WO1997035973A2 - SEQUENCES CODANT POUR LES RECEPTEURS β2- ET β3-ADRENERGIQUES CANINS ET LEURS APPLICATIONS EN TANT QUE SONDES ET POUR L'EXPRESSION DE PEPTIDES - Google Patents

SEQUENCES CODANT POUR LES RECEPTEURS β2- ET β3-ADRENERGIQUES CANINS ET LEURS APPLICATIONS EN TANT QUE SONDES ET POUR L'EXPRESSION DE PEPTIDES Download PDF

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WO1997035973A2
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Gerlinde Lenzen
France Pietri-Rouxel
Marie-Françoise DRUMARE
Arthur Donny Strosberg
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Vetigen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • the present invention relates to nucleotide sequences coding for certain canine ⁇ -adrenergic receptors, in particular ⁇ 2- and ⁇ 3- receptors, as well as to the use of these sequences as probes, for the expression of ⁇ - receptors.
  • canine adrenergics to study the tissue localization of the expressed receptor (PCR, Northern blot), to carry out site-directed mutagenesis and for the structure-function study of receptors.
  • the present invention also relates to the use of said canine ⁇ -adrenergic receptors for the preparation of specific antibodies.
  • the present invention also relates to a method for the differential screening of substances, with agonist or antagonist action with respect to canine ⁇ 3-adrenergic receptors and with kits or kits for detecting the degree of affinity of different substances for said substances.
  • canine ⁇ 3-adrenergic receptors Such substances are used in particular for the selective treatment of obesity in dogs or other metabolic disorders linked to obesity or to any other pathology involving canine ⁇ 3 receptors.
  • catecholamines such as adrenaline and noradrenaline
  • synthetic agonists of ⁇ -adrenergic receptors which mimic their biological functions and antagonists, which block these biological functions, exert their effects by binding to recognition sites (membrane receptors) specific, located in the plasma membranes of cells.
  • recognition sites membrane receptors
  • Two main categories of adrenergic receptors have been defined, the ⁇ adrenergic receptors and the ⁇ adrenergic receptors.
  • catecholamine receptors ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3-RA.
  • Their genes have been recently isolated and identified (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163; BK KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656; T FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924; LJ EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
  • membrane receptors when they have fixed the appropriate ligand (agonist or antagonist), undergo a change in conformation, which induces (agonist) or blocks (antagonist) an intracellular signal, which modifies the behavior of the target cell.
  • agonists bind to ⁇ -adrenergic receptors (RA- ⁇ ) they activate a class of proteins G, which in turn stimulates the activity of adenylyl cyclase, while the antagonists bind to RA- ⁇ , but do not activate adenylyl cyclase.
  • RA- ⁇ ⁇ -adrenergic receptors
  • aenyllyl cyclase When activated, it catalyzes the production of an intracellular mediator or second messenger, in particular cyclic AMP.
  • the inventors participated in the discovery of new ⁇ -adrenergic receptors in humans, called RA-Hu ⁇ 3, in mice (International Application WO 92/12246), called RA-Mu ⁇ 3 and in cattle (International Application WO 94 / 24162), called RA-Bo ⁇ 3, characterized by properties different from those of the ⁇ 1 and ⁇ 2 receptors, in particular in that they behave differently with respect to substances respectively antagonists and agonists of the ⁇ 1 and ⁇ 2 receptors ( International Application WO 90/08775).
  • the RA-Hu ⁇ 3 receptor is more particularly constituted by a sequence of 408 amino acids (VAN SPRONSEN A. et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 1117-1124) and is considered to contain seven hydrophobic transmembrane regions separated by intra- and extra-cellular hydrophilic loops and the RA-Mu ⁇ 3 receptor consists of a sequence of 400 amino acids (VAN SPRONSEN et al., cited above) while the RA-Bo ⁇ 3 receptor consists of a sequence of 405 amino acids, the latter two sequences also comprising seven transmembrane regions.
  • RA-Hu ⁇ 3, RA-Mu ⁇ 3 and RA-Bo ⁇ 3 has shown that the ⁇ 3-adrenergic receptor is involved in diseases such as diabetes and / or obesity; it is preferentially expressed in adipose tissue which plays an important role in metabolism.
  • RA-Ca ⁇ 3 adrenergic ⁇ 3 receptor in dogs
  • RA- ⁇ 2 ⁇ -adrenergic receptors
  • the subject of the present invention is isolated nucleotide sequences, characterized in that they correspond to a DNA sequence coding for a canine ⁇ -adrenergic receptor selected from the group consisting of cDNA coding for the canine ⁇ 2-adrenergic receptor, of sequence SEQ ID NO: 1 and by DNA coding for the canine ⁇ 3-adrenergic receptor, of sequence SEQ ID NO: 24.
  • the canine adrenergic ⁇ 3 and ⁇ 2 receptors have been effectively isolated, which gives the possibility either of developing selective treatments for dogs after defining a pharmacological profile distinct from that defined for the receptors ⁇ 3 human, murine and bovine, either to have specific products of a receptor subtype: specific canine ⁇ 3 or specific canine ⁇ 2.
  • the present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they consist of a nucleotide sequence as defined above or a fragment thereof, labeled with the aid of a marker such as a radioactive isotope, a suitable enzyme or a fluorochrome.
  • a marker such as a radioactive isotope, a suitable enzyme or a fluorochrome.
  • the hybridization conditions of the probes are defined as follows:
  • suitable hybridization conditions are as follows:
  • Washes are carried out in a solution containing 3 mM NaCl; 0.3 mM sodium citrate;
  • Washings are carried out in a solution containing 15 mM NaCl; 1.5 mM sodium citrate;
  • suitable hybridization conditions are those indicated above for shorter probes, but in which the above-defined medium contains 40 to 50% formamide instead of 10 to 25%.
  • the probes from SEQ ID N ° 1 hybridize only with RA-Ca ⁇ 2 receptors, while the probes from SEQ ID N ° 24 hybridize only with the RA-Ca ⁇ 3 receptor.
  • the present invention also relates to proteins ( ⁇ 2- and ⁇ 3-adrenergic receptors), characterized in that they are coded by a nucleotide sequence as defined above and are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 (RA-Ca ⁇ 2 receptor) and SEQ ID NO: 25 (RA-Ca ⁇ 3).
  • Canine ⁇ 2 and ⁇ 3 receptors activate adenylyl cyclase; however, the coupling between receptors and adenylyl cyclase via G proteins is deficient in murine CHO-Kl cells (ref .: ATCC CRL 9618, ATCC Catalog of Cell Unes & Hybridomas, 7th edition, 1992) and CHW, for the canine ⁇ 2 receptor and CHO-K1, for the canine ⁇ 3 receptor. This implies a loss of activity of canine ⁇ 2- and ⁇ 3-adrenergic receptors in these cells, although they are effectively expressed there.
  • the activity of the canine ⁇ 3 receptor expressed in CHO-K1 cells is distinguished from the ⁇ 3 activity of other species (man, beef), expressed in the same cells, in that it is zero when the receptor is cloned and expressed in CHO-K1 cells, while it is strong, when it is expressed in monkey COS-1 cells (ref .: ATCC CRL 1650, ATCC Ca talogue of Cell Unes & Hybridomas, 7th edition, 1992).
  • Said receptor presents, in COS-1 cells, in which - there is both correct expression and coupling, the activities of ⁇ 3-adrenergic receptors, namely, it activates adenylyl cyclase in the presence of one of the agonists following: (-) - isoprotere- nol, (-) - epinephrine, (-) - norepinephrine, CGP12177A, CL316,243.
  • the present invention also relates to fragments of said proteins of at least 6 amino acids, corresponding to an epitope capable of producing antibodies under suitable conditions, as described in GUILLAUME JL. et al. (Eur. J. Biochem., 1994, 224, 761-770)
  • the present invention also relates to antibodies directed specifically against the canine ⁇ 3-adrenergic receptor or against one of its epitopes, which antibodies recognize only said canine ⁇ 3-adrenergic receptor or one of its epitopes and neither recognize nor ⁇ 1- receptors, nor canine ⁇ 2- adrenergic receptors.
  • the present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • the term “recombinant vector” means both a plasmid, a cosmid and a phage.
  • said vector consists of an appropriate recombinant vector, comprising in particular an origin of replication in a suitable host microorganism, in particular a bacterium or a eukaryotic cell, at least one gene of which the expression allows the selection either of bacteria or of eukaryotic cells having received said vector, an appropriate regulatory sequence, in particular a promoter allowing the expression of genes in said bacs series or eukaryotic cells, and into which vector is inserted a nucleotide sequence or a fragment of a sequence as defined above, which vector is a vector for expression of a canine ⁇ 2- or ⁇ 3- adrenergic receptor.
  • said vector consists of a recombinant expression plasmid into which is inserted, at the level of a multisite linker, the sequence coding for the ⁇ 2- receptor or the canine ⁇ 3 -adrenergic receptor ;
  • a plasmid containing the sequence coding for the canine ⁇ 3 -adrenergic receptor was named pcDNA3 / canine adrenergic r ⁇ 3 or "canine Beta3-ADR" and was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) maintained by the INSTITUT PASTEUR, dated February 9, 1996 under No. I-1672;
  • a plasmid containing the sequence coding for the canine ⁇ 2-adrenergic receptor was designated pcDNA3 / r ⁇ 2-adrenergic.
  • the present invention also relates to an appropriate host cell, obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by a recombinant expression plasmid, in accordance with the invention.
  • Such a cell is capable of expressing a protein, of canine origin, having a ⁇ 2- or ⁇ 3-adrenergic receptor activity.
  • the host cell is in particular constituted by the CHO-K1 cells (stable expression not coupled to adenylyl cyclase activity) and COS-1 (transient expression and coupling to adenylyl cyclase).
  • the receptors according to the invention constitute a tool for the detection of specific ligands involved in the activation or inhibition of these receptors and make it possible to identify and select ⁇ -adrenergic ligands specific for canine ⁇ 3 receptors, by comparing the results obtained using both the sequences coding for the ⁇ 2- receptor and sequences coding for the canine ⁇ 3-adrenergic receptor.
  • the differential screening method for the study of the affinity in binding of substances and the selection and identification of substances capable of behaving as a specific ligand with respect to a ⁇ 3 receptor - canine adrenergic comprises:
  • Such a method makes it possible to define the pharmacological profile of the receptor, namely canine ⁇ 3 (when the substance studied is brought into contact with the receptor ⁇ 3), or canine ⁇ 2 (when the substance studied is brought into contact with the ⁇ 2 receptor).
  • canine ⁇ 3 when the substance studied is brought into contact with the receptor ⁇ 3
  • canine ⁇ 2 when the substance studied is brought into contact with the ⁇ 2 receptor.
  • the present invention further relates to a method for studying the efficacy of a substance having either an agonist or an antagonist activity with respect to the receptor studied, which method comprises:
  • the culture of the transformed host cell under conditions allowing the expression of the ⁇ 3 receptor coded by the nucleotide sequence, and the transfer of the expressed ⁇ 3 receptor to the membrane of said cell, so that the transmembrane sequences of the ⁇ 3 receptor are exposed on the surface of the transformed host cell;
  • the invention further relates to a kit for the detection of the possible binding affinity of a ligand for a receptor in accordance with the invention and / or for the detection of the activity of said ligand with respect to screw of the receiver studied, which kit includes:
  • control ligands having determined affinities for said ⁇ 3 receptor
  • the affinity of said substance for the receptor is measured by competition in the binding of the radioligand by increasing concentrations of said substance;
  • Figure 1 schematically represents the sequence coding for the canine ⁇ 3 -adrenergic receptor and the location of human primers for the implementation of a PCR;
  • FIGS. 2A and 2B represent the visualization of the amplification product, from genomic DNA of a fragment of sequence coding for the ⁇ 3 -adrenergic receptor;
  • FIGS. 3A and 3B represent Southern blots of dog genomic DNA, hybridized with a canine RA- ⁇ 3 probe
  • FIG. 4 shows a restriction map of canine genomic DNA comprising the canine ⁇ 3- adrenergic gene (darkened area);
  • FIG. 5 shows an agarose gel obtained from canine genomic DNA cut by EcoRI and fractionated in different sizes between 8 and 4.8 Kb;
  • - Figure 6 shows a Sou thern blot of the agarose gel of Figure 5 and shows that the gene coding for canine RA- ⁇ 3 is mainly contained in fraction No. 2;
  • FIGS. 7 and 8 show the unique restriction sites contained in the 2649 bp fragment containing the sequence coding for canine RA- ⁇ 3;
  • FIG. 10 shows an experiment carried out with one of the two stable CHO-K1 clones selected, expressing the canine ⁇ 3 receptor;
  • FIG. 11 represents an experiment carried out with one of the two stable HEK293 clones selected, expressing the ⁇ 3-canine receptor;
  • FIGS. 12 and 13 show the unique restriction sites contained in the fragment of 2679 bp, containing the sequence coding for canine RA- ⁇ 2;
  • FIG. 15 represents a typical experiment carried out with two subclones expressing the canine ⁇ 2 receptor and a clone expressing the human ⁇ 2 receptor.
  • Example 1 Demonstration of a ⁇ 3-adrenergic receptor in dogs.
  • Amplification experiments by PCR were carried out on canine genomic DNA, using as primers two oligonucleotides, synthesized from the human ⁇ 3-adrenergic sequence.
  • the first, called 1269 (SEQ ID NO: 26) - corresponds to the start of the coding part of the canine gene.
  • the second, designated 1263 (SEQ ID NO: 9) and also comprising 18 nucleotides, corresponds to a part coding for the fifth transmembrane segment of the receptor, as illustrated in FIG. 1, in which the location of the oligonucleotides
  • the PCR reaction carried out under the conditions as defined in 2) below makes it possible to obtain an amplified fragment of approximately 643 base pairs, that is to say of the same order of magnitude as the corresponding human fragment.
  • This fragment is visualized by detection of a fluorescence, resulting from the fixation of ethidium bromide after electrophoretic migration in agarose gel.
  • the size of the fragment is determined using known molecular weight markers. In FIG. 2, a fragment with the expected size corresponding to a part of the canine adrenergic ⁇ 3-receptor gene is effectively seen.
  • FIG. 2A corresponds to the visualization by fluorescence in ethidium bromide of the fragments obtained after amplification on human (Hu) and dog (Dg) genomic DNA. Size markers (MW) are multiples of 123 bp (BRL).
  • FIG. 2B corresponds to the results of hybridization with a specific human ⁇ 3 probe.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction
  • RNAs are extracted from brown adipose tissue of puppies, by the method using guanidium thiocyanate, then the poly A + messenger RNAs are purified, using oligo (dT) columns (Pharmacia ref. 27- 9258-A).
  • CDNA is synthesized from 0.5 ⁇ g of said poly A + mRNA, using reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus (M-MLV Gibco-BRL ref. 510-8025 SA), then this cDNA is amplified by PCR, using the two human primers used in 1) [oligonucleotides 1269 (SEQ ID NO: 26) (sense primer) and 1263 (SEQ ID NO: 9) (antisense primer)] .
  • a solution containing the primers SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 9 is added to the neosynthesized cDNA at a concentration of 0.25 ⁇ M each, 10% of dimethyl sulfoxide, 2.5 U of Taq polymerase (CetusR , Perkin Elmer), the various dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), each at a concentration of 0.25 mM; the reaction buffer used is that recommended by Perkin Elmer.
  • the PCR is carried out on a Perkin Elmer "Gene Amp PCR System 9600" device, under the following conditions:
  • the 643 bp fragment was purified and subcloned into a plasmid vector (Bluescript; subclones R2, R5, R10, R11) and M13 tg 130 and tg 131 for the sequence.
  • a primer specific for the canine ⁇ 3 -adrenergic receptor was synthesized and is located at position 464 relative to the initiation codon ATG (RT1, SEQ ID NO: 3); it is used as a sense primer to clone a second fragment of the canine ⁇ 3-adrenergic gene.
  • RT1, SEQ ID NO: 3 initiation codon ATG
  • antisense primer a human primer (TR2, SEQ ID NO: 47) or, in other words "interspecies”, was chosen because the comparison of the ⁇ 3 -adrenergic sequences shows great similarity in this region.
  • the PCR reaction was carried out as follows:
  • the primers RT1 and TR2 are added at a concentration of 0.25 ⁇ M each, 10% dimethylsulfoxide, 2.5 U of Taq polymerase (Promega), 0.25 mM of dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), the reaction buffer used is that supplied by Promega supplemented with 1.5 mM MgCl 2 .
  • a LEP * Sçientific device, PREM TM is used to carry out this reaction. After an initial denaturation step (5 min. At 92 ° C), 30 cycles are made as follows: 1 min. at -92 ° C; 1 min. at 62 ° C; 1 min. 30 sec. at 72 ° C; and last 1 time 7 min. at 72 ° C.
  • Cloning by PCR makes it possible to obtain the coding part of the gene ranging from methionine in position 1 to cysteine in position 347.
  • These 1041 nucleotides comprise the coding sequence for the 7 transmembrane domains of the receptor.
  • Example 2 Isolation and identification of the canine ⁇ 3- adrenergic gene.
  • enzymes are: Xba I / Hind III
  • the canine RA- ⁇ 3 probes were prepared by
  • the radiolabelled probes are added, at a concentration of approximately 10 "cpm / ml of hybridization medium.
  • Exon 2 generally codes for 6 to 8 amino acids and the following sequence corresponds to the 3 'untranslated part, which makes it possible to conclude that the ⁇ 3 gene proper is contained in the genomic fragment EcoRI and Xba I of 3 , 7 kb, or more broadly framed by 2 EcoRI sites.
  • the genomic library was constructed in a lambda bacteriophage as follows:
  • the size marker used is "Lambda DNA Bst EU digest” (New England Biolabs ref. 301-4S).
  • a and B correspond to 2 digests of genomic DNA by EcoRI and lanes 1, 2, 3 correspond respectively to the following molecular weights: 1: 8 to 7 kb, 2: 7, 2 to 6 kb, 3: 6.3 to 4.8 kb.
  • the DNA was transferred onto a Nylon membrane (Hybond N + see Southern Blot conditions as set out above).
  • Hybond N + see Southern Blot conditions as set out above.
  • the same canine ⁇ 3 probes are used, the labeling having been done by "random priming" using only the dCTP ⁇ 32 P.
  • the hybridization and washing conditions are the same as above.
  • the bacteriophage is used as a vector.
  • the phage particles were packaged using Promega "Packagene R System” in vitro packaging extracts for 3 hours at 22 ° C.
  • the phage particles thus reconstituted are able to infect bacteria of an appropriate strain. This is the strain
  • LE 392 (Genotype: F-, hsdR 574 (r K -, m K + ), supE44, supF58, LacYl or ⁇ (lacIZY) 6, ga1K2, Ga1T22, metB1, trpR55).
  • a colony of these bacteria was cultured to obtain fresh cells to be infected by phages, the aim being to be able to spread the infected bacteria on petri dishes containing a mili nutritious, in order to be able to screen with a radiolabelled probe.
  • the probe was made by PCR on canine genomic DNA with the primers SEQ ID NO: 26 (1269) and SEQ ID NO: 47 (TR2).
  • PCR conditions were as follows: primers at a concentration of 0.25 ⁇ M; buffer comprising 10% dimethyl sulfoxide, 2.5 U of Taq polymerase (Promega), 0.25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), the reaction buffer used is that supplied by Promega, supplemented with 1.5 mM MgCl 2 .
  • the 1041 nucleotide PCR fragment (ATG) -
  • TM7 was isolated from an agarose gel and then purified by Spin - X TM (Costar 0.22 ⁇ M cellulose acetate).
  • the radiolabelling was done by random priming, as specified above, using dCTP ⁇ 32 P (Amersham ref. PB 10205).
  • the hybridization conditions are the same as those described above (Southern Blot).
  • the membranes were washed with a solution comprising 3 mM NaCl, 0.3 mM Na-citrate, 0.05% SDS, at 45 ° C for 30 min.
  • the gene was sequenced on the 2 strands (Subclones 4S and 4AS) using primers specifically synthesized.
  • the primers used on the sense strand (4S), in sequential order, are as follows: SEQ ID NO: 14 (SG 2), SEQ ID NO: 15 (RT 3), SEQ ID NO: 3 (RT 1) , SEQ ID NO: 16 (RT 5), SEQ ID NO: 17 (RT 6), SEQ ID NO: 18 (RT 9), SEQ ID NO: 20 (RT 17), SEQ ID NO: 22 (RT 16) , SEQ ID NO: 19 (RT 26), SEQ ID NO: 21 (RT 27) and SEQ ID NO: 23 (RT28).
  • results obtained show the nucleotide sequence of the canine ⁇ 3-adrenergic gene composed of a region coding for the protein (1196 bp in exon 1 plus 22 bp in exon 2), and non-coding regions
  • the unique restriction sites contained in the 2649 bp fragment are positioned in FIGS. 7 and 8.
  • the comparison of the coding regions of the canine and human ⁇ 3 -adrenergic genes indicates a strong homology (82%) (FIG. 9); however, the differences observed, both structural and pharmacological, highlight the importance of the isolation of the canine ⁇ 3 -adrenergic receptor.
  • the canine ⁇ 3-adrenergic sequence codes for a protein of 405 amino acids and carries the structural characteristics of the ⁇ 3 -adrenergic receptors, in particular the seven hydrophobic regions which probably correspond to transmembrane segments.
  • e1 extracellular part
  • NTS and NTS glycosylation sites
  • exon 1 code for the majority of the open phase ranging from the initiation codon "ATG" in position 1, to the sequence GAC GG / in position 1196; the intronic sequence comprises 703 bp.
  • the splicing signals are underlined / gt .......... ag / (see also Maniatis vol. 3 page 16.7 and van Spronsen, Eur. J. Biochem. 213, 1117 - 1124 (1993)).
  • the vector pcDNA 3 (Invitrogene) can transform eukaryotic cells in culture in a way stable and transient and express the cloned genes, dependent on the CMV promoter (Cytomegalovirus).
  • the canine ⁇ 3-adrenergic sequence shows a BspE I site at 54 bases before the ATG codon.
  • the subcloning was done by taking the BspE I sites in 5 'and EcoRI in 3' of the gene.
  • the 2590 bp fragment was ligated into the vector pcDNA 3 as follows:
  • Example 3 Pharmacological properties of the expression product of the canine ⁇ 3 gene.
  • the plasmid pcDNA3 containing the canine adrenergic ⁇ 3 receptor gene was transfected into CHO-K1 cells by a lipofectin transfection method (Gibco); the transfected cells are selected with geneticin (G418).
  • CHO-K1 cells are grown at confluence in a culture medium containing: 50% DMEM medium, 50% Ham's F12 medium, 10% heat-inactivated fetal calf serum and glutamine
  • 1 ⁇ g of DNA from the canine pcDNA3 ⁇ 3 plasmid is mixed with 5 ⁇ l of lipofectin (GIBCO) and 1 ml of the culture medium described, without serum. This mixture is added to the cells in culture, which are incubated for 5 hours at 37 ° C. The medium is then replaced by the above-mentioned culture medium containing serum and the cells are again incubated for 48 hours.
  • GEBCO lipofectin
  • the cells are then diluted and distributed in 96-well plates and incubated at selection pressure, that is to say in the aforementioned culture medium containing geneticin (G418 GIBCO) 400 ⁇ g / ml for approximately 20 days, the medium being changed every other day.
  • selection pressure that is to say in the aforementioned culture medium containing geneticin (G418 GIBCO) 400 ⁇ g / ml for approximately 20 days, the medium being changed every other day.
  • the COS-1 cells are cultivated at confluence in a culture medium containing: 90% of DMEM medium, 10% of heat-inactivated fetal calf serum, 2 mM glutamine and 10 mM HEPES. 48 hours before transfection, the cells are washed, detached with trypsin and seeded at 1.7 ⁇ 10 4 cells / cm in 6-well plates.
  • the COS-1 cells are washed twice in PBS buffer, each well is incubated with 1 ml of DMEM transfection medium containing 1 ⁇ g of pcDNA3 / r ⁇ 3 (miniprep) and 20 ⁇ l of DEAE-Dextran (10 mg / ml) previously mixed and 8 ⁇ l of 10 mM chloroquine, for 4 to 6 hours at 37 ° C.
  • the transfection medium is aspirated and the cells are incubated with 10% DMSO in DMEM medium for exactly 90 seconds.
  • the cells are then washed with PBS and 3 ml of DMEM medium containing 10% serum are added to all the wells.
  • the membrane preparation for the binding tests and the accumulation of cAMP on whole cells are carried out 48 to 72 hours after the transfection.
  • HEK293 cells Stable transfection of HEK293 cells: The canine adrenergic pcDNA3 / r ⁇ 3 plasmid was transfected into HEK293 cells by a lipofectin transfection method (Gibco) as described in a); the transfected cells are selected with geneticin (G418) 500 ⁇ g / ml.
  • the cell culture medium is removed, the cells are washed with PBS and incubated with 1 ml / well in lysis buffer (hypotonic shock) containing 10 mM Tris / HCl pH 7.4, 1 mM EDTA and the inhibitors of PMSF proteases (0.5 mM) and leupeptin (5 ⁇ g / ml) for 10 minutes at 4 ° C, then homogenized, transferred to tubes for centrifugation and incubated again for 15 minutes at 4 ° C. The cells are then centrifuged for 60 minutes, at 4 ° C., 20,000 rpm (50,000 g) JA20 rotor. The membrane pellets are taken up in the storage buffer (25 mM Tris / HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 10% glycerol and protease inhibitors) and stored at -80 ° C.
  • lysis buffer hypertonic shock
  • the pre-influent cells (0.5 x 10 6 cells / well) are washed with Ham' ⁇ F12 medium, pH 7.4, containing 1 mM 3-isobutyl-methyl) xanthine (IBMX, Sigma) and HEPES 20 mM.
  • the cells are incubated for 25 min. at 37 ° C in 1 ml of medium, in the absence (basal level) or in the presence of 100 ⁇ M of (-) - isoproterenol
  • the reaction is stopped by centrifugation (3000 xg, 10 min, 4 ° C.) of the incubation medium containing the cells and not by washing ; the supernatant containing the ligand is eliminated and 500 ⁇ l of sodium hydroxide are added to the cell pellet.
  • the lysed cells are added to 1 N acetic acid, pH 7.4 and centrifuged at 3000 x g, 4 ° C, 10 minutes.
  • the binding measurements were carried out on membrane preparations made from COS-1 cells transfected for 72 hours.
  • the membrane aliquots 10-15 ⁇ g of protein per point, are incubated in a buffer containing Hank's saline solution (ref .: 010328 Eurobio catalog), 20 mM HEPES and 0.1% BSA (bovine serum albumin) , with 1 nM of ICYP (2000 Ci / mmol) in the presence or in the absence of increasing concentrations of competitor (1 pM-100 ⁇ M); inhibition of ICYP by (--- bupranonol 10 M makes it possible to estimate the non-specific binding.
  • the saturation curves were carried out in the presence of increasing concentrations of ICYP (1 pM to 4 nM) in the presence of (-) - bupranolol 10 -4 M (non-specific binding).
  • the tubes are incubated for 30 minutes at 37 ° C with shaking.
  • the reaction is stopped by filtration of the aliquots on a glass fiber filter saturated beforehand with 0.3% of polyethyleneimine, followed by 3 washes with 3 ml of ice-cold PBS (phosphate buffered saline) buffer.
  • the radioactivity retained on the filter is measured in a gamma counter (CompuGamma LKB 1282).
  • the canine adrenergic pcDNA3 / r ⁇ 3 plasmid was transfected into CHO-K1 cells as described in Example 3. After 3 weeks, 30 clones resistant to geneticin were selected.
  • FIG. 10 presents a typical experiment carried out with one of the two stable clones expressing the canine ⁇ 3 receptor (canine CHO-K1 ⁇ 3).
  • the accumulation of cAMP was measured simultaneously on this clone and on a stable CHO-K1 clone expressing the human ⁇ 3 receptor as a positive control (human CHO-K1 ⁇ 3).
  • (-) - isoproterenol was used at a concentration of 10 -4 M ( ⁇ so-4) and two ligands specific for the human ⁇ 3-adrenergic receptor, CGP12177A and
  • the dose-response curves made it possible to determine the values of the activation constants (Kact) and the intrinsic activities (IA, taking as reference the maximum activity of 1 '(-) - isoproterenol 10 M), for each ligand tested: (-) - norepinephrine, (-) - epinephrine, (-) - isoproterenol, CGP 12177A and CL 316,243.
  • Agonists specific for the adrenergic ⁇ 3 subtype such as CGP 12177A and CL 316,243 are also described here as agonists of the canine RA- ⁇ 3 receptor.
  • Bupranolol has an antagonistic activity on the canine ⁇ 3 receptor, as previously described for the human and murine ⁇ 3 receptors, whereas it is a partial agonist on the bovine ⁇ 3 receptor.
  • the saturation curves made it possible to determine the value of the dissociation constant of the radioligand ICYP for the canine ⁇ 3 receptor, K D of 4.7513.13 nM.
  • the competition curves were carried out on the same membrane preparations with the ligands: (-) - norepinephrine, (-) - epinephrine, (-) - isoproterenol, CGP 12177A and CL 316.243, for which the inhibition constants (Ki) have been determined.
  • FIG. 11 presents a typical experiment carried out with one of the two stable clones expressing the canine ⁇ 3 receptor.
  • the accumulation of cAMP was measured simultaneously on this clone and on a stable clone HEK293 expressing the human ⁇ 3 receptor as a positive control.
  • Physiological catecholamies, norepinephrine (NE) and epinephrine (PPE), a non-specific agonist (-) - isoproterenol (ISO) and two ligands specific for the human adrenergic ⁇ 3 receptor carazolol (cara) and CL316,243 have been used. All ligands were used at a concentration of 10 -4 M.
  • the canine ⁇ 2 -adrenergic gene was isolated from a cDNA library of brown adipose tissue from newborn puppies, built in the bacteriophage ⁇ gt 11.
  • RNAs were obtained from brown adipose tissue of puppies by the method using guanidium thiocyanate. Then, the poly A + messenger RNAs were purified using oligo (dT) columns (Pharmacia ref. 27-9258-A).
  • the next step was to synthesize the cDNA using the purified poly A + messenger RNA as a template, and as a primer for first strand synthesis an oligo (dT) 15 primer from the "RiboClone cDNA synthesis System" kit (Promega ref . C2100).
  • the synthesis of the first strand of cDNA is done using an enzyme (AMV reverse transcriptase), followed by the synthesis of the second strand using two enzymes acting at the same time (E. coli polymerase I and RNase H). Then the double-stranded cDNA is treated with T4 DNA polymerase, in order to obtain blunt ends.
  • the Promega C2100 kit was used for all these successive reactions.
  • the fractions between 1.3 and 2.3 kilobases (kb) are selected. This selective step is considered an enrichment, but it is not really a purification, in other words the cDNA molecules of neighboring sizes are not completely excluded.
  • the cDNA is deposited on a potassium acetate gradient (5 to 20%) and then centrifuged at 50,000 rpm (corresponds to 170,000-304,000 g in this rotor) for three hours at 22 ° C in a SW 55 rotor (Beckman). Then, 27 cDNA fractions were taken. After depositing a small amount of each fraction on a 0.8% agarose gel, we selected 4 fractions corresponding to the desired sizes. These fractions were mixed and then ligated with the vector ⁇ gt 11.
  • the bacteriophage ⁇ gt 11 used as a vector, comes from the "Protoclone Lambda gt 11 System” kit (Promega ref. T 301 / 0-2).
  • the phage DNA is digested with EcoRI and dephosphorylated. Dephosphorylation prevents the vector from closing in on itself.
  • the vector alone was also ligated and packaged in order to be able to know the background noise of this batch of ⁇ gt 11.
  • each phage dilution was incubated with Y1090 (r-) cells at 37 ° C for 30 minutes, and then these infected bacteria were spread on nutrient medium (LB agar) contained in petri dishes. The dishes are incubated overnight at 37 ° C., and the following day there are lysis plaques, each plaque corresponds to a recombinant phage.
  • LB agar nutrient medium
  • a radiolabelled probe As a radiolabelled probe, a fragment of about 600 base pairs (bp) of the human ⁇ 3-adrenergic gene (L.J. Emorine et al., 1989, Science, 245, 1118-1121) was used.
  • the probe includes the coding region ranging from the initiation codon (ATG) to the transmembrane domain 5 (TM 5).
  • Random Priming (Kit Boehringer ref. 1004 760), incorporating 50 ⁇ Ci of dATP ( ⁇ 32 P) and 50 ⁇ Ci of dCTP ( ⁇ 32 P) (Amersham ref. PB 10204 and ref. PB 10205 respectively).
  • DNA fingerprints of the lysis plaques on Hybond N + membranes were taken. These membranes were then hybridized with the probe in question, then washed and exposed overnight on autoradiography film.
  • ⁇ D1 The remaining positive clone, called ⁇ D1, was purified by four successive isolations, followed by hybridization with the human ⁇ 3-adrenergic probe.
  • the DNA of phage ⁇ D1 was prepared. This DNA was then cut with the restriction enzyme EcoRI in order to verify the insert size. It should indeed be noted that two fragments were obtained: one of 2.4 kb and one of 0.25 kb, which suggests the presence of an EcoRI site specific to the canine ⁇ 2-adrenergic gene, because the EcoRI site is unique on the vector ⁇ gt 11.
  • the 4 subclones were completely sequenced using the Sequenase version 2.0 kit (Amersham- United States Biochemical ref. 70770). The sequence was carried out using specific primers, which hybridize on the sense strand (H and 16.4) or on the antisense strand (D3 and 16.2). These primers are represented by the following sequences:
  • the canine ⁇ 2-adrenergic sequence codes for a protein of 415 amino acids SEQ ID NO: 2 and carries the structural characteristics of the ⁇ -adrenergic receptors, in particular the seven hydrophobic regions which probably correspond to transmembrane segments. In the extracellular part (el) there are two glycosylation sites (NRS and NGS) common to the other ⁇ 2-adrenergic receptors.
  • the intracellular C-terminal part (i4) is more conserved between the ⁇ 2-adrenergic receptors than between the ⁇ 3-adrenergic receptors.
  • the human sequence reveals an absence of 6 residues in position 360.
  • Three residues are absent in the canine ⁇ 2-adrenergic sequence in position 391 compared to the other ⁇ 2-adrenergic sequences.
  • FIG. 14 shows the comparison in amino acids of the various ⁇ 2-adrenergic receptors.
  • the EcoRI fragment of 2427 bp from clone "H” was purified and used as a probe. This DNA fragment was radiolabeled, as described above, by the Random Priming method. The probe thus prepared was used in genomic DNA hybridization experiments (Southern Blot), to estimate its specificity vis-à-vis the ⁇ 2-adrenergic gene. Canine genomic DNA was cut by the following restriction enzymes: EcoRI, Hind III, Bam HI, Xba I. After separation of the fragments in an electrophoretic field on 0.7% agarose gel, the DNA was transferred to a nylon membrane (Amersham, Hybond N +). This membrane was hybridized with the EcoRI probe then washed at low stringency and then autoradiographed.
  • the results indicate, for the EcoRI cut, a fragment of 8 to 8.5 kb, for the BamHI cut a fragment of about 20 kb, for the Xbal cut a fragment of 7.5 to 8 kb and for the Hind III cut. a 4 kb fragment.
  • the presence of a single band for each cut indicates that there are no other sequences highly homologous in the canine genome to the ⁇ 2-adrenergic gene.
  • Example 5 Construction of a vector for the expression of the canine ⁇ 2-adrenergic receptor.
  • the restriction map of the canine ⁇ 2-adrenergic gene indicates the presence of a site of cleavage by the enzyme Nae I, at position 154, ie
  • the DNA of the clone M13-H was digested with the enzymes Nae I and EcoRI, to release the fragment of 2273 bp containing the coding region of the gene ⁇ 2- adrenergic canine and part of the 3 'region not translated. This DNA fragment was purified, then inserted into the expression vector pcDNA 3 (Invitrogene), at the Bam HI and EcoRI cleavage sites.
  • the Bam HI ends of the vector were treated with the Klenow fragment of polymerase I, so as to obtain blunt ends (Maniatis and al., Molecular Cloning, 2nd edition, pages 5.40 to 5.43).
  • the Nae I cut generates blunt ends and after ligation, the recombinant canine pcDNA 3 / r ⁇ 2- canine adrenergic plasmid (subclone 41) was thus obtained.
  • the canine ⁇ 2-adrenergic receptor gene is then dependent on the strong promoter CMV (cytomegalovirus), which ensures overexpression of the gene once introduced into mammalian cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • Example 6 Study of the expression of the canine ⁇ 2 receptor in CHO-K1 cells.
  • the canine adrenergic pcDNA3 / r ⁇ 2 plasmid was transfected into CHO-K1 cells as described in Example 3. After approximately 3 weeks, 39 clones resistant to geneticin were selected.
  • FIG. 15 presents a typical experiment carried out with 2 subclones expressing the canine ⁇ 2 receptor (CHO-K1 ⁇ 2 canine 10 and CHO-K1 ⁇ 2 canine 31).

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Abstract

Séquences nucléotidiques codant pour certains récepteurs β-adrénergiques canins, notamment les récepteurs β2- (SEQ ID NO1) et les récepteurs β3- (SEQ ID NO24), ainsi qu'à l'utilisation de ces séquences comme sondes, pour l'expression des récepteurs β-adrénergiques canins, pour étudier la localisation tissulaire du récepteur exprimé (PCR, Northern blot), pour effectuer des mutagenèses dirigées et pour l'étude structure-fonction des récepteurs. Utilisation desdits récepteurs β-adrénergiques canins pour la préparation d'anticorps spécifiques. Procédé de criblage différentiel pour l'étude en affinité de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des récepteurs β3-adrénergiques canins et trousses ou kits pour l'étude de l'efficacité de différentes substances pour lesdits récepteurs β3-adrénergiques canins. De telles substances sont notamment utilisées pour le traitement sélectif de l'obésité des chiens ou d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité ou à toute autre pathologie faisant intervenir les récepteurs β3 canins.

Description

RECEPTEURS BETA-2 ET BETA-3 ADRENERGIQUES CANINS ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à des séquences nucleotidiques codant pour certains récepteurs β-adrénergiques canins, notamment les récepteurs β2- et les récepteurs β3-, ainsi qu'à l'utilisation de ces séquences comme sondes, pour l'expression des récepteurs β-adrénergiques canins, pour étudier la localisation tissulaire du récepteur exprimé (PCR, Northern blot), pour effectuer des mutagenèses dirigées et pour l'étude structure-fonction des récepteurs.
La présente invention est également relative à l'utilisation desdits récepteurs β-adrénergiques canins pour 1a préparation d'anticorps spécifiques.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage différentiel de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des récepteurs β3-adrénergiques canins et à des trousses ou kits pour la détection du degré d'affinité de différentes substances pour lesdits récepteurs β3-adrénergiques canins. De telles substances sont notamment utilisées pour le traitement sélectif de l'obésité des chiens ou d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité ou à toute autre pathologie faisant intervenir les récepteurs β3 canins.
Il est connu que les catécholamines telles que l'adrénaline et la noradrénaline, les agonistes synthétiques des récepteurs β-adrénergiques, qui miment leurs fonctions biologiques et les antagonistes, qui bloquent ces fonctions biologiques, exercent leurs effets en se liant à des sites de reconnaissance (récepteurs membranaires) spécifiques, situés dans les membranes plasmiques des cellules. Deux classés principales de récepteurs adré- nergiques ont été définies, les récepteurs adrénergiques α et les récepteurs adrénergiques β.
Dans l'ensemble de ces deux classes, on distingue, maintenant, cinq sous-types de récepteurs aux catécholamines (α1, α2, β1, β2 et β3-RA). Leurs gènes ont été récemment isolés et identifiés (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163 ; B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656 ; T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6995-6999 ; L.J. EMORINE et al., 1989, Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récep- teurs membranaires intégraux présentant certaines homolo- gies (R.A.F. DIXON et al., 1988, Annual Reports in Médicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988, Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des pro- téines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Ces récepteurs membranaires, lorsqu'ils ont fixé le ligand approprié (agoniste ou antagoniste), subissent un changement de conformation, qui induit (agoniste) ou bloque (antagoniste) un signal intracellulaire, qui modifie le comportement de la cellule cible.
Dans le cas où des agonistes se lient à des récepteurs β-adrénergiques (RA-β), ils activent une classe de protéines G, qui stimule à son tour l'activité de 1' adénylyl cyclase, alors que les antagonistes se lient à des RA-β, mais n'activent pas 1'adénylyl cyclase.
Lorsque l'a'énylyl cyclase est activée, elle catalyse la production d'un médiateur intracellulaire ou second messager, notamment l'AMP cyclique. Les Inventeurs ont participé à la mise en évidence de nouveaux récepteurs β-adrénergiques chez l'homme, dénommés RA-Huβ3, chez la souris (Demande Internationale WO 92/12246), dénommés RA-Muβ3 et chez les bovins (Demande Internationale WO 94/24162), dénommés RA- Boβ3, caractérisés par des propriétés différentes de celles des récepteurs β1 et β2, notamment en ce qu'ils se comportent de façon différente vis-à-vis de substances respectivement antagonistes et agonistes des récepteurs β1 et β2 (Demande Internationale WO 90/08775).
Le récepteur RA-Huβ3 est plus particulièrement constitué par une séquence de 408 amino-acides (VAN SPRONSEN A. et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 1117- 1124) et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-Muβ3 est constitué par une séquence de 400 amino- acides (VAN SPRONSEN et al., précité) alors que le récepteur RA-Boβ3 est constitué par une séquence de 405 amino- acides, ces deux dernières séquences comportant également sept régions transmembranaires.
Les travaux antérieurs concernant le RA-Huβ3, le RA-Muβ3 et le RA-Boβ3 ont montré que le récepteur β3- adrénergique intervient dans les maladies telles que le diabète et/ou l'obésité ; il est préférentiellement exprimé dans le tissu adipeux qui joue un rôle important dans le métabolisme.
Un certain nombre de travaux ont mis en évidence l'existence in vivo de récepteurs β2 et β3 adréner- giqueε canins ; toutefois, il n'avait pas été possible jusqu'à présent d'isoler ni les séquences codantes, ni ces récepteurs β2 et β3 adrénergiques canins, toutes les tentatives en ce sens ayant échoué (CHAMPIGNY O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10774-10777 ; HOLLOWAY B.R. et al., Int. J. Obes., 1985, 9, 423-432 ; HOLLOWAY B.R. et al., Br . J. Pharmacol., 1991, 104, 97- 104 ; VALLET P. et al., J. Pharmacol. and Exp. Therap., 1988, 249(1), 271-277 ; TAOUIS M. et al., J. Pharmacol. and Exp. Therap., 1987, 242(3), 1041-1049 ; ASHWELL M., Int. J. Obes., 1987, 11(4), 357-365 ; LANGIN D. et al., Eur. J. Pharmacol., 1991, 199, 291-301).
Poursuivant leurs travaux dans cette voie, les Inventeurs ont cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrenergique β3 chez les chiens (RA-Caβ3) et à le distinguer des autres récepteurs β-adrénergiques (RA-β2, notamment), afin de mettre au point des agents thérapeutiques spécifiques au chien.
La présente invention a pour objet des séquences nucleotidiques isolées, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une séquence d'ADN codant pour un récepteur β-adrénergique canin sélectionné dans le groupe constitué par l'ADNc codant pour le récepteur β2- adrenergique canin, de séquence SEQ ID NO:1 et par l'ADN codant pour le récepteur β3-adrénergique canin, de séquence SEQ ID NO: 24.
Dans le cadre de la présente invention, les récepteurs β3 et β2 adrénergiques canins ont effectivement été isolés, ce qui donne la possibilité soit de mettre au point des traitements sélectifs pour les chiens après définition d'un profil pharmacologique distinct de celui défini pour les récepteurs β3 humains, murins et bovins, soit de disposer de produits spécifiques d'un sous-type de récepteur : β3 canin spécifique ou β2 canin spécifique.
Le fait d'avoir effectivement isolé à la fois le récepteur β3- et le récepteur β2-adrénergiques canins, permet d'utiliser ce dernier en tant que témoin de comparaison pour la mise au point de traitements spécifiques du chien, dans le's maladies concernées par le récepteur β3-adrenergique (obésité essentiellement).
La présente invention a également pour objet des sondes nucleotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucleotidique telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Les conditions d'hybridation des sondes sont définies comme suit :
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes :
* conditions d'hybridation des sondes β3 :
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. (sodium dodécylsulfate) ; 10 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 42°C.
Les lavages sont effectués dans une solution contenant 3 mM de NaCl ; 0 , 3 mM de citrate de sodium ;
0,05 % de S.D.S., à 50°C, pendant 30 minutes à 1 heure.
* Conditions d'hybridation des sondes β2 :
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HCl, pH
7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. ; 10 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 42°C.
Les lavages sont effectués dans une solution contenant 15 mM de NaCl ; 1,5 mM de citrate de sodium ;
0,05 de S.D.S., à 45°C, pendant 45 min. Pour les- sondes plus longues, c'est-à-dire présentant plus de 100- nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont celles indiquées précédemment pour les sondes plus courtes, mais dans lesquelles le milieu sus-défini contient 40 à 50 % de formamide au lieu de 10 à 25 %.
Dans les conditions exposées ci-dessus, les sondes issues de la SEQ ID N°1 ne s'hybrident qu'avec les récepteurs RA-Caβ2, alors que les sondes issues de la SEQ ID N° 24 ne s'hybrident qu'avec le récepteur RA-Caβ3.
La présente invention a également pour objet des protéines (récepteurs β2- et β3-adrénergiques), caractérisées en ce qu'elles sont codées par une séquence nucleotidique telle que définie ci-dessus et sont sélec- tionnees dans le groupe constitué par la SEQ ID NO : 2 (récepteur RA-Caβ2) et la SEQ ID NO: 25 (RA-Caβ3).
Les récepteurs β2 et β3 canins activent l'adénylyl cyclase ; toutefois, le couplage entre les récepteurs et l'adénylyl cyclase par l'intermédiaire des protéines G, est déficient dans des cellules murines CHO- Kl (réf.: ATCC CRL 9618, ATCC Catalogue of Cell Unes & Hybridomas, 7ème édition, 1992) et CHW, en ce qui concerne le récepteur β2 canin et CHO-K1, pour le récepteur β3 canin. Cela implique une perte d'activité des récepteurs β2- et β3-adrénergiques canins dans ces cellules, bien qu'ils y soient effectivement exprimés.
L'activité du récepteur β3 canin exprimé dans les cellules CHO-K1 se distingue de l'activité β3 d'autres espèces (homme, boeuf), exprimé dans les mêmes cellules, en ce qu'elle est nulle lorsque le récepteur est clone et exprimé dans des cellules CHO-K1, alors qu'elle est forte, quand il est exprimé dans les cellules de singe COS-1 (réf.: ATCC CRL 1650, ATCC Ca talogue of Cell Unes & Hybridomas , 7ème édition, 1992). Ledit récepteur présente, dans les cellules COS-1, dans lesquelles il - y a à la fois expression et couplage corrects, les activités des récepteurs β3- adrénergiques, à savoir, il active l'adénylyl cyclase en présence de l'un des agoniste suivants : (-)-isoprotéré- nol, (-)-épinéphrine, (-)-norépinéphrine, CGP12177A, CL316,243.
La présente invention a également pour objet des fragments desdites protéines d'au moins 6 amino- acides, correspondant à un épitope apte à produire des anticorps dans des conditions convenables, telles que décrites dans GUILLAUME JL. et al. (Eur. J. Biochem., 1994, 224, 761-770)
La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés spécifiquement contre le récepteur β3-adrenergique canin ou contre l'un de ses épitopes, lesquels anticorps ne reconnaissent que ledit récepteur β3 -adrenergique canin ou l'un de ses épitopes et ne reconnaissent ni les récepteurs β1-, ni les récepteurs β2- adrénergiques canins.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucleotidique conforme à l'invention.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide, qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant ap- proprié, comprenant en particulier une origine de répli- cation dans un micro-organisme hôte convenable, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bac téries ou cellules eùcaryotes, et dans lequel vecteur est insérée une séquence nucleotidique ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un récepteur β2- ou β3- adrenergique canin.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide recombinant d'expression dans lequel est insérée, au niveau d'un lieur multisite, la séquence codant pour le récepteur β2- ou le récepteur β3 -adrenergique canin ; un plasmide contenant la séquence codant pour le récepteur β3 -adrenergique canin a été dénommé pcDNA3/rβ3 adrenergique canin ou « Beta3 canine-ADR » et a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 9 février 1996 sous le n° I-1672 ; un plasmide contenant la séquence codant pour le récepteur β2-adrenergique canin a été dénommé pcDNA3 /rβ2-adrenergique.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide recombinant d'expression, conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer une protéine, d'origine canine, ayant une activité de récepteur β2- ou β3-adrenergique.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules CHO-Kl (expression stable non couplée à l'activité adénylyl cyclase) et COS-1 (expression transitoire et couplage à l'adénylyl cyclase).
Un autre des micro-organismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli . De manière avantageuse, les récepteurs selon l'invention constituent un outil pour la détection de ligands spécifiques intervenant dans l'activation ou l'inhibition de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands β-adrénergiques spécifiques des récepteurs β3 canins, en comparant les résultats obtenus à l'aide à la fois des séquences codant pour le récepteur β2- et des séquences codant pour le récepteur β3-adrenergique canin.
Conformément à l'invention, le procédé de criblage différentiel pour l'étude de l'affinité en liaison de substances et la sélection et l'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un récepteur β3 -adrenergique canin conforme à l'invention comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression tel que défini ci-dessus, laquelle cellule hôte exprime ledit récepteur adrénergi- que β3 canin, le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et permet le couplage adénylyl cyclase/récepteur par l'intermédiaire des protéines G, laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre le récepteur et ladite substance s'il y a lieu,
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression du récepteur β2-adréner- gique canin, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-protéine.
Un tel procédé permet de définir le profil pharmacologique du récepteur soit β3 canin (lorsque la substance étudiée est mise en contact avec le récepteur β3), soit β2 canin (lorsque la substance étudiée est mise en contact avec le récepteur β2). L'analyse et la comparaison de ces deux profils permettent de mettre en évidence les ligands spécifiques de chacun des sous-types.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé pour l'étude de l'efficacité d'une substance ayant une activité soit agoniste, soit antagoniste, vis- à-vis du récepteur étudié, lequel procédé comprend :
- la transformation d'une cellule hôte appro- priée par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention exprimant le récepteur β3 -adrenergique canin ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur β3 codé par la séquence nucleotidique, et le transfert du récepteur β3 exprimé vers la membrane de ladite cellule, de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur β3 soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée ;
- la mise en contact de ladite cellule hôte transformée avec ladite substance ; et
- la mesure de l'accumulation du second messager AMPc , induite par la liaison de ladite substance sur son récepteur et la stimulation de l'effecteur adénylyl cyclase par l'intermédiaire d'une protéine G.
L'invention a, en outre, pour objet un kit pour la détection de l'affinité de liaison éventuelle d'un ligand pour un récepteur conforme à l'invention et/ou pour la détection de l'activité dudit ligand vis- à-vis du récepteur étudié, lequel kit comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'un récepteur β3 canin codé' par une séquence nucleotidique conforme à l'invention, contenue dans un plasmide recombinant dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur β3 ;
l'affinité de ladite substance pour le récepteur est mesurée par compétition de la liaison du radioligand par des concentrations croissantes de ladite substance ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique dudit ligand sur le récepteur β3 exprimé.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
* en ce qui concerne le récepteur β3- adrénerσique canin :
- la figure 1 représente schématiquement la séquence codant pour le récepteur β3 -adrenergique canin et l'emplacement des amorces humaines pour la mise en œuvre d'une PCR ;
- les figures 2A et 2B représentent la visualisation du produit d'amplification, à partir d'ADN géno- mique d'un fragment de séquence codant pour le récepteur β3 -adrenergique ;
les figures 3A et 3B représentent des Southern blots de l'ADN génomique de chien, hybride avec une sonde RA-β3 canin ;
- la figure 4 représente une carte de restriction de l'ADN génomique canin comportant le gène β3- adrénergique canin (zone noircie) ;
- la figure 5 représente un gel d'agarose obtenu à partir d'ADN génomique canin coupé par EcoRI et fractionné en tailles différentes entre 8 et 4,8 Kb ; - la figure 6 représente un Sou thern blot du gel d'agarose de la figure 5 et montre que le gène codant pour le RA-β3 canin est contenu majoritairement dans la fraction n° 2 ;
- les figures 7 et 8 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2649 pb contenant la séquence codant pour le RA-β3 canin ;
- la figure 9 est une comparaison des séquences en acides aminés entre RA-Caβ3 et RA-Huβ3 ;
- la figure 10 représente une expérience réalisée avec l'un des deux clones stables CHO-K1 sélectionnés, exprimant le récepteur β3 canin ;
la figure 11 représente une expérience réalisée avec l'un des deux clones stables HEK293 sélec- tionnés, exprimant le récepteur β3-canin ;
* en ce qui concerne le récepteur β2- adrénerσique canin :
- les figures 12 et 13 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb, contenant la séquence codant pour le RA-β2 canin ;
- la figure 14 est une comparaison des différents récepteurs β2 ; et
- la figure 15 représente une expérience typique réalisée avec deux sous-clones exprimant le récepteur β2 canin et un clone exprimant le récepteur β2 humain.
Exemple 1 : Mise en évidence d'un récepteur β3- adrénergique chez le chien.
1) Amplification d'un fragment du gène β3 canin par PCR :
Des expériences d'amplification par PCR ont été réalisées sur ADN génomique canin, en utilisant comme amorces deux oligonucléotides, synthétisés à partir de la séquence β3-adrenergique humaine. Le premier, dénommé 1269 (SEQ ID NO:26) - correspond au début de la partie codante du gène canin. Le- second, dénommé 1263 (SEQ ID NO: 9) et comprenant également 18 nucléotides, correspond à une partie codant pour le cinquième segment transmem- branaire du récepteur, comme illustré à la figure 1, dans laquelle la localisation des oligonucléotides
Figure imgf000015_0001
utilisés comme amorces pour la réaction PCR est représentée .
La réaction PCR réalisée dans les conditions telles que définies en 2) ci-après permet d'obtenir un fragment amplifié d'environ 643 paires de bases, c'est-à- dire du même ordre de grandeur que le fragment humain correspondant. Ce fragment est visualisé par détection d'une fluorescence, résultant de la fixation de bromure d'ethidium après migration electrophoretique en gel d'agarose. La taille du fragment est déterminée à l'aide de marqueurs de poids moléculaires connus. Sur la figure 2, on voit effectivement un fragment à la taille attendue correspondant à une partie du gène du récepteur β3- adrenergique canin.
La figure 2A, correspond à la visualisation par fluorescence en bromure d'ethidium des fragments obtenus après amplification sur ADN génomique humain (Hu) et de chien (Dg) . Les marqueurs de taille (MW) sont des multiples de 123 pb (BRL). La figure 2B correspond aux résultats de l'hybridation avec une sonde humaine β3 spécifique.
Ces résultats montrent une forte homologie entre les récepteurs β3 -adrenergique canin et humain, du fait que le fragment amplifié correspond à la région amino-terminale et aux cinq premiers domaines transmembranaires qui sont les parties les mieux conservées dans les divers récepteurs couplés aux protéines liant le GTP.
Toutefois, les particularités du couplage récepteur-adénylyl cyclase illustrent l'utilité et la nécessité de tels récepteurs β3 -adrénergiques canins pour les applications précitées.
2) Clonage d'une partie du gène β3 adrenergique canin par PCR :
Le fragment de 643 pb, observé en 1) est clone par la méthode dite "RT-PCR" (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction).
Pour ce faire, les ARN totaux sont extraits de tissu adipeux brun de chiots, par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidium, puis on purifie les ARN messagers poly A+, à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. 27-9258-A).
On synthétise de l'ADNc, à partir de 0,5 μg dudit ARNm poly A+, à l'aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV Gibco- BRL réf. 510-8025 SA), puis on amplifie cet ADNc par PCR, à l'aide des deux amorces humaines utilisées en 1) [oligonucléotides 1269 (SEQ ID NO: 26) (amorce sens) et 1263 (SEQ ID NO : 9 ) (amorce anti-sens)].
Les conditions de mise en oeuvre de la réaction PCR sont les suivantes :
On ajoute à l'ADNc néosynthétisé , une solution contenant les amorces SEQ ID NO: 26 et SEQ ID NO : 9 à une concentration de 0,25 μM chacune, 10 % de diméthyl- sulfoxide, 2,5 U de Taq polymerase (CetusR, Perkin Elmer), les différents dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), chacun à une concentration de 0,25 mM ; le tampon de réaction utilisé est celui préconisé par Perkin Elmer.
La PCR est réalisée sur un appareil Perkin Elmer "Gène Amp PCR System 9600", dans les conditions suivantes :
Après une étape de dénaturation initiale (2 min. à 94°C), on réalise 29 cycles comme suit : 15 sec. à 94°C ; 30 sec. à 56°C ; 30 sec. à 72°C et en dernier une fois 3 min. à 72°C. Pour obtenir un rendement important en fragment amplifié, après avoir obtenu le fragment attendu, on procède à une nouvelle amplification, dans les mêmes conditions que ci-dessus, à partir de 1 μl de la solution obtenue après dilution d'une petite partie du produit obtenu après la première PCR au 1/10, afin d'enrichir l'échantillon en fragment recherché, avant le clonage. L'ensemble des fragments obtenus sont traités à la Klenow polymérase pour rendre les bouts francs (Maniatis et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43).
Le fragment de 643 pb a été purifié et sous- cloné dans un vecteur plasmidique (Bluescript ; sous- clones R2, R5, R10, R11) et M13 tg 130 et tg 131 pour la séquence.
En se basant sur cette séquence, une amorce spécifique du récepteur β3 -adrenergique canin a été synthétisée et se situe en position 464 par rapport au codon d'initiation ATG (RT1, SEQ ID NO:3) ; elle est employée comme amorce sens pour cloner un 2ème fragment du gène β3-adrenergique canin. Comme amorce anti-sens, une amorce humaine (TR2, SEQ ID NO:47) ou, autrement dit "interespèce", a été choisie car la comparaison des séquences β3 -adrénergiques montre une grande similitude dans cette région.
La réaction PCR a été faite comme suit :
A 700 ng d'ADN génomique canin, on ajoute les amorces RTl et TR2 à une concentration de 0,25 uM chacune, 10 % diméthylsulfoxide, 2,5 U de Taq polymerase (Promega) , 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , le tampon de réaction utilisé est celui fourni par Promega complémenté par 1,5 mM de MgCl2.
Un appareil LEP* Sçientific, PREM™ est utilisé pour réaliser cette réaction. Après une étape de dénaturation initiale (5 min. à 92°C) , on fait 30 cycles comme suit: 1 min. à -92°C; 1 min. à 62°C; 1 min. 30 sec. à 72°C; et en dernier 1 fois 7 min. à 72°C.
Dans ces conditions, on obtient un fragment de 577 pb. Avant la ligation dans un vecteur, ce fragment est traité à la Klenow polymerase et ensuite isolé sur gel de polyacrylamide à 5%. Ce fragment a été sous-cloné dans le vecteur M 13 tg 130 (clonage à bouts francs dans le site EcoRV) dans les deux orientations (Clone 1 = sens, Clone 10 et 13 = anti-sens). Ce fragment correspond au gène β3-adrenergique canin allant de la région trans- membranaire 4 à la région transmembranaire 7.
Le clonage par PCR permet d'obtenir la partie codante du gène allant de la méthionine en position 1 jusqu'à la cystéine en position 347.
Ces 1041 nucléotides comprennent la séquence codante pour les 7 domaines transmembranaires du récepteur.
Exemple 2 : Isolement et identification du gène β3- adrénergique canin.
- Etude moléculaire du gène RA-β3 canin, construction d'une banque génomique :
Hybridation d'ADN génomique (Southern Blot) : D'abord l'ADN génomique canin a été coupé par différentes enzymes de restriction, afin de connaître les sites de restriction qui encadrent le gène RA- β3 canin :
1) Utilisation d'une seule enzyme : les enzymes utilisées sont : Xba I, Bam HI, Hind III et Eco RI
(10 μg d'ADN/coupure).
2) Utilisation de deux enzymes, simultané- ment : les enzymes
Figure imgf000018_0001
sont : Xba I/Hind III
Xba I/Bam HI ; Bam
Figure imgf000018_0002
ind III ; Eco RI/Xba I ; Eco RI/Hind III et Eco RI/
Figure imgf000018_0003
HI.
L'ADN coupé a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% et ensuite dénaturé en présence de NaOH 0,05 M, NaCl 1,5 M, puis transféré sur une mem- brane de Nylon (Hybond® N+ Amersham) en présence de NaCl 3 M ; Na-citrate 0,3 M ( =Southern Blot ) .
Les sondes RA-β3 canin ont été préparées par
PCR en utilisant les conditions décrites plus haut, et ensuite radiomarquees au 32P par la méthode du " random priming" utilisant le dCTPα32P et le dATPα32P.
Les membranes ont été mise en présence des sondes RA-β3 canin radiomarquees au phosphore 32 (= hybridation Southern) dans le milieu réactionnel sui- vant :
600 mM de NaCl ; 60 mM de Na-citrate ; Tris- HCl 8 mM pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 40 % de formamide ; 0 , 2 % de SDS ; 10 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
Après une préhybridation dans ce milieu à 42 °C pendant au moins une heure, les sondes radiomarquees sont ajoutées, à une concentration d'environ 10" cpm/ml de milieu d'hybridation.
L'hybridation est réalisée pendant une nuit
(12-16 h) à 42°C.
Les membranes ont été lavées avec une solution contenant 3 mM de NaCl ; Na-citrate 0,3 mM ; SDS à 0,05 %, à 50°C pendant 30 min ou 1 heure pour les frag- ments obtenus avec les deux enzymes. Après traitement, les membranes sont mises en contact avec un film radio- graphique (autoradiographie) pendant 3 jours (4 jours pour les coupures par deux enzymes) . La révélation de ce film fait apparaître des fragments de taille différente dans chaque piste correspondant à des enzymes différentes. Les figures 3A et 3B montrent les résultats obtenus à partir de deux Southern Blots , réalisés dans les conditions définies ci-dessus. Sur la figure- 3A, M = marqueur de tailles, X =
Xbal (6,4 kb), B = Bam HI (8 kb) , H = Hind III (>20 kb),
E = Eco RI (6 kb) ; sur la figure 3B, XH = Xba I-Hind III
(6,4 kb), XB = Xba I-Bam HI (4,3 kb), BH = Bam HI-Hind III (6,3 kb), EX = Eco Rl-Xba I (3,7 kb), EH = Eco RI-
Hind III (4,8 kb), EB = Eco RI-Bam HI (6 Kb).
Ces données ont permis d'établir une carte de restriction du fragment génomique canin qui contient le gène RA-β3 (figure 4). Ces expériences montrent que le gène RA-β3 canin est contenu dans un fragment génomique de 3,7 kb encadré par les sites de restriction Eco RI et Xba I .
La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologue au gène β3- adrénergique.
Les gènes RA-β3 des différentes espèces sont composés d'une région promotrice suivie d'une région codante d'environ 1,2 kb = exon 1, qui est le plus souvent interrompue par un intron d'environ 1 kb. L'exon 2 code en général pour 6 à 8 acides aminés et la séquence suivante correspond à la partie 3' non-traduite, ce qui permet de conclure que le gène β3 proprement dit est contenu dans le fragment génomique EcoRI et Xba I de 3,7 kb, ou alors plus largement encadré par 2 sites EcoRI.
C'est le fragment d'ADN génomique EcoRI de 6 kb qui a été sélectionné et qui est utilisé pour construire la banque d'ADN génomique.
- La banque génomique a été construite dans un bactériophage lambda comme suit :
1) Digestion d'ADN génomique
2x 100 μg d'ADN génomique canin ont été digérés par EcoRI (New England Biolabs) dans les conditions suivantes : 1,25 U d'enzyme/μg d'ADN, 10 mM de spermidine, tampon de réaction fournie par le fabricant ; incubation une nuit à 37°C.
Ensuite les fragments issus des coupures ont été déposés sur un gel d'electrophorese d'agarose à 0,7%. La migration a été effectuée à 20 V pendant 24 heures.
Pour enrichir la banque en fragments EcoRI contenant le gène recherché, trois fractions ont été découpées par dépôt et ceci par rapport au marqueur indi- quant les tailles de référence, c'est-à-dire allant de
1) 8 à 7 Kb,
2) 7,2 à 6 Kb,
3) 6,3 à 4,8 Kb
Le marqueur de taille utilisé est "Lambda DNA Bst EU digest" (New England Biolabs réf. 301-4S).
Ces six morceaux ont été traités séparément par Spin-X™ (Costar 0,22 μM cellulose acétate) afin d'en extraire l'ADN. Après précipitation à l'éthanol, les culots d'ADN ont été solubilisés dans 60 μl de tampon Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 1 mM EDTA (TE).
2 μl de chaque fraction ont été déposés sur gel d'agarose. Le résultat est illustré à la figure 5, dans laquelle A et B correspondent à 2 digestions d'ADN génomique par EcoRI et les pistes 1, 2, 3 correspondent respectivement aux poids moléculaires suivants : 1 : 8 à 7 kb, 2 : 7,2 à 6 kb, 3 : 6,3 à 4,8 kb.
De plus, une hybridation Southern a été effectuée pour connaître la fraction à liguer qui contient effectivement le gène RA-β3 canin. Pour ce faire, on fait migrer environ 750 ng de chaque fraction sur gel d'agarose.
Après electrophorese et dénaturation, l'ADN a été transféré sur membrane Nylon (Hybond N+ voir conditions Southern Blot telles qu'exposées ci-dessus). On utilise les mêmes sondes de β3 canin, le marquage ayant été fait par "random priming" utilisant uniquement le dCTP α32P. Les conditions d'hybridation et de lavage sont les mêmes que précédemment .
Après exposition pendant 2 jours, on obtient les résultats illustrés à la figure 6 ; le gène codant pur le RA-β3 canin est majoritairement contenu dans la fraction 2 :
les deux fractions n°2 venant des deux digestions (voir figure 6, dans laquelle 1, 2 et 3 ont la même signification que pour la figure 5) sont mélangées, afin de les liguer dans un vecteur bactériophagique.
2) Ligation dans un vecteur bactériophagique et encapsidation in vitro :
Comme vecteur, on utilise le bactériophage
Lambda λGEM-2 (Promega), déjà coupé par EcoRI et déphos- phorylé pour éviter qu'il ne se referme sur lui-même.
Le vecteur a été ligué avec des quantités croissantes de fragments EcoRI génomiques de la fraction 2 (voir figure 6) (Insert) : 1 μg V + 50ng I; 1 μg V + 100 ng I, 1 μg V + 150 ng I; puis 0,75 μg V + 200 ng I (V=λGEM-2, I=Insert).
Ligation à 4°C.
Après ligation, les particules des phages ont été encapsidées à l'aide d'extraits d' encapsidation in vi tro Promega "PackageneR System" pendant 3 heures à 22°C.
Après cette incubation, les particules des phages ainsi reconstituées sont en mesure d'infecter des bactéries d'une souche appropriée. Il s'agit de la souche
LE 392 (Génotype: F-, hsdR 574 (rK-, mK + ) , supE44, supF58, LacYl ou Δ(lacIZY)6, ga1K2, Ga1T22, metB1, trpR55).
Une colonie de ces bactéries a été mise en culture pour obtenir des cellules fraîches à infecter par les phages, le but étant de pouvoir étaler les bactéries infectées sur des boîtes de Pétri contenant un miliei nutritif, afin de pouvoir cribler avec une sonde radio- marquée. Pour ce faire, on dilue très fortement les phages encapsides avant de les mettre en contact avec les cellules bactériennes afin de pouvoir les étaler à une densité voulue, c'est-à-dire de pouvoir déterminer les titres de la banque (= nombre des phages recombinants obtenus).
Ainsi, on a pu déterminer que la banque ainsi construite comporte environ 377 000 phages.
3) Criblage de la banque :
Toute la banque a été étalée sur différentes boîtes de Pétri à l'aide des bactéries hôtes LE 392 et ensuite des empreintes sur membranes de nylon Hybond N+ (Amersham) ont été prises.
La sonde a été faite par PCR sur ADN génomique canin avec les amorces SEQ ID NO: 26 (1269) et SEQ ID NO: 47 (TR2).
Les conditions de PCR ont été les suivantes : amorces à une concentration de 0,25 μM ; tampon comprenant diméthylsulfoxide à 10 %, 2,5 U de Taq polymerase (Promega), 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), le tampon de réaction utilisé est celui fourni par Promega, complémenté avec 1,5 mM de MgCl2.
On utilise un appareil Perkin Elmer "Gène Amp PCR System 9600"®.
Après une étape de dénaturation initiale (2 min. à 94°C), on fait 30 cycles comme suit : 15 sec. à 94°C, 30 sec. à 63,6°C, 60 sec. à 72°C et en dernier 1 fois 3 min. à 72°C.
Le fragment PCR de 1041 nucléotides ("ATG" -
TM7 ) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et ensuite purifié par Spin - X™ (Costar 0,22 μM cellulose acétate).
Le radiomarquage a été fait par random priming, comme précisé ci-dessus, en utilisant du dCTPα32P (Amersham réf. PB 10205). Les conditions d'hybridation sont les mêmes que celles décrites plus haut (Southern Blot) .
Les membranes ont été lavées avec une solution comprenant 3 mM de NaCl, 0,3 mM de Na-citrate, 0,05 % de SDS, à 45°C pendant 30 min.
Après une exposition durant 4 jours, 7 signaux fortement positifs et 50 signaux faiblement positifs ont été trouvés ; seuls les signaux fortement positifs ont été pris en compte.
Après différentes étapes de purification, c'est le clone λ20,1 qui a été sélectionné pour des analyses plus poussées .
4) Analyse du clone λ20,1 :
L'ADN du phage λ20,l a été préparé et ensuite coupé par EcoRI (= site d'insertion) et par EcoRl-Xbal (= sites uniques sur le vecteur).
Les tailles trouvées sont les suivantes : EcoRI 6 Kb/EcoRI-Xbal 3,7 Kb et >2,3 Kb.
Ces résultats sont en accord avec les tailles trouvées par Southern Blot sur ADN génomique canin (voir carte de restriction plus haut).
5) Sous-clonage dans un vecteur M13 pour le séquençage :
Le fragment EcoRI du clone λ20,l a été sous- clone dans le vecteur M13 tg131 ; les sous-clones 20,1,9 et 20,1,4 sont des clones « anti-sens » dans ce vecteur et ceci par rapport à l'emplacement du primer universel M13. L' inseet du clone 20,1,4 aussi appelé 4AS a été séquence [voir plus loin 6)].
Pour avoir l'orientation opposée, un sous- clonage a également été réalisé à partir du clone 20,1,4 (4AS) . Sachant que la partie intéressante de l'insert EcoRI provenant de l'ADN génomique se situe plus précisément entre les sites EcoRI et Xbal sur un fragment de 3,7 Kb, ce fragment a été sous-cloné dans un vecteur M13 tg 130 dans ces mêmes sites. Plusieurs sous-clones ont été obtenus : EX 3, EX 4, Ex 5, Ex 6. Le clone EX 4 aussi appelé 4S a été sélectionné pour une analyse de séquence.
Le gène a été séquence sur les 2 brins (Sous- clones 4S et 4AS) à l'aide d'amorces spécifiquement syn- thétisées.
Les amorces utilisées sur le brin anti-sens
(4AS) sont, dans l'ordre séquentiel, les suivantes : primer universel M13 (-40) : SEQ ID NO:5 (TR 12), SEQ ID
NO: 6 (TR 15), SEQ ID NO : 7 (TR 24), SEQ ID NO : 4 (TR 22), SEQ ID NO:8 (TR 21), SEQ ID NO:13 (TR25), SEQ ID NO : 9
(1263), SEQ ID NO:10 (TR 7), SEQ ID NO: 11 (TR 8), SEQ ID
NO: 12 (TR 10).
Les amorces utilisées sur le brin sens (4S), dans l'ordre séquentiel, sont les suivantes : SEQ ID NO:14 (SG 2), SEQ ID NO:15 (RT 3), SEQ ID NO : 3 (RT 1), SEQ ID NO: 16 (RT 5), SEQ ID NO: 17 (RT 6), SEQ ID NO: 18 (RT 9), SEQ ID NO:20 (RT 17), SEQ ID NO:22 (RT 16), SEQ ID NO:19 (RT 26), SEQ ID NO:21 (RT 27) et SEQ ID NO:23 (RT28).
6) Résultats de séquence :
L' insert EcoRl-Xbal n'a pas été séquence en totalité mais juste la partie correspondant aux séquences suivantes : la séquence en 5' =112 nucléotides avant le codon d'initiation "ATG", la phase ouverte de lecture (exons 1 et 2), l'intron, ainsi que la séquence en 3' allant jusqu'au site EcoRI (=en tout 2649 pb).
Les résultats obtenus, montrent la séquence nucleotidique du gène β3-adrenergique canin composée d'une région codant pour la protéine (1196 pb dans l'exon 1 plus 22 pb dans l'exon 2), et des régions non codantes
(112 pb en 5' et 616 pb en 3'), ainsi que l'intron de 703 pb qui sépare les 2 exons.
Les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2649 pb sont positionnés sur les figures 7 et 8. La comparaison des régions codantes des gènes β3 -adrenergique canin et humain indique une forte homolo- gie (82%) (figure 9) ; toutefois, les différences observées, tant structurelles que pharmacologiques, mettent en valeur l'importance de l'isolement du récepteur β3 -adrenergique canin.
La séquence β3-adrenergique canine code pour une protéine de 405 acides aminés et porte les caractéristiques structurales des récepteurs β3 -adrénergiques, notamment les sept régions hydrophobes qui correspondent probablement à des segments transmembranaires. Dans la partie extracellulaire (e1) on trouve deux sites de gly- cosylation (NGS et NTS) communs aux autres récepteurs β3- adrénergiques.
Ainsi l'exon 1 code pour la majorité de la phase ouverte allant du codon d'initiation "ATG" en position 1, à la séquence GAC GG/ en position 1196 ; la séquence intronique comporte 703 pb.
L'épissage se fait comme suit :
pos . 1189* CTC GAC GG/g t g g g t
Leu Asp Gly
ttttt c a g/G GCT TCC TGG GGA ATC TCT TAG
Ala Ser Trp Gly Ile Ser (Stop) par rapport au codon d'initiation « ATG »
L'exon 2 code pour les 6 acides aminés ci- dessus.
Les signaux d'épissage sont soulignés / gt..........ag/ (voir aussi Maniatis vol. 3 page 16.7 et van Spronsen, Eur. J. Biochem. 213, 1117 - 1124 (1993)).
7) Sous-clonage dans un vecteur pour expression dans des cellules eucaryotes :
Le vecteur pcDNA 3 (Invitrogene) peut transformer les cellules eucaryotes en culture de manière stable et transitoire et exprimer les gènes clones, sous dépendance du promoteur CMV (Cytomegalovirus).
La séquence β3-adrénergique canine montre un site BspE I à 54 bases avant le codon ATG. Le sous-clo- nage a été fait en prenant les sites BspE I en 5' et EcoRI en 3' du gène.
Le fragment de 2590 pb a été ligué dans le vecteur pcDNA 3 comme suit :
1) - En pratique, l'ADN du clone 4S a été coupé par BspE I (New Enσland Biolabs). Le protocole comprend ensuite :
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme,
traitement à la Klenow polymerase (New England Biolabs) d'après Maniatis,
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme,
- coupure par EcoRI (New England Biolabs) et inactivation de l'enzyme 15 min. à 65°C et
- dépôt de la totalité sur gel d'agarose et purification du fragment de 2,5 kb par Spin-X.
2) - Ligation de ce fragment dans le vecteur σui a été préparé comme suit:
Coupure par Bam HI (New England Biolabs) ; inactivation de l'enzyme 15 min. à 65°C ; traitement à la Klenow polymerase (New England Biolabs) d'après Maniatis ; extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme et coupure par EcoRI (New England Biolabs) ; inactivation de l'enzyme 15 min. à 65°C.
On obtient ainsi plusieurs sous-clones, le n° 8 a été séquence pour vérifier le codon d'initiation "ATG" afin d'être sûr qu'il n'y a pas d'empêchement de la traduction du messager en protéine après transformation dans les cellules. Exemple 3 : Propriétés pharmacologiques du produit d'expression du gène β3 canin.
A. MATERIELS ET METHODES
I. Techniques de transfection
a) Transfection stable de cellules CHO-K1 :
Le plasmide pcDNA3 contenant le gène du récepteur β3 adrenergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 par une méthode de transfection à la lipofectine (Gibco) ; les cellules transfectées sont sélectionnées avec de la généticine (G418).
Méthode de transfection
Les cellules CHO-K1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 50 % de milieu DMEM, 50 % de milieu Ham's F12, 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et de la glutamine
2 mM.
1 μg d'ADN du plasmide pcDNA3 β3 canin est mélangé à 5 μl de lipofectine (GIBCO) et 1 ml du milieu de culture décrit, sans sérum. Ce mélange est ajouté aux cellules en culture, qui sont incubées 5 heures à 37°C. Le milieu est remplacé alors par le milieu de culture précité contenant du sérum et les cellules sont à nouveau incubées 48 heures.
Les cellules sont alors diluées et réparties dans des plaques de 96 puits et incubées en pression de sélection c'est-à-dire dans le milieu de culture précité contenant de la généticine (G418 GIBCO) 400 μg/ml pendant environ 20 jours, le milieu étant changé tous les deux jours.
Les clones obtenus sont ensuite sous-clonés et les sous-clones obtenus sont criblés pour leur capacité à lier de façon spécifique l'[125I]-cyanopindolol (ICYP) ainsi que leur capacité à stimuler l'adénylyl cyclase. b) Transfection transitoire de cellules COS-1:
Méthode de transfection
Les cellules COS-1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 90% de milieu DMEM, 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, de la glutamine 2 mM et de l'HEPES 10 mM. 48 heures avant la transfection les cellules sont lavées, décollées avec de la trypsine et ensemencées à 1,7.104 cellules/cm en plaques de 6 puits.
Le jour de la transfection, les cellules COS-1 sont lavées 2 fois en tampon PBS, chaque puits est incubé avec 1 ml de milieu DMEM de transfection contenant 1 μg de pcDNA3/rβ3 (miniprep) et 20 μl de DEAE-Dextran (10 mg/ml) préalablement mélangés et 8 μl de chloroquine 10 mM, pendant 4 à 6 heures à 37°C. Le milieu de transfection est aspiré et les cellules sont incubées avec 10 % de DMSO dans le milieu DMEM pendant exactement 90 secondes. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et 3 ml de milieu DMEM contenant 10 % de sérum sont ajoutés dans tous les puits. La préparation membranaire pour les essais de liaison et l'accumulation d'AMPc sur cellules entières sont réalisés 48 à 72 heures après la transfection.
c) Transfection stable de cellules HEK293 : Le plasmide pcDNA3/rβ3 adrenergique canin a été transfecté dans des cellules HEK293 par une méthode de transfection à la lipofectine (Gibco) comme décrit en a) ; les cellules transfectées sont sélectionnées avec de la généticine (G418) 500 μg/ml.
On utilise la même technique que celle décrite pour les cellules CHO-K1, à l'exception de différences mineures concernant la durée de deuxième incubation des cellules, après ajout du mélange plasmide et lipofectine
(incubation de 24 heures) et la concentration en génétii cine. II. Préparation de membranes de cellules COS-1 après transfection
L'activité de 1'adénylyl cyclase et les essais de liaison sont réalisés sur des préparations membra- naires de cellules COS-1 transfectées de façon transitoire comme expliqué ci-dessus.
Le milieu de culture des cellules est enlevé, les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec 1 ml/puits dans un tampon de lyse (choc hypotonique) contenant Tris/HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM et les inhibiteurs de protéases PMSF (0,5 mM) et leupeptine (5 μg/ml) pendant 10 minutes à 4°C, puis homogénéisées, transférées dans des tubes pour centrifugation et incubées de nouveau 15 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite centrifugées 60 minutes, à 4°C, 20 000 rpm (50 000 g) rotor JA20. Les culots membranaires sont repris dans le tampon de stockage (Tris/HCl 25 mM pH 7,4, 1 mM d'EDTA, 10 % de glycérol et les inhibiteurs de protéases) et stockés à -80°C.
III. Mesure de la production d'AMPc
* dans les cellules CHO-K1
Les cellules préconfluentes (0,5 x 106 cellules/puits) sont lavées avec du milieu Ham'ε F12 pH 7,4 contenant de la 3-isobutyl-méthyl) xanthine (IBMX, Sigma) 1 mM et de l'HEPES 20 mM. Les cellules sont incubées 25 min. à 37°C dans 1 ml de milieu, en l'absence (niveau basai) ou en présence de 100 μM d' (-)-isoprotérénol
(effet maximum), ou de 100 μM de forskoline (stimulation directe de l'adénylyl cyclase), ou 10 μM de ligand. L'ac- tivité antagoniste est testée, en pré-incubant les cellules avec 10 μM de ligand 10 min. avant l'ajout de l' (-)- isoprotérénol à une concentration sous-maximale de
10-8 M. La réaction est arrêtée par un lavage avec 1 ml de PBS [Phosphate Buffered Saline) et l'addition de 500 μl de soude 1 N. Après 20 min. à 37°C. Les cellules décollées et lysées sont reprises, ajoutées à de l'acide acétique 1 N, pH 7,4 et centrifugées à 3 000 x g, 4°C, 10 minutes. Le taux d'AMPc total contenu dans 50 μl de surnageant est déterminé en utilisant le kit de dosage Amersham (Kit 3H-cAMP Amersham réf. TRK 432). Les expériences ont toutes été réalisées 2 ou 3 fois en duplicats.
* dans les cellules HEK293 :
On utilise la même technique que celle décrite pour les cellules CHO-K1, ci-dessus, sauf que la réaction est arrêtée par centrifugation (3 000 x g, 10 min, 4°C) du milieu d'incubation contenant les cellules et non par lavage ; le surnageant contenant le ligand est éliminé et 500 μl de soude sont ajoutés sur le culot cellulaire. Après 20 minutes à 37°C, les cellules lysées sont ajoutées à de l'acide acétique 1 N, pH 7,4 et centrifugées à 3 000 x g, 4°C, 10 minutes.
IV. Mesure de 1a liaison
a) Méthode de liaison sur les clones stables CHO-K1 β3 canin
Les études de liaison sur les cellules CHO-K1 β3 canin ont été menées suivant le protocole décrit dans Tate et al., Eur . J. Biochem., 1991, 196, 357-361.
b) Liaison sur préparation membranaire
Les mesures de liaison ont été menées sur des préparations membranaires réalisées à partir des cellules COS-1 transfectées pendant 72 heures.
Les aliquots membranaires, 10-15 μg de protéines par point, sont incubés dans un tampon contenant une solution saline Hank's (réf.: 010328 catalogue Eurobio), de l'HEPES 20 mM et 0,1 % de BSA ( bovine sérum albumin) , avec 1 nM d'ICYP (2 000 Ci/mmol) en présence ou en l'absence de concentrations croissantes de compétiteur (1 pM-100 μM) ; l'inhibition de l'ICYP par le (---bupranonol 10 M permet d'estimer la liaison non spécifique. Les courbes dé saturation ont été réalisées en présence de concentrations croissantes d'ICYP ( 1 pM à 4 nM) en présence de (-)-bupranolol 10-4 M (liaison non spécifique).
Les tubes sont incubés 30 minutes à 37 °C sous agitation. L'arrêt de la réaction se fait par filtration des aliquots sur filtre en fibres de verre saturé préalablement avec 0,3 % de polyéthylèneimine, suivi par 3 lavages avec 3 ml de tampon PBS (phosphate buffered saline) glacé. La radioactivité retenue sur le filtre est mesurée dans un compteur gamma (CompuGamma LKB 1282) .
B. RESULTATS
Expression stable du récepteur β3 canin dans les cellules CHO-K1.
* Sélection des clones stables exprimant le récepteur β3 canin :
Le plasmide pcDNA3/rβ3 adrenergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines, 30 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Ces clones ont été testés pour leur capacité à lier le radioligand ICYP suivant le protocole décrit à l'exemple 3. Ce test permet d'évaluer le niveau d'expression des récepteurs à la membrane des cellules. Sept clones ont été ainsi sélectionnés pour leur bon niveau d'expression des récepteurs à la membrane plas- mique (le rapport de la liaison spécifique sur la liaison non spécifique était au moins supérieur à 5).
* Mesure de l'accumulation d'AMPc :
Deux clones ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adénylyl cyclase. La figure 10 présente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur β3 canin (CHO-K1 β3 canin). L'accumulation d'AMPc a été mesurée simultanément sur ce clone et sur un clone stable CHO-K1 exprimant le récepteur β3 humain comme contrôle positif (CHO-K1 β3 humain) .
L '(-)-isoprotérénol a été utilisé à la concentration de 10-4 M (ιso-4) et deux ligands spécifiques du récepteur β3-adrenergique humain, le CGP12177A et le
CL316,243 à la concentration de 10-4 M. Cette expérience a été réalisée au moins deux fois en duplicats avec deux différents clones.
Les résultats (figure 10) montrent que dans ce type cellulaire, à savoir les cellules CHO-K1, lorsque le récepteur β3 canin est exprimé à la membrane des cellules, il est peu ou pas couplé à l'effecteur adénylyl cyclase.
Expression transitoire et activité du récepteur β3 canin dans les cellules COS-1.
* Mesure de l'accumulation d'AMPc dans les cellules COS-1 exprimant le récepteur β3 canin.
Les courbes dose-réponse ont permis de déterminer les valeurs des constantes d'activation (Kact) et les activités intrinsèques (IA, prenant comme référence l'activité maximale de 1'(-)-isoprotérénol 10 M), pour chaque ligand testé : (-)-norépinéphrine, (-)- epinéphrine, (-)-isoprotérénol, CGP 12177A et CL 316,243.
Figure imgf000033_0001
L'ordre de potentialité des catécholamines physiologiques : la (-)-norépinéphrine, l'(-)-épine- phrine, et synthétique : 1'(-)-isoprotérénol, défini pour le récepteur β3 canin est similaire à celui déjà décrit pour les récepteurs β3 humain, de rongeurs et bovin (BLIN N. et al., Br. J. Pharmacol., 1994, 112, 911-919 ; PIETRI-ROUXEL F. et al., Eur. J. Biochem., 1995, 230, 350-358). Les agonistes spécifiques du sous-type β3 adrenergique comme le CGP 12177A et le CL 316,243 sont également décrits ici comme étant des agonistes du récepteur RA-β3 canin. Le bupranolol possède une activité antago- niste sur le récepteur β3 canin, comme précédemment décrit pour les récepteurs β3 humains et murins, alors qu'il est agoniste partiel sur le récepteur β3 bovin.
* Mesure de la liaison sur préparations membranaires de cellules COS-1 exprimant le récepteur β3 canin :
Les courbes de saturation ont permis de déterminer la valeur de la constante de dissociation du radio- ligand ICYP pour le récepteur β3 canin, KD de 4,7513,13 nM.
Les courbes de compétition ont été réalisées sur les mêmes préparations membranaires avec les ligands : (-)-norépinéphrine, (-)-epinéphrine, (-)-isoprotérénol, CGP 12177A et CL 316,243, pour lesquels les constantes d'inhibition (Ki) ont été déterminées.
Figure imgf000034_0001
L'ordre d'affinité des catécholamines (-)- norépinéphrine, (-)-epinéphrine et (-)-isoprotérénol correspond au profil décrit pour les récepteurs β3 adrénergiques humain, bovin et de rongeurs.
* Expression stable du récepteur β3 canin dans les cellules HEK293.
. Sélection des clones stables exprimant le récepteur β3 canin :
Ces clones ont été testés pour leur capacité à lier le radioligand ICYP suivant le protocole décrit en IV a) (méthode de liaison sur les clones stables...).
Ce test permet d'évaluer le niveau d'expression des récepteurs, à la membrane des cellules. Deux clones ont été ainsi sélectionnés pour leur bonne expression à la membrane plasmique (le rapport de la liaison totale sur la liaison non spécifique était au moins supérieur à 8).
. Mesure de l'accumulation d'AMPc :
Ces deux clones ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adénylyl cyclase.
La figure 11 présente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur β3 canin. L'accumulation d'AMPc a été mesurée simultanément sur ce clone et sur un clone stable HEK293 exprimant le récepteur β3 humain comme contrôle positif. Les catecholamies physiologiques, la norépinéphrine (NE) et 1 ' epinéphrine (EPI), un agoniste non spécifique l'(-)- isoprotérénol (ISO) et deux ligands spécifiques du récepteur β3 adrenergique humain le carazolol (cara) et le CL316,243 ont été utilisés. Tous les ligands ont été uti- lises à la concentration de 10-4 M. Cette expérience a été réalisée au moins deux fois en duplicats avec deux clones différents. Les résultats montrent que dans ce type cellulaire, à savoir les cellules HEK293, lorsque le récepteur β3 canin est exprimé à la membrane des cellules, il est couplé à l'effecteur adénylyl cyclase. Exemple 4 : Isolement et identification du gène β2- adrénergique canin.
1) Préparation d'ARN :
Le gène β2 -adrenergique canin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de chiots nouveaux-nés, construite dans le bactériophage λ gt 11.
Pour ce faire, les ARN totaux ont été obtenus à partir de tissu adipeux brun de chiots par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidium. Ensuite, les ARN messagers poly A+ ont été purifiés à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. 27-9258-A).
2) Synthèse d'ADNc :
L'étape suivante a consisté à synthétiser l'ADNc en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo (dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis System" (Promega réf. C2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait à l'aide d'une enzyme (l'AMV reverse transcriptase), suivie par la synthèse du deuxième brin à l'aide de deux enzymes agissant en même temps ( E. coli polymerase I et RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymerase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C2100 a été utilisé pour toutes ces réactions successives.
Une fois l'ADNc synthétisé, des adaptateurs comportant des sites EcoRI ont été ajoutés, afin de pouvoir l'insérer dans le bactériophage λ gt 11. Pour ce faire, le kit "EcoRI Adaptor Ligation System I" (Promega réf. C1900) a été utilisé. D'abord l'ADNc a été centrifugé à travers une matrice Sephacryl S-400 (kit), pour enlever les molécules de petite taille, ensuite les adaptateurs ont été ajoutés aux molécules d'ADNc par ligation (T4 DNA Ligase du kit) durant la nuit et une nouvelle centrifugation à travers une colonne Sephacryl S-400 a permis d'éliminer les adaptateurs non fixés. Avant de pouvoir insérer l'ADNc ainsi traité dans le vecteur λ gt 11, il faut phosphoryler ses adaptateurs à l'aide de l'enzyme T4 polynucléotide kinase, contenue dans le kit.
3) Sélection de molécules d'ADNc de grande taille :
Avant de liguer les molécules d'ADNc dans le vecteur λ gt 11, on sélectionne les fractions comprises entre 1,3 et 2,3 kilobases (kb). Cette étape sélective est considérée comme un enrichissement, mais ce n'est pas réellement une purification, autrement dit les molécules d'ADNc de tailles avoisinantes ne sont pas totalement exclues.
Pour ce faire, l'ADNc est déposé sur un gra- dient d'acétate de potassium (5 à 20%) et ensuite centrifugé à 50 000 rpm (correspond à 170 000-304 000 g dans ce rotor) pendant trois heures à 22°C dans un rotor SW 55 (Beckman). Ensuite, 27 fractions d'ADNc ont été prélevées. Après dépôt d'une petite quantité de chaque fraction sur un gel 0,8% agarose, nous avons sélectionné 4 fractions correspondant aux tailles voulues. Ces fractions ont été mélangées et ensuite liguées avec le vecteur λ gt 11.
4) Insertion (ligation) dans le bactériophage λ gt 11 :
Le bactériophage λ gt 11, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gt 11 System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
Plusieurs ligations ont été faites avec des petites quantités variables d'ADNc, chacune liguée avec 0,5 μg d'ADN de vecteur. Les ligations ont été faites pendant trois heures à température ambiante, en prenant la T4 DNA Ligase du kit Promega C1900 (voir plus haut). Tout de sϋite^ après, on procède à l'encapsidation in vi tro à l'aide des extraits "Packagene" fournis par le kit Promega T301/0-2 (voir plus haut) . Après une incubation à 22 °C durant deux heures et demie, les particules des phages ainsi reconstituées sont en mesure d'infecter des bactéries d'une souche appropriée. Il s'agit de la souche Y 1090(r-) (Génotype: Δ(LacU169), proA+,
Δ(lon); araD139, strA, SupF, (trpC22:Tn10 (tetr), (pMC9), hsdR(rK-, mk +). Une colonie de ces bactéries a été mise en culture pour obtenir des cellules fraîches à infecter par les phages, le but étant de pouvoir étaler les bactéries infectées sur des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif, afin de pouvoir cribler avec une sonde radiomarquée. Pour ce faire, on dilue très fortement les phages encapsides, avant de les mettre en contact avec les cellules bactériennes, afin de pouvoir les étaler à une densité voulue, c'est-à-dire de pouvoir déterminer le titre de 1a banque (=nombre des phages recombinants obtenus).
Parallèlement, le vecteur seul a aussi été ligué et encapsidé afin de pouvoir connaître le bruit de fond de ce lot de λ gt 11.
Chaque dilution de phages a été incubée avec des cellules Y1090 (r-) à 37°C durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées ont été étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont incubées une nuit à 37°C, et le lendemain on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant . En comptant le nombre de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, on peut ainsi déterminer le titre de la banque, qui est d'environ 340 000 phages recombinants. (Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de
20 %). 5) Criblage des phages recombinants :
En se basant sur ces chiffres, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîtes de Pétri (milieu LB agar) afin de pouvoir cribler avec une sonde radio- marquée. Cette fois, c'est la souche bactérienne LE 392
(Génotype: F-, hdsR 574 (rK-, mK +) supE44, supF58, lacY1 ou Δ(1acIZY)6, ga1K2, ga1T22, metB1, trpR55), qui a été utilisée.
Comme sonde radiomarquée, un fragment d'envi- ron 600 paires de bases (pb) du gène β3-adrenergique humain (L.J. Emorine et al., 1989, Science, 245, 1118- 1121) a été utilisé. La sonde comprend la région codante allant du codon d'initiation (ATG) jusqu'au domaine transmembranaire 5 (TM 5).
Le radiomarquage de ce fragment a été fait par
Random Priming (Kit Boehringer réf. 1004 760), en incorporant 50 μCi de dATP(α32P) et de 50 μCi de dCTP(α32P) (Amersham réf. PB 10204 et réf. PB 10205 respectivement).
D'abord, des empreintes d'ADN des plages de lyse sur des membranes Hybond N+ (Amersham réf. RPN 132B) ont été prises. Ces membranes ont ensuite été hybridées avec la sonde en question, puis lavées et exposées pendant une nuit sur film d' autoradiographie.
24 signaux d'hybridation ont été observés, dont 23 se sont par la suite révélés être de faux positifs. Le clone restant positif, appelé λD1, a été purifié par quatre isolements successifs, suivis d'une hybridation avec 1a sonde β3-adrenergique humaine.
6) Analyse du clone positif :
Pour identifier le clone contenant le gène β2- adrénergique canin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, l'ADN du phage λD1 a été préparé. Cet ADN a été coupé ensuite par l'enzyme de restriction EcoRI afin de vérifier la taille de l'insert. Il y a en effet lieu de noter que deux fragments ont été obtenus : un de 2,4 kb et un de 0,25 kb, ce qui laisse supposer la présence d'un site EcoRI propre au gène β2-adrenergique canin, car le site EcoRI est unique sur le vecteur λ gt 11.
7) Sous-clonage des fragments EcoRI dans un vecteur M13 :
Les fragments EcoRI du clone λDl ont été souscloné dans un bactériophage M13 (M13 tg 131) approprié pour faire le séquençage ; de cette manière, l'on obtient 4 sous-clones :
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin sens, appelé "H",
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin anti-sens, appelé "D3",
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin sens, appelé "16,4", et
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin anti-sens, appelé "16,2".
8) Séquençage du gène β2-adrenergique canin :
Les 4 sous-clones ont été entièrement séquences à l'aide du kit Sequenase version 2.0 (Amersham- United States Biochemical réf. 70770) . La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens (H et 16,4) ou sur le brin antisens (D3 et 16,2) . Ces amorces sont représentées par les séquences suivantes :
- amorces sens : SEQ ID NO:27→SEQ ID NO:36
- amorces sens : SEQ ID NO:37→SEQ ID NO:46. Les résultats obtenus à partir de la séquence des fragments EcoRI, montrent la séquence nucleotidique du récepteur β2-adrenergique canin (1248 pb) et des régions non-codantes (168 pb en 5' et 1262 pb en 3'). Les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb sont positionnés sur les figures 12 et 13.
La comparaison des régions codantes des gènes β2-adrenergique canin et humain et des rongeurs (hamster, rat, souris), indique une forte homologie (87%) (figure 14).
La séquence β2-adrenergique canine code pour une protéine de 415 acides aminés SEQ ID NO : 2 et porte les caractéristiques structurales des récepteurs β- adrénergiques, notamment les sept régions hydrophobes qui correspondent probablement à des segments transmembranaires. Dans la partie extracellulaire (el) on trouve deux sites de glycosylation (NRS et NGS) communs aux autres récepteurs β2-adrénergiques.
La partie C-terminale intracellulaire (i4) est plus conservée entre les récepteurs β2-adrénergiques qu'entre les récepteurs β3 -adrénergiques. Toutefois, la séquence humaine révèle une absence de 6 résidus en position 360. Trois résidus sont absents dans la séquence β2- adrénergique canin en position 391 comparée aux autres séquences β2-adrénergiques . La figure 14 montre la comparaison en acides aminés des différents récepteurs β2- adrénergiques.
9) Vérification de la présence du site EcoRI interne au gène :
Pour vérifier que les deux fragments EcoRI composent le gène β2 -adrenergique canin, une amplification PCR a été réalisée sur l'ADN du phage λD1 avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du site EcoRI (SEQ ID NO: 35 et SEQ ID NO: 37) . Un fragment de 720 pb a ainsi pu être amplifié. Après sous-clonage dans le vecteur M13 tg 130 (clone n° 2) et séquençage de ce fragment, la cer- titude que le site EcoRI se trouve en position 2427 sur la séquence a été apportée.
10) Préparation d'une sonde spécifique du gène β2-adrenergique canin:
Le fragment EcoRI de 2427 pb du clone "H" a été purifié et utilisé comme sonde. Ce fragment d'ADN a été radiomarqué, comme décrit plus haut, par la méthode du Random Priming. La sonde ainsi préparée a été utilisée dans des expériences d'hybridation d'ADN génomique (Southern Blot), pour estimer sa spécificité vis-à-vis du gène β2-adrenergique. L'ADN génomique canin a été coupé par les enzymes de restriction suivantes : EcoRI, Hind III, Bam HI, Xba I . Après séparation des fragments dans un champ electrophoretique sur gel d'agarose à 0,7 %, l'ADN a été transféré sur une membrane de nylon (Amersham, Hybond N+). Cette membrane a été hybridée avec la sonde EcoRI puis lavée à faible stringence et ensuite autoradiographiée.
Les résultats indiquent, pour la coupure EcoRI, un fragment de 8 à 8,5 kb, pour la coupure BamHI un fragment d'environ 20 kb, pour la coupure Xbal un fragment de 7,5 à 8 kb et pour la coupure Hind III un fragment de 4 kb. La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologues au gène β2-adrenergique.
Exemple 5 : Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur β2-adrenergique canin.
La carte de restriction du gène β2-adréner- gique canin (figures 12 et 13) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Nae I, en position 154, soit
15 pb en amont de la région codante du gène β2- adrenergique canin. L'ADN du clone M13 - H a été digéré avec les enzymes Nae I et EcoRI, pour libérer le fragment de 2273 pb contenant la région codante du gène β2- adrenergique canin et une partie de la région 3' non- traduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pcDNA 3 (Invitrogene), aux sites de coupure Bam HI et EcoRI . Comme les extrémités Nae I d'une part et Bam HI d'autre part, ne sont pas compatibles, les extrémités Bam HI du vecteur ont été traitées avec le fragment Klenow de la polymerase I, de façon à obtenir des bouts francs (Maniatis et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43). La coupure Nae I génère des bouts francs et après ligation, on a ainsi obtenu le plasmide recombinant pcDNA 3/rβ2- adrénergique canin (sous-clone 41). Le gène du récepteur β2-adrenergique canin se trouve alors sous dépendance du promoteur fort CMV (cytomegalovirus), qui assure une sur- expression du gène une fois introduit dans les cellules de mammifères.
Exemple 6 : Etude de l'expression du récepteur β2 canin dans les cellules CHO-K1.
* Sélection des clones stables exprimant le récepteur β2 canin :
Le plasmide pcDNA3/rβ2 adrenergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines environ, 39 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Ces clones ont été testés pour leur capacité à lier le radioligand ICYP, suivant le protocole décrit à l'exemple 3. Ce test permet d'évaluer le niveau d'expression des récepteurs à la membrane des cellules. Quatre clones ont été ainsi sélectionnés pour leur bon niveau d'expression des récepteurs à la membrane plasmi- que (le rapport de liaison spécifique sur la liaison non spécifique était au moins supérieur à 3). Le sous-clonage de ces clones a été entrepris afin de sélectionner une population homogène de cellules exprimant un taux élevé de récepteurs à la surface cellulaire. Sur ce critère, les expériences d'accumulation d'AMPc ont été réalisées sur les sous-clones obtenus du clone 65.
* Mesure de l'accumulation d'AMPc :
10 sous-clones du clone 65 ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adénylyl cyclase. L'accumulation d'AMPc a été mesurée sur ces sous-clones et sur un clone stable CHO exprimant le récepteur β2 humain comme contrôle positif. L' (-)-isoprotérénol à la concentration de 10-4 M (iso-4) a été utilisé. Cette expérience a été réalisée en duplicats sur les 10 sous- clones. La figure 15 présente une expérience typique réalisée avec 2 sous-clones exprimant le récepteur β2 canin (CHO-K1 β2 canin 10 et CHO-K1 β2 canin 31). L'accumulation d'AMPc a été mesurée simultanément sur ces deux sous- clones et sur un clone stable CHO exprimant le récepteur β2 humain (CHO-β2 humain) comme contrôle positif. Les résultats montrent que dans ce type cellulaire, à savoir les cellules CHO-K1, lorsque le récepteur β2 canin est exprimé à la membrane plasmique des cellules, il est peu ou pas couplé à l'effecteur adénylyl cyclase.
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Claims

REVENDICATIONS
1°) Séquences nucleotidiques isolées, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une séquence d'ADN codant pour un récepteur β-adrénergique canin sélectionné dans le groupe constitué par l'ADNc codant pour le récepteur β2-adrénergique canin, de séquence SEQ ID N0:1 et par l'ADN codant pour le récepteur β3- adrénergique canin, de séquence SEQ ID NO:24.
2°) Sondes nucleotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucleotidique selon la revendication 1 ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
3°) Protéine, caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence nucleotidique selon la revendication 1 et est sélectionnée dans le groupe constitué par la SEQ ID NO : 2 (récepteur RA-Caβ2) et la SEQ ID NO: 25 (RA-Caβ3).
4°) Protéine selon la revendication 3, carac- térisée en ce qu'elle correspond à un récepteur β3- adrénergique canin et en ce qu'elle présente les activités pharmacologiques d'un récepteur β3 lorsqu'elle est exprimée de façon transitoire dans les cellules de singe COS-1.
5°) Fragments des protéines selon la revendication 3, d'au moins 6 aminoacides, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un épitope apte à produire des anticorps dans des conditions convenables.
6°) Anticorps dirigés spécifiquement contre le récepteur β3 -adrenergique canin ou l'un de ses épitopes selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisés en ce qu'ils ne reconnaissent que ledit récepteur β3 -adrenergique canin ou l'un de ses épitopes et ne reconnaissent ni les récepteurs βl-, ni les récepteurs β2- adrénergiques canins.
7°) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucleotidique selon la revendication 1.
8°) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un micro-organisme hôte convenable, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel vecteur est insérée une séquence nucleotidique ou un fragment de séquence selon la revendication 1, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un récepteur β2- ou β3- adrenergique canin.
9°) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit vecteur est constitué d'un plasmide recombinant d'expression dans lequel est insérée, au niveau d'un lieur multisite, la séquence codant pour le récepteur β2- ou le récepteur β3 -adrenergique canin.
10°) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence codant pour le récepteur β3 -adrenergique canin et en ce qu'il a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 9 février 1996 sous le n° 1-1672.
11°) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10. 12°) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est notamment constituée par les cellules CHO-Kl et les cellules COS-1.
13°) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est notamment constituée par une bactérie, notamment Escherichia coli .
14°) Procédé de criblage différentiel pour l'étude de l'affinité en liaison de substances et la sélection et l'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un récepteur β3 -adrenergique canin selon la revendication 3 ou la revendication 4, lequel procédé comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, laquelle cellule hôte exprime ledit récepteur adrenergique β3 canin, le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu,
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression du récepteur β2- adrenergique canin, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-protéine .
15°) Procédé pour l'étude de l'efficacité et de l'activité d'une substance ayant une activité soit agoniste, soit antagoniste, vis-à-vis du récepteur étudié, lequel procédé comprend :
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 exprimant le récepteur β3-adaenergique canin ; - la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur β3 codé par la séquence nucleotidique, et le transfert du récepteur β3 exprimé vers la membrane de ladite cellule, de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur β3 soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée ;
- la mise en contact de ladite cellule hôte transformée avec ladite substance ; et
- la mesure de l'accumulation du second messager AMPc, induite par la liaison de ladite substance sur son récepteur et la stimulation de l'effecteur adénylyl cyclase par l'intermédiaire d'une protéine G.
16°) Kit pour la détection de l'affinité de liaison éventuelle d'un ligand pour un récepteur selon la revendication 3 ou la revendication 4 et/ou pour la détection de l'activité dudit ligand vis-à-vis dudit récepteur, lequel kit comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'un récepteur β3 canin codé par une séquence nucleotidique selon la revendication 1, contenue dans un plasmide recombinant dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur β3 ;
- l'affinité de ladite substance pour le récepteur est mesurée par compétition de la liaison du radioligand par des concentrations croissantes de ladite substance ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du récepteur β3 exprimé. 17°) Réactif, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, les séquences SEQ ID NO: 3 -23 et les séquences SEQ ID NO: 27- 46.
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