEQ ID NO:56)，

3’Probe-R：5’-CAGGTAGCAGCAGAGATTCCAAAC-3’(SEQ ID NO:57)；

表7具体探针及目的片段长度

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化CD200R蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。具体来说，分别取6周龄C57BL/6野生型小鼠和CD200R基因人源化杂合子小鼠各1只，取小鼠腹膜渗出巨噬细胞，分别用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouseCD45(mCD45)、抗鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体PerCP anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody(mGr-)、抗鼠F4/80抗体FITC anti-mouse F4/80(mF4/80)、抗鼠CD11b抗体V450Rat Anti-mouse CD11b(mCD11b)、抗鼠CD200R抗体APC anti-mouse CD200R(OX2R)Antibody(mCD200R)、抗人CD200R抗体PE anti-human CD200RAntibody(hCD200R)、ZombieNIR^TM Fixable Viability Kit、Purified anti-mouse CD16/32等识别染色后进行流式检测，检测CD200R蛋白的表达情况。

结果表明，C57BL/6小鼠腹膜渗出巨噬细胞(特征为mCD45+mGr-1-mCD11b+mF4/80+)有0.67％hCD200R阳性细胞(特征为mCD45+mGr-1-mCD11b+mF4/80+hCD200R+)，有58.6％mCD200R阳性细胞(特征为mCD45+mGr-1-mCD11b+mF4/80+mCD200R+)，CD200R杂合子小鼠腹膜渗出巨噬细胞有54.9％hCD200R阳性细胞，有39.3％mCD200R阳性细胞，说明在野生型C57BL/6小鼠体内只能检测到鼠CD200R蛋白，不能检测到人源化CD200R蛋白；人源化CD200R蛋白只能在CD200R人源化杂合子小鼠体内检测到。

实施例3双基因或多基因人源化小鼠

利用本方法或制得的CD200、CD200R基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有CD200R、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CD200小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CD200与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CD200小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到CD200基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。使用前述实施例2获得CD200R人源化小鼠根据上述方法，同样可以获得CD200R基因与其它基因修饰的纯合子小鼠。

以CD200/CD200R双基因人源化小鼠为例，使用上述实施例制备的CD200人源化鼠与CD200R人源化鼠进行交配，得到CD200/CD200R双基因人源化小鼠。使用流式细胞术检测CD200/CD 200R双基因人源化纯合子小鼠体内CD200和CD200R蛋白表达情况。具体来说，分别选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和CD200/CD200R双基因人源化纯合小鼠(H/H)各1只，脱颈安乐死后取脾细胞或腹水，使用Purified anti-mouse CD16/32Antibody、Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit、BioLegend PerCP anti-mouse CD45 Antibody、Alexa

700anti-mouse CD3 Antibody、FITC anti-Mouse CD19、BioLegendBrilliant Violet 785^TM anti-mouse/human CD11b Antibody、Brilliant Violet 650^TManti-mouse Ly-6G Antibody、PE/Cyanine7 anti-mouse F4/80Antibody、CD200Monoclonal Antibody(OX90),PE,eBioscience^TM、APC anti-mouse CD200R(OX2R)Antibody、Rat IgG2a kappa Isotype Control(eBR2a),PE,eBioscience^TM、APC MouseIgG2a,κIsotype Ctrl Antibody、PE anti-human CD200R Antibody、CD200 MonoclonalAntibody(OX104),APC,eBioscience^TM、PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody和MouseIgG1 kappa Isotype Control(P3.6.2.8.1),APC,eBioscience等识别染色后进行流式检测，CD200和CD200R蛋白表达结果如表8所示。

表8流式细胞术检测CD200和CD200R蛋白检测结果

由表8结果可知，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠CD200蛋白和CD200R蛋白；在CD200/CD200R双基因人源化纯合子小鼠体内仅能检测到人CD200蛋白和人源化CD200R蛋白。

利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CD200、CD200R和其它基因调节剂的体内药效验证等。

实施例4药效验证

利用本方法制得的CD200和/或CD200R人源化小鼠可以用于评估靶向人CD200抗体或人CD200R抗体的药效。例如，取CD200和/或CD200R人源化纯合子小鼠皮下接种过表达CD200结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组注射靶向人CD200R或CD200的抗体药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，通过比较小鼠体重变化和肿瘤体积，可有效评估抗体药物在人源化CD200和/或CD200R小鼠体内安全性和体内药效。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种CD200基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化CD200基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人源化CD200蛋白包含人CD200蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化CD200蛋白包含人CD200蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200蛋白包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的部分，优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化CD200基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200基因还包含非人动物CD200基因的部分，优选的，所述的人源化CD200基因包含非人动物CD200基因的1号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。

5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：16和/或17所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD200基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化CD200基因可操作连接到至少一条染色体上内源CD200基因的内源调控元件。

8.根据权利要求6-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，优选的，所述的导入非人动物CD200基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物CD200基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换，进一步优选的，非人动物CD200基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。

9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。

11.根据权利要求1-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将CD200基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自CD200R、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述其它基因为CD200R基因，所述CD200R基因为人源化CD200R基因，优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化CD200R基因包含SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

13.根据权利要求1-12任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化CD200基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。

14.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，包括人CD200基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。

16.一种人源化CD200基因，其特征在于，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的部分。

17.根据权利要求16所述的人源化CD200基因，其特征在于，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化CD200基因包含人CD200基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，优选的，所述的人CD200基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

18.根据权利要求16-17任一所述的人源化CD200基因，其特征在于，所述的人源化CD200基因还包含非人动物CD200基因的部分，优选的，所述的人源化CD200基因包含非人动物CD200基因的1号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号外显子的全部。

19.根据权利要求16-18任一所述的人源化CD200基因，其特征在于，所述的人源化CD200基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：16和/或17所示的核苷酸序列。

20.一种CD200R基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CD200R蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化CD200R基因。

21.根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的胞外区的全部或部分，更优选的，包含人CD200R蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸，更优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含SEQ IDNO：8第29-243位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

22.根据权利要求20或21所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白还包含非人动物CD200R蛋白的部分，优选为非人动物CD200R蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQID NO：7第1-25、239-326位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

23.根据权利要求20-22任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；

24.根据权利要求20-23任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的部分，优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化CD200R基因包含SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

25.根据权利要求24所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R基因还包含非人动物CD200R基因的部分，优选的，所述的人源化CD200R基因包含非人动物CD200R基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号至7号外显子的全部。

26.根据权利要求24-25任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD200R基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：14所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：35和/或36所示的核苷酸序列。

27.根据权利要求20-26任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD200R基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

B)编码人CD200R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人CD200R蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人CD200R蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，包含编码SEQ IDNO：8第29-243位的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

D)人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，包括人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，包括人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，最为优选的，包含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

28.根据权利要求20-27任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化CD200R基因可操作连接到至少一条染色体上内源CD200R基因的内源调控元件。

29.根据权利要求27-28任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，优选的，所述的导入非人动物CD200R基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分被替换，进一步优选的，非人动物CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分被替换。

30.根据权利要求20-29任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

31.根据权利要求30所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9或11所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10或12所示。

32.根据权利要求20-31任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将CD200R基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自CD200、PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

33.根据权利要求32所述的构建方法，其特征在于，所述其它基因为CD200基因，所述CD200基因为人源化CD200基因，优选的，所述的人源化CD200基因如权利要求16-19任一所述的人源化CD200基因。

34.根据权利要求32-33任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化CD200R基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。

35.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD200R蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD200R基因的核苷酸序列；或，

36.根据权利要求35所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9或11所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10或12所示。

37.一种人源化CD200R蛋白，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的全部或部分。

38.根据权利要求37所述的人源化CD200R蛋白，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含人CD200R蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人CD200R蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸，更优选的，所述的人源化CD200R蛋白包含SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：8第29-243位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第29-243位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

39.根据权利要求37-38任一所述的人源化CD200R蛋白，其特征在于，所述的人源化CD200R蛋白还包含非人动物CD200R蛋白的部分，优选为非人动物CD200R蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：7第1-25、239-326位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，

优选的，所述的人源化CD200R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：15所示氨基酸序列；

40.一种人源化CD200R基因，其特征在于，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的部分，优选的，所述的人源化CD200R基因编码权利要求37-39任一所述的人源化CD200R蛋白。

41.根据权利要求40所述的人源化CD200R基因，其特征在于，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号至5号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含人CD200R基因的2号外显子的部分、3号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的人源化CD200R基因包含SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

42.根据权利要求40-41任一所述的人源化CD200R基因，其特征在于，所述的人源化CD200R基因还包含非人动物CD200R基因的部分，优选的，所述的人源化CD200R基因包含非人动物CD200R基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分、5号外显子的部分和/或6号至7号外显子的全部。

43.根据权利要求40-42任一所述的人源化CD200R基因，其特征在于，所述的人源化CD200R基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：14所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：35和/或36所示的核苷酸序列。

44.根据权利要求37-39任一所述的人源化CD200R蛋白、权利要求16-19任一所述的人源化CD200基因、权利要求40-43任一所述的人源化CD200R基因或权利要求1-13和20-34任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

45.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求16-19任一所述的人源化CD200基因和/或权利要求40-43任一所述的人源化CD200R基因，所述的细胞、组织或器官表达人CD200蛋白和/或权利要求37-39任一所述的人源化CD200R蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求1-13和20-34任一所述的构建方法获得的非人动物，优选的，所述的组织包括荷瘤后的瘤组织。

46.一种权利要求37-39任一所述的人源化CD200R蛋白、权利要求16-19任一所述的人源化CD200基因、权利要求40-43任一所述的人源化CD200R基因或权利要求1-13和20-34任一所述的构建方法获得的非人动物或权利要求45所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包含：