KR20240037269A - 인간 또는 키메라 tfr1을 갖는 유전자 변형 비인간 동물 - Google Patents
인간 또는 키메라 tfr1을 갖는 유전자 변형 비인간 동물 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1을 발현하는 유전자 변형 비인간 동물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2021년 7월 16일 출원된 중국 특허 출원 제202110808740.8호 및 2021년 10월 25일에 출원된 중국 특허 출원 제202111238943.4호에 대한 우선권을 주장하며 전술한 출원의 전체 내용이 인용 방식으로 본원에 포함된다.
본 개시는 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1을 발현하는 유전자 변형 동물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
분화 클러스터 71(CD71)로도 알려진 트랜스페린 수용체 1(TFR1)은 널리 발현되며 높은 친화도로 트랜스페린(Tf)에 결합할 수 있다. 혈액뇌 장벽의 내피 세포에서 발현되는 TFR1은 항체를 포함한 거대 분자를 뇌로 전달하기 위한 전임상 연구에 사용된다. 따라서, TFR1을 표적으로 하는 항체는 중추신경계 치료에 중요할 수 있다. 예를 들어, 혈액뇌 장벽을 통해 거대 분자를 운반하고 중추신경계에 치료법을 전달하는 데 사용할 수 있다.
다양한 치료법을 위한 전통적인 약물 연구 및 개발은 동물 모델과 관련된다. 그러나 사람과 동물의 차이로 인해 체내 약리학적 시험을 위해 종래의 실험 동물을 사용하여 수득한 시험 결과는 실제 질환 상태와 표적화 부위에서의 상호작용을 반영하지 않을 수 있어 많은 임상 시험의 결과는 동물 실험 결과와는 유의하게 상이하다는 것으로 이어진다. 따라서, 인간 항체 스크리닝 및 평가에 적합한 인간화 동물 모델의 개발은 신약 개발의 효율성을 유의하게 개선하고 약물 연구 개발 비용을 감소시킬 수 있을 것이다.
본 개시는 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1을 갖는 동물 모델에 관한 것이다. 동물 모델은 체내에서 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1) 단백질을 발현할 수 있다. 이는 TFR1 유전자의 기능에 대한 연구에 사용될 수 있으며, 항-인간 TFR1 항체의 스크리닝 및 평가에 사용될 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 방법으로 준비되는 동물 모델은 약물 스크리닝, 약력학 연구, 면역 관련 질환 치료 및 인간 TFR1 표적 부위에 대한 암 요법에 사용할 수 있으며, 또한, 신약 개발 및 설계를 촉진하고 시간과 비용을 절약하기 위해 사용될 수 있다. 요약하면, 본 개시는 TFR1 단백질의 기능을 연구하기 위한 강력한 도구와 항암 약물을 스크리닝하기 위한 플랫폼을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 게놈이 인간 또는 키메라 TFR1(트랜스페린 수용체 단백질 1)을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 염색체를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 서열은 적어도 하나의 염색체에 있는 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 조절 요소에 조작 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 서열은 인간 TFR1(NP_003225.2(서열 번호: 2))과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 서열은 서열 번호: 9와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 서열은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동물은 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 설치류, 마우스 또는 래트이다. 일부 실시양태에서, 동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 동물은 내인성 TFR1을 발현하지 않거나 감소한 수준의 내인성 TFR1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 갖는다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 발현된 인간 또는 키메라 TFR1은 인간 트랜스페린(Tf) 및 철과 상호작용하여 철-Tf-TFR1 착물을 형성함으로써 철 섭취를 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 발현된 인간 또는 키메라 TFR1은 내인성 트랜스페린(Tf) 및 철과 상호작용하여 철-Tf-TFR1 착물을 형성함으로써 철 섭취를 촉진할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 유전자 변형 비인간 동물에 관한 것이며, 일부 실시양태에서, 동물의 게놈은 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열은 상기 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 조절 요소에 조작 가능하게 연결되며, 동물의 하나 이상의 세포는 인간 또는 키메라 TFR1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 동물은 내인성 TFR1을 발현하지 않거나 감소한 수준의 내인성 TFR1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 대체된 유전자좌는 TFR1의 세포외 영역이다. 일부 실시양태에서, 동물은 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 일부 실시양태에서, 세포외 영역은 인간 TFR1의 세포외 영역과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 TFR1의 세포외 영역은 인간 TFR1의 세포외 영역에 존재하는 연속 서열과 적어도 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 620개, 650개, 660개, 665개, 666개, 667개, 668개, 669개, 670개, 671개 또는 672개의 동일한 연속 아미노산을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열은 내인성 TFR1 유전자의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 동물은 내인성 TFR1 유전자좌에서의 대체와 관련하여 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 동물은 내인성 TFR1 유전자좌에서의 대체와 관련하여 동형접합성이다.
일 양태에서, 본 개시는 유전자 변형 비인간 동물을 만들어내는 방법에 관한 것이며, 동물의 적어도 하나의 세포에 있는 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열은 인간 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열은 인간 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 영역은 TFR1의 세포외 영역 내에 위치된다. 일부 실시양태에서, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열은 내인성 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서,동물은 마우스이며, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열은 내인성 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및 엑손 19의 부분을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 키메라 TFR1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 비인간 동물에 관한 것이며, 일부 실시양태에서, 키메라 TFR1 폴리펩티드는 인간 TFR1의 상응하는 연속 아미노산 서열과 적어도 50개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 일부 실시양태에서, 동물은 키메라 TFR1 폴리펩티드를 발현한다.
일부 실시양태에서, 키메라 TFR1 폴리펩티드는 인간 TFR1 세포외 영역의 상응하는 연속 아미노산 서열과 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 550개, 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 660개, 적어도 670개, 적어도 671개 또는 적어도 672개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 키메라 TFR1 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 동물의 내인성 TFR1 조절 요소에 조작 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 키메라 TFR1 폴리펩티드는 내인성 TFR1 세포질 영역 및/또는 내인성 TFR1 막관통 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 동물의 내인성 TFR1 유전자좌에 통합된다.
일부 실시양태에서, 키메라 TFR1 폴리펩티드는 적어도 하나의 마우스 TFR1 활성 및/또는 적어도 하나의 인간 TFR1 활성을 갖는다.
일 양태에서, 본 개시는 키메라 TFR1을 발현하는 유전자 변형 동물 세포를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은: 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 키메라 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변형 동물 세포를 생성하게 되며, 일부 실시양태에서, 동물 세포는 키메라 TFR1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 동물은 마우스이다. 일부 실시양태에서, 키메라 TFR1은 마우스 TFR1의 세포질 영역 및/또는 막관통 영역; 및 인간 TFR1의 세포외 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 TFR1 조절 요소, 예를 들어, 프로모터에 조작 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 동물은 추가 인간 또는 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가 인간 또는 키메라 단백질은 세포예정사 단백질 1(PD-1), 세포예정사 리간드 1(PD-L1), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 4(OX40), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3) 또는 CD73이다.
일 양태에서, 본 개시는 암(예를 들어, 종양) 치료를 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 항-TFR1 항체를 본원에 기재된 동물에 투여하며, 일부 실시양태에서, 동물은 암(예를 들어, 종양)을 갖는, 단계; 및 b) 항-TFR1 항체의 암(예를 들어, 종양)에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암(예를 들어, 종양)은 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암(예를 들어, 종양)은 동물에 주입되는 하나 이상의 암세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체의 암에 대한 억제 효과를 결정하는 단계는 동물에 있는 종양 부피를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 뇌암, 유방암, 결장암, 간암, 난소암, 폐암, 골암, 백혈병 및/또는 림프종이다.
일 양태에서, 본 개시는 암 치료를 위한 항-TFR1 항체 및 추가 치료제의 유효성을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 항-TFR1 항체 및 추가 치료제를 본원에 기재된 동물에 투여하며, 일부 실시양태에서, 동물은 암(예를 들어, 종양)을 갖는, 단계; 및 b) 암(예를 들어, 종양)에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 키메라 세포예정사 단백질 1(PD-1)을 코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 키메라 세포예정사 리간드 1(PD-L1)을 코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체이다.
일부 실시양태에서, 암은 TFR1 및/또는 PD-L1을 발현하는 하나 이상의 암세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 암세포를 동물에 주입하여 야기된다. 일부 실시양태에서, 치료의 억제 효과를 결정하는 단계는 동물에 있는 종양 부피를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 동물은 뇌암, 유방암, 결장암, 간암, 난소암, 폐암, 골암, 백혈병 및/또는 림프종이 있다.
일 양태에서, 본 개시는 혈액뇌 장벽을 통과하는 치료제의 전달 효율을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 치료제를 본원에 기재된 동물에 투여하는 단계; 및 b) 동물의 뇌 및/또는 혈청에서 시간 경과에 따른 치료제의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 TFR1(예를 들어, 인간 TFR1) 및 제2 항원을 표적으로 하는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)이다.
일부 실시양태에서, 제2 항원은 베타-분비효소 1(BACE1) 또는 아밀로이드 베타이다.
일부 실시양태에서, 치료제의 농도는 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 또는 적어도 25시간의 기간에 걸쳐 결정된다.
일 양태에서, 본 개시는 골 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 항-TFR1 항체를 본원에 기재된 동물에 투여하며, 일부 실시양태에서, 동물은 골 질환을 갖는, 단계; 및 b) 골 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 골 질환은 골절, 골변성, 관절염, 골기형, 골다공증 및/또는 대퇴골두 괴사이다.
일 양태에서, 본 개시는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 항-TFR1 항체를 본원에 기재된 동물에 투여하며, 일부 실시양태에서, 동물은 신경퇴행성 질환을 갖는, 단계; 및 b) 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 신경퇴행성 질환은 뇌허혈, 뇌손상 또는 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및/또는 척수소뇌 실조증이다.
일 양태에서, 본 개시는 면역 장애를 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법에 관한 것이며, a) 항-TFR1 항체를 본원에 기재된 동물에 투여하며, 일부 실시양태에서, 동물은 면역 장애가 있는 단계; 및 b) 면역 장애를 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 장애는 알레르기, 천식, 심근염, 신염, 간염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 경피증, 갑상선항진증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 자가면역 용혈성 빈혈, 궤양성 대장염, 자가 면역 간 질환, 당뇨병, 통증 및/또는 신경 장애이다.
일 양태에서, 본 개시는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 관한 것이며, 일부 실시양태에서 아미노산 서열은 (a) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열; (b) 서열 번호: 1, 2 또는 9와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; (c) 서열 번호: 1, 2 또는 9와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열; (d) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열; 및 (e) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열에 대한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열 중 하나이다.
일 양태에서, 본 개시는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이며,일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 (a) 본원에 기재된 단백질을 코딩하는 서열; (b) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8; (c) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 90% 동일한 서열; 및 (d) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열 중 하나이다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 동물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시는 게놈이 동물의 내인성 TFR1 유전자에서 파괴를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 또한 제공하며, 여기서 내인성 TFR1의 유전자의 파괴는 내인성 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 TFR1 유전자의 파괴는 내인성 TFR1 유전자의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 엑손 또는 엑손의 부분의 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 TFR1 유전자의 파괴는 내인성 TFR1 유전자의 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 인트론 12, 인트론 13, 인트론 14, 인트론 15, 인트론 16, 인트론 17 및/또는 인트론 18로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인트론 또는 인트론의 부분의 결실을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 여기서 결실은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2100개, 2200개, 2300개, 2400개, 2500개, 2600개, 2700개, 2800개, 2900개, 3000개, 3100개, 3200개, 3300개, 3400개, 3500개, 3600개, 3700개, 3800개, 3900개, 4000개, 4100개, 4200개, 4300개, 4400개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 결실되는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 TFR1 유전자의 파괴는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개 또는 300개의 뉴클레오티드의 결실(엑손 4, 엑손 5 내지 18로부터 적어도 180개의 뉴클레오티드 및 엑손 19로부터 적어도 200개의 뉴클레오티드의 결실)을 포함한다.
본 개시는 또한 인간화 마우스의 TFR1 게놈 DNA 서열로서, 이의 전사에 의해 수득되는 mRNA의 역전사에 의해 수득되며, 이는 해당 DNA 서열과 일치하거나 상보적인 DNA 서열; 이의 아미노산 서열을 발현하는 작제물; 이의 작제물을 포함하는 세포; 이의 세포를 포함하는 조직에 관한 것이다.
본 개시는 인간 세포의 면역화 과정과 관련된 제품의 개발, 인간 항체의 제조, 또는 약리학, 면역학, 미생물학 및 의학의 연구를 위한 모델 시스템에 있어서, 비인간 포유동물 또는 이의 자손, 종양 보유 비인간 포유동물, 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용에 관한 것이다.
본 개시는 또한 인간 세포와 관련되는 면역화 과정의 동물 실험 질환 모델의 생산 및 활용, 병원체에 대한 연구 또는 새로운 진단적 전략 및/또는 치료적 전략의 개발에 있어서, 비인간 포유동물 또는 이의 자손, 종양 보유 비인간 포유동물, 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용에 관한 것이다.
본 개시는 또한 TFR1 유전자 기능, 인간 TFR1 항체, 인간 TFR1 표적화 부위에 대한 약물 또는 효능, 및 면역 관련 질환용 약물과 항종양 약물의 스크리닝, 검증, 평가 또는 연구에 있어서, 비인간 포유동물 또는 이의 자손, 종양 보유 비인간 포유동물, 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 모두 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료가 본원에서 설명되며 당업계에 알려진 다른 적합한 방법 및 재료도 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예시는 단지 예시적이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에서 언급되는 모든 공개, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 다른 참조문헌은 이들의 전체 내용이 인용방식으로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 적용된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 도면 및 청구범위에 따라 명백해질 것이다.
본 개시는 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1을 갖는 동물 모델에 관한 것이다. 동물 모델은 체내에서 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1) 단백질을 발현할 수 있다. 이는 TFR1 유전자의 기능에 대한 연구에 사용될 수 있으며, 항-인간 TFR1 항체의 스크리닝 및 평가에 사용될 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 방법으로 준비되는 동물 모델은 약물 스크리닝, 약력학 연구, 면역 관련 질환 치료 및 인간 TFR1 표적 부위에 대한 암 요법에 사용할 수 있으며, 또한, 신약 개발 및 설계를 촉진하고 시간과 비용을 절약하기 위해 사용될 수 있다. 요약하면, 본 개시는 TFR1 단백질의 기능을 연구하기 위한 강력한 도구와 항암 약물을 스크리닝하기 위한 플랫폼을 제공한다.
도 1은 마우스 및 인간 TFR1 유전자좌를 나타내는 개략도이다.
도 2는 인간화 TFR1 유전자좌를 나타내는 개략도이다.
도 3은 TFR1 유전자 표적화 전략을 나타내는 개략도이다.
도 4는 A 프로브 및 Neo 프로브를 사용한 재조합 후 세포의 서던 블롯 결과를 나타낸다. WT는 야생형 대조군이다.
도 5는 TFR1 유전자 인간화 마우스에서 Flp-Frt 재조합 과정을 나타내는 개략도이다.
도 6a 내지 도 6d는 각각 프라이머 쌍 Frt-F/Frt-R, WT-F/WT-R, Flp-F2/Flp-R2, 및 WT-F/Mut-R에 의한 F1 세대 마우스의 마우스 꼬리 PCR 식별 결과를 나타낸다. M은 마커이다. PC는 양성 대조군이다. WT는 야생형 대조군이다. H2O는 물 대조군이다.
도 7a 내지 도 7c는 야생형 C57BL/6 마우스(+/+) 및 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스(H/H)의 비장세포에서 각각 인간화 TFR1 mRNA, 마우스 TFR1 mRNA 및 GAPDH mRNA의 RT-PCR 검출 결과를 나타낸다. M은 마커이다. H2O는 물 대조군이다. GAPDH는 내부 참조이다.
도 8a는 ELISA로 결정한 마우스 뇌 조직에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 PK 검출 결과를 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 8b는 ELISA로 결정한 마우스 혈청에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 PK 검출 결과를 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 8c는 시간 경과에 따른 마우스 뇌 조직 대 혈청에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 농도 비율을 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 9는 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 마우스 TFR1 아미노산 서열(NP_035768.1; 서열 번호: 1) 사이의 정렬을 나타낸다.
도 10은 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 래트 TFR1 아미노산 서열(NP_073203.1; 서열 번호: 31) 사이의 정렬을 나타낸다.
도 2는 인간화 TFR1 유전자좌를 나타내는 개략도이다.
도 3은 TFR1 유전자 표적화 전략을 나타내는 개략도이다.
도 4는 A 프로브 및 Neo 프로브를 사용한 재조합 후 세포의 서던 블롯 결과를 나타낸다. WT는 야생형 대조군이다.
도 5는 TFR1 유전자 인간화 마우스에서 Flp-Frt 재조합 과정을 나타내는 개략도이다.
도 6a 내지 도 6d는 각각 프라이머 쌍 Frt-F/Frt-R, WT-F/WT-R, Flp-F2/Flp-R2, 및 WT-F/Mut-R에 의한 F1 세대 마우스의 마우스 꼬리 PCR 식별 결과를 나타낸다. M은 마커이다. PC는 양성 대조군이다. WT는 야생형 대조군이다. H2O는 물 대조군이다.
도 7a 내지 도 7c는 야생형 C57BL/6 마우스(+/+) 및 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스(H/H)의 비장세포에서 각각 인간화 TFR1 mRNA, 마우스 TFR1 mRNA 및 GAPDH mRNA의 RT-PCR 검출 결과를 나타낸다. M은 마커이다. H2O는 물 대조군이다. GAPDH는 내부 참조이다.
도 8a는 ELISA로 결정한 마우스 뇌 조직에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 PK 검출 결과를 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 8b는 ELISA로 결정한 마우스 혈청에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 PK 검출 결과를 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 8c는 시간 경과에 따른 마우스 뇌 조직 대 혈청에서의 항-인간 TFR1 항체 Ab의 농도 비율을 나타낸다. 인간 IgG1(hIgG)은 대조군이다.
도 9는 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 마우스 TFR1 아미노산 서열(NP_035768.1; 서열 번호: 1) 사이의 정렬을 나타낸다.
도 10은 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 래트 TFR1 아미노산 서열(NP_073203.1; 서열 번호: 31) 사이의 정렬을 나타낸다.
본 개시는 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1을 갖는 유전자 변형 비인간 동물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
철은 산소 운반, 에너지 생성/미토콘드리아 기능, 또한 DNA 합성 및 복구를 포함하는 여러 생물학적 과정에서 필수적인 요소이다. 암세포의 맥락에서, DNA 합성을 촉진하면 증식이 증가하며, DNA 복구 능력이 향상되면 암세포 사이에서 보편적으로 일어나는 돌연변이 부담 증가로 인한 DNA 손상을 복구하는 데 도움이 된다. 철 대사 조절의 중심 단백질은 트랜스페린(Tf) 및 이의 수용체이다. 철의 주요 세포 섭취원으로서, 트랜스페린 수용체 1(TFR1) 기능은 철 관련 과정에 매우 중요하며 TFR1을 통한 Tf 결합 철의 흡수는 일반적으로 세포 철 섭취의 주요 공급원이다.
철 항상성의 파괴는 세포에 잠재적으로 해로운 결과를 초래할 수 있으므로 TFR1의 발현은 엄격하게 조절된다. 그러나, TFR1은 많은 상이한 유형의 암세포에서 과발현되며, 흔히 정상 세포보다 여러 배 더 높은 수준으로 과발현된다. 실제로, TFR1은 보편적인 암 마커로 인식되어 왔다. TFR1의 발현 증가는 다수의 암, 예를 들어, 고형암, 예컨대, 식도 편평 세포 암종, 유방암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 골육종, 췌장암, 담관 암종, 신세포 암종, 간세포 암종, 부신 피질 암종 및 신경계의 암뿐만 아니라 조혈 악성 종양, 예컨대, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL)에서 진행된 단계 및/또는 더 불량한 예후와 상관관계가 있다. 따라서, TFR1은 암에 대한 잠재적인 바이오마커 및 치료 표적으로 간주된다.
또한, 혈액뇌 장벽의 내피 세포에서 발현되는 TFR1은 항체를 포함한 거대 분자를 뇌로 전달하기 위해 사용된다. TFR1 표적화 항체 중 일부는 철 흡수를 방해하지 않고 혈액뇌 장벽을 통과하는 것으로 나타났다. 항체-TfR 상호작용의 친화도는 혈액뇌 장벽의 내피 세포를 통한 세포통과 운반의 성공을 결정하는 데 중요한 것으로 보인다.
실험 동물 모델은 이러한 항체(예를 들어, 항-TFR1 항체)의 효과를 연구하는 데 없어서는 안 될 연구 도구이다. 일반적인 실험 동물은 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼, 개, 원숭이, 돼지, 물고기 등이 있다. 그러나, 인간과 동물 사이의 유전자 및 단백질 서열은 많은 차이가 있고, 많은 인간 단백질은 동물의 상동성 단백질과 결합하여 생물학적 활성을 생성할 수 없으며, 이는 많은 임상시험 결과가 동물 실험으로부터 수득되는 결과와 일치하지 않는 경우를 초래한다. 많은 수의 임상 연구는 더 양호한 동물 모델이 시급히 필요하다. 유전 공학 기술의 지속적인 발전 및 성숙에 따라, 동물의 내인성 유사 세포 또는 유전자를 대체하거나 치환하여 인간에 더 근접한 생물학적 시스템 또는 질환 모델을 확립하고 인간화 실험 동물 모델(인간화 동물 모델)을 확립하기 위한 인간의 세포 또는 유전자의 사용은 새로운 임상적 접근법 또는 수단을 위한 중요한 도구를 제공해왔다. 이러한 맥락에서, 유전자 조작 동물 모델, 즉, 유전자 조작 기법의 사용, 동물의 상동성 유전자를 대체하기 위한 인간 정상 또는 돌연변이 유전자의 사용은 인간 유전자 시스템에 더 근접한 유전자 변형 동물 모델을 확립하기 위해 사용될 수 있다. 인간화 동물 모델은 다양한 중요한 응용이 있다. 예를 들어, 인간 또는 인간화 유전자의 존재로 인해, 동물은 인간의 기능을 갖는 단백질을 발현하거나 이의 부분을 발현할 수 있어 인간과 동물 사이의 임상 시험의 차이를 크게 감소시키고 동물 수준에서의 약물 스크리닝의 가능성을 제공한다.
TFR1
분화 클러스터 71(CD71)로도 알려진 트랜스페린 수용체 1(TFR1)은 널리 발현되며 높은 친화도로 트랜스페린(Tf)에 결합할 수 있다. 인간 TFR1은 세포 표면에서 이황화 결합으로 연결되는 이량체(180kDa)로 발견되는 760개의 아미노산으로 구성되는 90kDa 유형 II 막관통 당단백질이다. TFR1 단량체는 Tf 결합 부위를 함유하는 671개의 아미노산의 대형 세포외 C-말단 도메인, 막관통 도메인(28개의 아미노산) 및 세포내 N-말단 도메인(61개의 아미노산)으로 구성된다. C-말단 세포외 도메인은 아스파라긴 잔기 251, 317 및 727에서 3개의 N-연결 글리코실화 부위 및 트레오닌 104에서 1개의 O-연결 글리코실화 부위를 함유하며, 이는 모두 수용체의 적절한 기능에 필요하다.
트랜스페린(Tf), 이는 짧은 링커 서열에 의해 분리되는 N-로브 및 C-로브로 알려진 2개의 40kDa 서브유닛으로 구성되는 80kDa 당단백질이다. 각 서브유닛은 하나의 유리 제2철(Fe3+)에 결합할 수 있으며, 따라서 Tf에는 최대 2개의 철 원자가 부착될 수 있다. 철 유리 형태의 Tf인 apo-Tf는 혈액에서 높은 효율로 Fe3+에 결합하며 TFR1과의 상호작용을 통해 내부화를 위해 이를 세포 표면으로 운반한다. 철 섭취를 조절하는 막 단백질로서, TFR1은 Fe3+에 결합되는 트랜스페린(Tf)에 대해 나노몰 친화도를 나타내는 TFR 패밀리의 구성원이다. Tf-TFR1 착물은 클라트린에 의해 매개되는 내포작용을 통해 내부화되며, Fe3+는 pH가 5.5로 감소하는 경우 Tf로부터 해리된다. 이러한 pH에서 apo-Tf 및 TFR1은 여전히 생리적 pH로 회합하여 세포 표면에 재활용되며, 따라서 전자가 방출된다.
트랜스페린 수용체에 의한 철 흡수는 암세포가 철을 흡수하는 중요한 방법이며, 이로써, TFR1이 종양 발병 및 진행에 참여하였고 이의 발현이 많은 암에서 유의하게 조절되지 않았다는 증거가 축적된다. TFR1과 암 사이의 관계가 밝혀져 TFR1은 암에 개입하기 위한 귀중한 약제학적 표적이 되었다.
혈액뇌 장벽의 내피 세포에서 발현되는 TFR1은 또한 항체를 포함한 거대 분자를 뇌로 전달하기 위한 전임상 연구에 사용된다. TFR1 표적화 항체 중 일부는 철 흡수를 방해하지 않고 혈액뇌 장벽을 통과하는 것으로 나타났다.
TFR1, Tf 및 이들의 기능에 대한 상세한 설명은 예를 들어 Candelaria, P. V. 등. "Antibodies targeting the transferrin receptor 1 (TfR1) as direct anti-cancer agents." Frontiers in Immunology 12 (2021): 607692; 및 Shen, Y. 등. "Transferrin receptor 1 in cancer: a new sight for cancer therapy." American Journal of Cancer Research 8.6 (2018): 916에서 발견할 수 있으며; 이들은 각각의 전체 내용이 인용방식으로 포함된다.
인간 게놈에서, TFR1 유전자(유전자 ID: 7037)좌는 19개의 엑손인 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및 엑손 19를 갖는다(도 1). TFR1 단백질은 또한 N-말단으로부터 C-말단까지 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는다. 인간 TFR1 mRNA의 뉴클레오티드 서열은 NM_003234.4이고, 인간 TFR1의 아미노산 서열은 NP_003225.2(서열 번호: 2)이다. 인간 TFR1 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 각 엑손 및 각 영역의 위치는 아래에 나열되어 있다:
|
인간 TFR1
(대략적인 위치) |
NM_003234.4
5224bp |
NP_003225.2
760aa(서열 번호: 2) |
| 엑손 1 | 1-260 | 0 |
| 엑손 2 | 261-319 | 1-12 |
| 엑손 3 | 320-521 | 13-79 |
| 엑손 4 | 522-717 | 80-145 |
| 엑손 5 | 718-867 | 146-195 |
| 엑손 6 | 868-970 | 196-229 |
| 엑손 7 | 971-1084 | 230-267 |
| 엑손 8 | 1085-1183 | 268-300 |
| 엑손 9 | 1184-1323 | 301-347 |
| 엑손 10 | 1324-1481 | 348-399 |
| 엑손 11 | 1482-1601 | 400-439 |
| 엑손 12 | 1602-1687 | 440-468 |
| 엑손 13 | 1688-1751 | 469-489 |
| 엑손 14 | 1752-1819 | 490-512 |
| 엑손 15 | 1820-1878 | 513-532 |
| 엑손 16 | 1879-1960 | 533-559 |
| 엑손 17 | 1961-2182 | 560-633 |
| 엑손 18 | 2183-2323 | 634-647 |
| 엑손 19 | 2324-5224 | 648-760 |
| 세포질 | 284-484 | 1-67 |
| 막관통 | 485-547 | 68-88 |
| 세포외 | 548-2563 | 89-760 |
| 공여체 영역 | 548-2566 | 89-760 |
인간 TFR1 유전자(유전자 ID: 7037)는 인간 게놈의 염색체 16에 위치하며 NC_000003.12의 196018694 내지 1960821231에 위치한다. 전사체 NM_003234.4를 기준으로 5’ UTR은 196082043 내지 196082090 및 196077100 내지 196077122이며; 엑손 1 196082090 내지 196082043이며; 제1 인트론은 196082042 내지 196077123이며; 엑손 2는 196077122 내지 196077064이며; 제2 인트론은 196077063 내지 196075361이며; 엑손 3은 196075360 내지 196075159이며; 제3 인트론은 196075158 내지 196074126이며; 엑손 4는 196074125 내지 196073930이며; 제4 인트론은 196073929 내지 196072153이며; 엑손 5는 196072152 내지 196072003이며; 제5 인트론은 196072002 내지 196071499이며; 엑손 6은 196071498 내지 196071396이며; 제6 인트론은 196071395 내지 196069569이며; 엑손 7은 196069568 내지 196069455이며; 제7 인트론은 196069454 내지 196068131이며; 엑손 8은 196068130 내지 196068032이며; 제8 인트론은 196068031 내지 196067658이며; 엑손 9는 196067657 내지 196067518이며; 제9 인트론은 196067517 내지 196065601이며; 엑손 10은 196065600 내지 196065443이며; 제10 인트론은 196065442 내지 196064429이며; 엑손 11은 196064428 내지 196064309이며; 제11 인트론은 196064308 내지 196062940이며; 엑손 12는 196062939 내지 196062854이며; 제12 인트론은 196062853 내지 196062646이며; 엑손 13은 196062645 내지 196062582이며; 제13 인트론은 196062581 내지 196060248이며; 엑손 14는 196060247 내지 196060180이며; 제14 인트론은 196060179 내지 196058633이며; 엑손 15는 196058632 내지 196058574이며; 제15 인트론은 196058573 내지 196058366이며; 엑손 16은 196058365 내지 196058284이며; 제16 인트론은 196058283 내지 196055302이며; 엑손 17은 196055301 내지 196055080이며; 제17 인트론은 196055079 내지 196053559이며; 엑손 18은 196053558 내지 196053418이며; 제18 인트론은 196053417 내지 196052185이며; 엑손 19는 196052184 내지 196049284이며, 3’UTR은 196049284 내지 196051941이다. 마우스 TFR1 유전자좌에 대한 모든 관련 정보는 유전자 ID: 7037로 NCBI 웹사이트에서 발견할 수 있다.
마우스에서 TFR1 유전자좌는 19개의 엑손인 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및 엑손 19를 갖는다(도 1). 마우스 TFR1 단백질은 또한 N-말단으로부터 C-말단까지 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는다. 마우스 TFR1 mRNA의 뉴클레오티드 서열은 NM_011638.4이고 마우스 TFR1의 아미노산 서열은 NP_035768.1(서열 번호: 1)이다. 마우스 TFR1 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 각 엑손 및 각 영역의 위치는 아래에 나열되어 있다:
|
마우스 TFR1
(대략적인 위치) |
NM_011638.4
4920bp |
NP_035768.1
763aa(서열 번호: 1) |
| 엑손 1 | 1-141 | 0 |
| 엑손 2 | 142-200 | 1-12 |
| 엑손 3 | 201-402 | 13-79 |
| 엑손 4 | 403-604 | 80-147 |
| 엑손 5 | 605-754 | 148-197 |
| 엑손 6 | 755-857 | 198-231 |
| 엑손 7 | 858-971 | 232-269 |
| 엑손 8 | 972-1070 | 270-302 |
| 엑손 9 | 1071-1210 | 303-349 |
| 엑손 10 | 1211-1368 | 350-401 |
| 엑손 11 | 1369-1491 | 402-442 |
| 엑손 12 | 1492-1577 | 443-471 |
| 엑손 13 | 1578-1641 | 472-492 |
| 엑손 14 | 1642-1709 | 493-515 |
| 엑손 15 | 1710-1768 | 516-535 |
| 엑손 16 | 1769-1850 | 536-562 |
| 엑손 17 | 1851-2072 | 563-636 |
| 엑손 18 | 2073-2213 | 637-683 |
| 엑손 19 | 2214-4914 | 684-763 |
| 세포질 | 142-359 | 1-65 |
| 막관통 | 360-428 | 66-88 |
| 세포외 | 429-2453 | 89-763 |
| 대체된 영역 | 429-2456 | 89-763 |
마우스 TFR1 유전자(유전자 ID: 22042)는 마우스 게놈의 염색체 16에 위치하며 NC_000082.7의 32427714 내지 32451612에 위치한다. 전사체 NM_011638.4를 기준으로 5’ UTR은 32427738 내지 32427854 및 32431986 내지 32432008이며; 엑손 1 32427738 내지 32427854이며; 제1 인트론은 32427855 내지 32431985이며; 엑손 2는 32431986 내지 32432044이며; 제2 인트론은 32432045 내지 32433383이며; 엑손 3은 32433384 내지 32433585이며; 제3 인트론은 32433586 내지 32434010이며; 엑손 4는 32434011 내지 32434212이며; 제4 인트론은 32434213 내지 32435566이며; 엑손 5는 32435567 내지 32435716이며; 제5 인트론은 32435717 내지 32435914이며; 엑손 6은 32435915 내지 32436017이며; 제6 인트론은 32436018 내지 32437035이며; 엑손 7은 32437036 내지 32437149이며; 제7 인트론은 32437150 내지 32437450이며; 엑손 8은 32437451 내지 32437549이며; 제8 인트론은 32437550 내지 32437854이며; 엑손 9는 32437855 내지 32437994이며; 제9 인트론은 32437995 내지 32439183이며; 엑손 10은 32439184 내지 32439341이며; 제10 인트론은 32439342 내지 32439992이며; 엑손 11은 32439993 내지 32440115이며; 제11 인트론은 32440116 내지 32441874이며; 엑손 12는 32441875 내지 32441960이며; 제12 인트론은 32441961 내지 32442189이며; 엑손 13은 32442190 내지 32442253이며; 제13 인트론은 32442254 내지 32443186이며; 엑손 14는 32443187 내지 32443254이며; 제14 인트론은 32443255 내지 32443585이며; 엑손 15는 32443586 내지 32443644이며; 제15 인트론은 32443645 내지 32443801이며; 엑손 16은 32443802 내지 32443883이며; 제16 인트론은 32443884 내지 32445366이며; 엑손 17은 32445367 내지 32445588이며; 제17 인트론은 32445589 내지 32447293이며; 엑손 18은 32447294 내지 32447434이며; 제18 인트론은 32447435 내지 32448911이며; 엑손 19는 32448912 내지 32451612이며, 3’UTR은 32449155 내지 32451612이다. 마우스 TFR1 유전자좌에 대한 모든 관련 정보는 유전자 ID: 22042로 NCBI 웹사이트에서 발견할 수 있으며, 이의 전체 내용이 인용방식으로 본원에 포함된다.
도 9는 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 마우스 TFR1 아미노산 서열(NP_035768.1; 서열 번호: 1) 사이의 정렬을 나타낸다. 따라서, 인간과 마우스 TFR1 사이의 상응하는 아미노산 잔기 또는 영역은 도 9에서 발견할 수 있다.
다른 종의 TFR1 유전자, 단백질 및 유전자좌 또한 당업계에서 알려져 있다. 예를 들어, Rattus norvegicus(래트)의 TFR1에 대한 유전자 ID는 64678이고, Felis catus(고양이)의 TFR1에 대한 유전자 ID는 493880이며, Canis lupus familiaris(개)의 TFR1에 대한 유전자 ID는 403703이고, Sus scrofa(돼지)의 TFR1에 대한 유전자 ID는 397062이다. 이러한 유전자에 대한 관련 정보(예를 들어, 이러한 단백질의 인트론 서열, 엑손 서열, 아미노산 잔기)는 예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 발견할 수 있으며, 이의 전체 내용이 인용방식으로 본원에 포함된다. 도 10은 인간 TFR1 아미노산 서열(NP_003225.2; 서열 번호: 2)과 래트 TFR1 아미노산 서열(NP_073203.1; 서열 번호: 31) 사이의 정렬을 나타낸다. 따라서, 인간과 설치류 TFR1 사이의 상응하는 아미노산 잔기 또는 영역은 도 10에서 발견할 수 있다.
본 개시는 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 마우스 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 엑손 19, 세포질 영역, 막관통 영역 및/또는 세포외 영역의 전체 서열은 상응하는 인간 서열에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, 마우스 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 엑손 19, 세포질 영역, 막관통 영역 및/또는 세포외 영역의 "영역" 또는 "일부"는 상응하는 인간 서열에 의해 대체된다. 용어 "영역" 또는 "일부"는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개의 뉴클레오티드 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 650개, 660개 또는 670개의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, "영역" 또는 "일부"는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 엑손 19, 세포질 영역, 막관통 영역 또는 세포외 영역과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 영역, 부분 또는 전체 서열(예를 들어, 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)은 인간 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 및/또는 엑손 19의 영역, 부분 또는 전체 서열(예를 들어, 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 세포질 영역, 막관통 영역, 세포외 영역, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 "영역" 또는 "일부"가 결실된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 게놈이 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1 뉴클레오티드 서열은 세포외 영역을 포함하는 TFR1 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포외 영역은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 영역은 인간 TFR1 세포외 영역의 전체 또는 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동물의 게놈은 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 비인간 동물은 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TFR1 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 인간 또는 인간화 세포질 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 내인성 세포질 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 인간 또는 인간화 막관통 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 내인성 막관통 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 인간 또는 인간화 세포외 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 단백질은 내인성 세포외 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 비인간 동물은 인간 또는 인간화 TFR1 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 19개의 엑손을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 내인성 또는 인간화 엑손 1, 내인성 또는 인간화 엑손 2, 내인성 또는 인간화 엑손 3, 인간 또는 인간화 엑손 4, 인간 또는 인간화 엑손 5, 인간 또는 인간화 엑손 6, 인간 또는 인간화 엑손 7, 인간 또는 인간화 엑손 8, 인간 또는 인간화 엑손 9, 인간 또는 인간화 엑손 10, 인간 또는 인간화 엑손 11, 인간 또는 인간화 엑손 12, 인간 또는 인간화 엑손 13, 인간 또는 인간화 엑손 14, 인간 또는 인간화 엑손 15, 인간 또는 인간화 엑손 16, 인간 또는 인간화 엑손 17, 인간 또는 인간화 엑손 18 및/또는 인간 또는 인간화 엑손 19를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 내인성 또는 인간화 인트론 1, 내인성 또는 인간화 인트론 2, 인간 또는 인간화 인트론 3, 인간 또는 인간화 인트론 4, 인간 또는 인간화 인트론 5, 인간 또는 인간화 인트론 6, 인간 또는 인간화 인트론 7, 인간 또는 인간화 인트론 8, 인간 또는 인간화 인트론 9, 인간 또는 인간화 인트론 10, 인간 또는 인간화 인트론 11, 인간 또는 인간화 인트론 12, 인간 또는 인간화 인트론 13, 인간 또는 인간화 인트론 14, 인간 또는 인간화 인트론 15, 인간 또는 인간화 인트론 16, 인간 또는 인간화 인트론 17 및/또는 인간 또는 인간화 인트론 18을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 인간 또는 인간화 5’ UTR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 인간 또는 인간화 3’ UTR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 내인성 5’ UTR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자는 내인성 3’ UTR을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시는 또한 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 제공하며, 여기서 일부 실시양태에서, 서열의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%는 마우스 TFR1 mRNA 서열(예를 들어, NM_011638.4), 마우스 TFR1 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호: 1) 또는 이들의 부분(예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4의 부분 및 엑손 19의 부분)과 동일하거나 이로부터 유래되며, 일부 실시양태에서, 서열의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%는 TFR1 mRNA 서열(예를 들어, NM_003234.4), 인간 TFR1 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호: 2) 또는 이들의 부분(예를 들어, 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)과 동일하거나 이로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 마우스 TFR1의 아미노산 89 내지 763을 코딩하는 서열(서열 번호: 1)이 대체된다. 일부 실시양태에서, 서열은 인간 TFR1의 상응하는 영역(예를 들어, 인간 TFR1의 아미노산 89 내지 760(서열 번호: 2))을 코딩하는 서열에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산은 프로모터 또는 조절 요소, 예를 들어, 내인성 마우스 TFR1 프로모터, 유도성 프로모터, 인핸서 및/또는 마우스 또는 인간 조절 요소에 조작 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 전체 마우스 TFR1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NM_011638.4의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)과 상이한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 뉴클레오티드)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 전체 마우스 TFR1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NM_011638.4의 엑손 1 내지 3, 엑손 4의 부분 및 엑손 19의 부분)과 동일한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 뉴클레오티드)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 전체 인간 TFR1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NM_003234.4의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4의 부분 및 엑손 19의 부분)과 상이한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 뉴클레오티드)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 전체 인간 TFR1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NM_003234.4의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)과 동일한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 뉴클레오티드)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 전체 마우스 TFR1 아미노산 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NP_ 035768.1(서열 번호: 1)의 아미노산 89 내지 763)과 상이한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 아미노산 잔기)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 전체 마우스 TFR1 아미노산 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NP_ 035768.1(서열 번호: 1)의 아미노산 1 내지 88)과 동일한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 아미노산 잔기)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 전체 인간 TFR1 아미노산 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NP_003225.2(서열 번호: 2)의 아미노산 1 내지 88)과 상이한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 아미노산 잔기)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 전체 인간 TFR1 아미노산 서열 또는 이의 부분(예를 들어, NP_003225.2(서열 번호: 2)의 아미노산 89 내지 760)과 동일한 적어도 부분(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 연속적 또는 불연속적 아미노산 잔기)을 갖는다.
본 개시는 또한 인간화 TFR1 마우스 아미노산 서열을 제공하며, 여기서 아미노산 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
a) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열;
b) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖거나 적어도 90% 동일한 아미노산 서열;
c) 낮은 엄격성 조건 또는 엄격한 엄격성 조건 하에서 서열 번호: 1, 2, 또는 9에 나타난 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열;
d) 서열 번호: 1, 2 또는 9와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖거나 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열;
e) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열; 또는
f) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열.
본 개시는 또한 인간화 TFR1 아미노산 서열을 제공하며, 여기서 아미노산 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
a) 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760의 전부 또는 부분;
b) 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열; 및
d) 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열.
본 개시는 또한 인간화 TFR1 아미노산 서열을 제공하며, 여기서 아미노산 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
a) 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 88의 전부 또는 부분;
b) 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 88과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 88과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열;
d) 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 88에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열.
본 개시는 또한 TFR1 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열에 관한 것이며, 여기서 핵산 서열은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다:
a) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 바와 같은 핵산 서열 또는 인간화 마우스 TFR1의 상동성 TFR1 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
b) 낮은 엄격성 조건 또는 엄격한 엄격성 조건 하에서 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열;
c) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖거나 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열;
d) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖거나 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
e) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 갖거나 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
f) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및/또는
g) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열.
본 개시는 인간화 마우스의 TFR1 게놈 DNA 서열에 더 관한 것이다. DNA 서열은 이의 전사에 의해 수득되는 mRNA의 역전사에 의해 수득되며, 이는 서열 번호: 5 또는 8에 나타난 서열과 상동적인 DNA 서열과 일치하거나 상보적이다.
본 개시는 또한 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖거나 적어도 90% 동일하며 단백질 활성을 갖는 아미노산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호: 1, 2 또는 11에 나타난 서열과의 상동성은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서 전술한 상동성은 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 또는 85%이다.
일부 실시양태에서, 서열 번호: 1, 2 또는 9에 나타난 서열과의 백분율 동일성은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서 전술한 백분율 동일성은 적어도 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 또는 85%이다.
본 개시는 또한 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖거나 적어도 90% 동일하며 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 서열과의 상동성은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서 전술한 상동성은 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 또는 85%이다.
일부 실시양태에서, 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 나타난 서열과의 백분율 동일성은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%이다. 일부 실시양태에서 전술한 백분율 동일성은 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 또는 85%이다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열 및 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 500개 또는 600개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 미만의 아미노산 잔기이다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 (i) 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열로 구성되며, 여기서 아미노산 서열은 본원에 기재된 서열 중 임의의 하나이다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 (i) 핵산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 핵산 서열로 구성되며, 여기서 핵산 서열은 본원에 기재된 서열 중 임의의 하나이다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 해당 서열을 최적의 비교를 목적으로 정렬한다(예를 들어, 갭을 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입할 수 있고, 비상동성 서열을 비교 목적을 위해 무시할 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 마찬가지로 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 양 서열 사이의 동일성 백분율은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입해야 하는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일 위치 수의 함수이다. 예를 들어, 서열 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 백분율 결정은 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4 및 프레임시프트 갭 페널티 5를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.
유사한 물리화학적 특성(상동성 백분율)으로 보존되는 잔기, 예를 들어, 류신 및 이소류신의 백분율을 또한 서열 유사성을 측정하기 위해 사용할 수 있다. 유사한 물리화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 무극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 많은 경우, 상동성 백분율은 동일성 백분율보다 더 높다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포, 조직 및 동물(예를 들어, 마우스)뿐만 아니라 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1을 내인성 비인간 TFR1 유전자좌로부터 발현하는 세포, 조직 및 동물(예를 들어, 마우스)가 또한 제공된다.
유전자 변형 동물
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 변형 비인간 동물"은 동물 게놈의 적어도 하나의 염색체에 외인성 DNA를 갖는 비인간 동물을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 비인간 동물의 적어도 하나 이상의 세포, 예를 들어, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%의 세포는 게놈에 외인성 DNA를 갖는다. 외인성 DNA를 갖는 세포는 다양한 종류의 세포, 예를 들어 내인성 세포, 체세포, 면역 세포, T 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 생식 세포, 배반포 또는 내인성 종양 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 서열(예를 들어, 인간 서열)을 포함하는 변형 내인성 TFR1 유전자좌, 예를 들어, 하나 이상의 비인간 서열을 하나 이상의 인간 서열로의 대체를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 동물은 일반적으로 변형을 자손에게, 즉 생식계열 전달을 통해 전달할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 유전자" 또는 "키메라 핵산"은 유전자 또는 핵산의 2개 이상의 부분이 상이한 종으로부터 유래되거나 유전자 또는 핵산의 서열 중 적어도 하나가 동물의 야생형 핵산에 상응하지 않는 유전자 또는 핵산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 키메라 유전자 또는 키메라 핵산은 2개 이상의 상이한 공급원으로부터 유래한 서열, 예를 들어, 상이한 단백질을 코딩하는 서열 또는 2개 이상의 상이한 단백질의 동일한(또는 상동성) 단백질을 코딩하는 서열의 적어도 하나의 부분을 갖는다.
일부 실시양태에서, 키메라 유전자 또는 키메라 핵산은 인간화 유전자 또는 인간화 핵산이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩티드"는 단백질 또는 폴리펩티드의 2개 이상의 부분이 상이한 종으로부터 유래되거나 단백질 또는 폴리펩티드의 서열 중 적어도 하나가 동물의 야생형 아미노산 서열에 상응하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 2개 이상의 상이한 공급원으로부터 유래한 서열 중 적어도 하나의 부분, 예를 들어, 상이한 종의 동일한(또는 상동성) 단백질을 갖는다.
일부 실시양태에서, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 인간화 단백질 또는 인간화 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 단백질" 또는 "인간화 폴리펩티드"는 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 부분이 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드로부터 유래한 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 인간화 단백질 또는 폴리펩티드는 인간 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 핵산"은 핵산의 적어도 부분이 인간으로부터 유래한 핵산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 인간화 핵산의 전체 핵산은 인간으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 인간화 핵산은 인간화 엑손이다. 인간화 엑손은 예를 들어, 인간 엑손 또는 키메라 엑손일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 유전자 또는 키메라 핵산은 인간화 TFR1 유전자 또는 인간화 TFR1 핵산이다.
일부 실시양태에서, 유전자 또는 핵산의 적어도 하나 이상의 부분은 인간 TFR1 유전자로부터 유래되고, 유전자 또는 핵산의 적어도 하나 이상의 부분은 비인간 TFR1 유전자로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 유전자 또는 핵산은 TFR1 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 코딩된 TFR1 단백질은 기능적이거나 인간 TFR1 단백질 또는 비인간 TFR1 단백질의 적어도 하나의 활성, 예를 들어, 트랜스페린과의 상호작용; 내포작용에 의한 철의 세포성 흡수 조절; 및 철 항상성 유지를 갖는다.
일부 실시양태에서, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 인간화 TFR1 단백질 또는 인간화 TFR1 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나 이상의 부분은 인간 TFR1 단백질로부터 유래되고, 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나 이상의 부분은 비인간 TFR1 단백질로부터 유래된다. 인간화 TFR1 단백질 또는 인간화 TFR1 폴리펩티드는 기능적이거나 인간 TFR1 단백질 또는 비인간 TFR1 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포질 영역은 인간 또는 인간화 세포질 영역이다. 일부 실시양태에서, 세포질 영역은 내인성 세포질 영역이다.
일부 실시양태에서, 막관통 영역은 인간 또는 인간화 막관통 영역이다. 일부 실시양태에서, 막관통 영역은 내인성 막관통 영역이다. 일부 실시양태에서, 세포외 영역은 인간 또는 인간화 세포외 영역이다.
일부 실시양태에서, 세포외 영역은 내인성 세포외 영역이다.
유전자 변형 비인간 동물은 다양한 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들어, 예를 들어 마모셋, 붉은털 원숭이)일 수 있다. 적합한 유전적으로 변형 가능한 배아 줄기(ES) 세포를 용이하게 이용 가능하지 않은 비인간 동물의 경우, 다른 방법이 유전적 변형을 포함하는 비인간 동물을 만들어내기 위해 사용된다. 이러한 방법은 예를 들어, 비ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유모세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형하는 단계 및 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포로 이동시키기 위해 핵 이동을 사용하는 단계 및 배아를 형성하기 위해 적합한 조건 하에서 비인간 동물에서 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 임신시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 당업계에서 알려져 있고, 예를 들어, A. Nagy, 등, "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (제3판)," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003에서 설명되어 있으며, 이의 전체 내용이 인용방식으로 본원에 포함된다.
일 양태에서, 동물은 포유동물, 예를 들어, 슈퍼패밀리 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 포유동물이다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물은 설치류이다. 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스 유사 햄스터(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터(hamster), 신세계 래트(New World rat) 및 신세계 마우스(New World mouse), 들쥐(vole)), 쥐과(Muridae)(진성 마우스(true mouse) 및 진성 래트(true rat), 게르빌루스쥐(gerbil), 아프리카가시쥐(spiny mouse), 갈기쥐(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(나무타기쥐(climbing mice), 바위쥐(rock mice), 흰꼬리쥐(white tailed rat), 마다가스카르 래트(Malagasy rat) 및 마다가스카르 마우스(Malagasy mice)), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormice)), 및 장님쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 두더지쥐(mole rat), 대나무쥐(bamboo rat) 및 장님두더지쥐(zokor))로부터 선택되는 과로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 설치류는 진성 마우스 또는 래트(쥐과(Muridae) 패밀리), 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐 및 갈기쥐로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 비인간 동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 계통의 마우스이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 계통으로 구성되는 군으로부터 선택되는 129 계통이다. 이러한 마우스는 Festing 등, Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10: 836 (1999); Auerbach 등, Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines (2000)에서 설명되어 있으며, 이들의 전체 내용이 모두 인용방식으로 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 마우스는 129 계통와 C57BL/6 계통의 혼합이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 129 계통의 혼합 또는 BL/6 계통의 혼합이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 BALB 계통와 다른 계통의 혼합이다.
일부 실시양태에서, 마우스는 혼성 계열(hybrid line)이다(예를 들어, 50% BALB/c-50% 12954/Sv; 또는 50% C57BL/6-50% 129).
일부 실시양태에서, 비인간 동물은 설치류이다.
일부 실시양태에서, 비인간 동물은 BALB/c, A, A/He, A/J, A/WySN, AKR, AKR/A, AKR/J, AKR/N, TA1, TA2, RF, SWR, C3H, C57BR, SJL, C57L, DBA/2, KM, NIH, ICR, CFW, FACA, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL (C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola), C58, CBA/Br, CBA/Ca, CBA/J, CBA/st 또는 CBA/H 배경을 갖는 마우스이다.
일부 실시양태에서, 동물은 래트이다. 래트는 Wistar 래트, LEA 계통, Sprague Dawley 계통, Fischer 계통, F344, F6 및 Dark Agouti로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 래트 계통은 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 및 Dark Agouti로부터 선택되는 2종 이상의 계통의 혼합이다.
동물은 인간화 TFR1 동물을 만들어내는 특정 목적에 적합한 하나 이상의 다른 유전적 변형 및/또는 다른 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 이종이식(예를 들어, 인간 암 또는 종양)을 유지하는 데 적합한 마우스는 전체적으로 또는 부분적으로 비인간 동물의 면역계를 손상시키거나 비활성화하거나 파괴하는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 비인간 동물의 면역계의 손상, 비활성화 또는 파괴는 예를 들어, 화학적 수단(예를 들어, 독소 투여), 물리적 수단(예를 들어, 동물에 방사선 조사) 및/또는 유전적 변형(예를 들어, 하나 이상의 유전자를 녹아웃)에 의한 조혈 세포 및/또는 면역 세포의 파괴를 포함할 수 있다. 이러한 마우스의 비제한적 예는 NOD 마우스, SCID 마우스, NOD/SCID 마우스, IL2Rγ 녹아웃 마우스, NOD/SCID/γcnull 마우스(Ito, M. 등, NOD/SCID/ γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells, Blood 100(9): 3175-3182, 2002), 누드 마우스 및 Rag1 및/또는 Rag2 녹아웃 마우스를 포함한다. 이러한 마우스는 선택적으로 방사선을 조사하거나 다른 방식으로 처리하여 하나 이상의 면역 세포 유형을 파괴할 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 내인성 비인간 TFR1 유전자좌의 적어도 부분의 인간화를 포함할 수 있으며 전체적으로 또는 부분적으로 비인간 동물의 면역계(또는 면역계의 하나 이상의 세포 유형)를 손상시키거나 비활성화하거나 파괴하는 변형을 더 포함하는 유전자 변형 마우스가 제공된다.
일부 실시양태에서, 변형은 예를 들어, NOD 마우스, SCID 마우스, NOD/SCID 마우스, IL-2Rγ 녹아웃 마우스, NOD/SCID/γcnull 마우스, 누드 마우스, Rag1 및/또는 Rag2 녹아웃 마우스, NOD-Prkdcscid IL-2rγnull 마우스, NOD-Rag 1-/--IL2rg-/- (NRG) 마우스, Rag 2-/--IL2rg-/- (RG) 마우스 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이러한 유전자 변형 동물은 예를 들어, US20150106961에서 설명되어 있으며, 이의 전체 내용이 인용방식으로 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 마우스는 성숙한 TFR1 코딩 서열의 전부 또는 부분을 인간 성숙한 TFR1 코딩 서열로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
내인성 비인간 TFR1 유전자좌의 변형을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. 일부 실시양태에서, 변형은 (예를 들어, 성숙한 TFR1 단백질 서열과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함) 성숙한 TFR1 단백질의 적어도 부분을 코딩하는 인간 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 변형을 포함할 수 있는 유전자 변형 세포(예를 들어, ES 세포, 체세포) 또한 제공되나, 많은 실시양태에서, 유전자 변형 비인간 동물은 동물의 생식계열에서 내인성 TFR1 유전자좌의 변형을 포함한다.
유전자 변형 동물은 인간 TFR1 및/또는 키메라(예를 들어, 인간화) TFR1을 내인성 마우스 유전자좌로부터 발현할 수 있으며, 여기서 내인성 마우스 TFR1 유전자는 인간 TFR1 서열 또는 인간 TFR1 서열과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 영역을 코딩하는 인간 TFR1 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열로 대체되었다. 다양한 실시양태에서, 내인성 비인간 TFR1 유전자좌는 성숙한 TFR1 단백질의 적어도 하나의 단백질-코딩 서열을 코딩하는 인간 핵산 서열을 포함하도록 전체적으로 또는 부분적으로 변형된다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 마우스는 마우스 프로모터 및/또는 마우스 조절 요소의 제어 하에 있는 내인성 유전자좌로부터 인간 TFR1 및/또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1)을 발현한다. 내인성 마우스 유전자좌에서의 대체는 적절한 세포 유형에서 당업계에서 알려진 일부 다른 이식유전자 마우스에서 관찰되는 잠재적인 병리 현상을 초래하지 않는 방식으로 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1)을 발현하는 비인간 동물을 제공한다. 동물에서 발현되는 인간 TFR1 또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1)은 동물에서 야생형 마우스 또는 인간 TFR1의 하나 이상의 기능을 유지할 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 비인간 TFR1 리간드(예를 들어, 트랜스페린)는 발현된 TFR1에 결합할 수 있다.
또한, 일부 실시양태에서, 동물은 내인성 TFR1을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 동물은 야생형 동물과 비교하여 감소된 수준의 내인성 TFR1을 발현한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "내인성 TFR1"은 임의의 유전자 변형 전 비인간 동물(예를 들어, 마우스)의 내인성 TFR1 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 TFR1 단백질을 지칭한다.
동물의 게놈은 인간 TFR1(NP_003225.2)(서열 번호: 2)과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 게놈은 서열 번호: 9와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
유전자 변형 동물의 게놈은 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대체되는 서열은 내인성 TFR1 유전자좌, 예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 엑손 19, 5’-UTR, 3’-UTR, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 인트론 12, 인트론 13, 인트론 14, 인트론 15, 인트론 16, 인트론 17, 인트론 18 등 내에 있는 임의의 서열이다.
일부 실시양태에서, 대체되는 서열은 내인성 TFR1 유전자의 조절 영역 내에 있다.
일부 실시양태에서, 대체되는 서열은 내인성 마우스 TFR1 유전자좌의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 엑손 19 또는 이들의 부분이다.
유전자 변형 동물은 N-말단으로부터 C-말단까지 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는 인간 또는 키메라 TFR1(예를 들어, 인간화 TFR1)을 발현하는 하나 이상의 세포를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 영역은 인간 TFR1의 세포외 영역과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 TFR1의 세포외 영역은 인간 TFR1과 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 620개, 650개, 660개, 665개, 666개, 667개, 668개, 669개, 670개, 671개 또는 672개의 동일한 아미노산을 (예를 들어, 연속적으로 또는 불연속적으로) 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간화 TFR1의 세포외 영역은 (예를 들어, 연속적으로 또는 비연속적으로) 5개 내지 760개 또는 10개 내지 672개의 아미노산인 서열을 갖는다. 인간 TFR1과 비인간 TFR1(예를 들어, 마우스 TFR1) 서열은 많은 경우 상이하기 때문에, 인간 TFR1에 결합하는 항체가 반드시 비인간 TFR1과 동일한 결합 친화도를 갖거나 비인간 TFR1에 대해 동일한 효과를 갖지는 않는다. 따라서, 인간 또는 인간화 세포외 영역을 갖는 유전자 변형 동물을 사용하여 동물 모델에서 항-인간 TFR1 항체의 효과를 더 양호하게 평가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물의 게놈은 인간 TFR1의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 부분 또는 전체 서열, 인간 TFR1의 세포외 영역의 부분 또는 전체 서열 또는 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760의 부분 또는 전체 서열에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물의 게놈은 인간 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 엑손 4의 부분은 적어도 50개, 70개, 100개, 130개, 150개, 160개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 180개, 190개 또는 196개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 엑손 19의 부분은 적어도 100개, 200개, 220개, 230개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 250개, 270개, 300개, 500개, 700개, 1000개, 1300개, 1500개, 1700개, 2000개, 2200개, 2500개, 2700개, 2900개 또는 2901개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물의 게놈은 인간 TFR1 유전자 서열의 약 20개 내지 63430개, 약 20개 내지 22158개, 약 20개 내지 5224개 또는 약 20개 내지 2016개의 뉴클레오티드(연속적 또는 불연속적 뉴클레오티드)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비인간 동물은 내인성 TFR1 유전자 유전자좌에서 키메라 인간/비인간 TFR1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 여기서 키메라 인간/비인간 TFR1 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 TFR1 세포외 도메인의 부분을 포함하며 동물은 동물의 세포 표면상에 기능성 TFR1을 발현한다. 키메라 인간/비인간 TFR1 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 TFR1의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및/또는 엑손 19의 부분에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 인간/비인간 TFR1 폴리펩티드의 인간 부분은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질 영역은 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 65의 전체 또는 부분에 상응하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막관통 영역은 서열 번호: 1의 아미노산 66 내지 88의 전체 또는 부분에 상응하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 인간/비인간 TFR1 폴리펩티드의 비인간 부분은 내인성 비인간 TFR1 폴리펩티드의 막관통 및/또는 세포질 영역을 포함한다.
또한, 유전자 변형 동물은 내인성 TFR1 유전자좌에서의 대체와 관련하여 이형접합성이거나, 내인성 TFR1 유전자좌에서의 대체와 관련하여 동형접합성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자좌는 인간 TFR1 5'-UTR이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 TFR1 유전자좌는 내인성(예를 들어, 마우스) 5'-UTR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화는 내인성(예를 들어, 마우스) 3'-UTR을 포함한다. 적절한 경우, 마우스 및 인간 TFR1 유전자가 5'-측접 서열의 유사성을 기준으로 유사하게 조절되는 것으로 추정하는 것이 합리적일 수 있다. 본 개시에 나타낸 바와 같이, 마우스 조절 요소를 보유하나 TFR1 코딩 서열의 인간화를 포함하는 내인성 마우스 TFR1 유전자좌에서의 대체를 포함하는 인간화 TFR1 마우스는 병리 현상을 나타내지 않는다. 인간화 TFR1에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 유전자 변형 마우스는 모두 전체적으로 정상이다.
본 개시는 위에서 언급되는 방법을 통해 생성되는 비인간 포유동물에 더 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이의 게놈은 인간 유전자를 함유한다.
일부 실시양태에서, 비인간 포유동물은 설치류이며, 바람직하게는 비인간 포유동물은 마우스이다.
일부 실시양태에서, 비인간 포유동물은 인간화 TFR1 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현한다.
추가적으로, 본 개시는 또한 비인간 포유동물 모델이 본원에 기재된 방법을 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 종양 보유 비인간 포유동물 모델에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비인간 포유동물은 설치류(예를 들어, 마우스)이다.
본 개시는 비인간 포유동물 또는 이의 자손 또는 종양 보유 비인간 동물로부터 유래한 세포 또는 세포주 또는 이들의 1차 세포 배양물; 비인간 포유동물 또는 이의 자손 또는 종양 보유 비인간 동물로부터 유래한 조직, 장기 또는 이들의 배양물; 및 종양을 보유한 경우 비인간 포유동물 또는 이의 자손 또는 종양 보유 비인간 동물로부터 유래한 종양 조직에 더 관한 것이다.
본 개시는 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성되는 비인간 포유동물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 비인간 포유동물이 제공되며, 유전자 변형 동물은 동물의 게놈에 인간 또는 인간화 TFR1을 코딩하는 DNA를 함유한다.
일부 실시양태에서, 비인간 포유동물은 본원에 기재된 유전자 작제물(예를 들어, 도 2, 도 3, 도 5에 나타난 바와 같은 유전자 작제물)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 또는 인간화 TFR1을 발현하는 비인간 포유동물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 인간 또는 인간화 TFR1 단백질의 조직 특이적 발현이 제공된다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물에서 인간 또는 인간화 TFR1의 발현은 특정 유도제 또는 억제제 물질의 첨가에 의해 제어 가능하다.
일부 실시양태에서, 특정 유도제는 Tet-Off 시스템/Tet-On 시스템 또는 타목시펜 시스템으로부터 선택된다.
비인간 포유동물은 당업계에서 알려져 있고 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 임의의 비인간 동물일 수 있다. 바람직한 비인간 포유동물은 포유동물(예를 들어, 설치류)이다. 일부 실시양태에서, 비인간 포유동물은 마우스이다.
위에 기재된 비인간 포유동물에 대한 유전적, 분자적 및 행동 분석을 수행할 수 있다. 본 개시는 또한 동일하거나 다른 유전자형과 교배된 본 개시에 의해 제공되는 비인간 포유동물에 의해 생산된 자손에 관한 것이다.
본 개시는 또한 비인간 포유동물 또는 이의 자손으로부터 유래한 세포주 또는 1차 세포 배양물을 제공한다. 세포 배양물을 기반으로 하는 모델은 예를 들어, 다음 방법에 의해 준비될 수 있다. 세포 배양물을 비인간 포유동물로부터 단리하여 수득할 수 있으며, 대안적으로, 세포를 동일한 작제물 및 표준 세포 형질감염 기법을 사용하여 확립된 세포 배양물로부터 수득할 수 있다. 인간 TFR1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 유전자 작제물의 통합은 다양한 방법으로 검출할 수 있다.
외인성 DNA를 검출하기 위해 사용할 수 있는 많은 분석 방법이 있으며, 이는 핵산 수준의 방법(역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 서던 블롯팅을 사용한 mRNA 정량화 접근법 및 제자리 혼성화를 포함함) 및 단백질 수준의 방법(조직화학, 면역 블롯 분석 및 체외 결합 연구를 포함함)을 포함한다. 추가적으로, 관심 유전자의 발현 수준은 당업계에서 잘 알려진 ELISA 기법에 의해 정량화될 수 있다. 많은 표준 분석 방법을 사용하여 정량적 측정을 완료할 수 있다. 예를 들어, 전사 수준을 RT-PCR 및 RNase 보호, 서던 블롯 분석, RNA 도트 분석(RNAdot analysis)을 포함하는 혼성화 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색, 유세포 측정법, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 인간 또는 인간화 TFR1 단백질의 존재를 또한 평가할 수 있다.
벡터
본 개시는 표적화 벡터에 관한 것이며, a) 길이가 100개 내지 10,000개의 뉴클레오티드인 TFR1 유전자 게놈 DNA로부터 선택되는, 변경될 영역(5' 아암)의 5' 말단과 상동적인 DNA 단편,; b) 공여체 영역을 코딩하는 원하는/공여체 DNA 서열; 및 c) 길이가 100개 내지 10,000개의 뉴클레오티드인 TFR1 유전자 게놈 DNA로부터 선택되는, 변경될 영역(3' 아암)의 3' 말단과 상동적인 제2 DNA 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, a) 변경될 전환 영역(5' 아암)의 5' 말단과 상동적인 DNA 단편은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 선택되고; c) 변경될 영역(3’ 아암)의 3' 말단과 상동적인 DNA 단편은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7에 대해 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, a) 변경될 영역(5' 아암)의 5' 말단과 상동적인 DNA 단편은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7의 위치 32429794 내지 위치 32434036의 뉴클레오티드로부터 선택되고; c) 변경될 영역(3’ 아암)의 3' 말단과 상동적인 DNA 단편은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7의 위치 32449155 내지 위치 32453445의 뉴클레오티드로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적화 벡터에 있는 선택된 게놈 뉴클레오티드 서열의 길이는 약 3kb, 약 4kb, 약 5kb, 약 6kb, 약 7kb, 약 8kb, 약 9kb, 약 10kb, 약 15kb, 약 20kb, 약 21kb, 약 22kb, 약 23kb, 약 24kb 또는 약 25kb 초과이다.
일부 실시양태에서, 변경될 영역은 TFR1 유전자의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19(예를 들어, 마우스 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분)이다.
표적화 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커, 예를 들어 양성 또는 음성 선택 가능한 마커를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양성 선택 가능한 마커는 Neo 유전자 또는 Neo 카세트이다. 일부 실시양태에서, 음성 선택 가능한 마커는 DTA 유전자이다.
일부 실시양태에서, 5' 아암의 서열은 서열 번호: 3에 나타나 있으며; 3' 아암의 서열은 서열 번호: 4에 나타나 있다.
일부 실시양태에서, 서열은 인간(예를 들어, NC_000003.12의 196051942 내지 196074099)으로부터 유래한다. 예를 들어, 표적화 벡터에 있는 표적 영역은 인간 TFR1의 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 전체, 바람직하게는 인간 TFR1의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19이다.
일부 실시양태에서, 인간화 TFR1의 뉴클레오티드 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_003225.2(서열 번호: 2)를 갖는 인간 TFR1 단백질의 전체 또는 부분을 코딩한다.
본 개시는 또한 위에 기재된 바와 같은 표적화 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
추가적으로, 본 개시는 전술한 표적화 벡터 중 임의의 하나 및 본원에 기재된 작제물의 체외 전사체를 갖는 비인간 포유동물 세포에 더 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 Cas9 mRNA 또는 이의 체외 전사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포에 있는 유전자는 이형접합성이다.
일부 실시양태에서, 세포에 있는 유전자는 동형접합성이다.
일부 실시양태에서, 비인간 포유동물 세포는 마우스 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 수정란 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포이다.
유전자 변형 동물을 만들어내는 방법
유전자 변형 동물은 예를 들어 비상동성 말단 결합(NHEJ), 상동성 재조합(HR), 아연 핑거 핵산분해효소(ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 기반 핵산분해효소(TALEN) 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas 시스템을 포함하는 당업계에서 알려진 여러 기법으로 만들어낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 재조합이 사용된다.
일부 실시양태에서, CRISPR-Cas9 게놈 편집은 유전자 변형 동물을 생성하기 위해 사용된다. 이러한 게놈 편집 기법 중 다수는 당업계에서 알려져 있고, 예를 들어 Yin 등, "Delivery technologies for genome editing", Nature Reviews Drug Discovery 16.6 (2017): 387-399에서 설명되어 있으며, 이의 전체 내용이 인용방식으로 포함된다. 많은 다른 방법이 또한 제공되며 게놈 편집에 사용될 수 있다(예를 들어, 유전자 변형 핵을 탈핵 난모세포에 미세 주입하고 탈핵 난모세포를 다른 유전자 변형 세포와 융합시키는 것).
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시는 동물의 적어도 하나의 세포에 있는 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 또는 키메라 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대체는 생식 세포, 체세포, 배반포 또는 섬유모세포 등에서 발생한다. 체세포 또는 섬유모세포의 핵은 제핵 난모세포에 삽입될 수 있다.
도 3은 마우스 TFR1 유전자좌에 대한 인간화 전략을 나타낸다. 도 3에서, 표적화 전략은 5’ 말단 상동성 아암, 인간 TFR1 유전자 단편 및 3’ 상동성 아암을 포함하는 벡터와 관련된다. 과정은 상동성 재조합에 의해 내인성 TFR1 서열을 인간 서열로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, (예를 들어, 아연 핑거 핵산분해효소, TALEN 또는 CRISPR에 의한) 표적 부위의 업스트림 및 다운스트림에서의 절단은 DNA 이중 가닥 절단을 초래할 수 있으며, 상동성 재조합은 내인성 TFR1 서열을 인간 TFR1 서열로 대체하기 위해 사용된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 유전자 변형 인간화 동물을 만들어내기 위한 방법은 내인성 TFR1 유전자좌(또는 부위)에서 내인성 TFR1 영역을 코딩하는 서열을 코딩하는 핵산을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 서열은 인간 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18, 및/또는 엑손 19의 영역(예를 들어, 부분 또는 전체 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열은 인간 TFR1 유전자(예를 들어, NM_003234.4의 핵산 548 내지 2566)의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18 및 엑손 19의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 영역은 TFR1의 세포외 영역(예를 들어, 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760; 또는 서열 번호: 1의 아미노산 89 내지 763) 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 내인성 TFR1 유전자좌는 마우스 TFR1의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19이다. 일부 실시양태에서, 서열은 마우스 TFR1 유전자(예를 들어, NM_011638.4의 핵산 429 내지 2456)의 엑손 4의 부분, 엑손 5 내지 18, 및 엑손 19의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 인간/마우스 TFR1 펩티드를 발현하기 위해 마우스의 TFR1 유전자좌를 변형시키는 방법은 내인성 마우스 TFR1 유전자좌에서 마우스 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 키메라 인간/마우스 TFR1을 코딩하는 서열을 생성하게 되는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 인간/마우스 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 TFR1의 세포질 영역 및 막관통 영역을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 인간 TFR1의 세포외 영역을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 서로 중첩되지 않는다(예를 들어, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열은 중첩되지 않는다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않는다.
본 개시는 다음 단계를 포함하는 TFR1 유전자 인간화 동물 모델을 확립하는 방법을 더 제공한다:
(a) 본원에 기재된 방법을 기반으로 세포(예를 들어, 수정란 세포)를 제공하는 단계;
(b) 액체 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계;
(c) 배양된 세포를 수용자 암컷 비인간 포유동물의 나팔관 또는 자궁에 이식하여 세포가 암컷 비인간 포유동물의 자궁에서 발달하도록 하용하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 임신한 암컷의 자손 유전자 변형 인간화 비인간 포유동물에서 생식계열 전달을 식별하는 단계.
일부 실시양태에서, 전술한 방법에서 비인간 포유동물은 마우스(예를 들어, C57BL/6 마우스)이다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)의 비인간 포유동물은 가임신(또는 거짓 임신)한 암컷이다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 방법을 위한 수정란은 C57BL/6 수정란이다. 본원에 기재된 방법에서 또한 사용될 수 있는 다른 수정란은 FVB/N 수정란, BALB/c 수정란, DBA/1 수정란 및 DBA/2 수정란을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
수정란은 임의의 비인간 동물, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 비인간 동물로부터 유래할 수 있다.
부 실시양태에서, 수정란 세포는 설치류로부터 유래한다. 유전자 작제물을 DNA의 미세주입에 의해 수정란에 도입할 수 있다. 예를 들어, 미세주입 후 수정란을 배양하는 방법으로, 배양된 수정란을 거짓 임신한 비인간 동물에게 이식하고 이후 비인간 포유동물을 낳아 위에 기재된 방법으로 언급되는 비인간 포유동물을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물을 만들어내는 방법은, 예를 들어, 비인간 동물의 TFR1 유전자의 내인성 조절 요소 직후 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, cDNA 서열)을 삽입하여 비인간 동물의 TFR1 유전자의 코딩 프레임을 변형시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 비인간 동물의 TFR1 유전자의 하나 이상의 기능 영역 서열은 녹아웃되거나 서열과 함께 삽입되어 비인간 동물이 내인성 TFR1 단백질을 발현할 수 없거나 감소된 수준으로 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형 비인간 동물의 TFR1 유전자의 코딩 프레임은 비인간 동물의 TFR1 유전자의 엑손 1 내지 엑손 19의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물을 만들어내는 방법은 비인간 동물의 TFR1 유전자의 내인성 조절 요소 후 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 보조 서열을 삽입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 보조 서열은 TFR1 유전자 인간화 동물 모델이 체내에서 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 발현할 수 있으나 비인간 동물의 TFR1 단백질을 발현하지 않도록 정지 코돈일 수 있다.
일부 실시양태에서, 보조 서열은 WPRE(WHP 전사후 반응 요소) 및/또는 폴리A를 포함한다.
유전자 변형 동물을 사용하는 방법
내인성 비인간 유전자좌에서 그리고 내인성 프로모터 및/또는 조절 요소의 제어 하에, 비인간 동물에서 비인간 유전자를 상동성 또는 직교 인간 유전자 또는 인간 서열로 대체하면 전형적인 녹아웃-플러스-이식유전자 동물과는 실질적으로 상이할 수 있는 품질 및 특성을 갖는 비인간 동물을 초래할 수 있다. 전형적인 녹아웃 + 이식유전자 동물에서, 내인성 유전자좌는 제거되거나 손상되며, 완전한 인간 이식유전자는 동물의 게놈에 삽입되어 아마도 무작위로 게놈에 통합된다. 전형적으로, 통합된 이식유전자의 위치는 알려져 있지 않으며, 인간 단백질의 발현은 인간 유전자 및/또는 단백질 검정 및/또는 기능적 검정의 전사에 의해 측정된다. 업스트림 및/또는 다운스트림 인간 서열의 인간 이식유전자 내 포함은 이식유전자의 발현 및/또는 조절을 위한 적합한 지원을 제공하기에 충분한 것으로 명백히 추정된다.
일부 경우, 인간 조절 요소를 갖는 이식유전자가 비생리적이거나 불만족스러운 방식으로 발현되어 동물에게 실제로 유해할 수 있다. 본 개시는 내인성 조절 요소의 제어 하, 내인성 유전자좌에서 인간 서열로의 대체가 대체된 유전자에 관한 생리적 기능이 인간화 동물의 생리적 기능의 맥락에서 의미 있고 적절한 유용한 인간화 동물을 생성하는 생리학적으로 적절한 발현 패턴 및 수준을 제공한다는 점을 입증한다.
예를 들어, 생리학적으로 적절한 방식으로 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 발현하는 유전자 변형 동물은 인간 질환 및 장애에 대한 치료제 개발 및 동물 모델에서 이러한 인간 치료제의 독성 및/또는 효능 평가를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 용도를 제공한다.
다양한 양태에서, TFR1과 TFR1 리간드(예를 들어, 트랜스페린) 사이의 상호작용 또는 TFR1과 항-인간 TFR1 항체 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있거나 차단할 수 있는 작용제를 시험하고, 작용제가 면역 반응을 증가시킬 수 있거나 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하고, 및/또는 작용제가 TFR1 효능제 또는 길항제인지 여부를 결정하는 데 유용한 인간 또는 인간화 TFR1을 발현하는 유전자 변형 동물이 제공된다. 유전자 변형 동물은 예를 들어, 인간 질환의 동물 모델일 수 있으며, 예를 들어, 질환은 유전적으로 유발된다(녹인 또는 녹아웃). 다양한 실시양태에서, 유전자 변형 비인간 동물은 손상된 면역계, 예를 들어, 인간 이종이식편, 예를 들어, 인간 고형 종양 또는 혈액 세포 종양(예를 들어, 백혈병, 림프종, 또는 B 세포 또는 T 세포 종양)을 지속하거나 유지하도록 유전자 변형된 비인간 동물을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 TFR1 관련 신호전달 경로를 차단하거나 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TFR1 항체는 TFR1과 트랜스페린 사이의 상호작용을 차단함으로써, 예를 들어, 내포작용에 의한 철 섭취를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TFR1 항체는 TFR1과 감마-아미노부티르산 수용체 연관 단백질(GABARAP) 또는 인간 항상성 철 조절 단백질(HFE) 사이의 상호작용을 차단할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물은 암 치료를 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 항-TFR1 항체(예를 들어, 항-인간 TFR1 항체)를 본원에 기재된 바와 같은 동물에게 투여하는 단계, 여기서 동물은 종양을 보유하고; 및 항-TFR1 항체의 종양에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 결정될 수 있는 억제 효과는, 예를 들어, 종양 크기 또는 종양 부피의 감소, 종양 성장의 감소, (예를 들어, 치료 전 동일한 대상체 또는 이러한 치료를 받지 않은 다른 대상체의 종양 부피 증가율 대비) 대상체의 종양 부피 증가율의 감소, 전이의 발생 위험 또는 하나 이상의 추가 전이의 발생 위험의 감소, 생존율의 증가, 및 기대 수명의 증가 등을 포함한다. 대상체의 종양 부피는, 예를 들어, 직접 측정, MRI 또는 CT에 의해 결정되는 바와 같이, 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, TFR1은 다른 많은 세포에서 또한 발현되므로 이러한 항체는 섬세한 균형이 필요하다. 따라서, 인간화 TFR1이 내인성 TFR1과 비교하여 대체로 유사한 방식으로 기능하여 인간화 동물에서의 결과를 사용하여 인간에서 이러한 치료제의 효능 또는 독성을 예측할 수 있다는 점이 중요하다. 일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는, 예를 들어, 보체 매개 세포독성(CMC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유도하여 암세포를 사멸시킴으로써, TFR1을 발현하는 암세포를 직접 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양은 동물에 주입되는 하나 이상의 암세포(예를 들어, 인간 또는 마우스 암세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 트랜스페린이 TFR1에 결합하는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 트랜스페린이 TFR1에 결합하는 것을 방지하지 않는다.
일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물은 항-TFR1 항체가 TFR1 효능제인지 길항제인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 TFR1에 대한 작용제(예를 들어, 항-TFR1 항체)의 효과, 예를 들어, 작용제가 면역 세포를 자극할 수 있거나 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)를 억제할 수 있는지 여부, 작용제가 사이토카인의 생성을 증가시킬 수 있거나 감소시킬 수 있는지 여부, 작용제가 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)를 활성화할 수 있거나 비활성화할 수 있는지 여부, 작용제가 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있는지 여부, 작용제가 면역 반응을 상향조절할 수 있거나 면역반응을 하향조절할 수 있는지 여부 및/또는 작용제가 보체 매개 세포독성(CMC) 또는 항체 의존 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있는지 여부를 결정하도록 설계되었다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형 동물은 대상체의 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 치료제의 유효 투여량을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
종양에 대한 억제 효과는 또한 당업계에서 알려진 방법, 예를 들어, 동물에 있는 종양 부피를 측정하고, 및/또는 종양(부피) 억제율(TGITV)을 결정하여 결정될 수 있다. 종양 성장 억제율을 공식 TGITV (%) = (1 - TVt/TVc) x 100을 사용하여 계살할 수 있으며, 식 중 TVt 및 TVc는 치료군 및 대조군의 평균 종양 부피(또는 중량)이다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 다양한 암을 치료하기 위해 설계된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 자가 성장 능력을 갖는 세포, 즉 신속하게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 병태를 지칭한다. 해당 용어는 조직병리학적 유형이나 침습 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암 과정, 전이성 조직 또는 악성 변형 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "종양"은 암성 세포, 예를 들어, 암성 세포 덩어리를 지칭한다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 치료하거나 진단할 수 있는 암은 폐, 유방, 갑상선, 림프, 위장 및 생식기-비뇨관에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 장기 시스템의 악성 종양뿐만 아니라 대부분의 대장암, 신세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소세포암종, 소장의 암 및 식도의 암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 대상체의 암종을 치료하거나 진단하기 위해 설계된다. 용어 "암종"은 당업계에서 인정되며 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 암은 신장 암종 또는 흑색종이다. 예시적인 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소 조직에서 형성되는 암종을 포함한다. 해당 용어는 또한 예를 들어, 암종성 조직 및 육종성 조직으로 구성되는 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. "선암종"은 선 조직으로부터 유래하거나 종양 세포가 인식 가능한 선 구조를 형성하는 암종을 지칭한다. 용어 "육종"은 당업계에서 인정되며 중간엽 유래의 악성 종양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 암은 림프종, 비소세포폐암, 자궁경부암, 백혈병, 난소암, 비인두암, 유방암, 자궁내막암, 결장암, 직장암, 위암, 방광암, 신경교종, 폐암, 기관지암, 골암, 전립선암, 췌장암, 간암 및 담관암, 식도암, 신장암, 갑상선암, 두경부암, 고환암, 교모세포종, 성상세포종, 흑색종, 골수증식 이상 증후군 및 육종이다.
일부 실시양태에서, 백혈병은 급성 림프구성(림프모구성) 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 림프종은 호지킨 림프종 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 외투세포 림프종, 변연부 B 세포 림프종, T 세포 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함하는 비호지킨 림프종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 육종은 골육종, 유잉 육종, 평활근육종, 윤활막 육종, 연조직 육종, 혈관육종, 지방육종, 섬유육종, 횡문근육종 및 연골육종으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 종양은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 폐암 또는 간암이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 암은 고형암(예를 들어, 식도 편평 세포 암종, 유방암, 난소암, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 골육종, 췌장암, 담관 암종, 신세포 암종, 간세포 암종, 부신 피질 암종), 신경계의 암 또는 조혈 악성 종양(예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL))이다.
일부 실시양태에서, TFR1 항체는 뇌암, 유방암, 결장암, 간암, 난소암, 폐암, 골암, 백혈병 및/또는 림프종을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 류마티스 관절염, 크론병, 전신성 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염 또는 경피증을 포함하는 다양한 자가면역 질환을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 알레르기, 천식 및/또는 아토피성 피부염을 포함하는 다양한 면역 장애를 치료하기 위해 설계된다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 면역 반응을 억제하는 데 있어 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역 장애는 알레르기, 천식, 심근염, 신염, 간염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 경피증, 갑상선항진증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 자가면역 용혈성 빈혈, 궤양성 대장염, 자가 면역 간 질환, 당뇨병, 통증 및/또는 신경 장애 등이다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 다양한 골질환, 예를 들어, 골절, 골변성, 관절염, 골기형, 골다공증 및/또는 대퇴골두 괴사를 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 항체는 다양한 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 뇌허혈, 뇌 손상 또는 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및/또는 척수소뇌 실조증을 치료하기 위해 설계된다.
본 개시는 또한 항체(예를 들어, 항-TFR1 항체)의 독성을 결정하는 방법을 제공한다. 방법은 항체를 본원에 기재된 같은 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 이후 동물의 체중 변화, 적혈구 수, 적혈구 용적률 및/또는 헤모글로빈을 평가한다. 일부 실시양태에서, 항체는 적혈구(RBC), 적혈구 용적률 또는 헤모글로빈을 20%, 30%, 40% 또는 50% 초과로 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 동물은 대조군의 체중(예를 들어, 항체로 치료되지 않은 동물의 평균 체중)보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 적은 체중을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 동물은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 철 흡수 또는 철 관련 대사와 관련이 있다. 방법은 항-TFR1 항체(예를 들어, 항-인간 TFR1 항체)를 본원에 기재된 바와 같은 동물에게 투여하는 단계; 및 항-TFR1 항체의 질환 또는 병태에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 동물은 혈액뇌 장벽을 통과하는 치료제의 전달 효율을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 치료제(예를 들어, 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-TFR1 이중특이성 또는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함)를 동물에게 투여하는 단계 및 동물의 뇌 및/또는 혈청에서 시간 경과에 따른 치료제의 농도(예를 들어, 약동학)을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제는 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 항-TFR1 항체의 C-말단)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 항-TFR1 이중특이성 또는 다중특이성 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 또한 제2 항원을 표적으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 항원은 알츠하이머병과 관련된 단백질(예를 들어, BACE1 또는 아밀로이드 베타)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 동물은 중추신경계 질환을 치료하기 위한 치료제의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 치료제(예를 들어, 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-TFR1 이중특이성 또는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함)를 동물에게 투여하는 단계 및 질환에 대한 작용제의 효과를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여 시, 항-TFR1 항체 농도(예를 들어, 본원에 기재된 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나)는 동물의 뇌에 있는 대조군 항체(예를 들어, 인간 IgG)의 농도보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 높다. 일부 실시양태에서, 투여 시, 항-TFR1 항체 농도(예를 들어, 본원에 기재된 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나)는 인간의 혈청에 있는 대조군 항체(예를 들어, 인간 IgG)의 농도보다 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 또는 20% 미만 낮다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제(예를 들어, 본원에 기재된 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나)의 농도는 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간 또는 적어도 25시간의 기간에 걸쳐 결정된다. 특정 시점에(예를 들어, 투여 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간 또는 30시간), 뇌에 있는 항체 농도 대 혈청에 있는 항체 농도의 비율이 계산될 수 있다. 일부 경우, 비율은 본원에 기재된 치료제(예를 들어, 본원에 기재된 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 임의의 하나)에 대해 적어도 0.5, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, or 적어도 20이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제에 대한 비율은 대조군 항체(예를 들어, 인간 IgG)에 대한 비율과 비교하여 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배이다.
본 개시는 또한 약리학, 면역학, 미생물학 및 의학의 연구를 위한 인간 세포의 면역화 과정, 인간 항체의 제조 또는 모델 시스템의 개발에서 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 인간 세포와 관련되는 면역화 과정의 동물 실험 질환 모델의 생산 및 활용, 병원체에 대한 연구 또는 새로운 진단적 전략 및/또는 치료적 전략의 개발에서 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용을 제공한다.
본 개시는 또한 TFR1 유전자 기능, 인간 TFR1 항체, 인간 TFR1 표적화 부위에 대한 약물, 인간 TFR1 표적화 부위에 대한 약물 또는 효능, 면역 관련 질환 및 항종양 약물의 스크리닝, 검증, 평가 또는 연구에서 본원에 기재된 방법을 통해 생성되는 동물 모델의 사용에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 TCR-T, CAR-T 및/또는 다른 면역요법(예를 들어, T 세포 입양 이동 요법)의 체내 효능을 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 인간 종양 세포를 본원에 기재된 동물에 이식하는 단계 및 인간 CAR-T를 인간 종양 세포를 갖는 동물에 적용하는 단계를 포함한다. CAR-T 치료법의 효과를 결정하고 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물은 본원에 기재된 방법에 의해 준비되는 TFR1 유전자 인간화 비인간 동물, 본원에 기재된 TFR1 유전자 인간화 비인간 동물, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 이중 또는 다중 인간화 비인간 동물(또는 이의 자손), 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 발현하는 비인간 동물 또는 본원에 기재된 종양 보유 또는 염증성 동물 모델로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TCR-T, CAR-T 및/또는 다른 면역요법은 본원에 기재된 TFR1 연관 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, TCA-T, CAR-T 및/또는 다른 면역요법은 본원에 기재된 TFR1 연관 질환을 치료하기 위한 평가 방법을 제공한다.
2개 이상의 인간 또는 키메라 유전자를 갖는 유전자 변형 동물 모델
본 개시는 2개 이상의 인간 또는 키메라 유전자를 갖는 유전자 변형 동물 모델을 생성하기 위한 방법에 더 관한 것이다. 동물은 인간 또는 키메라 TFR1 유전자 및 추가 인간 또는 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 추가 인간 또는 키메라 단백질은 세포예정사 단백질 1(PD-1), 세포예정사 리간드 1(PD-L1), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 4(OX40), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3) 또는 CD73일 수 있다.
2개 이상의 인간 또는 키메라 유전자(예를 들어, 인간화 유전자)를 갖는 유전자 변형 동물 모델을 생성하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 본원에 기재된 인간 TFR1 유전자 또는 키메라 TFR1 유전자를 도입하여 유전자 변형 비인간 동물을 수득하는 방법을 사용하는 단계;
(b) 유전자 변형 비인간 동물을 다른 유전자 변형 비인간 동물과 교배시킨 후, 자손을 스크리닝하여 2개 이상의 인간 또는 키메라 유전자를 갖는 유전자 변형된 비인간 동물을 수득하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법의 단계 (b)에서, 유전자 변형 동물은 인간 또는 키메라 PD-1, PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM3 또는 CD73을 갖는 유전자 변형 비인간 동물과 교배될 수 있다. 이러한 유전자 변형 비인간 동물 중 부분은 예를 들어, PCT/CN2018/110069, PCT/CN2017/090320, PCT/CN2017/099574, PCT/CN2017/099577, PCT/CN2017/099575, PCT/CN2017/110435, PCT/CN2019/127084, PCT/CN2017/110494 및 PCT/CN2019/119793에서 설명되어 있으며; 이들 중 각각의 전체 내용이 인용방식으로 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, TFR1 인간화는 인간 또는 키메라 PD-1, PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM3 또는 CD73 유전자 변형을 갖는 유전자 변형 동물에 대해 직접적으로 수행된다.
이러한 단백질은 서로 다른 메커니즘을 수반할 수 있으므로, 이러한 단백질 중 2개 이상을 표적으로 하는 조합 요법이 더 효과적인 치료법이 될 수 있다. 실제로, 많은 관련 임상 시험이 진행 중이며 양호한 효과를 나타내고 있다. 2개 이상의 인간 또는 인간화 유전자를 갖는 유전자 변형 동물 모델은 이러한 단백질 중 2개 이상을 표적으로 하는 조합 요법, 예를 들어 항-TFR1 항체 및 암 치료를 위한 추가 치료제의 유효성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 항-TFR1 항체 및 추가 치료제를 종양을 갖는 동물에게 투여하는 단계; 및 조합 치료의 종양에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM3 또는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항-CTLA4 항체(예를 들어, 이필리무맙), 항-PD-1 항체(예를 들어, 니볼루맙) 또는 항-PD-L1 항체이다.
일부 실시양태에서, 동물은 인간 또는 인간화 PD-1을 코딩하는 서열, 인간 또는 인간화 PD-L1을 코딩하는 서열 또는 인간 또는 인간화 CTLA-4를 코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙), 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체이다.
일부 실시양태에서, 종양은 CD80, CD86, PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 하나 이상의 종양 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조합 치료는 본원에 기재된 바와 같은 다양한 암, 예를 들어, 흑색종, 비소세포폐암종(NSCLC), 소세포폐암(SCLC), 방광암, 전립선암(예를 들어 전이성 호르몬-난치성 전립선암), 진행성 유방암, 진행성 난소암 및/또는 진행성 난치성 고형 종양을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 조합 치료는 전이성 고형 종양, NSCLC, 흑색종, B 세포 비호지킨 림프종, 결장직장암 및 다발성 골수종을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 조합 치료는 흑색종, 암종(예를 들어, 췌장 암종), 중피종, 혈액 악성 종양(예를 들어, 비호지킨 림프종, 림프종, 만성 림프구성 백혈병) 또는 고형 종양(예를 들어, 진행성 고형 종양)을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 조합 치료는 유방암, 결장암, 자궁경부암, 섬유육종, 간암, 폐암, 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 난소암, 신장암, 피부암, 형질세포종, 림프종 및/또는 백혈병을 치료하기 위해 설계된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 일부 다른 방법과의 조합 치료를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 단독으로 또는 본원에 기재된 방법과 조합하여 사용될 수 있는 암을 치료하는 방법은 예를 들어, 대상체를 예를 들어, 화학요법, 예를 들어, 캄포테신, 독소루비신, 시스플라틴, 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 아드리아마이신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 비술판, 니트로수레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드, 베람필, 포도필로톡신, 타목시펜, 탁솔, 트랜스플라티넘, 5-플루로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및/또는 메토트렉세이트로 치료하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 환자로부터 암의 적어도 부분을 제거하기 위해, 예를 들어 종양의 부분 또는 전부를 제거하기 위해 대상체에 대해 수술을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에서 더 설명되며, 이는 청구범위에서 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
재료 및 방법
다음 재료를 다음 실시예에서 사용하였다.
DraIII, EcoRV 및 AseI 제한 효소를 NEB로부터 구입하였다(각각 카탈로그 번호: R3510V, R3195V 및 R0101M).
C57BL/6 마우스 및 Flp 이식유전자 마우스를 China Food and Drugs Research Institute National Rodent Experimental Animal Center로부터 구입하였다.
정제된 항-마우스 CD16/32 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 101302).
Brilliant Violet 510™ 항-마우스 CD45 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 103138).
PerCP/Cy5.5 항-마우스 TCRβ 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 109228).
FITC 항-마우스 CD19 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 115506).
Brilliant Violet 605™ 항-마우스 TER-119/적혈구 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 116239).
PE 항-마우스 CD43 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 143205).
APC 항-인간 CD43 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 343205).
APC 항-인간 CD71 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 334107).
Zombie NIR™ Fixable Viability Kit를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 423106).
Brilliant Violet 605™ 항-마우스 TER-119/적혈구 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 116239).
PE 항-마우스 CD71 항체를 BioLegend로부터 구입하였다(카탈로그 번호: 113807).
실시예 1: 인간화 TFR1 유전자를 갖는 마우스의 생성
비인간 동물(예를 들어, 마우스)의 게놈은 인간 TFR1 단백질의 전부 또는 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하기 위해 변형될 수 있어 유전자 변형 비인간 동물은 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 발현할 수 있게 한다. 마우스 TFR1 게놈(NCBI Gene ID: 22042, 1차 공급원: MGI: 98822, UniProt ID: Q62351)은 염색체 16(NC_000082.7)의 32427714 내지 32451612에 위치되며, 인간 TFR1 게놈(NCBI Gene ID: 7037, 1차 공급원: HGNC: 117631, UniProt ID: P02786)은 염색체 3(NC_000003.12)의 196018694 내지 196082123에 위치된다. 마우스 TFR1 전사체는 NM_011638.4이며, 상응하는 단백질 서열 NP_035768.1은 서열 번호: 1에 제시된다. 인간 TFR1 전사체는 NM_003234.4이며, 상응하는 단백질 서열 NP_003225.2는 서열 번호: 2에 제시된다. 마우스 및 인간 TFR1 유전자좌는 도 1에 나타나 있다.
인간 TFR1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 부분은 마우스 내인성 TFR1 유전자좌에 도입될 수 있어 마우스가 인간 또는 인간화 TFR1 단백질을 발현할 수 있게 한다. 구체적으로, 마우스 TFR1 유전자 조절 요소의 제어 하, 인간 TFR1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 유전자 편집 기법을 사용하고 상응하는 마우스를 대체하여 도 2에 나타난 바와 같이 인간화 TFR1 유전자좌를 수득함으로써 마우스 TFR1 유전자를 인간화하게 된다.
도 3의 표적화 전략의 개략도에서 나타난 바와 같이, 표적화 벡터는 마우스 TFR1 유전자의 상동성 아암 업스트림 및 다운스트림 및 인간 TFR1 유전자의 DNA 서열을 함유하는 "A 단편"을 함유한다. 구체적으로, 업스트림 상동성 아암(5' 상동성 아암, 서열 번호: 3)의 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7의 32429794 내지 32434036의 뉴클레오티드 서열과 동일하며, 다운스트림 상동성 아암(3' 상동성 아암, 서열 번호: 4)의 서열은 NCBI 수탁 번호 NC_000082.7의 32449155 내지 32453445의 뉴클레오티드 서열과 동일하다. TFR1 유전자의 인간 게놈 DNA 서열(서열 번호: 5)은 NCBI 수탁 번호 NC_000003.12의 196051942 내지 196074099의 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
표적화 벡터는 또한 양성 클론 스크리닝을 위한 항생제 저항성 유전자(네오마이신 인산전이효소 유전자 또는 Neo) 및 Neo 카세트를 형성한 항생제 저항성 유전자와 측접하는 2개의 Frt 재조합 부위를 포함한다. Neo 카세트의 5’ 말단과 인간 서열 사이의 연결은: 5’- TAGCCTCCTTTAGAATTTTAACCTTAGAAGATTAGCATTAGC CAATT GCATCTGGCGAATCGGACCCACAAGAGCACTGAGGTCGGAAGTTCCTATTCTCTAGAAA-3’(서열 번호: 6)과 같이 설계되었으며, 여기서 서열 "ATTAGC" 중 "C"는 인간 서열의 마지막 뉴클레오티드이며, 서열 " CAATT " 중 "C"는 Neo 카세트의 처음 뉴클레오티드이다. Neo 카세트의 3’ 말단과 인간 서열 사이의 연결은: 5’- TCATCAGTCCAGGATACATAGATTACCACAACTCCGAGC CTGGT TCTCAGCATTCTTTTTTCCTTACTCTGCTATAGAAA-3’(서열 번호: 7)과 같이 설계되었으며, 여기서 서열 "CGAGC" 중 "C"는 Neo 카세트의 마지막 뉴클레오티드이며, 서열 " CTGGT " 중 "C"는 인간 유전자의 처음 뉴클레오티드이다. 추가적으로, 음성 선택 가능한 마커를 갖는 코딩 유전자(디프테리아 독소 A 서브유닛(DTA)을 코딩하는 유전자)도 표적화 벡터의 3' 상동성 아암의 다운스트림에 구축되었다. 인간화 후 조작된 마우스 TFR1의 mRNA 서열 및 이의 코딩된 단백질 서열은 각각 서열 번호: 8 및 서열 번호: 9에 나타나 있다.
표적화 벡터를 예를 들어 제한 효소 소화 및 결찰로 구축하였다. 구축된 표적화 벡터 서열을 제한 효소 절단으로 사전 확인한 후 시퀸싱을 통해 검증하였다. C57BL/6 마우스의 배아 줄기 세포를 전기천공법을 통해 정확한 표적화 벡터로 형질감염시켰다. 양성 선택 가능한 마커 유전자를 사용하여 세포를 스크리닝하였으며, 외인성 유전자의 통합을 PCR(PCR 프라이머는 아래 표에 나타나 있다) 및 서던 블롯(Southern Blot)으로 확인하였다.
| 프라이머 명칭 및 서열 번호 | 프라이머 서열(5’-3’) | 표적 단편 크기 |
| PCR-F1(서열 번호: 10) | AGCTAGTGCTGAAGAGTAAGAGCCT | 4626bp |
| PCR-R1(서열 번호: 11) | CACTTGATGGTGCCGGTGAAGTCTG | |
| PCR-F2(서열 번호: 12) | GCTCGACTAGAGCTTGCGGA | 5416bp |
| PCR-R2(서열 번호: 13) | GGTGTCTGTGAGCTGCCTCACTTG |
구체적으로, 마우스 배아 줄기 세포를 표적화 벡터로 형질감염시킨 후, PCR로 양성으로 식별한 클론을 서던 블롯으로 검증하여 (세포 DNA를 각각 DraIII, EcoRV 및 AseI로 소화하였으며 3개의 프로브와 혼성화하였음) 정확한 양성 클론 세포를 스크리닝하였다. 제한 효소, 프로브 및 표적 단편의 크기는 아래 표에 나타나 있다. 서던 블롯 검출 결과는 도 4에 나타나 있다. 결과는 4개의 PCR 양성 배아 줄기 세포(ES-1 내지 ES-4)가 무작위 삽입 없이 양성 클론으로 검증되었음을 나타낸다.
| 제한 효소 | 프로브 | 야생형 단편 크기 | 재조합 단편 크기 |
| DraIII | A 프로브 | - - | 15.4kb |
| EcoRV | A 프로브 | - - | 17.2kb |
| AseI | Neo(3’) | - - | 12.9kb |
다음 프라이머를 서던 블롯 식별을 위해 사용하였다:
A 프로브:
A 프로브 -F: 5’- GGTGAGAAGAAACTAAACTATGCCA -3’(서열 번호: 14),
A 프로브 -R: 5’- TCTGGTTCACCCAGGTTAGAGC -3’(서열 번호: 15);
Neo 프로브:
Neo 프로브-F: 5’- GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(서열 번호: 18),
Neo 프로브-R: 5’- CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(서열 번호: 19).
스크리닝된 양성 클론(흑색 마우스)을 단리된 배반포(백색 마우스)에 도입하였으며, 생성된 키메라 배반포를 단기 배양용 배양 배지로 이동시킨 후 대리모(백색 마우스)의 나팔관에 이식하여 F0 키메라 마우스(흑색 및 백색)를 생성하였다. F0 세대 키메라 마우스와 야생형 마우스를 역교배하여 F1 세대 마우스를 수득한 후 F1 세대 이형접합성 마우스를 서로 교배시킴으로써 F2 세대 동형접합성 마우스를 수득하게 되었다. 양성 마우스를 Flp 이식유전자 마우스와 교배하여 양성 선택 가능한 마커 유전자를 제거한 후(도 5에 나타난 개략도), 이형접합성 마우스를 서로 교배시켜 인간화 TFR1 유전자를 갖는 인간화 동형접합성 마우스를 수득하였다.
TFR1 유전자 인간화 마우스의 유전자형은 아래 표에 나타난 프라이머를 사용한 PCR을 통해 검증할 수 있다. 예시적 F1 세대 마우스(Neo 카세트 제거)의 식별 결과는 도 6a 내지 도 6d에 나타나 있으며, 여기서 F1-01 및 F1-02로 넘버링된 두 마리의 마우스가 양성 이형접합성 마우스로 식별되었다. 사용된 PCR 프라이머는 아래 표에 나타나 있다.
| 프라이머 명칭 및 서열 번호 | 프라이머 서열(5’- 3’) | 표적 단편 크기(bp) |
| WT-F(서열 번호: 20) | AGTAAGACAAGGTGTGCACCCATGT | WT: 420 |
| WT-R(서열 번호: 21) | TCAGGACTGAACTTGGGAAGTTGAG | |
| WT-F(서열 번호: 20) | AGTAAGACAAGGTGTGCACCCATGT | Mut: 319 |
| Mut-R(서열 번호: 22) | ATATAAGCGACGTGCTGCAGGGAAG | |
| Frt-F(서열 번호: 23) | AGGCCGGTCTCGAACTCCCAACC | Mut: 313 |
| Frt-R(서열 번호: 24) | GAGCCACTGTACCCAGCCAGCTGAT | |
| Flp-F2(서열 번호: 25) | GACAAGCGTTAGTAGGCACATATAC | Mut: 325 |
| Flp-R2(서열 번호: 26) | GCTCCAATTTCCCACAACATTAGT |
결과는 인간화 TFR1 유전자를 갖는 유전자 조작 마우스가 본원에 기재된 방법을 사용하여 구축될 수 있음을 나타낸다. 마우스를 무작위 삽입 없이 안정적으로 계대배양할 수 있다.
양성 마우스에 있는 인간화 TFR1 단백질의 발현을 예를 들어 유세포 측정법 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 확인할 수 있다. 구체적으로, 7주령 암컷 C57BL/6 야생형 마우스 한 마리 및 7주령 암컷 TFR1 유전자 인간화 이형접합성 마우스 한 마리를 선택하였다. 골수 조직을 자궁경부 탈구에 의한 안락사 후 채취하였으며 세포를 정제 항-마우스 CD16/32 항체(항-마우스 CD16/32 항체); Brilliant Violet 510™ 항-마우스 CD45 항체(항-마우스 CD45 항체); PerCP/Cy5.5 항-마우스 TCRβ 항체(항-마우스 TCRβ 항체); FITC 항-마우스 CD19 항체(항-마우스 CD19 항체); Brilliant Violet 605™ 항-마우스 TER-119/적혈구 항체(항-마우스 TER-119 항체); PE 항-마우스 CD43 항체(항-마우스 CD43 항체); APC 항-인간 CD43 항체(hCD43-PE; 항-인간 CD43 항체); PE 항-마우스 CD71 항체(mTFR1; 항-마우스 TFR1 항체); 및 APC 항-인간 CD71 항체(hTFR1; 항-인간 TFR1 항체)로 염색한 후, 유세포 측정법으로 검출하였다.
결과는 50.6%의 C57BL/6 마우스의 비장에 있는 B 세포(mCD45+ mCD19+를 특징으로 함)가 mTFR1 양성(mCD45+ mCD19+ mTFR1+를 특징으로 함)이었으며, 0.20%는 hTFR1 양성(mCD45+ mCD19+ hTFR1+를 특징으로 함)이었음을 나타내었다. TFR1 유전자 인간화 이형접합성 마우스의 비장에서, 32.9%의 B 세포는 mTFR1 양성(mCD45+ mCD19+ mTFR1+를 특징으로 함)이었으며 11.3%는 hTFR1 양성(mCD45+ mCD19+ hTFR1+를 특징으로 함)이었다. 결과는 인간화 TFR1이 아닌 마우스 TFR1의 발현이 야생형 마우스 비장세포에서 검출되었던 반면, 마우스 TFR1 및 인간화 TFR1 둘 모두의 발현은 체내 TFR1 유전자 인간화 이형접합성 마우스에서 검출되었음을 나타내었다. 위 실험 결과는 TFR1이 TFR1 유전자 인간화 마우스에서 정상적으로 발현될 수 있음을 나타낸다.
F1 세대 이형접합성 마우스를 교배시켜 F2 세대 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스를 수득하였다. TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스에서 mRNA의 전사를 RT-PCR로 검출하였다. 구체적으로, 7주령 암컷 C57BL/6 야생형 마우스 한 마리 및 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스(본원에 기재된 방법을 사용하여 생성됨) 한 마리를 선택하였다. 마우스 비장세포를 자궁경부 탈구에 의한 안락사 후 수집하였다. 세포성 RNA를 TRIzol™ 키트의 지침에 따라 추출하였다. 이후, 추출된 세포성 RNA를 cDNA로 역전사시킨 후, 아래에 나타난 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 검출하였다. 도 7a 내지 도 7c에 나타난 바와 같이, 인간화 TFR1 mRNA가 아닌 마우스 TFR1 mRNA만이 C57BL/6 야생형 마우스에서 검출되었다. 대조적으로, 마우스 TFR1 mRNA가 아닌 인간화 TFR1 mRNA만이 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스에서 검출되었다.
다음 프라이머를 RT-PCR 검출에서 사용하였다:
PCR-F1: 5’-CTCTGCTTTGCAGCTATTGCAC-3’(서열 번호: 27),
PCR-R1: 5’-CAGGATTCTCCACCAGGTAAACA-3’(서열 번호: 28);
PCR-F2: 5’-GTTCGAGAGTCACCACGCTGAG-3’(서열 번호: 29),
PCR-R2: 5’-GGCAACCCTGATGACTGAGATG-3’(서열 번호: 30);
GAPDH-F: 5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(서열 번호: 16),
GAPDH-R: 5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(서열 번호: 17).
위에 기재된 바와 같은 유세포 측정법을 사용하는 유사한 방법을 사용하여 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스에서 인간화 TFR1 단백질의 발현을 검증할 수 있다. 구체적으로, 7주령 암컷 C57BL/6 야생형 마우스 한 마리 및 7주령 암컷 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스 한 마리를 선택하였다. 골수 조직을 자궁경부 탈구에 의한 안락사 후 수집하였으며 세포를 정제 항-마우스 CD16/32 항체(항-마우스 CD16/32 항체); Brilliant Violet 605™ 항-마우스 TER-119/적혈구 항체(항-마우스 TER-119 항체); PE 항-마우스 CD71 항체(mTFR1; 항-마우스 TFR1 항체); 및 APC 항-인간 CD71 항체(hTFR1; 항-인간 TFR1 항체)로 염색한 후, 유세포 측정법으로 검출하였다. 결과는 14.2%의 C57BL/6 마우스의 골수에 있는 적혈구(mTer119+를 특징으로 함)가 mTFR1 양성(mTer119+ mTFR1+를 특징으로 함)이었으며, 0.087%는 hTFR1 양성(mTer119+hTFR1+를 특징으로 함)이었음을 나타내었다. TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스의 골수에서, 0.04%의 적혈구가 mTFR1 양성이었으며 10.1%가 hTFR1 양성이었다. 결과는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되는 TFR1 유전자 인간화 마우스가 체내 인간화 TFR1 단백질을 성공적으로 발현할 수 있음을 나타낸다.
또한, 야생형 C57BL/6 마우스 및 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스의 비장, 림프절 및 말초 혈액에서 백혈구 및 T 세포를 수집하여 유세포 측정법에 의한 면역 표현형 검출을 수행하였다. 정기적인 혈액 검사 및 생화학 검사를 또한 수행하였다. 결과는 백혈구 하위유형(B 세포, T 세포, NK 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 과립구, 수지상 세포(DC 세포), 대식세포, 단핵구 포함) 및 T 세포 서브타입(CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 Treg 세포)의 백분율 및 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스의 각각의 조직 검체에 대한 정기적인 혈액 검사 및 생화학적 검사가 기본적으로 C57BL/6 야생형 마우스에서 검출된 바와 동일하였음을 나타낸다. 결과는 TFR1 유전자의 인간화가 마우스의 비장, 림프 조직 및 말초 혈액에서 백혈구 및 T 세포의 분화, 백혈구 및 T 세포의 발달 및 분포에 유의하게 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 2: 마우스에서 항-인간 TFR1 항체의 약동학(PK) 검출
마우스 뇌 조직 및 혈청에서 항-인간 TFR1 항체의 PK 과정을 다음과 같이 검출하였다. TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스를 선택하여 대조군 및 치료군에 무작위로 배치하였다. 대조군 마우스에 대조 인간 IgG1(hIgG) 10mg/kg을 주입하였으며, 처리군 마우스에 꼬리 정맥을 통해 등몰량(10.9mg/kg)의 항-인간 TFR1 항체 Ab를 주입하였다. 마우스 뇌 조직 및 혈청 시료를 채취하였으며, 마우스 뇌 조직 및 혈청 검체에 있는 항-인간 TFR1 항체 Ab의 농도를 항-인간 Fc 항체를 사용한 ELISA로 측정하였다. 도 8a 내지 도 8c에 나타난 바와 같이, 치료군 마우스의 뇌 조직에 있는 Ab의 농도는 시험 기간 동안 고수준으로 유지되었고(도 8a), 혈청에 있는 Ab의 농도는 시간 경과에 따라 감소하였으며(도 8b), 치료군 마우스의 뇌 조직 대 혈청에 있는 Ab 농도 비율은 대조군 마우스보다 유의하게 높았다(도 8c). 결과는 TFR1 유전자 인간화 마우스의 뇌가 정맥내 투여된 항-인간 TFR1 항체를 흡수할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본원에 기재된 TFR1 유전자 인간화 마우스는 중추신경계(CNS)에 대한 단백질 치료 약물의 효과적인 전달 및 효능 평가를 평가하기 위한 동물 모델로 사용될 수 있다.
실시예 3: 체내 효능 검증
본원에서 생성되는 TFR1 유전자 인간화 마우스를 사용하여 인간 TFR1을 표적으로 하는 조절제의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 TFR1 유전자 인간화 동형접합성 마우스에 마우스 결장암 세포 MC38을 피하 접종할 수 있다. 종양이 약 100mm3까지 성장한 경우, 마우스를 종양 크기를 기준으로 대조군 및 여러 치료군으로 무작위로 배치하였다. 치료군 마우스를 무작위로 선택하여 인간 TFR1을 표적으로 하는 약물(예를 들어, 항체)을 투여할 수 있으며, 대조군 마우스는 동량의 식염수를 투여할 수 있다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 측정할 수 있으며, 해당 결과는 예를 들어, 마우스의 종양 부피 및 체중 변화를 비교하여 약물의 체내 안전성 및 효능을 효과적으로 평가하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 4: 이중 또는 다중 유전자 인간화 마우스의 생성
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되는 TFR1 유전자 인간화 마우스는 또한 이중 또는 다중 유전자 인간화 마우스 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에서, 배반포 미세주입을 위한 배아 줄기(ES) 세포는 변형(예를 들어, 인간 또는 인간화) PD-1, PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG3, TIM3 및/또는 CD73 유전자와 같은 다른 유전자 변형을 포함하는 마우스로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 인간화 TFR1 마우스로부터 배아 줄기 세포를 단리할 수 있으며, 유전자 재조합 표적화 기술을 사용하여 TFR1 및 다른 유전자 변형의 이중 유전자 또는 다중 유전자 변형 마우스 모델을 수득할 수 있다.
추가적으로, 본원에 기재된 방법에 의해 수득되는 동형접합성 또는 이형접합성 TFR1 유전자 인간화 마우스를 다른 유전자 변형 동형접합성 또는 이형접합성 마우스와 교배하는 것도 가능하며, 자손을 스크리닝할 수 있다. 멘델의 법칙에 따르면, 변형(예를 들어, 인간 또는 인간화) TFR1 유전자 및 다른 유전적 변형을 포함하는 이중 유전자 또는 다중 유전자 변형 이형접합성 마우스를 생성하는 것이 가능하다. 이후, 이형접합성 마우스를 서로 교배시켜 동형접합성 이중 유전자 또는 다중 유전자 변형 마우스를 수득할 수 있다. 이러한 이중 유전자 또는 다중 유전자 변형 마우스는 인간 TFR1 및 다른 유전자를 표적으로 하는 유전자 조절자의 체내 검증에 사용할 수 있다.
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 설명되었으나, 전술한 설명은 첨부되는 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하려는 것이 아니라는 점을 이해하여야 한다. 다른 양태, 이점 및 변형은 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
Claims (69)
- 유전자 변형 비인간 동물로서, 게놈이 인간 또는 키메라 TFR1(트랜스페린 수용체 단백질 1)을 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 염색체를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 상기 서열은 상기 적어도 하나의 염색체에 있는 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 조절 요소에 조작 가능하게 연결되는 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 상기 서열은 인간 TFR1(NP_003225.2(서열 번호: 2))과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 상기 서열은 서열 번호: 9와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 동물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인간 또는 키메라 TFR1을 코딩하는 상기 서열은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 동물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 설치류, 마우스 또는 래트인 동물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 동물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 내인성 TFR1을 발현하지 않거나 감소한 수준의 내인성 TFR1을 발현하는 동물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 갖는 동물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 상기 발현된 인간 또는 키메라 TFR1은 인간 트랜스페린(Tf) 및 철과 상호작용하여 철-Tf-TFR1 착물을 형성함으로써 철 섭취를 촉진하는 동물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 상기 발현된 인간 또는 키메라 TFR1은 내인성 트랜스페린(Tf) 및 철과 상호작용하여 철-Tf-TFR1 착물을 형성함으로써 철 섭취를 촉진하는 동물.
- 유전자 변형 비인간 동물로서, 상기 동물의 게놈은 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 것을 포함하는 동물.
- 제12항에 있어서, 상기 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 상기 서열은 상기 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 조절 요소에 조작 가능하게 연결되며, 상기 동물의 하나 이상의 세포는 인간 또는 키메라 TFR1을 발현하는 동물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 동물은 내인성 TFR1을 발현하지 않거나 감소한 수준의 내인성 TFR1을 발현하는 동물.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대체된 유전자좌는 TFR1의 세포외 영역인 동물.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 세포질 영역, 막관통 영역 및 세포외 영역을 갖는 키메라 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 가지며, 상기 세포외 영역은 상기 인간 TFR1의 세포외 영역과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 동물.
- 제16항에 있어서, 상기 키메라 TFR1의 상기 세포외 영역은 상기 인간 TFR1의 세포외 영역에 존재하는 연속 서열과 적어도 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 620개, 650개, 660개, 665개, 666개, 667개, 668개, 669개, 670개, 671개 또는 672개의 동일한 연속 아미노산을 갖는 서열을 갖는 동물.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 상기 서열은 상기 내인성 TFR1 유전자의 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함하는 동물.
- 제18항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 동물.
- 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 상기 내인성 TFR1 유전자좌에서의 상기 대체와 관련하여 이형접합성인 동물.
- 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 상기 내인성 TFR1 유전자좌에서의 상기 대체와 관련하여 동형접합성인 동물.
- 유전자 변형 비인간 동물을 만들어내는 방법으로서,
상기 동물의 적어도 하나의 세포에 있는 내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 서열로 대체하는 단계를 포함하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 상기 서열은 인간 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함하는 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 상기 서열은 인간 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19의 부분을 포함하는 동물.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 상기 서열은 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760을 코딩하는 방법.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영역은 TFR1의 세포외 영역 내에 위치되는 방법.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 상기 서열은 상기 내인성 TFR1 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및/또는 엑손 19 또는 이들의 부분을 포함하는 방법.
- 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 마우스이며, 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 상기 서열은 상기 내인성 TFR1 유전자의 엑손 4의 부분, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14, 엑손 15, 엑손 16, 엑손 17, 엑손 18 및 엑손 19의 부분을 포함하는 방법.
- 키메라 TFR1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 비인간 동물로서, 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드는 인간 TFR1의 상응하는 연속 아미노산 서열과 동일한 적어도 50개의 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 동물은 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드를 발현하는 동물.
- 제29항에 있어서, 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드는 인간 TFR1 세포외 영역의 상기 상응하는 연속 아미노산 서열과 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 550개, 적어도 600개, 적어도 650개, 적어도 660개, 적어도 670개, 적어도 671개 또는 적어도 672개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 동물.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 89 내지 760과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 동물.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 동물의 내인성 TFR1 조절 요소에 조작 가능하게 연결되는 동물.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드는 내인성 TFR1 세포질 영역 및/또는 내인성 TFR1 막관통 영역을 포함하는 동물.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 동물의 내인성 TFR1 유전자좌에 통합되는 동물.
- 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 TFR1 폴리펩티드는 적어도 하나의 마우스 TFR1 활성 및/또는 적어도 하나의 인간 TFR1 활성을 갖는 동물.
- 키메라 TFR1을 발현하는 유전자 변형 동물 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
내인성 TFR1 유전자좌에서 내인성 TFR1의 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 TFR1의 상응하는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 상기 키메라 TFR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변형 동물 세포를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 동물 세포는 상기 키메라 TFR1을 발현하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 방법.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 키메라 TFR1은
마우스 TFR1의 세포질 영역 및/또는 막관통 영역; 및
인간 TFR1의 세포외 영역을 포함하는 방법.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 TFR1을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 내인성 TFR1 조절 요소, 예를 들어, 프로모터에 조작 가능하게 연결되는 방법.
- 제1항 내지 제21항 및 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 추가 인간 또는 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하는 동물.
- 제40항에 있어서, 상기 추가 인간 또는 키메라 단백질은 세포예정사 단백질 1(PD-1), 세포예정사 리간드 1(PD-L1), 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 4(OX40), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3) 또는 CD73인 동물.
- 제22항 내지 제28항 및 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물 또는 마우스는 추가 인간 또는 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하는 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 추가 인간 또는 키메라 단백질은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, OX40, LAG-3, TIM3 또는 CD73인 방법.
- 암 치료를 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 항-TFR1 항체를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하며, 상기 동물은 암을 갖는 단계; 및
b) 상기 항-TFR1 항체의 상기 암에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 암은 TFR1을 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 암은 상기 동물에 주입되는 하나 이상의 암세포를 포함하는 방법.
- 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TFR1 항체의 상기 암에 대한 억제 효과를 결정하는 단계는 상기 동물에 있는 상기 종양 부피를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 유방암, 결장암, 간암, 난소암, 폐암, 골암, 백혈병 및/또는 림프종인 방법.
- 암 치료를 위한 항-TFR1 항체 및 추가 치료제의 유효성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 항-TFR1 항체 및 상기 추가 치료제를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하며, 상기 동물은 암을 갖는 단계; 및
b) 상기 암에 대한 억제 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 동물은 인간 또는 키메라 세포예정사 단백질 1(PD-1)을 코딩하는 서열을 더 포함하는 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 동물은 인간 또는 키메라 세포예정사 리간드 1(PD-L1)을 코딩하는 서열을 더 포함하는 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 치료제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 방법.
- 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 TFR1 및/또는 PD-L1을 발현하는 하나 이상의 암세포를 포함하는 방법.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 하나 이상의 암세포를 상기 동물에 주입하여 야기되는 방법.
- 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료의 억제 효과를 결정하는 단계는 상기 동물에 있는 상기 종양 부피를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 뇌암, 유방암, 결장암, 간암, 난소암, 폐암, 골암, 백혈병 및/또는 림프종을 갖는 방법.
- 혈액뇌 장벽을 통과하는 치료제의 전달 효율을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 치료제를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하는 단계; 및
b) 상기 동물의 뇌 및/또는 혈청에서 시간 경과에 따른 상기 치료제의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 치료제는 항-TFR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 치료제는 TFR1(예를 들어, 인간 TFR1) 및 제2 항원을 표적으로 하는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)인 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 제2 항원은 베타-분비효소 1(BACE1) 또는 아밀로이드 베타인 방법.
- 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제의 농도는 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 적어도 20시간, 또는 적어도 25시간의 기간에 걸쳐 결정되는 방법.
- 골 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 항-TFR1 항체를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하며, 상기 동물은 상기 골 질환을 갖는 단계; 및
b) 상기 골 질환을 치료하기 위한 상기 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 골 질환은 골절, 골변성, 관절염, 골기형, 골다공증 및/또는 대퇴골두 괴사인 방법.
- 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 항-TFR1 항체를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하며, 상기 동물은 상기 신경퇴행성 질환을 갖는 단계; 및
b) 상기 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 상기 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 뇌허혈, 뇌 손상 또는 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및/또는 척수소뇌 실조증인 방법.
- 면역 장애를 치료하기 위한 항-TFR1 항체의 유효성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 항-TFR1 항체를 제1항 내지 제21항, 제29항 내지 제35항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 따른 동물에 투여하며, 상기 동물은 상기 면역 장애를 갖는 단계; 및
b) 상기 면역 장애를 치료하기 위한 상기 항-TFR1 항체의 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 면역 장애는 알레르기, 천식, 심근염, 신염, 간염, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 경피증, 갑상선항진증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 자가면역 용혈성 빈혈, 궤양성 대장염, 자가 면역 간 질환, 당뇨병, 통증 및/또는 신경 장애인 방법.
- 아미노산 서열을 포함하는 단백질로서, 상기 아미노산 서열은:
(a) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열;
(b) 서열 번호: 1, 2 또는 9와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열;
(c) 서열 번호: 1, 2 또는 9와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열;
(d) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열과 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 아미노산 서열; 및
(e) 서열 번호: 1, 2 또는 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 아미노산 서열 중 하나인 단백질.
- 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 뉴클레오티드 서열은:
(a) 제68항에 따른 단백질을 코딩하는 서열;
(b) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8;
(c) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 90% 동일한 서열; 및
(d) 서열 번호: 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열 중 하나인 핵산.
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