CN115873876A - Fap基因人源化的非人动物的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种FAP基因人源化非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人FAP蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化FAP蛋白，可以作为人FAP信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化FAP蛋白、一种人源化FAP基因、一种FAP基因的靶向载体、一种FAP基因人源化的非人动物、一种FAP基因人源化的细胞以及其在生物医药领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种FAP基因人源化非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein alpha，简称FAP)是一种II型膜结合丝氨酸蛋白酶，同源二聚体具有活性，单体无活性。FAP是一种在大多数正常成人组织中低水平表达的细胞表面蛋白，但在常见癌症中过度表达，特别是在形成肿瘤基质的癌相关成纤维细胞上，而肿瘤基质是肿瘤生长所必需的。癌相关成纤维细胞上FAP的高表达通常与实体瘤的不良预后相关。在组织病理学研究中发现，90％以上的上皮肿瘤中发现了FAP阳性的癌症相关成纤维细胞，而正常组织成纤维细胞极少甚至不表达FAP，这使得FAP成为各种恶性肿瘤成像和治疗的潜在靶点。
目前，以FAP为治疗靶点的治疗策略主要有单克隆抗体、FAP酶活抑制剂、FAP激活式靶向前体药物和DNA疫苗。西罗珠单抗(Sibrotuzumab)为Boehringer Ingelheim开发的单克隆抗体，其作为最先进入临床的FAP抗体2002年进入临床，未达到预计终点项目已暂停。罗氏FAP抗体有多个研发管线，以双抗为主包括FAP-OX40双抗，FAP抗体-4-1BBL、FAP抗体-IL-2用于肿瘤治疗，FAP抗体-IL-10用于肠炎IBD的治疗。FAP抗体-4-1BBL目前处于临床I/II期。基本上均处于临床前研发阶段。FAP抗体药物和FAP酶活抑制剂在目前的临床研究中效果有限。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和治疗药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠，豚鼠，地鼠(仓鼠)，兔，犬，猴，猪，鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。大量的临床研究急需更好的动物模型。
然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠FAP蛋白的一致性为89.488％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于FAP复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发FAP相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
发明内容
本申请用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
本发明的第一方面，提供了一种人源化FAP蛋白，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
进一步优选的，所述人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的至少20个到至少760个氨基酸序列，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区至少20个到至少735个，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸序列的人FAP蛋白胞外区。
进一步优选所述人源化FAP蛋白包含非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分。
优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分包含SEQ ID NO：1的第26-31位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第26-31位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含非人动物内源FAP蛋白的胞外区的N端的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸。
在一些具体实施方式中进一步优选的，所述的人源化FAP蛋白还包含非人动物内源FAP蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
进一步优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的跨膜区包含SEQ ID NO：1的第5-25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第5-25位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
进一步优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的胞质区包含SEQ ID NO：1的第1-4位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第1-4位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
优选的，所述的人FAP蛋白的部分和非人动物内源FAP蛋白的部分直接连接或者通过接头连接，所述的接头优选为肽接头。
在一些具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白的32至760位氨基酸序列为人FAP蛋白的32至760位氨基酸序列，其余为非人动物内源FAP蛋白的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白按N端到C端的顺序包含非人动物内源FAP蛋白的胞质区的全部、跨膜区的全部、胞外区的部分，以及，人FAP蛋白的胞外区的部分。
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FAP蛋白还包含SEQ ID NO：1的第1-31位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第1-31位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第1-31位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第1-31位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列以及SEQ ID NO：1的第1-31位所示氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP基因编码的全部或部分氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含由人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列；进一步优选包含由人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上的外显子编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含由人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列；再进一步优选包含由人FAP基因的3号至26号外显子中的一种、两种或三种以上编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含由3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分编码的氨基酸序列。其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含人或人源化FAP蛋白的胞外区。优选包含人或人源化FAP蛋白的跨膜区、优选还包括人或人源化FAP蛋白的胞质区。
优选的，所述的人源化FAP蛋白的胞外区包括人FAP蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个到至少735个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、720、728、729、730或735个连续氨基酸的人FAP蛋白的胞外区；进一步优选包含729个连续氨基酸的人FAP蛋白的胞外区；更优选的，所述的人源化FAP蛋白的胞外区包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
进一步优选的，所述的人源化FAP胞外区还包括非人动物内源FAP蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少1个到至少736个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、400、500、600、700或736个连续氨基酸序列的非人动物内源FAP蛋白的胞外区；进一步优选包含6个连续氨基酸的非人动物内源FAP蛋白的胞外区；更优选的，所述的人源化FAP胞外区包含SEQ ID NO：1第26-31位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第26-31位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第26-31位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第26-31位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP胞外区包含729个连续氨基酸的人FAP蛋白的胞外区，以及，6个连续氨基酸的非人动物内源FAP蛋白的胞外区；优选的，所述的人源化FAP胞外区包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列和SEQ ID NO：1第26-31位所示氨基酸序列；其中，人FAP蛋白的胞外区的部分(SEQ ID NO：2第32-760位)和非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分(SEQ ID NO：1第26-31位)直接连接或通过接头连接，所述的接头优选为肽接头。
优选的，所述的人源化FAP跨膜区包含人FAP蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含至少1个到至少21个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸序列的人FAP蛋白的跨膜区；进一步优选的，人源化FAP跨膜区包含SEQID NO：2第5-25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第5-25位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第5-25位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第5-25位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FAP胞质区包含人FAP蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少1个到至少4个，例如1、2、3或4个连续氨基酸序列的人FAP蛋白的胞质区；进一步优选的，人源化FAP胞质区包含SEQ ID NO：2第1-4位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：2第1-4位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-4位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-4位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含下列组中任一种：
1)人或人源化FAP胞外区、非人动物内源FAP蛋白的跨膜区，和，非人动物内源FAP蛋白的胞质区；
2)非人动物内源FAP蛋白的胞外区、人或人源化FAP跨膜区，和，非人动物内源FAP蛋白的胞质区；
3)非人动物内源FAP蛋白的胞外区、非人动物内源FAP蛋白的跨膜区，和，人或人源化FAP胞质区；
4)人或人源化FAP胞外区、人或人源化FAP跨膜区，和，非人动物内源FAP蛋白的胞质区；
5)人或人源化FAP胞外区、非人动物内源FAP蛋白的跨膜区，和，人或人源化FAP胞质区；
6)非人动物内源FAP蛋白的胞外区、人或人源化FAP跨膜区，和，人或人源化FAP胞质区；
7)人或人源化FAP胞外区、人或人源化FAP跨膜区，和，人或人源化FAP胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包括非人动物内源FAP蛋白的胞质区(优选为SEQ ID NO：1第1-4位)、非人动物内源FAP蛋白的跨膜区(优选为SEQ IDNO：1第5-25位)、非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分(优选为SEQ ID NO：1第26-31位)，以及，人FAP蛋白的胞外区的部分(优选为SEQ ID NO：2第32-760位)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包括非人动物内源FAP蛋白(SEQ ID NO：1)的32-761位氨基酸序列被替换获得的人源化FAP蛋白，优选的，所述的人源化FAP蛋白包括用人FAP蛋白(SEQ ID NO：2)的第32-760位氨基酸序列区替换非人动物内源FAP相应部分获得的人源化FAP蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11的全部或部分；
B)与SEQ ID NO：11的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：11的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述人源化FAP蛋白中来源于人FAP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
优选的，所述人源化FAP蛋白中来源于非人动物内源FAP蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示或与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列同一性至少为、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
优选的，所述人源化FAP蛋白包含至少200、300、400、500、600、700、720或729个氨基酸组成的序列与人FAP蛋白的相应氨基酸序列相同，进一步优选的，所述的至少200、300、400、500、600、700、720或729个氨基酸组成的序列来源于人源化FAP蛋白的胞外区。
在一个具体实施方式中，所述人源化FAP蛋白包含至少729个氨基酸组成的序列与人FAP蛋白的相应氨基酸序列相同。
本发明的第二方面，提供了一种编码如上所述人源化FAP蛋白的核酸。
本发明的第三方面，提供了一种人源化FAP基因。
优选的，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的部分。
优选的，所述的人源化FAP基因编码如上所述的人源化FAP蛋白。
优选的，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分。优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上。进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分。优选包含人FAP基因的3号至26号外显子中的一种、两种或三种以上。更优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分。优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子。其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，所述的人源化FAP基因包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FAP基因包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FAP基因还包含非人动物内源FAP基因的部分，所述非人动物内源FAP基因的部分为非人动物内源FAP基因的1至26号外显子的全部或部分；优选为非人动物内源FAP基因的1至3号外显子的全部或部分以及26号外显子的全部或部分；在一些具体实施方式中，所述非人动物内源FAP基因的部分为非人动物内源FAP基因的1至2号外显子的全部、2-3号内含子、3号外显子的部分和26号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP基因从5’端到3’端依次包含非人动物内源FAP基因的部分(优选为非人动物内源FAP基因的1号至2号外显子的全部、3号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子)、人FAP基因的部分(优选为人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包括3-4号内含子和/或25-26号内含子)、非人动物内源FAP基因的部分(优选为非人动物内源FAP基因26号外显子的部分)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP基因从5’端到3’端依次包含非人动物内源FAP基因的部分(优选为非人动物内源FAP基因的1号至2号外显子的全部、3号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子)、SEQ ID NO：5或编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列、非人动物内源FAP基因的3’UTR。
在一些具体实施方式中，所述的人源化FAP基因还包含抗性基因；优选的，所述的抗性基因位于人源化FAP基因25号至26号外显子之间；优选的，所述的人源化FAP基因还包含抗性基因两侧的两个同向排列的Frt重组位点。在一个具体实施方式中，所述的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述的人源化FAP基因包含编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人FAP蛋白胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，更进一步优选包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。
再进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个到至少735个，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列的核苷酸序列。
再进一步优选包含编码N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的人FAP蛋白的胞外区的核苷酸序列。更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FAP基因包含编码非人动物内源FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码非人动物内源FAP蛋白的部分胞外区、全部跨膜区和全部胞质区的核苷酸序列，其中，非人动物内源FAP蛋白的部分胞外区至少包含N端0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个连续氨基酸的非人动物内源FAP蛋白胞外区，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：1第1-31位氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第1-31位氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第1-31位氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第1-31位氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP基因包含编码SEQ ID NO：1第1-4、1-25、5-25或者1-31位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FAP基因在非人动物中通过调控元件进行调控，进一步优选的，所述的调控元件是内源性或者外源性。
优选的，所述的调控元件包括启动子。
优选的，所述的人源化FAP基因包括非人动物内源FAP基因的5’UTR和/或3’UTR。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP基因转录的mRNA包含下列组中的一种：
(a)SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的全部或部分；
(b)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(c)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
(d)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化FAP基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
本发明的第四方面，提供了一种靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上的组合，进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分，更优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选包含3-4号内含子和/或25-26号内含子，其中，人FAP基因的3号外显子的部分包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列的核苷酸序列；再优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人或人源化FAP基因的核苷酸序列。
优选的，所述的A)至D)的任一核苷酸序列为供体DNA序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：6和/或SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：8和/或SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，所述的靶向载体还包含抗性基因；优选的，所述的抗性基因位于人FAP基因25号至26号外显子之间；优选的，所述的靶向载体还包含抗性基因两侧的两个同向排列的Frt重组位点。在一个具体实施方式中，所述的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
所述的5’臂(或5’同源臂)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。其选自非人动物内源FAP基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ IDNO：3。
所述的3’臂(或3’同源臂)与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。其选自非人动物内源FAP基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列包含SEQ IDNO：4。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物内源FAP基因的1号至26号外显子上，进一步优选位于非人动物内源FAP基因的3号至26号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物3’UTR。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物5’UTR。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第五方面，提供了一种靶向非人动物内源FAP基因的sgRNA。
优选的，所述sgRNA的序列在待改变的非人动物内源FAP基因上的靶序列上。
本发明的第六方面，提供了一种编码上述靶向非人动物内源FAP基因sgRNA的DNA分子。
优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述靶向非人动物内源FAP基因的sgRNA载体。
本发明的第八方面，提供了一种包含上述靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体、上述靶向非人动物内源FAP基因的sgRNA、上述DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第九方面，提供了上述靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体、上述靶向非人动物FAP基因的sgRNA、上述DNA分子、上述sgRNA载体和/或上述细胞在FAP基因修饰中的应用。
优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十方面，提供了一种FAP基因人源化的细胞，所述细胞表达上述任一的人源化FAP蛋白，和/或，所述细胞的基因组中包含人FAP基因的部分或上述的核酸或上述的人源化FAP基因。
优选的，所述的细胞还包含其他基因修饰，优选的，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10中的至少一种。
优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
本发明的第十一方面，提供了一种FAP基因人源化的细胞的制备方法，所述的制备方法包括将包含下列组中的任一种核苷酸序列导入细胞：
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上的组合，进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分，更优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子，其中，人FAP基因的3号外显子的部分包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列；更优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列的核苷酸序列；更进一步优选，包含编码人FAP蛋白的胞外区的至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列的核苷酸序列；再优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人或人源化FAP基因的核苷酸序列。
本发明的第十二方面，提供了一种FAP基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化FAP蛋白，和/或，所述非人动物基因组中包含上述的核酸，或，人FAP基因的部分，或，人源化FAP基因。
优选的，所述的人源化FAP蛋白为上述任一所述的人源化FAP蛋白。
优选的，所述的人源化FAP基因为上述任一所述的人源化FAP基因。
优选的，所述的非人动物的内源FAP蛋白表达降低或缺失。
在本发明的一个具体实施方式中优选的，所述的非人动物基因组中包含上述的核酸或包含上述的人源化FAP基因。
所述的非人动物的基因组中包含人FAP基因的全部或部分。优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分。进一步优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上，更进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分。更进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子。其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中再优选的，所述的非人动物基因组中包含SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物基因组中包含编码人或人源化FAP蛋白全部或部分的核苷酸序列。优选包含编码人或人源化FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人FAP蛋白胞外区的全部或部分的核苷酸序列。更进一步优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸的核苷酸序列；再优选包含编码人FAP蛋白胞外区至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸的人FAP蛋白的胞外区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物包括将下列组中任一种核苷酸序列导入非人动物内源FAP基因座上构建获得：
A)人FAP基因的部分，优选人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上的组合，进一步优选人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分，再进一步优选人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子，其中，人FAP基因的3号外显子的部分包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；更优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ IDNO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人或人源化FAP基因的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列、人FAP基因的部分或上述的人源化FAP基因。
优选的，编码所述人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列或者所述人或人源化FAP基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源FAP基因座处的内源性调控元件。
优选的，所述的非人动物通过上述靶向载体构建。
优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，优选的，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10中的至少一种。
优选的，所述FAP基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，所述FAP基因和/或所述其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第十三方面，提供了一种FAP基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化FAP蛋白，和/或，所述非人动物基因组中包含上述的核酸，或，人FAP基因的部分，或，人源化FAP基因。
优选的，所述的非人动物的内源FAP蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含上述的人源化FAP基因。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人FAP基因的全部或部分。优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分。优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上，进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分。更优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分。优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子。其中，人FAP基因的3号外显子的部分包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，再优选的，所述的非人动物基因组中包含SEQID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人或人源化FAP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。优选包含编码人FAP蛋白胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人FAP蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸的核苷酸序列；再优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸的核苷酸序列。再进一步优选包含编码人FAP蛋白的N端去除0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸的胞外区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ IDNO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
优选的，所述的构建方法包括将包含下列组中任一种核苷酸序列导入非人动物FAP基因座上。
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子中的一种、两种或三种以上的组合，进一步优选包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分，更优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子，其中，人FAP基因的3号外显子的部分包含至少50bp到至少99bp，例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或至少99bp的连续核苷酸序列；或者，人FAP基因的3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人FAP基因的26号外显子的部分包含至少50bp到至少397bp，例如50、60、70、80、90、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或397bp连续核苷酸序列，或者，人FAP基因的26号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白至少20个到至少760个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列的核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的至少20个到至少735个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列的核苷酸序列；再优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
C)编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人或人源化FAP基因的核苷酸序列。
优选的，所述的导入为插入或替换。
其中，所述的插入为在不删除核苷酸的前提下，将目的片段置于相邻两个碱基之间，其中，目的片段例如人FAP基因、人源化FAP基因、编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列、人FAP基因与非人动物内源FAP基因拼接获得的核苷酸序列。当然也可以为人FAP基因的部分核苷酸序列。
在一些具体实施方式中，导入非人动物FAP基因座上的核苷酸序列还包含抗性基因；优选的，所述的抗性基因位于人FAP基因25号和26号外显子之间；优选的，还包含抗性基因两侧的两个同向排列的Frt重组位点。在一个具体实施方式中，所述的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
进一步优选的，所述的导入非人动物FAP基因座上的核苷酸序列还包含与SEQ IDNO：8和/或SEQ ID NO：9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的导入非人动物FAP基因座上的核苷酸序列还包含与SEQ IDNO：6和/或SEQ ID NO：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
优选的，所述导入包含A)-D)的任一核苷酸序列可操作的连接到内源调控元件或者外源调控元件。
优选的，所述的编码人FAP或人源化FAP蛋白的核苷酸序列、人FAP基因的部分或人源化FAP基因在非人动物中通过调控元件进行调控，所述的调控元件是内源性或者外源性。优选的，所述的调控元件包括但不限于启动子。
优选的，内源性调控元件来源于非人动物内源FAP基因，外源性调控元件来源于人FAP基因。
优选的，所述的构建方法包括修饰非人动物内源FAP基因的编码框，将包含如上所述的人FAP基因的核苷酸序列插入非人动物内源FAP基因内源调控元件之后，其中，所述的修饰非人动物内源FAP基因的编码框可以采用敲除非人动物内源FAP基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物内源FAP蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能；进一步优选的，所述的敲除为敲除非人动物始于内源FAP基因3号外显子内部，终于内源FAP基因26号外显子内部的核苷酸序列。
优选的，根据具体实施方式的需要，所述的插入还可能破坏非人动物内源FAP基因的编码框或破坏插入序列之后的内源FAP基因的编码框，随后进行插入操作。或者，所述的插入步骤既可以给内源FAP基因做成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
优选的，所述的插入位点为非人动物内源FAP基因的内源调控元件之后。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列或者人或人源化FAP基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物内源FAP基因内源调控元件之后，所述的辅助序列可以为具有终止功能的序列，使得FAP基因人源化的动物模型体内表达人或人源化FAP蛋白，而不表达非人动物内源FAP蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列可以为WPRE和/或STOP序列。
其中，所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换。所述的相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物内源FAP基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。
优选的，所述的导入非人动物内源FAP基因座为替换非人动物相应区域。
进一步优选替换非人动物基因组中编码非人动物内源FAP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，非人动物内源FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分被替换，进一步优选3号至26号外显子的全部或部分被替换，更优选3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分被替换，优选3-4号内含子和/或25-26号内含子也被替换。
优选的，非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列被替换，进一步优选编码SEQ ID NO：1第32-761位所示氨基酸序列的核苷酸序列被替换。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含编码人FAP蛋白胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物内源编码FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含编码人FAP蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物内源编码FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分插入或替换非人动物内源FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分插入或替换非人动物内源FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分插入或替换非人动物内源FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部26号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含人FAP基因的基因组DNA、cDNA序列或CDS序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1第32-761位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列插入或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1第32-761位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
所述的导入非人动物内源FAP基因座为插入非人动物内源FAP基因座。优选编辑非人动物内源FAP基因的编码框使得非人动物内源FAP蛋白的表达降低或者缺失，然后将编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列插入非人动物内源FAP基因座，优选插入非人动物内源FAP基因的1号至26号外显子的任一位置。
优选将编码人FAP蛋白的胞外区的核苷酸序列插入编码非人动物内源FAP跨膜区之后，优选插入编码非人动物FAP跨膜区与胞外区之间。
优选将人FAP基因3号至26号外显子的核苷酸序列插入非人动物内源FAP基因3号外显子处。
优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞(优选为胚胎干细胞)中，将阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FAP基因基因人源化的非人动物。
优选的，为提高重组效率，还可以使用上述的靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体与上述sgRNA一起进行非人动物的构建。
在一个具体实施方式中，使用上述的靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体、上述sgRNA及Cas9蛋白进行非人动物的构建。将上述靶向载体、上述sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FAP基因基因人源化的非人动物。
在一个具体实施方式中，使用靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，所述的构建方法包括将FAP基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10中的至少一种。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10蛋白中的至少一种。
优选的，所述的人或人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，所述的人或人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
本发明的第十四方面，提供了一种FAP基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选缺失3号至26号外显子的部分，进一步优选缺失3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，更优选还缺失3-4号内含子和/或25-26号内含子。
本发明的第十五方面，提供了一种FAP基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体和/或上述sgRNA进行非人动物的制备。
本发明的第十六方面，提供了一种FAP基因缺失的细胞，所述的细胞缺失内源FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选缺失3号至26号外显子的部分，进一步优选缺失3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，更优选还缺失3-4号内含子和/或25-26号内含子。
本发明的第十七方面，提供了一种FAP基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向非人动物内源FAP基因的靶向载体和/或上述sgRNA进行FAP基因缺失的细胞的构建。
本发明的第十八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：
I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10修饰的非人动物中的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为纯合的。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰(优选替换)基因座为杂合的。
本发明的第十九方面，提供了一种上述构建方法获得的FAP基因人源化的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或其子代或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十一方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述的FAP基因人源化的非人动物或其子代或者采用上述的构建方法构建的非人动物或其子代的步骤。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第二十二方面，提供了上述的FAP基因人源化的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代、或者上述的构建方法获得的FAP基因人源化的非人动物、或者上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。
本发明的第二十三方面，提供了一种所述的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达所述的人或人源化FAP蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含上述的核酸或上述的人或上述的人源化FAP基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，来源于上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第二十四方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人或人源化FAP蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组中包含上述的核酸，或，上述的人或人源化FAP基因，或者，所述的瘤组织来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物，或者上述的动物模型。
本发明的第二十五方面，提供了一种FAP基因人源化的非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化FAP基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化FAP蛋白的核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的人源化FAP基因为上述的人源化FAP基因。
优选的，所述的人源化FAP蛋白为上述的人源化FAP蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源FAP基因座处用人FAP基因的基因组片段(优选人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选人FAP基因的3号至26号外显子的全部或部分，更优选人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子)置换非人动物内源FAP基因的基因组片段以形成经修饰的FAP基因。
优选的，所述的被置换的非人动物内源FAP基因的基因组片段包含非人动物内源FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含3号至26号外显子的部分，更优选包含3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或25-26号内含子。
优选的，所述的经修饰的FAP基因编码人源化FAP蛋白。
优选的，所述的经修饰的FAP基因表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的基因组中包含人源化的内源FAP基因座，在该基因座中，内源FAP基因座的片段已被缺失并替换为对应的人FAP序列。
优选的，所述的人源化的FAP基因座包含内源FAP启动子，其中，人FAP序列可操作的连接到内源FAP启动子。
优选的，内源FAP基因座的1号至26号外显子的全部或部分(优选为3号至26号外显子的全部或部分，进一步优选为3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分)已被缺失并被替换为对应的人FAP序列。
在本发明的一个具体实施方式中，内源FAP基因座的编码胞外区的全部或部分核苷酸序列已被缺失并被替换为对应的人FAP序列。
在本发明的一个具体实施方式中，内源FAP基因的跨膜区、胞质区、3’UTR和/或5’UTR尚未被缺失并尚未被替换为对应的人FAP序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十六方面，提供了一种上述的人源化FAP蛋白、上述的人源化FAP基因、上述的非人动物或其子代、上述的细胞、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型、上述的细胞、组织或器官、上述的荷瘤后的瘤组织的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与FAP相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与FAP相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与FAP相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人FAP信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究FAP基因功能，研究针对人FAP靶位点的药物、药效，研究与FAP相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型用于人FAP特异性调节剂的筛选。
本发明的第二十八方面，提供了一种人FAP特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、或者上述的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述人FAP特异性调节剂的筛选方法可以为治疗目的或非治疗目的。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第二十九方面，提供了一种人用药物筛选方法或干预方案的评价方法，所述的人用药物筛选方法或评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体给与候选药物，或，施加干预方案，对给与候选药物，或，施加干预方案后的个体进行药效检测和/或比较，或，肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。
优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物包括靶向药物，更优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述人用药物筛选方法或干预方案的评价方法可以为治疗目的或非治疗目的。人用药物筛选方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。同样的，干预方案的评价方法是对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型在制备人FAP特异性调节剂中的用途。
本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
本发明所述的FAP基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化FAP蛋白，可用于针对人FAP靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究FAP蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化FAP蛋白”，包含来源于人FAP蛋白的部分和非人FAP蛋白的部分。其中，所述的“人FAP蛋白”同人FAP蛋白的全部，即其氨基酸序列与人FAP蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人FAP蛋白的部分”，为连续或间隔的5-760个氨基酸序列与人FAP蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔10-729或10-735个，更优选为连续10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、729、735、750、760个氨基酸序列与人FAP蛋白的氨基酸序列一致。
本发明所述的“人FAP蛋白的跨膜区的全部”、“人FAP蛋白的胞质区的全部”或“人FAP蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人FAP蛋白的跨膜区、胞质区或胞外区的全长氨基酸序列一致。
本发明所述的“非人动物内源FAP蛋白的部分”，为连续或间隔5-761个氨基酸序列与非人动物内源FAP蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10-31个，更优选为5、10、20、25、30、31、50、100、200、300、400、500、600、700、750、761个氨基酸序列与非人动物内源FAP蛋白的氨基酸序列一致。
本发明所述的“人源化FAP基因”，包含来源于人FAP基因的部分和非人FAP基因的部分。其中，所述的“人FAP基因”同人FAP基因的全部，即其核苷酸序列与人FAP基因的全长核苷酸序列一致。
在一个具体实施方式中，所述的“人FAP基因的部分”为连续或间隔的20-72789bp核苷酸序列与人FAP基因的核苷酸序列一致，优选为100-55641或100-2190或100-2696个，更优选为20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、2190、2696、4000、6000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、55641、60000、70000、72000、72789bp核苷酸序列与人FAP基因的核苷酸序列一致。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人FAP基因的3号外显子的部分，包含连续或间隔的5-99bp，优选10-96bp，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99bp核苷酸序列与人FAP基因的3号外显子核苷酸序列一致。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如“1号至3号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子和3号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“非人动物内源FAP基因的部分”为连续或间隔20-73085bp核苷酸序列与非人动物内源FAP基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔20-55014或20-2456或20-264或20-2193bp，更优选为连续20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000或73000个核苷酸序列与非人动物内源FAP基因的核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成人源化FAP基因的非人动物内源FAP基因的部分包含非人动物内源FAP基因3号外显子的部分和/或26号外显子的部分。优选的，所述的非人动物内源FAP基因3号外显子的部分至少包含2个核苷酸。优选的，所述的非人动物内源FAP基因26号外显子的部分至少包含非编码区的核苷酸序列。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“FAP基因座”表示FAP基因1号至26号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的FAP基因座可以是FAP基因1号至26号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“三个以上”包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个或八个等。
本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，VolumesI and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
本发明有益的技术效果在于：
利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的基因人源化动物模型，使其体内表达人源蛋白，作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
利用基因人源化动物模型建立各种疾病模型，可以进行抗人抗体药物的药理药效评价。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠FAP基因和人FAP基因座对比示意图(非按比例)；
图2：小鼠FAP基因人源化改造示意图(非按比例)；
图3：FAP基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图4：Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型；
图5：FAP基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图6：FAP基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，M为Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
StuI、AvrII、BglII、DraIII、ScaI酶购自NEB，货号分别为R0187S、R0174S、R0144S、R3510S、R3122S；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心。
实施例1FAP基因人源化小鼠的制备
小鼠FAP基因(NCBI Gene ID：14089，Primary source：MGI:109608，UniProt：P97321-1，位于2号染色体NC_000068.8的第62331280至62404365位，基于转录本NM_007986.3及其编码蛋白NP_032012.1(SEQ ID NO：1))和人FAP基因(NCBI Gene ID：2191，Primary source：HGNC:3590，UniProt ID：Q12884-1，位于2号染色体NC_000002.12的第162170684至162243472位，基于转录本NM_004460.5及其编码蛋白NP_004451.2(SEQ IDNO：2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源FAP基因座引入编码人FAP蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化FAP蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠FAP基因调节元件的控制下，用包含人FAP基因的3号外显子的部分序列至26号外显子的部分序列约55.6kb替换小鼠3号外显子的部分序列至26号外显子的部分序列约55.0kb，得到人源化FAP基因座示意图如图2所示，实现对小鼠FAP基因的人源化改造。
设计如图3所示的打靶策略，图3中显示了靶向载体上含有小鼠FAP基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人FAP序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ IDNO：3)与NCBI登录号为NC_000068.8的第62386542至62390778位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000068.8的第62326474至62331527位核苷酸序列相同。A片段上人FAP的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000002.12的第162170979至162226619位核苷酸序列相同；人FAP序列上游与小鼠的连接设计为：
其中序列/>
中最后一个“T”是小鼠最后一个核苷酸，序列“CATA”中“C”是人第一个核苷酸。人FAP序列下游与小鼠的连接设计为/>
其中序列/>
中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“ACCA”中的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与人基因的连接设计为
其中序列/>
中的“C”是人的最后一个核苷酸，序列“CATC”的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人基因的连接设计为/>
其中序列/>
中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列/>
中的“T”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠FAP的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。
鉴于人FAP具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆，再进行Southern Blot(分别用StuI、AvrII、BglII、DraIII、ScaI酶消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，检测结果如图4所示1-A11、1-C04、1-C08、1-D04、2-C02、2-D02、2-E02、2-E07和2-E08均为阳性的克隆，进一步测序验证为阳性的且无随机插入的克隆进行下一步实验。
表1：具体探针及目的片段长度
| 限制性内切酶 | 探针 | 野生型片段 | 重组序列片段 |
| AvrII | A1 Probe | — | 17.5kb |
| BglII | A1 Probe | — | 18.6kb |
| DraIII | A2 Probe | — | 20.6kb |
| ScaI | A2 Probe | — | 11.0kb |
| StuI | Neo Probe(3’) | — | 13.0kb |
其中，PCR测定包括下述引物：
A-F1：5’-CATGGCTCTGGATTCATAGTTGGAGTC-3’(SEQ ID NO：28),
A-R1：5’-CATGACCCTTAAAGGGTTCATTGTCAG-3’(SEQ ID NO：12),
A-F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：13),
A-R2：5’-GTACAGCCTTGGTACTGGAGTTAGAG-3’(SEQ ID NO：14)；
Southern Blot检测包括如下探针引物：
A1探针(A1 Probe)：
A1 Probe-F：5’-CGTGACCTCGGTGATCAATCTC-3’(SEQ ID NO：15)，
A1 Probe-R：5’-CCAAGATTGGCCCGCTAGGCATG-3’(SEQ ID NO：16)；
A2探针(A2 Probe)：
A2 Probe-F：5’-CCACAATTCCTTATTCCTCCACC-3’(SEQ ID NO：17)，
A2 Probe-R：5’-CTCCTATACTGTCTAATACTTCATGGAAAC-3’(SEQ ID NO：18)；
Neo探针(Neo Probe(3’))：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：19)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：20)；
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到FAP基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01和F1-02的小鼠为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的FAP基因人源化小鼠。
表2：引物名称及具体序列
可通过常规方法检测阳性小鼠体内人或人源化FAP蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。检测结果显示，在C57BL/6小鼠中检测到鼠FAP蛋白，在FAP纯合子小鼠中仅可检测到人源化FAP蛋白。结果表明，人源化FAP蛋白在FAP人源化纯合子小鼠体内可以正常表达。
实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的FAP小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化FAP小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得FAP与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的FAP小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化FAP与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人FAP和其它基因调节剂的体内药效验证等。
实施例3药效实验
利用本方法制得的FAP人源化小鼠可以用于评估靶向人FAP的抗体药物的药效。例如，取FAP人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人FAP的抗体药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (21)
1.一种FAP基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化FAP蛋白，和/或，所述非人动物基因组中包含人FAP基因的部分或人源化FAP基因；
优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分；进一步优选包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分；
进一步优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白胞外区的全部或部分；更优选包含人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更进一步优选包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
优选的，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的部分；
优选的，所述的人FAP基因的部分包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物内源FAP蛋白表达降低或缺失。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将包含下列组中的任一种核苷酸序列导入非人动物内源FAP基因座：
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)编码人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人源化FAP基因的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，人FAP基因的部分或人源化FAP基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。
5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入；优选的，所述的导入非人动物内源FAP基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的非人动物内源FAP基因的3号至26号外显子全部或部分被替换。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向载体进行非人动物的构建；
优选的，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)编码人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)人源化FAP基因的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；其中，
所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂包含SEQ ID NO：3；
所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述的3’臂包含SEQ ID NO：4。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法进一步包括将FAP基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4-1BB、IL-2、OX40或IL-10中的至少一种；
优选的，所述的人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；
优选的，所述的人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。
9.一种人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分。
10.根据权利要求9所述的人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选包含人FAP蛋白胞外区的全部或部分；进一步优选包含人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更优选包含SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白还包含非人动物内源FAP蛋白的部分，优选包含非人动物内源FAP蛋白的跨膜区和/或胞质区；进一步优选包含非人动物内源FAP蛋白胞外区的部分。
12.根据权利要求9-11任一所述的人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：11的全部或部分；
B)与SEQ ID NO：11的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
C)与SEQ ID NO：11的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
13.一种人源化FAP基因，其特征在于，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的部分；优选的，所述的人源化FAP基因编码权利要求9-12任一所述的人源化FAP蛋白。
14.根据权利要求13所述的人源化FAP基因，其特征在于，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分；其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；更优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。
15.根据权利要求13或14所述的人源化FAP基因，其特征在于，所述的人源化FAP基因还包含非人动物内源FAP基因的部分，优选包含非人动物内源FAP基因的1号至2号外显子的全部、3号外显子的部分和26号外显子的部分，其中，非人动物FAP基因的3号外显子的部分至少包含1bp连续核苷酸序列，非人动物FAP基因的26号外显子的部分至少包含50bp连续核苷酸序列。
16.根据权利要求13-15任一所述的人源化FAP基因，其特征在于，所述的人源化FAP基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：
(A)SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的全部或部分；
(B)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
(C)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
(D)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
17.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：
A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32-760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
C)编码权利要求9-12任一所述的人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，
D)权利要求13-16任一所述的人源化FAP基因的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；其中，
所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂包含SEQ ID NO：3；
所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述的3’臂包含SEQ ID NO：4。
19.根据权利要求11-12任一所述的人源化FAP蛋白、权利要求15-16任一所述的人源化FAP基因、权利要求17-18所述的靶向载体、权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
20.一种细胞、组织、瘤组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织、瘤组织或器官表达权利要求9-12任一所述的人源化FAP蛋白，或者，所述的细胞、组织、瘤组织或器官的基因组中包含权利要求13-16任一所述的人源化FAP基因，或者，所述的细胞、组织、瘤组织或器官来源于权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物。
21.一种权利要求9-12任一所述的人源化FAP蛋白，或，权利要求13-16任一所述的人源化FAP基因，或，权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物，或，权利要求20所述的细胞、组织、瘤组织或器官的应用，
其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与FAP相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与FAP相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与FAP相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人FAP信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究FAP基因功能，研究针对人FAP靶位点的药物、药效，研究与FAP相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
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