CN109735498B - 一种cd137基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明基于CRISPR/Cas9技术提供了一种CD137基因修饰人源化动物的制备方法，构建得到一种免疫系统完整、可有效评价抗CD137抗体的CD137基因修饰人源化动物模型。进一步的，本发明以上述模型建立了一种可用于抗CD137抗体的临床前筛选的CD137人源化小鼠药效评价平台，可根据该药效评价平台设计合理的抗CD137抗体的给药方法，为候选抗CD137抗体提供更准确的临床前药效评价方法。

Description

一种CD137基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于RISPR/Cas9技术的CD137基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

复杂的生物过程通常需要进行体内分析，许多重要的研究进展已经用小鼠作为研究各种生物系统的模型。体内人体生物学的研究受到道德和技术的严重限制，越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠或人鼠嵌合体来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。

在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。

通过临床前评估的候选药，大部分在临床I期失败，这其中小鼠与人体内生理、病理等的差异是重要的因素：人鼠免疫系统的差异、许多致病因子和药物在人鼠之间的种系特异性、药物靶点与受体之间在人鼠之间的亲和力差异、人源肿瘤与鼠源肿瘤的差异等都将影响临床前与临床数据的一致性。因此构建具有人的功能性基因、细胞及组织的人源化小鼠模型具有重要的意义。随着人源化小鼠的不断完善，可以更好的反应预期临床数据。

抗肿瘤免疫疗法在近两年掀起研究热潮，Checkpoint许多药物已获得了临床批准用药，并取得了可喜的成绩。免疫检查点疗法出现彻底改变了癌症治疗方法。针对PD-1及其主要配体PD-L1的单克隆抗体已证明在多种癌症类型中具有抗肿瘤作用。然而，在人们欣喜与一些患者出现快速持久的肿瘤消退时，大多数患者对PD-1/PD-L1的疗法没有明显的反应。而与此同时，相对应的其他免疫检查点的研究不断取得成果后，人们开始开发免疫检查点之间进行联用的策略，以期获得更为广泛的适应症人群。

CD137，一种肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，是在80年代后期从活化细胞中发现的，作为治疗靶点具有独特的吸引力。CD137在整个造血和非造血细胞室中广泛表达，例如DC、活化的单核细胞和NK细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。通过激活CD137，可刺激T细胞和抗原提呈细胞增殖并分泌细胞因子，提高机体的抗肿瘤免疫应答水平。在NK细胞上，CD137信号传导可以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，同时，CD137能够保护T细胞免于活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell dea th，AICD)。由于其广泛的表达，和CD137增强强效和持久免疫效应的能力，使CD137成为癌症免疫治疗的临床靶标。

功能表征显示CD137主要在T细胞的免疫应答中发挥作用，可以协同CD28在免疫后期提供共刺激信号以及T细胞的存活信号，在维持免疫应答、抵抗免疫细胞凋亡、减少抗原特异性免疫细胞的清除以及增强免疫记忆方面发挥重要作用。研究发现在移植抗宿主病的小鼠模型中，激动性CD137单克隆抗体可以加剧细胞毒性CD8+T细胞介导的组织损伤并加速心脏和皮肤同种异体移植物的排斥。T细胞上的CD137连接触发信号级联，其导致抗细胞凋亡分子的上调，细胞因子分泌和细胞效应功能增强。CD137在增强T细胞细胞毒性中的作用为CD137单克隆抗体的开发提供了科学依据。

Melero等人首次表明体内给予激动性抗CD137单克隆抗体对免疫原性较差的Ag104A和高度免疫原性的P815均具有强大的抗肿瘤特性，一些研究者也已经证实了4-1BB抗体的抗肿瘤作用。由于其强大的抗肿瘤特性，单独或与其他药剂组合的CD137疗法获得了广泛的认可。例如，小鼠中共注射抗CD137mAb及半外源DC可导致MC38肿瘤消退。抗CD137的抗肿瘤作用主要是CD4+T及CD8+T细胞活化引起的，但NK和NKT细胞在CD137抗肿瘤活性中也起着重要的作用，如CD137和IL-12抗体联合治疗，可以通过增强NK细胞的活性，将B16-F10黑素瘤及肺转移模型小鼠的存活率提高至50％。这些数据强烈表明抗CD137抗体在体内具有许多潜在靶标，其刺激导致肿瘤根除增强。

由于CD137的广泛表达，CD137激动剂容易造成系统性不良反应。目前有两种CD137激动剂抗体正在进行临床实验：Urelumab(BMS-663513，by Bristol-Myers Squibb)，Utomilumab(PF-05082566，by Pfizer)。urelumab在人源化小鼠模型中被证明均有良好的抗肿瘤药效，同时在小鼠胃癌PDX模型中，使用urelumab和nivolumab联合治疗同样具有良好的抗肿瘤活性及免疫系统激活作用。然而，Urelumab在Phase1和Phase2阶段的数据显示具有严重的3-4级临床不良反应，阻碍了其临床开发。自2012年开始，Urelumab开始与rituximab,cetuximab,elotuzumab和nivolumab组合测试临床试验(NCT01471210，NCT01775631，NCT02110082，NCT02252263，NCT02253992)，通过降低临床给药剂量降低相关不良反应。Utomilumab与Urelumab相比，具有更高的安全性及更低的抗肿瘤效果。

CD137人源化模型允许研究人员在功能性免疫系统的背景下研究治疗效果，以及可以促进更准确的进行免疫相关毒性评估。在CD137人源化模型中，研究人员可以通过调整给药方案设计开发药效最大化同时最小化CD137引起的不良反应。本发明利用基因改造技术，将CD137基因的胞外区进行人源化，保留鼠源胞内区，可以有效的评价人源抗CD137抗体调动免疫系统对肿瘤的杀伤。此外，研究表明利用CD137人源化模型，模拟临床上Urelumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗CD137抗体的安全性。

因此，人源化CD137小鼠模型可以有效的推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证，免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。

发明内容

本发明基于CRISPR/Cas9技术提供了一种CD137基因修饰人源化小鼠的制备方法，构建得到一种免疫系统完整、可有效评价抗CD137抗体的CD137基因修饰人源化小鼠模型。进一步的，本发明以上述模型建立了一种可用于抗CD137抗体的临床前筛选的CD137人源化小鼠药效评价平台，可根据该药效评价平台设计合理的抗CD137抗体的给药方法，为候选抗CD137抗体提供更准确的临床前药效评价方法。

实现发明目的的具体技术方案如下：

一种CD137基因修饰人源化动物细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)选择动物CD137基因的完整胞外区两端作为打靶位点，设计包含人源CD137基因胞外区的同源DNA供体和鉴定方案；

(2)基于CRISPR/Cas9技术，制备Cas9或其表达载体，在动物CD137基因的完整胞外区的5’端和3’端各设计一条sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体或各自的表达载体；

或者，制备Cas9、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体；

(3)将步骤(2)制备得到的Cas9、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体注射入受精卵，敲除动物CD137基因的胞外区的同时将人源CD137基因的胞外区插入到基因组。

进一步的，本发明提供了CD137基因修饰人源化动物细胞模型的构建方法，将上述方法构建的CD137基因修饰人源化动物受精卵移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代动物，经基因型鉴定正确的F0代动物性成熟后与同背景野生型动物配繁获得F1代，制备得到CD137基因修饰人源化动物模型。

本发明所述方法可适用于非人哺乳动物的基因修饰人源化模型构建，优选啮齿类动物，更优选小鼠。BALB/c小鼠是肿瘤与免疫研究领域中最常用的小鼠品系，具有较多同源肿瘤细胞系；C57BL/6小鼠是目前研究比较成熟的小鼠品系。本发明在研究中以BALB/c和C57BL/6两种小鼠为背景鼠，成功获得了2个背景的CD137人源化小鼠模型，2个背景的小鼠皆可实现人源CD137的表达。最终表达的CD137人源化氨基酸序列为MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGGHSLQVLTLFLALTSALLLALIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGY(SEQ ID No:29)。

本发明将人的CD137与鼠的CD137序列进行比较后，选取人CD137的完整胞外区替换鼠源CD137完整胞外序列，保留小鼠CD137信号肽、跨膜区及胞内区，选取的鼠源CD137基因胞外区序列如SEQ ID No:1所示，人源CD137基因胞外区如SEQ ID No:2所示。(人CD137基因的胞外区位于部分Exon3至Exon4-7，小鼠CD137基因的胞外区位于部分Exon2至Exon3-6，图1为本发明所述方法CD137人源化策略示意图。)以鼠源部分Exon2前端序列设计5端同源臂(SEQ ID No:27)，以Exon6后端序列设计3端同源臂(SEQ IDNo:28)，以人CD137基因的胞外区作为替换区构建同源DNA供体，同源DNA供体序列如SEQ ID No:3所示。

本发明述构建方法，步骤(2)还包括进一步检测制得的sgRNA或者crRNA和tracrRNA二元复合体的切割效率。所述检测包括核酸内切酶检测法、SSA报告载体检测法、Sanger测序法、Digenome-Seq技术。优选的，所述核酸内切酶选自SURVEYOR酶或T7EN1酶。切割效率的检测具体为将野生型Cas9蛋白、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转入小鼠受精卵，受精卵发育至囊胚后提取细胞基因组并用特异引物扩增目标切割区域，对获得的PCR产物进行T7EN1酶切，酶切后进行电泳检测，检测结果显示比对照组多出一条或多条条带的视为有效切割，或者对获得的PCR产物进行Sanger测序，测序结果比对显示，gRNA区域出现双峰视为有效切割；筛选出高效sgRNA或crRNA和tracrRNA。

本发明所述方法转入受精卵的方法包括受精卵电转或者受精卵注射。

本发明所述的构建方法，一个优选的技术方案使用sgRNA的序列如SEQ ID No:4和7所示。

本发明另一目的在于提供一种多靶点基因修饰人源化动物模型的构建方法，将非CD137的免疫检查点基因修饰人源化小鼠与本发明所述方法构建的CD137人源化小鼠交配，获得其他基因杂合CD137杂合人源化小鼠，双靶点杂合人源化小鼠与单靶点纯合人源化小鼠以体外受精的快速扩繁方式获得单靶点纯合另外一个靶点杂合的人源化小鼠，以此小鼠为基础，将其兄妹互配获得双靶点纯合人源化小鼠，所述非CD137的免疫检查点基因选自PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、GITR、BTLA、LAG3、TIM3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa、VISTA。

本发明一个具体的实施例，公开了一种PD1及CD137人源化小鼠模型的构建方法，将PD1纯合人源化小鼠与CD137人源化小鼠交配获得PD1杂合CD137杂合人源化小鼠，雄鼠与PD1纯合人源化小鼠进行IVF，获得大量PD1纯合CD137杂合人源化小鼠，待PD1纯合CD137杂合人源化小鼠到适配年龄，将其兄妹互配获得PD1与CD137双纯合人源化小鼠。获得的hPD1/hCD137人源化小鼠可同时表达PD1及CD137蛋白。

本发明另一目的在于提供本发明所述构建方法制备得到的CD137人源化动物模型在免疫检查点激活或抑制药物活性筛选及评价中的应用。

本发明优点：

1.本发明构建的CD137人源化小鼠，将小鼠CD137基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化模型拥有人源胞外区，可筛选人源免疫检查点药物(如中和性抗体)，而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为(激活或抑制)。胞外区的人源化尽可能保留了筛选抗体的更多区域，适用于更多的药物产品筛选及评价。

2.mRNA表达验证结果表明本发明方法构建的人源化CD137小鼠的嵌合mRNA剪接正常。CD137人源化小鼠蛋白表达检测结果表明本方法制备得到的CD137基因修饰人源化小鼠可成功表达人CD137蛋白，且表达水平达到普通小鼠水平一致。hCD137人源化小鼠的免疫系统指标评价结果表明CD137人源化修饰小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异。抗CD137抗体的肿瘤药效验证结果表明荷瘤的CD137人源化小鼠对抗hCD137抗体抗肿瘤药具有良好的药效反应。

本发明构建的CD137人源化小鼠不仅可以用于抗体肿瘤药效的评估，对验证相关药物、免疫相关药物的开发的临床前效果有着重要的指导意义，为CD137蛋白在免疫系统的通路及功能研究提供理想的模型，为指导临床给药方案设计提供策略。同时也是抗CD137抗体药物及CD137激动剂蛋白安全性评价的理想模型，对CD137抗体药物的毒理学进行临床前体内评价。

3.根据本发明构建的CD137人源化模型进一步构建多靶点人源化模型不仅可用于热门靶点如CD137、PD1、PD-L1等的单独药效验证，同时提供多靶点联合用药的模型，提供更广泛的临床前联合用药方案，为更多的适应症人群筛选多种靶点的组合疗法提供科学数据。

4.BALB/c背景具有更易发肿瘤，对致癌物非常敏感，肿瘤发生率高的特点，因此BALB/c背景的hCD137人源化模型是更适用于肿瘤学及免疫学研究的理想模型；同时，来源于BALB/c的肿瘤细胞系资源更加丰富，使用BALB/c背景来源的肿瘤细胞荷瘤模型评价抗体药物在多种肿瘤细胞中的药效能力，丰富抗体药物的临床前评价体系。本发明制备的BALB/c背景的CD137人源化单靶点及双靶点模型直接使用Crispr-Cas9技术对受精卵直接进行打靶，快速获得CD137人源化系列模型，填补了市场空白。

附图说明

图1为本发明所述方法CD137人源化策略示意图。

图2为鼠源CD137胞外区两端sgRNA切割活性PCR鉴定电泳图。

图3为hCD137F0鼠尾DNA鉴定电泳图。

图4为hCD137F1鼠尾DNA鉴定电泳图。

图5为hCD137小鼠的mRNA表达验证电泳图结果。

图6为C57BL/6背景脾脏中CD137表达检测结果。

图7为BALB/c背景脾脏中CD137表达检测结果。

图8为CD137人源化小鼠血液中免疫细胞分群数据。

图9为CD137人源化小鼠脾脏中免疫细胞分群数据。

图10为荷瘤的CD137人源化小鼠各组体重变化曲线(N＝6)。

图11为荷瘤的CD137人源化小鼠各组的肿瘤体积变化曲线。

图12为荷瘤的CD137人源化小鼠为个体肿瘤体积变化曲线。

图13为荷瘤的CD137人源化小鼠实验终点脾脏及肿瘤重量统计分析。

图14为荷瘤的CD137人源化小鼠外周血、脾脏、肿瘤组织中T细胞及亚群的比例。

图15为BALB/c-hPD1/hCD137蛋白表达检测结果。

图16为C57BL/6-hPD1/hCD137人源化小鼠的血淋巴细胞分群检测结果。

图17为C57BL/6-hPD1/hCD137人源化小鼠的脾淋巴细胞分群检测结果。

图18为BALB/c-hPD1/hCD137人源化小鼠的血淋巴细胞分群检测结果。

图19为BALB/c-hPD1/hCD137人源化小鼠的脾淋巴细胞分群检测结果。

图20为C57BL/6-hPD1/hCD137人源化小鼠的各组体重变化曲线(N＝5)。

图21为C57BL/6-hPD1/hCD137人源化小鼠的各组的肿瘤体积变化曲线。

图22为C57BL/6-hPD1/hCD137人源化小鼠的个体肿瘤体积变化曲线。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1 CD137人源化打靶同源DNA供体构建

本发明将人的CD137与鼠的CD137序列进行比较后，选取人CD137的完整胞外区替换鼠源CD137完整胞外序列，保留小鼠CD137信号肽、跨膜区及胞内区，选取的鼠源CD137基因胞外区序列如SEQ ID No:1所示，人源CD137基因胞外区如SEQ ID No:2所示。以人BAC(RP11-1080K5)序列为基础，扩增CD137胞外区序列，在人源CD137基因胞外区序列的5’端和3’端各增加鼠源胞外区两端同源臂(SEQ ID No:27和SEQ ID No:28)，与pMD18T连接后构建同源DNA供体，全序列如SEQ ID No:3所示。

实施例2 CD137人源化小鼠sgRNA筛选

在人源化替换区域设计针对鼠源序列的sgRNA。设计并合成识别5’端靶位点和3’端靶位点，并构建sgRNA表达载体。两端sgRNA识别位点分别位于小鼠CD137基因胞外区的两端，各sgRNA在CD137上的靶位点序列见表1。将各sgRNA序列克隆至pUC57kan-T7-delG载体中，构建puc57-sgRNA质粒)(以000060-CD137-5S1为例，puc57-sgRNA-5S1序列见SEQ IDNo:8)。

表1 sgRNA序列

sgRNA名称	sgRNA序列(5’→3’)	PAM
			000060-CD137-5S1	ucauugugcugcugcuagu(SEQ ID No:4)	GGG
000060-CD137-5S2	ucauugugcugcugcuag(SEQ ID No:5)	UGG
			000060-CD137-3S1	acaucaugcgguuguu(SEQ ID No:6)	UGG
000060-CD137-3S2	acaucaugcgguuguuu(SEQ ID No:7)	GGG

sgRNA转录制备方法：以PrimerStar或PrimerStar Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行sgRNA的转录。

sgRNA筛选：分别将5端和3端的sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，将混合液注射至0.5天的受精卵中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠CD137基因的ko阳性率的鉴定，以此筛选切割活性高的sgRNA，分别选择5端和3端切割活性最高的sgRNA配对成sgRNA对。

sgRNA切割鉴定方法：对收集的囊胚进行PCR扩增(PCR方案如下表2)，将扩增条带进行二代测序(5S1-5S2测序引物：CD137-5in-tF1，3S1-3S2测序引物：CD137-3in-tR1)，与wt条带比对，统计发生突变的概率(鉴定结果见下表3)，最终选择huCD137-5S1和huCD137-3S2。

表2 sgRNA切割PCR鉴定方案

hCD137sgRNA囊胚DNA鉴定电泳图如图2所示，其中，1-20#样品为000060-CD137-3S1囊胚，21-40#样品为000060-CD137-5S1囊胚，41-60#为000060-CD137-3S2囊胚，61-80#为000060-CD137-5S2囊胚，阴性对照为B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；DL：DL2000 2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。

表3 sgRNA切割活性

sgRNA名称	切割效率
		huCD137-5S1	14/14＝100％
huCD137-5S2	14/15＝93％
		huCD137-3S1	0/15＝0
huCD137-3S2	9/14＝64％

根据表3结果选择切割效率高的huCD137-5S1和huCD137-3S2用于下一步实验。

实施例3 CD137人源化小鼠模型建立

将实施例2筛选得到的sgRNA以及实施例1设计的CD137人源化打靶同源DNA供体，将同源DNA供体及Cas9/sgRNA系统注射至0.5天的C57BL/6小鼠受精卵中，移植至0.5天假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠(F0)。

人源化小鼠F0代基因型鉴定。对获得的F0小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物对同源DNA供体中靶后的两端序列以及同源DNA供体中的序列进行PCR鉴定，引物000060-huCD137-5’-tF1/000060-huCD137-tR1分别位于5’同源臂外及同源DNA供体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标同源DNA供体在小鼠基因组5’进行了有效插入；000060-huCD137-3’-tF1/000060-huCD137-3’-tR1分别位于同源DNA供体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标同源DNA供体在小鼠基因组3’进行了有效插入。对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证，同源DNA供体在小鼠基因组中替换小鼠相应序列后，测序正确的克隆经鉴定为阳性小鼠。

表4 F0鉴定及测序引物：

PCR反应体系：

PCR反应条件

对F0代鼠尾进行基因鉴定，F0代小鼠PCR实验结果见图3，(图3为hCD137F0鼠尾DNA鉴定电泳图，其中，阴性对照为B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；DL：DL20002000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。)打靶后供体鼠共获得62只F0小鼠，获得阳性小鼠编号如下：2#，5#，13#，17#，19#，22#，50#，59#，F0阳性率为13.0％。结果表明可以获得两端鉴定阳性的F0小鼠，共8只两端阳性小鼠。

将F0与背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果见图4，其中注：阴性对照为B6基因组DNA，N为空白对照,无模板的对照，P为阳性质粒对照，Trans2KII条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。

结果表明可以获得可遗传的阳性F1小鼠。获得阳性小鼠编号如下：52#，58#，61#，63#，48#，53#，56#。F1大量扩繁后进行互配，获得纯合子。

参照上述方法可获得CD137人源化BALB/c小鼠模型。

实施例4单靶点CD137人源化小鼠模型的表达及功能验证

1.CD137人源化小鼠的mRNA表达验证

通过mRNA检测杂合子中人源CD137转录情况，而后通过流式细胞术分析杂合子及纯合子人源化基因的表达情况并对免疫细胞类群进行检查，经分析能够成功表达人源化基因，且未造成免疫系统明显异常的小鼠可供肿瘤药效实验。

检测方法:实验使用样品为C57BL/6背景人源化CD137(KI/wt)及C57BL/6野生型(wt/wt)。提取小鼠胸腺RNA进行RT-PCR，对PCR产物测序以验证CD137mRNA剪接是否正确。引物(CD137-wt-mRNA-F4/CD137-KI-mRNA-R52)位于鼠源CD137胞外区5端外侧、人源CD137胞外区内；引物(CD137-KI-mRNA-F32/CD137-wt-mRNA-R4)位于人源CD137胞外区5端外侧、鼠源CD137胞外区外；引物(CD137-wt-mRNA-F4/CD137-wt-mRNA-R4)及引物(CD137-wt-mRNA-F3/CD137-wt-mRNA-R3)位于鼠源CD137胞外区3端外侧、鼠源CD137胞外区外侧；引物(YF000095BTLA-wtTF1/YF000095BTLA-wtTR1)及引物(YF000095BTLA-wtTF2/YF000095BTLA-wtTR2)用于内参检测。以胸腺RNA的反转录cDNA为模板扩增，如果CD137mRNA正确剪接，则出现的目的条带。结果如图5所示，其中KI-mCD137:5`end PCR引物为CD137-wt-mRNA-F4、CD137-wt-mRNA-R4。3`end PCR引物为CD137-wt-mRNA-F3、CD137-wt-mRNA-R3；KI-hCD137:5`end PCR引物为CD137-wt-mRNA-F4、CD137-KI-mRNA-R52。3`end PCR引物为CD137-KI-mRNA-F32、CD137-wt-mRNA-R4；KI-mBTLA4:5`end PCR引物为YF000095BTLA-wtTF1、YF000095BTLA-wtTR1。3`end PCR引物为YF000095BTLA-wtTF2、YF000095BTLA-wtTR2；DL为Marker DL2000，条带：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。将目的条带切胶送测序。测序结果显示：hCD137阳性小鼠PCR产物检测到正确人源化mRNA。上述结果说明：人源化CD137小鼠的嵌合mRNA剪接正常。

表5人源mRNA及鼠源mRNA鉴定引物

PCR体系：

试剂	体积(μl)
		2×Primer Star Max	25
ddH<sub>2</sub>O	22
		primer F	1
primer R	1
		Template	1

PCR程序：

Seg.	Temp.	Time	Cycle
				1	95℃	5min
2	95℃	30s
				3	60℃	30s
4	72℃	50s	2-4，35
				5	72℃	5min
6	10℃	hold

2.CD137人源化小鼠的CD137表达及功能验证

2.1 CD137人源化小鼠蛋白表达检测

流式检测蛋白方法：

取材：对4周龄C57BL/6背景杂合及4周龄BALB/c背景杂合CD137小鼠腹腔注射7.5μg CD3e抗体，刺激24h后取脾脏进行流式检测，称重，置于C型管。

消化：C型管中有预冷的酶消化液3ml(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30μgDNase+1.75mg胶原酶D)，置于37℃水浴中消化30min。消化完成的脾脏细胞加300μl 0.1M的EDTA终止消化。1mL滤膜过滤除去未消化完全的组织块，每管加2mL FACS buffer中和EDTA。脾脏使用RBC室温避光裂解红细胞5min，加FACS buffer洗涤并重悬，分到流式管中100μL，准备孵育抗体。

抗体孵育：加入抗hCD137、抗mCD137抗体，冰上避光孵育1h；FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

检测结果：F1代杂合子交配可获得纯合子。选取C57BL/6背景杂合及BALB/c背景的CD137小鼠脾脏，使用抗CD3e抗体进行刺激后，将组织研磨消化成单个细胞，使用人源抗CD137抗体及鼠源抗CD137抗体，通过流式细胞术分析人源化小鼠基因的表达情况。C57BL/6背景脾脏中CD137表达检测结果如图6所示，BALB/c背景脾脏中CD137表达检测结果如图7所示。分析发现，2种背景鼠中均未检测到人源CD137表达，而CD137杂合小鼠中即可以检测到人源CD137表达，又可以检测到鼠源CD137的表达。与对照组小鼠CD137相比，人源CD137表达情况与其基本一致，表明本方法制备得到的CD137基因修饰人源化小鼠可成功表达CD137蛋白，且表达水平达到普通小鼠水平一致。

2.2 hCD137人源化小鼠的免疫系统指标评价

建系获得的hCD137人源化小鼠应具有健全的免疫系统，且hCD137蛋白的表达不会引起小鼠免疫系统的紊乱(T/NK细胞的严重缺陷等)，对于CD137靶点的药物评价有效性至关重要。以流式细胞分选术检测不同周龄的小鼠免疫指标(主要为T/B/NK细胞)，同时辅以血常规检测，综合判定小鼠的免疫系统指标。可表达功能性CD137且免疫系统健全的人源化小鼠模型将是基于CD137靶点的抗体药效评价的重要的临床前测评工具。

流式检测方法：

取材：对4周龄C57BL/6背景纯合CD137小鼠腹腔注射7.5μg CD3e抗体，刺激24h后取外周血及脾脏进行流式检测，称重，置于C型管。

消化：C型管中有预冷的酶消化液3ml(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30μgDNase+1.75mg胶原酶D)，置于37℃水浴中消化30min。消化完成的脾脏细胞加300μl 0.1M的EDTA终止消化。1mL滤膜过滤除去未消化完全的组织块，每管加2mL FACS buffer中和EDTA。脾脏使用RBC室温避光裂解红细胞5min，加FACS buffer洗涤并重悬，分到流式管中100μL，准备孵育抗体。

抗体孵育：加入CD3,CD4,CD8,CD19,CD335,IgM,B220抗体，冰上避光孵育1h；FACSbuffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。

检测结果：选取C57BL/6背景纯合CD137小鼠脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。为验证hCD137是否参与到小鼠的免疫应答，在体外分离hCD137人源化小鼠的脾脏细胞，分别用Anti-hCD137抗体和Anti-mCD137抗体刺激后，检测淋巴细胞的活化状态。结果如图8和9所示，结果表明CD137人源化小鼠脾脏单核细胞(mononuclear cells，MNC)被Anti-hCD137和Anti-mCD137抗体活化，CD25+CD69+双阳性细胞的比例>95％，淋巴细胞活化显著。C57BL/6-hCD137纯合小鼠各T、B、NK各免疫细胞数量与C57BL/6背景鼠基本无差别。以上数据表明hCD137参与到了小鼠的免疫应答过程，CD137人源化修饰小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异。

2.3 hCD137人源化小鼠评价抗CD137抗体的肿瘤药效验证

由于体外水平的验证数据，并不足以反映hCD137在人源化小鼠体内的实际情况，本发明设计实验收集以下体内实验数据：荷瘤的CD137人源化小鼠对抗hCD137抗体抗肿瘤药效反应性。

检测方法：MC38细胞培养。复苏细胞：液氮罐中取出，于37℃水浴锅中迅速解冻，接种在15cm dish中培养。传代：MC38属于贴壁细胞，通常情况下，每2-3天需要进行一次传代。观察与测量：分组前每天观察小鼠的生长情况，每周称重2次。确认小鼠荷瘤后，对肿瘤大小进行检测。分组。接MC38细胞7天后，肿瘤平均体积为80-120mm3，将小鼠随机分为2组，开始药效实验。皮下注射MC38细胞。收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清，用10ml无钙镁离子的PBS洗2次。PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为5×106/ml。皮下注射，将100μl MC38细胞注射到小鼠右侧背部，大腿上方。治疗组注射10mpk的抗CD137药物，对照组注射等体积的同型对照。给药当日测量小鼠体重和肿瘤体积，后续周测量2次，每日给药前测量小鼠体重，依据体重进行当日给药。给药第28天或者接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm³时执行安乐死结束实验。

表6分组及给药方案

2.3.1小鼠体重变化

所有动物在给药后每周称重两次，各组荷瘤鼠的体重变化曲线如图10所示。不同组小鼠之间的体重变化没有明显的差异,，说明在抗体测试剂量下，小鼠耐受良好，未出现明显毒副反应。

2.3.2肿瘤体积变化

图11为不同组的肿瘤体积变化曲线，图12为个体肿瘤体积变化曲线，G3组阳性药对应为G1组对照，G4组阳性药对应为G2组对照。

2.3.3相对肿瘤抑制率TGI(％)

在D28，第3组(Urelumab analog)肿瘤体积低于第1组对照(hIgG4)，差异有统计学意义(P＝0.000)，TGI(％)为100.00％。第4组(Utomilumab analog)肿瘤体积差异与第2组对照(hIgG2)相比，无统计学意义(P＝0.323)，TGI(％)为47.67％。

表7受试品处理后药效统计分析

备注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001.

2.3.4终点小鼠脾脏及肿瘤重量

在实验终点(D29)，Group3(Urelumab analog)肿瘤几乎全部消失，不同组的肿瘤瘤重及脾脏重量如图13所示。

2.3.5流式检测结果

Group1(hIgG4)、Group3(Urelumab analog)组小鼠终点处理后，流式检测外周血、脾脏、肿瘤组织中T细胞及亚群的比例见图14，注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

结论：

药效实验结果表明，Urelumab analog对MC38细胞小鼠皮下移植瘤有非常明显的抑制作用，可以在5mpk剂量下达到肿瘤消除的效果；Utomilumab analog在5mpk剂量下，仅可以达到部分肿瘤小鼠的效果。在供试品测试剂量下，小鼠耐受良好，未出现明显毒副反应。

与G1组(hIgG4 5mpk)相比，G3组(Urelumab analog 5mpk)外周血中T细胞亚群比例除总T细胞的比例增高，而各细胞亚群的比例没有明显变化；脾脏中总T细胞的比例没有明显变化，而各T细胞亚群的中CD25-CD69+与CD25+CD69-的比例均降低。

实施例5双靶点hPD1/hCD137人源化小鼠的CD137及PD1表达及功能验证

1.hPD1/hCD137人源化小鼠的CD137及PD1蛋白表达验证

将PD1纯合人源化小鼠与CD137人源化小鼠交配获得PD1杂合CD137杂合人源化小鼠，雄鼠与PD1纯合人源化小鼠进行IVF，获得大量PD1纯合CD137杂合人源化小鼠，待PD1纯合CD137杂合人源化小鼠到适配年龄，将其兄妹互配获得PD1与CD137双纯合人源化小鼠。获得的hPD1/hCD137人源化小鼠安排PD1及CD137蛋白的表达。选取双靶点小鼠脾脏，检测组织中CD137和PD1的表达。在小鼠体内注射Anti-CD3e抗体可以活化小鼠体内的T细胞，因此使用Anti-CD3e抗体对小鼠进行刺激后，样品处理及蛋白检测与单靶点CD137小鼠的检测使用同种检测方法。经验证的BALB/c背景双靶点小鼠可以同时表达PD1及CD137(图15)。

检测结果：使用人源抗PD1与CD137抗体及鼠源抗PD1与CD137抗体，通过流式细胞仪检测BALB/c-hPD1/hCD137纯合小鼠和BALB/c背景鼠刺激与未刺激中表达人源和鼠源PD1和CD137 T-cell情况，BALB/c背景鼠中未检测到人源PD1和CD137表达，而BALB/c-hPD1/hCD137纯合小鼠中仅能检测到人源PD1和CD137表达。且在CD3e抗体刺激后，人源PD1与CD137表达情况与均显著提高，提升幅度与鼠源PD1与CD137提升幅度相似。以上结果表明本方法制备得到的PD1与CD137基因修饰人源化小鼠可成功表达PD1与CD137蛋白，且其中CD137表达水平达与普通小鼠水平接近(见图15)。

2.hPD1/hCD137人源化小鼠的淋巴细胞分群检测

选取小鼠的主要免疫器官胸腺或脾脏，剪取C57BL/6及BALB/c背景的hPD1/hCD137纯合小鼠和C57BL/6及BALB/c背景鼠外周血和脾脏，T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量，验证双靶点人源化后的小鼠免疫系统处于正常水平，双基因的人源替换不会影响小鼠的免疫激活或抑制。样品处理及蛋白检测与单靶点CD137小鼠的检测使用同种检测方法。经验证的C57BL/6及BALB/c背景双靶点小鼠与背景鼠一致，具有正常免疫系统(图16-图19)。

检测结果：如图16-图19所示，C57BL/6及BALB/c背景的hPD1/hCD137纯合小鼠和C57BL/6及BALB/c背景鼠外周血和脾脏之间各T、B、NK免疫细胞数量基本无差别。以上数据表明人源PD1与CD137参与到了小鼠的免疫应答过程，hPD1/hCD137小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异，可用于需借助免疫系统进行药物评价的药效评价系统。

3.hPD1/hCD137人源化小鼠评价抗CD137抗体及抗PD1抗体的联合肿瘤药效验证

检测方法：与hCD137单靶点人源化小鼠的肿瘤药效评价方法一致。

表8分组及给药方案

3.1小鼠体重变化

所有动物在给药后每周称重两次，各组荷瘤鼠的体重变化曲线如图20所示。在供试品测试剂量下，小鼠耐受良好，与对照组之间相比，没有明显的差异，未出现明显毒副反应

3.2肿瘤体积变化

图21为不同组的肿瘤体积变化曲线，图22为个体肿瘤体积变化曲线。与对照组相比，Utomilumab给药组具有部分抗肿瘤药效，Opdivo给药组及两者联用可达到更好的抗肿瘤效果。结论：药效实验结果表明，MC38细胞在hPD1/hCD137人源化小鼠皮下移植荷瘤后，Opdivo和Anti-CD137抗体均对皮下移植瘤有肿瘤抑制作用，表明双靶点hPD1/hCD137人源化小鼠可以用作评价抗人CD137和抗人PD1抗体的药效评价及联合药效的验证。

序列表

<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司

<120> 一种CD137基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggaaaca actgttacaa cgtggtggtc attgtgctgc tgctagtggg ctgtgagaag 60

gtgggagccg tgcagaactc ctgtgataac tgtcagcctg gtaagtgcca aagtgacatg 120

actgttgaag actcagttca gttagcctgg tgtcttagtt agggttccgt tgctgtgaag 180

agacaccacg gccaaggcag ctcttataaa gaacagcatt taattggggc tggcttacag 240

gctcagaggt ttggttcatt atcatctctg tgggaagcat ggaatcttcc caccaggtag 300

gcttggtgct ggagaaggag ctgagagttc tacatcttga tccaaagact gccaggagaa 360

gactgtcttc tgcagctact cattcccttg caaaagcttg ttgagggggc tggagagatg 420

actttggtta agagcaccga ctgctcttct gaaggtcctg agttcaaatc ccagcaacca 480

catggtggct cacaaacatc cgtaatgaga tgccctctac gggtgcatct gaagacagct 540

acagtgtact tagatataat aataataata aataaatcct tttaaaaaaa aagcttgttg 600

aatccaacaa agcagccatg aggactccac ttgctcactt aaccttgcca ccttgtcaat 660

ttgccatctg agctttcttt gtcatggtat ttatatgttg ttcttcctgg ctgctggact 720

gtgctgacgg tcaccctgca aacatgtgca gtcctaaaat gccagtcatt gtgatgccag 780

gaggacagac agaatattta ttttgatatc ctcgaaaatg tcacaatgct gagagaactg 840

gtcatttgtt gtcagacaca aatgcctgtg acaattcttg caggtacttt ctgcagaaaa 900

tacaatccag tctgcaagag ctgccctcca agtaccttct ccagcatagg tggacagccg 960

aactgtaaca tctgcagagt gtgtgcaggt aggtcagtct gtctgtctgt ctgtctgtct 1020

ggaaaggaga gcttgctgtt gcccaggcta gactggaacc tgtgactctt gttcctcagc 1080

ctcccaagtc tggaggtttg ctttagaggg gagacatctt catctttaag accattgggc 1140

agagttaagc tttgatccgt ttactgactg atttttgatt aaaagcttga gcctcacagg 1200

tgtgctaatg cctctgtcca cagccaggtg tggtaaaatt ctttcatgca ataacaatca 1260

tttttttttt ttgctgaact ttttgaataa cagagcaaat actcacttga cgtgagaggc 1320

attttgttgt tgttgttggt tgttgttttg ttttgacgct ggatcacatt atgtagccct 1380

agctgaccca gaacttacta catagaccaa gttgccccag aacccagatc cacctgcctc 1440

tacctctgga gtgctgagat taaaagtgtg cacaaccatt cctggattgt tttttaattt 1500

ttttaaagtc ccatgtatcc caggctatcc ttaaacacct catctttctg tctaaatgct 1560

gagattacag gtgtgcacca ccacacagtt tatgatagtg gctctcaacc ttcctaatgc 1620

tacaaccctt taatacaggt ccttgtgttg tggtgacccc agccataaaa tcattttcat 1680

tgttacttcc caactgtaat tttgctactg ttatgaatca tagtgtaaac atctgtgttt 1740

tcccattatc ttagacaacc cctttgaaag ggtcgttcaa ccctgaaggg gattgctact 1800

tacagattga gaatacctgg tttatgaggt gggatgggac ccaaggcttt ggcacaccat 1860

tgagccacac caccagccca agaaaaggtt tcaatgagca aagcgtaaaa atattgtagt 1920

ggagattgaa aataaaacag tatgatccag gcattacagc acaaagagcc agcactaggc 1980

aactgaagca ggaggatttt cagtttaacg ctagtctggg ccacactgtg aaaccctatt 2040

tcaaaacaga aaaagaaagt aaacaggcaa acatgatgtt ctaaagttat aatgtcacta 2100

acatatggag agcaatcatg gatatgtatg tacatatatg agtatatata ggatgtatat 2160

gtgtacatat gatatatgtg tgtatatgat gtatatgtgt gtgtgtatat gatgtgtata 2220

taatatatat catgaatatg tgtatatatg ttcatatgat gtatatgtgt atatgatgca 2280

tatatgtgtg tatgatatgt atgtgtatat atgtacatat ggtatatatg tatatgcatg 2340

atatgtgtat atgatgtata tgtgtgtata tatacatatg tgtatatatt cacacacaca 2400

aaattgtaga acagagattt gcttcctgaa tttagaggta acacggagct ggggctttgt 2460

aggctatttc aggttcaaga agttttgctc ctctacccac aacgcggagt gtgagtgcat 2520

tgaaggattc cattgcttgg ggccacagtg caccagatgt gaaaaggact gcaggcctgg 2580

ccaggagcta acgaagcagg gtaggttgct ctctctccac ccagcaggca cgaatctgtc 2640

aacctgagca cagcaagcag cagacagaga cacagaagtg ttgccaacag gtgatttcat 2700

tccactctag tgcatattcc ataaatggga ataatcagaa accaggacat tttgttagtc 2760

atcagagcca cggatctgta catggtttag atgagcaccg tatgaatcca ttgaacatga 2820

gctctcccag gcttccaggg caagcatcat taagcaggtg cttcagagag actgctgcgc 2880

ttgcagaaga cccaagttca tttcccagca tccacatcag gcagctcaca gcagcctgcc 2940

atgccagccc caggagctat ggtgctatct tctgcattca ttctgtgggt gtctgcactc 3000

acgtgatcat gtgcacatac aggtacatgc acacatgcat gtgaattaaa aaaaaaatta 3060

aacaaatctt caagataacc actgagcagt ttgtgcaggt taacctaatg acccgagata 3120

gttgctcatc accaggaaag ctgagagatg gaaaatgcct tctactgatt ctcaaccttt 3180

cttcaaggtt gcaaaacctg tagcttggga acatttaatg accagaacgg tactggcgtc 3240

tgtcgaccct ggacgaagta cgtatgcact ctcatttttc ttatagcaca aagaccctgg 3300

ggcaaactga aagagaagga cactgtcact ggaatgacga tctgcaatga caacccctag 3360

gtgacaggga aactctgtgc ttacagaagt ttgtgtgaat acaggcattt cctcagaacc 3420

tattctctgt gtgctgtgct ggccactgga gggacacagg cagtggaaag ggtccaggtg 3480

tgctcatggg cttgcaaggt tggcgctggg ctctgggggt ggccactggt ccaggtgagg 3540

tttgatgcta cctaggacaa cagggatctg ggctggaacg catggctcag aggttgtgaa 3600

ggcaagctgg cagtcatacg gacccctaat gacccttttt tgctacttca gttatatgtt 3660

tataatgttt aacaagtgta ctggtgggta acagactaat gtgttttttt taagctcttt 3720

caacttaaat tgattagaat gtccaagtta gtgtttgtaa aatgggctgt gaacaggaat 3780

ctaaagaaaa agaaaaatcc tatatggatt tatatggtgg tgatagtgat gatgatggta 3840

gtgatgcaag aacagctgct attcatgagt ctgtgtccct ggggactttt ttgtttgctt 3900

ttatcccact cctgggagca caggctgccc ttcttttaag ctgctgagca aaccaaggca 3960

tagttaggca ggctttataa atctcccgac agtcactctg aagtacagac ccaaggctta 4020

cacctgcatt gtctaatgat gctgctggaa acccttgtcc ctattagtgt cccacatgtg 4080

cccaggtcac tcaaaggagc aaaacctcaa ggggaagggt tgagagactc atgagtcaaa 4140

acatgttgag tcacgatggc tgaacttggc tgtaatggag taagatggaa tatatgtggc 4200

tcctgaggct ggggagagag gagccctgat gggaggtgga gtgagtgacg cttagtgtac 4260

caggaggtga gggagacagg tgcaggccag agagcctctt ggtacctctt ggcactttct 4320

cacatcatct gctccctgct tgagatccca ggcctgccca ctgagtcact tggatacaaa 4380

gtttctcacg gtgctgctct gtaaattaac catctgattt ctttcccttg acttgtctaa 4440

gctgctctct agacggaagg tctgtgctta agaccgggac cacggagaag gacgtggtgt 4500

gtggaccccc tgtggtgagc ttctctccca gtaccaccat ttctgtgact ccagagggag 4560

gaccaggtga ctgtctaatt gcttttattt aaataaaagt taatgagcag ctatggtagc 4620

ttacaaccgg aatcgctcca ctaggaggct gaggcagaaa gttggcaagt tccaggatag 4680

cctaggctac ataaaaaggg gctacccttt tcttaacccc ttcaagaacc tcacccaaac 4740

aaccgcatga tgtccattca gactccatgg gcactg 4776

<210> 2

<211> 5209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60

acaagatcat tgcaggatcc ttgtagtaac tgcccagctg gtgagtaccc agttatcatg 120

tgcatttgat ctgctctgtt ggaagtatgg ttcagttagt ctagtagtca gggctaacga 180

gctccctttt aaggaaagga aaatgaaaat tcattcattt acaaatgttt attggatgct 240

acaacctagc tgtgtgaaca cagcaaagtc attcaacctc ttgtgccttg actttctcat 300

ctggggataa taagagaacc tgttttatag gatggctggg aggatcaaat gaagggctta 360

gaacagtgca tggcacaagg caagacttca ataaatgtta gttttgtgtg tagggctttg 420

tgctccgact gggggcatag cagcgagtaa gcgcgtagta aagggcttaa cagagtgggg 480

acggtcagtc gcatttaaat tttagtgtag gacattgatg tcctcctgga tccagtcata 540

ttcatctcct acatcaatca agataatcat tttgttttat tcaatagata aagtattttc 600

tttctgttga tttatttgtt acaatatctg gtttttttgt tttttttgtg tgtgtatgtt 660

tttttttttt tttttgagac acagtctcac tctgtcgccc aggctggagt gcagtggcac 720

gatctcagct cactgcaacc ttggcctccc aggttcaagc aattctcctg cctcagcctc 780

ccgagtagct gggattacag gtgtgcacca ctgcgcctgg ctaatttttg tatttttagt 840

agagacagga tttcaccatg ttggccaagc tggtcttgaa ctgctgacct caggtgatct 900

gcccgcttcg gcctcccaaa gtgctgtgat tacaggcgtg agccactgca cctggcctgt 960

attttgttat ttctaattct gtgattacac aaagaataat cttgcaaatg tattgtttta 1020

ggaagtcaat caaactaatg tccaccactg tggcatctag aaaactcatc attcttttat 1080

aatcttattt tattgtaaac ttcggaatgc cttgggtgac gattgcccat tgtcaaacgt 1140

gtaccactat tgtctgcctt tcttaggtac attctgtgat aataacagga atcagatttg 1200

cagtccctgt cctccaaata gtttctccag cgcaggtgga caaaggacct gtgacatatg 1260

caggcagtgt aaaggtatga gttcaaagat attttcttct tctagaagat agttgggaag 1320

ataagctttt ctttcccatt tactaactgc tctcttttga aaatctcaag tgtcaaagac 1380

tgattcttct gccaaccagc aggtctagga caataatatc cagtgacagc aattatttgt 1440

ggactgagct ttctaaatat tagaggaaac attcatttga caagagagaa gtttttactt 1500

acctaaatgt aaaaatgtct ttatggagat ttaaaagtaa actttaaaat tactgggaac 1560

actataagta gagtgagcat gatttttact gcagagcata aattcgcttc ctggatttgg 1620

aggtcaagtg taataaaatg ttgggggctg gggggacttt gtaggtgttt tcaggaccag 1680

gaaggagtgt tcctccacca gcaatgcaga gtgtgactgc actccagggt ttcactgcct 1740

gggggcagga tgcagcatgt gtgaacagga ttgtaaacaa ggtcaagaac tgacaaaaaa 1800

aggtacgttt gcgtttcttt gatctagtgt agttttgtga catagacaaa cttagctttg 1860

atcttgatcc tttgaaaata aacaaacaga tttgtagaac cttaaagtaa caagggagta 1920

tatgatatat catattttaa ttaataaaat atttcaatta ataaaatatt tccgttattt 1980

cttcataaat ggaaataatt tgaaatcaga acatttgtta attgccagaa ccattaatct 2040

tcacatgttc cagacatata caatacttta tgtacaatta aaataaaaac tagccatctt 2100

agggtgttgt ttcaagaatt attgaacaat ttgtgcagat tgcattatgg taatgactta 2160

tattaagttc atcacaggaa aagttacaaa atgatgaaaa tgcttccctt ttattattgc 2220

tttcattttt aatacaaggt tgtaaagact gttgctttgg gacatttaac gatcagaaac 2280

gtggcatctg tcgaccctgg acaaagtacg tataatttcc tttagtttat ggaataaaga 2340

atctgggtta aattttttgg aagataagga atgctatcat tgaagctttt ttgcacccat 2400

caagtgtaga cagaatgtaa catactaata ggcagcgtgg gaacactgtg aggtcgtagc 2460

aactcaatag gcaaagtggg cattttctcc agaaatagtg cctggaacat ctagatcaga 2520

attgccagtg gaggctgggc acgtgcagtg gttcacgcct gtaatcccag cactttggga 2580

ggctgagaca ggaggactcc ttgagcccag gagttcaaaa ccagcctggg tgagaccctg 2640

tctctacaaa aaatcaaaaa attagccagg cataatggca catgcctgtg gtcccagcta 2700

tagggaaggc tgatgaggca ggaggatcac ctgagtctgg gaggttgagg ctgcaatgag 2760

ctatgatcgc accatcgcac tccagagcag agagcctgtc tcaaaagaaa ggaaaagaat 2820

tgccagtgga actttgccgc tgtctgcctc ttttctgttt ccttctcatt cctttgctgc 2880

ctcttatctt ctctcattga tcagcctgtc tccatgtgtt caatgccagc ccctagaatg 2940

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tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 540

caccgagtcg gtgctttttt taaagggccc gtcgactgca gaggcctgca tgcaagcttg 600

gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 660

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 720

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 780

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg cggccgccgc 840

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 900

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 960

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 1020

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 1080

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1140

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1200

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 1260

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 1320

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 1380

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 1440

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 1500

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 1560

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 1620

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 1680

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 1740

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttagaaa aactcatcga gcatcaaatg 1800

aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg 1860

taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc 1920

tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag 1980

gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagttt 2040

atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact 2100

cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc 2160

gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag 2220

cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt 2280

cccagggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat 2340

ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc 2400

attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata 2460

caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata 2520

taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctagag caagacgttt cccgttgaat 2580

atggctcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 2640

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 2700

tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 2760

aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 2789

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagaatgaca cttgtgagat atccc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caagcttttg caagggaatg agtag 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaggtggagt gagtgacgct tag 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacccaagcc ctaaacctaa g 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggatgcca acatggatac tctg 24

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcacaagag gttgaatgac tttgc 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccacgtgcat tcttcctgaa tcc 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagactgtcc tctgactcca gacgt 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaacctcacc gagctgccaa ggaa 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggtaaggac ctgcaaggag tgcc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgccaaggaa gcagaacgct cctc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaagccgatg tcagcgccag gaac 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaccacgtcc ctctccttcg tccc 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtagccactc tgttgctggt cctc 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttgctgtttg gaggtaatag c 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtattgctgt gattccacag ac 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gccattcagt aaccatccat g 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

catcagagca tccaaacata ac 22

<210> 27

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

actttgtgct tccatagtat cccagttttt tcttaaagga ctttaaaatg ttaaattgtc 60

tttgtatgtt tggacacttg agtgcagaca gccggaggca taggatcccc tggagctgga 120

gttatagaca gttgtgagcc tcccagtatg gggttgggaa tcaaacctgg gtcctttaca 180

ggagcaacgt gtgctttcaa gcattgagcc atctctccag ccccaatatc ccagtcttaa 240

ctgctcttta aaacactgtg gaactggggg ctggagagat ggctcagtgg ttaagagcac 300

tgactgttct tccataggtc ctgagttcaa ttcccaacaa ctacatggtg gctcacaacc 360

atctgtaatg agatctgatg ccctcttctg atgtgtctga agacagctac agtgtactca 420

tataaataaa acatatctta aaaaatactg tggaactgct taaatatggt tgatagtgta 480

gacagttcgg gaaaggaacc ccaccccact tatagtttac agaatgacac ttgtgagata 540

tccccctctt ttagagacag ggtttcatgt agctcaggtt ggcctggaac tttctctgca 600

gtcggggatg gccttgaact cttgctcctc ccgctcccat ctcatgtgtg ctggggttac 660

agcatccact accactccgg gtatctgcac actggttcct gtttagcaag catgctatca 720

gtcaagcaac agcagcagcc agaggacaac tcatctgact gagacacttt cggaatctcc 780

tttgctagtg tcctgtgcat gtgacatttc gcc 813

<210> 28

<211> 820

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctgggtctcc cagctcttcc cacggcaggc agttctgatg taccatgctc tttgtactgt 60

cttgtttcct ggatgttgtt actaagtcag taatcagtaa tagtgaccct tgtcccacac 120

aggtaatgta cctttacaaa ggccaagtcc atggaactga caggtctcac acttcctctg 180

tgtttagtag gacaggctac ctagtttccg caggcttcta gtaaagccgt tacatataag 240

tacattgtct acattgtcac tctcttcaga cacaccagaa gaggccatca gatcccatca 300

cagatggttg tgagccatct gtggttgcta ggaattgaac tcaggacctc tggaagagca 360

gctagtgctc ttagccactg agccatctct ccagcccact tttgggttca attttaaaag 420

ctgcttaggt ttagggcttg ggttgtgact cagttggtag agtacttacc tcacatgccg 480

gaaaggcccc ggattccctc cccagaactg tatgaatctg ggcatggtgg cgtataccta 540

tgatctccac tctggtggca gaggcaggag tttgaggtta tcctcaggta tacgtggagt 600

ttgaggctag cctgggatac atgagaccct gtctcaaaaa caaaacagaa caaacaaaag 660

acagtaaagt cataaggtta ttgagttacg ggtgggggtg cctgggcact gcctctccag 720

agcccatgca tttccagggt gagctccaat caagcttgcg ctcaccaacc actgtggcat 780

ctgtctcctt gctccctcag gagggcactc cttgcaggtc 820

<210> 29

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe

180 185 190

Leu Ala Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu

195 200 205

Leu Phe Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr

245 250 255

Claims (5)

1.一种CD137基因修饰人源化动物细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）选择小鼠CD137基因的完整胞外区两端作为打靶位点，设计包含人源CD137基因胞外区的同源DNA供体和鉴定方案，所述小鼠CD137基因的胞外区序列如SEQ ID No:1所示，人源CD137基因的胞外区序列如SEQ ID No:2所示，所述同源DNA供体的序列如SEQ ID No:3所示；

（2）基于CRISPR/Cas9技术，制备Cas9或其表达载体，在小鼠CD137基因的完整胞外区的5’端和3’端各设计一条sgRNA或其表达载体；

或者，制备Cas9、sgRNA的共表达载体；

所述sgRNA的序列如SEQ ID No:4和7所示；

（3）将步骤（2）制备得到的Cas9、sgRNA，或者各自的表达载体或共表达载体注射入受精卵，敲除小鼠CD137基因的胞外区的同时将人源CD137基因的胞外区插入到基因组。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述小鼠为BALB/c或C57BL/6小鼠。

3.一种CD137基因修饰人源化动物模型的构建方法，其特征在于采用权利要求1或2任一项所述的方法制备得到的CD137基因修饰人源化小鼠受精卵移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代小鼠，经基因型鉴定正确的F0代小鼠性成熟后与同背景野生型小鼠配繁获得F1代，即为CD137基因修饰人源化动物模型。

4.一种双靶点基因修饰CD137人源化动物模型的构建方法，其特征在于将非CD137的免疫检查点基因修饰人源化小鼠与权利要求3所述方法构建的CD137人源化小鼠交配，获得其他基因杂合CD137杂合人源化小鼠，双靶点杂合人源化小鼠与单靶点纯合人源化小鼠以体外受精的快速扩繁方式获得单靶点纯合另外一个靶点杂合的人源化小鼠，以此小鼠为基础，将其兄妹互配获得双靶点纯合人源化小鼠。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述非CD137的免疫检查点基因选自PD-1、PD-L1、OX40、CTLA4、TIGIT、GITR、BTLA、LAG3、TIM3、CD28、CD40、ICOS、CD47、SIRPa、VISTA。

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