CN116463376A - Baffr和/或baff基因人源化非人动物的构建方法及应用 - Google Patents

Baffr和/或baff基因人源化非人动物的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种BAFFR和/或BAFF基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化BAFFR和/或BAFF蛋白、一种人源化BAFFR和/或BAFF基因、一种BAFFR和/或BAFF基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人BAFFR和/或BAFF蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化BAFFR和/或BAFF蛋白，可以作为人BAFFR和/或BAFF信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

BAFFR和/或BAFF基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种BAFFR和/或BAFF基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
BAFF又称TNFSF13B(TNF superfamily member 13b)，一种细胞因子，TNF超家族的一个成员，属Ⅱ型跨膜蛋白。BAFF在髓系细胞中表达，是一种有效的B细胞激活剂，在B细胞的增殖和分化中发挥着重要作用。在单核细胞、树突状细胞和骨髓基质细胞等多种细胞类型中以跨膜蛋白的形式表达。BAFF的过度表达与自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、干燥综合征和血液系统恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、淋巴瘤和淋巴细胞性肿瘤白血病密切相关。
BAFF与三种不同的受体结合—BCMA(B-cell maturation antigen)、TACI(transmembr ane activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand(CAML)interactor)和BAFF-R(B cell activating factor of the TNF-family receptor)，通过与其受体结合而广泛参与B、T淋巴细胞增殖和功能的调节。BAFFR也称为TNFRSF13C，是一种Ⅲ型跨膜蛋白，包含一个单一的胞外富半胱氨酸结构域。除浆细胞外，BAFFR在B细胞亚群中广泛表达，不仅存在于细胞膜，还存在于细胞质、核膜和核质中。BAFFR作为单一受体与BAFF结合，可激活调节基本细胞功能的关键信号通路，包括存活、蛋白质合成和代谢适应性，在促进不同发育阶段B细胞存活方面起着关键作。BAFFR缺乏会使得B细胞从未成熟B细胞过渡到成熟B细胞的过程中断，并导致B淋巴细胞减少、体液免疫反应受损等。
BAFFR与BAFF的人鼠蛋白同源性分别为62％和49％。在药物开发过程中，利用实验动物进行人类药物，特别是抗体药物的发现和筛选，是非常重要的研究过程；同时，利用实验动物进行人类药物的药理药效等临床前研究更是不可缺少的开发步骤。但由于动物与人类在生理结构和代谢系统的差异，传统的动物模型并不能很好地反映药物在人体的真实状况，建立更接近人类生理特征的人源化动物模型是生物医药行业的迫切需求。而由于动物与人类生理病理的差异，以及基因的复杂性，构建“有效”的人源化动物用于新药开发依旧是存在巨大困难。
鉴于BAFFR在肿瘤疾病治疗领域的巨大应用潜力，为进一步探索相关生物学特性，并提高BAFFR靶点相关药物临床前试验的有效性，降低临床研究风险，本领域急需开发BAFFR及BAFF相关信号通路的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种BAFFR基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFFR蛋白。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含1号至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、50、70、75、76、77、78个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白胞外区包含SEQ IDNO：2第1-78位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、7、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白部分包含SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFFR蛋白的胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区和跨膜区、非人动物BAFFR蛋白的胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化BAFFR基因，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的部分。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码人BAFFR蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFFR蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFFR蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-78位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第79-97或79-99位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分、2号外显子的部分和3号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因还包含编码SEQ IDNO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物BAFFR基因座上，进一步优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFFR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包含人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包括人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入可能包括破坏非人动物内源BAFFR基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源BAFFR基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源BAFFR基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能在插入的目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源BAFFR蛋白不能正常表达。
优选的，所述的人或人源化BAFFR基因可操作连接到至少一条染色体上内源BAFFR基因的内源调控元件。
所述的人或人源化BAFFR基因在非人动物中通过调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人BAFFR基因。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物BAFFR基因。
优选的，所述的导入的位置位于BAFFR基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物BAFFR基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分和2号外显子的部分被替换。
优选的，编码SEQ ID NO：1的第1-93或1-95位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。
优选的，使用基因编辑技术进行BAFFR基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物BAFFR基因的编码框，将编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列或者人源化BAFFR基因的核苷酸序列插入非人动物BAFFR基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物BAFFR基因的编码框可以采用敲除非人动物BAFFR基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物BAFFR蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物BAFFR基因的编码框可以为敲除非人动物BAFFR基因的1号外显子至3号外显子的全部或部分，优选为敲除1号外显子的部分和2号外显子的部分。
优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFFR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分。优选的，包含人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物BAFFR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000081.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3或5所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物BAFFR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000081.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4或6所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子上，进一步优选的，位于非人动物BAFFR基因的1号至2号外显子上。
优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向BAFFR基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物BAFFR基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的BAFFR基因上的靶序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于BAFFR基因的1号外显子至3号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于BAFFR基因位于1号外显子至2号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于BAFFR基因位于1号外显子和/或2号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA在BAFFR基因上的靶序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向BAFFR基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得BAFFR基因人源化的非人动物。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得BAFFR基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将BAFFR基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为BAFF、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种基因。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的BAFF、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38蛋白中的至少一种。
优选的，所述其他基因为BAFF基因，所述的BAFF基因为人源化BAFF基因。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种BAFFR基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFFR蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源BAFFR蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，包含1号至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、50、70、75、76、77、78个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白胞外区包含SEQ IDNO：2第1-78位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、7、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白部分包含SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFFR蛋白的胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区和跨膜区、非人动物BAFFR蛋白的胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化BAFFR基因，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的部分。优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码人BAFFR蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFFR蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFFR蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-78位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第79-97或79-99位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分、2号外显子的部分和3号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因还包含编码SEQ IDNO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性BAFFR基因的内源调控元件。
优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物BAFFR基因座构建：
A)编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFFR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包括人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自BAFF、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种。
优选的，所述其他基因为BAFF基因，所述的BAFF基因为人源化BAFF基因。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化BAFFR基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFFR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分。优选的，包含人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含1号至2号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物BAFFR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000081.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3或5所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物BAFFR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000081.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4或6所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子上，进一步优选的，位于非人动物BAFFR基因的1号至2号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：8和/或9。
本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物BAFFR基因，其靶位点位于BAFFR基因的1号外显子至3号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于BAFFR基因的1号外显子至2号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于BAFFR基因的1号外显子和/或2号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA在BAFFR基因上的靶序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示。
本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ IDNO：14和16，SEQ ID NO：15和17，SEQ ID NO：18和20，SEQ ID NO：19和21。
本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在BAFFR基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第九方面，提供了一种人源化BAFFR蛋白，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，包含1号至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：10编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，例如包含至少20、30、40、50、70、75、76、77、78个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白胞外区包含SEQ IDNO：2第1-78位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、7、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFFR蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白部分包含SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFFR蛋白的胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区和跨膜区、非人动物BAFFR蛋白胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十方面，提供了一种人源化BAFFR基因，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的部分。
优选的，所述的人源化BAFFR基因编码上述的人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码人BAFFR蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFFR蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFFR蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFFR蛋白胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-78位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFFR蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第79-97或79-99位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选还包含1-2号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、135、136、137、138、139、140、150、160、169bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、158、160、180、200、210、230、231bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含2号外显子第一个核苷酸至编码跨膜区C端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分、2号外显子的部分和3号外显子的全部。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因还包含编码SEQ IDNO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第94-175或96-175位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFFR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种BAFF基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化BAFF蛋白包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含至少100、130、150、170、200、210、215、216、217、218个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白胞外区包含SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、6、7、8、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白部分包含SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFF蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：29第1-59位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：37所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化BAFF基因，进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的部分。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码人BAFF蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFF蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFF蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第68-285位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第59-67位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含非人动物BAFF基因的1号至7号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的1号外显子的部分和7号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因还包含编码SEQ ID NO：29第1-59位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：29第1-59位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：36所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物BAFF基因座上，进一步优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFF基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包括人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，进一步优选的，包含人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸，优选的，包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入可能包括破坏非人动物内源BAFF基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源BAFF基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源BAFF基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
进一步优选的，根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能在插入的目的片段后加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源BAFF蛋白不能正常表达。
其中，本发明中所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换。所述相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物BAFF或BAFFR基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换例如用编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列替换编码非人动物BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列，用编码人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列替换编码非人动物BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列。当然也可以相应外显子的替换例如用人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分替换非人动物1号至2号外显子的全部或部分。所述的不相应位置的替换包括外显子位置不相对应或不同功能区的替换，例如用人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分替换非人动物1号至7号外显子的全部或部分。
优选的，所述的人或人源化BAFF基因可操作连接到至少一条染色体上内源BAFF基因的内源调控元件。
所述的人或人源化BAFF基因在非人动物中通过调控元件进行调控。优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人BAFF基因。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物BAFF基因。
优选的，所述的导入的位置位于BAFF基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物BAFF基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物BAFF基因的1号至7号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物BAFF基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分被替换。
优选的，编码SEQ ID NO：29的第60-309位所示氨基酸的的核苷酸序列被替换。
优选的，使用基因编辑技术进行BAFF基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物BAFF基因的编码框，将编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列或者人源化BAFF基因的核苷酸序列插入非人动物BAFF基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物BAFF基因的编码框可以采用敲除非人动物BAFF基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物BAFF蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物BAFF基因的编码框可以为敲除非人动物BAFF基因的1号外显子至7号外显子的全部或部分，优选为敲除1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分。
优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFF基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物BAFF基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：31所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物BAFF基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：32所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物BAFF基因的1号至7号外显子上。
优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向BAFF基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物BAFF基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的BAFF基因上的靶序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于BAFF基因的1号外显子至7号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于BAFF基因位于1号外显子和/或7号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA在BAFF基因上的靶序列如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向BAFF基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得BAFF基因人源化的非人动物。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得BAFF基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将BAFF基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为BAFFR、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种基因。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的BAFFR、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38蛋白中的至少一种。
优选的，所述其他基因为BAFFR基因，所述的BAFFR基因为人源化BAFF基因，所述的人源化BAFFR基因如上述的人源化BAFFR基因。
在一种优选的实施方式中，所述非人动物为BAFF基因和BAFFR基因双基因人源化动物，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFFR蛋白和BAFF蛋白，和/或，所述的非人动物基因组中包含人或人源化BAFFR基因和BAFF基因；优选的，所述人源化BAFFR蛋白为上述人源化BAFFR蛋白；优选的，所述人源化BAFFR基因为上述的人源化BAFFR基因。
本发明的一个优选实施方式，提供了一种包含BAFF基因人源化和BAFFR基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括将上述的构建方法构建的BAFF基因人源化的非人动物或者BAFF基因人源化的非人动物，与上述的构建方法构建的BAFFR基因人源化非人动物或者上述的BAFFR基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到包含BAFF基因人源化和BAFFR基因人源化的非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--BAFF-/-(NRG)小鼠、Rag2-/--BAFF-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十二方面，提供了一种BAFF基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源BAFF蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化BAFF蛋白包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含至少100、130、150、170、200、210、215、216、217、218个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白胞外区包含SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、6、7、8、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白部分包含SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFF蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：29第1-59位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：37所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化BAFF基因，进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的部分。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码人BAFF蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFF蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFF蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第68-285位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第59-67位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含非人动物BAFF基因的1号至7号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的1号外显子的部分和7号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因还包含编码SEQ ID NO：29第1-59位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：29第1-59位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：36所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述人或人源化BAFF基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性BAFF基因的内源调控元件。
优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物BAFF基因座构建：
A)编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFF基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包括人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，进一步优选的，包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸，优选的，包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自BAFFR、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种。
优选的，所述其他基因为BAFFR基因，所述的BAFFR基因为人源化BAFFR基因，所述的人源化BAFFR基因如上述的人源化BAFFR基因。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化BAFF基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFF基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。进一步优选的，包含人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸；进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物BAFF基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：31所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物BAFF基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000074.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：32所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物BAFF基因的1号至7号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：34和/或35。
本发明的第十四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物BAFF基因，其靶位点位于BAFF基因的1号外显子至7号外显子序列上。
优选的，所述sgRNA的靶位点位于BAFF基因的1号外显子和/或7号外显子序列上。
优选的，所述的sgRNA在BAFF基因上的靶序列如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示。
本发明的第十五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ IDNO：40和42，SEQ ID NO：41和43，SEQ ID NO：44和46，SEQ ID NO：45和47。
本发明的第十六方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。
本发明的第十七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第十八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述编码sgRNA的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在BAFF基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十九方面，提供了一种人源化BAFF蛋白，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化BAFF蛋白包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸，例如包含至少100、130、150、170、200、210、215、216、217、218个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白胞外区包含SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸，例如包含至少5、6、7、8、9、10、15、17、19、20、21个连续氨基酸；所述的人源化BAFF蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白部分包含SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的部分，进一步优选为非人动物BAFF蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的全部或部分，优选的，包含SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：29第1-59位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：37所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十方面，提供了一种人源化BAFF基因，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的部分。
优选的，所述的人源化BAFF基因编码上述的人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码人BAFF蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人BAFF蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人BAFF蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人BAFF蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第68-285位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含编码人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码人BAFF蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：30第59-67位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：30第59-285位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、150、160、165、166、167、168、169、170、200、300、400、500、510、517bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从编码跨膜区C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、100、105、106、107、108、109、110、150、200、500、700、900、1000、1500、1600、1653bp的核苷酸序列；优选的，6号外显子的部分包含6号外显子第一个核苷酸至终止密码子或终止密码子前一个核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含非人动物BAFF基因的1号至7号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的1号外显子的部分和7号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因还包含编码SEQ ID NO：29第1-59位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位氨基酸的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：29第1-59位的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：29第1-59位氨基酸的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化BAFF基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：36所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十一方面，提供了一种BAFFR基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源BAFFR基因的1号外显子至3号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分和2号外显子的部分。
本发明的第二十二方面，提供了一种BAFFR基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。
本发明的第二十三方面，提供了一种BAFF基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源BAFF基因的1号外显子至7号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分。
本发明的第二十四方面，提供了一种BAFF基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。
本发明的第二十五方面，提供了一种BAFFR基因缺失的细胞，所述的细胞缺失BAFFR基因的1号外显子至3号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分和2号外显子的部分。
本发明的第二十六方面，提供了一种BAFFR基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行BAFFR基因缺失的细胞的构建。
本发明的第二十七方面，提供了一种BAFF基因缺失的细胞，所述的细胞缺失BAFF基因的1号外显子至7号外显子的全部或部分，优选为1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分。
本发明的第二十八方面，提供了一种BAFF基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行BAFF基因缺失的细胞的构建。
本发明的第二十九方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，包括如下步骤：
I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28或CD38修饰的非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物或八基因以上的人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源基因座的修饰均可以是纯合或杂合的。
本发明的第三十方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化BAFFR蛋白和/或上述的人源化BAFF蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化BAFFR基因和/或上述的人源化BAFF基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第三十一方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化BAFFR蛋白和/或上述的人源化BAFF蛋白。或者，所述的瘤组织的基因组中包含上述的人源化BAFFR基因和/或上述的人源化BAFF基因，或者，所述荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第三十二方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第三十三方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行构建的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第三十四方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第三十五方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第三十六方面，提供了一种BAFFR和/或BAFF基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化BAFFR蛋白和/或人或人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化BAFFR蛋白和/或上述的人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人BAFFR和/或人BAFF基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化BAFFR基因和/或上述的人源化BAFF基因。
本发明的第三十七方面，提供了一种包含上述的人源化BAFFR基因和/或上述的人源化BAFF基因的构建体或者表达上述的人源化BAFFR蛋白和/或上述的人源化BAFF蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。
本发明的第三十八方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第三十九方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
本发明的第四十方面，提供了一种BAFFR基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化BAFFR基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化BAFFR蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFFR基因为上述的人源化BAFFR基因。
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白为上述的人源化BAFFR蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源BAFFR基因座处用人BAFFR基因的基因组片段(优选编码人BAFFR的胞外区和/或跨膜区的全部或部分序列)，和/或，非人动物BAFFR基因的基因组片段(优选编码非人动物BAFFR的胞质区的全部或部分序列)，导入非人动物BAFFR基因的基因组片段以形成经修饰的BAFFR基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源BAFFR基因座处用人源化BAFFR基因导入非人动物BAFFR基因的基因组片段以形成经修饰的BAFFR基因。
所述的经修饰的BAFFR基因编码人源化BAFFR蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的导入非人动物BAFFR基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分和2号外显子的部分被替换。
优选的，所述的经修饰的BAFFR基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第四十一方面，提供了一种BAFF基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化BAFF基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化BAFF蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化BAFF基因为上述的人源化BAFF基因。
优选的，所述的人源化BAFF蛋白为上述的人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源BAFF基因座处用人BAFF基因的基因组片段(优选编码人BAFF的胞外区和/或跨膜区的全部或部分序列)，和/或，非人动物BAFF基因的基因组片段(优选编码非人动物BAFF的胞质区和/或跨膜区的全部或部分序列)，导入非人动物BAFF基因的基因组片段以形成经修饰的BAFF基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源BAFF基因座处用人源化BAFF基因导入非人动物BAFF基因的基因组片段以形成经修饰的BAFF基因。
所述的经修饰的BAFF基因编码人源化BAFF蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物BAFF基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的替换为替换非人动物BAFF基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分。
优选的，所述的经修饰的BAFF基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第四十二方面，提供了包含上述BAFFR和/或BAFF基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
本发明的第四十三方面，提供了一种上述的人源化BAFFR蛋白、上述的人源化BAFF蛋白、上述的人源化BAFFR基因、上述的人源化BAFF基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与BAFFR和/或BAFF相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与BAFFR和/或BAFF相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与BAFFR和/或BAFF相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人BAFFR和/或BAFF信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究BAFFR和/或BAFF基因功能，研究针对人BAFFR和/或BAFF靶位点的药物、药效，研究与BAFFR和/或BAFF相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
优选的，所述的应用包括疾病的治疗和/或诊断方法，或，非疾病的诊断和治疗方法。
本发明的第四十四方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人BAFFR和/或BAFF特异性调节剂的筛选。
本发明的第四十五方面，提供了一种人BAFFR和/或BAFF特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗BAFFR和/或BAFF抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第四十六方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。本发明所述的“炎症”包括感染，所述的感染是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于GVHD(移植物抗宿主病)、克罗恩病、动脉粥样硬化、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“BAFFR基因座”表示BAFFR基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被修饰的BAFFR基因座可以是BAFFR基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化BAFFR蛋白”，包含来源于人BAFFR蛋白的部分。其中，所述的“人BAFFR蛋白”同“人BAFFR蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人BAFFR蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人BAFFR蛋白的部分”，为连续或间隔的5-184个(优选为10-97个)氨基酸序列与人BAFFR蛋白的氨基酸序列一致或与人BAFFR蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化BAFF蛋白”，包含来源于人BAFF蛋白的部分。其中，所述的“人BAFF蛋白”同“人BAFF蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人BAFF蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人BAFF蛋白的部分”，为连续或间隔的5-285个(优选为10-227个)氨基酸序列与人BAFF蛋白的氨基酸序列一致或与人BAFF蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化BAFFR基因”，包含来源于人BAFFR基因的部分。其中，所述的“人BAFFR基因”同“人BAFFR基因的全部”，即其核苷酸序列与人BAFFR基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人BAFFR基因的部分”为连续或间隔的20-4775bp(优选为20-3923bp、20-597bp或20-291bp)个核苷酸序列与人BAFFR核苷酸序列一致或与人BAFFR核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化BAFF基因”，包含来源于人BAFF基因的部分。其中，所述的“人BAFF基因”同“人BAFF基因的全部”，即其核苷酸序列与人BAFF基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人BAFF基因的部分”为连续或间隔的20-40245bp(优选为20-36866bp、20-2576bp或20-681bp)个核苷酸序列与人BAFF核苷酸序列一致或与人BAFF核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人BAFFR基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-169bp个，优选10-136bp个核苷酸序列与人BAFFR基因的1号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化BAFFR基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“BAFFR蛋白”、“BAFF蛋白”，例如“人BAFFR蛋白”、“人BAFF蛋白”、“非人动物BAFFR蛋白”、“非人动物BAFF蛋白”、“人源化BAFFR蛋白”或“人源化BAFF蛋白”，均包含胞外区、胞内区和/或跨膜区。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠BAFFR基因座和人BAFFR基因座对比示意图(非按比例)；
图2：小鼠BAFFR基因人源化改造示意图(非按比例)；
图3：BAFFR基因打靶策略及靶向载体V1设计示意图(非按比例)；
图4：BAFFR基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图5：BAFFR基因打靶策略及靶向载体V2设计示意图(非按比例)；
图6：BAFFR基因人源化小鼠F0代小鼠基因型鉴定结果，其中WT为野生型对照，H2O为水对照；
图7：BAFFR基因人源化小鼠F1代小鼠基因型鉴定结果，其中WT为野生型对照，H2O为水对照；
图8：BAFFR基因人源化小鼠Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；
图9：小鼠BAFF基因座和人BAFF基因座对比示意图(非按比例)；
图10：小鼠BAFF基因人源化改造示意图(非按比例)；
图11：BAFF基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图12：BAFF基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图13：BAFF基因人源化小鼠F1代小鼠基因型鉴定结果，其中M表示Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图14：BAFF基因人源化小鼠F1代小鼠蛋白检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为BAFF人源化杂合子小鼠；
图15：BAFF/BAFFR双人源化小鼠体内BAFF蛋白的ELISA检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为BAFF/BAFFR双人源化纯合子小鼠；
图16：BAFF/BAFFR双人源化小鼠体内白细胞亚型流式细胞术检测结果，其中A、B、C分别为脾脏、淋巴结和血液中白细胞亚型流式细胞术检测结果，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为BAFF/BAFFR双人源化纯合子小鼠。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
EcoRI、BamHI、BgLII酶购自NEB，货号分别为R3101L、R3136L、R0144L；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；
Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody购自Biolegend，货号109228；
Brilliant Violet 605TManti-mouse CD19 Antibody购自Biolegend，货号115541；
FITC anti-mouse CD19 Antibody购自Biolegend，货号115506；
Alexa647anti-mouse CD268(BAFF-R)Antibody购自Biolegend，货号134105；
PE anti-human CD268(BAFF-R)Antibody购自Biolegend，货号316905；
Alexa647Rat IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400418；
FITC Rat Anti-Mouse CD3Antibody购自BD Pharmingen，货号561798；
BioLegend Brilliant Violet 785TManti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100453；
Alexa700anti-mouse CD8a Antibody购自Biolegend，货号100730；
Brilliant Violet 711TManti-mouse NK-1.1Antibody购自Biolegend，货号108745；
BioLegend Brilliant Violet 785TManti-mouse/human CD11b Antibody购自Biolegend，货号101243；
Brilliant Violet 711TManti-mouse CD11c Antibody购自Biolegend，货号117349；
Brilliant Violet 421TManti-mouse F4/80Antibody购自Biolegend，货号123132；
Brilliant Violet 650TManti-mouse Ly-6G Antibody购自Biolegend，货号127641；
PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400112；
Mouse BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit购自R&D，货号MBLYS0；
Human BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit购自R&D，货号DBLYS0B。
实施例1BAFFR基因人源化小鼠
小鼠BAFFR基因(NCBI Gene ID：72049，Primary source：MGI：1919299，UniProtID：Q9D8D0，位于15号染色体NC_000081.7的第82105943至82108581位，基于转录本NM_028075.3及其编码蛋白NP_082351.1(SEQ ID NO：1))和人BAFFR基因(NCBI Gene ID：115650，Primary source：HGNC：17755，UniProt ID：Q96RJ3，位于22号染色体NC_000022.11的第41922032至41926806位，基于转录本NM_052945.4及其编码蛋白NP_443177.1(SEQ IDNO：2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源BAFFR基因座引入编码人BAFFR蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化BAFFR蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠BAFFR基因调节元件的控制下，用编码人BAFFR蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化BAFFR基因座示意图如图2所示，实现对小鼠BAFFR基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V1上含有小鼠BAFFR基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人BAFFR蛋白的核苷酸序列的A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000081.7的第82108514-82112780位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000081.7的第82101425-82105529位核苷酸序列相同；A1片段上包含的人BAFFR序列(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000022.11的第41926177-41926773位核苷酸序列相同。
靶向载体V1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为 其中序列“GATGG”中的最后一个“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列/>中的第一个“T”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为/>
其中序列/>中的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“AACA T”中的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠BAFFR的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，如图4所示，再通过互相交配即可得到BAFFR基因人源化纯合子小鼠。
此外，还可引入CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图5所示的打靶策略，图中显示了靶向载体V2上含有小鼠BAFFR基因上游和下游的同源臂序列，以及人BAFF R核苷酸序列。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000081.7的第82108514-82109399位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000081.7的第82106933-82107989位核苷酸序列相同，人BAFFR核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。sgRNA在BAFFR基因上的示例性靶序列如下所示：
sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：12)：5’-GACCGAGTGCTTCGACCCTCTGG-3’
sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：13)：5’-ACTGATACTGGCGCTGACCCTGG-3’
在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表1)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-BAFFR-1和pT7-BAFFR-2。
表1sgRNA1和sgRNA2序列列表
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：22)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-BAFFR-1和pT7-BAFFR-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的BAFFR基因人源化小鼠品系。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的示例性鉴定结果见图6。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果，经测序进一步验证图中编号为F0-01、F0-02、F0-03、F0-04、F0-05的小鼠为阳性小鼠。PCR引物如表2所示。
表2F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小
/>
其中，引物L-GT-F位置位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，L-GT-R和R-GT-F均位于人BAFFR序列上。
将F0鉴定为阳性的BAFFR基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法(引物序列如表2所示)对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图7，显示编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04、F1-05、F1-06、F1-07、F1-08、F1-09、F1-10、F1-11、F1-12和F1-13的13只小鼠为阳性小鼠。
对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BgLII酶消化基因组，转膜，杂交。A探针位于人片段，具体探针及目的片段的长度见表3。Southern blot检测结果见图8，综合A探针的结果，并经测序验证，编号为F1-04、F1-05、F1-09、F1-10、F1-11、F1-12、F1-13的7只阳性小鼠均无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的BAFFR基因人源化小鼠。
表3具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
BgLII A Probe -- 5.1kb
探针合成引物如下：
A Probe-F(SEQ ID NO：27)：5’-ATGAGGCGAGGGCCCCGGAGCCTGC-3’，
A Probe-R(SEQ ID NO：28)：5’-CGGGGCTCTGCCTGCGCCCTGGCGAT-3’；
将F1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得F2代BAFFR基因人源化纯合子小鼠。
可通过流式细胞术确认阳性小鼠体内人源化BAFFR蛋白的表达情况。具体来说，分别选取6周龄雄性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的BAFFR基因人源化杂合子小鼠(H/+)及纯合子小鼠(H/H)各1只，脱颈安乐死后取脾脏，制备单细胞悬液后，使用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45 Antibody(mCD45)、抗鼠CD268抗体Alexa 647anti-mouse CD268(BAFF-R)Antibody(mCD268)、抗人CD268抗体PE anti-human CD268(BAFF-R)Antibody(hCD268)、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19 Antibody(mCD19)、抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody(mTCRβ)识别染色后进行流式检测，分析脾脏细胞中人源化BAFFR(hBAFFR)阳性细胞或鼠BAFFR(mBAFFR)阳性细胞的百分比。对照选用鼠同型对照抗体(Alexa/>647Rat IgG1,κIsotype CtrlAntibody)和人同型对照抗体(PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody)。
表4脾脏细胞上BAFFR蛋白流式检测结果
结果如表4所示，在野生鼠及杂合子小鼠组别中，在野生鼠和BAFFR基因人源化杂合子小鼠中都可以检测到鼠蛋白，但仅在BAFFR基因人源化杂合子小鼠中检测到人源化蛋白；同时，在野生鼠及纯合子小鼠组别中，仅在野生鼠中检测到鼠蛋白，仅在纯合子小鼠中检测到人源化蛋白，表明本实施例构建的BAFFR人源化小鼠可以成功表达人源化BAFFR蛋白。
实施例2BAFF基因人源化小鼠
小鼠BAFF基因(NCBI Gene ID：24099，Primary source：MGI：1344376，UniProtID：Q9WU72，位于8号染色体NC_000074.7的第10056229至10086000位，基于转录本NM_033622.2及其编码蛋白NP_296371.1(SEQ ID NO：29)和人BAFF基因(NCBI GeneID：10673，Primary source：HGNC：11929，UniProt ID：Q9Y275，位于13号染色体NC_000013.11的第108268240至108308484位，基于转录本NM_006573.5及其编码蛋白NP_006564.1(SEQ IDNO：30))对比示意图如图9所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源BAFF基因座引入编码人BAFF蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化BAFF蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠BAFF基因调节元件的控制下，用编码人BAFF蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化BAFF基因座示意图如图10所示，实现对小鼠BAFF基因的人源化改造。
进一步设计如图11所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠BAFF基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人BAFF蛋白的核苷酸序列的A2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：31)与NCBI登录号为NC_000074.7的第10052020-10057019位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：32)与NCBI登录号为NC_000074.7的第10085439-10089036位核苷酸序列一致性至少为99％，其中第10088139位碱基由G突变为A；A2片段上包含的人BAFF序列(SEQ ID NO：33)与NCBI登录号为NC_000013.11的第108270070-108306935位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与人基因的连接设计为 其中序列“TCTGC”中的最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列/> 中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人基因的连接设计为5’-CTAGAA 其中序列/>中的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TCTCT”中的第一个“T”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠BAFFR的mRNA序列如SEQ ID NO：36所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：37所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等，构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。
引入CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。sgRNA在BAFF基因上的示例性靶序列如下所示：
sgRNA3靶位点(SEQ ID NO：38)：5’-GCTCCATGCGCAGGTTCATCAGG-3’
sgRNA4靶位点(SEQ ID NO：39)：5’-AACGGAGACGACACCTTCTTTGG-3’
表5 sgRNA3和sgRNA4序列列表
在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表5)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-BAFF-3和pT7-BAFF-4。pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA(SEQ ID NO：22)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
将pT7-BAFF-3和pT7-BAFF-4质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA、测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到BAFF基因人源化纯合子小鼠，如图12所示。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，将F0鉴定为阳性的BAFF基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图13，显示编号为F1-01、F1-02、F1-03的3只小鼠为阳性小鼠。F0代及F1代基因型PCR引物如表6所示。
表6 F0代及F1代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小
将F1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得F2代BAFF基因人源化纯合子小鼠。
可通过ELISA方法检测阳性小鼠体内人源化BAFF蛋白的表达情况。具体来说，分别选取7周龄雄性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和本实施例制备的BAFF基因人源化杂合子小鼠(H/+)各3只，脱颈安乐死后取血清，使用Mouse BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISAKit和Human BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit试剂盒检测血清中BAFF蛋白，结果如图14所示。
由图14可知，在野生型小鼠和BAFF基因人源化杂合子小鼠中都可以检测到鼠BAFF蛋白，但仅在BAFF基因人源化杂合子小鼠中检测到人源化BAFF蛋白，表明本实施例构建的BAFF人源化小鼠可以成功表达人源化BAFF蛋白。
实施例3双重人源化或多重人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的BAFFR基因人源化小鼠还可以制备BAFFR/BAFF双基因人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于实施例2中的BAFF基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化BAFFR小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得BAFFR与BAFF基因修饰的双基因修饰的小鼠模型。也可将本方法实施例1得到的BAFFR小鼠纯合子或杂合子与实施例2的BAFF基因的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化BAFFR/BAFF双基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因修饰的纯合子。
同时，还可以利用上述方法制得的BAFFR基因人源化小鼠、BAFF基因人源化小鼠、或BAFFR/BAFF双基因修饰人源化小鼠制备双人源化或多人源化小鼠模型，修饰的小鼠基因可选择PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28、CD38等其它基因。利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人BAFFR和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以BAFF/BAFFR双人源化小鼠为例，因为BAFF基因位于小鼠8号染色体，BAFFR基因位于小鼠15号染色体，将实施例1制备的BAFFR基因人源化小鼠与实施例2制备的BAFF基因人源化小鼠相互交配获得BAFF/BAFFR双人源化小鼠。
通过常规方法例如流式细胞术检测小鼠体内BAFFR蛋白的表达情况。具体来说，分别选取7周龄C57BL/6野生型雌性小鼠(+/+)和BAFF/BAFFR双人源化雌性纯合小鼠(H/H)各3只，脱颈安乐死后取脾脏、淋巴结和血液，制备单细胞悬液后，使用抗鼠CD45抗体BrilliantViolet 510TManti-mouse CD45 Antibody(mCD45)、抗鼠CD19抗体Brilliant Violet605TManti-mouse CD19 Antibody(mCD19)、抗鼠BAFFR抗体Alexa 647anti-mouseCD268Antibody(mBAFFR)、抗人BAFFR抗体PE anti-human CD268 Antibody(hBAFFR)识别染色后进行流式检测，结果如表7所示。在C57BL/6野生型小鼠体内仅检测出鼠BAFFR蛋白，在BAFF/BAFFR双人源化小鼠体内仅检测出人源化BAFFR蛋白。
表7 小鼠体内BAFFR人源化蛋白流式检测结果
通过ELISA方法检测小鼠体内BAFF蛋白的表达情况。分别选取7周龄C57BL/6野生型雌性小鼠(+/+)和BAFF/BAFFR双人源化雌性纯合小鼠(H/H)各3只，取血清，分别使用鼠BAFF检测试剂盒Mouse BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit和人BAFF检测试剂盒Human BAFF/BLyS/TNFSF13B Quantikine ELISA Kit的操作说明进行检测。结果如图15所示，在C57BL/6野生型小鼠体内仅检测到鼠BAFF蛋白(图15A)，在BAFF/BAFFR双人源化小鼠体内仅检测到人BAFF蛋白(图15B)。
上述结果表明，本实施例制备的BAFF/BAFFR双人源化小鼠可成功表达人BAFF蛋白和人源化BAFFR蛋白。
进一步地，通过流式细胞术检测小鼠体内白细胞亚群的分布与发育情况。分别选取7周龄C57BL/6野生型雌性小鼠(+/+)和BAFF/BAFFR双人源化雌性纯合小鼠(H/H)各3只，脱颈安乐死后取脾脏、胸腺和血液，使用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510TManti-mouseCD45 Antibody(mCD45)、抗鼠CD19抗体Brilliant Violet 605TManti-mouse CD19Antibody(mCD19)、抗鼠CD3抗体FITC Rat Anti-Mouse CD3Antibody(mCD3)、抗鼠CD4抗体BioLegend Brilliant Violet 785TManti-mouse CD4 Antibody(mCD4)、抗鼠CD8抗体Alexa700anti-mouse CD8a Antibody(mCD8)、抗鼠NK1.1抗体Brilliant Violet711TManti-mouse NK-1.1Antibody(mNK1.1)、抗鼠Ly-6G抗体BrilliantViolet 650TManti-mouse Ly-6G Antibody(mLy6G)、抗鼠CD11b抗体BioLegend Brilliant Violet 785TManti-mouse/human CD11b Antibody(mCD11b)、抗鼠CD11c抗体Brilliant Violet 711TManti-mouse CD11c Antibody(mCD11c)、抗鼠F4/80抗体Brilliant Violet 421TManti-mouse F4/80Antibody(mF4/80)、抗人BAFFR抗体PE anti-human CD268Antibody(hBAFFR)、抗鼠BAFFR抗体Alexa/>647anti-mouse CD268 Antibody(mBAFFR)识别染色后进行流式检测。
其中，T细胞特征为mCD45+mCD3+，CD4+T细胞的特征为mCD45+mCD3+mCD4+，CD8+T细胞的特征为mCD45+mCD3+mCD8+，B细胞的特征为mCD45+mCD19+，NK细胞的特征为mCD45+mCD3-mNK1.1+，中性粒细胞的特征为mCD45+mLy6G+mCD11b+，树突细胞的特征为mCD45+mLy6G-mCD11c+，单核细胞的特征为mCD45+mLy6G-mCD11b+mF4/80-，巨噬细胞的特征为mCD45+mLy6G-mCD11b+mF4/80+。
检测结果如图16所示，BAFF/BAFFR双人源化小鼠体内T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致。结果表明，BAFF基因和BAFFR基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞亚型的发育及分布。
实施例4人源化小鼠体内药效验证
利用本方法制得的BAFF人源化小鼠、BAFFR人源化小鼠或BAFFR/BAFF双基因人源化小鼠可以用于评估靶向人BAFF和/或人BAFFR药物(包括抗体)的安全性和药效。例如，通过诱导或通过人源化小鼠自发获得系统性红斑狼疮作为治疗组，并设置对照组，定期测量外周血中系统性红斑狼疮相关检测指标，可通过比较相关指标的变化有效评估药物的体内安全性和有效性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (26)

1.一种BAFFR基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFFR蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化BAFFR基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的部分，优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区的全部或部分，更优选的，包含人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分，进一步优选的，包含人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸；更优选的，包含SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，
优选的，所述的人BAFFR蛋白部分包含SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的部分，优选为非人动物BAFFR蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的部分，优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化BAFFR基因包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的部分，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分、2号外显子的部分和3号外显子的全部。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFFR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物BAFFR基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFFR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人BAFFR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-97或1-99位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFFR基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包括人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包括人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化BAFFR基因可操作连接到至少一条染色体上内源BAFFR基因的内源调控元件。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物BAFFR基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分和2号外显子的部分被替换。
10.根据权利要求1-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将BAFFR基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自BAFF、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种，
优选的，所述人或人源化BAFFR基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为BAFF基因，所述的BAFF基因为人源化BAFF基因，优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
12.一种人源化BAFFR蛋白，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的部分。
13.根据权利要求12所述的人源化BAFFR蛋白，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化BAFFR蛋白包含人BAFFR蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人BAFFR蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更优选的，包含SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-78位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含人BAFFR蛋白的跨膜区的全部或部分，进一步优选的，包含人BAFFR蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸；更优选的，包含SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第79-97或79-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
14.根据权利要求12-13任一所述的人源化BAFFR蛋白，其特征在于，所述的人BAFFR蛋白部分包含SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-97或1-99位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，
优选的，所述的人源化BAFFR蛋白还包含非人动物BAFFR蛋白的部分，优选为非人动物BAFFR蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第94-175或96-175位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
15.根据权利要求12-14任一所述的人源化BAFFR蛋白，其特征在于，所述的人源化BAFFR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
16.一种人源化BAFFR基因，其特征在于，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的部分，优选的，所述的人源化BAFFR基因包含编码权利要求12-15任一所述的人源化BAFFR蛋白的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的人源化BAFFR基因，其特征在于，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含人BAFFR基因的1号至2号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化BAFFR基因包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，
优选的，所述的人源化BAFFR基因还包含非人动物BAFFR基因的部分，进一步优选的，所述的人源化BAFFR基因包含非人动物BAFFR基因的1号外显子的部分、2号外显子的部分和3号外显子的全部。
18.根据权利要求16-17任一所述的人源化BAFFR基因，其特征在于，所述的人源化BAFFR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
19.一种BAFF基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化BAFF蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化BAFF基因。
20.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的部分，优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFF蛋白包含人BAFF蛋白的胞外区的全部或部分，更优选的，包含人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第68-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含人BAFF蛋白的跨膜区的全部或部分，进一步优选的，包含人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸；更优选的，包含SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-67位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，
优选的，所述的人BAFF蛋白部分包含SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：30第59-285位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，
优选的，所述的人源化BAFF蛋白还包含非人动物BAFF蛋白的部分，优选为非人动物BAFF蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ IDNO：29第1-59位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：29第1-59位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，
更优选的，人源化BAFF蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：37；或者包含与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
21.根据权利要求19-20任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的部分，优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化BAFF基因包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，
优选的，所述的人源化BAFF基因还包含非人动物BAFF基因的部分，进一步优选的，所述的人源化BAFF基因包含非人动物BAFF基因的1号外显子的部分和7号外显子的部分，
优选的，所述的人源化BAFF基因的核苷酸序列转录的mRNA为SEQ ID NO：36所示核苷酸序列；或者，与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，与SEQ ID NO：36所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，具有SEQ IDNO：36所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
22.根据权利要求19-21任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物BAFF基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化BAFF蛋白的核苷酸序列；
B)编码人BAFF蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人BAFF蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含人BAFF蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人BAFF蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：30第59-285位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化BAFF基因的核苷酸序列；或，
D)人BAFF基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包括人BAFF基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，优选的，包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列，
优选的，所述的导入非人动物BAFF基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物BAFF基因的1号至7号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物BAFF基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分被替换，
更优选的，所述人或人源化BAFF基因可操作连接到至少一条染色体上内源BAFF基因的内源调控元件。
23.根据权利要求19-22任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将BAFF基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自BAFFR、PD-1、PD-L1、LAG3、4-1BB、CD40、CTLA4、BCMA、IL6R、IL17、CD3、CD28和CD38中的至少一种，
优选的，所述人或人源化BAFF基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的，
优选的，所述其他基因为BAFFR基因，所述的BAFFR基因为人源化BAFFR基因，所述的人源化BAFFR基因如权利要求16-18任一所述的人源化BAFFR基因。
24.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求16-18任一所述的人源化BAFFR基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达权利要求12-15任一所述的人源化BAFFR蛋白，或者，权利要求1-11和19-23任一所述的构建方法获得的非人动物，优选的，所述的组织包括荷瘤后的瘤组织。
25.一种权利要求12-15任一所述的人源化BAFFR蛋白、权利要求16-18任一所述的人源化BAFFR基因或权利要求1-11和19-23任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求24所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与BAFFR和/或BAFF相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与BAFFR和/或BAFF相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与BAFFR和/或BAFF相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人BAFFR和/或BAFF信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究BAFFR和/或BAFF基因功能，研究针对人BAFFR和/或BAFF靶位点的药物、药效，研究与BAFFR和/或BAFF相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
26.权利要求1-10和19-23任一所述的构建方法、权利要求14-15任一所述的人源化BAFFR蛋白或权利要求17-18任一所述的人源化BAFFR基因，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
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