CN111965367A - Hip-55在作为gpcr偏向药物靶点中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HIP‑55在作为GPCR偏向药物靶点中的应用。本发明提供了HIP‑55蛋白相关生物材料在如下任一中的应用：制备用于调控肾上腺素受体信号通路的产品；制备用于预防和/或治疗肾上腺素受体信号通路相关疾病的产品；所述相关生物材料为能够促进所述HIP‑55蛋白表达的物质，或者能够抑制所述HIP‑55蛋白表达的物质。本发明研究发现信号分子HIP‑55独立介导新的β‑AR偏向性激活信号通路，不依赖G蛋白途径，依赖HIP‑55介导的受体内吞和信号通路。本发明证明HIP‑55可作为β‑AR新的偏向药物靶点。

Description

HIP-55在作为GPCR偏向药物靶点中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及HIP-55在作为GPCR偏向药物靶点中的应用，特别涉及HIP-55在作为β-AR新的偏向激活药物靶点中的应用。

背景技术

β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor，β-AR)作为G蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptor，GPCR)家族的主要成员，已经成为心血管疾病防治药物最重要的靶点之一，尤其在心力衰竭中。经典理论认为，β-AR在与胞外配体结合后被激活，其胞内区偶联Gs蛋白，之后通过腺苷酸环化酶(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)等传递下游信号。然而，近年来提出了GPCR偏向激活的概念，即β-arrestin介导GPCR非G蛋白依赖的偏向性信号通路，也相应的提出了受体的“偏向性配体”这一概念，为受体功能选择性药物研发打开了全新的视野。这一重要发现也成为Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka两位科学家2012年被授予诺贝尔化学奖的奠基性成果之一。尽管β-arrestin的发现已经使人们对于GPCR信号通路的认识，从最初经典的认为GPCR只通过G蛋白信号转导通路的线性模式，扩展为GPCR也可通过非G蛋白依赖的β-arrestin偏向信号通路发挥不同于G蛋白通路的独特功能。然而，GPCR在机体内具有极其重要的功能和复杂的信号网络调控体系，一定还存在其他新的通路来制约和平衡整个GPCR信号网络和功能。

发明内容

本发明的目的是提供HIP-55在作为β-AR新的偏向激活药物靶点中的应用。

第一方面，本发明要求保护HIP-55蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A1)制备用于调控肾上腺素受体信号通路的产品，或调控肾上腺素受体信号通路；

(A2)制备用于预防和/或治疗肾上腺素受体信号通路相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗肾上腺素受体信号通路相关疾病；

其中，所述相关生物材料可为能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质或者能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质。

进一步地，所述调控(抑制或促进)肾上腺素受体信号通路不依赖G蛋白信号通路。

更进一步地，所述调控(抑制或促进)肾上腺素受体信号通路依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现。

在本发明中，所述受体内吞具体为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

第二方面，本发明要求保护HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(B1)制备用于抑制肾上腺素受体信号通路的产品，或抑制肾上腺素受体信号通路；

(B2)制备用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路过度激活相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路过度激活相关疾病。

其中，所述抑制肾上腺素受体信号通路不依赖G蛋白信号通路。进一步地，所述抑制肾上腺素受体信号通路依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现。所述受体内吞具体可为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

其中，所述与肾上腺素受体信号通路过度激活相关疾病可如心血管疾病，如心力衰竭。

第三方面，本发明要求保护能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质在如下任一中的应用：

(C1)制备用于增强肾上腺素受体信号通路的产品，或增强肾上腺素受体信号通路；

(C2)制备用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路传递受阻相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路传递受阻相关疾病。

其中，所述增强肾上腺素受体信号通路不依赖G蛋白信号通路。进一步地，所述增强肾上腺素受体信号通路依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现。所述受体内吞具体可为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

在上述各方面中，所述肾上腺素受体信号通路均可为β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路。

进一步地，所述β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路具体可为p38信号通路和/或ERK1/2信号通路。

第四方面，本发明要求保护HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(D1)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏重塑的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏重塑；

(D2)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心肌肥大和/或纤维化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心肌肥大和/或纤维化；

(D3)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞横截面积增加左心室壁厚度增加和/或肥厚标志物ANP表达量增加的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞横截面积增加、左心室壁厚度增加和/或肥厚标志物ANP表达量增加；

(D4)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏组织胶原含量增加的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏组织胶原含量增加。

其中，所述抑制β-肾上腺素受体介导的心脏重塑、所述抑制β-肾上腺素受体介导的心肌肥大和/或纤维化、所述抑制β-肾上腺素受体介导的心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞横截面积增加增加、左心室壁厚度增加和/或肥厚标志物ANP表达量增加和/或所述抑制β-肾上腺素受体介导的心脏组织胶原含量增加，不依赖G蛋白信号通路，依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路实现。所述受体内吞具体可为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

其中，所述胶原为胶原I和/或胶原III。

所述抑制可为预防性抑制和/或治疗性抑制。

第五方面，本发明要求保护HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(E1)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化；

(E2)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化；

(E3)制备用于促进Clathrin内吞囊泡完成内吞的产品，或者促进Clathrin内吞囊泡完成内吞。

其中，所述抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化和/或所述抑制β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化，不依赖G蛋白信号通路，依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现。所述受体内吞具体可为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

第六方面，本发明要求保护能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质在如下任一中的应用：

(F1)制备用于增强β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化的产品，或增强β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；

(F2)制备用于增强β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化的产品，或增强β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化；

(F3)制备用于抑制Clathrin内吞囊泡完成内吞的产品，或者抑制Clathrin内吞囊泡完成内吞。

其中，所述增强β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化和/或所述增强β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化，不依赖G蛋白信号通路，依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现。所述受体内吞具体可为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

第七方面，本发明要求保护HIP-55蛋白在如下任一中的应用：

(G1)制备能够与β-AR蛋白相互作用的产品；

(G2)制备能够与Clathrin蛋白相互作用的产品；

(G3)制备能够与Clathrin内吞囊泡特异性结合的产品。

第八方面，本发明要求保护HIP-55蛋白在作为肾上腺素受体偏向药物靶点中的应用。

在本发明中，所述肾上腺素受体具体为β肾上腺素受体。所述β-AR蛋白即为β肾上腺素受体。

在上述各应用中，所述能够促进HIP-55蛋白表达的物质可为任何能够促进HIP-55蛋白表达的物质。如能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA，或者含有所述DNA的表达盒、重组载体或重组细胞等。

在上述各应用中，所述能够抑制HIP-55蛋白表达的物质可为任何能够抑制HIP-55蛋白表达的物质。如能够抑制所述HIP-55蛋白表达的shRNA、siRNA等。

在本发明的具体实施方式中，所述HIP-55蛋白的氨基酸序列具体为SEQ ID No.1。相应的，所述能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA(即HIP-55基因)的核苷酸序列具体为SEQID No.2。所述能够抑制所述HIP-55蛋白表达的shRNA的序列为SEQ ID No.4。所述能够抑制所述HIP-55蛋白表达的siRNA的序列为SEQ ID No.7。

在上述各应用中，所述产品均可为药物、细胞模型或用于制备所述细胞模型的物质。

实验证明，本发明研究发现信号分子HIP-55独立介导新的β-AR偏向性信号通路。HIP-55抑制肾上腺素受体信号通路。HIP-55介导的β-AR偏向信号通路不依赖G蛋白。HIP-55介导的β-AR偏向信号通路依赖HIP-55介导的信号通路和/或受体内吞。本发明证明HIP-55可作为β-AR新的偏向药物靶点。过表达HIP-55可抑制β-AR介导的心脏重塑。

附图说明

图1为HIP-55负调控β-肾上腺素受体介导心脏重塑过程中重要下游MAPK信号通路。A为过表达HIP-55抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；B为敲减HIP-55增加β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；C为过表达HIP-55抑制β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化；D为敲减HIP-55增加β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化(p-ERK1/2：磷酸化的ERK1/2；ERK1/2：总的ERK1/2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为一种内参蛋白；ISO：异丙肾上腺素，一种肾上腺素受体的激动剂；p-P38：磷酸化的P38；P38：总的P38；EIF-5：eukaryotic translation initiation factor 5,真核翻译起始因子5，作为一种内参蛋白。

图2为HIP-55不影响β-AR下游Gs/cAMP的生成。A为异丙肾上腺素(ISO)激动β-AR引起下游信号分子cAMP生成明显增加，过表达HIP-55对β-AR下游信号分子cAMP的生成无调控作用；B为过表达HIP-55对β-AR下游信号分子cAMP的生成也无调控作用。

图3为HIP-55与β2-AR共定位情况。

图4为HIP-55介导β2-AR内吞。A为双色TIRFM显示HIP-55与β2-AR共定位；B为TIRFM动态观察β2-AR和HIP-55膜上驻留情况和Kymograph分析图。

图5为过表达dynamin增强HIP-55负调控β-AR介导激活ERK1/2。A为过表达dynamin蛋白，给予ISO刺激，显著增强HIP-55对β-AR激活ERK1/2的负调控作用；B为统计学结果。HA：influenza hemagglutinin epitope，流感病毒血凝素，一个蛋白标签；GAPDH：作为内参蛋白。

图6为重组载体pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP的质粒图谱。

图7为过表达HIP-55可抑制β-AR介导的心脏重塑。A为心脏特异性过表达HIP-55的转基因(HIP-55Tg)和野生型(WT)小鼠进行基因型分析。B为心脏特异性过表达HIP-55的转基因(HIP-55Tg)和野生型(WT)小鼠的心脏进行HIP-55蛋白表达水平的检测。C为上面显示了使用ISO14天前后野生型(WT)和HIP-55转基因(HIP-55Tg)小鼠心脏的代表性图像。下面显示野生型(WT)和HIP-55转基因(HIP-55Tg)小鼠心脏在使用ISO 14天前后心脏重量(HW)与胫骨长度(TL)比值。D为上面显示各组心肌细胞横截面积的代表性图像。下面显示各组心肌细胞横截面积的统计学分析。E为超声心动图显示左心室壁厚度的各组典型图像。右面显示各组左心室壁厚度(LVPW；d)的统计学分析。F为RT-PCR分析各组心脏肥大标志物ANP的mRNA表达情况。G为左面为各组心肌组织的天狼星红染色，显示心脏胶原沉积情况。右侧胶原含量的统计学分析。H和I为RT-PCR分析各组心脏胶原Ⅰ和Ⅲ的含量。Ctrl为对照组。

各图中，*表示经统计学分析，P＜0.05；**表示经统计学分析，P＜0.01。NS表示两组间没有统计学意义(即P＞0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中定量试验均重复三次，结果取平均值。

下述实施例中所涉及的HIP-55蛋白的氨基酸序列具体为SEQ ID No.1。HIP-55基因的核苷酸序列具体为SEQ ID No.2。

下述实施例采用的离体乳大鼠心脏成纤维细胞通过如下方法获得：

实验用SD乳大鼠购自北京大学医学部实验动物部，完全遵照北京大学医学部实验动物相关伦理学标准；采用酶消化和差速贴壁方法进行分离培养；细胞在含有10％胎牛血清(Biochrom AG，Berlin，Germany)的高糖DMEM(Hyclone，Logan，UT)培养基里，其中添加100μg/ml链霉素及100U/ml青霉素，置于37℃的5％CO₂孵箱里培养，具体如下：

出生1-3天内的SD乳大鼠，浸没于75％酒精；眼科剪开胸取心脏；置于冰冷的Hank’s缓冲液中剪除心房部分并洗涤两次。转移到10ml血清瓶中，剪碎组织后Hank’s缓冲液再洗涤两次。弃去上清；加入4mL 0.1％胰蛋白酶置于37℃水浴中平缓搅动消化，每次4min，弃去前两次细胞悬液。继续进行6-8次消化，收集细胞悬液，加入含4mLDMEM完全培养基(含10％胎牛血清)的离心管中，1000rpm×5min离心，取4mL DMEM完全培养基洗涤细胞沉淀，再次重悬离心。最后合并收集细胞，接种于10cm培养皿，37℃、5％CO₂培养箱静置培养2小时。吸取未贴壁的心肌细胞悬液，已贴壁的成纤维细胞用DMEM洗涤后，加入DMEM完全培养基进行培养。长满后传代，实验选用第二代离体心脏成纤维细胞。

实验中也可采用商品化的大鼠心脏成纤维细胞进行相应操作。

下面实施例采用的过表达HIP-55的重组腺病毒和shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒通过如下方法构建和制备：

(一)过表达HIP-55的重组腺病毒的制备

1、过表达HIP-55重组腺病毒载体的构建

利用重叠延伸PCR扩增attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。

重叠PCR扩增：以SEQ ID No.2所示的DBNL基因(HIP-55蛋白的编码基因)为模板，使用引物attB1-HIP-55和HIP-55-Flag-IRES-R进行PCR扩增；以IRES/DesRed为模板，使用引物Flag-IRES-F和DesRedE2-attB2进行PCR扩增；分别回收两个PCR产物；再以两个PCR产物为模板，用引物：attB1-HIP-55和DesRedE2-attB2进行融合PCR，得到2656bp的PCR产物，该PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID No.3，命名为attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。重叠PCR扩增引物见表1。

表1重叠PCR扩增引物

引物名称	5’-3’
		attB1-HIP-55	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGGTGAACCTGAGC
HIP-55-Flag-R	CTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTATGAGCTCCACATAGT
		Flag-IRES-F	ACGACGATGACAAGTAGGCCCCTCTCCCTCCCCC
DesRedE2-attB2	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTGGAACAGGTGGTGGC

重叠PCR扩增反应体系及扩增程序如下：

反应体系：5×Primer STAR^TM Buffer(Mg²⁺Plus)10μl；dNTP Mixture(10μM)4μl；上游引物-F(10μM)1μl；下游引物-R(10μM)1μl；模板DNA 1μl；Primer STAR^TM HS DNAPolymerase 0.5μl；补加ddH₂O至总体积50μl。

扩增程序：98℃3min；98℃10s，60℃10s，72℃3min，30个循环；72℃5min。

6×loading buffer终止反应；

将上述2665bp的PCR产物利用Gateway clone构建重组载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：25℃，BP反应3h。反应体系：attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2-attB2 100ng；pDONR 221载体(Invitrogen目录编号：12536-017)100ng；BPclonase 1μl；TE buffer补足5μl。

加入蛋白酶K终止反应10min，得到BP反应产物，将BP反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2(SEQ ID No.3)插入pDONR 221中得到的中间载体，命名为pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

利用Gateway clone构建pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：

将中间载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2和母载体质粒pAd/CMV/V5-DEST进行LR反应，体系如下：pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2 16ng；pAd/CMV/V5-DEST(Invitrogen；V493-20该载体上不带有Flag-IRES/DesRedE2，需要同样步骤将Flag-IRES/DesRedE2构建到pAd/CMV/V5-DEST中作为对照)140ng；LR clonase 1μl；TE buffer补足5μl。

25℃，LR反应3h，加入蛋白酶K终止反应10min，得到LR反应产物，将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2(SEQ ID No.3)插入pAd/CMV/V5-DEST中，得到腺病毒表达载体，命名为pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

2、对照病毒腺病毒表达载体pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2的构建

pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2为将Flag-IRES/DesRedE2(SEQ ID No.3自5’末端第1335-2627位核苷酸)构建到pAd/CMV/V5-DEST中得到的载体；

1)利用引物flag+DsRed-F和attB2+DsRed为引物(序列见表2)，SEQ ID No.3自5’末端第1335-2627位核苷酸所示的DNA分子为模板PCR扩增获得1293bp的flag-IRES/DsRedE2片段；

2)利用引物attB1-K-Flag和attB2+DsRed为引物(序列见表2)，flag-IRES/DsRedE2片段为模板PCR扩增获得1357bp的attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段。

3)BP反应

采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段通过BP反应插入pDONR 221载体中，构建pDown-flag/IRES/DsRed Express2；

4)LR反应

采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2片段通过LR反应插入pAd/CMV/V5-DEST载体中得到pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2。

表2引物序列

3、过表达HIP-55重组腺病毒的获得

将上述获得的过表达HIP-55重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2转入HEK293A细胞(美国ATCC，产品目录号CRL-1573^TM)，包装得到过表达HIP-55重组腺病毒(命名简称：Dsred-HIP-55)。

将上述获得的空腺病毒载体pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express 2转染HEK293A细胞，包装得到pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express 2腺病毒(命名简称：DsRed)。

(二)shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的制备

针对鼠HIP-55蛋白编码基因设计并合成如下HIP-55shRNA和对照Control shRNA：

HIP-55 shRNA：5’-ucuuuggcau guuuccugcc aacucgaguu ggcaggaaacaugccaaagu uuuuc-3’(SEQ ID No.4)；

Control shRNA：5’-ugcgcgcuuu guaggauucg cucgagcgaa uccuacaaagcgcgcuuuuu c-3’(SEQ ID No.5)。

1、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒载体的构建

shRNA的扩增引物为shHIP-55-F和shHIP-55-R(序列见表3)；对照shRNA的扩增引物为Control-F和Control-R(序列见表3)。

表3 shRNA相关引物序列

引物	5’-3’
		shHIP-55-F	TCTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGTTTTTC
shHIP-55-R	TCGAGAAAAACTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGA
		Control-F	TGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTC
Control-R	TCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCA

(1)Oligo DNA的退火

a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配制成50μM，溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×)，混匀备用。

b)设置反应体系(总体积100μl)：DEPC-water 40μl；Annealing Buffer for DNAOligos(5×)20μl；shHIP-55-F(50μM)20μl；shHIP-55-R(50μM)20μl。

设置PCR仪进行退火反应：95℃2min；每8s下降0.1℃，降至25℃，约90min；4℃长时间保存。

退火产物-20℃保存，得到退火的shHIP-55Oligo DNA。

(2)酶切载体shpDown-MCS

a)酶切体系：shpDown-MCS(3043bp，载体的全序列为SEQ ID No.6)2μg；10×Kbuffer 5μl；Xho Ⅰ 1μl；Hpa Ⅰ 1μl；H₂O补足至50μl。

b)37℃酶切3h。

c)6×loading buffer终止反应，1％的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收约3043bp的载体片段。

3)连接

a)连接体系：3043bp的载体片段30fmol；退火的shHIP-55 Oligo DNA(1/10dilute)1μl；10×T₄ DNA ligase buffer 2.5μl；T₄ DNA ligase 1μl；H₂O补足至25μl。

b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

PCR鉴定引物：

shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’；

shpDown-flank-r：5’-AGCGAGCTTATCGATACCGT-3’。

得到234bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’，结果该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55Oligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDwon-HIP-55。

(3)利用Gateway Technology构建shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55

具体如下：

LR反应体系：pAd/PL-Dest(Invitrogen；V494-20)118.80ng；shpDwon-HIP-5517.00ng；LR clonase 1μl；TE buffer补足至5μl。

反应条件：25℃，16h。

加入0.5μl蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：5’-GGCCGCTAGCGACATCGATC-3’和pAd/PL-flank-r：5’-CCTTAAGCCACGCCCACAC-3’，结果为该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因(退火的shHIP-55 Oligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-HIP-55。

2、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得

将上述获得的shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55转入HEK293A细胞，包装得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒。

3、对照shRNA干扰重组腺病毒载体的构建

(1)Oligo DNA的退火

a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM，溶解Annealing Buffer forDNA Oligos(5×)，混匀备用。

b)设置反应体系(总体积100μl)：DEPC-water 40μl；Annealing Buffer for DNAOligos(5×)20μl；Control-F(50μM)20μl；Control-R(50μM)20μl。

设置PCR仪进行退火反应：95℃ 2min；每8s下降0.1℃，降至25℃，约90min；4℃长时间保存。

c)退火产物-20℃保存，得到和退火Control Oligo DNA。

(2)酶切载体shpDown-MCS

a)酶切体系：shpDown-MCS 2μg；10×K buffer 5μl；Xho Ⅰ 1μl；Hpa Ⅰ 1μl；H₂O补足至50μl。

b)37℃酶切3h；

d)6×loading buffer终止反应，1％的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收3kb的载体片段。

3)连接

a)连接体系：3kb的载体片段30fmol；退火Control Oligo DNA(1/10dilute)1μl；10×T₄ DNA ligase buffer 2.5μl；T₄ DNA ligase 1μl；H₂O补足至25μl。

b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

PCR鉴定引物：

shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’；

shpDown-flank-r：5’-AGCGAGCTTATCGATACCGT-3’。

得到230bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：5’-AGCTACATTTTACATGATAGGCTT-3’，结果该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDown-Scramble。

(3)利用Gateway Technology构建Scramble干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-Scramble

具体如下：

LR反应体系：

反应条件：25℃，16h。

加入0.5μl蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：5’-GGCCGCTAGCGACATCGATC-3’和pAd/PL-flank-r：5’-CCTTAAGCCACGCCCACAC-3’，结果为该质粒为将Control shRNA编码基因(退火ControlOligo DNA)插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-Scramble。

4、对照shRNA干扰重组腺病毒的获得

将上述步骤上述获得的对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpAd-Scramble转入HEK293A细胞，包装得到对照shRNA干扰重组腺病毒(简称scramble)。

实施例1、信号分子HIP-55独立介导新的β-AR偏向性激活信号通路

一、HIP-55负调控β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路

1、过表达HIP-55抑制β-肾上腺素受体介导的MAPK信号通路

将乳大鼠心脏成纤维细胞接种于6孔板(Corning，3516)中，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，分别将5×10⁶pfu过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)和5×10⁶pfu对照重组腺病毒(DsRed)感染进入乳大鼠心脏成纤维细胞中。培养24小时后，再分别给予异丙肾上腺素(ISO，终浓度10^-5mol/L)分别处理0、10、15分钟后，迅速弃去上清，拍干。

使用蛋白印迹的方法检测ERK1/2磷酸化和p38磷酸化情况。上述操作后，迅速向6孔板中的每个孔加入100μL蛋白裂解液(配方：1％脱氧胆酸、10mM Na₄P₂O₇、1％TritonX-100、10％甘油、100mM NaCl、5mM EDTA(pH＝8.0)、20mM Tris-HCl(pH＝7.4)、0.1％SDS、50mM NaF、1mM Na₃VO₄、1mM PMSF、10mg/L抑肽酶)裂解细胞。用SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。5％脱脂奶粉室温封闭1h后，使用一抗4℃孵育过夜(一抗：p-ERK1/2(CST，9102S)；T-ERK1/2(CST，4370L)；p-P38(CST，4511S)；T-P38(CST，8690L)；HIP-55(Santa Cruz Biotechnology，sc 366772)；GAPDH(Santa CruzBiotechnology，sc-25778))。过夜后用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h(二抗：山羊抗兔IgG/辣根酶标记(中杉金桥，ZB-2301)；山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记(中杉金桥，ZB-2305))，用增强型化学发光系统(中国北京，Millipore)检测蛋白条带，使用Image J软件(NIH，MA，USA)测定条带灰度值并进行统计学分析。

2、敲减HIP-55促进β-肾上腺素受体介导的MAPK信号通路

将乳大鼠心脏成纤维细胞接种于6孔板(Corning，3516)中，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，分别将5×10⁶pfu shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒和对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)感染进入乳大鼠心脏成纤维细胞中。培养24小时后，再分别给予异丙肾上腺素(ISO，终浓度10^-5mol/L)分别处理0、10、15分钟后，迅速弃去上清，拍干。

使用蛋白印迹的方法检测ERK1/2磷酸化和p38磷酸化情况。方法如上述步骤1

结果如图1所示。可见过表达HIP-55抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；敲减HIP-55增加β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；过表达HIP-55抑制β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化；敲减HIP-55增强β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化。该结果表明，HIP-55负调控β-肾上腺素受体介导心脏重塑的p38信号通路和ERK1/2信号通路。

二、HIP-55介导的GPCR信号途径不依赖G蛋白途径

1、过表达HIP-55不影响β-肾上腺素受体介导的cAMP增加

1.1细胞感染

将乳大鼠心脏成纤维细胞接种于10cm皿中，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，分别将5×10⁶pfu过表达HIP-55重组腺病毒(Dsred-HIP55)和5×10⁶pfu对照重组腺病毒(DsRed)感染进入乳大鼠心脏成纤维细胞中。培养12小时后，进行下一步实验。

1.2cAMP检测

cAMP检测是根据试剂盒(Promega，V1501)进行的。具体步骤如下：

(1)相关试剂配备(按说明书要求配制)：1)1×PBS(pH＝7.4)；2)100mM IBMX(sigma I7018)：22.2mg/ml(22.2mg IBMX溶于1ml 100％DMSO中)；3)100mM R020-1724(sigma B8279)：27.84mg/ml(27.84mg R020-1724溶于1ml 100％DMSO中)；4)Inductionbuffer：含100μM R020-1724和500μM IBMX；5)4.0μM标准品cAMP配制：1μl 1mM的cAMP标准品溶于250μl induction buffer中，获得4μM的cAMP溶液250μl；6)Kinase-GIo reagent：将

buffer和

substrate轻轻混匀，最好现配现用，余量-20℃保存；7)cAMP-Glo^TM reaction buffer配制：将2.5μl蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)加入1mlcAMP–Glo^TM reaction buffer(冰上操作)。

(2)处理细胞：将待检测细胞接种于96孔板中(5000个/孔)，完全培养基培养12h后细胞撤血清，12h后加异丙肾上腺素(ISO)(10μM，induction buffer配制)分别刺激5或15min，空白孔只含induction buffer。

(3)cAMP标准曲线制作：将1μl 1mM的cAMP标准品溶于250μl induction buffer中，获得4μM的cAMP溶液250μl，然后倍比稀释依次获得2μM，1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM，62.5nM，31.25nM，15.625nM，7.81nM,3.95nM，0nM的储存液。

(4)cAMP检测：1)将上述配制的标准液按浓度从小到大依次加入到不透光的96孔白板中，每个浓度做3个复孔；2)向上述的每个标准品及待检样品孔中加入20μl cAMP Glo^TMlysis buffer 20μl，室温轻轻振荡孵育20-30min，以确保细胞完全裂解；3)将上述待检样品细胞裂解液转移到不透光的96孔白板中，向不透光的96孔白板每孔(含待检样品孔和标准液样品孔)加入40μl cAMP-Glo^TM reaction buffer，震荡混匀20-30s后，室温孵育20min；4)每孔加入80μl Kinase-Glo reagent(将

Substrate和

Buffer充分缓和溶解后的试剂)震荡混匀30-60s，室温避光孵育10min；5)Lumino meter检测：将不透光的96孔白板置入Lumino meter检测仪中进行检测，记录荧光值结果。通过标准曲线法测定待测样本中cAMP含量。

2、敲减HIP-55不影响β-肾上腺素受体介导的cAMP增加

2.1细胞感染

将乳大鼠心脏成纤维细胞接种于10cm皿中，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，分别将5×10⁶pfu shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒和对照shRNA干扰重组腺病毒(scramble)感染进入乳大鼠心脏成纤维细胞中。培养12小时后，进行下一步实验。

2.2cAMP检测

方法如上步骤1.2。

本发明检测了HIP-55对β-AR激活Gs依赖信号的指标——环磷酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate,cAMP)生成的影响。结果如图2所示。异丙肾上腺素(ISO)激动β-AR引起下游信号分子cAMP生成明显增加，过表达HIP-55对β-AR下游信号分子cAMP的生成无调控作用；敲减HIP-55对β-AR下游信号分子cAMP的生成也无调控作用。可见，HIP-55不影响β-AR下游Gs/cAMP的生成，提示不依赖Gs偶联信号途径。

三、HIP-55介导的GPCR偏向性激活信号通路依赖受体内吞

1、HIP-55与β2-AR共定位情况

1.1细胞转染使用Lipofectamine2000按照说明书进行HEK293A细胞(美国ATCC，产品目录号CRL-1573^TM)转染。简述步骤如下：取两个Eppendorf管并分别加入100μL的Opti-MEM，其中一管中加入0.5μg Abp1-tDimerRFP质粒(带有红色荧光的HIP-55质粒，Addgene，#27699)和0.5μgβ2-AR-GFP质粒(Sino Biological，HG10378-ACG)和2.5μL Lipofectamine2000，静置5min后，将两管混合并混匀。室温静置20min后，将细胞换成无抗生素无胎牛血清的DMEM，并将质粒DNA-Lipofectamine 2000的混合物加入到细胞中，放回培养箱继续培养。12h后更换为含有1％抗生素10％胎牛血清的DMEM培养基，待转染36h后，细胞用做进一步实验。

1.2全内反射显微镜显微镜观察

细胞样品使用4％多聚甲醛室温固定20分钟，物镜型全内反射显微镜(TIRFM)搭载于倒置Olympus IX71显微镜上，配有TIRF照明器、100X/1.45NA的平场复消色差全内反射物镜(Olympus)和14-bit EMCCD(back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device camera，Andor iXon DU-897BV)。使用氩离子激光器(Melles Griot)的488nm激光激发GFP以及Alexa Flour 488，561nm激光激发RFP。为了同时收集红色和绿色荧光，在EMCCD前端增加了双通道分光器件(dual-view splitter，Optical Insights)，550nm二向色镜分离红绿荧光，515/30nm带通滤光片用于收集绿色荧光，580nm长通滤光片用于收集红色荧光。图像使用MetaMorph软件(Molecular Device)采集，采集速度为10Hz，连续采集500帧。对于活细胞成像，转染后将细胞更换37℃预热新鲜无酚红DMEM(Gibco)，放入显微镜搭载的CO₂温控培养台(TOKAI HIT)进行成像。活细胞双色单粒子追踪采用Image J软件完成。Kymograph图像由Image J插件Multiple Kymograph完成。

HIP-55与β2-AR共定位情况如图3所示。HIP-55介导β2-AR内吞如图4所示。

2、HIP-55介导GPCR信号依赖于受体Clathrin途径的内吞

2.1稳定敲减HIP-55的HEK293A细胞系和对照HEK293A细胞的构建

RNA干扰HIP-55的重组载体pSilencer5.1-siRNA的构建：合成编码HIP-55siRNA的DNA分子，其核苷酸序列为；5'-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTGTTCAAGAGACAATTCTCTACGTTCACTGTTTTTTGGAAA-3'；由两条单链DNA退火形成，其中一条单链DNA的核苷酸序列为F:5'-GATCCGCAGTGAACGTAGAGAATTGTTCAAGAGACAATTCTCTACGTTCACTGTT TTTTGGAAA-3'另一条单链DNA的核苷酸序列为R:5'-AGCTTTTCCAAAAAACAGTGAACGTAGAGAATTGTCTCTTGAACAATTCTCTACGTTCACTGCG-3'。

RNA干扰载体pSilencer5.1-siRNA为将编码HIP-55siRNA的DNA分子插入pSilencer5.1(Invitrogen，AM5782)载体的BamHI和HindIII酶切位点间，得到表达SEQ IDNo.7所示的HIP-55siRNA的载体。

HIP-55siRNA：5’-gauccgcagu gaacguagag aauuguucaa gagacaauuc ucuacguucacuguuuuuuggaaa-3’(SEQ ID No.7)。

对照RNA干扰载体pSilencer5.1-Scramble：为将编码Scramble siRNA的DNA分子插入pSilencer5.1载体的BamHI和HindIII位点间，得到表达SEQ ID No.8所示的ScramblesiRNA的载体。

Scramble siRNA：5’-gauccgcacu accgguugua uagguguuca agagacaccuauacaaaggu aguguuuugg aaa-3’(SEQ ID No.8)。

稳定敲减HIP-55的HEK293A细胞系和对照HEK293A细胞的构建：将上述得到的RNA干扰载体pSilencer5.1-siRNA和RNA对照干扰载体pSilencer5.1-Scramble通过脂质体法分别转染HEK293A细胞中，嘌呤霉素(puromycin，1.25μg/ml)筛选病毒感染阳性细胞克隆，得到HEK293A/pSilencer5.1-siRNA和HEK293A/pSilencer5.1-Scramble细胞系。

2.2HIP-55介导GPCR信号依赖于受体Clathrin途径的内吞

在稳定敲减HIP-55的HEK293A细胞系和对照HEK293A细胞的基础上，通过转染HA-Dynamin质粒(Addgene，#34684)过表达Dynamin蛋白，方法如“HIP-55介导的GPCR偏向性激活信号通路依赖受体内吞”部分的1.1。细胞转染36小时后，加入10^-5mol/L ISO刺激0、5、15min后，收集细胞，提取蛋白。通过蛋白印迹(Western Blot)检测ERK1/2磷酸化情况。蛋白印迹(Western Blot)的具体方法如“HIP-55负调控β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路”中所描述的。

结果如图5所示。可见过表达dynamin蛋白(增加Clathrin途径受体内吞)，给予ISO刺激，显著增强HIP-55对β-AR激活ERK1/2的负调控作用。

四、过表达HIP-55可抑制β-AR介导的心脏重塑

1、构建心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠及小鼠基因型鉴定

转基因小鼠制作流程：

(1)重组表达载体的设计、构建

将目前国际通用的心脏特异性过表达基因的启动子——αMHC启动子和人源DBNL基因(DBNL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。DBNL基因编码HIP-55蛋白，HIP-55蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)利用Gateway Technolgy构建到目的载体pRP.Des3d中，得到重组载体命名为pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP，该载体的质粒图谱如图6所示，全序列如SEQ ID No.9所示。

(2)转基因小鼠的制备及鉴定

将以上得到的重组载体pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP用NotI酶切，得到线性化DNA，注射到200个FVB/NCrlVr(简写为FVB/N)品系小鼠受精卵，显微注射后的受精卵回送到4-5只代孕母鼠输卵管中。

建立转基因Founder(原代)小鼠，以Founder小鼠与野生型的小鼠配种。根据插入的基因片段，设计不同的引物，以确保对获得的转基因小鼠鉴定的准确性。后代中PCR鉴定阳性小鼠即为心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠。

鉴定心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠的引物序列为：

Forward：5′-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3′；

Reverse：5′-GCCTTCATAGGTAAAGAGAGCCCAGTCG-3′。

2、心脏重塑模型制备

以FVB/N小鼠和步骤1构建的心脏特异性过表达HIP-55转基因小鼠构建心脏重塑模型。具体如下：

12周龄，每日皮下注射异丙肾上腺素(ISO，10mg/kg/d，Sigma-Aldrich)，连续14天建立心脏重塑模型，对照组给予等体积的溶剂(生理盐水)。

3、HE染色和天狼星红染色

具体如下：

组织切片的处理：石蜡切片脱蜡处理：二甲苯15分钟×3次，无水乙醇5分钟×2次，95％乙醇5分钟×2次，80％乙醇5分钟，蒸馏水浸泡2分钟。

HE染色：1)将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色2分钟。2)酸水及氨水中分色，各数10秒钟。3)流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。4)入70％和90％酒精中脱水各10分钟。5)入酒精伊红染色液染色2—3分钟。6)染色后的切片经无水酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。7)将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。

天狼星红染色：1)天狼猩红染色液染色：切片入饱和苦味酸天狼猩红染色液内染色8分钟。2)漂洗：切片入无水酒精漂洗数分钟，显微镜下观察满意为止。3)封片：切片于60℃烤箱烤干后于二甲苯透明5分钟，中性树胶封片。4)显微镜镜检，图像采集分析。

4、超声心动图检测

重塑模型第14天用Vevo 770型超声仪(Visual Sonics,Toronto,Canada)行经胸超声心动图检查，评价心脏结构和功能。用1.5％异氟醚(Baxter HealthcareCorporation,New Providence,USA)麻醉小鼠，同时将心率保持在450次/分钟左右。在乳头肌水平获得左心室直径最大的胸骨旁长轴位和短轴位的二维图像。测量舒张期左室后壁厚度(LVPW；d)，计算射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)评价心脏收缩功能。所有测量值均取连续三个心动周期的平均值。

5、RNA提取

使用Tridzol法提取组织或细胞中的RNA，因RNA易被RNA酶降解，故整个操作过程中，要使用无RNA酶的枪头、试剂。取冰冻组织置于专用的组织匀浆管中，每管加入1ml的Tridzol及适量磁珠后，置于组织匀浆仪，选择程序将组织裂解。12000转，4℃，离心15分钟，取上清置于新的1.5ml无RNA酶EP管中,每管加入氯仿200μl，充分震荡混匀后，置于室温5-10分钟，此时管中会出现分层现象。将EP管置于离心机中，12000rpm，4℃，离心15分钟，取上层水相400μl左右(注意：中层呈白色，含蛋白质、DNA等，下层为有机相，都不能吸到)转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻混匀，室温静置10分钟，此时RNA沉淀会析出，12000rpm,4℃，离心15分钟后，弃上清。向管内加入1ml的75％乙醇，上下轻轻颠倒EP管十几次，以洗净RNA沉淀上的异丙醇及其他有机杂质。7500rpm，4℃，离心5分钟后，弃上清，重复以上步骤再洗涤RNA一次，可用真空泵将管中的残余液体吸干。将EP管管盖打开，置于超净工作台中干燥15分钟左右，至RNA变透明即可。向管中加入20-50ul(根据RNA的大小稍作调整)DEPC水溶解RNA，测量RNA浓度后分装，-80℃保存。

逆转录：先要将RNA逆转录为cDNA，才能再进行下一步的PCR扩增。应用试剂盒ImProm-II ReverseTranscription System(Promega公司)进行逆转录。RNA的逆转录如下：取1000ngRNA置于PCR专用EP管中，再加入DEPC水与Random Primer 1μL，组成11μL的体系。将EP管置于70℃,5分钟使RNA变性，接着置于0℃，5分钟后，每管加入9μL逆转录Mix，混匀低速离心。逆转录反应体系为：5×buffer 4μL；MgCl₂ 2.5μL；dNTP 1μL；RNAase抑制剂0.5μL；逆转录酶0.5μL；无RNA酶水0.5μL。

按以下程序逆转录：25℃，5分钟；42℃，1小时；70℃，15分钟。逆转录的产物可置于-20℃保存。

实时荧光定量PCR：cDNA稀释5倍后，使用

2-Step RT-qPCR System试剂盒(Promega,WI,USA)。

反应体系：无RNA酶水6.5μL；Mix 12.5μL；正向引物0.5μL；反向引物0.5μL；cDNA 5μL。

将装有以上反应液的8联管置于Real Time PCR仪中，使用ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)进行实时定量PCR。PCR程序选用二步法，设置如下：95℃，2分钟；(95℃for 15秒，60℃for 1分钟)×35个循环。所得CT值，运用2^-△△Ct法进行数据分析。涉及引物序列如下：

ANP-F：5’-CTTCCAGGCCATATTGGAG-3’；

ANP-R：5’-GGGGGCATGACCTCATCTT-3’。

Collagen I(mouse)-F：5’-GTAACTTCGTGCCTAGCAACA-3’；

Collagen I(mouse)-R：5’-CCTTTGTCAGAATACTGAGCAGC-3’。

Collagen III(mouse)-F：5’-TGGTCCTCAGGGTGTAAAGG-3’；

Collagen III(mouse)-R：5’-GTCCAGCATCACCTTTTGGT-3’。

GAPDH(mouse)-F：5’-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3’；

GAPDH(mouse)-R：5’-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA-3’。

结果如图7所示。通过基因型分析验证HIP-55转基因小鼠构建成功。与WT小鼠相比，HIP-55转基因小鼠心脏组织中HIP-55蛋白高表达。WT和HIP-55转基因小鼠进行了2周的ISO处理制备β-AR介导的心脏重塑模型。HIP-55过表达可以预防小鼠心肌肥厚，包括抑制心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞在组织切片中的横截面积增大、左心室壁厚度(LVPW；d)增加和肥厚标志物ANP表达量增加对纤维化面积，胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的定量研究显示，与WT小鼠相比，HIP-55转基因小鼠的心脏纤维化程度要小得多。这些结果表明，HIP-55过表达可以减轻ISO诱导的心肌肥大和纤维化。综上所述，我们的结果显示HIP-55抑制β-AR介导的心脏重构。

序列表

<110> 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）

<120> HIP-55在作为GPCR偏向药物靶点中的应用

<130> GNCLN201248

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 430

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Asn Leu Ser Arg Asn Gly Pro Ala Leu Gln Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Val Arg Val Val Thr Glu Lys Ser Pro Thr Asp Trp Ala Leu Phe Thr

20 25 30

Tyr Glu Gly Asn Ser Asn Asp Ile Arg Val Ala Gly Thr Gly Glu Gly

35 40 45

Gly Leu Glu Glu Met Val Glu Glu Leu Asn Ser Gly Lys Val Met Tyr

50 55 60

Ala Phe Cys Arg Val Lys Asp Pro Asn Ser Gly Leu Pro Lys Phe Val

65 70 75 80

Leu Ile Asn Trp Thr Gly Glu Gly Val Asn Asp Val Arg Lys Gly Ala

85 90 95

Cys Ala Ser His Val Ser Thr Met Ala Ser Phe Leu Lys Gly Ala His

100 105 110

Val Thr Ile Asn Ala Arg Ala Glu Glu Asp Val Glu Pro Glu Cys Ile

115 120 125

Met Glu Lys Val Ala Lys Ala Ser Gly Ala Asn Tyr Ser Phe His Lys

130 135 140

Glu Ser Gly Arg Phe Gln Asp Val Gly Pro Gln Ala Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Val Tyr Gln Lys Thr Asn Ala Val Ser Glu Ile Lys Arg Val Gly Lys

165 170 175

Asp Ser Phe Trp Ala Lys Ala Glu Lys Glu Glu Glu Asn Arg Arg Leu

180 185 190

Glu Glu Lys Arg Arg Ala Glu Glu Ala Gln Arg Gln Leu Glu Gln Glu

195 200 205

Arg Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Ala Ala Arg Arg Glu Gln Arg Tyr

210 215 220

Gln Glu Gln Gly Gly Glu Ala Ser Pro Gln Arg Thr Trp Glu Gln Gln

225 230 235 240

Gln Glu Val Val Ser Arg Asn Arg Asn Glu Gln Glu Ser Ala Val His

245 250 255

Pro Arg Glu Ile Phe Lys Gln Lys Glu Arg Ala Met Ser Thr Thr Ser

260 265 270

Ile Ser Ser Pro Gln Pro Gly Lys Leu Arg Ser Pro Phe Leu Gln Lys

275 280 285

Gln Leu Thr Gln Pro Glu Thr His Phe Gly Arg Glu Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Ile Ser Arg Pro Arg Ala Asp Leu Pro Ala Glu Glu Pro Ala Pro Ser

305 310 315 320

Thr Pro Pro Cys Leu Val Gln Ala Glu Glu Glu Ala Val Tyr Glu Glu

325 330 335

Pro Pro Glu Gln Glu Thr Phe Tyr Glu Gln Pro Pro Leu Val Gln Gln

340 345 350

Gln Gly Ala Gly Ser Glu His Ile Asp His His Ile Gln Gly Gln Gly

355 360 365

Leu Ser Gly Gln Gly Leu Cys Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Tyr Gln Ala

370 375 380

Ala Asp Asp Thr Glu Ile Ser Phe Asp Pro Glu Asn Leu Ile Thr Gly

385 390 395 400

Ile Glu Val Ile Asp Glu Gly Trp Trp Arg Gly Tyr Gly Pro Asp Gly

405 410 415

His Phe Gly Met Phe Pro Ala Asn Tyr Val Glu Leu Ile Glu

420 425 430

<210> 2

<211> 1290

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggcggcga acctgagccg gaacgggcca gcgctgcaag aggcctacgt gcgggtggtc 60

accgagaagt ccccgaccga ctgggctctc tttacctatg aaggcaacag caatgacatc 120

cgcgtggctg gcacagggga gggtggcctg gaggagatgg tggaggagct caacagcggg 180

aaggtgatgt acgccttctg cagagtgaag gaccccaact ctggactgcc caaatttgtc 240

ctcatcaact ggacaggcga gggcgtgaac gatgtgcgga agggagcctg tgccagccac 300

gtcagcacca tggccagctt cctgaagggg gcccatgtga ccatcaacgc acgggccgag 360

gaggatgtgg agcctgagtg catcatggag aaggtggcca aggcttcagg tgccaactac 420

agctttcaca aggagagtgg ccgcttccag gacgtgggac cccaggcccc agtgggctct 480

gtgtaccaga agaccaatgc cgtgtctgag attaaaaggg ttggtaaaga cagcttctgg 540

gccaaagcag agaaggagga ggagaaccgt cggctggagg aaaagcggcg ggccgaggag 600

gcacagcggc agctggagca ggagcgccgg gagcgtgagc tgcgtgaggc tgcacgccgg 660

gagcagcgct atcaggagca gggtggcgag gccagccccc agaggacgtg ggagcagcag 720

caagaagtgg tttcaaggaa ccgaaatgag caggagtctg ccgtgcaccc gagggagatt 780

ttcaagcaga aggagagggc catgtccacc acctccatct ccagtcctca gcctggcaag 840

ctgaggagcc ccttcctgca gaagcagctc acccaaccag agacccactt tggcagagag 900

ccagctgctg ccatctcaag gcccagggca gatctccctg ctgaggagcc ggcgcccagc 960

actcctccat gtctggtgca ggcagaagag gaggctgtgt atgaggaacc tccagagcag 1020

gagaccttct acgagcagcc cccactggtg cagcagcaag gtgctggctc tgagcacatt 1080

gaccaccaca ttcagggcca ggggctcagt gggcaagggc tctgtgcccg tgccctgtac 1140

gactaccagg cagccgacga cacagagatc tcctttgacc ccgagaacct catcacgggc 1200

atcgaggtga tcgacgaagg ctggtggcgt ggctatgggc cggatggcca ttttggcatg 1260

ttccctgcca actacgtgga gctcattgag 1290

<210> 3

<211> 2656

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatggc ggtgaacctg agccggaacg 60

ggccggcgct gcaggaggcc tatgtgcggg tggtcaccga gaaatccccg accgactggg 120

ctctttttac ctatgaaggc aacagcaatg acatccgtgt ggctggcaca ggggagggag 180

gcctggagga gctggtggag gagctcaaca gcgggaaggt gatgtacgcc ttctgcaggg 240

tgaaggaccc caactctggc ctgcccaagt ttgtcctcat caactggaca ggcgagggtg 300

tgaatgatgt gcgaaaagga gcatgtgcca accacgtcag caccatggcc aacttcctaa 360

agggtgccca tgtgaccatc aacgcacggg ctgaggaaga tgtggagcct gagtgcatca 420

tggagaaggt tgccaaggct tctggggcta attacagctt ccataaggaa agcagctgct 480

tccaggatgt ggggcctcag gccccagtgg gctctgtgta ccagaagacc aatgccgtgt 540

ctgagatcaa gagagttggc aaggataact tctgggccaa agctgagaag gaggaggaga 600

accgccgcct ggaggagaag cggcgggctg aagaggagaa gcagcggctg gaggaggagc 660

ggcgggagcg ggagctgcag gaggctgccc gacgggaaca acgctaccag gaacagcaca 720

gatcagctgg acccccaagc aggacaggtg aactggagca agaggtggtt tcaaggagca 780

gacaggaatg ggagtctgct gggcagcagg ccccacaccc acgggagatt ttcaagcaga 840

aggaaagggc tatgtccacc acctctgtct ccagctctca gccaggcaag ctgaggagcc 900

ccttcctgca gaagcagttc actcaaccag aagcttccta tggccgagag cccacttctc 960

ctgtgtcacg gcctgcagca ggtgtctgcg aggagctggc acccagcact ccgccctcag 1020

cccagacaga cgatgaacct acatatgaag tgccctccga gcaggagacc ctgtacgagg 1080

aaccaccacc ggtccagcag ccaggggctg gctccggaca cattgacaac tacatgcaga 1140

gccaggacct cagtgggcaa ggactgtgcg ctcgggcctt gtacgactac caggcagctg 1200

acgacacgga gatctccttt gaccctgaga acctaatcac aggcatcgag gtgattgacg 1260

aaggctggtg gcgtggctat gggcctgacg gccactttgg catgtttcct gccaactatg 1320

tggagctcat agaggactac aaggacgacg atgacaagta ggcccctctc cctccccccc 1380

ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 1440

attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1500

cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1560

tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1620

cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1680

tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1740

tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 1800

gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tacacatgct ttacatgtgt 1860

ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1920

aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tggatagcac tgagaacgtc atcaagccct 1980

tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg 2040

gcgagggcga gggcaagccc tacgagggca cccagaccgc caagctgcag gtgaccaagg 2100

gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg 2160

tgtacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct 2220

tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact 2280

cctccctgca ggacggcacc ttcatctacc acgtgaagtt catcggcgtg aacttcccct 2340

ccgacggccc cgtaatgcag aagaagactc tgggctggga gccctccacc gagcgcctgt 2400

acccccgcga cggcgtgctg aagggcgaga tccacaaggc gctgaagctg aagggcggcg 2460

gccactacct ggtggagttc aagtcaatct acatggccaa gaagcccgtg aagctgcccg 2520

gctactacta cgtggactcc aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccgtgg 2580

tggagcagta cgagcgcgcc gaggcccgcc accacctgtt ccagtagacc cagctttctt 2640

gtacaaagtg gtcccc 2656

<210> 4

<211> 55

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ucuuuggcau guuuccugcc aacucgaguu ggcaggaaac augccaaagu uuuuc 55

<210> 5

<211> 51

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ugcgcgcuuu guaggauucg ctcgagcgaa uccuacaaag cgcgcuuuuu c 51

<210> 6

<211> 3043

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240

tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300

gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360

acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420

caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480

gcagttccct actctcgcgt ttcctacctt ctcttcgttt ccaacgctag catggatgtt 540

ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtcttaag ctcgggcccc aaataatgat 600

tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacaaatt gatgagcaat gcttttttat 660

aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctg atccgacgcc gccatctcta ggcccgcgcc 720

ggccccctcg cacagacttg tgggagaagc tcggctactc ccctgccccg gttaatttgc 780

atataatatt tcctagtaac tatagaggct taatgtgcga taaaagacag ataatctgtt 840

ctttttaata ctagctacat tttacatgat aggcttggat ttctataaga gatacaaata 900

ctaaattatt attttaaaaa acagcacaaa aggaaactca ccctaactgt aaagtaattg 960

tgtgttttga gactataaat atcccttgga gaaaagcctt gttaacgcgc ggtgaccctc 1020

gaggtcgacg gtatcgataa gctcgcttca cgagattcca gcaggtcgag ggacctaata 1080

acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tattaagggt tccaagctta agcggcccgc 1140

gggcccggga tctggcctcc gcgccggacc cagctttctt gtacaaagtt ggcattataa 1200

gaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca 1260

ttatttgcca tccagctgat atcccctata gtgagtcgta ttacatggtc atagctgttt 1320

cctggcagct ctggcccgtg tctcaaaatc tctgatgtta cattgcacaa gataaaataa 1380

tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 1440

gccatattca acgggaaacg tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 1500

atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgcttgt 1560

atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 1620

atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 1680

tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggaa 1740

aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 1800

tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 1860

atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 1920

gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 1980

aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 2040

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 2100

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 2160

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 2220

atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 2280

gcattacgct gacttgacgg gacggcgcaa gctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 2340

acgcgtcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 2400

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 2460

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 2520

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 2580

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 2640

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 2700

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 2760

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 2820

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2880

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2940

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 3000

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gtt 3043

<210> 7

<211> 64

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gauccgcagu gaacguagag aauuguucaa gagacaauuc ucuacguuca cuguuuuuug 60

gaaa 64

<210> 8

<211> 63

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gauccgcacu accgguugua uagguguuca agagacaccu auacaaaggu aguguuuugg 60

aaa 63

<210> 9

<211> 11257

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcatca actttgtata gaaaagttgg gatcctgcaa 60

ggtcacacaa gggtctccac ccaccaggtg ccctagtctc aatttcagtt tccatgcctt 120

gttctcacaa tgctggcctc cccagagcta atttggactt tgtttttatt tcaaaagggc 180

ctgaatgagg agtagatctt gtgctaccca gctctaaggg tgcccgtgaa gccctcagac 240

ctggagcctt tgcaacagcc ctttaggtgg aagcagaata aagcaatttt ccttaaagcc 300

aaaatcctgc ctctagactc ttcttctctg acctcggtcc ctgggctcta gggtggggag 360

gtggggcttg gaagaagaag gtggggaagt ggcaaaagcc gatccctagg gccctgtgaa 420

gttcggagcc ttccctgtac agcactggct catagatcct cctccagcca aacatagcaa 480

gaagtgatac ctcctttgtg acttccccag gcccagtacc tgtcaggttg aaacaggatt 540

tagagaagcc tctgaactca cctgaactct gaagctcatc caccaagcaa gcacctaggt 600

gccactgcta gttagtatcc tacgctgata atatgcagag ctgggccaca gaagtcctgg 660

ggtgtaggaa ctgaccagtg acttttcagt cggcaaaggt atgaccccct cagcagatgt 720

agtaatgtcc ccttagatcc catcccaggc aggtctctaa gaggacatgg gatgagagat 780

gtagtcatgt ggcattccaa acacagctat ccacagtgtc ccttgcccct tccacttagc 840

caggaggaca gtaaccttag cctatctttc ttcctcccca tcctcccagg acacaccccc 900

tggtctgcag tattcatttc ttccttcacg tcccctctgt gacttccatt tgcaaggctt 960

ttgacctctg cagctgctgg aagatagagt ttggccctag gtgtggcaag ccatctcaag 1020

agaaagcaga caacaggggg accagatttt ggaaggatca ggaactaaat cactggcggg 1080

cctgggggta gaaaaaagag tgagtgagtc cgctccagct aagccaagct agtccccgag 1140

atactctgcc acagctgggc tgctcggggt agctttagga atgtgggtct gaaagacaat 1200

gggattggaa gacatctctt tgagtctccc ctcaacccca cctacagaca cactcgtgtg 1260

tggccagact cctgttcaac agccctctgt gttctgacca ctgagctagg caaccagagc 1320

atgggccctg tgctgaggat gaagagttgg ttaccaatag caaaaacagc aggggaggga 1380

gaacagagaa cgaaataagg aaggaagaag gaaaggccag tcaatcagat gcagtcagaa 1440

gagatgggaa gccaacacac agcttgagca gaggaaacag aaaagggaga gattctgggc 1500

ataaggaggc cacagaaaga agagcccagg ccccccaagt ctcctcttta taccctcatc 1560

ccgtctccca attaagccca ctcttcttcc tagatcagac ctgagctgca gcgaagagac 1620

ccgtagggag gatcacactg gatgaaggag atgtgtggag aagtccaggg caacctaaga 1680

gccagagcct aaaagagcaa gagataaagg tgcttcaaag gtggccaggc tgtgcacaca 1740

gagggtcgag gactggtggt agagcctcaa gataaggatg atgctcagaa tgggcggggg 1800

gggggattct ggggggggga gagagaaggt gagaaggagc ctggaacaga gaatctggaa 1860

gcgctggaaa cgataccata aagggaagaa cccaggctac ctttagatgt aaatcatgaa 1920

agacagggag aagggaagct ggagagagta gaaggacccc ggggcaagac atggaagcaa 1980

ggacaagcca ggttgagcgc tccgtgaaat cagcctgctg aaggcagagc cctggtatga 2040

gcaccagaac agcagaggct agggttaatg tcgagacagg gaacagaagg tagacacagg 2100

aacagacaga gacgggggag ccaggtaaca aaggaatggt ccttctcacc tgtggccaga 2160

gcgtccatct gtgtccacat actctagaat gttcatcaga ctgcagggct ggcttgggag 2220

gcagctggaa agagtatgtg agagccaggg gagacaaggg ggcctaggaa aggaagaaga 2280

gggcaaacca ggccacacaa gagggcagag cccagaactg agttaactcc ttccttgttg 2340

catcttccat aggaggcagt gggaactctg tgaccaccat cccccatgag cccccactac 2400

ccataccaag tttggcctga gtggcattct aggttccctg aggacagagc ctggcctttg 2460

tctcttggac ctgacccaag ctgacccaat gttctcagta ccttatcatg ccctcaagag 2520

cttgagaacc aggcagtgac atattaggcc atgggctaac cctggagctt gcacacagga 2580

gcctcaagtg acctccaggg acacagctgc agacaggtgg cctttatccc caaagagcaa 2640

ccatttggca taggtggctg caaatgggaa tgcaaggttg aatcaggtcc cttcaagaat 2700

actgcatgca agacctaaga cccctggaga gaggggtatg ctcctgcccc cacccaccat 2760

aaggggagtg aactatccta gggggctggc gaccttgggg agacaccaca ttactgagag 2820

tgctgagccc agaaaaactg accgccctgt gtcctgccca cctccacact ctagagctat 2880

attgagaggt gacagtagat agggtgggag ctggtagcag ggagagtgtt cctgggtgtg 2940

agggtgtagg ggaaagccag agcaggggag tctggctttg tctcctgaac acaatgtcta 3000

cttagttata acaggcatga cctgctaaag acccaacatc tacgacctct gaaaagacag 3060

cagccctgga ggacaggggt tgtctctgag ccttgggtgc ttgatggtgc cacaaaggag 3120

ggcatgagtg tgagtataag gccccaggag cgttagagaa gggcacttgg gaaggggtca 3180

gtctgcagag cccctatcca tggaatctgg agcctggggc caactggtgt aaatctctgg 3240

gcctgccagg cattcaaagc agcacctgca tcctctggca gcctggggag gcggaaggga 3300

gcaacccccc acttataccc tttctccctc agccccagga ttaacacctc tggccttccc 3360

ccttcccacc tcccatcagg agtggagggt tgcagaggga gggtaaaaac ctacatgtcc 3420

aaacatcatg gtgcacgata tatggatcag tatgtgtaga ggcaagaaag gaaatctgca 3480

ggcttaactg ggttaatgtg taaagtctgt gtgcatgtgt gtgtgtctga ctgaaaacgg 3540

gcatggctgt gcagctgttc agttctgtgc gtgaggttac cagactgcag gtttgtgtgt 3600

aaattgccca aggcaaagtg ggtgaatccc ttccatggtt taaagagatt ggatgatggc 3660

ctgcatctca aggaccatgg aaaatagaat ggacactcta tatgtgtctc taagctaagg 3720

tagcaaggtc tttggaggac acctgtctag agatgtgggc aacagagact acagacagta 3780

tctgtacaga gtaaggagag agaggagggg gtgtagaatt ctcttactat caaagggaaa 3840

ctgagtcgtg cacctgcaaa gtggatgctc tccctagaca tcatgacttt gtctctgggg 3900

agccagcact gtggaacttc aggtctgaga gagtaggagg ctcccctcag cctgaagcta 3960

tgcagatagc cagggttgaa agggggaagg gagagcctgg gatgggagct tgtgtgttgg 4020

aggcagggga cagatattaa gcctggaaga gaaggtgacc cttacccagt tgttcaactc 4080

acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 4140

tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact 4200

aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg 4260

ggccctgctg tcctcctgtc acctccagag ccaagggatc aaaggaggag gagccaggac 4320

aggagggaag tgggagggag ggtcccagca gaggactcca aatttaggca gcaggcatat 4380

gggatgggat ataaaggggc tggagcactg agagctgtca gagatttctc caacccaggt 4440

aagagggagt ttcgggtggg ggctcttcac ccacaccaga cctctcccca cctagaagga 4500

aactgccttt cctggaagtg gggttcaggc cggtcagaga tctgacaggg tggccttcca 4560

ccagcctggg aagttctcag tggcaggagg tttccacaag aaacactgga tgccccttcc 4620

cttacgctgt cttctccatc ttcctcctgg ggatgctcct ccccgtcttg gtttatcttg 4680

gctcttcgtc ttcagcaaga tttgccctgt gctgtccact ccatctttct ctactgtctc 4740

cgtgccttgc cttgccttct tgcgtgtcct tcctttccac ccatttctca cttcaccttt 4800

tctccccttc tcatttgtat tcatccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860

ccttccttcc tttctccctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctg 4920

tgtcagagtg ctgagaatca cacctggggt tcccaccctt atgtaaacaa tcttccagtg 4980

agccacagct tcagtgctgc tgggtgctct cttaccttcc tcaccccctg gcttgtcctg 5040

ttccatcctg gtcaggatct ctagattggt ctcccagcct ctgctactcc tcttcctgcc 5100

tgttcctctc tctgtccagc tgcgccactg tggtgcctcg ttccagctgt ggtccacatt 5160

cttcaggatt ctctgaaaag ttaaccaggt gagaatgttt cccctgtaga cagcagatca 5220

cgattctccc ggaagtcagg cttccagccc tctctttctc tgcccagctg cccggcactc 5280

ttagcaaacc tcaggcaccc ttaccccaca tagacctctg acagagaagc aggcacttta 5340

catggagtcc tggtgggaga gccataggct acggtgtaaa agaggcaggg aagtggtggt 5400

gtaggaaagt caggacttca catagaagcc tagcccacac cagaaatgac agacagatcc 5460

ctcctatctc ccccataaga gtttgagtcg accaagtttg tacaaaaaag caggctgcca 5520

ccatggcggc gaacctgagc cggaacgggc cagcgctgca agaggcctac gtgcgggtgg 5580

tcaccgagaa gtccccgacc gactgggctc tctttaccta tgaaggcaac agcaatgaca 5640

tccgcgtggc tggcacaggg gagggtggcc tggaggagat ggtggaggag ctcaacagcg 5700

ggaaggtgat gtacgccttc tgcagagtga aggaccccaa ctctggactg cccaaatttg 5760

tcctcatcaa ctggacaggc gagggcgtga acgatgtgcg gaagggagcc tgtgccagcc 5820

acgtcagcac catggccagc ttcctgaagg gggcccatgt gaccatcaac gcacgggccg 5880

aggaggatgt ggagcctgag tgcatcatgg agaaggtggc caaggcttca ggtgccaact 5940

acagctttca caaggagagt ggccgcttcc aggacgtggg accccaggcc ccagtgggct 6000

ctgtgtacca gaagaccaat gccgtgtctg agattaaaag ggttggtaaa gacagcttct 6060

gggccaaagc agagaaggag gaggagaacc gtcggctgga ggaaaagcgg cgggccgagg 6120

aggcacagcg gcagctggag caggagcgcc gggagcgtga gctgcgtgag gctgcacgcc 6180

gggagcagcg ctatcaggag cagggtggcg aggccagccc ccagaggacg tgggagcagc 6240

agcaagaagt ggtttcaagg aaccgaaatg agcaggagtc tgccgtgcac ccgagggaga 6300

ttttcaagca gaaggagagg gccatgtcca ccacctccat ctccagtcct cagcctggca 6360

agctgaggag ccccttcctg cagaagcagc tcacccaacc agagacccac tttggcagag 6420

agccagctgc tgccatctca aggcccaggg cagatctccc tgctgaggag ccggcgccca 6480

gcactcctcc atgtctggtg caggcagaag aggaggctgt gtatgaggaa cctccagagc 6540

aggagacctt ctacgagcag cccccactgg tgcagcagca aggtgctggc tctgagcaca 6600

ttgaccacca cattcagggc caggggctca gtgggcaagg gctctgtgcc cgtgccctgt 6660

acgactacca ggcagccgac gacacagaga tctcctttga ccccgagaac ctcatcacgg 6720

gcatcgaggt gatcgacgaa ggctggtggc gtggctatgg gccggatggc cattttggca 6780

tgttccctgc caactacgtg gagctcattg aggactacaa ggacgacgat gacaagtaaa 6840

cccagctttc ttgtacaaag tgggcccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg 6900

aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc 6960

gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag 7020

gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt 7080

tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa 7140

ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc 7200

aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg 7260

gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat 7320

gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa 7380

acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata 7440

tggccacaac catggtgagc aagcagatcc tgaagaacac cggcctgcag gagatcatga 7500

gcttcaaggt gaacctggag ggcgtggtga acaaccacgt gttcaccatg gagggctgcg 7560

gcaagggcaa catcctgttc ggcaaccagc tggtgcagat ccgcgtgacc aagggcgccc 7620

ccctgccctt cgccttcgac atcctgagcc ccgccttcca gtacggcaac cgcaccttca 7680

ccaagtaccc cgaggacatc agcgacttct tcatccagag cttccccgcc ggcttcgtgt 7740

acgagcgcac cctgcgctac gaggacggcg gcctggtgga gatccgcagc gacatcaacc 7800

tgatcgagga gatgttcgtg taccgcgtgg agtacaaggg ccgcaacttc cccaacgacg 7860

gccccgtgat gaagaagacc atcaccggcc tgcagcccag cttcgaggtg gtgtacatga 7920

acgacggcgt gctggtgggc caggtgatcc tggtgtaccg cctgaacagc ggcaagttct 7980

acagctgcca catgcgcacc ctgatgaaga gcaagggcgt ggtgaaggac ttccccgagt 8040

accacttcat ccagcaccgc ctggagaaga cctacgtgga ggacggcggc ttcgtggagc 8100

agcacgagac cgccatcgcc cagctgacca gcctgggcaa gcccctgggc agcctgcacg 8160

agtgggtgta acaactttat tatacatagt tgatggccgg ccgcttcgag cagacatgat 8220

aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat 8280

ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt 8340

taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt 8400

ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg taaaatcgat aaggatccgt cgaccgatgc 8460

ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg 8520

ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct 8580

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 8640

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 8700

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 8760

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 8820

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 8880

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 8940

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 9000

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 9060

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 9120

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 9180

aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 9240

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 9300

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 9360

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 9420

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 9480

tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 9540

gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 9600

tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 9660

gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 9720

cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 9780

gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 9840

atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 9900

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 9960

atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 10020

aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 10080

aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 10140

gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 10200

gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 10260

gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 10320

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 10380

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 10440

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 10500

gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 10560

agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 10620

tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 10680

ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 10740

cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 10800

tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 10860

tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 10920

caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttccca ttcgccattc 10980

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagccc 11040

aagctaccat gataagtaag taatattaag gtacgggagg tacttggagc ggccgcaata 11100

aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa 11160

catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca 11220

gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgata 11257

Claims (10)

1.HIP-55蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(A1)制备用于调控肾上腺素受体信号通路的产品，或调控肾上腺素受体信号通路；

(A2)制备用于预防和/或治疗肾上腺素受体信号通路相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗肾上腺素受体信号通路相关疾病；

所述相关生物材料为能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质或者能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控肾上腺素受体信号通路不依赖G蛋白信号通路。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调控肾上腺素受体信号通路依赖于所述HIP-55蛋白介导的受体内吞或信号通路而实现；

进一步地，所述受体内吞为依赖于Clathrin途径的受体内吞。

4.HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(B1)制备用于抑制肾上腺素受体信号通路的产品，或抑制肾上腺素受体信号通路；

(B2)制备用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路过度激活相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路过度激活相关疾病。

5.能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质在如下任一中的应用：

(C1)制备用于增强肾上腺素受体信号通路的产品，或增强肾上腺素受体信号通路；

(C2)制备用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路传递受阻相关疾病的产品，或用于预防和/或治疗与肾上腺素受体信号通路传递受阻相关疾病。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述肾上腺素受体信号通路为β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路；

进一步地，所述β-肾上腺素受体介导心脏重塑的下游MAPK信号通路为p38信号通路和/或ERK1/2信号通路。

7.HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(D1)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏重塑的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏重塑；

(D2)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心肌肥大和/或纤维化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心肌肥大和/或纤维化；

(D3)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞横截面积增加、左心室壁厚度增加和/或肥厚标志物ANP表达量增加的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏增大、HW/TL比值升高、心肌细胞横截面积增加、左心室壁厚度增加和/或肥厚标志物ANP表达量增加；

(D4)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的心脏组织胶原含量增加的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的心脏组织胶原含量增加。

8.HIP-55蛋白或能够促进所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性提高的物质在如下任一中的应用：

(E1)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的ERK1/2蛋白磷酸化；

(E2)制备用于抑制β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化的产品，或抑制β-肾上腺素受体介导的p38蛋白磷酸化；

(E3)制备用于促进Clathrin内吞囊泡完成内吞的产品，或者促进Clathrin内吞囊泡完成内吞；

或者

能够抑制所述HIP-55蛋白表达和/或使其活性降低的物质在如下任一中的应用：

(F1)制备用于增强β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化的产品，或增强β-肾上腺素受体介导的ERK1/2磷酸化；

(F2)制备用于增强β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化的产品，或增强β-肾上腺素受体介导的p38磷酸化；

(F3)制备用于抑制Clathrin内吞囊泡完成内吞的产品，或者抑制Clathrin内吞囊泡完成内吞。

9.HIP-55蛋白在如下任一中的应用：

(G1)制备能够与β-AR蛋白相互作用的产品；

(G2)制备能够与Clathrin蛋白相互作用的产品；

(G3)制备能够与Clathrin内吞囊泡特异性结合的产品。

10.HIP-55蛋白在作为肾上腺素受体偏向药物靶点中的应用。

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