CN115850442A - 一种tslp和/或tslpr基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

一种tslp和/或tslpr基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115850442A
CN115850442A CN202211182223.5A CN202211182223A CN115850442A CN 115850442 A CN115850442 A CN 115850442A CN 202211182223 A CN202211182223 A CN 202211182223A CN 115850442 A CN115850442 A CN 115850442A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tslpr
gene
humanized
nucleotide sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211182223.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张淑金
聂琰晖
常佳慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Publication of CN115850442A publication Critical patent/CN115850442A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G01N2800/122—Chronic or obstructive airway disorders, e.g. asthma COPD
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/202—Dermatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种TSLP和/或TSLPR基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化TSLP和/或TSLPR蛋白、一种人源化TSLP和/或TSLPR基因、一种TSLP和/或TSLPR基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人TSLP和/或TSLPR蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化TSLP和/或TSLPR蛋白，可以作为人TSLP和/或TSLPR信号机理研究、炎症、肿瘤或免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

一种TSLP和/或TSLPR基因人源化的非人动物及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种TSLP和/或TSLPR基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一种上皮细胞来源的Ⅰ型细胞因子，属于IL-2细胞因子家族。TSLP主要在活化的肺和肠上皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞中表达。树突状细胞(DC)、肥大细胞和的其他免疫细胞也能产生TSLP。TSLP在免疫反应的调节和造血细胞的分化中起着重要作用。TSLP能激活小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的表达，诱导人的B细胞增殖和分化，增强DC细胞和初始T细胞的成熟与增殖。TSLP通过与由IL-7受体α链(IL-7Rα)和TSLP受体链(TSLPR)组成的异源二聚体受体结合而发挥其生物学活性，其与共同受体γ链(γc)密切相关。
TSLPR又称为细胞因子受体样因子2(CRLF2)，是胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymicstromal lymphopoietin，TSLP)的受体，属于血细胞生成素家族。TSLPR在心脏、骨骼肌、肾脏和肝脏中有表达，在成熟树突状细胞、CD4+和CD8+T细胞、B细胞、肥大细胞、自然杀伤T细胞(NKT)中也可检测到TSLPR的表达。虽然TSLPR与TSLP的亲和力较低，但它与IL-7Rα结合后，可生成与TSLP高亲和力的结合位点，并触发信号传导。
TSLP和TSLPR表达与许多疾病相关。TSLP表达与Th2调节的过敏性疾病有关，如哮喘和特异性皮炎。研究表明在OVA诱导的气道炎症模型中，小鼠肺中的TSLP上调，而在TSLPR缺陷的小鼠中的症状却明显减轻。越来越多的证据表明，TSLP和TSLPR参与了慢性炎症、自身免疫疾病和癌症。关于TSLP/TSLPR与癌症的报道，有报道说TSLP在肿瘤微环境中，通过表达细胞因子促进肿瘤中Th2样环境的作用，促进肿瘤生长。
针对TSLP和TSLPR，目前约有40多款在研药物，适应症多集中在哮喘和特异性皮炎，研发进展最快的抗体药物Tezepelumab是一种IgG2型全人源的抗TSLP单克隆抗体，由MedImmune与安进公司合作开发。临床数据表明，该抗体药能结合并阻止TSLP与受体复合物相互作用，从而阻止免疫细胞释放促炎性细胞因子，进而防止哮喘恶化并控制哮喘。2018年，FDA正式通过Tezepelumab突破性治疗药物认定，用于治疗没有嗜酸性粒细胞表型的严重哮喘患者。目前该药正在临床Ⅲ期试验中的适应症包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、重症哮喘和特异性皮炎。此外，研究报道，在肿瘤微环境中，作为屏障组织，TSLP诱导了单核细胞来源的树突状细胞MoDC的成熟，去除TSLP或shRNA诱导的TSLP表达下调都显著降低了乳腺癌发展、肺转移和胰腺肿瘤的生长速度。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，TSLP的人鼠同源性仅为34.4％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于TSLP复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发TSLP相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化TSLPR蛋白，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含1号至6号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、50、70、75、76、77、78、79、80、90、94bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸或从编码信号肽N端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、111、112、113、114、115、120、121bp的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人TSLPR蛋白胞外区，例如包含至少50、70、90、100、150、170、200、205、206、207、208、209个连续氨基酸的人TSLPR蛋白胞外区；所述的人源化TSLPR蛋白胞外区包含SEQ ID NO：8第23-231位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第23-231位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第23-231位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第23-231位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白还包含人TSLPR蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含至少10个连续氨基酸的人TSLPR蛋白跨膜区，例如包含至少10、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸的人TSLPR蛋白跨膜区；所述的人源化TSLPR蛋白跨膜区包含SEQ ID NO：8第232-252位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第232-252位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第232-252位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第232-252位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白还包含人TSLPR蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含至少10个连续氨基酸的人TSLPR蛋白信号肽，例如包含至少10、15、16、17、18、19、20、21、22个连续氨基酸的人TSLPR蛋白信号肽；所述的人源化TSLPR蛋白信号肽包含SEQ ID NO：8第1-22或2-22位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：8第1-22或2-22位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-22或2-22位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-22或2-22位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白还包含人TSLPR蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化TSLPR蛋白还包含1个氨基酸的人TSLPR蛋白胞质区，更优选的，包含SEQ ID NO：8第253位所示的氨基酸。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白部分包含SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白还包含非人动物TSLPR蛋白的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白包含非人动物TSLPR蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的非人动物TSLPR蛋白胞质区，例如包含至少50、70、90、100、101、102、103、104、105、106个连续氨基酸的非人动物TSLPR蛋白胞质区。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：19所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：19所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
在一个具体的实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、猪、兔子或猴子。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠或大鼠。
本发明的第二方面，提供了一种编码上述的人源化TSLPR蛋白的人源化TSLPR基因。
本发明的第三方面，提供了一种人源化TSLPR基因，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的部分。
优选的，所述的人源化TSLPR基因编码上述的人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、50、70、75、76、77、78、79、80、90、94bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸或从编码信号肽N端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、111、112、113、114、115、120、121bp的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因包含SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR基因包含编码人TSLPR蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人TSLPR蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选还包含编码人TSLPR蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的人源化TSLPR基因包含编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR基因还包含非人动物TSLPR基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物TSLPR基因的6号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选包含6号外显子的部分、7号外显子的全部和8号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因包含SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因包含编码非人动物TSLPR蛋白的胞质区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的非人动物TSLPR蛋白的胞质区包含至少50个连续氨基酸的非人动物TSLPR蛋白胞质区，例如包含至少50、70、90、100、101、102、103、104、105、106个连续氨基酸的非人动物TSLPR蛋白胞质区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因还包含编码SEQ IDNO：7第255-359位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因还包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLPR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：18所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：18所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
E)包含SEQ ID NO：34、35和/或40所示的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的人源化TSLPR基因还包含P2A序列，所述的P2A序列如SEQ ID NO：17所示。
优选的，所述的人源化TSLPR基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
在一个具体的实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、猪、兔子或猴子。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠或大鼠。
本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人TSLPR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的跨膜区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，再进一步优选的，编码SEQ IDNO：8第1-253或2-253位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化TSLPR基因的核苷酸序列；或，
D)人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含1号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、50、70、75、76、77、78、79、80、90、94bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸或从编码信号肽N端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、111、112、113、114、115、120、121bp的核苷酸序列。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：15、69或16所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述B)中还包括编码非人动物TSLPR蛋白的核苷酸序列，进一步优选为编码SEQ ID NO：7第255-359位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的D)中还包括非人动物TSLPR基因的部分，优选为非人动物TSLPR基因的6号至8号外显子的全部或部分。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物TSLPR基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物TSLPR基因的6号至8号外显子的全部或部分，更进一步优选包含6号外显子的部分、7号外显子的全部和8号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物TSLPR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9、11或20所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物TSLPR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10、12或21所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：34、35、36、37和/或40。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物TSLPR基因的1号至8号外显子上，进一步优选位于非人动物TSLPR基因的1号外显子或2号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第五方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物TSLPR基因，其靶位点位于TSLPR基因的1号外显子或2号外显子上。
优选的，所述的sgRNA在TSLPR基因上的靶序列如SEQ ID NO：41或53所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgRNA靶向2号外显子序列如SEQ ID NO:41所示，靶向1号外显子序列如SEQ ID NO:53所示。
本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列如SEQ IDNO：41和SEQ ID NO:43，SEQ ID NO：42和SEQ ID NO:44，SEQ ID NO：53和SEQ ID NO:55，或者，SEQ ID NO：54和SEQ ID NO:56。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。
本发明的第八方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。
本发明的第九方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在TSLPR基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十方面，提供了一种TSLPR基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源TSLPR蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化TSLPR基因，更优选包含上述的人源化TSLPR基因。
优选的，所述人或人源化TSLPR基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性TSLPR基因座处的内源调控元件。
优选的，将人TSLPR基因导入非人动物TSLPR基因座上。
优选的，所述的人TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含1号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或5-6号内含子，更优选的包含1-6号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、50、70、75、76、77、78、79、80、90、94bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸或从编码信号肽N端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、111、112、113、114、115、120、121bp的核苷酸序列。
优选的，将包含SEQ ID NO：15、69或16所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
优选的，将包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
在本发明的一个实施方式中，用从5’-3’包含P2A序列、人TSLPR核苷酸序列、小鼠TSLPR核苷酸序列、3’UTR序列和STOP序列导入非人动物TSLPR基因座，其中，所述人TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：15或编码SEQ ID NO：8第1-253位所示氨基酸的核苷酸序列，所述的小鼠TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，所述的P2A序列如SEQ ID NO：17所示，优选的，所述的构建方法包括用SEQ ID NO：13或14所示核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
在本发明的另一个实施方式中，用从5’-3’包含人TSLPR核苷酸序列、小鼠TSLPR核苷酸序列、3’UTR序列和STOP序列导入非人动物TSLPR基因座，其中，所述人TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：69或编码SEQ ID NO：8第2-253位所示氨基酸的核苷酸序列，所述的小鼠TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，优选的，所述的构建方法包括用SEQID NO：22所示核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
优选的，用包含编码人TSLPR蛋白的全部或部分的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座，优选包含编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，更优选包含编码人TSLPR蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分。
优选的，用包含编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
优选的，所述导入非人动物基因座为插入非人动物基因座，所述获得的人源化非人动物的人源化TSLPR基因进一步包含非人动物外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和/或外显子8的全部或部分。
优选的，所述导入非人动物基因座为替换非人动物基因座，所述获得的人源化非人动物的人源化TSLPR基因进一步包含非人动物外显子1、外显子6、外显子7和外显子8的全部或部分。优选的，包含非人动物外显子1部分、外显子6部分、外显子7全部和外显子8部分或外显子1全部、外显子2部分、外显子6部分、外显子7全部和外显子8部分。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL7R、TSLP、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化TSLPR基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述IL33基因为人源化IL33基因。
优选的，所述的人源化IL33基因包含人IL33基因的全部或部分。进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL33基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述IL7R基因为人源化IL7R基因。
优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分。进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
优选的，所述TSLP基因为人源化TSLP基因，进一步优选的，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。更优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，更优选的包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。
优选的，所述的人源化TSLP基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
在一个具体的实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、猪、兔子或猴子。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠或大鼠。
本发明的第十一方面，提供了一种TSLPR基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化TSLPR基因，更优选包含上述的人源化TSLPR基因。
优选的，所述的非人动物为上述的TSLPR基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人TSLPR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的跨膜区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，再进一步优选的，编码SEQ IDNO：8第1-253或2-253位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化TSLPR基因的核苷酸序列；或，
D)人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含1号至6号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、50、70、75、76、77、78、79、80、90、94bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸或从编码信号肽N端1-5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸开始至1号外显子最后一个核苷酸，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、111、112、113、114、115、120、121bp的核苷酸序列。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：15、69或16所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述B)中还包括编码非人动物TSLPR蛋白的核苷酸序列，进一步优选为编码SEQ ID NO：7第255-359位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的D)中还包括非人动物TSLPR基因的部分，优选为非人动物TSLPR基因的6号至8号外显子的全部或部分。
优选的，所述的构建方法包括将包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
在本发明的一个实施方式中，所述的构建方法包括用从5’-3’包含P2A序列、人TSLPR核苷酸序列、小鼠TSLPR核苷酸序列、3’UTR序列和STOP序列导入非人动物TSLPR基因座，其中，所述人TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：15或编码SEQ ID NO：8第1-253位所示氨基酸的核苷酸序列，所述的小鼠TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，所述的P2A序列如SEQ ID NO：17所示，优选的，所述的构建方法包括用SEQ ID NO：13或14所示核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
在本发明的另一个实施方式中，所述的构建方法包括用从5’-3’包含人TSLPR核苷酸序列、小鼠TSLPR核苷酸序列、3’UTR序列和STOP序列导入非人动物TSLPR基因座，其中，所述人TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：69或编码SEQ ID NO：8第2-253位所示氨基酸的核苷酸序列，所述的小鼠TSLPR核苷酸序列包含SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，优选的，所述的构建方法包括用SEQ ID NO：22所示核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码人TSLPR蛋白的全部或部分的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座，优选包含编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，更优选包含编码人TSLPR蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ IDNO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人TSLPR蛋白的cDNA序列导入非人动物TSLPR基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换或插入。
优选的，所述的供体核苷酸序列可操作连接到至少一条染色体上内源TSLPR内源调控元件。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物TSLPR基因。所述的外源性调控元件来自人TSLPR基因。
优选的，所述的导入的位置位于TSLPR基因的内源调控元件之后。
优选的，导入的位置位于非人动物TSLPR基因的1号至8号外显子上，进一步优选的，导入的位置位于非人动物TSLPR基因的1号外显子或2号外显子上，更优选为NM_016715.4的第113-114或260-261位所示的核苷酸序列之间。
优选的，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:7的第1-2或50-51位所示氨基酸的核苷酸序列之间。
优选的，使用基因编辑技术进行TSLPR基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物TSLPR基因的编码框，将编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列或者人源化TSLPR基因的核苷酸序列插入非人动物TSLPR基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物TSLPR基因的编码框可以采用敲除非人动物TSLPR基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物TSLPR蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物TSLPR基因的编码框可以为敲除非人动物TSLPR基因的1号外显子或2号外显子的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列或者人源化TSLPR基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物TSLPR基因内源调控元件之后。进一步优选的，所述的辅助序列包括STOP序列。
优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向TSLPR基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物TSLPR基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的TSLPR基因上的靶序列上。
优选的，所述的sgRNA靶位点位于TSLPR基因的1号外显子或2号外显子上。
优选的，所述的sgRNA在TSLPR基因上的靶序列如SEQ ID NO：41或53所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向TSLPR基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得TSLPR基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将TSLPR基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为IL7R、TSLP、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL7R、TSLP、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α蛋白中的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
优选的，所述IL33基因为人源化IL33基因。
优选的，所述的人源化IL33基因包含人IL33基因的全部或部分。进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL33基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述IL7R基因为人源化IL7R基因。
优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分。进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL7R蛋白包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：81所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：81所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：81所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述TSLP基因为人源化TSLP基因，进一步优选的，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。更优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，更优选的包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。
优选的，所述的人源化TSLP基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因包含编码SEQ ID NO：2所示蛋白的氨基酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示蛋白的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示蛋白的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十二方面，提供了一种TSLPR基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源TSLPR基因的1号外显子或2号外显子的全部或部分。
本发明的第十三方面，提供了一种TSLPR基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体或上述的sgRNA进行非人动物的制备。
本发明的第十四方面，提供了一种人源化TSLP基因，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的部分。
优选的，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，更优选的包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLP基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因包含编码人TSLP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化TSLP基因包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因还包含非人动物TSLP基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物TSLP基因的1号至5号外显子的全部或部分，更优选包含1号外显子的部分和/或5号外显子的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLP基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
E)包含SEQ ID NO：23和/或24所示的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
在一个具体的实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、猪、兔子或猴子。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠或大鼠。
本发明的第十五方面，提供了一种人源化TSLP蛋白，所述的人源化TSLP蛋白包含人TSLP蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化TSLP蛋白是由上述的人源化TSLP基因编码的。
优选的，所述的人源化TSLP蛋白包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化TSLP蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十六方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化TSLP基因的核苷酸序列；或，
C)人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物TSLP基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000084.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物TSLP基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000084.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：23、24、25和/或26。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物TSLP基因的1号至5号外显子上，进一步优选位于非人动物TSLP基因的1号外显子和/或5号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第十七方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。
本发明的第十八方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在TSLP基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第十九方面，提供了一种TSLP基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源TSLP蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化TSLP基因，更优选包含上述的人源化TSLP基因。
优选的，所述人或人源化TSLP基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性TSLP基因座处的内源调控元件。
优选的，将人TSLP基因导入非人动物TSLP基因座上。
优选的，所述的人TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子和/或3-4号内含子，更优选的包含1-4号外显子之间的任一内含子，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。
优选的，将包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座。
优选的，用编码人TSLP蛋白的全部或部分的核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座，进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自IL7R、TSLPR、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述人或人源化TSLP基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述TSLPR基因为人源化TSLPR基因，进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因如上述的人源化TSLPR基因。
优选的，所述IL33基因为人源化IL33基因。
优选的，所述的人源化IL33基因包含人IL33基因的全部或部分。进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL33基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述IL7R基因为人源化IL7R基因。
优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分。进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
在一个具体的实施方式中，所述非人动物是非人哺乳动物，优选为啮齿类动物、猪、兔子或猴子。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠或大鼠。
本发明的第二十方面，提供了一种TSLP基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化TSLP基因，更优选包含上述的人源化TSLP基因。
优选的，所述的非人动物为上述的TSLP基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化TSLP基因的核苷酸序列；或，
C)人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至4号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、130、150、170、171、172、173、174、175、180、200、250、300、349bp的核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、150、200、500、1000、1500、2000、2081bp的核苷酸序列；优选的，4号外显子的部分包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用编码人TSLP蛋白的全部或部分的核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座，进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人TSLP蛋白的cDNA序列导入非人动物TSLP基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的供体核苷酸序列可操作连接到至少一条染色体上内源TSLP内源调控元件。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物TSLP基因。所述的外源性调控元件来自人TSLP基因。
优选的，所述的导入的位置位于TSLP基因的内源调控元件之后。
优选的，导入的位置位于非人动物TSLP基因的1号至5号外显子上，进一步优选的，导入的位置包括非人动物TSLP基因的1号至5号外显子的全部或部分，更优选的，导入的位置包括非人动物TSLP基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，更优选为NM_021367.2的第18-440位所示的核苷酸序列。
优选的，所述的导入的位置包括编码SEQ ID NO:1的第1-140位所示氨基酸的核苷酸序列。
优选的，使用基因编辑技术进行TSLP基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物TSLP基因的编码框，将编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列或者人源化TSLP基因的核苷酸序列插入非人动物TSLP基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物TSLP基因的编码框可以采用敲除非人动物TSLP基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物TSLP蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物TSLP基因的编码框可以为敲除非人动物TSLP基因的1号至5号外显子的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列或者人源化TSLP基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物TSLP基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得TSLP基因人源化的动物模型体内表达人TSLP蛋白，不表达非人动物TSLP蛋白。
优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向TSLP基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得TSLP基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将TSLP基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为IL7R、TSLPR、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的IL7R、TSLPR、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α蛋白中的至少一种。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
优选的，所述的TSLPR基因为人源化TSLPR基因，进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因为上述的人源化TSLPR基因。
优选的，所述IL33基因为人源化IL33基因。
优选的，所述的人源化IL33基因包含人IL33基因的全部或部分。进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，优选的，包含人IL33基因从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述IL7R基因为人源化IL7R基因。
优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分。进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL7R蛋白包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：81所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：81所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：81所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第二十一方面，提供了一种TSLP基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源TSLP基因的1号至5号外显子的全部或部分。
本发明的第二十二方面，提供了一种TSLP基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行非人动物的制备。
本发明的第二十三方面，提供了一种TSLP和TSLPR基因修饰非人动物的构建方法，所述的多基因修饰包括多基因人源化，优选的，所述的多基因修饰非人动物表达人源化TSLP蛋白和人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的构建方法包括：
将非人动物之间进行交配或体外授精；
或者非人动物进行基因编辑获得多基因修饰非人动物。
优选的，所述的人源化TSLP蛋白选自上述的人源化TSLP蛋白，
所述的人源化TSLPR蛋白选自上述的人源化TSLPR蛋白。
本发明的第二十四方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，所述的构建方法包括：
(一)提供上述的构建方法获得的非人动物；
(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因IL7R、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。
本发明的第二十五面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化TSLP蛋白和/或上述的人源化TSLPR蛋白，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化TSLP基因和/或上述的人源化TSLPR基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第二十六方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化TSLP蛋白和/或上述的人源化TSLPR蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组中包含上述的人源化TSLP基因和/或上述的人源化TSLPR基因。或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第二十七方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十八方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第二十九方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第三十方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第三十一方面，提供了一种TSLP和/或TSLPR基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化TSLP和/或TSLPR蛋白。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化TSLP蛋白和/或上述的人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人TSLP和/或TSLPR基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化TSLP基因和/或上述的人源化TSLPR基因。
本发明的第三十二方面，提供了一种包含上述的人源化TSLP基因和/或上述的人源化TSLPR基因的构建体或者表达上述的人源化TSLP蛋白和/或上述的人源化TSLPR蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。
本发明的第三十三方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第三十四方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
本发明的第三十五方面，提供了一种TSLPR基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化TSLPR基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化TSLPR蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLPR基因为上述的人源化TSLPR基因。
优选的，所述的人源化TSLPR蛋白为上述的人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TSLPR基因座处用人TSLPR基因的基因组片段(优选编码人TSLPR的信号肽、胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分序列)，和/或，非人动物TSLPR基因的基因组片段，导入非人动物TSLPR基因的基因组片段以形成经修饰的TSLPR基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TSLPR基因座处用人源化TSLPR基因导入非人动物TSLPR基因的基因组片段以形成经修饰的TSLPR基因。
所述的经修饰的TSLPR基因编码人源化TSLPR蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物TSLPR基因的1号外显子或2号外显子处。
优选的，所述的经修饰的TSLPR基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第三十六方面，提供了一种TSLP基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化TSLP基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化TSLP蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化TSLP基因为上述的人源化TSLP基因。
优选的，所述的人源化TSLP蛋白为上述的人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TSLP基因座处用人TSLP基因的基因组片段，和/或，非人动物TSLP基因的基因组片段，导入非人动物TSLP基因的基因组片段以形成经修饰的TSLP基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源TSLP基因座处用人源化TSLP基因导入非人动物TSLP基因的基因组片段以形成经修饰的TSLP基因。
所述的经修饰的TSLP基因编码人源化TSLP蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物TSLP基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的替换为替换非人动物TSLP基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分。
优选的，所述的经修饰的TSLP基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第三十七方面，提供了包含上述TSLPR和/或TSLP基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
本发明的第三十八方面，提供了一种上述的人源化TSLP蛋白、上述的人源化TSLPR蛋白、上述的人源化TSLP基因和/或上述的人源化TSLPR基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、或者瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与TSLP/TSLPR相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TSLP/TSLPR相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TSLP/TSLPR相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人TSLP/TSLPR信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究TSLP/TSLPR基因功能，研究针对人TSLP/TSLPR靶位点的药物、药效，研究与TSLP/TSLPR相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的第三十九方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人TSLP/TSLPR特异性调节剂的筛选。
本发明的第四十方面，提供了一种人TSLP/TSLPR特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗TSLP和/或TSLPR抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第四十一方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“TSLP基因座”表示TSLP基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的TSLP基因座可以是TSLP基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化TSLP蛋白”，包含来源于人TSLP蛋白的部分。其中，所述的“人TSLP蛋白”同“人TSLP蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人TSLP蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人TSLP蛋白的部分”，为连续或间隔的5-159个(优选为10-159个)氨基酸序列与人TSLP蛋白的氨基酸序列一致或与人TSLP蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化TSLP基因”，包含来源于人TSLP基因的部分和非人TSLP基因的部分。其中，所述的“人TSLP基因”同“人TSLP基因的全部”，即其核苷酸序列与人TSLP基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人TSLP基因的部分”为连续或间隔的20-7965bp(优选为20-2610bp、20-4184bp或20-480bp)个核苷酸序列与人TSLP核苷酸序列一致或与人TSLP核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化TSLPR蛋白”，包含来源于人TSLPR蛋白的部分。其中，所述的“人TSLPR蛋白”同“人TSLPR蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人TSLPR蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人TSLPR蛋白的部分”，为连续或间隔的5-371个(优选为10-253或10-252个)氨基酸序列与人TSLPR蛋白的氨基酸序列一致或与人TSLPR蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化TSLPR基因”，包含来源于人TSLPR基因的部分和非人TSLPR基因的部分。其中，所述的“人TSLPR基因”同“人TSLPR基因的全部”，即其核苷酸序列与人TSLPR基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人TSLPR基因的部分”为连续或间隔的20-22326bp(优选为20-759bp或20-756bp)个核苷酸序列与人TSLPR核苷酸序列一致或与人TSLPR核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人TSLP基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-349bp个，优选10-171bp个核苷酸序列与人TSLP基因的1号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化TSLP基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从起始密码子开始至1号外显子最后一个核苷酸。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“TSLP蛋白”、“TSLPR蛋白”，例如“人TSLP蛋白”、“非人动物TSLPR蛋白”或“人源化TSLPR蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.NO:4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
有益效果：
利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的基因人源化动物模型，使其体内表达人源蛋白，作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
利用基因人源化动物模型建立各种疾病模型，可以进行抗人抗体药物的药理药效评价。
优选的，考虑到TSLP/TSLPR在信号通路上的功能相互关联，本发明设计出多个基因人源化的技术方案，使得包含上述人源化基因的非人动物能表达出多个人源化或人的相应蛋白，为筛选适合人的试剂提供更为人源化的微环境，从而筛选出的试剂效力更好。
优选的，为便于多个人源化基因的表达，本发明优化了导入的人的TSLP/TSLPR基因的片段选择，以及导入位置的选择，人的TSLP/TSLPR基因可以无随机插入的导入，并正确表达人源化或人的相应蛋白，可以稳定传代，同时不影响非人动物的其他功能。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠TSLP基因和人TSLP基因座对比示意图(非按比例)；
图2：小鼠TSLP基因人源化改造部分示意图(非按比例)；
图3：TSLP基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图4：TSLP重组细胞PCR结果，其中，WT为野生型，H2O为水，M为Maker；
图5：Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型；
图6：TSLP基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水，PC为对照，M为Marker；
图7：TSLP基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图8：ELISA蛋白检测结果(B-hTSLP为TSLP人源化杂合子小鼠)；
图9：小鼠TSLPR基因和人TSLPR基因座对比示意图(非按比例)；
图10：小鼠TSLPR基因人源化改造部分示意图(非按比例)；
图11：TSLPR基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图12：TSLPR基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；
图13：TSLPR基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
图14：TSLPR基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水，M为Maker；
图15：Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型；
图16：小鼠TSLPR基因人源化改造示意图(非按比例)；
图17：TSLPR基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)。
图18：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和TSLP/TSLPR基因人源化杂合子小鼠(H/+)外周血中TSLPR mRNA检测结果；
图19：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠(H/H)ELISA蛋白检测结果；
图20：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠(H/H)经人FMS样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)刺激的小鼠骨髓细胞中TARC表达流式分析结果；
图21：制备IL33基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图(非按比例)；
图22：制备IL7R基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图(非按比例)；
图23：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型实验方案；
图24：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的体重情况；
图25：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的耳朵厚度情况；
图26：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的血清IgE浓度的情况；
图27：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的嗜酸性粒细胞的情况；
图28：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的耳朵组织切片染色结果；
图29：TSLP/TSLPR双人源化小鼠OXA诱导特异性皮炎模型组、对照组、治疗组的耳朵组织切片总评分结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
DraIII、HindIII、EcoRV、ScaI、StuI酶购自NEB，货号分别为R3510S、R3104S、R3195S、R3122S、R0187S；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；
V450 Rat Anti-mouse CD11b购自BD Horizon，货号560455；
Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c购自Biolegend，货号117334；
APC anti-mouse TSLPR(TSLP-R)Antibody购自Biolegend，货号151805；
PE anti-human TSLPR(TSLP-R)Antibody购自Biolegend，货号322805；
APC Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400512；
PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号400112；
Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号101302；
FITC anti-mouse F4/802购自Biolegend，货号123108；
MOUSE TSLP ELISA KIT购自Biolegend，货号434107；
HUMAN TSLP ELISA KIT购自Biolegend，货号434207。
实施例1 TSLP基因人源化小鼠的制备
小鼠TSLP基因(NCBI Gene ID：53603，Primary source：MGI：1855696，UniProtID：Q9JIE6，位于18号染色体NC_000084.7的第32948436至32952852位，基于转录本NM_021367.2及其编码蛋白NP_067342.1(SEQ ID NO:1))和人TSLP基因(NCBI Gene ID：85480，Primary source：HGNC:30743，UniProt ID：Q969D9-1，位于5号染色体NC_000005.10的第111070062至111078026位，基于转录本NM_033035.5及其编码蛋白NP_149024.1(SEQ IDNO:2))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源TSLP基因座引入编码人TSLP蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化TSLP蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠TSLP基因调节元件的控制下，用包含人TSLP基因的1号外显子部分序列至4号外显子部分序列约4.18kb替换小鼠1号外显子的部分序列至5号外显子的部分序列约3.71kb，得到人源化TSLP基因座示意图如图2所示，实现对小鼠TSLP基因的人源化改造。
设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠TSLP基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人TSLP DNA片段的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQID NO:3)与NCBI登录号为NC_000084.7的第32943730至32948452位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:4)与NCBI登录号为NC_000084.7的第32953181至32957221位核苷酸序列相同。人TSLP的DNA片段核苷酸序列(SEQ ID NO:5)与NCBI登录号为NC_000005.10的第111071891至111076074位核苷酸序列相同；A片段序列上游与小鼠的连接设计为：
Figure BDA0003867309300000401
(SEQ ID NO:23)，其中序列“CAGC”中最后一个“C”是小鼠最后一个核苷酸，序列“ATGT”中的“A”是人第一个核苷酸。A片段序列下游与小鼠的连接设计为5’-
Figure BDA0003867309300000402
Figure BDA0003867309300000403
(SEQ ID NO:24)，其中序列/>
Figure BDA0003867309300000404
中的最后一个“G”是A片段的最后一个核苷酸，序列/>
Figure BDA0003867309300000405
中第一个“C”是小鼠序列的第一个核苷酸。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为：
Figure BDA0003867309300000406
Figure BDA0003867309300000407
Figure BDA0003867309300000408
(SEQ ID NO:25)，其中序列“CAAC”中最后一个“C”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“AAGC”的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为：/>
Figure BDA0003867309300000409
Figure BDA00038673093000004010
Figure BDA00038673093000004011
(SEQ ID NO:26)，其中序列“GGTG”中最后一个“G”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CCTC”中第一个“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠TSLP的mRNA序列如SEQ ID NO:6所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
鉴于人TSLP具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。PCR检测结果如图4所示，其中，编号为ES-01-ES-14均为阳性的克隆。
PCR引物如下：
ES-F(SEQ ID NO:67)：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’，
ES-R(SEQ ID NO:68)：5’-AGAGATGGTCTCCTTGGAGGTAGGC-3’；
进一步对PCR鉴定为阳性的部分细胞进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。(分别用DraIII、HindIII、EcoRV酶消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，检测结果如图5所示：ES-01、ES-02、ES-04、ES-05、ES-06、ES-07、ES-08、ES-10、ES-11、ES-13和ES-14均为阳性克隆且无随机插入。
表1具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
DraIII 5’Probe 11.1kb 15.3kb
HindIII 3’Probe 13.5kb 9.9kb
EcoRV Neo Probe-5(3’) -- 12.8kb
探针合成引物如下：
5’Probe-F(SEQ ID NO:27)：5’-TACAAGTCCAGCATGACATAGCCA-3’，
5’Probe-R(SEQ ID NO:28)：5’-TGCCACCTAATTGCAGAGGCGA-3’；
3’Probe-F(SEQ ID NO:29)：5’-AAGACCTGACAGTGTTGTTCAAGG-3’，
3’Probe-R(SEQ ID NO:30)：5’-TTCCGGTGGCCTGTAGGACATT-3’；
Neo Probe-5(3’)-F(SEQ ID NO:31)：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’，
Neo Probe-5(3’)-R(SEQ ID NO:32)：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’；
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图7)后，再通过互相交配即可得到TSLP基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04的小鼠为阳性杂合小鼠,证明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的TSLP人源化基因工程小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。
表2引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000421
可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人TSLP蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法，选取10周龄野生型C57BL/6小鼠和23周龄TSLP基因人源化杂合子小鼠各2只，取小鼠耳朵组织，研磨后取上清液，用MOUSE TSLP ELISA KIT试剂盒和HUMAN TSLP ELISAKIT试剂盒检测鼠TSLP蛋白水平和人或人源化TSLP蛋白水平。检测结果(见图8)显示，在野生型C57BL/6小鼠体内未检测到人或人源化TSLP蛋白的表达，在TSLP基因人源化小鼠杂合子体内可检测到鼠TSLP蛋白和人TSLP蛋白的表达。
以上实验表明通过本方法，构建了可稳定传代、无随机插入且可在小鼠体内表达人TSLP蛋白的TSLP人源化小鼠。
实施例2 TSLPR基因人源化小鼠的制备
小鼠TSLPR基因(NCBI Gene ID：57914，Primary source：MGI：1889506，UniProt：A0A0R4J0F5，位于5号染色体NC_000071.7的第109702575至109707301位，基于转录本NM_016715.4及其编码蛋白NP_057924.3(SEQ ID NO:7))和人TSLPR基因(NCBI Gene ID：64109，Primary source：HGNC：14281，UniProt ID：Q9HC73-1，位于X染色体NC_000023.11的第1190437至1212762位，基于转录本NM_022148.4及其编码蛋白NP_071431.2(SEQ ID NO:8))对比示意图如图9所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源TSLPR基因座引入编码人TSLPR蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化TSLPR蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠内源TSLPR基因调节元件的控制下，将编码人TSLPR蛋白核苷酸序列和编码鼠TSLPR蛋白的核苷酸序列插入小鼠TSLPR基因座，得到人源化TSLPR基因座示意图如图10所示，实现对小鼠TSLPR基因的人源化改造。
进一步设计如图11所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠TSLPR基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含P2A序列(SEQ ID NO:17)、编码人TSLPR核苷酸序列和编码小鼠TSLPR蛋白的核苷酸序列的A2片段(SEQ ID NO:14)。其中，5’同源臂(SEQ ID NO:9)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109705410至109709296位核苷酸序列相同；3’同源臂(SEQ ID NO:10)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109701469至109705409位核苷酸序列相同。A2片段上包含的人TSLPR基因序列(SEQ ID NO:15)与NCBI登录号为NM_022148.4的第16至774位核苷酸序列相同，A2片段上包含的小鼠TSLPR基因序列(SEQ IDNO:16)与NCBI登录号为NM_016715.4的第873至1190位核苷酸序列相同；小鼠与A2片段序列上游的连接设计为
Figure BDA0003867309300000431
Figure BDA0003867309300000432
(SEQ ID NO:34)，其中序列/>
Figure BDA0003867309300000433
中最后一个“C”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“GGAA”中的第一个“G”是A2片段的第一个核苷酸；小鼠与A2片段序列下游的连接设计为/>
Figure BDA0003867309300000434
Figure BDA0003867309300000435
Figure BDA0003867309300000436
(SEQ ID NO:35)，其中序列/>
Figure BDA0003867309300000437
中最后一个/>
Figure BDA0003867309300000438
是A2片段的最后一个核苷酸，序列“GGCG”中第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠TSLPR的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与STOP序列的连接设计为
Figure BDA0003867309300000439
Figure BDA00038673093000004310
Figure BDA0003867309300000441
(SEQ ID NO:36)，其中序列/>
Figure BDA0003867309300000442
的“A”是STOP序列的最后一个核苷酸，序列“GTCG”第一个“G”是NEO盒的第一个核苷酸；NEO盒3’端与小鼠的连接设计为：
Figure BDA0003867309300000443
Figure BDA0003867309300000444
Figure BDA0003867309300000445
(SEQ ID NO:37)，其中序列/>
Figure BDA0003867309300000446
的最后一个“C”是NEO盒的最后一个核苷酸，序列“GGCG”的第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
鉴于人TSLPR具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定(引物如表3所示)为阳性的克隆，再进行Southern Blot检测确认无随机插入后，再进一步测序验证正确的克隆进行下一步实验。
表3引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000447
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图12)后，再通过互相交配即可得到TSLPR基因人源化纯合子小鼠。
此外，还可引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，设计如图13所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠TSLPR基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含P2A序列(SEQID NO:17)、编码人TSLPR蛋白的核苷酸序列和编码小鼠TSLPR蛋白的核苷酸序列的A1片段(SEQ ID NO:13)。其中，其中5’同源臂(SEQ ID NO:11)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109705410至109706794位核苷酸序列相同；3’同源臂(SEQ ID NO:12)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109704095至109705409位核苷酸序列相同。A1片段上包含的人TSLPR基因序列(SEQ ID NO:15)与NCBI登录号为NM_022148.4的第16至774位核苷酸序列相同，A1片段上包含的小鼠TSLPR基因序列(SEQ ID NO:16)与NCBI登录号为NM_016715.4的第873至1190位核苷酸序列相同；小鼠与A1片段序列上游的连接设计为5’-CTCGGGCCCCGACCACCACGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAA-3’(SEQ ID NO:34)，其中序列“CCAC”中最后一个“C”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“GGAA”中的第一个“G”是A1片段的第一个核苷酸；小鼠与A1片段序列下游的连接设计为：
5’-GGGCTGCAGGTCGAGGGACCTAAGTACTGTCGACGGCGCCAACTTGAGCCTGGAGTTCCGGTGAGTGAAGGGG-3’(SEQ ID NO:40)，其中序列“CGAC”中最后一个“C”是A1片段的最后一个核苷酸，序列“GGCG”中第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠TSLPR的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，sgRNA在TSLPR基因上的靶序列如下：
5’-GGCTCAAGTTGGCGCCGTGGTGG-3’(SEQ ID NO:41)；
利用UCA试剂盒检测sgRNA活性。确定其可介导高效切割效率后，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表4)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-TSLPR-1。
表4 sgRNA序列列表
Figure BDA0003867309300000451
Figure BDA0003867309300000461
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:45)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-TSLPR质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的TSLPR基因人源化小鼠品系。可通过PCR鉴定F0代小鼠体细胞的基因型(引物如表5所示)，经PCR鉴定为阳性的小鼠，再进行SouthernBlot检测。Southern检测为阳性的小鼠，进一步测序验证确认是否存在随机插入。
表5引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000462
可通过多数方法鉴定上述方法制备的小鼠是否成功。例如，可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表6所示)，示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图14，其中，编号为F1-01-F1-09的小鼠为阳性杂合小鼠。
表6引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000463
Figure BDA0003867309300000471
对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用ScaI酶或StuI酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表7，示例性检测结果如图15示F1-03-F1-09均为阳性的小鼠，这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的TSLPR基因人源化小鼠。最后再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
lox2 STOP Probe探针(lox2 STOP Probe)：
lox2 STOP Probe-F：5’-AACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGG-3’(SEQ ID NO:49)，
lox2 STOP Probe-R：5’-GCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAG-3’(SEQ ID NO:50)；
3’探针(3’Probe)：
3’Probe-F：5’-CGGGTGGGCGTGACCTGCGATG-3’(SEQ ID NO:51)，
3’Probe-R：5’-CGGCGCAGGGGTCACCTGTGAG-3’(SEQ ID NO:52)；
表7具体探针及目的片段长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
ScaI lox2 Stop Probe -- 5.5kb
StuI 3’Probe 3.4kb 4.5kb
实施例3 TSLPR人源化小鼠(二)
本发明的发明人还通过将实施例2中人鼠嵌合序列插入到第一外显子启动子ATG之后，成功获得了TSLPR人源化小鼠。改造小鼠的基因座的示意图如图16所示，实现了对小鼠TSLPR的另一种人源化改造。
设计如图17所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠TSLPR基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人TSLPR蛋白的核苷酸片段和编码小鼠TSLPR蛋白的核苷酸序列的A3片段(SEQ ID NO:22)。其中，其中5’同源臂(SEQ ID NO:20)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109706747至109707691位核苷酸序列具有99.89％相同；3’同源臂(SEQID NO:21)与NCBI登录号为NC_000071.7的第109704991至109706746位核苷酸序列的相似性为99.89％。A3片段上包含的人TSLPR核苷酸片段(SEQ ID NO:69)与NCBI登录号为NM_022148.4的第19至774位核苷酸序列相同，A3片段上包含的小鼠TSLPR基因序列(SEQ IDNO:16)与NCBI登录号为NM_016715.4的第873至1190位核苷酸序列相同。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，sgRNA序列如下：
5’-CCTGCCTCGGCTCCTTGCGGCGG-3’(SEQ ID NO:53)；
利用UCA试剂盒检测sgRNA活性。确定其可介导高效切割效率后，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表7)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-TSLPR-2。
表8 sgRNA序列列表
Figure BDA0003867309300000481
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:45)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-TSLPR质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的TSLPR基因人源化小鼠品系。
可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表9所示)，将F0鉴定为阳性的TSLPR基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，获得F1阳性小鼠。最后再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。
表9引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000491
实施例4 TSLP/TSLPR双重人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的TSLP或TSLPR人源化小鼠还可以制备双人源化小鼠模型。如，前述实施例2或3中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于实施例1中含有TSLP基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化TSLP或TSLPR小鼠的基础上，利用分离的小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得TSLP和TSLPR基因修饰的双基因修饰的小鼠模型，也可将实施例1制备得到的TSLP基因人源化小鼠与实施例2或实施例3制备获得的TSLPR基因人源化小鼠进行交配繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到TSLP/TSLPR基因双人源化小鼠。
通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化TSLPR mRNA的表达情况，例如RT-PCR等。具体来说，分别取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和本实施例制得的TSLP/TSLPR基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取小鼠外周血，按照Trizol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测(引物见表10)，检测结果如图18所示：在C57BL/6野生型小鼠(+/+)外周血中仅检测到鼠TSLPR mRNA，没有检测到人源化TSLPR mRNA；仅在TSLP/TSLPR基因人源化杂合子小鼠(H/+)体内检测到人源化TSLPR mRNA。
表10 RT-PCR引物名称及具体序列
Figure BDA0003867309300000492
Figure BDA0003867309300000501
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化TSLPR蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。具体来说，分别取8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和TSLP/TSLPR基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取外周血，分别用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510TManti-mouse CD45(mCD45)、抗鼠CD11b抗体V450 Rat Anti-mouse CD11b(mCD11b)、抗鼠TSLPR抗体APC anti-mouse TSLPR(TSLP-R)Antibody(mTSLPR)、抗人TSLPR抗体PE anti-humanTSLPR(TSLP-R)Antibody(hTSLPR)、抗鼠IgG2a抗体APC Rat IgG2a,κIsotype CtrlAntibody、抗鼠IgG1抗体PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody、抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32、抗鼠FITC抗体FITC anti-mouse F4/80(mF4/80)等识别染色后进行流式检测。
结果表明，C57BL/6小鼠外周血巨噬细胞(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+)有0.77％hTSLPR阳性细胞(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+hTSLPR+)，有91.5％mTS LPR阳性细胞(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+mTSLPR+)，TSLP/TSLPR杂合子小鼠外周血中巨噬细胞中有24.7％hTSLPR阳性细胞(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+hTSLPR+)，有63.8％mTSLPR阳性细胞，说明人源化TSLPR蛋白在TSLP/TSLPR人源化杂合子小鼠体内可以正常表达。
将TSLP/TSLPR基因人源化杂合子小鼠互相交配即可获得TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠。通过常规检测方法确认获得的纯合子小鼠体内人TSLP蛋白或人源化TSLPR蛋白的表达情况，例如ELISA、流式细胞术等。具体来说，选取野生型C57BL/6小鼠和TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠各1只，取小鼠耳部组织，研磨后取上清液，用MOUSE TSLPELISA KIT试剂盒和HUMAN TSLP ELISA KIT试剂盒检测鼠TSLP蛋白水平和人TSLP蛋白水平。检测结果(见图19)显示：在野生型C57BL/6小鼠体内(+/+)仅检测到鼠TSLP蛋白，未检测到人TSLP蛋白，仅在TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠(H/H)体内检测到人TSLP蛋白。
使用流式细胞术检测TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠体内人源化TSLPR蛋白的表达情况，结果显示，仅在TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠体内检测到人TSLPR蛋白的表达。
已知胸腺激活调节趋化因子(TARC)为TSLP/TSLPR介导的信号通路中的下游产物，可通过检测TSLP/TSLPR基因人源化纯合子小鼠体内TARC的表达情况来验证人源化小鼠信号通路是否正常。取野生型C57BL/6小鼠和TSLP/TSLPR基因人源化纯合小鼠骨髓细胞(2×106个)，在包含2mL 10％FBS和200ng/mL hFLT3L(人FMS样酪氨酸激酶3配体)的RPMI培养基中持续刺激培养9天后收获细胞，分别用100ng/mL鼠TSLP蛋白(mTSLP)或人TSLP蛋白(hTSLP)诱导培养3天，通过ELISA检测细胞上清液中鼠TARC水平。结果(图20)显示：使用mTSLP诱导后，仅在野生型C57BL/6小鼠(+/+)体内检测出鼠TARC表达(图20B)；使用hTSLP诱导后，仅在TSLP/TSLPR基因人源化纯合小鼠体内检测出鼠TARC的表达(图20A)。结果表明，TSLP/TSLPR基因人源化小鼠体内TSLP/TSLPR信号通路正常。
实施例5 TSLP和/或TSLPR多重人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的TSLP和/或TSLPR人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有IL6、IL12、IL23、TNF-α等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化TSLP和/或TSLPR小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得TSLP和/或TSLPR与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的TSLP和/或TSLPR小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化TSLP和/或TSLPR与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
利用上述小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括银屑病、多发性硬化等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，TSLP和/或TSLPR基因人源化小鼠可用于评估人特异性TSLP信号通路药物的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
实施例6药效验证
选择单基因或双人源化TSLP/TSLPR小鼠，采用卵白蛋白(OVA)联合氢氧化铝腹腔注射致敏3次，3周后连续雾化5天激发可诱导哮喘，对照组用PBS替换OVA。
使用上述方案在人源化单基因或双人源化TSLP/TSLPR小鼠诱导哮喘。与对照相比，OVA诱导具有增高的血清IgE水平和肺组织学病理特征等典型症状，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的浸润细胞分析提示嗜酸性粒细胞计数增加。使用抗人TSLP抗体或抗人TSLPR抗体进行治疗，实验结束时可以通过常规方法，如气道反应性检测、苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)或免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理检测、炎症细胞和IgE检测评估抗人抗体的药效。
实施例7 IL33/TSLP/TSLPR三人源化小鼠的制备
小鼠IL33基因(NCBI Gene ID：77125，Primary source：MGI：1924375，UniProtID：Q8BVZ5，位于19号染色体NC_000085.6的第29925114至29960715位，基于转录本NM_133775.3及其编码蛋白NP_598536.2(SEQ ID NO：65))和人IL33基因(NCBI Gene ID：90865，Primary source：HGNC:16028，UniProt ID：O95760，位于9号染色体NC_000009.12的第6214591至6257983位，基于转录本NM_033439.3及其编码蛋白NP_254274.1(SEQ ID NO：66))。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠IL33基因座引入人IL33的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL33蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在内源小鼠IL33基因座上用人IL33基因序列替换小鼠IL33基因序列，如将至少包含小鼠IL33基因的2号外显子至8号外显子的约9371bp序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL33基因序列，实现对小鼠IL33基因的人源化改造。
如图21所示的打靶策略示意图中，显示了IL33打靶载体上含有小鼠IL33基因的上游和下游的同源臂序列(内源IL33基因2号外显子部分序列及其上游4218bp和8号外显子部分序列及其下游共4081bp的小鼠DNA)，以及包含编码人IL33序列的IL33-A片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：67)与NCBI登录号为NC_000085.6的第29945453-29949670位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：68)与NCBI登录号为NC_000085.6的第29959042-29963122位核苷酸序列相同；IL33-A片段含有人IL33的第2号外显子部分序列至第8外显子部分序列的基因组DNA，与NCBI登录号为NC_000009.12的第6241695-6256168位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠IL33的mRNA序列如SEQ ID NO：85所示，表达的蛋白序列与SEQ ID NO：66所示的人IL33蛋白相同。
通过将实施例中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞选择来源于实施例1-5获得的TSLP人源化小鼠、TSLPR小鼠和/或TSLP/TSLPR人源化小鼠，或者将本实施例获得的小鼠与TSLP人源化小鼠、TSLPR小鼠和/或TSLP/TSLPR人源化小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IL33/TSLP/TSLPR三人源化小鼠。
实施例8 IL7R/TSLP/TSLPR三人源化小鼠的制备
小鼠IL7R基因(NCBI Gene ID：16197，Primary source：MGI:96562，UniProtKB：P16872，位于15号染色体NC_000081.6的第9506159至9529941位，基于转录本NM_008372.4及其编码蛋白NP_032398.3(SEQ ID NO：75))和人IL7R基因(NCBI Gene ID：3575，Primarysource：HGNC:6024，UniProtKB：P16871-1，位于5号染色体NC_000005.10的第35856891至35879603位，基于转录本NM_002185.5及其编码蛋白NP_002176.2(SEQ ID NO：76所示))。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL7R基因座引入编码人IL7R蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL7R蛋白。可以采取在小鼠内源IL7R基因座上直接插入含有人IL7R的基因序列的方法，例如含有人IL7R的DNA序列或cDNA序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转，或敲除)使得插入位点后的小鼠内源IL7R基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL7R基因座上直接用人IL7R的基因序列(例如，人IL7R的DNA序列或cDNA序列)进行替换。本实施例将以DNA序列的原位替换策略来阐述如何对小鼠IL7R基因进行人源化改造。
进一步的，设计如图22所示的打靶策略。其中图22所示的靶向载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：77)、3’同源臂(SEQ ID NO：78)以及含有人IL7R DNA片段的敲进片段(KI片段)，其中5’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第9529743-9534180位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号为NC_000081.6的第9505623-9509583位核苷酸序列相同；敲进片段上的人IL7R DNA片段与NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列相同。其中，含有人IL7R DNA序列的片段上游与5’同源臂直接连接，含有人IL7R DNA序列的片段下游与鼠基因座的连接设计为
Figure BDA0003867309300000531
/>
Figure BDA0003867309300000532
Figure BDA0003867309300000541
(SEQ ID NO：79)，其中序列“TGGAT”的最后一个“T”是人序列的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003867309300000543
的第一个“C”是小鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL7R的mRNA序列如SEQ ID NO：80所示，其表达的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示。
通过将实施例中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞选择来源于实施例1-5获得的TSLP人源化小鼠、TSLPR小鼠和/或TSLP/TSLPR人源化小鼠，或者将本实施例获得的小鼠与TSLP人源化小鼠、TSLPR小鼠和/或TSLP/TSLPR人源化小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IL7R/TSLP/TSLPR三人源化小鼠。
实施例9恶唑酮(OXA)诱导的特异性皮炎模型
选择TSLP/TSLPR双人源化纯合子小鼠(5-7周)，采用恶唑酮(OXA)诱导的方法建立特异性皮炎模型。具体的，TSLP/TSLPR双人源化小鼠根据体重情况随机分为对照组或治疗组，每组5-8只共6组。首次(第0天)使用0.8％OXA涂抹小鼠耳朵和背部致敏，并使用0.4％OXA涂抹小鼠耳朵和背部激发(方案见图23)。对照组G1用溶媒(丙酮：橄榄油＝4:1)替换0.4％OXA及0.8％OXA。治疗组注射Dexamethasone(3mg/kg)或Tezepelumab analog(1-10mg/kg)，Tezepelumab的序列VH如SEQ ID NO:70,VL序列如SEQ ID NO:71。造模组G2注射等体积人IgG2抗体。Dexamethasone给药频率为一天一次，共给药20次。Tezepelumabanalog给药频率为每周两次，共给药6次(具体给药情况如下表)。每周测量体重2次并测量小鼠的耳朵厚度，在试验结束(第26天)测量血清中IgE水平和取耳朵组织苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)或免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理检测，并根据表皮基质细胞增生、糜烂/痂皮、角化过度以及真皮及皮下混合炎细胞浸润、嗜酸性粒细胞浸润的轻微、轻度、中度、重度情况评分为0、0.5、1、1.5、2分进行在整体评分。
表11分组及给药
Figure BDA0003867309300000542
Figure BDA0003867309300000551
整体看来，实验过程中小鼠健康状态良好，与对照组G1组相比，治疗组G3体重有所下降，其它组小鼠体重呈上升趋势(图24)。使用上述方案在人源化TSLP/TSLPR小鼠中诱导AD，与对照组相比，OXA诱导组G2具有表皮基质细胞增生、增厚、增高的血清IgE水平，嗜酸性粒细胞浸润和耳朵厚度增加等典型症状(图25-29)。使用Dexamethasone anology(G3)和抗人TSLP抗体(G4-G6)进行治疗，与OXA诱导组(G2)相比，抗人TSLP抗体(Tezepelumabanalog)和Dexamethasone治疗组小鼠的血清中总IgE浓度显著降低(图26)。
通过H&E染色结果(图28)，与OXA诱导组相比，治疗组上述典型症状明显减轻，在基质增生、表皮糜烂/痂皮、真皮及皮下混合炎细胞浸润和真皮及皮下嗜酸性粒细胞浸润病变方面均有显著改善作用，使用Tezepelumab-analog治疗组中G6组(10mg/kg)效果相对最好(图29)。这表明本方法制备的人源化TSLP/TSLPR小鼠可以模拟疾病模型，在临床前研究中用于筛选、评估抗人TSLP/TSLPR抗体的体内药效，并可用于表征抗人TSLP和/或TSLPR抗体特性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (54)

1.一种人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的部分。
2.根据权利要求1所述的人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含人TSLPR蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人TSLPR蛋白的胞外区。
3.根据权利要求1或2所述的人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述人源化TSLPR蛋白包含至少10个连续氨基酸的人TSLPR蛋白的跨膜区，优选的，所述人源化TSLPR蛋白包含至少10个连续氨基酸的人TSLPR蛋白的信号肽。
4.根据权利要求1-3任一所述的人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述的人TSLPR蛋白部分包含SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：8第1-253或2-253位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述的人源化TSLPR蛋白还包含非人动物TSLPR蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化TSLPR蛋白包含非人动物TSLPR蛋白的胞质区的全部或部分，进一步优选的，包含至少50个连续氨基酸的非人动物TSLPR蛋白胞质区，更优选的，所述的人源化TSLPR蛋白还包含SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：7第255-359位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5任一所述的人源化TSLPR蛋白，其特征在于，所述的人源化TSLPR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：19所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：19所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：19所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
7.一种人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的部分。
8.根据权利要求7所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因编码权利要求1-6任一所述的人源化TSLPR蛋白。
9.根据权利要求7-8任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化TSLPR基因包含人TSLPR基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列。
10.根据权利要求7-9任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人TSLPR基因包含编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
11.根据权利要求7-10任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人TSLPR基因包含SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：15或69所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
12.根据权利要求7-11任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因还包含非人动物TSLPR基因的部分，优选的，所述的人源化TSLPR基因包含非人动物TSLPR基因的6号至8号外显子的全部或部分，进一步优选所述的人源化TSLPR基因包含非人动物TSLPR基因6号外显子的部分、7号外显子的全部和8号外显子的部分，更优选的，所述的人源化TSLPR基因包含SEQ ID NO：16所示或编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：16所示或编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：16所示或编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：16所示或编码SEQ ID NO：7第255-359位的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
13.根据权利要求7-12任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因还包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
14.根据权利要求7-13任一所述的人源化TSLPR基因，其特征在于，所述的人源化TSLPR基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：18所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：18所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
E)包含SEQ ID NO：34、35和/或40所示的核苷酸序列。
15.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人TSLPR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的跨膜区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，再进一步优选的，编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化TSLPR基因的核苷酸序列；或，
D)人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，人TSLPR基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，人TSLPR基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：15、69或16所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQID NO：15、69或16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9、11或20所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10、12或21所示。
17.一种TSLPR基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLPR蛋白。
18.根据权利要求17所述的构建方法，其特征在于，所述人源化TSLPR蛋白为权利要求1-6任一所述的人源化TSLPR蛋白。
19.根据权利要求17-18任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含权利要求7-14任一所述的人源化TSLPR基因。
20.根据权利要求17-19任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座上。
21.根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLPR蛋白的核苷酸序列；
B)编码人TSLPR蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人TSLPR蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人TSLPR蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的跨膜区至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人TSLPR蛋白的信号肽至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，还包含编码人TSLPR蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，再进一步优选的，编码SEQ ID NO：8第1-253或2-253位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化TSLPR基因的核苷酸序列；或，
D)人TSLPR基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，人TSLPR基因的1号至6号外显子的全部或部分，进一步优选的，人TSLPR基因的1号外显子的部分、2号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：15、69或16所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：15、69或16所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQID NO：15、69或16所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
22.根据权利要求20-21任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将包含SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：13、14或22所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物TSLPR基因座。
23.根据权利要求20-22任一所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过内源调控元件进行调控。
24.根据权利要求20-23任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物TSLPR基因座的导入位置位于非人动物TSLPR基因的1号至8号外显子上，优选的，导入位置位于非人动物的1号外显子或2号外显子上。
25.根据权利要求17-24任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求15-16任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。
26.根据权利要求17-25任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将TSLPR基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，
优选的，所述的其他基因选自IL7R、TSLP、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种。
27.根据权利要求26所述的构建方法，其特征在于，所述的TSLP基因为人源化TSLP基因，优选的，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化TSLP基因包括人TSLP基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化TSLP基因包含编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
29.根据权利要求26所述的构建方法，其特征在于，所述的IL33基因为人源化IL33基因，优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列,进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
30.根据权利要求26所述的构建方法，其特征在于，所述的IL7R基因为人源化IL7R基因，优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
31.一种人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的部分。
32.根据权利要求31所述的人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人源化TSLP基因包含人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分，优选的，包含1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列。
33.根据权利要求31-32任一所述的人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人TSLP基因包含编码人TSLP蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，所述的人TSLP基因包含编码SEQID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
34.根据权利要求31-33任一所述的人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人TSLP基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
35.根据权利要求31-34任一所述的人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人源化TSLP基因还包含非人动物TSLP基因的部分，优选的，包含非人动物TSLP基因的1号外显子的部分和/或5号外显子的部分。
36.根据权利要求31-35任一所述的人源化TSLP基因，其特征在于，所述的人源化TSLP基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，
E)包含SEQ ID NO：23和/或24所示的核苷酸序列。
37.一种人源化TSLP蛋白，其特征在于，所述的人源化TSLP蛋白由权利要求31-36任一所述的人源化TSLP基因编码的。
38.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化TSLP基因的核苷酸序列；或，
C)人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分，优选的，人TSLP基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，所述的靶向载体包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
39.根据权利要求38所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000084.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000084.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
40.一种TSLP基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化TSLP蛋白。
41.根据权利要求40所述的构建方法，其特征在于，所述人源化TSLP蛋白为权利要求37所述的人源化TSLP蛋白。
42.根据权利要求40-41任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含权利要求31-36任一所述的人源化TSLP基因。
43.根据权利要求40-42任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TSLP基因座。
44.根据权利要求43所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化TSLP蛋白的核苷酸序列；
B)人或人源化TSLP基因的核苷酸序列；或，
C)人TSLP基因的1号至4号外显子的全部或部分，优选的，人TSLP基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，所述的靶向载体包含SEQ IDNO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
45.根据权利要求43-44任一所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过内源调控元件进行调控。
46.根据权利要求43-45任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物TSLP基因座的导入位置包含非人动物TSLP基因的1号至5号外显子的全部或部分。
47.根据权利要求40-46任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求38-39任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。
48.根据权利要求40-47任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将TSLP基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，
优选的，所述的其他基因选自IL7R、TSLPR、IL4、IL33、IL6、IL12、IL23、CD47、PD1、CD27、4-1BB、CTLA4、PSMA、CD47、OX40、TIGIT、LAG3和TNF-α中的至少一种。
49.根据权利要求48所述的构建方法，其特征在于，所述的TSLPR基因为人源化TSLPR基因，优选的，所述的人源化TSLPR基因如权利要求7-14任一所述的人源化TSLPR基因。
50.根据权利要求48所述的构建方法，其特征在于，所述的IL33基因为人源化IL33基因，优选的，所述的人源化IL33基因包含编码人IL33蛋白的全部或部分的核苷酸序列,进一步优选的，所述的人源化IL33基因包含编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：66的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
51.根据权利要求48所述的构建方法，其特征在于，所述的IL7R基因为人源化IL7R基因，优选的，所述的人源化IL7R基因包含人IL7R基因的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000005.10的第35856978-35874459位核苷酸序列。
52.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求31-36任一所述的人源化TSLP基因和/或权利要求7-14任一所述的人源化TSLPR基因，所述的细胞、组织或器官表达权利要求37所述的人源化TSLP蛋白和/或权利要求1-6任一所述的人源化TSLPR蛋白，或者，权利要求17-30和40-51任一所述的构建方法获得的非人动物。
53.一种瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求37所述的人源化TSLP蛋白和/或权利要求1-6任一所述的人源化TSLPR蛋白，或者，权利要求17-30和40-51任一所述的构建方法获得的非人动物。
54.一种权利要求1-6任一所述的人源化TSLPR蛋白、权利要求37所述的人源化TSLP蛋白、权利要求31-36任一所述的人源化TSLP基因、权利要求7-14任一所述的人源化TSLPR基因或权利要求17-30和40-51任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求52所述的细胞、组织或器官或权利要求53所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与TSLP和/或TSLPR相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与TSLP和/或TSLPR相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与TSLP和/或TSLPR相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人TSLP和/或TSLPR信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究TSLP和/或TSLPR基因功能，研究针对人TSLP和/或TSLPR靶位点的药物、药效，研究与TSLP和/或TSLPR相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
CN202211182223.5A 2021-09-27 2022-09-27 一种tslp和/或tslpr基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 Pending CN115850442A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021111389189 2021-09-27
CN202111138918 2021-09-27
CN202111481782 2021-12-06
CN2021114817821 2021-12-06
CN2022106389982 2022-06-07
CN202210638998 2022-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115850442A true CN115850442A (zh) 2023-03-28

Family

ID=85661194

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211182223.5A Pending CN115850442A (zh) 2021-09-27 2022-09-27 一种tslp和/或tslpr基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115850442A (zh)
WO (1) WO2023046201A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014089021A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 The Johns Hopkins University Humanized transgenic single nucleotide polymorphism animal systems
CN112300265B (zh) * 2019-07-29 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il33基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN111808882B (zh) * 2020-09-01 2020-12-29 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Il7r基因人源化改造的动物模型的构建方法及其应用
IL303724A (en) * 2020-12-21 2023-08-01 Regeneron Pharma Non-human animals with a humanized TSLP gene, a humanized TSLP receptor gene, and/or a humanized IL7RA gene

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023046201A1 (en) 2023-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107815467B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN111808882B (zh) Il7r基因人源化改造的动物模型的构建方法及其应用
CN111793647B (zh) Cd226基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN109452229B (zh) 狗源化pd-1基因改造动物模型的制备方法及应用
CN111073907A (zh) 人源化细胞因子csf1基因改造非人动物的构建方法及应用
CN107955817B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN112779284B (zh) Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN110195057B (zh) Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用
CN116479050A (zh) 人源化il2rb和/或il2rg基因改造动物及其制备方法和应用
CN108070614B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN113881681B (zh) Ccr8基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115785251A (zh) Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115011606A (zh) Cd37基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN112501206B (zh) Psma基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN114751973A (zh) Siglec15基因人源化非人动物的构建方法和应用
CN115850442A (zh) 一种tslp和/或tslpr基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN117384960B (zh) 一种tl1a基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN113603765B (zh) Il17f基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN113388640B (zh) Ccr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
WO2022222958A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
CN116463376A (zh) Baffr和/或baff基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN115918611A (zh) Tgfbr2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN115010800A (zh) Pvrig基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN115873902A (zh) 一种cd200和/或cd200r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN115786354A (zh) Tgfb1、garp和/或lrrc33基因人源化非人动物的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination