CN111991550B - Hip-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HIP‑55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用。本发明提供了HIP‑55蛋白或能够促进HIP‑55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：制备用于在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏的产品；在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏。本发明发现缺血‑再灌注后，小鼠心肌缺血区域心肌HIP‑55蛋白表达量增加；过表达HIP‑55可使小鼠心梗面积下降。在细胞水平也发现过表达HIP‑55可以抑制心肌细胞凋亡比例。综合研究结果，可知HIP‑55在心肌缺血再灌注损伤中通过抑制细胞凋亡和抗氧化应激发挥心肌保护作用。本发明结果表明HIP‑55是一种新的心脏保护蛋白，同时为临床诊断、治疗及新药开发提了供新的靶点。

Description

HIP-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及HIP-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用。

背景技术

HIP-55(hematopoietic progenitor kinase 1[HPK1]-interacting protein of55kDa；也称作SH3P7或mAbp1)是一个包含多功能域的蛋白质。结构主要包含N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。HIP-55参与突触发生、受体内吞、骨架重排及信号转导。

目前对HIP-55功能了解较少，已知HIP-55通过调节T细胞受体内吞、细胞因子释放和B细胞受体呈递等在免疫系统起着重要作用。近来的研究表明HIP-55能够促进肺癌细胞存活(促进细胞生长并抑制细胞凋亡)。

但还没有研究表明HIP-55在心血管系统中的保护作用。

发明内容

本发明的目的是提供HIP-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用。

第一方面，本发明要保护HIP-55蛋白或能够促进HIP-55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备用于在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏的产品；

(A2)在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏。

在所述应用中，所述在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏是通过抑制细胞凋亡和/或抗氧化应激来实现的。

第二方面，本发明要保护HIP-55蛋白或能够促进HIP-55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：

(B1)制备用于抑制心肌缺血再灌注诱发心肌细胞凋亡的产品；或抑制心肌缺血再灌注诱发心肌细胞凋亡；

(B2)制备用于抑制心肌缺血再灌注后产生活性氧自由基(ROS)的产品；或抑制心肌缺血再灌注后产生活性氧自由基(ROS)；

(B3)制备用于减少心肌缺血再灌注术后心梗面积的产品；或减少心肌缺血再灌注术后心梗面积；

(B4)制备用于抑制心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡的产品；或抑制心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡；

(B5)制备用于抑制心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基(ROS)的产品；或抑制心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基(ROS)。

在步骤(B2)中，所述抑制心肌缺血再灌注后产生活性氧自由基(ROS)是通过抑制NADPH氧化酶活性，下调NOX-2蛋白和NOX-4蛋白的表达量来实现的。

在本发明的具体实施方式中，步骤(B4)和(B5)中，所述缺氧复氧为缺氧24h后复氧6h。其中，所述缺氧为0.1％O₂环境(5％CO₂，其余气体为N₂；％表示体积百分含量)，所述复氧为95％O₂环境(其余气体为5％CO₂；％表示体积百分含量)。

在上述各应用中，所述能够促进HIP-55蛋白表达的物质可为任何能够促进HIP-55蛋白表达的物质。如能翻译成所述HIP-55蛋白的DNA，或者含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞等。

在第一方面和第二方面所述应用中，所述产品具体可为药物。

第三方面，本发明还要求保护能够抑制HIP-55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：

(C1)制备用于促进心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡的产品；或促进心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡；

(C2)制备用于促进心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基的产品；或促进心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基。

在本发明的具体实施方式中，所述能够抑制HIP-55蛋白表达的物质为靶向HIP-55蛋白的编码基因的shRNA或能够转录成所述shRNA的DNA。

进一步地，所述靶向HIP-55蛋白的编码基因的shRNA为SEQ ID No.5所示的RNA分子。

在第三方面所述应用中，所述产品可为动物模型或者用于制备所述动物模型的试剂或试剂盒。

第四方面，本发明还要求保护如下各应用：

(D1)HIP-55蛋白在预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物开发中的应用。

(D2)HIP-55蛋白在作为心脏保护蛋白中的应用。

(D3)HIP-55蛋白在作为心肌缺血再灌注损伤的临床诊断指标中的应用。

在本发明的具体实施方式中，所述HIP-55蛋白的氨基酸序列具体为SEQ ID No.1。相应的，所述能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA(即DBNL基因)的核苷酸序列具体为SEQ IDNo.2。

实验证明，本发明发现缺血-再灌注后，小鼠心肌缺血区域心肌HIP-55蛋白表达量增加；心脏特异性过表达HIP-55可使小鼠缺血-再灌注后心梗面积下降，并且抑制缺血-再灌注导致的心肌细胞凋亡及活性氧自由基(ROS)的过量产生。在细胞水平也发现过表达HIP-55可以抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡。综合研究结果，可知HIP-55在心肌缺血再灌注损伤中通过抑制细胞凋亡和抗氧化应激发挥心肌保护作用。本发明结果表明HIP-55是一种新的心脏缺血再灌注损伤保护蛋白，同时为缺血再灌注的临床诊断、治疗及新药开发提了供新的靶点。

附图说明

图1为重组载体pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP的质粒图谱。

图2为在小鼠心脏缺血再灌注损伤模型心脏组织中HIP-55蛋白表达显著上调。

图3为心脏特异性HIP-55过表达导致小鼠心脏缺血再灌注导致的心梗面积减轻。其中A所示是基因型鉴定心脏特异性HIP-55过表达鼠的证据。B所示是心脏特异性HIP-55过表达鼠的蛋白水平证据。C所示为小鼠心脏缺血-再灌注损伤手术。D所示为小鼠心肌缺血-再灌注时期心电图变化。D上层为小鼠术前正常心电图，D中层为缺血时小鼠心电图，箭头所示为抬高的ST-T，D下层为再灌注时小鼠心电图，箭头所示为病理性Q波。E为TTC染色显示心脏特异性HIP-55过表达会导致小鼠心肌梗死面积减少。

图4为心脏特异性HIP-55过表达导致小鼠心脏缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡减少。

图5为心脏特异性HIP-55过表达抑制小鼠心脏缺血再灌注诱导的ROS水平。

图6为心脏特异性HIP-55过表达抑制小鼠心脏缺血再灌注诱导的NADPH酶活性增加。

图7为心脏特异性HIP-55过表达抑制小鼠心脏缺血再灌注诱导NOX-2和NOX-4蛋白水平增加。

图8为在小鼠心肌细胞在缺氧复氧模型中HIP-55蛋白表达显著上调。

图9为HIP-55抑制心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡。A为DsRed-HIP-55腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞后，HIP-55表达显著比对照组增加。B为以DsRed-HIP-55腺病毒或DsRed腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞24h后，进行24h缺氧培养和6h复氧培养，对照组(DsRed)和过表达HIP-55组(DsRed-HIP-55)的细胞凋亡率。C为HIP-55-shRNA腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞后，HIP-55表达显著比对照组减少；D为以HIP-55-shRNA腺病毒或Scramble-RNA腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞24h后，进行24h缺氧培养和6h复氧培养，对照组(Scramble)和敲减HIP-55基因组(HIP-55-shRNA，KD)的心肌细胞凋亡百分比。

图10为HIP-55抑制心肌细胞缺氧复氧后的ROS水平。A为在新生大鼠心肌细胞中过表达HIP-55，能够显著抑制心肌细胞缺氧复氧后ROS水平。B为在新生大鼠心肌细胞中敲减HIP-55，能够显著促进心肌细胞缺氧复氧后ROS水平。

各图中，*表示p值小于0.05；**表示p值小于0.01；***表示p值小于0.001。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的蛋白印迹检测HIP-55蛋白所用的一抗为SantaCruzBiotechnology公司产品，货号为sc-366772，抗体稀释比为1:1000；所用兔二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，是中杉金桥公司产品，货号为ZB-2301，抗体稀释比为1:5000。

下述实施例中所用的蛋白印迹检测Hsp90蛋白所用的一抗为Santa CruzBiotechnology公司产品，货号为sc-69703，抗体稀释比为1:1000；所用鼠二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，是中杉金桥公司产品，货号为ZB-2305，抗体稀释比为1:5000。

下述实施例中所用的蛋白印迹检测GAPDH蛋白所用的一抗为SantaCruzBiotechnology公司产品，货号为sc-47724，抗体稀释比为1:1000；所用鼠二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，是中杉金桥公司产品，货号为ZB-2305，抗体稀释比为1:5000。

下述实施例中所用的蛋白印迹检测NOX-2蛋白所用的一抗为SantaCruzBiotechnology公司产品，货号为sc-130543，抗体稀释比为1:1000；所用鼠二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，是中杉金桥公司产品，货号为ZB-2305，抗体稀释比为1:5000。

下述实施例中所用的蛋白印迹检测NOX-4蛋白所用的一抗为SantaCruzBiotechnology公司产品，货号为sc-518092，抗体稀释比为1:1000；所用鼠二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，是中杉金桥公司产品，货号为ZB-2305，抗体稀释比为1:5000。

实施例1、整体动物水平实验

一、实验方法

1、构建心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠及小鼠基因型鉴定

转基因小鼠制作流程：

(1)重组表达载体的设计、构建

将目前国际通用的心脏特异性过表达基因的启动子——αMHC启动子和人源DBNL基因(DBNL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。DBNL基因编码HIP-55蛋白，HIP-55蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)利用Gateway Technolgy构建到目的载体pRP.Des3d中，得到重组载体命名为pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP(质粒图谱如图1所示)，全序列如SEQ ID No.3所示。

(2)转基因小鼠的制备及鉴定

将以上得到的重组载体pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP用NotI酶切，得到线性化DNA，注射到200个FVB/NCrlVr(简写为FVB/N)品系小鼠受精卵，显微注射后的受精卵回送到4-5只代孕母鼠输卵管中。

建立转基因Founder(原代)小鼠，以Founder小鼠与野生型的小鼠配种。根据插入的基因片段，设计不同的引物，以确保对获得的转基因小鼠鉴定的准确性。后代中PCR鉴定阳性小鼠即为心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠。

鉴定心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠的引物序列为：

Forward：5′-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3′；

Reverse：5′-GCCTTCATAGGTAAAGAGAGCCCAGTCG-3′。

2、小鼠心肌缺血再灌注损伤模型制备

以FVB/N小鼠和步骤1构建的心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠分别构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。

小鼠术前禁食水8h。称重后，使用1％戊巴比妥那溶液(0.60ml/100g)腹腔注射进行麻醉。小鼠麻醉后，给予经口腔气管插管，连接小动物呼吸机维持呼吸(气道压力峰值14.40cmH2O，呼吸频率88次/分，通气量1L/min)。将小鼠四肢仰卧固定于循环加热手术台上，连接小动物心电图检测仪肢导电极，记录术中心电变化。手术区域备皮消毒，于胸骨左旁第三、四肋间剪开皮肤，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，打开胸腔，用开胸器撑开肋间、充分暴露心脏，小心剪开心包，在体视显微镜下仔细辨认左冠状动脉前降支(Left anteriordescending coronary artery,LAD)，可见在心耳下缘或左侧出现一条时隐时现粉红色血管即为冠状动脉的前降支。采用带线6-0线缝合针于心耳下缘1mm处穿过心肌表层，结扎前在线下垫两条长约5cm的缝线线圈，以便后续在体外进行再灌注操作。随后以活结结扎LAD，观察看到左室前壁心肌颜色变白，局部收缩运动受限，左心耳充盈胀满。正常情况下，小鼠心电图II导联ST段位于基线水平，QRS波较窄。结扎LAD造成心肌缺血后，ST-T迅速抬高，并且随着时间的延长抬高更加明显，呈持续弓背抬高，J点抬高，甚至与R波融合，并可见ORS波增宽。心电图出现以上改变即表明诱发心肌缺血成功。确认心肌缺血后逐层关闭胸腔、缝合皮肤和肌肉，注意将两条线圈置于切口两侧并留在体外。缺血60min后，双手同时缓慢用力，向小鼠身体两侧水平拉动线圈，直至将其完全拉出体外，多数情况下可见一侧线圈上粘附心脏结扎线，此时心脏上的结扎线被线圈拉开，ST-T部分回落，但不能完全回复基线水平，QRS波群电压变低，并且出现病理性Q波，说明再灌注成功。对照组(Sham组)小鼠处理方式与缺血再灌注小鼠处理方式完全相同，除了不以6-0线结扎LAD外。

3、Evans Blue-TTC双染色法评价心梗面积

评价心肌梗死面积采用Evans blue-TTC双染色法，可以将未被结扎的非缺血区染成蓝色，将心脏缺血危险区(area at risk,AAR)中的存活心肌染成红色、梗死心肌染成白色。其染色原理为：伊文思蓝(Evans Blue,Sigma,E2129)染料经心尖注射后，AAR因冠脉被结扎，其心肌无Evans Blue灌注，所以不着色，而正常区域着蓝色。氯化三苯基四氮唑(TTC,triphenyltetrazolium chloride,Sigma,T8877)是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原物质，其溶于水中成为无色溶液，被还原后生成红色、不溶于水的三苯基，是检测脱氢酶的常用方法。TTC是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，其与正常组织中的脱氢酶反应呈红色，而坏死组织内脱氢酶活性下降，故坏死组织不会变红而呈苍白色。

具体操作步骤如下：再灌注结束后，麻醉动物，使用小动物呼吸机维持呼吸，开胸后原位结扎左冠状动脉前降支，从心尖注射1％的Evans Blue 0.2mL，非缺血心肌被染成蓝色，从而显示出AAR心肌。立即摘取心脏，以预冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffersolution,PBS)冲洗残血并使用滤纸吸干。-60℃冰冻20min后，取出心脏，将结扎线以下心肌沿垂直左心室(left ventricular,LV)长轴方向横切为5-6片(厚约1mm)，置于事先37℃温浴的1％TTC磷酸盐缓冲液中，并在37℃温箱中孵育10min，此时坏死区(infarct area,IA)呈白色，缺血非坏死心肌被染成红色。将染好的心肌切片按顺序摆放在洁净的玻璃片上，使用EPSON Scan Perf V700(24位真彩，2400dpi分辨率)进行扫描。随后，将心肌切片逐一称重，计算每片心肌切重量占全部的百分比。采用Image-Pro Plus 6.0进行面积统计分析，分别算每片心肌左心室(全部心肌，LV)、缺血危险区面积(红色+白色，AAR)和梗死区面积(白色，IA)，并用该切片中各区域的面积乘以该片心肌重量的百分比(％)，最后将各切片中相应的面积叠加。用AAR/LV评价结扎的位置是否一致，即经历缺血危险区相同，用IA/AAR评价心肌梗死的面积。

4、TUNEL染色检测心脏组织凋亡

心脏石蜡切片脱蜡，然后利用TUNEL试剂盒(Roche,11684795910)检测心肌细胞凋亡，具体操作步骤按照试剂盒说明书操作。随后使用DAPI(sigma，D9542)染核，孵育60分钟。倒置荧光显微镜下观察荧光并采集图像，绿色荧光为发生凋亡的心肌细胞，蓝色荧光为细胞核。

5、检测组织切片活性氧(ROS)

二氢溴化乙啶(dihydroethidium，DHE；Invitrogen，D23107)是一种可透过细胞膜的荧光探针，被细胞内的超氧自由基阴离子氧化后，二氢溴化乙啶转化为溴化乙啶，溴化乙啶可进入细胞核与DNA紧密结合，产生红色荧光，其荧光强度与ROS的量成正比。具体操作步骤为：石蜡切片脱蜡以后，给予DHE荧光探针(10μm)37℃孵育30min，PBS清洗3次后，倒置荧光显微镜下观察荧光并采集图像，每张切片采集6个视野。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行荧光强度定量分析。

6、心肌NADPH氧化酶活性测定

制备心肌组织匀浆，采用经典的光度法定量检测NAPDH氧化酶的活性(GENMED,GMS50096.2)。具体操作按照产品说明书进行。

7、组织总蛋白提取

取适量心脏组织，加入200μl裂解液[含1％脱氧胆酸(Deoxycholic acid)，10mmol/L焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)，10％甘油(Glycerol)，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，50mmol/L氟化钠(NaF)，1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，100mmol/L氯化钠(NaCl)，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH 7.4)，1mmol/L正钒酸钠(Na₃VO₄)，5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，100μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)和1μg/ml抑肽酶(Aprotinin)]，冰上裂解细胞15min后，用细胞刮刮下样品并转移入EP管中，超声处理后离心(4℃12,000rpm)15min，吸取上清，冻存于-80℃冰箱。

8、蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)

(1)蛋白样品处理：采用BCA法定量待测蛋白，加入5X Loading buffer，混匀后置于100℃煮沸5min，待用或冻存于-80℃。

5X Loading buffer配方如下：1mol/L Tris·HCl三羟甲基氨基甲烷(pH6.8)8ml；SDS十二烷基硫酸钠2g；甘油(Glycerol)10ml；2％溴酚兰β-巯基300μl；乙醇300μl；1mol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸0.5ml。将此配方加去离子水定容至终体积为20ml，然后过滤分装，-20℃保存。

其中，2％溴酚兰由0.01g溴酚兰加500μl乙醇溶解；1mol/L EGTA乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸由0.234g EGTA乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸加0.5ml水溶解。

(2)配制SDS聚丙烯酰胺凝胶

如表1所示。

表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶组成

(3)将冻存的蛋白样品置于冰上融化，取50μg蛋白样品，按顺序加入凝胶孔中。

(4)电泳：采用电压80V电压电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝条带到达分离胶底部，共约2h～3h。电泳缓冲液配方如表2所示。

表2电泳缓冲液配方

加水定容至500mL，配制成5×电泳缓冲液(5×running buffer)。使用前稀释至1×running buffer。

(5)转膜：剪裁6张与凝胶大小一样的滤纸和1张NC膜，按顺序将NC膜和凝胶紧贴固定，按BIO-RAD产品说明安装电泳转移装置，200mA恒流冰浴电转移2h。转膜缓冲液配方如表3所示。

表3转膜缓冲液配方

加水定容至1000mL。

(6)封闭：转膜结束后，将NC膜置于5ml 5％BSA(以TBST配制)或5％牛

奶(以TBST配制)溶液中，室温孵育1h。TBST配方如表4所示。

表4 TBST配方

加去离子水定容至500mL，配制成10×TBS液。用去离子水将10×TBS液稀释成1×TBS，并加入Triton X-100。

(7)一抗孵育：用5％牛奶溶液(以TBST配制)配制一抗溶液，将封闭好的NC膜置于一抗溶液中，平放在平缓摇动的摇床(240rpm)平台上，4℃过夜。

(8)漂洗一抗：一抗孵育完毕后，加入10ml TBST，于室温摇床上(320rpm)漂洗10min，重复3次。

(9)二抗孵育：用5％牛奶溶液(以TBST配制)配制辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，将清洗过的NC膜置于含二抗的封闭缓冲液中，于室温摇床上(240rpm)孵育1h。

(10)漂洗二抗：二抗孵育完毕后，再次用10ml TBST漂洗10min，重复3次。

(11)显影：采用Pierce公司western blot超敏发光液。避光配制发光液，将A液与B液按1:1比例混合后加入NC膜，室温下避光孵育5min。

(12)沥干发光液，用保鲜膜覆盖NC膜，采用X胶片曝光、显影及定影，曝光及显影时间视信号强弱而定。

(13)待胶片风干后，采用凝胶成像系统进行灰度扫描并分析胶片结果。

二、结果

1、心肌缺血-再灌注后HIP-55表达上调

如图2所示。与对照组(sham)相比，心脏缺血-再灌注组小鼠心脏组织中HIP-55蛋白表达上调。该结果提示HIP-55在心脏缺血-再灌注损伤中可能发挥重要作用。

2、HIP-55减少小鼠心肌缺血再灌注术后的心梗面积

如图3所示。A所示是基因型鉴定心脏特异性HIP-55过表达鼠的证据，使用相应的引物能够扩增出相应分子量的目的条带，说明心脏特异性HIP-55过表达鼠构建成功。B所示是心脏特异性HIP-55过表达鼠的蛋白水平证据，心脏特异性HIP-55过表达鼠心脏组织中的HIP-55表达量比野生型小鼠心脏组织高，进一步证实心脏特异性HIP-55过表达鼠构建成功。C所示为小鼠心脏缺血-再灌注损伤手术。D所示为小鼠心肌缺血-再灌注时期心电图变化。D上层为小鼠术前正常心电图，小鼠心电图II导联ST段位于基线水平，QRS波较窄；D中层为缺血时小鼠心电图，结扎LAD造成心肌缺血后，ST-T迅速抬高(箭头所示)，并且随着时间的延长抬高更加明显，呈持续弓背抬高，J点抬高，甚至与R波融合，并可见ORS波增宽。心电图出现以上改变即表明诱发心肌缺血成功；D下层为再灌注时小鼠心电图，确认心肌缺血后逐层关闭胸腔、缝合皮肤和肌肉，注意将两条线圈置于切口两侧并留在体外。缺血60min后，双手同时缓慢用力，向小鼠身体两侧水平拉动线圈，直至将其完全拉出体外，多数情况下可见一侧线圈上粘附心脏结扎线，此时心脏上的结扎线被线圈拉开，ST-T部分回落，但不能完全回复基线水平，QRS波群电压变低，并且出现病理性Q波(箭头所示)，说明再灌注成功。E左侧所示为Evans blue-TTC染色结果，正常区域成蓝色，存活心肌染成红色，而梗死区域不着色(即白色)。E中部所示为AAR/LV统计结果，两组无差异，说明结扎的位置一致，即经历缺血危险区相同。E右侧所示为IA/AAR统计结果，心脏特异性HIP-55过表达鼠组心肌梗死的面积比野生型小鼠组少，说明HIP-55减少小鼠心肌缺血再灌注术后的心梗面积。

3、HIP-55抑制缺血-再灌注诱发的心肌细胞凋亡

本发明利用TUNEL染色检测心脏特异性HIP-55过表达对缺血-再灌注诱发的心肌细胞凋亡的影响，如图4结果显示，心脏缺血-再灌注损伤后WT小鼠的心肌细胞凋亡率为(22.03±3.263)％，而过表达HIP-55小鼠的心肌细胞凋亡率仅为(10.61±1.778)％(p<0.05；n均＝6)。结果证实心脏特异性HIP-55过表达可以抑制缺血-再灌注诱发的心肌细胞凋亡。

4、HIP-55抑制心肌缺血-再灌注后ROS的产生

如图5所示。在缺血再灌注心肌组织中，应用DHE染色检测心脏组织中ROS的含量发现，与WT小鼠相比，过表达HIP-55小鼠心脏组织中ROS含量减少，差异具有统计，结果证实心脏特异性HIP-55过表达可以抑制缺血-再灌注诱发的ROS含量。

5、HIP-55抑制NADPH氧化酶活性

如图6所示。在缺血再灌注心肌组织中，应用试剂盒检测NADPH氧化酶的活性，与WT小鼠相比，过表达HIP-55小鼠心脏组织中NADPH酶活性减少，差异具有统计，结果证实心脏特异性HIP-55过表达可以抑制NADPH氧化酶活性。

6、HIP-55抑制NOX-2和NOX-4表达

NADPH氧化酶(NOX)类是一个多亚基的酶复合体家族，是机体内催化ROS生成的主要酶体，而在心脏组织中，NOX-2和NOX-4是NOX的主要蛋白。采用Western blot方法检测了NOX-2、NOX-4蛋白的表达量。图7结果表明，在经历缺血–再灌注后，与WT组小鼠相比，过表达HIP-55小鼠心脏组织中NOX-2和NOX-4表达下调，差异具有统计学意义(*p<0.05)。以上结果提示HIP-55可以抑制NOX-2和NOX-4表达。

实施例2、细胞水平实验

一、实验方法

(一)过表达HIP-55重组腺病毒的制备

1、过表达HIP-55重组腺病毒载体的构建

利用重叠延伸PCR扩增attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。

重叠PCR扩增：以SEQ ID No.2所示的DBNL基因(HIP-55蛋白的编码基因)为模板，使用引物attB1-HIP-55和HIP-55-Flag-IRES-R进行PCR扩增；以IRES/DesRed为模板，使用引物Flag-IRES-F和DesRedE2-attB2进行PCR扩增；分别回收两个PCR产物；再以两个PCR产物为模板，用引物：attB1-HIP-55和DesRedE2-attB2进行融合PCR，得到2656bp的PCR产物，该PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID No.4，命名为attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。重叠PCR扩增引物见表5。

表5重叠PCR扩增引物

引物名称	5’-3’
		attB1-HIP-55	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGGTGAACCTGAGC
HIP-55-Flag-R	CTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTATGAGCTCCACATAGT
		Flag-IRES-F	ACGACGATGACAAGTAGGCCCCTCTCCCTCCCCC
DesRedE2-attB2	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTGGAACAGGTGGTGGC

重叠PCR扩增反应体系及扩增程序如下：

反应体系：5×Primer STAR^TM Buffer(Mg²⁺Plus)10μl；dNTP Mixture(10μM)4μl；上游引物-F(10μM)1μl；下游引物-R(10μM)1μl；模板DNA 1μl；Primer STAR^TM HS DNAPolymerase 0.5μl；补加ddH₂O至总体积50μl。

扩增程序：98℃3min；(98℃,10s；60℃,10s；72℃,3min)30个循环；72℃5min。

6×loading buffer终止反应；

将上述2665bp的PCR产物利用Gateway clone构建重组载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：

25℃，BP反应3h。

反应体系：attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2-attB2 100ng；pDONR 221载体(Invitrogen目录编号：12536-017)100ng；BP clonase 1μl；TE buffer补足至5μl。

加入蛋白酶K终止反应10min，得到BP反应产物，将BP反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2(SEQ ID No.4)插入pDONR 221中得到的中间载体，命名为pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

利用Gateway clone构建pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：

将中间载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2和母载体质粒pAd/CMV/V5-DEST进行LR反应，体系如下：pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2 16ng；pAd/CMV/V5-DEST(Invitrogen；V493-20该载体上不带有Flag-IRES/DesRedE2，需要同样步骤将Flag-IRES/DesRedE2构建到pAd/CMV/V5-DEST中作为对照)140ng；LR clonase 1μl；TE buffer补足至5μl。

25℃，LR反应3h，加入蛋白酶K终止反应10min，得到LR反应产物，将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2(SEQ ID No.4)插入pAd/CMV/V5-DEST中，得到腺病毒表达载体，命名为pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

2、对照病毒腺病毒表达载体pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2的构建

pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2为将Flag-IRES/DesRedE2(SEQ ID No.4自5’末端第1335-2627位核苷酸)构建到pAd/CMV/V5-DEST中得到的载体；

1)利用引物flag+DsRed-F和attB2+DsRed为引物(序列见表6)，SEQ ID No.3自5’末端第1335-2627位核苷酸所示的DNA分子为模板PCR扩增获得1293bp的flag-IRES/DsRedE2片段；

2)利用引物attB1-K-Flag和attB2+DsRed为引物(序列见表6)，flag-IRES/DsRedE2片段为模板PCR扩增获得1357bp的attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段。

3)BP反应

采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段通过BP反应插入pDONR 221载体中，构建pDown-flag/IRES/DsRed Express2；

4)LR反应

采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段通过LR反应插入pAd/CMV/V5-DEST载体中得到pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2。

表6引物序列

3、过表达HIP-55重组腺病毒的获得

将上述获得的过表达HIP-55重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2转入HEK293A细胞(美国ATCC，产品目录号CRL-1573^TM)，包装得到过表达HIP-55重组腺病毒(命名简称：DsRed-HIP-55)。

将上述获得的空腺病毒载体pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express 2转染HEK293A细胞，包装得到pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express 2腺病毒(命名简称：Dsred)。

(二)shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的制备

shRNA HIP-55：5’-ucuuuggcau guuuccugcc aacucgaguu ggcaggaaacaugccaaagu uuuuc-3’(SEQ ID No.5)；

Control shRNA：5’-ugcgcgcuuu guaggauucg cucgagcgaa uccuacaaagcgcgcuuuuu c-3’(SEQ ID No.6)。

1、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒载体的构建

shRNA的扩增引物为shHIP-55-F和shHIP-55-R(序列见表7)；对照shRNA的扩增引物为Control-F和Control-R(序列见表7)。

表7 shRNA相关引物序列

引物	5’-3’
		shHIP-55-F	TCTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGTTTTTC
shHIP-55-R	TCGAGAAAAACTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGA
		Control-F	TGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTC
Control-R	TCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCA

(1)Oligo DNA的退火

a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配制成50μM，溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×)，混匀备用。

b)设置反应体系：DEPC-water 40μl；Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)20μl；shHIP-55-F(50μM)20μl；shHIP-55-R(50μM)20μl；总体积100μl。

设置PCR仪进行退火反应：95℃2min；每8s下降0.1℃，降至25℃约90min；4℃长时间保存。

退火产物-20℃保存，得到退火的shHIP-55Oligo DNA。

(2)酶切载体shpDown-MCS

a)酶切体系：shpDown-MCS(3043bp，载体的全序列为SEQ ID No.7)2μg；10×Kbuffer 5μl；XhoⅠ 1μl；HpaⅠ 1μl；H₂O补足至50μl。

b)37℃酶切3h。

c)6×loading buffer终止反应，1％的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收约3043bp的载体片段。

(3)连接

a)连接体系：3043bp的载体片段30fmol；退火的shHIP-55Oligo DNA(1/10dilute)1μl；10×T₄ DNA ligase buffer 2.5μl；T₄ DNA ligase 1μl；H₂O补足至25μl。

b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

PCR鉴定引物：

shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’；

shpDown-flank-r：5’-AGCGAGCTTATCGATACCGT-3’。

得到234bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’，结果该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55Oligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDwon-HIP-55。

(4)利用Gateway Technology构建shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55

LR反应体系：pAd/PL-Dest(Invitrogen；V494-20)118.80ng；shpDwon-HIP-5517.00ng；LR clonase 1μl；TE buffer补足至5μl。

反应条件：25℃，16h。

加入0.5μl蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：5’-GGCCGCTAGCGACATCGATC-3’和pAd/PL-flank-r：5’-CCTTAAGCCACGCCCACAC-3’，结果为该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55Oligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-HIP-55。

2、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得

将上述获得的shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55转入HEK293A细胞，包装得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒。

3、对照shRNA干扰重组腺病毒载体的构建

(1)Oligo DNA的退火

a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM，溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×)，混匀备用。

b)设置反应体系：DEPC-water 40μl；Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)20μl；Control-F(50μM)20μl；Control-R(50μM)20μl；总体积100μl。

设置PCR仪进行退火反应：95℃2min；每8s下降0.1℃，降至25℃约90min；4℃长时间保存。

c)退火产物-20℃保存，得到和退火Control Oligo DNA。

(2)酶切载体shpDown-MCS

a)酶切体系：shpDown-MCS 2μg；10×K buffer 5μl；XhoⅠ 1μl；HpaⅠ 1μl；H₂O补足至50μl。

b)37℃酶切3h；

c)6×loading buffer终止反应，1％的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收3kb的载体片段。

(3)连接

a)连接体系：3kb的载体片段30fmol；退火Control Oligo DNA(1/10dilute)1μl；10×T₄ DNA ligase buffer 2.5μl；T₄ DNA ligase 1μl；H₂O补足至25μl。

b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

PCR鉴定引物：

shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’；

shpDown-flank-r：5’-AGCGAGCTTATCGATACCGT-3’。

得到230bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’，结果该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDown-Scramble。

(4)利用Gateway Technology构建Scramble干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-Scramble。

LR反应体系：pAd/PL-Dest(Invitrogen；V494-20)118.80ng；shpDown-Scramble17.00ng；LR clonase 1μl；TE buffer补足至5μl。

反应条件：25℃，16h。

加入0.5μl蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：5’-GGCCGCTAGCGACATCGATC-3’和pAd/PL-flank-r：5’-CCTTAAGCCACGC CCACAC-3’，结果为该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-Scramble。

4、对照shRNA干扰重组腺病毒的获得

将上述步骤上述获得的对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpAd-Scramble转入HEK293A细胞，包装得到对照shRNA干扰重组腺病毒(简称scramble)。

(三)新生大鼠心脏心肌细胞培养

Sprague-Dawley新生大鼠，采用酶消化和差速贴壁法进行分离培养心脏心肌细胞。具体操作如下：

1)Sprague-Dawley新生大鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，实验过程完全符合北京大学医学部实验动物相关伦理学标准。

2)新生大鼠浸没于75％乙醇进行表皮消毒，使用眼科剪从剑突偏右剪开胸腔，将心脏剪下置于冰冷PBS中清洗2次，并修剪多余血管组织及血块。随后将心脏组织转移到10ml无菌血清瓶中，快速剪碎心脏，再用冰冷的PBS清洗两次，弃去上清。

3)向血清瓶中加入4ml消化液(含1g/L胰蛋白酶和0.1g/L II型胶原酶，溶于Hank’s液)，置于37℃水浴中搅动消化4min。收集含有细胞的上清至15ml离心管中，并加入4ml全培养液(含10％新生小牛血清的高糖DMEM)，轻柔吹打混匀，将混悬于DMEM的细胞悬液以1000rpm离心5min，弃去上清，向沉淀中加入4ml DMEM重悬，再次离心，向第二次离心后沉淀中加入2ml DMEM重悬。

4)重复上次操作步骤，一共消化8-10管，直至血清瓶中心脏组织块几乎消失时停止。

5)合并所有含细胞的DMEM悬液，接种于10cm培养皿(10只新生大鼠接种于1个10cm培养皿)，置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)培养2小时。

6)2小时后心脏成纤维细胞几乎完全贴壁，而心肌细胞尚未贴壁。轻轻晃动培养皿，吸取培养皿中的培养液，并用2ml DMEM轻轻洗涤平皿两次，将含有心肌细胞的培养液接种于新的培养皿中，接种密度为10⁶细胞/皿，并加入BrdU(终浓度为10^-4mmol/L)。

(四)心肌细胞缺氧-复氧模型制备

分离的新生大鼠心肌细胞，细胞培养箱(37℃，95％O₂，5％CO₂)中培养48h后，采用不含血清的高糖DMEM培养液继续培养24小时，耗尽细胞内存储的血清、糖和能量。缺氧培养箱中(37℃，0.1％O₂，5％CO₂)，低糖DMEM(不含血清)继续培养24h。结束缺氧，高糖DMEM复氧6小时。其中对照组培养的心肌细胞没有经过任何处理，始终在常规环境(37℃，95％O₂，5％CO₂)及常规培养液(含10％新生小牛血清的高糖DMEM)中培养。

5、TUNEL染色检测心脏组织凋亡

新生大鼠心肌细胞种植于confocal皿中，然后利用TUNEL试剂盒(Roche,11684795910)检测心肌细胞凋亡，具体操作步骤按照试剂盒说明书操作。随后使用DAPI(sigma，D9542)染核，孵育60分钟。倒置荧光显微镜下观察荧光并采集图像，绿色荧光为发生凋亡的心肌细胞，蓝色荧光为细胞核。

6、检测细胞内活性氧(ROS)

二氯荧光黄双乙酸钠(2',7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA；Invitrogen，C2938)能够穿过细胞膜，在细胞内酯酶的作用下转化成DCFH，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化成发出绿色荧光的DCF，其荧光强度与ROS的量成正比。具体操作步骤为：吸弃细胞培养皿中的DMEM，用在37℃预温的PBS清洗3次后，加入含有绿色荧光探针DCFH-DA的PBS(终浓度2.5μmol)，置于37℃细胞培养箱孵育30min，再次用37℃预温的PBS洗3次，去除未结合的探针，置于倒置荧光显微镜低倍镜下观察细胞内的荧光并采集图像，每皿细胞采集6个视野。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行荧光强度定量分析。

7、细胞总蛋白提取

如实施例1中所述。

8、蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)

如实施例1中所述。

二、结果

1、心肌细胞缺氧-复氧后HIP-55表达上调

如图8所示。与对照组相比，缺氧-复氧组心肌细胞中HIP-55蛋白表达上调。该结果提示HIP-55在心肌细胞缺氧-复氧中可能发挥重要作用。

2、HIP-55抑制新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧诱导的凋亡

如图9所示。图9中A所示，DsRed-HIP-55腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞后(MOI50，感染时间为24小时)，HIP-55表达显著比对照组(DsRed腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞)增加；如图9中B所示，我们以DsRed-HIP-55腺病毒或DsRed腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞(MOI 50)24h后，进行24h缺氧培养和6h复氧培养，随后利用TUNEL染色检测发现，对照组(DsRed)细胞凋亡率为(34.8±3.601)％，过表达HIP-55组(DsRed-HIP-55)细胞凋亡率为(22.23±2.223)％(p<0.05；n＝5)，说明HIP-55抑制新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧诱导的凋亡。

同时，图9中C所示，HIP-55-shRNA腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞后(MOI 50，感染时间为24小时)，HIP-55表达显著比对照组(Scramble-RNA腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞)减少；如图9中D所示，我们以HIP-55-shRNA腺病毒或Scramble-RNA腺病毒感染原代新生大鼠心肌细胞(MOI 50)24h后，进行24h缺氧培养和6h复氧培养，同样利用TUNEL染色技术检测也发现，与对照组(Scramble)相比，敲减HIP-55基因组(HIP-55-shRNA，KD)心肌细胞凋亡百分比更高[HIP-55-shRNA(49.25±5.113)％与Scramble(32.25±3.218)％，p<0.05]，结果同样证实HIP-55抑制新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧诱导的凋亡。

3、HIP-55减少新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧后的ROS含量

如图10所示。图10中A所示，在腺病毒感染的原代新生大鼠心肌细胞中，利用DCFH-DA染色检测细胞ROS的生成量发现，与对照组相比，过表达HIP-55组心肌细胞ROS水平较低(p<0.01；n＝5)；同时，图10中B所示，敲减HIP-55基因组心肌细胞ROS生成水平明显升高(p<0.01；n均＝5)。这些结果说明HIP-55具有减少新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧后ROS含量的作用。

序列表

<110> 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）

<120> HIP-55在制备用于诊断和防治心肌缺血再灌注损伤产品中的应用

<130> GNCLN201934

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 430

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Asn Leu Ser Arg Asn Gly Pro Ala Leu Gln Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Val Arg Val Val Thr Glu Lys Ser Pro Thr Asp Trp Ala Leu Phe Thr

20 25 30

Tyr Glu Gly Asn Ser Asn Asp Ile Arg Val Ala Gly Thr Gly Glu Gly

35 40 45

Gly Leu Glu Glu Met Val Glu Glu Leu Asn Ser Gly Lys Val Met Tyr

50 55 60

Ala Phe Cys Arg Val Lys Asp Pro Asn Ser Gly Leu Pro Lys Phe Val

65 70 75 80

Leu Ile Asn Trp Thr Gly Glu Gly Val Asn Asp Val Arg Lys Gly Ala

85 90 95

Cys Ala Ser His Val Ser Thr Met Ala Ser Phe Leu Lys Gly Ala His

100 105 110

Val Thr Ile Asn Ala Arg Ala Glu Glu Asp Val Glu Pro Glu Cys Ile

115 120 125

Met Glu Lys Val Ala Lys Ala Ser Gly Ala Asn Tyr Ser Phe His Lys

130 135 140

Glu Ser Gly Arg Phe Gln Asp Val Gly Pro Gln Ala Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Val Tyr Gln Lys Thr Asn Ala Val Ser Glu Ile Lys Arg Val Gly Lys

165 170 175

Asp Ser Phe Trp Ala Lys Ala Glu Lys Glu Glu Glu Asn Arg Arg Leu

180 185 190

Glu Glu Lys Arg Arg Ala Glu Glu Ala Gln Arg Gln Leu Glu Gln Glu

195 200 205

Arg Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Ala Ala Arg Arg Glu Gln Arg Tyr

210 215 220

Gln Glu Gln Gly Gly Glu Ala Ser Pro Gln Arg Thr Trp Glu Gln Gln

225 230 235 240

Gln Glu Val Val Ser Arg Asn Arg Asn Glu Gln Glu Ser Ala Val His

245 250 255

Pro Arg Glu Ile Phe Lys Gln Lys Glu Arg Ala Met Ser Thr Thr Ser

260 265 270

Ile Ser Ser Pro Gln Pro Gly Lys Leu Arg Ser Pro Phe Leu Gln Lys

275 280 285

Gln Leu Thr Gln Pro Glu Thr His Phe Gly Arg Glu Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Ile Ser Arg Pro Arg Ala Asp Leu Pro Ala Glu Glu Pro Ala Pro Ser

305 310 315 320

Thr Pro Pro Cys Leu Val Gln Ala Glu Glu Glu Ala Val Tyr Glu Glu

325 330 335

Pro Pro Glu Gln Glu Thr Phe Tyr Glu Gln Pro Pro Leu Val Gln Gln

340 345 350

Gln Gly Ala Gly Ser Glu His Ile Asp His His Ile Gln Gly Gln Gly

355 360 365

Leu Ser Gly Gln Gly Leu Cys Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Tyr Gln Ala

370 375 380

Ala Asp Asp Thr Glu Ile Ser Phe Asp Pro Glu Asn Leu Ile Thr Gly

385 390 395 400

Ile Glu Val Ile Asp Glu Gly Trp Trp Arg Gly Tyr Gly Pro Asp Gly

405 410 415

His Phe Gly Met Phe Pro Ala Asn Tyr Val Glu Leu Ile Glu

420 425 430

<210> 2

<211> 1290

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcggcga acctgagccg gaacgggcca gcgctgcaag aggcctacgt gcgggtggtc 60

accgagaagt ccccgaccga ctgggctctc tttacctatg aaggcaacag caatgacatc 120

cgcgtggctg gcacagggga gggtggcctg gaggagatgg tggaggagct caacagcggg 180

aaggtgatgt acgccttctg cagagtgaag gaccccaact ctggactgcc caaatttgtc 240

ctcatcaact ggacaggcga gggcgtgaac gatgtgcgga agggagcctg tgccagccac 300

gtcagcacca tggccagctt cctgaagggg gcccatgtga ccatcaacgc acgggccgag 360

gaggatgtgg agcctgagtg catcatggag aaggtggcca aggcttcagg tgccaactac 420

agctttcaca aggagagtgg ccgcttccag gacgtgggac cccaggcccc agtgggctct 480

gtgtaccaga agaccaatgc cgtgtctgag attaaaaggg ttggtaaaga cagcttctgg 540

gccaaagcag agaaggagga ggagaaccgt cggctggagg aaaagcggcg ggccgaggag 600

gcacagcggc agctggagca ggagcgccgg gagcgtgagc tgcgtgaggc tgcacgccgg 660

gagcagcgct atcaggagca gggtggcgag gccagccccc agaggacgtg ggagcagcag 720

caagaagtgg tttcaaggaa ccgaaatgag caggagtctg ccgtgcaccc gagggagatt 780

ttcaagcaga aggagagggc catgtccacc acctccatct ccagtcctca gcctggcaag 840

ctgaggagcc ccttcctgca gaagcagctc acccaaccag agacccactt tggcagagag 900

ccagctgctg ccatctcaag gcccagggca gatctccctg ctgaggagcc ggcgcccagc 960

actcctccat gtctggtgca ggcagaagag gaggctgtgt atgaggaacc tccagagcag 1020

gagaccttct acgagcagcc cccactggtg cagcagcaag gtgctggctc tgagcacatt 1080

gaccaccaca ttcagggcca ggggctcagt gggcaagggc tctgtgcccg tgccctgtac 1140

gactaccagg cagccgacga cacagagatc tcctttgacc ccgagaacct catcacgggc 1200

atcgaggtga tcgacgaagg ctggtggcgt ggctatgggc cggatggcca ttttggcatg 1260

ttccctgcca actacgtgga gctcattgag 1290

<210> 3

<211> 11257

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcatca actttgtata gaaaagttgg gatcctgcaa 60

ggtcacacaa gggtctccac ccaccaggtg ccctagtctc aatttcagtt tccatgcctt 120

gttctcacaa tgctggcctc cccagagcta atttggactt tgtttttatt tcaaaagggc 180

ctgaatgagg agtagatctt gtgctaccca gctctaaggg tgcccgtgaa gccctcagac 240

ctggagcctt tgcaacagcc ctttaggtgg aagcagaata aagcaatttt ccttaaagcc 300

aaaatcctgc ctctagactc ttcttctctg acctcggtcc ctgggctcta gggtggggag 360

gtggggcttg gaagaagaag gtggggaagt ggcaaaagcc gatccctagg gccctgtgaa 420

gttcggagcc ttccctgtac agcactggct catagatcct cctccagcca aacatagcaa 480

gaagtgatac ctcctttgtg acttccccag gcccagtacc tgtcaggttg aaacaggatt 540

tagagaagcc tctgaactca cctgaactct gaagctcatc caccaagcaa gcacctaggt 600

gccactgcta gttagtatcc tacgctgata atatgcagag ctgggccaca gaagtcctgg 660

ggtgtaggaa ctgaccagtg acttttcagt cggcaaaggt atgaccccct cagcagatgt 720

agtaatgtcc ccttagatcc catcccaggc aggtctctaa gaggacatgg gatgagagat 780

gtagtcatgt ggcattccaa acacagctat ccacagtgtc ccttgcccct tccacttagc 840

caggaggaca gtaaccttag cctatctttc ttcctcccca tcctcccagg acacaccccc 900

tggtctgcag tattcatttc ttccttcacg tcccctctgt gacttccatt tgcaaggctt 960

ttgacctctg cagctgctgg aagatagagt ttggccctag gtgtggcaag ccatctcaag 1020

agaaagcaga caacaggggg accagatttt ggaaggatca ggaactaaat cactggcggg 1080

cctgggggta gaaaaaagag tgagtgagtc cgctccagct aagccaagct agtccccgag 1140

atactctgcc acagctgggc tgctcggggt agctttagga atgtgggtct gaaagacaat 1200

gggattggaa gacatctctt tgagtctccc ctcaacccca cctacagaca cactcgtgtg 1260

tggccagact cctgttcaac agccctctgt gttctgacca ctgagctagg caaccagagc 1320

atgggccctg tgctgaggat gaagagttgg ttaccaatag caaaaacagc aggggaggga 1380

gaacagagaa cgaaataagg aaggaagaag gaaaggccag tcaatcagat gcagtcagaa 1440

gagatgggaa gccaacacac agcttgagca gaggaaacag aaaagggaga gattctgggc 1500

ataaggaggc cacagaaaga agagcccagg ccccccaagt ctcctcttta taccctcatc 1560

ccgtctccca attaagccca ctcttcttcc tagatcagac ctgagctgca gcgaagagac 1620

ccgtagggag gatcacactg gatgaaggag atgtgtggag aagtccaggg caacctaaga 1680

gccagagcct aaaagagcaa gagataaagg tgcttcaaag gtggccaggc tgtgcacaca 1740

gagggtcgag gactggtggt agagcctcaa gataaggatg atgctcagaa tgggcggggg 1800

gggggattct ggggggggga gagagaaggt gagaaggagc ctggaacaga gaatctggaa 1860

gcgctggaaa cgataccata aagggaagaa cccaggctac ctttagatgt aaatcatgaa 1920

agacagggag aagggaagct ggagagagta gaaggacccc ggggcaagac atggaagcaa 1980

ggacaagcca ggttgagcgc tccgtgaaat cagcctgctg aaggcagagc cctggtatga 2040

gcaccagaac agcagaggct agggttaatg tcgagacagg gaacagaagg tagacacagg 2100

aacagacaga gacgggggag ccaggtaaca aaggaatggt ccttctcacc tgtggccaga 2160

gcgtccatct gtgtccacat actctagaat gttcatcaga ctgcagggct ggcttgggag 2220

gcagctggaa agagtatgtg agagccaggg gagacaaggg ggcctaggaa aggaagaaga 2280

gggcaaacca ggccacacaa gagggcagag cccagaactg agttaactcc ttccttgttg 2340

catcttccat aggaggcagt gggaactctg tgaccaccat cccccatgag cccccactac 2400

ccataccaag tttggcctga gtggcattct aggttccctg aggacagagc ctggcctttg 2460

tctcttggac ctgacccaag ctgacccaat gttctcagta ccttatcatg ccctcaagag 2520

cttgagaacc aggcagtgac atattaggcc atgggctaac cctggagctt gcacacagga 2580

gcctcaagtg acctccaggg acacagctgc agacaggtgg cctttatccc caaagagcaa 2640

ccatttggca taggtggctg caaatgggaa tgcaaggttg aatcaggtcc cttcaagaat 2700

actgcatgca agacctaaga cccctggaga gaggggtatg ctcctgcccc cacccaccat 2760

aaggggagtg aactatccta gggggctggc gaccttgggg agacaccaca ttactgagag 2820

tgctgagccc agaaaaactg accgccctgt gtcctgccca cctccacact ctagagctat 2880

attgagaggt gacagtagat agggtgggag ctggtagcag ggagagtgtt cctgggtgtg 2940

agggtgtagg ggaaagccag agcaggggag tctggctttg tctcctgaac acaatgtcta 3000

cttagttata acaggcatga cctgctaaag acccaacatc tacgacctct gaaaagacag 3060

cagccctgga ggacaggggt tgtctctgag ccttgggtgc ttgatggtgc cacaaaggag 3120

ggcatgagtg tgagtataag gccccaggag cgttagagaa gggcacttgg gaaggggtca 3180

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aaacatcatg gtgcacgata tatggatcag tatgtgtaga ggcaagaaag gaaatctgca 3480

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ctgcatctca aggaccatgg aaaatagaat ggacactcta tatgtgtctc taagctaagg 3720

tagcaaggtc tttggaggac acctgtctag agatgtgggc aacagagact acagacagta 3780

tctgtacaga gtaaggagag agaggagggg gtgtagaatt ctcttactat caaagggaaa 3840

ctgagtcgtg cacctgcaaa gtggatgctc tccctagaca tcatgacttt gtctctgggg 3900

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aggcagggga cagatattaa gcctggaaga gaaggtgacc cttacccagt tgttcaactc 4080

acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 4140

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ggccctgctg tcctcctgtc acctccagag ccaagggatc aaaggaggag gagccaggac 4320

aggagggaag tgggagggag ggtcccagca gaggactcca aatttaggca gcaggcatat 4380

gggatgggat ataaaggggc tggagcactg agagctgtca gagatttctc caacccaggt 4440

aagagggagt ttcgggtggg ggctcttcac ccacaccaga cctctcccca cctagaagga 4500

aactgccttt cctggaagtg gggttcaggc cggtcagaga tctgacaggg tggccttcca 4560

ccagcctggg aagttctcag tggcaggagg tttccacaag aaacactgga tgccccttcc 4620

cttacgctgt cttctccatc ttcctcctgg ggatgctcct ccccgtcttg gtttatcttg 4680

gctcttcgtc ttcagcaaga tttgccctgt gctgtccact ccatctttct ctactgtctc 4740

cgtgccttgc cttgccttct tgcgtgtcct tcctttccac ccatttctca cttcaccttt 4800

tctccccttc tcatttgtat tcatccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860

ccttccttcc tttctccctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctg 4920

tgtcagagtg ctgagaatca cacctggggt tcccaccctt atgtaaacaa tcttccagtg 4980

agccacagct tcagtgctgc tgggtgctct cttaccttcc tcaccccctg gcttgtcctg 5040

ttccatcctg gtcaggatct ctagattggt ctcccagcct ctgctactcc tcttcctgcc 5100

tgttcctctc tctgtccagc tgcgccactg tggtgcctcg ttccagctgt ggtccacatt 5160

cttcaggatt ctctgaaaag ttaaccaggt gagaatgttt cccctgtaga cagcagatca 5220

cgattctccc ggaagtcagg cttccagccc tctctttctc tgcccagctg cccggcactc 5280

ttagcaaacc tcaggcaccc ttaccccaca tagacctctg acagagaagc aggcacttta 5340

catggagtcc tggtgggaga gccataggct acggtgtaaa agaggcaggg aagtggtggt 5400

gtaggaaagt caggacttca catagaagcc tagcccacac cagaaatgac agacagatcc 5460

ctcctatctc ccccataaga gtttgagtcg accaagtttg tacaaaaaag caggctgcca 5520

ccatggcggc gaacctgagc cggaacgggc cagcgctgca agaggcctac gtgcgggtgg 5580

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tccgcgtggc tggcacaggg gagggtggcc tggaggagat ggtggaggag ctcaacagcg 5700

ggaaggtgat gtacgccttc tgcagagtga aggaccccaa ctctggactg cccaaatttg 5760

tcctcatcaa ctggacaggc gagggcgtga acgatgtgcg gaagggagcc tgtgccagcc 5820

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acagctttca caaggagagt ggccgcttcc aggacgtggg accccaggcc ccagtgggct 6000

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gcatcgaggt gatcgacgaa ggctggtggc gtggctatgg gccggatggc cattttggca 6780

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tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 8640

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aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa 11160

catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca 11220

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<210> 4

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tacacatgct ttacatgtgt 1860

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<212> DNA

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<400> 7

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60

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caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480

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atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgcttgt 1560

atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1620

atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1680

tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggaa 1740

aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 1800

tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1860

atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1920

gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1980

aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 2040

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 2100

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 2160

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 2220

atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2280

gcattacgct gacttgacgg gacggcgcaa gctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 2340

acgcgtcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 2400

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 2460

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 2520

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 2580

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 2640

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 2700

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 2760

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 2820

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2880

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2940

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 3000

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gtt 3043

Claims (9)

1.HIP-55蛋白或能够促进HIP-55蛋白表达的物质在制备用于在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏的产品的应用；

所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1；

所述能够促进HIP-55蛋白表达的物质为能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA，或者含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述在心肌缺血再灌注损伤中保护心脏是通过抑制细胞凋亡和/或抗氧化应激来实现的。

3.HIP-55蛋白或能够促进HIP-55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：

（B1）制备用于抑制心肌缺血再灌注诱发心肌细胞凋亡的产品；

（B2）制备用于抑制心肌缺血再灌注后产生活性氧自由基的产品；

（B3）制备用于减少心肌缺血再灌注后心梗面积的产品；

（B4）制备用于抑制心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡的产品；

（B5）制备用于抑制心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基的产品；

所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1；

所述能够促进HIP-55蛋白表达的物质为能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA，或者含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述（B2）中，所述抑制心肌缺血再灌注后产生活性氧自由基是通过抑制NADPH氧化酶活性，下调 NOX-2蛋白和 NOX-4蛋白的表达量来实现的。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

6.能够抑制HIP-55蛋白表达的物质在如下任一中的应用：

（C1）制备用于促进心肌细胞在缺氧复氧后发生凋亡的产品；

（C2）制备用于促进心肌细胞在缺氧复氧后产生活性氧自由基的产品；

所述能够抑制HIP-55蛋白表达的物质为靶向HIP-55蛋白的编码基因的shRNA或能够转录成所述shRNA的DNA；

所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述靶向HIP-55蛋白的编码基因的shRNA为SEQ ID No.5所示的RNA分子。

8.HIP-55蛋白在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用；

所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

9.根据权利要求1、2、3、4、6、7或8所述的应用，其特征在于：所述HIP-55蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

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