CN115786354A - Tgfb1、garp和/或lrrc33基因人源化非人动物的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TGFB1、GARP和/或LRRC33基因人源化的非人动物，及其构建方法和在生物医药领域的应用。本发明还公开了一种TGFB1或LRRC33基因的靶向载体。本发明所述的非人动物可以表达人或人源化TGFB1蛋白，人或人源化GARP蛋白，和/或，人或人源化LRRC33蛋白；可以作为人TGFB1、GARP和/或LRRC33信号机理研究、神经性疾病、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

TGFB1、GARP和/或LRRC33基因人源化非人动物的构建方法及 应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种TGFB1、GARP和/或LRRC33基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

TGF-β(转化生长因子β)属于TGF-β超家族，是一种多功能的多肽类细胞因子，几乎体内所有细胞都能产生TGF-β并存在其受体，具有调控细胞生长、调节细胞表型、抑制多种免疫细胞(如造血干细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等)增殖及功能等作用，是免疫耐受的主要细胞因子。研究表明，肿瘤细胞分泌的TGF-β会通过刺激细胞外基质增加及组织纤维化来破坏集体免疫及炎症功能，刺激肿瘤组织血管生成，促进EMT过程，加速肿瘤转移过程，增加肿瘤细胞存活率。TGF-β表达的升高与肿瘤生长和较差的预后效果相关，是抗肿瘤免疫的一个关键可溶性免疫检查点。

LRRC33属于LRR家族，是TLR家族的同源成员，在细胞膜和内质网膜上都有分布，在动物体内广泛表达，尤其是在骨髓、胸腺、肝脏、肺、肠和脾脏中高表达。LRRC33能够与多个TLR相互作用，并抑制TLRs(Toll样受体)介导的先天免疫反应，是免疫抑制的重要参与者，在控制机体先天免疫平衡中发挥重要作用。人类LRRC33与鼠LRRC33具有约80％的同源性。

调节性T细胞(Treg)是诱导免疫耐受性的主要细胞，所述免疫耐受性在癌症患者的肿瘤区域中观察到。即，在癌症患者中，使本质上作用于杀死肿瘤的免疫细胞群通过肿瘤中的活化Treg而成为免疫抑制状态，并且这导致肿瘤的恶性进展。

GARP，又称LRRC32，是I型跨膜蛋白，其胞外区与TGF-β结合后会介导TGF-β的活化，在Treg、肿瘤细胞和血小板上高表达。人鼠同源性80％。

研究发现，LRRC33在小神经胶质细胞中调控TGF-β的自分泌信号通路激活，从而防止小胶质细胞过度激活，维持中枢神经系统的稳态。失去LRRC33的小胶质细胞TGF-β无活性，小胶质细胞过度激活，引起轴突细胞脱髓鞘，从而造成神经退行性疾病。肿瘤细胞上GARP的高表达可以激活肿瘤微环境中的TGF-β信号，促进肿瘤细胞的浸润和转移；还可以上调肿瘤微环境中Treg活性，引起肿瘤免疫耐受。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好地反映人体的真实状况。特别是对以TGFB1、GARP和/或LRRC33为治疗靶点的人源化抗体或全人抗体药物的开发而言，由于人和动物的种属差异，很多抗体药物很难同时识别人和动物的表位，难以在动物体内成功评价抗体的药理药效，阻碍药物的研发，因而在动物体内建立更接近人类生理或疾病特征的动物模型是生物医药行业的迫切需求。

鉴于TGFB1、GARP和/或LRRC33在肿瘤、炎症、神经性疾病等领域发挥着重要的作用，且功能互相关联，为进一步研究其相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域亟需开发涉及TGFB1、GARP和/或LRRC33信号通路的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种人源化TGFB1蛋白，所述的人源化TGFB1蛋白包含人TGFB1蛋白的全部或部分。优选的，所述的人源化TGFB1蛋白包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1蛋白包含人TGFB1蛋白的至少50个到至少390个，例如50、80、100、150、180、200、220、250、300、350、380、390个连续氨基酸。

优选的，所述人TGFB1蛋白的部分至少包含人TGFB1蛋白的成熟肽，例如：SEQ IDNO：2的第279-390位，更优选的，所述人TGFB1蛋白还可以包含潜伏期相关肽(Latency-associated peptide，LAP)和/或信号肽。

优选的，所述的人源化TGFB1蛋白还包括非人动物TGFB1蛋白的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

所述的人源化TGFB1蛋白由人源化TGFB1基因编码。

本发明的第二方面，提供了一种人源化TGFB1基因，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的部分。

优选的，所述的人源化TGFB1基因编码上述的人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，例如至少包含6号外显子的部分和7号外显子的部分。更优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子。其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、350、351、352、353、354、355、360、400、500、700、900、1000、1100、1200、1233bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、155、156、157、158、159、160、200、300、400、500、600、700、750、800、850、888bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的人源化TGFB1基因可以包含人TGFB1基因的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的起始密码子到终止密码子的核苷酸序列(例如基因组DNA序列、CDS序列或cDNA序列)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1基因包含编码人TGFB1蛋白的全部或部分的核苷酸序列。优选的，包含编码人TGFB1蛋白的至少50个到至少390个，例如50、80、100、150、180、200、220、250、300、350、380、390个连续氨基酸的核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人源化TGFB1基因包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1基因还包含非人动物TGFB1基因的全部或部分。优选包含非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分，更优选包含1号外显子的全部或部分和/或7号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含非人动物TGFB1基因的5’UTR和/或3’UTR。

优选的，所述的人源化TGFB1基因还包括SEQ ID NO：6和/或7所示核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1基因还包括SEQ ID NO：20、21和/或22所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)具有SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，所述的人源化TGFB1基因还包含编码连接肽P2A的核苷酸序列，所述连接肽P2A连接人基因序列和非人动物基因序列。进一步优选编码P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含STOP序列如SEQID NO：19所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含非人动物5’UTR、人TGFB1基因的部分(例如SEQ ID NO：5或18)和3’UTR。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含连接肽P2A、人TGFB1基因的部分(例如SEQ ID NO：5或18)、转录终止序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFB1基因包含非人动物TGFB1基因的1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的部分、连接肽P2A、人TGFB1基因的部分(例如SEQID NO：5或18)、转录终止序列和非人动物TGFB1基因的4号至7号外显子。

任选的，所述的人源化TGFB1基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子或猴子；更优选为小鼠或大鼠。

在一种优选的实施方式中，所述非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

A)编码上述人源化TGFB1蛋白的核苷酸序列；

B)上述人源化TGFB1基因的核苷酸序列；或，

C)人TGFB1基因的部分，优选包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，例如至少包含6号外显子的部分和7号外显子的部分。更进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、350、351、352、353、354、355、360、400、500、700、900、1000、1100、1200、1233bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、155、156、157、158、159、160、200、300、400、500、600、700、750、800、850、888bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。优选的，可以包含人TGFB1基因的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含人TGFB1基因的起始密码子到终止密码子的核苷酸序列(例如基因组DNA序列、CDS序列或cDNA序列)。

进一步优选的，包含SEQ ID NO：5或18所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

D)编码人TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的A)-D)的任一核苷酸序列为供体DNA序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物TGFB1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3、15、24或72所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物TGFB1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4、16或25所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子上，优选位于非人动物TGFB1基因的2号至3号外显子，或者，位于非人动物TGFB1基因的1号外显子至7号外显子上。

优选的，所述的靶向载体包含从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。

优选的，所述的靶向载体包含从5’端到3’端依次包括5’同源臂、编码连接肽P2A的核苷酸序列、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、辅助序列、3’同源臂。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。优选所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更优选所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为潮霉素编码序列HygR。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向设置于抗性基因的两侧。

在一个具体的实施方式中，所述的靶向载体还包含抗性基因的连接序列SEQ IDNO：6和/或7；在另一个具体的实施方式中，所述的靶向载体包含抗性基因的连接序列SEQID NO：21和/或22。

在一个具体实施方式中，所述的靶向载体还包含连接序列SEQ ID NO：20。

本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物TGFB1基因，其靶位点位于TGFB1基因的2号外显子和/或3号内含子。

优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：26或27所示。

优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：74或75所示。

本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。

本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在TGFB1基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第九方面，提供了一种TGFB1基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源TGFB1蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物基因组中包含人TGFB1基因的部分，更优选包含上述的人源化TGFB1基因。

优选的，所述人或人源化TGFB1基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性TGFB1基因座处的内源调控元件。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自LRRC33、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化TGFB1基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化TGFB1基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的TGFB1基因人源化的非人动物还经GARP基因修饰。所述GARP基因为人源化GARP基因，优选包含人GARP基因的部分。

优选的，所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分，优选的，包含人GARP基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GARP基因包含SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化GARP基因包含编码人GARP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化GARP基因包含编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的TGFB1基因人源化的非人动物还经LRRC33基因修饰，所述的LRRC33基因为人源化LRRC33基因。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分。优选还包含1-2号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列的全部或部分，其中，所述的人源化LRRC33基因包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的TGFB1基因人源化的非人动物还可以经上述人源化LRRC33基因和人源化GARP基因修饰。

本发明中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子或猴子；更优选为小鼠或大鼠。

优选的，所述非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十方面，提供了一种TGFB1基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化TGFB1蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人TGFB1基因的部分或人源化TGFB1基因；

优选的，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的部分。

优选的，所述的非人动物的内源TGFB1蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化TGFB1基因，更优选包含上述的人源化TGFB1基因。

优选的，所述的非人动物为上述的TGFB1基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分。优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，例如至少包含6号外显子的部分和7号外显子的部分。更进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子，更优选的包含1-7号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、350、351、352、353、354、355、360、400、500、700、900、1000、1100、1200、1233bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、155、156、157、158、159、160、200、300、400、500、600、700、750、800、850、888bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人TGFB1基因的基因组DNA序列、CDS或cDNA序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人TGFB1基因的起始密码子到终止密码子。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物TGFB1基因座：

A)编码上述人源化TGFB1蛋白的核苷酸序列；

B)上述人源化TGFB1基因的核苷酸序列；或，

C)人TGFB1基因的部分，优选包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，例如至少包含6号外显子的部分和7号外显子的部分。更进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、350、351、352、353、354、355、360、400、500、700、900、1000、1100、1200、1233bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸为止，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、155、156、157、158、159、160、200、300、400、500、600、700、750、800、850、888bp的核苷酸序列；优选的，7号外显子的部分包含从7号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。优选的，可以包含人TGFB1基因的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的基因组DNA序列、cDNA序列或CDS序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含人TGFB1基因的起始密码子到终止密码子的核苷酸序列。

进一步优选的，包含SEQ ID NO：5或18所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

D)编码人TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。优选的，所述的A)-D)任一核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。

优选的，所述的A)-D)任一核苷酸序列为供体DNA序列。

在一种优选的实施方式中，所述构建方法包括用从5’-3’包含编码P2A的核苷酸序列、人TGFB1基因的部分、小鼠3’UTR和STOP序列导入非人动物TGFB1基因座，其中，所述人TGFB1基因的部分为包含SEQ ID NO：18或编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列，所述的编码P2A的核苷酸序列为包含SEQ ID NO：17所示核苷酸序列，所述的STOP序列为包含SEQID NO：19所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人TGFB1蛋白的cDNA序列导入非人动物TGFB1基因座。优选的，导入的位置位于非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子上，进一步优选的，导入的位置位于非人动物TGFB1基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分，或者，1号外显子的部分至7号外显子的部分。

在一个具体的实施方式中，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:1所示氨基酸的核苷酸序列。

在一个具体的实施方式中，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:1的第131-211位所示氨基酸的核苷酸序列。

在一个具体的实施方式中，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:1的第161-211位所示氨基酸的核苷酸序列。

在另一种优选的实施方式中，所述的导入非人动物TGFB1基因座的导入位置包含非人动物TGFB1基因的非人动物TGFB1基因座中1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子。具体地，所述构建方法包括使用人TGFB1基因序列替换非人动物TGFB1基因座中1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选导入的位置包括编码SEQ ID NO:1的第1-390位所示氨基酸的核苷酸序列；其中，人TGFB1基因序列为包含SEQ ID NO：5或编码SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸序列。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。

所述的插入为在不删除核苷酸的条件下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，或者删除部分核苷酸序列之后将目的片段置于删除位置。根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源TGFB1基因的编码框或破坏插入序列之后的内源TGFB1基因的编码框，随后进行插入操作，或者，所述的插入步骤既可以给内源TGFB1基因造成移码突变又可以实现插入序列的步骤，所述的插入序列包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，进一步优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列。

在本发明的一个具体实施方式中，删除非人动物TGFB1基因的2号至3号外显子或编码SEQ ID NO：1第131-211位或161-211位的核苷酸序列，然后进行插入操作。

所述的替换为相应位置的替换或不相应位置的替换。所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物TGFB1基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。

优选的，所述的非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分被替换，进一步优选起始密码子至终止密码子被替换或编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列被替换。

优选的，所述的人TGFB1基因的部分或人源化TGFB1基因在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。

优选的，所述的调控元件包括但不限于启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物TGFB1基因。所述的外源性调控元件来自人TGFB1基因。

优选的，所述的导入的位置位于TGFB1基因的内源调控元件之后。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列或人或人源化TGFB1基因插入或替换编码非人动物TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人TGFB1基因的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子(2号至3号外显子)的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人TGFB1基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子(2号至3号外显子)的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的基因组DNA序列、CDS序列、cDNA序列插入或替换非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子(2号至3号外显子)的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人TGFB1基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子(2号至3号外显子)的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因编码SEQ ID NO：1或其131-211位或161-211位的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列插入或替换非人动物TGFB1基因编码SEQ ID NO：1或其131-211位或161-211位的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码连接肽P2A的序列、SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列以及辅助序列插入或替换非人动物TGFB1基因编码SEQ ID NO：1或其131-211位或161-211位的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的部分导入非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

所述的经修饰的TGFB1基因编码人或人源化TGFB1蛋白。

所述的经修饰的TGFB1基因的表达受到非人动物内源调控元件的调控。

优选的，使用基因编辑技术进行TGFB1基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物TGFB1基因的编码框，将编码人或人源化TGFB1蛋白的核苷酸序列或者人源化TGFB1基因的核苷酸序列插入非人动物TGFB1基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物TGFB1基因的编码框可以采用敲除非人动物TGFB1基因的全部或部分功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物TGFB1蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物TGFB1基因的编码框可以为敲除非人动物TGFB1基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分核苷酸序列，或者，1号外显子部分至7号外显子部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化TGFB1蛋白的核苷酸序列或者人源化TGFB1基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物TGFB1基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得TGFB1基因人源化的动物模型体内表达人TGFB1蛋白，不表达非人动物TGFB1蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为P2A和/或STOP序列。

优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向TGFB1基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物TGFB1基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的TGFB1基因上的靶序列上。

优选的，所述的sgRNA靶位点位于TGFB1基因的2号外显子和/或3号内含子上。

优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO:26或27所示。

优选的，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO:74或75所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向TGFB1基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得TGFB1基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞导入已分离好的囊胚中，短暂培养后移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得TGFB1基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将TGFB1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为LRRC33、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的LRRC33、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB蛋白中的至少一种。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。

当非人动物为TGFB1和GARP基因修饰时，所述GARP基因为人源化GARP基因。

优选的，所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子，优选的，包含人GARP基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GARP基因包含SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化GARP基因包含编码人GARP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化GARP基因包含编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，人源化GARP基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的人源化TGFB1基因修饰非人动物的构建方法中，非人动物还可经LRRC33基因修饰，所述的LRRC33基因为人源化LRRC33基因。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分。优选还包含1-2号内含子和/或2-3号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列的全部或部分，其中，所述的人源化LRRC33基因包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因转录的mRNA包含SEQID NO：40所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：40所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的人源化TGFB1基因修饰非人动物得构建方法中，非人动物还可以经上述人源化LRRC33基因和人源化GARP基因修饰。

本发明的第十一方面，提供了一种TGFB1基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源TGFB1基因的2号外显子和/或3号外显子的全部或部分，或者，1号外显子部分、2-6号外显子全部和7号外显子部分。

本发明的第十二方面，提供了一种TGFB1基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。

本发明的第十三方面，提供了一种TGFB1基因缺失的细胞，所述的细胞缺失内源TGFB1基因的2号外显子和/或3号外显子的全部或部分，或者，1号外显子部分、2-6号外显子全部和7号外显子部分。

本发明的第十四方面，提供了一种TGFB1基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行细胞的制备。

本发明的第十五方面，提供了一种人源化LRRC33蛋白，所述的人源化LRRC33蛋白包含人LRRC33蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化LRRC33蛋白包含人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33蛋白包含人LRRC33蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少200个氨基酸的人LRRC33蛋白胞外区，例如包含至少200、300、400、500、600、630、631、632个氨基酸的人LRRC33蛋白胞外区；所述的人源化LRRC33蛋白胞外区包含SEQ ID NO：34第19-650位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：34第19-650位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：34第19-650位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：34第19-650位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33蛋白还包含人LRRC33蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含至少10个氨基酸的人LRRC33蛋白跨膜区，例如包含至少10、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸的人LRRC33蛋白跨膜区；所述的人源化LRRC33蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：34第651-671位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：34第651-671位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：34第651-671位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：34第651-671位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33蛋白还包含人LRRC33蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少10个氨基酸的人LRRC33蛋白胞质区，例如包含至少10、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸的人LRRC33蛋白胞质区；所述的人源化LRRC33蛋白胞质区包含SEQ ID NO：34第672-692位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：34第672-692位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：34第672-692位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：34第672-692位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33蛋白还包含人LRRC33蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个氨基酸的人LRRC33蛋白信号肽，例如包含至少5、10、15、16、17、18个氨基酸的人LRRC33蛋白信号肽；所述的人源化LRRC33蛋白信号肽包含SEQ ID NO：34第1-18位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：34第1-18位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：34第1-18位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：34第1-18位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33蛋白还包含非人动物LRRC33蛋白的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：34所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：34所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：34所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：34所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33蛋白由人源化LRRC33基因编码。

本发明的第十六方面，提供了一种人源化LRRC33基因，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的部分。

优选的，所述的人源化LRRC33基因编码上述的人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的全部或部分和/或3号外显子的全部或部分。优选还包含1-2号内含子和/或2-3号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列的全部或部分，其中，所述的人源化LRRC33基因包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因还包含非人动物LRRC33基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分，更优选包含1号外显子的全部，更进一步优选还包含2号外显子的部分和/或3号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因包含非人动物LRRC33基因的5’UTR和/或3’UTR。

优选的，所述的人源化LRRC33基因还包含SEQ ID NO：38和/或39。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因包含非人动物LRRC33基因5’UTR、人LRRC33基因的部分(例如SEQ ID NO：37)和3’UTR。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LRRC33基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：40所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：40所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)具有SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子或猴子；更优选为小鼠或大鼠。

优选的，所述非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十七方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

A)编码人源化LRRC33蛋白的核苷酸序列；

B)编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

C)人源化LRRC33基因的核苷酸序列；或，

D)人LRRC33基因的部分，优选包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分。其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，包含人LRRC33基因的起始密码子到终止密码子。更进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的A)-D)的任一核苷酸序列为供体DNA序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物LRRC33基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：35所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物LRRC33基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：36所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子上，进一步优选位于非人动物LRRC33基因的2号外显子至3号外显子上。

优选的，所述的靶向载体包含从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。

在一个具体的实施方式中，所述的靶向载体还包含抗性基因的连接序列SEQ IDNO：38和/或39。

本发明的第十八方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。

本发明的第十九方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在LRRC33基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第二十方面，提供了一种LRRC33基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源LRRC33蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物基因组中包含人LRRC33基因的部分，更优选包含上述的人源化LRRC33基因。

优选的，所述人或人源化LRRC33基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性LRRC33基因座处的内源调控元件。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自TGFB1、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述LRRC33基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。

根据本发明的一些实施例，所述LRRC33基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。

优选的，所述GARP基因为人源化GARP基因，进一步优选的，所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的部分。

优选的，所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分，优选的，包含人GARP基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GARP基因包含SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化GARP基因包含编码人GARP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化GARP基因包含编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的LRRC33基因人源化的非人动物还可经TGFB1基因修饰，优选所述TGFB1基因为本发明第二方面提供的人源化TGFB1基因。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的LRRC33基因人源化的非人动物还可以经上述人源化TGFB1基因和人源化GARP基因修饰。

本发明中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子或猴子；更优选为小鼠或大鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。优选为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二十一方面，提供了一种LRRC33基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化LRRC33蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因。

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的部分。

优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化LRRC33基因，更优选包含上述的人源化LRRC33基因。

优选的，所述的非人动物为上述的LRRC33基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物的内源LRRC33蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人LRRC33基因的部分包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分。优选还包含1-2号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的人LRRC33基因的部分包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，更优选包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ IDNO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物LRRC33基因座：

A)编码人源化LRRC33蛋白的核苷酸序列；

B)编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

C)人源化LRRC33基因的核苷酸序列；或，

D)人LRRC33基因的部分，优选包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分。其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、105、106、107、108、109、110、120、121bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、500、1000、1500、1700、1900、1950、1970、1971、1972、1973、1974、1975、1980、2000、2253bp的核苷酸序列；优选的，3号外显子的部分包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的A)-D)任一核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。

优选的，所述的A)-D)任一核苷酸序列为供体DNA序列。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人LRRC33蛋白的cDNA序列导入非人动物LRRC33基因座。

在本发明的另一个实施方式中，用包含编码人LRRC33蛋白的基因组编码序列，例如SEQ ID NO：37，导入非人动物LRRC33基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。

所述的插入为在不删除核苷酸的条件下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，或者删除部分核苷酸序列之后将目的片段置于删除位置。根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源LRRC33基因的编码框或破坏插入序列之后的内源LRRC33基因的编码框，随后进行插入操作，或者，所述的插入步骤既可以给内源LRRC33基因造成移码突变又可以实现插入序列的步骤，所述的插入序列包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，进一步优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列。

所述的替换为相应位置的替换或不相应位置的替换。所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物LRRC33基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。

优选的，所述的非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分被替换，进一步优选起始密码子至终止密码子被替换或编码SEQ ID NO：33的核苷酸序列被替换。

优选的，所述的人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因在非人动物中通过调控元件进行调控。所述的调控元件可以是内源或者外源的。其中，所述的内源调控元件来自非人动物LRRC33基因。所述的外源性调控元件来自人LRRC33基因。

优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。

优选的，所述的导入的位置位于LRRC33基因的内源调控元件之后。

优选的，导入的位置位于非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子上，进一步优选的，导入的位置位于非人动物LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分。

优选的，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:33所示氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化LRRC33蛋白的全部或部分核苷酸序列或人或人源化LRRC33基因插入或替换编码非人动物LRRC33蛋白的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人LRRC33蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物LRRC33蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人LRRC33蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物LRRC33蛋白的胞外区全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的基因组DNA序列、CDS序列、cDNA核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子(优选2号至3号外显子)的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的2号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的2号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的2号外显子的全部或部分和/或3号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的2号外显子的全部或部分和/或3号外显子的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人LRRC33基因的起始密码子到终止密码子的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的起始密码子到终止密码子的全部或部分的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的编码SEQ ID NO：33的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列插入或替换非人动物LRRC33基因的编码SEQ ID NO：33的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源LRRC33基因座处用人LRRC33基因的部分导入非人动物LRRC33基因的基因组片段以形成经修饰的LRRC33基因。

所述的经修饰的LRRC33基因编码人或人源化LRRC33蛋白。

所述的经修饰的LRRC33基因的表达受到非人动物内源调控元件的调控。

优选的，使用基因编辑技术进行LRRC33基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物LRRC33基因的编码框，将编码人或人源化LRRC33蛋白的核苷酸序列或者人源化LRRC33基因的核苷酸序列插入非人动物LRRC33基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物LRRC33基因的编码框可以采用敲除非人动物LRRC33基因的全部或部分功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物LRRC33蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物LRRC33基因的编码框可以为敲除非人动物LRRC33基因的2号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化LRRC33蛋白的核苷酸序列或者人源化LRRC33基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物LRRC33基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得LRRC33基因人源化的动物模型体内表达人LRRC33蛋白，不表达非人动物LRRC33蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或STOP序列。

优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至已分离好的囊胚中，短暂培养后转移至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得LRRC33基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将LRRC33基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为TGFB1、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种基因修饰的非人动物。优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的TGFB1、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB蛋白中的至少一种。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。

当非人动物经LRRC33和GARP基因人源化修饰后，所述GARP基因为人源化GARP基因。

优选的，所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分，优选还包含2-3号内含子，优选的，包含人GARP基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化GARP基因包含SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化GARP基因包含编码人GARP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化GARP基因包含编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，人源化GARP基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的LRRC33基因人源化的非人动物的构建方法中，所述非人动物还可经TGFB1基因修饰，优选所述TGFB1基因为本发明第二方面提供的人源化TGFB1基因。

在一种优选的实施方式中，本发明提供的LRRC33基因人源化的非人动物的构建方法中，所述非人动物还可以经上述人源化TGFB1基因和人源化GARP基因修饰。

本发明的第二十二方面，提供了一种LRRC33基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源LRRC33基因的2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分。

本发明的第二十三方面，提供了一种LRRC33基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行非人动物的制备。

本发明的第二十四方面，提供了一种LRRC33基因缺失的细胞，所述的细胞缺失内源LRRC33基因的2号外显子的全部或部分至3号外显子的全部或部分。

本发明的第二十五方面，提供了一种LRRC33基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行细胞的制备。

本发明的第二十六方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，所述的多基因修饰包括多基因人源化，优选的，所述的多基因修饰非人动物表达人源化TGFB1、LRRC33或GARP蛋白中的两种及以上。

优选的，所述的构建方法包括：将非人动物之间进行交配或体外授精；或者非人动物进行基因编辑获得多基因修饰非人动物。

优选的，所述的人源化TGFB1蛋白选自上述的人源化TGFB1蛋白。优选的，所述的人源化LRRC33蛋白选自上述的人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的人源化GARP蛋白包括由人GARP基因2号至3号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化GARP蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：65所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：65所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：65所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：65所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第二十七方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：

(一)提供上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

本发明的第二十八方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化TGFB1蛋白、上述人源化GARP蛋白和/或上述的人源化LRRC33蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化TGFB1基因、上述人源化GARP基因和/或上述的人源化LRRC33基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十九方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化TGFB1蛋白、上述人源化GARP蛋白和/或上述的人源化LRRC33蛋白。或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第三十方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第三十一方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第三十二方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第三十三方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、神经性疾病、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明的第三十四方面，提供了一种TGFB1、GARP蛋白和/或LRRC33基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化TGFB1、人源化GARP和/或LRRC33蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化TGFB1蛋白和/或上述的人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人TGFB1和/或LRRC33基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化TGFB1基因和/或上述的人源化LRRC33基因。

本发明的第三十五方面，提供了一种包含上述的人源化TGFB1基因和/或上述的人源化LRRC33基因的构建体或者表达上述的人源化TGFB1蛋白和/或上述的人源化LRRC33蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。

本发明的第三十六方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第三十七方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第三十八方面，提供了一种TGFB1基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人TGFB1基因的部分或人源化TGFB1基因，和/或，包含编码人或人源化TGFB1蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化TGFB1基因为上述的人源化TGFB1基因。

优选的，所述的人源化TGFB1蛋白为上述的人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的全部或部分基因组片段、CDS序列或cDNA，导入非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分导入非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分(优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子)导入非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的1号至7号外显子的编码区核苷酸序列导入非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

所述的经修饰的TGFB1基因编码人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TGFB1基因座处用人TGFB1基因的全部或部分基因组片段、CDS序列或cDNA置换非人动物TGFB1基因的基因组片段以形成经修饰的TGFB1基因。

所述的全部或部分人TGFB1基因的基因组片段、CDS序列或cDNA包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的编码区、CDS序列或cDNA，或者1号至7号外显子的基因组片段。

所述的被置换的非人动物TGFB1基因的基因组片段包含非人动物TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分。

所述的被置换的非人动物TGFB1基因的基因组片段包含非人动物TGFB1基因的2号至3号外显子的全部或部分。

所述的经修饰的TGFB1基因编码人源化TGFB1蛋白。

优选的，所述的经修饰的TGFB1基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

优选的，所述的基因组中包含人源化的内源TGFB1基因座，在该基因座中，内源TGFB1基因座的区段已被缺失并替换为人TGFB1序列。

优选的，所述的人源化的内源TGFB1基因座包括内源TGFB1启动子，其中，人TGFB1序列可操作地连接到内源TGFB1启动子。

优选的，内源TGFB1基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并替换为人TGFB1序列。

优选的，内源TGFB1基因座的编码SEQ ID NO：1或其第131-211或161-211位的氨基酸序列的核苷酸序列被缺失并替换为人TGFB1序列(优选编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列或SEQ ID NO：5或18)。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第三十九方面，提供了包含上述TGFB1基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。

本发明的第四十方面，提供了一种LRRC33基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因，和/或，包含编码人或人源化LRRC33蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化LRRC33基因为上述的人源化LRRC33基因。

优选的，所述的人源化LRRC33蛋白为上述的人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源LRRC33基因座处用人LRRC33基因的全部或部分基因组片段、CDS序列或cDNA，导入非人动物LRRC33基因的基因组片段以形成经修饰的LRRC33基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源LRRC33基因座处用人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分导入非人动物LRRC33基因的基因组片段以形成经修饰的LRRC33基因。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源LRRC33基因座处用人LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分导入非人动物LRRC33基因的基因组片段以形成经修饰的LRRC33基因。

所述的经修饰的LRRC33基因编码人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的导入为插入或替换。

优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源LRRC33基因座处用人LRRC33基因的全部或部分基因组片段、CDS序列或cDNA置换非人动物LRRC33基因的基因组片段以形成经修饰的LRRC33基因。

所述的全部或部分人LRRC33基因的基因组片段、CDS序列或cDNA包含人LRRC33基因的2号至3号外显子的编码区、CDS序列或cDNA，或者2号至3号外显子的基因组片段。

所述的被置换的非人动物LRRC33基因的基因组片段包含非人动物LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分。

所述的被置换的非人动物LRRC33基因的基因组片段包含非人动物LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分。

所述的经修饰的LRRC33基因编码人源化LRRC33蛋白。

优选的，所述的经修饰的LRRC33基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。

优选的，所述的基因组中包含人源化的内源LRRC33基因座，在该基因座中，内源LRRC33基因座的区段已被缺失并替换为人LRRC33序列。

优选的，所述的人源化的内源LRRC33基因座包括内源LRRC33启动子，其中，人LRRC33序列可操作地连接到内源LRRC33启动子。

优选的，内源LRRC33基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并替换为人LRRC33序列。

优选的，内源LRRC33基因座的编码SEQ ID NO：33的氨基酸序列的核苷酸序列被缺失并替换为人LRRC33序列(优选SEQ ID NO：37)。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第四十一方面，提供了包含上述LRRC33基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。

本发明的第四十二方面，提供了一种上述的人源化TGFB1蛋白、上述的人源化LRRC33蛋白、上述的人源化TGFB1基因、上述的人源化LRRC33基因、上述人源化GARP蛋白、上述人源化GARP基因，上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的模型系统中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人TGFB1、GARP和/或LRRC33信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究TGFB1、GARP和/或LRRC33基因功能，研究针对人TGFB1、GARP和/或LRRC33靶位点的药物、药效，研究与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的神经性疾病药物、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的第四十三方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人TGFB1、GARP和/或LRRC33特异性调节剂的筛选。

本发明的第四十四方面，提供了一种人TGFB1、GARP和/或LRRC33特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植、上述人源化GARP蛋白入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗TGFB1、LRRC33和/或GARP抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法不是治疗方法。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第四十五方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述药物筛选或评价的方法可以为疾病的诊断和治疗目的，也可以为非疾病的诊断和治疗目的。例如该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、斑马鱼、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明所述的“神经性疾病”包括但不限于脑萎缩、老年痴呆症、帕金森综合征、肌肉萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆、路易体痴呆以及多系统萎缩。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“TGFB1基因座”表示TGFB1基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的TGFB1基因座可以是TGFB1基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“人源化TGFB1蛋白”，包含来源于人TGFB1蛋白的部分。其中，所述的“人TGFB1蛋白”同“人TGFB1蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人TGFB1蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人TGFB1蛋白的部分”，为连续或间隔的5-390个(优选为10-390个)，例如5、10、50、100、150、200、250、300、350、390个，氨基酸序列与人TGFB1蛋白的氨基酸序列一致或与人TGFB1蛋白的氨基酸序列具有80％以上同源性。

本发明所述的“人源化TGFB1基因”，包含来源于人TGFB1基因的部分。其中，所述的“人TGFB1基因”同“人TGFB1基因的全部”，即其核苷酸序列与人TGFB1基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人TGFB1基因的部分”为连续或间隔的20bp-23600bp(优选为20bp-21990bp或20bp-2780bp或20bp-2051bp或20bp-1173bp)，例如20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1173、1500、2000、2051、2500、2780、3000、4000、5000、6000、7000、8000、8500、9000、10000、15000、20000、21990、22000、23000、23600bp核苷酸序列与人TGFB1基因核苷酸序列一致或与人TGFB1基因核苷酸序列具有80％以上同源性。

本发明所述的“人源化LRRC33蛋白”，包含来源于人LRRC33蛋白的部分。其中，所述的“人LRRC33蛋白”同“人LRRC33蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人LRRC33蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人LRRC33蛋白的部分”，为连续或间隔的5-692个，例如5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、692个，氨基酸序列与人LRRC33蛋白的氨基酸序列一致或与人LRRC33蛋白的氨基酸序列具有80％以上同源性。

本发明所述的“人源化LRRC33基因”，包含来源于人LRRC33基因的部分。其中，所述的“人LRRC33基因”同“人LRRC33基因的全部”，即其核苷酸序列与人LRRC33基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人LRRC33基因的部分”为连续或间隔的20bp-22311bp(优选为20bp-2556bp或20bp-2274bp或20bp-2079bp或20bp-7183bp)，例如20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2079、2274、2500、2556、3000、4000、5000、6000、7000、7183、8000、9000、10000、15000、20000、21000、22000、22311bp核苷酸序列与人LRRC33基因核苷酸序列一致或与人LRRC33基因核苷酸序列具有80％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至7号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“xx号外显子的部分至xxx号外显子的部分”代表xx号外显子的部分、xx-(xx+1)号内含子、xx+1号外显子至xxx-1号外显子的全部、(xxx-1)-xxx号内含子和xxx号外显子的部分。例如所述的“1号外显子的部分至7号外显子的部分”包含1号外显子的部分、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子和7号外显子的部分。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Stopt.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

有益效果：

利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的基因人源化动物模型，使其体内表达人源蛋白，作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。

利用基因人源化动物模型建立各种疾病模型，可以进行抗人抗体药物的药理药效评价。

考虑到TGFB1、GARP和/或LRRC33在信号通路上的功能相互关联，本发明设计出多个基因人源化的技术方案，使得包含上述人源化基因的非人动物能表达出多个人源化或人的相应蛋白，为筛选适合人的试剂提供更为人源化的微环境，从而筛选出的试剂效力更好。

为便于多个人源化基因的表达，本发明优化了导入的人的TGFB1、GARP和/或LRRC33基因的片段选择，以及导入位置的选择，人的TGFB1、GARP和/或LRRC33基因可以无随机插入的导入，并正确表达人源化或人的相应蛋白，可以稳定传代，同时不影响非人动物的其他功能。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠TGFB1基因和人TGFB1基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠TGFB1基因人源化改造示意图一(非按比例)；

图3：小鼠TGFB1基因座人源化改造示意图二(非按比例)；

图4：TGFB1基因打靶策略及靶向载体V1设计示意图(非按比例)；

图5：Southern Blot检测结果，其中WT为野生型对照；

图6：TGFB1基因打靶策略及靶向载体V2设计示意图(非按比例)；

图7：TGFB1基因人源化小鼠FRT重组示意图(非按比例)；

图8：TGFB1基因打靶策略及靶向载体V3设计示意图(非按比例)；

图9：F0代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照；

图10：小鼠LRRC33基因座和人LRRC33基因座对比示意图(非按比例)；

图11：小鼠LRRC33基因座人源化改造示意图(非按比例)；

图12：LRRC33基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图13：Southern Blot检测结果，其中WT为野生型对照；

图14：LRRC33基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图15：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图16：RT-PCR检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为LRRC33基因人源化纯合子小鼠，H₂O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；

图17：Western Blot检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为LRRC33基因人源化纯合子小鼠，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；

图18：小鼠GARP基因座和人GARP基因座对比示意图(非按比例)；

图19：小鼠GARP基因座人源化改造示意图(非按比例)；

图20：GARP基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图21：F0代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照；

图22：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H₂O为水对照；

图23：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

Mfel、BbsI、EcoRI、ScaI、BamHI、StuI、NdeI、AseI酶购自NEB，货号分别为R0589L、R0539L、R0101M、R3122M、R0136L、R0187M、R0111L、R0526M；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Brilliant Violet 421^TManti-mouse CD45购自Biolegend，货号：103134；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain购自Biolegend，货号：109228；

GARP Monoclonal Antibody(YGIC86),PE购自eBioscience^TM，货号：12-9891-80；

PE anti-human GARP(LRRC32)Antibody购自Biolegend，货号：352504；

APC anti-mouse/rat Foxp3购自eBioscience，货号：17-5773-82；

PE Rat IgG2a K Iso Control购自eBioscience，货号：12-4321-42；

PE Rat IgG2b,k isotype Ctrl购自eBioscience，货号：400608；

Anti-LRRC33 antibody,anti-mouse/human，购自Sigma-Aldrich，货号：SAB2103948；

FITCanti-mouseCD41 Antibody购自Biolegend，货号：133903；

APCanti-mouseLAP(TGF-β1)Antibody购自Biolegend，货号：Biolegend；

PEanti-humanLAP(TGF-β1)Antibody购自Biolegend，货号：300004。

实施例1：TGFB1基因人源化小鼠的制备方法一

小鼠TGFB1基因(NCBIGeneID：21803，Primarysource：MGI：98725，UniProt：P04202，位于7号染色体NC_000073.7的第25386406至25404503位，基于转录本NM_011577.2及其编码蛋白NP_035707.1(SEQIDNO：1))和人TGFB1基因(NCBIGeneID：7040，Primarysource：HGNC：11766，UniProtID：P01137，位于19号染色体NC_000019.10的第41330323至41353922位，基于转录本NM_000660.7及其编码蛋白(SEQIDNO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源TGFB1基因座引入编码人TGFB1蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化TGFB1蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠内源TGFB1基因调节元件的控制下，将编码人TGFB1蛋白的核苷酸序列导入小鼠基因序列，例如将人TGFB1编码区基因组DNA序列替换小鼠相应序列，得到人源化TGFB1基因座示意图如图2所示，实现对小鼠TGFB1基因的人源化改造。

根据图2进一步设计如图4所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V1上含有小鼠TGFB1基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人TGFB1蛋白的核苷酸序列的A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25382425至25387293位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25404365至25408463位核苷酸序列相同；A1片段中包含的人TGFB1核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000019.10的第41353044至41331055位核苷酸序列相同。

靶向载体V1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即潮霉素编码序列HygR，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统LoxP重组位点，组成HygR盒1(HygR cassette)。其中，HygR盒1上游与人TGFB1的连接设计为

其中序列“AGAAA”中最后一个的“A”是人TGFB1的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“A”是HygR盒1的第一个核苷酸；HygR盒1下游与人的连接设计为

其中序列

中最后一个“T”是HygR盒1的最后一个核苷酸，序列“GGTAT”中的第一个“G”是人的第一个核苷酸。还在靶向载体V1的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。改造后的人源化小鼠TGFB1的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

采用常规方法进行如酶切连接构建靶向载体，构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术(具体探针及目的片段长度见表1)进行检测确认外源基因的整合情况，示例性Southern Blot检测结果如图5所示，其中编号为1-A04、1-E03、1-G12、1-H03、2-D07和2-F05的细胞为阳性细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，生产获得F0代嵌合鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配获得F2代纯合子鼠。

表1具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				Mfel	HygR Probe	——	12.5kb
Dralll	A Probe	——	28.6kb

其中，PCR测定包括下述引物：

PCR-F：5’-CAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGC-3’(SEQ ID NO：9)，

PCR-R：5’-GCAGAGGCAGGCAGATTTCTGAGTC-3’(SEQ ID NO：10)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

HygR Probe：

HygR Probe-F：5’-TCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGT-3’(SEQ ID NO：11)，

HygR Probe-R：5’-TGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCC-3’(SEQ ID NO：12)；

A Probe：

A Probe-F：5’-CAGCACTCTTAGACGTATACATGATT-3’(SEQ ID NO：13)，

A Probe-R：5’-AGTAAGGATCAAAGGCACAGGCTTTG-3’(SEQ ID NO：14)。

实施例2：TGFB1基因人源化小鼠的制备方法二

为了达到本发明的目的，也可以将包含人TGFB1编码区cDNA的核苷酸序列替换小鼠TGFB1基因2号外显子和3号外显子的部分序列，并通过编码具有连接功能的肽段(例如P2A)的核苷酸序列连接小鼠序列和人的序列，实现对小鼠TGFB1基因的人源化改造，得到人源化TGFB1基因座示意图如图3所示。

根据图3进一步设计了如图6所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V2上含有小鼠TGFB1基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人TGFB1蛋白的核苷酸序列的A2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：15)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25387365至25391836位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：16)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25394223至25397540位核苷酸序列相同；A2片段从5’端到3’端依次包括P2A编码序列(SEQ ID NO：17)、人TGFB1核苷酸序列、小鼠3’UTR及下游序列、STOP序列(SEQ ID NO：19)。其中，人TGFB1基因序列(SEQ ID NO：18)与NCBI登录号为NM_000660.7的第879至2051位核苷酸序列相同；人TGFB1序列下游与小鼠3’UTR直接相连，STOP序列与小鼠的连接设计为

其中序列“TTTCTT”中的最后一个“T”是小鼠的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“G”是STOP序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即潮霉素编码序列HygR，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成HygR盒2(HygR cassette)。其中，HygR盒2上游与STOP序列的连接设计为

其中序列“ACCTA”中最后一个的“A”是STOP序列的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“G”是小鼠序列的第一个核苷酸；HygR盒2下游与小鼠的连接设计为

其中序列“GATCC”中最后一个“C”是HygR盒2的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“G”是小鼠序列的第一个核苷酸。在靶向载体V2的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。改造后的人源化小鼠TGFB1的mRNA序列如SEQ ID NO：23所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern B1ot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到TGFB1基因人源化纯合子小鼠，TGFB1基因人源化小鼠FRT重组如图7所示。

根据图3所示的打靶方案，还可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图8所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V3上含有小鼠TGFB1基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人TGFB1蛋白的核苷酸序列的A3片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：24)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25391146至25391836位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：25)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25394223至25395674位核苷酸序列相同。A3片段与图5中的A2片段序列相似，区别在于不含HygR盒编码序列。改造后的人源化小鼠TGFB1的mRNA序列如SEQ ID NO：23所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续试验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。sgRNA在TGFB1基因上的示例性靶序列如下所示：

sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：26)：5’-ATCAAGTGTGGAGCAACATGTGG-3’

sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：27)：5’-TAGGTGCTTTATGAATAGTGAGG-3’

在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-TGFB1-1和pT7-TGFB1-2。pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA(SEQ ID NO：28)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将获得的表达载体pT7-TGFB1-1和pT7-TGFB1-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的TGFB1基因人源化小鼠品系。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图9。结合PCR引物检测结果，并经测序进一步验证图9中编号为F0-01的小鼠为阳性小鼠。PCR引物如表2所示。

表2 F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

将F0鉴定为阳性的TGFB1基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。将F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，进一步确认所得到的阳性杂合小鼠不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的TGFB1基因人源化小鼠。

通过常规方法例如流式细胞术检测TGFB1基因人源化小鼠体内TGFB1蛋白的表达情况。具体来说，选取14周龄雄性野生型C57BL/6小鼠和TGFB1基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取血细胞，用血小板标记抗体FITC anti-Mouse CD41 antibody(mCD41)、抗鼠LAP抗体APC anti-mouse LAP(TGF-β1)antibody(mTGFB1)、抗人LAP抗体PE anti-human LAP(TGF-β1)antibody(hTGFB1)识别染色后进行流式检测。数据显示，在野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠TGFB1(特征为mCD41+mTGFB1+)阳性细胞的比例为33.5％，人TGFB1(特征为mCD41+hTGFB1+)阳性细胞的比例为0.96％；在TGFB1基因人源化杂合子小鼠体内检测到鼠TGFB1的比例为24.9％，人TGFB1的比例为10.8％。结果表明，本方法制备的TGFB1基因人源化小鼠体内可成功表达人TGFB1蛋白。

另外，与上述方法类似，选取8周龄野生型C57BL/6小鼠和TGFB1基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取外周血，检测外周血中TGFB1蛋白表达情况。数据显示，在野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠TGFB1(特征为mCD41+mTGFB1+)阳性细胞的比例为43.4％，人TGFB1(特征为mCD41+hTGFB1+)阳性细胞的比例为0.48％；在TGFB1基因人源化纯合子小鼠体内检测到鼠TGFB1的比例为0.56％，人TGFB1的比例为70.1％。结果表明，本方法制备的TGFB1基因人源化纯合子小鼠体内可成功表达人TGFB1蛋白。

实施例3：TGFB1基因人源化小鼠的制备方法三

根据图8所示的打靶策略示意图，本发明还提供了另一种制备方法，与靶向载体V3相比，区别在于上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：72)与NCBI登录号为NC_000073.7的第25391146至25391926位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠TGFB1的mRNA序列如SEQID NO：73所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

采用与靶向载体V3相同的方法，确定活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。sgRNA在TGFB1基因上的示例性靶序列如下所示：

sgRNA3靶位点(SEQ ID NO：74)：5’-GAGCACAGTGTCGAAGCCTA AGG-3’

sgRNA4靶位点(SEQ ID NO：75)：5’-TAGGTGCTTTATGAATAGTGAGG-3’

采用与靶向载体V3相同的方法获得目的质粒，对小鼠原核期受精卵进行显微注射后，转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的TGFB1基因人源化小鼠品系。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图21。结合PCR引物检测结果，并经测序进一步验证图21中编号为F0-02的小鼠为阳性小鼠。PCR引物如表3所示。

表3 F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

将F0鉴定为阳性的TGFB1基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图22，显示编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04和F1-05小鼠为阳性小鼠。PCR引物如表4所示:

表4 F1代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小

对PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用Scal酶或Asel酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表5。Southern blot检测结果见图23，综合3’探针和5’探针的结果表明，F1-01、F1-02、F1-03、F1-04和F1-05鼠均无随机插入，这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的TGFB1基因人源化小鼠。

表5具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				Scal	Stop Probe	-	5.0kb
Asel	3’Probe	11.4kb	7.9kb

通过流式细胞术检测TGFB1基因人源化小鼠体内TGFB1蛋白的表达情况。取野生型C57BL/6小鼠和TGFB1基因人源化杂合小鼠的血液组织，用血小板标记抗体FITC anti-Mouse CD41 antibody(mCD41)、抗鼠LAP抗体APC anti-mouse LAP(TGF-β1)antibody(mTGFB1)、抗人LAP抗体PE anti-human LAP(TGF-β1)antibody(hTGFB1)识别染色后进行流式检测，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠TGFB1阳性细胞，在TGFB1基因人源化杂合小鼠体内即检测到鼠TGFB1阳性细胞，也检测到人TGFB1阳性细胞。表明本方法制备的TGFB1基因人源化小鼠体内可成功表达人TGFB1蛋白。

实施例4LRRC33基因人源化小鼠的制备

小鼠LRRC33基因(NCBI Gene ID：224109，Primary source：MGI：2445095，UniProt：Q8BMT4，位于16号染色体NC_000082.7的第31961603至31984412位，基于转录本NM_001347181.1及其编码蛋白NP_001334110.1(SEQ ID NO：33))和人LRRC33基因(NCBIGene ID：375387，Primary source：HGNC：24613，UniProt ID：Q86YC3，位于3号染色体NC_000003.12的第196639694至196662004位，基于转录本NM_198565.3及其编码蛋白NP_940967.1(SEQ ID NO：34))对比示意图如图10所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源LRRC33基因座引入编码人LRRC33蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化LRRC33蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠内源LRRC33基因调节元件的控制下，将编码人LRRC33蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化LRRC33基因座示意图如图11所示，实现对小鼠LRRC33基因的人源化改造。

进一步设计如图12所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠LRRC33基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人LRRC33蛋白的核苷酸序列的A4片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：35)与NCBI登录号为NC_000082.7的第31966479至31972859位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：36)与NCBI登录号为NC_000082.7的第31958276至31961280位核苷酸序列相同；A4片段上包含的人LRRC33基因序列(SEQ ID NO：37)与NCBI登录号为NC_000003.12的第196654540-196661722位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒上游与小鼠基因的连接设计为

其中序列“CAGAC”中的最后一个“C”是小鼠的最后一个核苷酸，序列

中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒下游与小鼠基因的连接设计为

其中序列“GATCC”中的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠LRRC33的mRNA序列如SEQ ID NO：40所示，表达的蛋白序列如SEQ IDNO：34所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用NdeI或AseI或StuI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表6所示)检测，示例性结果如图13所示，经测序进一步验证发现，编号为1-D08、1-D11、1-H02、1-H05、2-D05、2-H01、3-E08和5-G01的8个克隆为阳性克隆且无随机插入。

表6具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				NdeI	5’Probe	16.4kb	9.6kb
AseI	3’Probe	12.2kb	10.0kb
				StuI	Neo Probe	-	11.1kb

其中，PCR测定包括下述引物：

PCR-F1：5’-GTCATGGAAGGTGAGGAGGTTCTTG-3’(SEQ ID NO：41)，

PCR-R1：5’-GCCGACAGATCAGGGTTCAAGG-3’(SEQ ID NO：42)；

PCR-F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：43)，

PCR-R2：5’-GACAATCAGTCACAAAGCCAAAGCTG-3’(SEQ ID NO：44)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’Probe：

5’Probe-F：5’-CTGTGCCCTGTGCTGCAAATG-3’(SEQ ID NO：45)，

5’Probe-R：5’-GACCTAACAGCCTTGGGGCATTC-3’(SEQ ID NO：46)；

3’Probe：

3’Probe-F：5’-GGAATCAATCAAACTAAGGGCCATG-3’(SEQ ID NO：47)，

3’Probe-R：5’-CCTGTGAACATTCACTCAGTACAC-3’(SEQ ID NO：48)；

Neo Probe：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGA-3’(SEQ ID NO：49)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(SEQ ID NO：50)。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图14)后，再通过互相交配即可得到LRRC33基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表7所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图15，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04的4只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的LRRC33基因人源化小鼠。

表7：引物名称及具体序列

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人或人源化LRRC33的表达情况，例如使用RT-PCR或流式细胞术等。具体来说，分别选取8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠和本实施制备的LRRC33基因人源化纯合子各1只，脱颈安乐死后取胸腺组织，采用如表8所示的引物序列进行RT-PCR检测，检测结果如图16所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠胸腺组织中仅检测到鼠LRRC33 mRNA，未检测到人源化LRRC33 mRNA；在LRRC33基因人源化纯合子小鼠胸腺中仅检测到人源化LRRC33mRNA，未检测到鼠LRRC33 mRNA。

表8 RT-PCR引物序列及目的片段大小

进一步使用Western Blot检测小鼠体内LRRC33蛋白的表情况。具体来说，分别选取8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠和本实施制备的LRRC33基因人源化纯合子各1只，脱颈安乐死后取肝(Liver)、肾(Kidney)和肺部(Lung)组织，并使用人鼠LRRC33交叉识别抗体Anti-LRRC33 antibody produced in rabbit(mouse,human)(m/hLRRC33)进行WesternBlot检测，检测结果如图17所示。从图中可以看出，在LRRC33基因人源化纯合子小鼠的肝、肾和肺部组织均检测到LRRC33蛋白的表达。结合图16的RT-PCR检测结果可知，LRRC33基因人源化纯合子小鼠体内可成功表达人LRRC33蛋白。

实施例5GARP基因人源化小鼠的制备

小鼠GARP基因(NCBI Gene ID：434215，Primary source：MGI:93882，UniProt ID：G3XA59，位于7号染色体NC_000073.7的第98138515至98151038位，基于转录本NM_001113379.2及其编码蛋白NP_001106850.1(SEQ ID NO：64))和人GARP基因(NCBI GeneID：2615，Primary source：HGNC：4161，UniProt ID：Q14392，位于11号染色体NC_000011.10的第76,657,524-76,670,747位，基于转录本NM_001128922.2及其编码蛋白NP_001122394.1(SEQ ID NO：65))对比示意图如图18所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源GARP基因座引入编码人GARP蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化GARP蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠内源GARP基因调节元件的控制下，将编码人GARP蛋白的核苷酸序列替换小鼠基因序列，得到人源化GARP基因座示意图如图19所示，实现对小鼠GARP基因的人源化改造。

进一步设计如图20所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠GARP基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人GARP DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：66)与NCBI登录号为NC_000073.7第8138515至98143428位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：67)与NCBI登录号为NC_000073.7第98149214至98151038位核苷酸序列相同；人GARP DNA序列(SEQ ID NO：68)与NCBI登录号为NC_000011.10的第76659604至76665954位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与人的连接设计为

(SEQ IDNO：69)，其中，序列“CTGGCC”的最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列

的第一个“T”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人的连接设计为

内，其中序列“GGATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列

的第一个“C”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了负筛选标记编码基因DTA。改造后的人源化小鼠GARP的mRNA序列如SEQ ID NO：71所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：65所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot检测筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。

可以通过常规方法例如流式细胞术检测GARP基因人源化小鼠体内GARP蛋白的表达情况。具体来说，选取9周龄野生型C57BL/6小鼠和GARP基因人源化杂合子小鼠各1只，取脾脏细胞，用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45抗体(mCD45)、鼠源T细胞表面抗体PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain、GARP单克隆抗体GARP MonoclonalAntibody(YGIC86),PE,eBioscience^TM(mGARP)(以PE大鼠抗体IgG2a K同型对照抗体RatIgG2a kappa Isotype Control(eBR2a),PE,eBioscience^TM(IgG 2a)作参照)，抗人GARP抗体PE anti-human GARP(LRRC32)Antibody(hGARP)(以大鼠抗体Purified Mouse IgG2b,κIsotype Ctrl Antibody(IgG2b)作参照)进行表染，再将表染后的细胞固定和穿膜后，用APC抗鼠抗体APC anti-mouse/rat Foxp3抗体(mFoxp3)再次进行染色标记Treg细胞，最后，将穿膜染色后的细胞进行流式检测，数据显示，在野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠GARP阳性细胞(mCD45+mFoxp3+mGARP+)的比例为27.9％，人GARP阳性细胞(mCD45+mFoxp3+hGARP+)的比例为1.76％；在GARP基因人源化杂合小鼠体内检测到鼠GARP阳性细胞的比例为14.8％，人GARP阳性细胞的比例为24.6％。结果表明，本实施例制备的GARP基因人源化小鼠体内可成功表达人GARP蛋白。杂合子小鼠交配后可获得GARP基因人源化纯合子小鼠。

实施例6双重或多重人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的TGFB1基因人源化小鼠、LRRC33基因人源化小鼠或GARP基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。例如，前述实施例1、实施例2和/或实施例3中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有LRRC33、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40、4-1BB等基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化TGFB1小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得双人源化小鼠模型，例如TGFB1与GARP双基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的TGFB1小鼠纯合子或杂合子与目的修饰基因例如GARP基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化TGFB1与GARP基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因修饰的纯合子。

以TGFB1/GARP双基因人源化小鼠为例。由于小鼠TGFB1基因和GARP基因均处于第7号染色体上，在制备TGFB1人源化小鼠过程中，电穿孔转染时选取实施例5获得GARP基因人源化小鼠的胚胎干细胞，可获得TGFB1/GARP双基因人源化小鼠；或者，显微注射时选取GARP基因人源化小鼠的原核期受精卵，也可获得TGFB1/GARP双基因人源化小鼠。

进一步地，还可在获得的TGFB1/GARP双基因人源化小鼠基础上，分离小鼠胚胎干细胞，进一步对目的基因LRRC33进行人源化改造，获得TGFB1/GARP/LRRC33多基因人员化小鼠模型。也可将本方法得到的TGFB1/GARP双基因修饰小鼠纯合子或杂合子与实施例4制备的LRRC33基因人源化纯合或杂合小鼠交配，获得GFB1/GARP/LRRC33多基因人源化小鼠。

实施例7药效验证

利用上述实施例制备的人源化小鼠模型可以进行靶向人TGFB1、GARP和/或LRRC33基因调节剂的体内药效验证。例如，取TGFB1基因人源化小鼠、TGFB1/GARP双基因人源化鼠、或TGFB1/GARP/LRRC33三基因人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后，根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人TGFB1、GARP和/或LRRC33的药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估药物的体内安全性和体内药效。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (33)

1.一种人源化TGFB1基因，其特征在于，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的部分。

2.根据权利要求1所述的人源化TGFB1基因，其特征在于，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列；

进一步优选的，包含SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化TGFB1基因，其特征在于，所述的人源化TGFB1基因包含编码人TGFB1蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，所述的人源化TGFB1基因包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化TGFB1基因，其特征在于，所述的人源化TGFB1基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)具有SEQ ID NO：8、23或73所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

5.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

A)权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因的核苷酸序列；或，

B)人TGFB1基因的部分，优选的，包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分，进一步优选包含人TGFB1基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：5或18所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

C)编码人TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3、15、24或72所示；所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4、16或25所示。

7.一种TGFB1基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化TGFB1蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人TGFB1基因的部分或人源化TGFB1基因；

优选的，所述的人源化TGFB1基因包含人TGFB1基因的部分；

进一步优选的，所述的人源化TGFB1基因选自权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的内源TGFB1蛋白表达降低或缺失。

9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物TGFB1基因座：

A)权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因的核苷酸序列；或，

B)人TGFB1基因的部分，优选的，包含人TGFB1基因的1号至7号外显子的全部或部分，进一步优选包含人TGFB1基因的1号外显子的部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，更进一步优选包含SEQ ID NO：5或18所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5或18所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或18所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

C)编码人TGFB1蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

10.根据权利要求7-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人TGFB1基因的部分或人源化TGFB1基因在非人动物中通过内源调控元件调控。

11.根据权利要求9-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为插入或替换；

优选的，所述的导入非人动物TGFB1基因座的导入位置包含非人动物TGFB1基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分，或者，1号外显子的部分至7号外显子的部分。

12.根据权利要求7-11任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求5-6任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。

13.根据权利要求7-12任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将TGFB1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，筛选，得到多基因修饰的非人动物；

优选的，所述的其他基因选自LRRC33、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种；

优选的，所述人TGFB1基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；

优选的，所述人TGFB1基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。

14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为GARP基因，所述GARP基因为人源化GARP基因；

所述的人源化GARP基因包含人GARP基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分，进一步优选包含SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：68所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或者，

所述的人源化GARP基因包含编码人GARP蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：65的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

优选的，所述的人源化GARP基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

15.根据权利要求13或14所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为LRRC33，所述LRRC33基因为人源化LRRC33基因；

所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包含2号和/或3号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

或者，所述的人源化LRRC33基因包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

优选的，所述的人源化LRRC33基因转录的mRNA包含SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

16.一种人源化LRRC33基因，其特征在于，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的部分。

17.根据权利要求16所述的人源化LRRC33基因，其特征在于，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选的，包含2号外显子的部分和/或3号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

18.根据权利要求16或17所述的人源化LRRC33基因，其特征在于，所述的人源化LRRC33基因包含编码人LRRC33蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ IDNO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

19.根据权利要求16-18任一所述的人源化LRRC33基因，其特征在于，所述的人源化LRRC33基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：40所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：40所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)具有SEQ ID NO：40所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

20.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

A)编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

B)权利要求16-19任一所述的人源化LRRC33基因的核苷酸序列；或，

C)人LRRC33基因的部分，优选包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选包含人LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

21.根据权利要求20所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：35所示；所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.7至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：36所示。

22.一种LRRC33基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化LRRC33蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因；

优选的，所述的人源化LRRC33基因包含人LRRC33基因的部分；

进一步优选的，所述的人源化LRRC33基因选自权利要求16-19任一所述的人源化LRRC33基因。

23.根据权利要求22所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的内源LRRC33蛋白表达降低或缺失。

24.根据权利要求22或23所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物LRRC33基因座：

A)编码人LRRC33蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选包含编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：34的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

B)权利要求16-19任一所述的人源化LRRC33基因的核苷酸序列；或，

C)人LRRC33基因的部分，优选包含人LRRC33基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选包含人LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：37所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

25.根据权利要求22-24任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人LRRC33基因在非人动物中通过内源调控元件调控。

26.根据权利要求24或25所述的构建方法，其特征在于，所述的导入包括插入或替换；

优选的，所述的导入非人动物LRRC33基因座的导入位置包含非人动物LRRC33基因的2号外显子的部分至3号外显子的部分。

27.根据权利要求22-26任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求20-21任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。

28.根据权利要求22-27任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将LRRC33基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，筛选，得到多基因修饰的非人动物；

优选的，所述的其他基因选自TGFB1、GARP、PD-1、PD-L1、CD73、CD24、CD3、CTLA4、CD40和4-1BB中的至少一种；

优选的，所述人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；

优选的，所述人LRRC33基因的部分或人源化LRRC33基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。

29.根据权利要求28所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因为GARP基因，所述的GARP基因为人源化GARP基因，所述的人源化GARP基因如权利要求14所述的人源化GARP基因。

30.根据权利要求28或29所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因为TGFB1基因，所述的TGFB1基因为人源化TGFB1基因，所述的人源化TGFB1基因如权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因。

31.根据权利要求7-15和22-30任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为大鼠或小鼠。

32.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因和/或权利要求16-19任一所述的人源化LRRC33基因，或者，所述的细胞、组织或器官表达人或人源化TGFB1蛋白和/或人或人源化LRRC33蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求7-15和22-31任一所述的构建方法获得的非人动物；

优选的，所述的组织为瘤组织。

33.一种权利要求1-4任一所述的人源化TGFB1基因、权利要求16-19任一所述的人源化LRRC33基因、权利要求7-15和22-31任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求32所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的模型系统中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人TGFB1、GARP和/或LRRC33信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究TGFB1、GARP和/或LRRC33基因功能，研究针对人TGFB1、GARP和/或LRRC33靶位点的药物、药效，研究与TGFB1、GARP和/或LRRC33相关的神经性疾病药物、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

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