CN117417960A - Ighe和fcer1a基因人源化的非人动物及其制备方法和应用 - Google Patents

Ighe和fcer1a基因人源化的非人动物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种IGHE和/或FCER1A基因人源化改造非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人IGHE和/或FCER1A蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化IGHE和/或FCER1A蛋白，可以作为人IGHE和/或FCER1A信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病的药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化IGHE和/或FCER1A基因、一种IGHE和/或FCER1A基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的动物模型及其在生物医药领域的应用。

Description

IGHE和FCER1A基因人源化的非人动物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IGHE和/或FCER1A基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
免疫蛋白重链有5种类型，包括γ、μ、α、ε和δ，由此决定了免疫蛋白的类型，即IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。IgE蛋白全称Immunoglobulin E，由一对重链(IGHE)和一对轻链组成，血清中含量极低，仅占血清总Ig的0.002％，在个体发育中合成较晚。IgE有分泌型及膜型两种蛋白形式，分泌型IgE由一个可变区(VH)和四个恒定区(CH1，CH2，CH3和CH4)组成；膜型IgE除了1个VH、4个CH，还包含跨膜区M1和胞内区M2。主要由鼻咽部、扁桃体、支气管、胃肠等粘膜固有层的浆细胞产生，在急性过敏反应和慢性炎性变态反应性疾病中起核心作用。
IgE主要通过受体(FcεR)发挥功能。FcεR包括高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体FcεRII。其中FcεRI是一种异型多聚复合物，由一条α链，一条β链及两条由二硫键相连的γ链通过αβγ2四聚体形式或αγ2三聚体形式存在，主要参与I型变态反应；FcεRII主要介导IgE依赖的ADCC作用。FcεRI的α亚基负责结合IgE分子，β和γ亚基主要在细胞内参与受体交联诱导的信号转导。α亚基由FCER1A基因编码，是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，广泛表达于皮肤、食管等组织，胞外区含有两个免疫球蛋白样结构域，其中近膜端结构区是与IgE Fc段相结合的区域，另一个结构区与高亲和力结合有关。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，例如，人鼠IGHE蛋白氨基酸序列一致性仅42.9％，人鼠FCER1A蛋白氨基酸序列一致性仅48.40％，人IgE不能识别鼠FcεRI，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于IgE在自身免疫性疾病治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IGHE和/或FCER1A信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
发明内容
本申请利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立了更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。该动物模型通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
本发明的第一方面，提供了一种人源化FCER1A蛋白，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180连续氨基酸。进一步优选包含C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区。
更优选包含SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的信号肽的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白信号肽至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A蛋白包含的人FCER1A蛋白的氨基酸序列包含下列任一种：
A)SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白还包含非人动物FCER1A蛋白的部分。优选包含非人动物FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分。进一步优选包含非人动物FCER1A蛋白的跨膜区和/或胞内区，更进一步优选还包含非人动物FCER1A蛋白的胞外区的部分。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含非人动物FCER1A蛋白胞质区的全部或部分，优选包含非人动物FCER1A蛋白胞质区至少5到27个，例如5、10、15、20、25、26、27个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：21的第224-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含非人动物FCER1A蛋白跨膜区的全部或部分，优选包含非人动物FCER1A蛋白跨膜区至少5到19个，例如5、10、15、19个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含非人动物FCER1A蛋白胞外区的全部或部分，优选包含非人动物FCER1A蛋白胞外区的至多10个，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个连续氨基酸，进一步优选包含非人动物FCER1A蛋白胞外区C端和/或C端的至多10个，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸。
更优选包含SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：21的第199-204位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A蛋白包含的非人动物FCER1A蛋白的氨基酸序列包含下列任一种：
A)SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人FCER1A蛋白的部分与非人动物FCER1A蛋白的部分直接连接或者通过接头连接。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含胞外区、跨膜区、胞质区和信号肽，其中跨膜区和胞质区来源于非人动物，胞外区和信号肽来源于人。
优选的，所述的非人动物FCER1A蛋白的胞外区为嵌合胞外区，其中，包含来源于人FCER1A蛋白胞外区的SEQ ID NO：22的第26-200位以及非人动物FCER1A蛋白胞外区的SEQID NO：21的第199-204位。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白信号肽、嵌合胞外区和非人动物内源跨膜区、非人动物内源胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A蛋白从N端到C端依次包括人FCER1A蛋白信号肽、胞外区的部分和非人动物FCER1A蛋白的胞外区的部分以及跨膜区和胞质区。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，优选包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，进一步优选包含人FCER1A基因的3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列，更进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中3号外显子的部分至少包含3号外显子的部分至少包含10bp到114bp连续核苷酸序列，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含6bp到477bp，例如6、9、11、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的编码的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，优选包含非人动物FCER1A基因的5号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，5号外显子的部分至少包含50bp到389bp，例如50、100、150、200、250、300、350、379、389bp连续核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次包括人FCER1A基因3号至6号外显子的全部、7号外显子的部分和非人动物FCER1A基因5号外显子的部分编码的氨基酸序列。其中，人FCER1A基因7号外显子的部分至少包含6bp到477bp，例如6、9、11、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列，非人动物FCER1A基因5号外显子的部分至少50bp到389bp，例如50、100、150、200、250、300、350、379、389bp连续核苷酸序列
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：24所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种人源化FCER1A基因，所述的人源化FCER1A基因包含人FCER1A基因的部分。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码人FCER1A蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列。
更优选包含编码SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因包含编码SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码非人动物FCER1A蛋白的部分核苷酸序列。进一步优选包含编码非人动物FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码非人动物FCER1A蛋白的胞质区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物FCER1A蛋白的胞质区的至少5个到27个，例如5、10、15、20、25、26、27个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选包含编码SEQ ID NO：21的第224-250位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第224-250位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码非人动物FCER1A蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物FCER1A蛋白的跨膜区的至少5个到19个，例如5、10、15、19个连续氨基酸，更优选包含编码SEQ ID NO：21的第205-223位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第205-223位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ IDNO：21的第205-223位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含编码非人动物FCER1A蛋白胞外区的部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物FCER1A蛋白胞外区的至多10个，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码非人动物FCER1A蛋白胞外区C端和/或C端的至多10个，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的核苷酸序列。更优选包含编码SEQ ID NO：21的第199-204位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-204位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因包含编码SEQ ID NO：21的第199-250位所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因编码上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上外显子的组合，优选包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因还包括SEQ ID NO：28和/或29所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因包含的人FCER1A基因的核苷酸序列包含下列任一种：
A)SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因包含非人动物FCER1A基因的部分核苷酸序列，优选包含非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分核苷酸序列，优选包含非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子中的任一个或两个以上外显子的组合，进一步优选包含非人动物FCER1A基因的5号外显子的部分核苷酸序列，其中，非人动物FCER1A基因的5号外显子的部分至少包含50bp到168bp，例如50、100、150、155、156、157、160、168个连续核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，以及非人动物FCER1A基因的5号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FCER1A基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：23所示核苷酸序列；
B)与SEQ ID NO：23所示核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)与SEQ ID NO：23所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：23所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种FCER1A基因的靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：
A)人FCER1A基因的部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的组合，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，再优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化FCER1A基因；或，
D)编码上述的人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的A)至D)的任一核苷酸序列为供体DNA序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，其中，
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物FCER1A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述的5’臂序列包含SEQ ID NO：25或30；
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物FCER1A基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选与NCBI登录号为NC_000067.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述的3’臂序列包含SEQ ID NO：26或31。
优选的，所述的靶向载体还包括SEQ ID NO：28和/或29所示核苷酸序列。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子上。
优选的，所述的靶向载体包含从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述的标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第四方面，提供了一种靶向FCER1A基因的sgRNA。
所述的sgRNA靶向非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子，优选1号和/或5号外显子。
优选的，所述的sgRNA在FCER1A基因上的靶位点包含SEQ ID NO：32和/或33所示核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种编码上述靶向FCER1A基因的sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
本发明的第六方面，提供了一种包含上述靶向FCER1A基因的sgRNA的载体。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述FCER1A基因的靶向载体、上述靶向FCER1A基因的sgRNA、上述DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第八方面，提供了一种包含上述FCER1A基因的靶向载体、上述靶向FCER1A基因的sgRNA、上述DNA分子、上述载体和/或上述细胞在FCER1A基因编辑中的应用。
优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第九方面，提供了一种FCER1A基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白选自上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的人源化FCER1A基因选自上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的组合，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ IDNO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，再优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的内源FCER1A蛋白表达降低或缺失。
优选的，编码人或人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列、人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性FCER1A基因的内源调控元件。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人FCER1A蛋白的部分的核苷酸序列、人FCER1A基因的部分或上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物FCER1A基因座构建获得：
A)人FCER1A基因的部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的组合，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，再优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化FCER1A基因；或，
D)编码上述的人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体构建。
优选的，所述的非人动物进一步包括其他基因修饰，优选的，所述的其他基因选自IGHE、IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化FCER1A基因和/或其他基因对于内源被修饰的基因座为纯和或杂合。
优选的，所述的非人动物体内还表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中还包括人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因。
优选的，所述的人或人源化IGHE蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十方面，提供了一种FCER1A基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白选自上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的人源化FCER1A基因选自上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的组合，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ IDNO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，再优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物为上述的非人动物。
优选的，所述的非人动物的内源FCER1A蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化FCER1A蛋白的部分的核苷酸序列、人FCER1A基因的部分或上述的人源化FCER1A基因。
其中，编码人或人源化FCER1A蛋白的部分的核苷酸序列、人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性FCER1A基因的内源调控元件。
优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物FCER1A基因座：
A)人FCER1A基因的部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的组合，进一步优选包含人FCER1A基因的3号外显子至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区、信号肽、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FCER1A蛋白胞外区至少50到180个，例如50、80、100、150、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码C端和/或N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FCER1A蛋白胞外区的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的全部或部分核苷酸序列，再优选包含编码人FCER1A蛋白信号肽的至少5到25个，例如5、10、15、20、25个连续氨基酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：22的第1-25或26-200或26-205或1-200位或1-205位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化FCER1A基因；或，
D)编码上述的人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的A)-D)任一核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。
所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的导入位置为内源调控元件之后。
所述的插入为在不删除核苷酸的条件下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，或者删除部分核苷酸序列之后将目的片段置于删除位置(例如起始密码子)。根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源FCER1A基因的编码框或破坏插入序列之后的内源FCER1A基因的编码框，随后进行插入操作，或者，所述的插入步骤既可以给内源FCER1A基因造成移码突变又可以实现插入序列的步骤，所述的插入序列包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，进一步优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列。
所述的替换为相应位置的替换或不相应位置的替换。所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物FCER1A基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物FCER1A基因座为替换非人动物FCER1A基因的相应区域。
进一步优选非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分被替换。
进一步优选非人动物编码FCER1A蛋白的全部或部分被替换。优选编码胞外区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列被替换。
进一步优选编码SEQ ID NO：21的第1-198位的核苷酸序列被替换。
优选的，编码人或人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列、人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因在非人动物体内通过调控元件进行调控。所述的调控元件可以为内源或外源。优选的，所述的调控元件包括但不限于启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件为内源调控元件。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物FCER1A蛋白的胞外区全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人FCER1A蛋白的信号肽和胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换编码非人动物FCER1A蛋白的信号肽和胞外区全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：22的第1-200位的核苷酸序列插入或替换非人动物中编码SEQ ID NO：21的第1-198位的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人FCER1A基因的部分插入或替换非人动物FCER1A基因的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分插入或替换非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人FCER1A基因的3号的部分、4号至6号外显子的部分和7号外显子的全部或部分插入或替换非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：27所述的核苷酸序列插入或替换非人动物中编码SEQ ID NO：21的第1-198位的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源FCER1A基因座处用人FCER1A基因的部分导入非人动物FCER1A基因的基因组片段以形成经修饰的FCER1A基因。
所述的经修饰的FCER1A基因编码人源化FCER1A蛋白。
所述的经修饰的FCER1A基因的表达受到非人动物内源调控元件的调控。
优选的，使用基因编辑技术进行FCER1A基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎干细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，培养该囊胚，然后将培养后的囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FCER1A基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用上述的FCER1A基因的靶向载体和上述的靶向FCER1A基因的sgRNA一起进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述的FCER1A基因的靶向载体和上述的靶向FCER1A基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FCER1A基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法还包括将FCER1A基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因选自IGHE、IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化FCER1A基因和/或其他基因对于内源被修饰的基因座为纯和或杂合。
优选的，所述的多基因修饰非人动物基因组中的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。
优选的，所述的非人动物体内还表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中还包括人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因。
优选的，所述的人或人源化IGHE蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种FCER1A基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失FCER1A基因的全部或部分。
优选缺失FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分。
本发明的第十二方面，提供了一种FCER1A基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法为采用上述的靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。
本发明的第十三方面，提供了一种FCER1A基因缺失的细胞，所述的细胞缺失FCER1A基因的全部或部分。
优选缺失FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分。
本发明的第十四方面，提供了一种FCER1A基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法为采用上述的靶向载体和/或sgRNA进行细胞的构建。
本发明的第十五方面，提供了一种人源化IGHE基因，所述的人源化IGHE基因包含人IGHE基因的部分。
优选的，所述的人源化IGHE基因包含编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码至少50到485个，例如50、100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IGHE基因包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IGHE基因包含非人动物IGHE基因的部分。
优选的，所述的人源化IGHE基因包含SEQ ID NO：6和/或7所示核苷酸序列
优选的，所述的人源化IGHE基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
本发明的第十六方面，提供了一种人源化IGHE蛋白，所述的人源化IGHE蛋白包含人IGHE蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白包含人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸；优选包含人IGHE蛋白CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分编码的氨基酸序列，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的编码的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白还包含非人动物IGHE蛋白的部分。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白由上述的人源化IGHE基因编码。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGHE蛋白的氨基酸序列包含下列任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十七方面，提供了一种IGHE基因的靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：
A)人IGHE基因的部分，优选包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选编码人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化IGHE基因；
D)编码上述的人源化IGHE蛋白的核苷酸序列。
优选的，上述A)-D)的任一核苷酸序列为供体DNA序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物IGHE基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选与NCBI登录号为NC_000078.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3或8所示核苷酸序列；
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物IGHE基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选与NCBI登录号为NC_000078.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4或9所示核苷酸序列。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IGHE基因的1号至6号外显子上。
优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：6和/或7所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的IGHE基因的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-D)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述的标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十八方面，提供了一种靶向IGHE基因的sgRNA。
所述的sgRNA靶向非人动物IGHE基因的1号至6号外显子，优选1号和/或6号外显子。
优选的，所述的sgRNA在IGHE基因上的靶位点包含SEQ ID NO：10和/或11所示核苷酸序列。
本发明的第十九方面，提供了一种编码上述靶向IGHE基因的sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
本发明的第二十方面，提供了一种包含上述靶向IGHE基因的sgRNA的载体。
本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述IGHE基因的靶向载体、上述靶向IGHE基因的sgRNA、上述DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第二十二方面，提供了一种包含上述IGHE基因的靶向载体、上述靶向IGHE基因的sgRNA、上述DNA分子、上述载体和/或上述细胞在IGHE基因编辑中的应用。
优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第二十三方面，提供了一种IGHE基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白选自上述的人源化IGHE蛋白。
优选的，所述的人源化IGHE基因选自上述的人源化IGHE基因。
所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的部分，优选包含人IGHE基因的的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列；更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者包含与SEQ IDNO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
所述的非人动物的基因组中包含编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选编码人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ IDNO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的内源IGHE蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列、人IGHE基因的部分或上述的人源化IGHE基因。
优选的，编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列、人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性IGHE基因的内源调控元件。
优选的，编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列、人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因的核苷酸序列通过内源IGHE调控元件或人IGHE调控元件进行调控。优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物IGHE基因座构建获得：
A)人IGHE基因的部分，优选包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选人IGHE基因的1号至6号外显子中的任一个或两个以上的外显子的组合，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选编码人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化IGHE基因；
D)编码上述的人源化IGHE蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体构建。
优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，优选的，所述的其他基因选自FCER1A、IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化IGHE基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中还包含人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白选自上述的人源化FCER1A蛋白；
优选的，所述的人源化FCER1A基因选自上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十四方面，提供了一种IGHE基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白选自上述的人源化IGHE蛋白。
优选的，所述的人源化IGHE基因选自上述的人源化IGHE基因。
所述的非人动物的基因组中包含人IGHE基因的部分，优选包含人IGHE基因5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
所述的非人动物的基因组中包含编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选编码人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ IDNO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列、人IGHE基因的部分或上述的人源化IGHE基因。
优选的，所述的非人动物为上述的非人动物。
优选的，所述的非人动物的内源IGHE蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物IGHE基因座：
A)人IGHE基因的部分，优选包含人IGHE基因5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部或部分、3’UTR和3’UTR下游部分，进一步优选，5’UTR上游部分至少包含1500bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含2000bp连续核苷酸序列，更进一步的，包含人IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1620、1640、1660、1670、1671、1672、1673、1674、1675、1676、1677、1680或1700bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2240、2280、2281、2283、2287、2290、2300或2500bp连续核苷酸序列；再进一步优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选编码人IGHE蛋白至少50到485个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、485个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQID NO：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的核苷酸序列；
C)上述的人源化IGHE基因；
D)编码上述的人源化IGHE蛋白的核苷酸序列。
优选的，上述A)-D)中任一个核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。
所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的导入位置为内源调控元件之后。
优选的，所述导入位置为内源IGHE基因组座，更优选的，所述导入位置位于小鼠IGHE基因外显子1至外显子6。进一步优选的，所述导入位置位于小鼠IGHE基因外显子1全部至外显子6全部。
所述的插入为在不删除核苷酸的条件下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，或者删除部分核苷酸序列之后将目的片段置于删除位置(例如起始密码子)。根据具体实施方案的需要，所述的插入还可能包括破坏非人动物内源IGHE基因的编码框或破坏插入序列之后的内源IGHE基因的编码框，随后进行插入操作，或者，所述的插入步骤既可以给内源IGHE基因造成移码突变又可以实现插入序列的步骤，所述的插入序列包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，进一步优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列。
所述的替换为相应位置的替换或不相应位置的替换。所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物IGHE基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物IGHE基因座为替换非人动物IGHE基因的相应区域。
进一步优选非人动物IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分被替换，其中5’UTR上游部分至少包含1300bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含1200bp连续核苷酸序列；更进一步的，非人动物IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1320、1340、1360、1400或1500bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1240、1241、1243、1245、1247、1300、1400、1600或1800bp连续核苷酸序列被替换。
进一步优选非人动物编码IGHE蛋白的全部或部分被替换。
进一步优选编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列被替换。
优选的，编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列、人IGHE基因的部分或人源化IGHE基因在非人动物体内通过调控元件进行调控。
所述的调控元件可以为内源的或外源的(如，人IGHE调控元件)。
所述的调控元件包括但不限于启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物IGHE蛋白的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人IGHE蛋白的CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列插入或替换非人动物IGHE蛋白的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGHE基因的全部或部分插入或替换非人动物IGHE基因的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分插入或替换非人动物IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列插入或替换非人动物IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分被替换。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列或人或人源化IGHE基因的核苷酸序列插入替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源IGHE基因座处用人IGHE基因的部分导入非人动物IGHE基因的基因组片段以形成经修饰的IGHE基因。
所述的经修饰的IGHE基因编码人源化IGHE蛋白。
所述的经修饰的IGHE基因的表达受到非人动物内源调控元件的调控。
所述的经修饰的IGHE基因的表达受到人调控元件的调控
优选的，使用基因编辑技术进行IGHE基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎干细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，培养该囊胚，然后将培养后的囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IGHE基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用上述的IGHE基因的靶向载体和上述的靶向IGHE基因的sgRNA一起进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述的IGHE基因的靶向载体和上述的靶向IGHE基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IGHE基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将IGHE基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因选自FCER1A、IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化IGHE基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中还包含人FCER1A基因的部分或人源化FCER1A基因；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白选自上述的人源化FCER1A蛋白；
优选的，所述的人源化FCER1A基因选自上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上外显子的组合，优选包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分，更优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子，其中，人FCER1A基因的3号外显子的部分至少包含10bp到至少114bp，例如10、50、55、60、100、110、114bp连续核苷酸序列，人FCER1A基因的7号外显子的部分至少包含1bp到至少477bp，例如1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、477bp连续核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：27所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十五方面，提供了一种IGHE基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失IGHE基因的全部或部分，优选缺失IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分，其中5’UTR上游部分至少包含1300bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含1200bp连续核苷酸序列；进一步的，缺失非人动物IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1320、1340、1360、1400或1500bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1240、1241、1243、1245、1247、1300、1400、1600或1800bp连续核苷酸序列。。
本发明的第二十六方面，提供了一种IGHE基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述的靶向IGHE基因的sgRNA和/或IGHE基因的靶向载体进行IGHE基因缺失的非人动物的制备。
本发明的第二十七方面，提供了一种IGHE基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IGHE基因的全部或部分，优选缺失IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分被替换，其中5’UTR上游部分至少包含1300bp连续核苷酸序列，3’UTR下游部分至少包含1200bp连续核苷酸序列；进一步的，缺失非人动物IGHE基因起始密码子上游至少1000bp，如至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1320、1340、1360、1400或1500bp连续核苷酸序列，终止密码子下游至少200、400、800、1000、1200、1240、1241、1243、1245、1247、1300、1400、1600或1800bp连续核苷酸序列。
本发明的第二十八方面，提供了一种IGHE基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述的靶向IGHE基因的sgRNA和/或IGHE基因的靶向载体进行IGHE基因缺失的细胞的制备。
本发明的第二十九方面，提供了一种人源化IgE蛋白，所述的人源化IgE蛋白包含重链，所述的重链包含人IGHE蛋白或上述的人源化IGHE蛋白；
优选的，所述的人源化IgE蛋白还包括轻链。
本发明的第三十方面，提供了一种多聚体，所述的多聚体包含上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的多聚体还包含IgE蛋白，优选为上述的人源化IgE蛋白。
进一步优选的，所述的多聚体还包含FcεRI的β链和/或γ链。
本发明的第三十一方面，提供了一种双基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物表达人或人源化FCER1A蛋白，和，人或人源化IGHE蛋白；和/或，所述的非人动物基因组中包含人或人源化FCER1A基因，和，人或人源化IGHE基因；和/或，所述的非人动物表达人或人源化IgE蛋白，和，多聚体。
本发明的第三十二方面，提供了一种双基因修饰的非人动物的构建方法。
优选的，所述的构建方法包括如下步骤：
1)提供上述的FCER1A基因人源化的非人动物，或采用上述的FCER1A基因人源化的非人动物的构建方法获得的非人动物；
2)将步骤1)提供的非人动物与IGHE基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到双基因修饰的非人动物，优选的，所述的IGHE基因修饰的非人动物为上述的IGHE基因人源化的非人动物，或采用上述的IGHE基因人源化的非人动物的构建方法获得的非人动物；
或者，
1)提供上述的IGHE基因人源化的非人动物，或采用上述的IGHE基因人源化的非人动物的构建方法获得的非人动物；
2)将步骤1)提供的非人动物与FCER1A基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到双基因修饰的非人动物，优选的，所述的FCER1A基因修饰的非人动物为上述的FCER1A基因人源化的非人动物，或采用上述的FCER1A基因人源化的非人动物的构建方法获得的非人动物。
本发明的第三十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
1)提供上述任一的非人动物，或采用上述任一的构建方法获得的非人动物；
2)将步骤1)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因、IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R修饰的非人动物中的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座可以是纯合的；
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座可以是杂合的。
本发明的第三十四方面，提供了一种上述任一构建方法获得的非人动物及其子代。
本发明的第三十五方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含上述的人源化FCER1A基因和/或上述的人源化IGHE基因，和/或，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化FCER1A蛋白和/或上述的人源化IGHE蛋白；或者，所述的细胞、组织或器官包含上述的人源化IgE蛋白，和/或，上述的多聚体；或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第三十六方面，提供了一种瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第三十七方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物，优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第三十八方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法是利用上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物进行的，优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第三十九方面，提供了一种上述任一的非人动物、上述任一的构建方法获得的非人动物或上述的动物模型在制备治疗和/或预防肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第四十方面，提供了一种FCER1A基因人源化的细胞。
所述的细胞表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的细胞基因组中包含人或人源化FCER1A基因。
所述的细胞表达人或人源化IgE蛋白。
所述的细胞表达上述多聚体。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的细胞基因组中包含上述的人源化FCER1A基因。
本发明的第四十一方面，提供了一种FCER1A基因人源化的细胞的构建方法，所述的构建方法包括使用上述的FCER1A基因的靶向载体和/或上述的靶向FCER1A基因的sgRNA进行FCER1A基因人源化的细胞的构建。
本发明的第四十二方面，提供了一种IGHE基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的细胞基因组中包含人或人源化IGHE基因。
所述的细胞表达人或人源化IgE蛋白。
所述的细胞表达上述多聚体。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化IGHE蛋白。
优选的，所述的细胞基因组中包含上述的人源化IGHE基因。
本发明的第四十三方面，提供了一种IGHE基因人源化的细胞的构建方法，所述的构建方法包括使用上述的IGHE基因的靶向载体和/或上述的靶向IGHE基因的sgRNA进行IGHE基因人源化的细胞的构建。
本发明的第四十四方面，提供了一种FCER1A基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化FCER1A基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化FCER1A蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组中包括编码人或人源化IgE蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组中包括编码多聚体的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FCER1A基因为上述的人源化FCER1A基因。
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白为上述的人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源FCER1A基因座处用人FCER1A基因的基因组片段(优选人FCER1A基因的部分核苷酸序列)，导入非人动物FCER1A基因的基因组片段以形成经修饰的FCER1A基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源FCER1A基因座处用人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分导入非人动物FCER1A基因的基因组片段以形成经修饰的FCER1A基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源FCER1A基因座处用人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分(优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子)导入非人动物FCER1A基因的基因组片段以形成经修饰的FCER1A基因。
所述的经修饰的FCER1A基因编码人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源FCER1A基因座处用人FCER1A基因的基因组片段置换非人动物FCER1A基因的基因组片段以形成经修饰的FCER1A基因。
所述的人FCER1A基因的基因组片段包含人FCER1A基因的3号至7号外显子的全部或部分。优选包含人FCER1A基因的3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或6-7号内含子。
所述的被置换的非人动物FCER1A基因的基因组片段包含非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分。
所述的经修饰的FCER1A基因编码人源化FCER1A蛋白。
优选的，所述的经修饰的FCER1A基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的基因组中包含人源化的内源FCER1A基因座，在该基因座中，内源FCER1A基因座的区段已被缺失并替换为对应的人FCER1A序列。
优选的，所述的人源化的内源FCER1A基因座包括内源FCER1A启动子，其中，人FCER1A序列可操作地连接到内源FCER1A启动子。
优选的，内源FCER1A基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并替换为所对应的人FCER1A序列。
优选的，所述的经修饰的FCER1A基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第四十五方面，提供了一种IGHE基因人源化非人动物的基因组。优选的，所述的基因组中包含人或人源化IGHE基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化IGHE蛋白的全部或部分。
优选的，所述的基因组中包括编码人或人源化IgE蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组中包括编码多聚体的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IGHE基因为上述的人源化IGHE基因。
优选的，所述的人源化IGHE蛋白为上述的人源化IGHE蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源IGHE基因座处用人IGHE基因的基因组片段置换非人动物IGHE基因的基因组片段以形成经修饰的IGHE基因。
所述的人IGHE基因的基因组片段包含人IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部或部分、3’UTR和3’UTR下游部分。优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。
所述的被置换的非人动物IGHE基因的基因组片段包含非人动物IGHE基因的5’UTR上游部分、5’UTR、1号至6号外显子的全部、3’UTR和3’UTR下游部分。
所述的经修饰的IGHE基因编码人源化IGHE蛋白。
优选的，所述的经修饰的IGHE基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的基因组中包含人源化的内源IGHE基因座，在该基因座中，内源IGHE基因座的区段已被缺失并替换为对应的人IGHE序列。
优选的，所述的人源化的内源IGHE基因座包括内源IGHE启动子，其中，人IGHE序列可操作地连接到内源IGHE启动子。
优选的，内源IGHE基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并替换为所对应的人IGHE序列。
在本发明的一个具体实施方式中，内源IGHE基因座的整个IGHE编码序列已缺失并替换为对应的人IGHE序列。
在本发明的一个具体实施方式中，内源IGHE基因座从起始密码子到终止密码子的区域已被缺失并替换为对应的人IGHE基因座。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第四十六方面，提供了一种双基因修饰的非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化FCER1A基因、人或人源化IGHE基因、编码人或人源化FCER1A蛋白的核苷酸序列，和/或，编码人或人源化IGHE蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组中包括编码人或人源化IgE蛋白的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组中包括编码多聚体的核苷酸序列。
优选的，所述的基因组，包含第四十四方面所述的经修饰的FCER1A基因和第四十五方面所述的经修饰的IGHE基因。
本发明的第四十七方面，提供了包含上述FCER1A基因人源化非人动物的基因组、IGHE基因人源化非人动物的基因组和/或双基因修饰的非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
本发明的第四十八方面，提供了一种上述的人源化FCER1A蛋白、上述的人源化FCER1A基因、上述任一的非人动物、上述任一构建方法获得非人动物、上述的人源化IGHE蛋白、上述的人源化IGHE基因、上述的人源化IgE蛋白、上述的多聚体、上述的细胞、组织或器官、上述的瘤组织或上述的动物模型的应用。
优选的，所述的应用可以为非疾病的诊断和/或治疗目的，也可以为疾病的诊断和/或治疗目的。
优选的，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与FCER1A和/或IGHE相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与FCER1A和/或IGHE相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与FCER1A和/或IGHE相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人FCER1A和/或IGHE信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究FCER1A和/或IGHE基因功能，研究针对人FCER1A和/或IGHE靶位点的药物、药效，研究与FCER1A和/或IGHE相关的炎症、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的第四十九方面，提供了来源于上述任一的非人动物、上述任一构建方法获得的非人动物或上述动物模型用于FCER1A和/或IGHE特异性调节剂的筛选。
本发明的第五十方面，提供了一种FCER1A和/或IGHE特异性调节剂的筛选方法，所述的方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体为上述的非人动物或者采用上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗FCER1A和/或IGHE抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法可以为治疗目的或非治疗目的。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第五十一方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建动物模型，向动物模型给予候选药物，对给予候选药物的动物模型进行药效检测和/或比较。
优选的，所述人用药物筛选或评价的方法可以为治疗目的也可以为非治疗目的。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于GVHD(移植物抗宿主病)、银屑病、过敏、哮喘、特异性皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IGHE基因座”表示IGHE基因1号至6号外显子上任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IGHE基因座可以是IGHE基因1号至6号外显子上任选一段的DNA片段；又如所述的“非人动物FCER1A基因座”表示非人动物FCER1A基因1号至5号外显子上任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的非人动物FCER1A基因座可以是非人动物FCER1A基因1号至5号外显子上任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化FCER1A蛋白”，包含来源于人FCER1A蛋白的部分。其中，所述的“人FCER1A蛋白”同“人FCER1A蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人FCER1A蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人FCER1A蛋白的部分”，为连续或间隔的5-257个(优选为10-200个)，例如5、10、50、100、150、200、250、257个，氨基酸序列与人FCER1A蛋白的氨基酸序列一致或与人FCER1A蛋白的氨基酸序列具有80％以上同源性。
本发明所述的“人源化IGHE蛋白”，包含来源于人IGHE蛋白的部分。其中，所述的“人IGHE蛋白”同“人IGHE蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人IGHE蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IGHE蛋白的部分”，为连续或间隔的5-494个(优选为10-494个)，例如5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、494个，氨基酸序列与人IGHE蛋白的氨基酸序列一致或与人IGHE蛋白的氨基酸序列具有80％以上同源性。
本发明所述的“人源化FCER1A基因”，包含来源于人FCER1A基因的部分。其中，所述的“人FCER1A基因”同“人FCER1A基因的全部”，即其核苷酸序列与人FCER1A基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人FCER1A基因的部分”为连续或间隔的20bp-24628bp(优选为20bp-1172bp、20-600bp、20bp-5394bp)，例如20、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1172、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000、5394、5500、10000、20000、21000、22000、23000、24000、24628bp核苷酸序列与人FCER1A基因核苷酸序列一致或与人FCER1A基因核苷酸序列具有80％以上同源性。
本发明所述的“人源化IGHE基因”，包含来源于人IGHE基因的部分。其中，所述的“人IGHE基因”同“人IGHE基因的全部”，即其核苷酸序列与人IGHE基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人IGHE基因的部分”为连续或间隔的20bp-8001bp(优选为20bp-1485bp)，例如20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1485、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、8001bp核苷酸序列与人IGHE基因核苷酸序列一致或与人IGHE基因核苷酸序列具有80％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至5号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“3-4号内含子”表示3号外显子与4号外显子之间的内含子。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或其他体细胞，优选包括但不限于T细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠IGHE基因座和人IGHE基因座对比示意图(非按比例)；
图2：IGHE基因打靶策略及靶向载体V1设计示意图(非按比例)；
图3：IGHE基因打靶策略及靶向载体V2设计示意图(非按比例)；
图4：F0代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图5：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图6：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；
图7：小鼠FCER1A基因座和人FCER1A基因座对比示意图(非按比例)；
图8：小鼠FCER1A基因座人源化改造示意图(非按比例)；
图9：FCER1A基因打靶策略及靶向载体V3设计示意图(非按比例)；
图10：FCER1A基因打靶策略及靶向载体V4设计示意图(非按比例)；
图11：F0代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图12：F1代小鼠基因型鉴定结果，M为Marker，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图13：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；
图14：IGHE/FCER1A人源化造模小鼠给药后的体温变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
BspHI、BglII和NsiI酶购自NEB，货号分别为R0517S、R0144S和R0127S；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Pacific BlueTManti-mouse/human CD45R/B220 Antibody购自Biolegend，货号103227；
Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；
Brilliant Violet 605TManti-mouse CD4 Antibody购自Biolegend，货号100451；
Brilliant Violet 785TManti-mouse/human CD11b Antibody购自Biolegend，货号101243；
PerCP anti-mouse Ly-6C Antibody购自Biolegend，货号128028；
PE/Cyanine7 anti-mouse CD49b(pan-NK cells)Antibody购自Biolegend，货号108921；
CD49b(Integrin alpha 2)Monoclonal Antibody(DX5),PerCP-eFluorTM710购自eBioscience，货号46-5971-82；
BV650 Rat Anti-Mouse CD200R3购自BD，货号752646；
FITC Rat Anti-Mouse IgE Antibody购自BD，货号553415；
APC anti-mouse FcεRIαAntibody购自Biolegend，货号134315；
PE anti-human FcεRIαAntibody购自Biolegend，货号334609。
实施例1IGHE基因人源化小鼠的构建方法
小鼠IGHE基因(NCBI Gene ID：380792，Primary source：MGI：2685746，UniProt：A0A1Y7VJX7，位于12号染色体NC_000078.7的第113232883至113236868位，基于转录本ENSMUST00000223335.2及其编码蛋白A0A1Y7VJX7(SEQ ID NO：1)和人IGHE基因(NCBI GeneID:3497，Primary source：HGNC：5522，UniProt ID：A0A286YES5，位于14号染色体NC_000014.9的第105600066至105601727位，基于转录本ENST00000641420.1及其编码蛋白A0A286YES5(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IGHE基因座引入编码人IGHE蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化IGHE蛋白。具体来说，使用基因编辑技术，在小鼠内源IGHE基因调节元件的控制下，将人源IGHE基因组核苷酸序列导入小鼠内源IGHE基因座，例如将包含人IGHE(包含CH1-CH4、M1、M2编码序列及上下游侧翼序列)全部核苷酸序列替换小鼠相应序列，实现对小鼠IGHE基因的人源化改造。
进一步设计如图2所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V1上含有上游同源臂(5’同源臂)和下游同源臂(3’同源臂)序列，以及包含编码人IGHE蛋白的核苷酸序列A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000078.7的第113238207至113242396位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000078.7的第113226901至113231636位核苷酸序列相同；A1片段中包含人IGHE的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000014.9的第105595404至105603404位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。Neo盒上游与人序列的连接设计为： 其中序列“TGCA”中的“A”是人的最后一个核苷酸，序列/>中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠基因的连接设计为/> 其中序列“ATCC”中的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列中的第一个“A”是鼠的第一个核苷酸。还在靶向载体V1的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠IGHE表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
此外，还可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图3所示的打靶策略示意图。图中显示了靶向载体V2上含有小鼠IGHE基因的上、下游同源臂序列，以及编码人IGHE蛋白的核苷酸序列A2片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：8)与NCBI登录号为NC_000078.7的第113238207至113239737位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：9)与NCBI登录号为NC_000078.7的第113230461至113231636位核苷酸序列相同；A2片段序列与SEQ ID NO：5相同。改造后的小鼠IGHE表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。示例性靶序列如下所示：
sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：10)：5’-GGACTAGGCCAAACTATTAGAGG-3’
sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：11)：5’-CACAAGTGTGCCGAAGCTGGTGG-3’
在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT-IGHE-1和pT-IGHE-2。pT-sgRNA载体由质粒合成，公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：12)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将获得的表达载体pT-IGHE-1和pT-IGHE-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的IGHE基因人源化小鼠品系。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的示例性鉴定结果见图4。结合PCR引物检测结果，并经测序进一步验证图4中编号为F0-2为阳性小鼠。PCR引物如表1所示：
表1 F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小
将F0鉴定为阳性的IGHE基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。用上述引物L-GT-F/L-GT-R和R-GT-F/R-GT-R对F1代小鼠进行PCR检测，示例性检测结果见图5，显示编号为F1-1、F1-2、F1-3和F1-4为阳性小鼠。
对PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BspHI酶或BgIII酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表2。Southern blot检测结果见图6，综合3’探针和5’探针的结果表明，F1-1、F1-2、F1-3和F1-4鼠均无随机插入，这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的IGHE基因人源化小鼠。
表2具体探针及目的片段长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
BspHI 3’Probe - 7.1kb
BgIII 5’Probe 11.2kb 6.3kb
探针合成引物如下：
3’Probe:
3’Probe-F：5’-CCAAACACAGGATGGATGCGTG-3’(SEQ ID NO：17)；
3’Probe-R：5’-CACCGTGAGCTGCCTGCTGGTC-3’(SEQ ID NO：18)；
5’Probe:
5’Probe-F：5’-CTCAAGACTCACAAGCAAAATTAGTGG-3’(SEQ ID NO：19)；
5’Probe-R：5’-GGTGCCCACTCACAAGTGATTATC-3’(SEQ ID NO：20)。
实施例2FCER1A基因人源化小鼠的构建
小鼠FCER1A基因(NCBI Gene ID：14125，Primary source：MGI：95494，UniProt：P20489，位于1号染色体NC_000067.7的第173048836至173054799位，基于转录本NM_010184.2及其编码蛋白NP_034314.2(SEQ ID NO：21)和人FCER1A基因(NCBI Gene ID:2205，Primary source：HGNC：3609，UniProt ID：P12319，位于1号染色体NC_000001.11的第159283575至159308202位，基于转录本NM_002001.3及其编码蛋白NP_001992.1(SEQ IDNO：22)，对比示意图如图7示。
在小鼠内源FCER1A基因座，将人FCER1A的3号至7号外显子的部分核苷酸序列替换小鼠1号至5号外显子的部分序列，改造后的人源化小鼠FCER1A基因座示意图如图8所示，其mRNA序列及其编码的蛋白质序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。
进一步设计如图9所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体V3上含有上游同源臂(5’同源臂)和下游同源臂(3’同源臂)序列，以及A3片段(包含人FCER1A的3号至7号外显子的部分核苷酸序列)。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：25)与NCBI登录号为NC_000067.7的第173054743至173058797位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：26)与NCBI登录号为NC_000067.7的第173044299至173048465位核苷酸序列相同；A3片段中包含的人FCER1A核苷酸序列(SEQ ID NO：27)与NCBI登录号为NC_000001.11的第159302365至159307758位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。Neo盒上游与鼠序列的连接设计为： 其中序列“GACT”中的“T”是鼠的最后一个核苷酸，序列/>中的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠基因的连接设计为 其中序列“ATCC”中的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/>中的“G”是鼠的第一个核苷酸。还在靶向载体V3的3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因DTA。改造后的人源化小鼠FCER1A表达的蛋白序列如SEQ ID NO：24所示。
此外，还可采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，设计如图10所示的打靶策略示意图。图中显示了靶向载体V4上含有小鼠FCER1A基因的上、下游同源臂序列以及包含人FCER1A的3号至7号外显子的部分核苷酸序列A4片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQID NO：30)与NCBI登录号为NC_000067.7的第173054743至173056229位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：31)与NCBI登录号为NC_000067.7的第173047886至173049215位核苷酸序列相同；A4片段序列与NCBI登录号NC_000001.11的第159302365至159307758位相同(SEQ ID NO：27)。改造后的小鼠FCER1A表达的蛋白序列如SEQ ID NO：24所示。
设计并合成识别5’端和3’端靶位点的sgRNA序列，筛选出活性较好、序列特异性较高的sgRNA进行后续实验。示例性靶序列如下所示：
sgRNA3靶位点(SEQ ID NO：32)：5’-TGTCATGGTGGGAGCATTGATGG-3’
sgRNA4靶位点(SEQ ID NO：33)：5’-ATACTCCATTATACTAATGGTGG-3’
在sgRNA的5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT-FCER1A-1和pT-FCER1A-2。pT-sgRNA载体由质粒合成，公司合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA(SEQ ID NO：12)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将获得的表达载体pT-FCER1A-1和pT-FCER1A-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的FCER1A基因人源化小鼠品系。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的示例性鉴定结果见图11。结合PCR引物检测结果，并经测序进一步验证图12中编号为F0-1为阳性小鼠。PCR引物如表3所示：
表3F0代基因型PCR检测引物序列及重组片段大小
将F0鉴定为阳性的FCER1A基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。用上述引物A-L-GT-F/A-L-GT-R和A-R-GT-F/A-R-GT-R对F1代小鼠进行PCR检测，示例性检测结果见图12，显示编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04、F1-05、F1-06和F1-07小鼠为阳性小鼠。
对PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用NsiI酶或BspHI酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表4。Southern blot检测结果见图13，综合3’探针和5’探针的结果表明，F1-01、F1-02和F1-03鼠均无随机插入，这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的IGHE基因人源化小鼠。
表4具体探针及目的片段长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
NsiI 3’Probe 12kb 13.7kb
BspHI 5’Probe - 12.6kb
探针合成引物如下：
3’Probe：
3’Probe-F:5’-GACTGCAGAGTCTCAACGCTC-3’(SEQ ID NO：38)；
3’Probe-R:5’-TGAATGAGCAAACCTTATGCACTG-3’(SEQ ID NO：39)；
5’Probe:
5’Probe-F:5’-ATTGGAAGGCAATTTAACTAGTGC-3’(SEQ ID NO：40)；
5’Probe-R:5’-CCAAGCTTTGTCCTTCATTTTTAGC-3’(SEQ ID NO：41)。
通过流式细胞术确认小鼠体内人源化FCER1A蛋白表达情况。具体来说，选取6周龄雄性野生型C57BL/6小鼠和FCER1A基因人源化杂合子小鼠的血液组织，用白细胞标记抗体Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45Antibody(mCD45)、T细胞标记抗体BrilliantViolet 605TManti-mouse CD4Antibody(mCD4)、B细胞标记抗体Pacific Blue-VL1 anti-mouse/human CD45R/B220Antibody(mB220)、抗鼠IgE抗体FITC anti-mouse IgEAntibody(mIgE)、抗鼠FCER1A抗体APC anti-mouse FcεRIαAntibody(mFCER1A)、抗人FCER1A抗体PEanti-human FcεRIαAntibody(hFCER1A)识别染色后进行流式检测。
数据显示，在野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠FCER1A阳性细胞(特征为mCD45+mCD4-mIgE+mB220-mFCER1A+)的比例为96.2％，人FCER1A阳性细胞(特征为mCD45+mCD4-mIgE+mB220-hFCER1A+)的比例为2.5％；在FCER1A基因人源化杂合小鼠体内检测到鼠FCER1A阳性细胞的比例为88.9％，检测到人FCER1A阳性细胞的比例为66.7％。表明本方法制备的FCER1A基因人源化小鼠体内可成功表达人源化FCER1A蛋白。
此外还可以通过上述方法制备BALB/c背景的FCER1A人源化小鼠或者使用上述制备成功的FCER1A人源化小鼠与野生型BALB/c小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到BALB/c背景的FCER1A人源化小鼠。
实施例3IGHE/FCER1A双基因人源化鼠的制备
利用本方法制得的IGHE基因人源化小鼠和FCER1A基因人源化小鼠还可以制备IGHE/FCER1A双人源化小鼠。由于鼠IGHE与FCER1A基因分别位于12号和1号染色体上，选择实施例1制备的IGHE基因人源化小鼠与实施例2制备的FCER1A基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到IGHE/FCER1A双基因人源化小鼠。
通过流式细胞术检测小鼠体内人IGHE和人源化FCER1A蛋白表达情况。具体来说，选取8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和IGHE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠(H/H)，使用20μg/200μL的LPS刺激4h后，脱颈安乐死取骨髓组织，使用白细胞标记抗体BrilliantViolet 510TManti-mouse CD45Antibody(mCD45)、骨髓细胞标记抗体Brilliant Violet785TManti-mouse/human CD11b Antibody(mCD11b)、抗鼠Ly-6C抗体PerCP anti-mouse Ly-6C Antibody(mLy-6C)、抗鼠CD49b抗体CD49b(Integrin alpha 2)Monoclonal Antibody(DX5),PerCP-eFluorTM710(mCD49b)、嗜碱性粒细胞标记抗体BV650 Rat Anti-MouseCD200R3(mCD200R3)、抗鼠IGHE抗体FITC Rat Anti-Mouse IgE Antibody(mIGHE)、抗人IGHE抗体BV711 Mouse Anti-Human IgE(hIGHE)、抗鼠FCER1A抗体APC anti-mouse FcεRIαAntibody(mFCER1A)、抗人FCER1A抗体PE anti-human FcεRIαAntibody(hFCER1A)等识别染色后进行流式检测。
其中，鼠IGHE阳性细胞的特征为mCD45+mLy-6C+mCD11b+mCD200R3+mCD 49b+mIGHE+，人IGHE阳性细胞的特征为mCD45+mLy-6C+mCD11b+mCD200R3+mCD 49b+hIGHE+；鼠FCER1A阳性细胞的特征为mCD45+mLy-6C+mCD11b+mCD49b+mFCER1A+，人FCER1A阳性细胞的特征为mCD45+mLy-6C+mCD11b+mCD49b+hFCER1A+检测结果如表5所示。
表5流式检测结果
结果显示，在野生型C57BL/6小鼠体内仅能检测到鼠IGHE蛋白和鼠FCER1A蛋白表达，在IGHE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠体内仅能检测到人IGHE蛋白和人源化FCER1A蛋白表达，综上说明IGHE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠构建成功。
实施例4卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝诱导全身主动过敏模型(ASA)
Omalizumab由诺华公司研发(VH和VL的序列分别如SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示)，是靶向lgE人源化单克隆抗体。选择10周龄雌性IgE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠，造模组小鼠在分组后第0天(D0，i.p.)注射卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝致敏1次(空白组注射OVA/PBS)，然后在第14天i.v.注射OVA。具体的，将IGHE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠随机分为3组(n＝6)，其中G1为空白组，G2和G3为造模组。第14天进行OVA处理前3小时按照下述给药方案(见表6)注射抗人IgE抗体Omalizumab analog或PBS。经OVA处理后，每隔10min测量小鼠肛温，共测量10次，结果显示(见图14)，给药之后的0至90min内G3小鼠的体明显高于G2小鼠的体温，表明Omalizumab analog可有效缓解由于过敏造成的体温降低的症状。
综上结果表明，IGHE/FCER1A双基因人源化纯合小鼠可用于筛选、评估抗人IgE抗体的体内药效。
表6分组及给药情况
组别 数量(只) 药物 给药方式 给药次数
G1 6 PBS i.p. 1
G2 6 PBS i.p. 1
G3 6 Omalizumab analog i.p. 1
实施例5多基因人源化鼠的制备
利用本方法或制得的IGHE基因人源化小鼠和/或FCER1A基因人源化小鼠还可以制备多基因人源化小鼠模型。例如，前述实施例1、2或3中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有IL10、IL10R、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4、IL4R等基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化IGHE和/或FCER1A小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得多基因人源化小鼠模型。也可将本方法得到IGHE和/或FCER1A小鼠纯合子或杂合子与其他基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IGHE和/或FCER1A多基因修饰的小鼠，再将杂合子相互交配可以得到多基因修饰的纯合子。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (18)

1.一种FCER1A基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化FCER1A蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化FCER1A基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白胞外区至少50个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白还包含人FCER1A蛋白的信号肽的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白还包含非人动物FCER1A蛋白的跨膜区和/或胞内区，进一步优选还包含非人动物FCER1A蛋白的胞外区的部分，更优选包含SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列；或者，与SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化FCER1A基因包含人FCER1A基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选包含人FCER1A基因3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列，其中，3号外显子的部分至少包含10bp连续核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp连续核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将编码人FCER1A蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物FCER1A基因座，优选的，所述的导入为插入或替换；
优选的，所述的导入非人动物FCER1A基因座为替换非人动物FCER1A基因的相应区域，进一步优选的，所述替换非人动物相应区域为替换非人动物FCER1A基因的1号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选包含非人动物FCER1A基因5号外显子的全部或部分核苷酸序列，其中，5号外显子的部分至少包含50bp连续核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人FCER1A蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：22第1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；优选的，所述编码人FCER1A蛋白的核苷酸序列包含人FCER1A基因3号外显子的部分、4号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列，其中，3号外显子的部分至少包含10bp连续核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含1bp连续核苷酸序列；进一步优选包含SEQID NO：27所述核苷酸序列，或者，与SEQ ID NO：27所示核苷酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将FCER1A基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
优选的，所述的其他基因选自IGHE、IL10、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内还表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中还包括人或人源化IGHE基因；
优选的，所述的人源化IGHE基因包含人IGHE基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
8.一种人源化FCER1A蛋白，其特征在于，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的全部或部分。
9.根据权利要求8所述的人源化FCER1A蛋白，其特征在于，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的胞外区的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白胞外区至少50个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第26-200位或第26-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含人FCER1A蛋白的信号肽的全部或部分，优选包含人FCER1A蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，更优选包含SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：22的第1-25位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白包含的人FCER1A蛋白氨基酸序列包含SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：22的第1-200位或1-205位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白还包含非人动物FCER1A蛋白的部分，优选包含非人动物FCER1A蛋白的跨膜区和/或胞内区，进一步优选还包含非人动物FCER1A蛋白的胞外区的部分，再进一步优选包含SEQ ID NO：21的第199-250位所示氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：21的第199-250位所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FCER1A蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
10.一种人源化FCER1A基因，其特征在于，所述的人源化FCER1A基因包含人FCER1A基因的部分，优选的，所述的人源化FCER1A基因编码权利要求1-9任一所述的人源化FCER1A蛋白。
11.一种IGHE基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IGHE蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化IGHE基因。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物IGHE基因座，优选的，所述导入为插入或替换；
优选的，所述的导入非人动物IGHE基因座为替换非人动物IGHE基因的相应区域，进一步优选的，所述替换非人动物相应区域为替换非人动物IGHE基因的1号至6号外显子的全部或部分。
13.根据权利要求11或12所述的构建方法，其特征在于，所述编码人IGHE蛋白的核苷酸序列包括人IGHE基因1号至6号外显子的全部或部分，优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，或者，包含与SEQ IDNO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
优选的，所述人IGHE蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
14.根据权利要求11-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将IGHE基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
优选的，所述的其他基因选自FCER1A、IL10、IL5RA、CD247、PD-1、PD-L1、TNF-α、IL17、IL17R、IL4或IL4R中的至少一种。
15.根据权利要求1-7和11-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
16.一种人源化IGHE基因，其特征在于，所述的人源化IGHE基因包含人IGHE基因的部分，优选的，所述的人源化IGHE基因包含编码人IGHE蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码至少50个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码CH1、CH2、CH3、CH4、M1或M2中任一个或两个区域的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
优选的，所述的人源化IGHE基因包含人IGHE基因的1号至6号外显子的全部或部分核苷酸序列，优选包含人IGHE基因的起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，更优选包含SEQID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
17.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含权利要求10所述的人源化FCER1A基因和/或权利要求16所述的人源化IGHE基因，和/或，所述的细胞、组织或器官表达权利要求8所述的人源化FCER1A蛋白；或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求1-7和11-15任一所述的构建方法获得的非人动物。
18.一种权利要求8所述的人源化FCER1A蛋白，或，权利要求10所述的人源化FCER1A基因，或，权利要求1-7和11-15任一所述的构建方法获得的非人动物，或，权利要求16所述的人源化IGHE基因，或权利要求17所述的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与FCER1A和/或IGHE相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与FCER1A和/或IGHE相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与FCER1A和/或IGHE相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人FCER1A和/或IGHE信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究FCER1A和/或IGHE基因功能，研究针对人FCER1A和/或IGHE靶位点的药物、药效，研究与FCER1A和/或IGHE相关的炎症、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
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