FR2746813A1 - Sequences codant pour les recepteurs beta2- et beta3- adrenergiques canins et leurs applications en tant que sondes et pour l'expression de peptides - Google Patents
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Abstract
Séquences nucléotidiques codant pour certains récepteurs bêta-adrénergiques canins, notamment les récepteurs bêta2- (SEQ ID No1) et les récepteurs bêta3- (SEQ ID No24), ainsi qu'à l'utilisation de ces séquences comme sondes, pour l'expression des récepteurs bêta-adrénergiques canins, pour étudier la localisation tissulaire du récepteur exprimé (PCR, Northern blot), pour effectuer des mutagenèses dirigées et pour l'étude structure-fonction des récepteurs. Utilisation desdits récepteurs bêta-adrénergiques canins pour la préparation d'anticorps spécifiques. Procédé de criblage différentiel pour l'étude en affinité de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des récepteurs bêta3-adrénergiques canins et trousses ou kits pour l'étude de l'efficacité de différentes substances pour lesdits récepteurs bêta3-adrénergiques canins. De telles substances sont notamment utilisées pour le traitement sélectif de l'obésité des chiens ou d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité ou à toute autre pathologie faisant intervenir les récepteurs bêta-3 canins.
Description
La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques codant pour certains récepteurs ss-adrénergiques canins, notamment les récepteurs ss2- et les récepteurs ss3-, ainsi qu'à l'utilisation de ces séquences comme sondes, pour l'expression des récepteurs ss-adrénergiques canins, pour étudier la localisation tissulaire du récepteur exprimé (PCR, Northern blot), pour effectuer des mutagenèses dirigées et pour l'étude structure-fonction des récepteurs.
La présente invention est également relative à l'utilisation desdits récepteurs ss-adrénergiques canins pour la préparation d'anticorps spécifiques.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage différentiel de substances, à action agonis te ou antagoniste vis-à-vis des récepteurs ss3-adrénergiques canins et à des trousses ou kits pour la détection du degré d'affinité de différentes substances pour lesdits récepteurs ss3-adrénergiques canins. De telles substances sont notamment utilisées pour le traitement sélectif de l'obésité des chiens ou d'autres troubles métaboliques liés à l'obésité ou à toute autre pathologie faisant intervenir les récepteurs ss3 canins.
I1 est connu que les catécholamines telles que l'adrénaline et la noradrénaline, les agonistes synthétiques des récepteurs ss-adrénergiques, qui miment leurs fonctions biologiques et les antagonistes, qui bloquent ces fonctions biologiques, exercent leurs effets en se liant à des sites de reconnaissance (récepteurs membranaires) spécifiques, situés dans les membranes plasmiques des cellules.
Deux classes principales de récepteurs adrénergiques ont été définies, les récepteurs adrénergiques a et les récepteurs adrénergiques ss.
Dans l'ensemble de ces deux classes, on distingue, maintenant, cinq sous-types de récepteurs aux catécholamines (al, a2, B1, ss2 et ss3-RA). Leurs gènes ont été récemment isolés et identifiés (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163
B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656
T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656
T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 84, 6995-6999 ; L.J. EMORINE et al., 1989,
Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récepteurs membranaires intégraux présentant certaines homologies (R.A.F. DIXON et al., 1988, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988,
Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des protéines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récepteurs membranaires intégraux présentant certaines homologies (R.A.F. DIXON et al., 1988, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988,
Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des protéines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Ces récepteurs membranaires, lorsqu'ils ont fixé le ligand approprié (agoniste ou antagoniste), subissent un changement de conformation, qui induit (agoniste) ou bloque (antagoniste) un signal intracellulaire, qui modifie le comportement de la cellule cible.
Dans le cas où des agonistes se lient à des récepteurs ss-adrénergiques (RA-B), ils activent une classe de protéines G, qui stimule à son tour l'activité de l'adénylyl cyclase, alors que les antagonistes se lient à des RA-B, mais n'activent pas I'adénylyl cyclase.
Lorsque l'adénylyl cyclase est activée, elle catalyse la production d'un médiateur intracellulaire ou second messager, notamment 1'AMP cyclique.
Les Inventeurs ont participé à la mise en évidence de nouveaux récepteurs ss-adrénergiques chez l'homme, dénommés RA-HuB3, chez la souris (Demande Internationale WO 92/12246), dénommés RA-Muss3 et chez les bovins (Demande Internationale WO 94/24162), dénommés RA BoB3, caractérisés par des propriétés différentes de celles des récepteurs ssl et ss2, notamment en ce qu'ils se comportent de façon différente vis-à-vis de substances respectivement antagonistes et agonis tes des récepteurs B1 et ss2 (Demande Internationale WO 90/08775).
Le récepteur RA-HuB3 est plus particulièrement constitué par une séquence de 408 amino-acides (VAN
SPRONSEN A. et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 11171124) et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-MuB3 est constitué par une séquence de 400 aminoacides (VAN SPRONSEN et al., précité) alors que le récepteur RA-BoB3 est constitué par une séquence de 405 aminoacides, ces deux dernières séquences comportant également sept régions transmembranaires.
SPRONSEN A. et al., Eur. J. Biochem., 1993, 213, 11171124) et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-MuB3 est constitué par une séquence de 400 aminoacides (VAN SPRONSEN et al., précité) alors que le récepteur RA-BoB3 est constitué par une séquence de 405 aminoacides, ces deux dernières séquences comportant également sept régions transmembranaires.
Les travaux antérieurs concernant le RA-Huss3, le RA-MuB3 et le RA-BoB3 ont montré que le récepteur ss3- adrénergique intervient dans les maladies telles que le diabète et/ou l'obésité ; il est préférentiellement exprimé dans le tissu adipeux qui joue un rôle important dans le métabolisme.
Un certain nombre de travaux ont mis en évidence l'existence in vivo de récepteurs ss2 et ss3 adrénergiques canins ; toutefois, il n'avait pas été possible jusqu'à présent d'isoler ni les séquences codantes, ni ces récepteurs ss2 et ss3 adrénergiques canins, toutes les tentatives en ce sens ayant échoué (CHAMPIGNY O. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10774-10777
HOLLOWAY B.R. et al., Int. J. Obes., 1985, 9, 423-432
HOLLOWAY B.R. et al., Br. J. Pharmacol., 1991, 104, 97104 ; VALLET P. et al., J. Pharmacol. and Exp. Therap., 1988, 249(1), 271-277 ; TAOUIS M. et al., J. Pharmacol.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10774-10777
HOLLOWAY B.R. et al., Int. J. Obes., 1985, 9, 423-432
HOLLOWAY B.R. et al., Br. J. Pharmacol., 1991, 104, 97104 ; VALLET P. et al., J. Pharmacol. and Exp. Therap., 1988, 249(1), 271-277 ; TAOUIS M. et al., J. Pharmacol.
and Exp. Therap., 1987, 242(3), 1041-1049 ; ASHWELL M.,
Int. J. Obes., 1987, 11(4), 357-365 ; LANGIN D. et al.,
Eur. J. Pharmacol., 1991, 199, 291-301).
Int. J. Obes., 1987, 11(4), 357-365 ; LANGIN D. et al.,
Eur. J. Pharmacol., 1991, 199, 291-301).
Poursuivant leurs travaux dans cette voie, les
Inventeurs ont cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique ss3 chez les chiens (RA-Cass3) et à le distinguer des autres récepteurs ss-adrénergiques (RA-ss2, notamment), afin de mettre au point des agents thérapeutiques spécifiques au chien.
Inventeurs ont cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique ss3 chez les chiens (RA-Cass3) et à le distinguer des autres récepteurs ss-adrénergiques (RA-ss2, notamment), afin de mettre au point des agents thérapeutiques spécifiques au chien.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques isolées, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une séquence d'ADN codant pour un récepteur ss-adrénergique canin sélectionné dans le groupe constitué par 1'ADNc codant pour le récepteur ss2- adrénergique canin, de séquence SEQ ID NO:1 et par 1'ADN codant pour le récepteur '33-adrénergique canin, de séquence SEQ ID NO:24.
Dans le cadre de la présente invention, les récepteurs ss3 et ss2 adrénergiques canins ont effectivement été isolés, ce qui donne la possibilité soit de mettre au point des traitements sélectifs pour les chiens après définition d'un profil pharmacologique distinct de celui défini pour les récepteurs ss3 humains, murins et bovins, soit de disposer de produits spécifiques d'un sous-type de récepteur : ss3 canin spécifique ou ss2 canin spécifique.
Le fait d'avoir effectivement isolé à la fois le récepteur ss3- et le récepteur ss2-adrénergiques canins, permet d'utiliser ce dernier en tant que témoin de comparaison pour la mise au point de traitements spécifiques du chien, dans les maladies concernées par le récepteur ss3-adrénergique (obésité essentiellement).
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Les conditions d'hybridation des sondes sont définies comme suit
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes
* conditions d'hybridation des sondes ss3 :
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HC1, pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. (sodium dodécylsulfate) ; 10 Rg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 420C.
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes
* conditions d'hybridation des sondes ss3 :
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HC1, pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. (sodium dodécylsulfate) ; 10 Rg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 420C.
Les lavages sont effectués dans une solution contenant 3 mM de NaCl ; 0,3 mM de citrate de sodium 0,05 % de S.D.S., à 500C, pendant 30 minutes à 1 heure.
* Conditions d'hybridation des sondes ss2 :
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. ; 10 Fg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 420C.
en présence d'une solution contenant 600 mM de
NaCl ; 60 mM de citrate de sodium ; 8 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine 10 à 25 % de formamide ; 0,2 % de S.D.S. ; 10 Fg/ml d'ADN de sperme de saumon, pendant 12 à 16 heures à 420C.
Les lavages sont effectués dans une solution contenant 15 mM de NaCl ; 1,5 mM de citrate de sodium 0,05 de S.D.S., à 450C, pendant 45 min.
Pour les sondes plus longues, c'est-à-dire présentant plus de 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont celles indiquées précédemment pour les sondes plus courtes, mais dans lesquelles le milieu sus-défini contient 40 à 50 % de formamide au lieu de 10 à 25 %.
Dans les conditions exposées ci-dessus, les sondes issues de la SEQ ID N01 ne s'hybrident qu'avec les récepteurs RA-CaB2, alors que les sondes issues de la SEQ
ID NO 24 ne s'hybrident qu'avec le récepteur RA-CaB3.
ID NO 24 ne s'hybrident qu'avec le récepteur RA-CaB3.
La présente invention a également pour objet des protéines (récepteurs ss2- et ss3-adrénergiques), caractérisées en ce qu'elles sont codées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus et sont sélectionnées dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:2 (récepteur RA-Cass2) et la SEQ ID NO:25 (RA-Cass3).
Les récepteurs ss2 et ss3 canins activent l'adénylyl cyclase ; toutefois, le couplage entre les récepteurs et l'adénylyl cyclase par l'intermédiaire des protéines G, est déficient dans des cellules murines CHO K1 (réf.: ATCC CRL 9618, ATCC Catalogue of Cell lines &
Hybridomas, 7ème édition, 1992) et CHW, en ce qui concerne le récepteur ss2 canin et CHO-K1, pour le récepteur ss3 canin. Cela implique une perte d'activité des récepteurs ss2- et ss3-adrénergiques canins dans ces cellules, bien qu'ils y soient effectivement exprimés.
Hybridomas, 7ème édition, 1992) et CHW, en ce qui concerne le récepteur ss2 canin et CHO-K1, pour le récepteur ss3 canin. Cela implique une perte d'activité des récepteurs ss2- et ss3-adrénergiques canins dans ces cellules, bien qu'ils y soient effectivement exprimés.
L'activité du récepteur ss3 canin exprimé dans les cellules CHO-K1 se distingue de l'activité ss3 d'autres espèces (homme, boeuf), exprimé dans les mêmes cellules, en ce qu'elle est nulle lorsque le récepteur est cloné et exprimé dans des cellules CHO-K1, alors qu'elle est forte, quand il est exprimé dans les cellules de singe COS-1 (réf.: ATCC CRL 1650, ATCC Catalogue of
Cell lines & Hybridomas, 7ème édition, 1992).
Cell lines & Hybridomas, 7ème édition, 1992).
Ledit récepteur présente, dans les cellules
COS-1, dans lesquelles il y a à la fois expression et couplage corrects, les activités des récepteurs ss3- adrénergiques, à savoir, il active 1'adénylyl cyclase en présence de l'un des agoniste suivants : (-)-isoprotéré nol, (-)-épinéphrine, (-)-norépinéphrine, CGP12177A,
CL316,243.
COS-1, dans lesquelles il y a à la fois expression et couplage corrects, les activités des récepteurs ss3- adrénergiques, à savoir, il active 1'adénylyl cyclase en présence de l'un des agoniste suivants : (-)-isoprotéré nol, (-)-épinéphrine, (-)-norépinéphrine, CGP12177A,
CL316,243.
La présente invention a également pour objet des fragments desdites protéines d'au moins 6 aminoacides, correspondant à un épitope apte à produire des anticorps dans des conditions convenables, telles que décrites dans GUILLAUME JL. et al. (Eur. J. Biochem., 1994, 224, 761-770)
La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés spécifiquement contre le récepteur '33-adrénergique canin ou contre l'un de ses épitopes, lesquels anticorps ne reconnaissent que ledit récepteur ss3-adrénergique canin ou l'un de ses épitopes et ne reconnaissent ni les récepteurs B1-, ni les récepteurs ss2- adrénergiques canins.
La présente invention a également pour objet des anticorps dirigés spécifiquement contre le récepteur '33-adrénergique canin ou contre l'un de ses épitopes, lesquels anticorps ne reconnaissent que ledit récepteur ss3-adrénergique canin ou l'un de ses épitopes et ne reconnaissent ni les récepteurs B1-, ni les récepteurs ss2- adrénergiques canins.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide, qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un micro-organisme hôte convenable, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel vecteur est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un récepteur ss2- ou ss3- adrénergique canin.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide recombinant d'expression dans lequel est insérée, au niveau d'un lieur multisite, la séquence codant pour le récepteur ss2- ou le récepteur ss3-adrénergique canin ; un plasmide contenant la séquence codant pour le récepteur ss3-adrénergique canin a été dénommé pcDNA3/rss3 adrénergique canin ou Beta3 canine-ADR et a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 9 février 1996 sous le nO I-1672 ; un plasmide contenant la séquence codant pour le récepteur ss2-adrénergique canin a été dénommé pcDNA3/rB2-adrénergique.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide recombinant d'expression, conforme à l'inven- tien.
Une telle cellule est capable d'exprimer une protéine, d'origine canine, ayant une activité de récepteur ss2- ou ss3-adrénergique.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules CHO-Kl (expression stable non couplée à l'activité adénylyl cyclase) et COS-1 (expression transitoire et couplage à l'adénylyl cyclase).
Un autre des micro-organismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli.
De manière avantageuse, les récepteurs selon l'invention constituent un outil pour la détection de ligands spécifiques intervenant dans l'activation ou l'inhibition de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands ss-adrénergiques spécifiques des récepteurs ss3 canins, en comparant les résultats obtenus à l'aide à la fois des séquences codant pour le récepteur ss2- et des séquences codant pour le récepteur '33 -adrénergique canin.
Conformément à l'invention, le procédé de criblage différentiel pour l'étude de l'affinité en liaison de substances et la sélection et l'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un récepteur ss3-adrénergique canin conforme à l'invention comprend
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression tel que défini ci-dessus, laquelle cellule hôte exprime ledit récepteur adrénergique ss3 canin, le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et permet le couplage adénylyl cyclase/récepteur par l'intermédiaire des protéines G, laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre le récepteur et ladite substance s'il y a lieu,
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression du récepteur ss2- adrénergique canin, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-protéine.
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression tel que défini ci-dessus, laquelle cellule hôte exprime ledit récepteur adrénergique ss3 canin, le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et permet le couplage adénylyl cyclase/récepteur par l'intermédiaire des protéines G, laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre le récepteur et ladite substance s'il y a lieu,
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression du récepteur ss2- adrénergique canin, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-protéine.
Un tel procédé permet de définir le profil pharmacologique du récepteur soit ss3 canin (lorsque la substance étudiée est mise en contact avec le récepteur ss3), soit ss2 canin (lorsque la substance étudiée est mise en contact avec le récepteur '32) . L'analyse et la comparaison de ces deux profils permettent de mettre en évidence les ligands spécifiques de chacun des sous-types.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé pour l'étude de l'efficacité d'une substance ayant une activité soit agoniste, soit antagoniste, visà-vis du récepteur étudié, lequel procédé comprend
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention exprimant le récepteur ss3-adrénergique canin
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur ss3 codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur ss3 exprimé vers la membrane de ladite cellule, de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur ss3 soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée
- la mise en contact de ladite cellule hôte transformée avec ladite substance ; et
- la mesure de l'accumulation du second messager AMPc, induite par la liaison de ladite substance sur son récepteur et la stimulation de l'effecteur adénylyl cyclase par l'intermédiaire d'une protéine G.
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention exprimant le récepteur ss3-adrénergique canin
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur ss3 codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur ss3 exprimé vers la membrane de ladite cellule, de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur ss3 soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée
- la mise en contact de ladite cellule hôte transformée avec ladite substance ; et
- la mesure de l'accumulation du second messager AMPc, induite par la liaison de ladite substance sur son récepteur et la stimulation de l'effecteur adénylyl cyclase par l'intermédiaire d'une protéine G.
L'invention a, en outre, pour objet un kit pour la détection de l'affinité de liaison éventuelle d'un ligand pour un récepteur conforme à l'invention et/ou pour la détection de l'activité dudit ligand visà-vis du récepteur étudié, lequel kit comprend
- une culture de cellules hôtes transformées par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'un récepteur ss3 canin codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, contenue dans un plasmide recombinant dont le promoteur est inductible
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur ss3 ;
- l'affinité de ladite substance pour le récepteur est mesurée par compétition de la liaison du radioligand par des concentrations croissantes de ladite substance ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique dudit ligand sur le récepteur ss3 exprimé.
- une culture de cellules hôtes transformées par un plasmide recombinant d'expression conforme à l'invention
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'un récepteur ss3 canin codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, contenue dans un plasmide recombinant dont le promoteur est inductible
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur ss3 ;
- l'affinité de ladite substance pour le récepteur est mesurée par compétition de la liaison du radioligand par des concentrations croissantes de ladite substance ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique dudit ligand sur le récepteur ss3 exprimé.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, avec référence aux dessins annexés dans lesquels
* en ce qui concerne le récepteur ss3- adréneraioue canin
- la figure 1 représente schématiquement la séquence codant pour le récepteur '33-adrénergique canin et l'emplacement des amorces humaines pour la mise en oeuvre d'une PCR
- les figures 2A et 2B représentent la visualisation du produit d'amplification, à partir d'ADN génomique d'un fragment de séquence codant pour le récepteur ss3-adrénergique ;
- les figures 3A et 3B représentent des
Southern blots de 1'ADN génomique de chien, hybridé avec une sonde RA-B3 canin
- la figure 4 représente une carte de restriction de 1'ADN génomique canin comportant le gène ss3- adrénergique canin (zone noircie)
- la figure 5 représente un gel d'agarose obtenu à partir d'ADN génomique canin coupé par EcoRI et fractionné en tailles différentes entre 8 et 4,8 Kb
- la figure 6 représente un Southern blot du gel d'agarose de la figure 5 et montre que le gène codant pour le RA-B3 canin est contenu majoritairement dans la fraction nO 2
- les figures 7 et 8 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2649 pb contenant la séquence codant pour le RA-ss3 canin
- la figure 9 est une comparaison des séquences en acides aminés entre RA-CaB3 et RA-Huss3 ;
- la figure 10 représente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur ss3 canin
* en ce qui concerne le récepteur ss2- adrénergique canin
- les figures 11 et 12 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb, contenant la séquence codant pour le RA-B2 canin
- la figure 13 est une comparaison des différents récepteurs ss2 ; et
- la figure 14 représente une expérience typique réalisée avec deux sous-clones exprimant le récepteur ss2 canin et un clone exprimant le récepteur ss2 humain.
* en ce qui concerne le récepteur ss3- adréneraioue canin
- la figure 1 représente schématiquement la séquence codant pour le récepteur '33-adrénergique canin et l'emplacement des amorces humaines pour la mise en oeuvre d'une PCR
- les figures 2A et 2B représentent la visualisation du produit d'amplification, à partir d'ADN génomique d'un fragment de séquence codant pour le récepteur ss3-adrénergique ;
- les figures 3A et 3B représentent des
Southern blots de 1'ADN génomique de chien, hybridé avec une sonde RA-B3 canin
- la figure 4 représente une carte de restriction de 1'ADN génomique canin comportant le gène ss3- adrénergique canin (zone noircie)
- la figure 5 représente un gel d'agarose obtenu à partir d'ADN génomique canin coupé par EcoRI et fractionné en tailles différentes entre 8 et 4,8 Kb
- la figure 6 représente un Southern blot du gel d'agarose de la figure 5 et montre que le gène codant pour le RA-B3 canin est contenu majoritairement dans la fraction nO 2
- les figures 7 et 8 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2649 pb contenant la séquence codant pour le RA-ss3 canin
- la figure 9 est une comparaison des séquences en acides aminés entre RA-CaB3 et RA-Huss3 ;
- la figure 10 représente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur ss3 canin
* en ce qui concerne le récepteur ss2- adrénergique canin
- les figures 11 et 12 représentent les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb, contenant la séquence codant pour le RA-B2 canin
- la figure 13 est une comparaison des différents récepteurs ss2 ; et
- la figure 14 représente une expérience typique réalisée avec deux sous-clones exprimant le récepteur ss2 canin et un clone exprimant le récepteur ss2 humain.
ExemDle 1 : Mise en évidence d'un récepteur ss3- adrénergique chez le chien.
1) Amplification d'un fragment du gène ss3 canin par PCR
Des expériences d'amplification par PCR ont été réalisées sur ADN génomique canin, en utilisant comme amorces deux oligonucléotides, synthétisés à partir de la séquence ss3-adrénergique humaine. Le premier, dénommé 1269 (SEQ ID NO:26) correspond au début de la partie codante du gène canin. Le second, dénommé 1263 (SEQ ID
NO:9) et comprenant également 18 nucléotides, correspond à une partie codant pour le cinquième segment transmembranaire du récepteur, comme illustré à la figure 1, dans laquelle la localisation des oligonucléotides
utilisés comme amorces pour la réaction PCR est représentée.
Des expériences d'amplification par PCR ont été réalisées sur ADN génomique canin, en utilisant comme amorces deux oligonucléotides, synthétisés à partir de la séquence ss3-adrénergique humaine. Le premier, dénommé 1269 (SEQ ID NO:26) correspond au début de la partie codante du gène canin. Le second, dénommé 1263 (SEQ ID
NO:9) et comprenant également 18 nucléotides, correspond à une partie codant pour le cinquième segment transmembranaire du récepteur, comme illustré à la figure 1, dans laquelle la localisation des oligonucléotides
utilisés comme amorces pour la réaction PCR est représentée.
La réaction PCR réalisée dans les conditions telles que définies en 2) ci-après permet d'obtenir un fragment amplifié d'environ 643 paires de bases, c'est-àdire du même ordre de grandeur que le fragment humain correspondant. Ce fragment est visualisé par détection d'une fluorescence, résultant de la fixation de bromure d'éthidium après migration électrophorétique en gel d'agarose. La taille du fragment est déterminée à l'aide de marqueurs de poids moléculaires connus. Sur la figure 2, on voit effectivement un fragment à la taille attendue correspondant à une partie du gène du récepteur ss3- adrénergique canin.
La figure 2A, correspond à la visualisation par fluorescence en bromure d'éthidium des fragments obtenus après amplification sur ADN génomique humain (Hu) et de chien (Dg). Les marqueurs de taille (MW) sont des multiples de 123 pb (BRL). La figure 2B correspond aux résultats de l'hybridation avec une sonde humaine ss3 spécifique.
Ces résultats montrent une forte homologie entre les récepteurs ss3-adrénergique canin et humain, du fait que le fragment amplifié correspond à la région amino-terminale et aux cinq premiers domaines transmembranaires qui sont les parties les mieux conservées dans les divers récepteurs couplés aux protéines liant le
GTP.
GTP.
Toutefois, les particularités du couplage récepteur-adénylyl cyclase illustrent l'utilité et la nécessité de tels récepteurs ss3-adrénergiques canins pour les applications précitées.
2) Clonage d'une partie du gène p3 adréner gique canin par PCR
Le fragment de 643 pb, observé en 1) est cloné par la méthode dite "RT-PCR" (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction).
Le fragment de 643 pb, observé en 1) est cloné par la méthode dite "RT-PCR" (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction).
Pour ce faire, les ARN totaux sont extraits de tissu adipeux brun de chiots, par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidium, puis on purifie les ARN messagers poly A+, à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. 27-9258-A).
On synthétise de 1'ADNc, à partir de 0,5 ug dudit ARNm poly A+, à l'aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV Gibco
BRL réf. 510-8025 SA), puis on amplifie cet ADNc par PCR, à l'aide des deux amorces humaines utilisées en 1) [oligonucléotides 1269 (SEQ ID NO:26) (amorce sens) et 1263 (SEQ ID NO:9) (amorce anti-sens)].
BRL réf. 510-8025 SA), puis on amplifie cet ADNc par PCR, à l'aide des deux amorces humaines utilisées en 1) [oligonucléotides 1269 (SEQ ID NO:26) (amorce sens) et 1263 (SEQ ID NO:9) (amorce anti-sens)].
Les conditions de mise en oeuvre de la réaction PCR sont les suivantes
On ajoute à 1'ADNc néosynthétisé, une solution contenant les amorces SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:9 à une concentration de 0,25 uM chacune, 10 % de diméthylsulfoxide, 2,5 U de Taq polymérase (CetusR, Perkin
Elmer), les différents dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), chacun à une concentration de 0,25 mM ; le tampon de réaction utilisé est celui préconisé par Perkin Elmer.
On ajoute à 1'ADNc néosynthétisé, une solution contenant les amorces SEQ ID NO:26 et SEQ ID NO:9 à une concentration de 0,25 uM chacune, 10 % de diméthylsulfoxide, 2,5 U de Taq polymérase (CetusR, Perkin
Elmer), les différents dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), chacun à une concentration de 0,25 mM ; le tampon de réaction utilisé est celui préconisé par Perkin Elmer.
La PCR est réalisée sur un appareil Perkin
Elmer " Gene Amp PCR System 9600", dans les conditions suivantes
Après une étape de dénaturation initiale (2 min. à 940C), on réalise 29 cycles comme suit : 15 sec. à 940C ; 30 sec. à 560C ; 30 sec. à 720C et en dernier une fois 3 min. à 720C.
Elmer " Gene Amp PCR System 9600", dans les conditions suivantes
Après une étape de dénaturation initiale (2 min. à 940C), on réalise 29 cycles comme suit : 15 sec. à 940C ; 30 sec. à 560C ; 30 sec. à 720C et en dernier une fois 3 min. à 720C.
Pour obtenir un rendement important en fragment amplifié, après avoir obtenu le fragment attendu, on procède à une nouvelle amplification, dans les mêmes con ditions que ci-dessus, à partir de 1 F1 de la solution obtenue après dilution d'une petite partie du produit obtenu après la première PCR au 1/10, afin d'enrichir l'échantillon en fragment recherché, avant le clonage.
L'ensemble des fragments obtenus sont traités à la Klenow polymérase pour rendre les bouts francs (Maniatis et al.,
Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43).
Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43).
Le fragment de 643 pb a été purifié et souscloné dans un vecteur plasmidique (Bluescripto ; sousclones R2, R5, R10, Roll) et M13 tg 130 et tg 131 pour la séquence.
En se basant sur cette séquence, une amorce spécifique du récepteur ss3-adrénergique canin a été synthétisée et se situe en position 464 par rapport au codon d'initiation ATG (RT1, SEQ ID NO:3) ; elle est employée comme amorce sens pour cloner un 2ème fragment du gène ss3-adrénergique canin. Comme amorce anti-sens, une amorce humaine (TR2, SEQ ID NO:47) ou, autrement dit "interespèce", a été choisie car la comparaison des séquences ss3-adrénergiques montre une grande similitude dans cette région.
La réaction PCR a été faite comme suit
A 700 ng d'ADN génomique canin, on ajoute les amorces RT1 et TR2 à une concentration de 0,25 uM chacune, 10 % diméthylsulfoxide, 2,5 U de Taq polymérase (Promega), 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), le tampon de réaction utilisé est celui fourni par Promega complémenté par 1,5 mM de MgCl2.
A 700 ng d'ADN génomique canin, on ajoute les amorces RT1 et TR2 à une concentration de 0,25 uM chacune, 10 % diméthylsulfoxide, 2,5 U de Taq polymérase (Promega), 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), le tampon de réaction utilisé est celui fourni par Promega complémenté par 1,5 mM de MgCl2.
Un appareil LEP Scientific, PREMTM est utilisé pour réaliser cette réaction. Après une étape de dénaturation initiale (5 min. à 920C), on fait 30 cycles comme suit: 1 min. à 920C; 1 min. à 620C; 1 min. 30 sec.
à 720C; et en dernier 1 fois 7 min. à 720C.
Dans ces conditions, on obtient un fragment de 577 pb. Avant est traité à la Klenow polymérase et ensuite isolé sur gel de polyacrylamide à 5%. Ce fragment a été sous-cloné dans le vecteur M 13 tg 130 (clonage à bouts francs dans le site EcoRV) dans les deux orientations (Clone 1 = sens, Clone 10 et 13 = anti-sens) . Ce fragment correspond au gène ss3-adrénergique canin allant de la région transmembranaire 4 à la région transmembranaire 7.
Le clonage par PCR permet d'obtenir la partie codante du gène allant de la méthionine en position 1 jusqu'à la cystéine en position 347.
Ces 1041 nucléotides comprennent la séquence codante pour les 7 domaines transmembranaires du récepteur.
Exemple 2 : Isolement et identification du gène p3- adrénergique canin.
- Etude moléculaire du gène RA-B3 canin, construction d'une banque génomique
Hybridation d'ADN génomicue (Southern Blot)
D'abord 1'ADN génomique canin a été coupé par différentes enzymes de restriction, afin de connaître les sites de restriction qui encadrent le gène RA- ss3 canin
1) Utilisation d'une seule enzyme : les enzymes utilisées sont : Xba I, Bam HI, Hind III et Eco RI (10 ug d'ADN/coupure).
Hybridation d'ADN génomicue (Southern Blot)
D'abord 1'ADN génomique canin a été coupé par différentes enzymes de restriction, afin de connaître les sites de restriction qui encadrent le gène RA- ss3 canin
1) Utilisation d'une seule enzyme : les enzymes utilisées sont : Xba I, Bam HI, Hind III et Eco RI (10 ug d'ADN/coupure).
2) Utilisation de deux enzymes, simultanément : les enzymes utilisées sont : Xba I/Hind III
Xba I/Bam HI ; Bam HI/Hind III ; Eco RI/Xba I ; Eco
RI/Hind III et Eco RI/Bam HI.
Xba I/Bam HI ; Bam HI/Hind III ; Eco RI/Xba I ; Eco
RI/Hind III et Eco RI/Bam HI.
L'ADN coupé a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% et ensuite dénaturé en présence de NaOH 0,05 M, NaCl 1,5 M, puis transféré sur une membrane de Nylon (Hybond N+ Amersham) en présence de NaCl 3 M ; Na-citrate 0,3 M (=Southern Blot).
Les sondes RA-ss3 canin ont été préparées par
PCR en utilisant les conditions décrites plus haut, et ensuite radiomarquées au 32P par la méthode du "random priming" utilisant le dCTPa32P et le dATPa32P.
PCR en utilisant les conditions décrites plus haut, et ensuite radiomarquées au 32P par la méthode du "random priming" utilisant le dCTPa32P et le dATPa32P.
Les membranes ont été mise en présence des sondes RA-ss3 canin radiomarquées au phosphore 32 (= hybridation Southern) dans le milieu réactionnel suivant
600 mM de NaCl ; 60 mM de Na-citrate ; Tris
HCl 8 mM pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 40 % de formamide ; 0,2 % de SDS ; 10 ug/ml d'ADN de sperme de saumon.
600 mM de NaCl ; 60 mM de Na-citrate ; Tris
HCl 8 mM pH 7,5 ; 50 mM de phosphate de sodium ; 1 % de Ficoll ; 1 % de polyvinylpyrrolidone ; 1 % de sérum albumine bovine ; 40 % de formamide ; 0,2 % de SDS ; 10 ug/ml d'ADN de sperme de saumon.
Après une préhybridation dans ce milieu à 420C pendant au moins une heure, les sondes radiomarquées sont ajoutées, à une concentration d'environ 106 cpm/ml de milieu d'hybridation.
L'hybridation est réalisée pendant une nuit (12-16 h) à 420C.
Les membranes ont été lavées avec une solution contenant 3 mM de NaC1 Na-citrate 0,3 mM ; SDS à 0,05 %, à 500C pendant 30 min ou 1 heure pour les fragments obtenus avec les deux enzymes. Après traitement, les membranes sont mises en contact avec un film radiographique (autoradiographie) pendant 3 jours (4 jours pour les coupures par deux enzymes). La révélation de ce film fait apparaître des fragments de taille différente dans chaque piste correspondant à des enzymes différentes. Les figures 3A et 3B montrent les résultats obtenus à partir de deux Southern Blots, réalisés dans les conditions définies ci-dessus.
Sur la figure 3A, M = marqueur de tailles, X =
XbaI (6,4 kb), B = Bam HI (8 kb), H = Hind III (220 kb),
E = Eco RI (6 kb) ; sur la figure 3B, XH = Xba I-Hind III (6,4 kb), XB = Xba I-Bam HI (4,3 kb), BH = Bam HI-Hind
III (6,3 kb), EX = Eco RI-Xba I (3,7 kb), EH = Eco RI
Hind III (4,8 kb), EB = Eco RI-Bam HI (6 Kb).
XbaI (6,4 kb), B = Bam HI (8 kb), H = Hind III (220 kb),
E = Eco RI (6 kb) ; sur la figure 3B, XH = Xba I-Hind III (6,4 kb), XB = Xba I-Bam HI (4,3 kb), BH = Bam HI-Hind
III (6,3 kb), EX = Eco RI-Xba I (3,7 kb), EH = Eco RI
Hind III (4,8 kb), EB = Eco RI-Bam HI (6 Kb).
Ces données ont permis d'établir une carte de restriction du fragment génomique canin qui contient le gène RA-B3 (figure 4). Ces expériences montrent que le gène RA-B3 canin est contenu dans un fragment génomique de 3,7 kb encadré par les sites de restriction Eco RI et
Xba I.
Xba I.
La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologue au gène ss3- adrénergique.
Les gènes RA-B3 des différentes espèces sont composés d'une région promotrice suivie d'une région codante d'environ 1,2 kb = exon 1, qui est le plus souvent interrompue par un intron d'environ 1 kb. L'exon 2 code en général pour 6 à 8 acides aminés et la séquence suivante correspond à la partie 3' non-traduite, ce qui permet de conclure que le gène ss3 proprement dit est contenu dans le fragment génomique EcoRI et Xba I de 3,7 kb, ou alors plus largement encadré par 2 sites EcoRI.
C'est le fragment d'ADN génomique EcoRI de 6 kb qui a été sélectionné et qui est utilisé pour construire la banque d'ADN génomique.
- La banque génomique a été construite dans un bactériophage lambda comme suit
1) Digestion d'ADN génomique
2x 100 ug d'ADN génomique canin ont été digérés par EcoRI (New England Biolabs) dans les conditions suivantes
1,25 U d'enzyme/,ug d'ADN, 10 mM de spermidine, tampon de réaction fournie par le fabricant ; incubation une nuit à 370C.
1) Digestion d'ADN génomique
2x 100 ug d'ADN génomique canin ont été digérés par EcoRI (New England Biolabs) dans les conditions suivantes
1,25 U d'enzyme/,ug d'ADN, 10 mM de spermidine, tampon de réaction fournie par le fabricant ; incubation une nuit à 370C.
Ensuite les fragments issus des coupures ont été déposés sur un gel d'électrophorèse d'agarose à 0,7%.
La migration a été effectuée à 20 V pendant 24 heures.
Pour enrichir la banque en fragments EcoRI contenant le gène recherché, trois fractions ont été découpées par dépôt et ceci par rapport au marqueur indiquant les tailles de référence, c'est-à-dire allant de
1) 8 à 7 Kb,
2) 7,2 à 6 Kb,
3) 6,3 à 4,8 Kb
Le marqueur de taille utilisé est "Lambda DNA
Bst EII digest" (New England Biolabs réf. 301-4S).
1) 8 à 7 Kb,
2) 7,2 à 6 Kb,
3) 6,3 à 4,8 Kb
Le marqueur de taille utilisé est "Lambda DNA
Bst EII digest" (New England Biolabs réf. 301-4S).
Ces six morceaux ont été traités séparément par Spin-XTM (Costar 0,22 AM cellulose acétate) afin d'en extraire 1'ADN. Après précipitation à 1'méthanol, les culots d'ADN ont été solubilisés dans 60 ul de tampon
Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 1 mM EDTA (TE).
Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 1 mM EDTA (TE).
2 ul de chaque fraction ont été déposés sur gel d'agarose. Le résultat est illustré à la figure 5, dans laquelle A et B correspondent à 2 digestions d'ADN génomique par EcoRI et les pistes 1, 2, 3 correspondent respectivement aux poids moléculaires suivants : 1 : 8 à 7 kb, 2 : 7,2 à 6 kb, 3 : 6,3 à 4,8 kb.
De plus, une hybridation Southern a été effectuée pour connaître la fraction à liguer qui contient effectivement le gène RA-B3 canin. Pour ce faire, on fait migrer environ 750 ng de chaque fraction sur gel d'agarose.
Après électrophorèse et dénaturation, 1'ADN a été transféré sur membrane Nylon (Hybond N+ voir conditions Southern Blot telles qu'exposées ci-dessus) . On utilise les mêmes sondes de ss3 canin, le marquage ayant été fait par "random priming utilisant uniquement le dCTP a32P. Les conditions d'hybridation et de lavage sont les mêmes que précédemment.
Après exposition pendant 2 jours, on obtient les résultats illustrés à la figure 6 ; le gène codant pur le RA-B3 canin est majoritairement contenu dans la fraction 2
les deux fractions n02 venant des deux digestions (voir figure 6, dans laquelle 1, 2 et 3 ont la même signification que pour la figure 5) sont mélangées, afin de les liguer dans un vecteur bactériophagique.
les deux fractions n02 venant des deux digestions (voir figure 6, dans laquelle 1, 2 et 3 ont la même signification que pour la figure 5) sont mélangées, afin de les liguer dans un vecteur bactériophagique.
2) Ligation dans un vecteur bactériophagique et encapsidation in vitro
Comme vecteur, on utilise le bactériophage
Lambda kGEM-2 (Promega), déjà coupé par EcoRI et déphosphorylé pour éviter qu'il ne se referme sur lui-même.
Comme vecteur, on utilise le bactériophage
Lambda kGEM-2 (Promega), déjà coupé par EcoRI et déphosphorylé pour éviter qu'il ne se referme sur lui-même.
Le vecteur a été ligué avec des quantités croissantes de fragments EcoRI génomiques de la fraction 2 (voir figure 6) (Insert) : 1 ug V + 50ng I; 1 ug V + 100 ng I, 1 ug V + 150 ng I; puis 0,75 ug V + 200 ng I (V=kGEM-2, I=Insert).
Ligation à 40C.
Après ligation, les particules des phages ont été encapsidées à l'aide d'extraits d'encapsidation in vitro Promega " "PackageneR System" pendant 3 heures à 220C.
Après cette incubation, les particules des phages ainsi reconstituées sont en mesure d'infecter des bactéries d'une souche appropriée. I1 s'agit de la souche
LE 392 (Genotype: F-, hsdR 574 (rK , mu+), supE44, supF58, LacYl ou A(lacIZY)6, galK2, GalT22, metBl, trpR55).
LE 392 (Genotype: F-, hsdR 574 (rK , mu+), supE44, supF58, LacYl ou A(lacIZY)6, galK2, GalT22, metBl, trpR55).
Une colonie de ces bactéries a été mise en culture pour obtenir des cellules fraîches à infecter par les phages, le but étant de pouvoir étaler les bactéries infectées sur des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif, afin de pouvoir cribler avec une sonde radiomarquée. Pour ce faire, on dilue très fortement les phages encapsidés avant de les mettre en contact avec les cellules bactériennes afin de pouvoir les étaler à une densité voulue, c'est-à-dire de pouvoir déterminer les titres de la banque (= nombre des phages recombinants obtenus).
Ainsi, on a pu déterminer que la banque ainsi construite comporte environ 377 000 phages.
3) Criblage de la banque
Toute la banque a été étalée sur différentes boîtes de Pétri à l'aide des bactéries hôtes LE 392 et ensuite des empreintes sur membranes de nylon Hybond N+ (Amersham) ont été prises.
Toute la banque a été étalée sur différentes boîtes de Pétri à l'aide des bactéries hôtes LE 392 et ensuite des empreintes sur membranes de nylon Hybond N+ (Amersham) ont été prises.
La sonde a été faite par PCR sur ADN génomique canin avec les amorces SEQ ID NO:26 (1269) et SEQ ID
NO:47 (TR2).
NO:47 (TR2).
Les conditions de PCR ont été les suivantes
amorces à une concentration de 0,25 uM tampon comprenant diméthylsulfoxide à 10 %, 2,5 U de Taq polymérase (Promega), 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), le tampon de réaction utilisé est celui fourni par
Promega, complémenté avec 1,5 mM de MgC12.
amorces à une concentration de 0,25 uM tampon comprenant diméthylsulfoxide à 10 %, 2,5 U de Taq polymérase (Promega), 0,25 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), le tampon de réaction utilisé est celui fourni par
Promega, complémenté avec 1,5 mM de MgC12.
On utilise un appareil Perkin Elmer "Gene Amp
PCR System 9600".
PCR System 9600".
Après une étape de dénaturation initiale (2 min. à 940C), on fait 30 cycles comme suit : 15 sec. à 940C, 30 sec. à 63,60C, 60 sec. à 720C et en dernier 1 fois 3 min. à 720C.
Le fragment PCR de 1041 nucléotides ("ATG"
TM7) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et ensuite purifié par Spin - XTM (Costar 0,22 AM cellulose acétate).
TM7) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et ensuite purifié par Spin - XTM (Costar 0,22 AM cellulose acétate).
Le radiomarquage a été fait par random priming, comme précisé ci-dessus, en utilisant du dCTPa32P (Amersham réf. PB 10205).
Les conditions d'hybridation sont les mêmes que celles décrites plus haut (Southern Blot).
Les membranes ont été lavées avec une solution comprenant 3 mM de NaC1, 0,3 mM de Na-citrate, 0,05 % de
SDS, à 450C pendant 30 min.
SDS, à 450C pendant 30 min.
Après une exposition durant 4 jours, 7 signaux fortement positifs et 50 signaux faiblement positifs ont été trouvés ; seuls les signaux fortement positifs ont été pris en compte.
Après différentes étapes de purification, c'est le clone k20,1 qui a été sélectionné pour des analyses plus poussées.
4) Analyse du clone k20,1 :
L'ADN du phage B20,1 a été préparé et ensuite coupé par EcoRI (= site d'insertion) et par EcoRI-XbaI (= sites uniques sur le vecteur)
Les tailles trouvées sont les suivantes
EcoRI 6 Kb/EcoRI-XbaI 3,7 Kb et > 2,3 Kb.
L'ADN du phage B20,1 a été préparé et ensuite coupé par EcoRI (= site d'insertion) et par EcoRI-XbaI (= sites uniques sur le vecteur)
Les tailles trouvées sont les suivantes
EcoRI 6 Kb/EcoRI-XbaI 3,7 Kb et > 2,3 Kb.
Ces résultats sont en accord avec les tailles trouvées par Southern Blot sur ADN génomique canin (voir carte de restriction plus haut).
5) Sous-clonage dans un vecteur M13 pour le séquençage
Le fragment EcoRI du clone B20,1 a été souscloné dans le vecteur M13 tg131 ; les sous-clones 20,1,9 et 20,1,4 sont des clones anti-sens dans ce vecteur et ceci par rapport à l'emplacement du primer universel
M13. L'insert du clone 20,1,4 aussi appelé 4AS a été séquencé [voir plus loin 6)].
Le fragment EcoRI du clone B20,1 a été souscloné dans le vecteur M13 tg131 ; les sous-clones 20,1,9 et 20,1,4 sont des clones anti-sens dans ce vecteur et ceci par rapport à l'emplacement du primer universel
M13. L'insert du clone 20,1,4 aussi appelé 4AS a été séquencé [voir plus loin 6)].
Pour avoir l'orientation opposée, un sousclonage a également été réalisé à partir du clone 20,1,4 (4AS). Sachant que la partie intéressante de l'insert
EcoRI provenant de 1'ADN génomique se situe plus précisément entre les sites EcoRI et XbaI sur un fragment de 3,7 Kb, ce fragment a été sous-cloné dans un vecteur M13 tg 130 dans ces mêmes sites. Plusieurs sous-clones ont été obtenus : EX 3, EX 4, Ex 5, Ex 6. Le clone EX 4 aussi appelé 4S a été sélectionné pour une analyse de séquence.
EcoRI provenant de 1'ADN génomique se situe plus précisément entre les sites EcoRI et XbaI sur un fragment de 3,7 Kb, ce fragment a été sous-cloné dans un vecteur M13 tg 130 dans ces mêmes sites. Plusieurs sous-clones ont été obtenus : EX 3, EX 4, Ex 5, Ex 6. Le clone EX 4 aussi appelé 4S a été sélectionné pour une analyse de séquence.
Le gène a été séquencé sur les 2 brins (Sousclones 4S et 4AS) à l'aide d'amorces spécifiquement synthétisées.
Les amorces utilisées sur le brin anti-sens (4AS) sont, dans l'ordre séquentiel, les suivantes primer universel M13 (-40) SEQ ID NO:5 (TR 12), SEQ ID
NO:6 (TR 15), SEQ ID NO: 7 (TR 24), SEQ ID NO:4 (TR 22),
SEQ ID NO:8 (TR 21), SEQ ID NO:13 (TR25), SEQ ID NO:9 (1263), SEQ ID NO:10 (TR 7), SEQ ID NO:ll (TR 8), SEQ ID NO:12 (TR 10).
NO:6 (TR 15), SEQ ID NO: 7 (TR 24), SEQ ID NO:4 (TR 22),
SEQ ID NO:8 (TR 21), SEQ ID NO:13 (TR25), SEQ ID NO:9 (1263), SEQ ID NO:10 (TR 7), SEQ ID NO:ll (TR 8), SEQ ID NO:12 (TR 10).
Les amorces utilisées sur le brin sens (4S), dans l'ordre séquentiel, sont les suivantes : SEQ ID
NO:14 (SG 2), SEQ ID NO:15 (RT 3), SEQ ID NO:3 (RT 1),
SEQ ID NO:16 (RT 5), SEQ ID NO:17 (RT 6), SEQ ID NO:18 (RT 9), SEQ ID NO:20 (RT 17), SEQ ID NO:22 (RT 16), SEQ
ID NO:19 (RT 26), SEQ ID NO:21 (RT 27) et SEQ ID NO:23 (RT28).
NO:14 (SG 2), SEQ ID NO:15 (RT 3), SEQ ID NO:3 (RT 1),
SEQ ID NO:16 (RT 5), SEQ ID NO:17 (RT 6), SEQ ID NO:18 (RT 9), SEQ ID NO:20 (RT 17), SEQ ID NO:22 (RT 16), SEQ
ID NO:19 (RT 26), SEQ ID NO:21 (RT 27) et SEQ ID NO:23 (RT28).
6) Résultats de séquence
L'insert EcoRI-XbaI n'a pas été séquencé en totalité mais juste la partie correspondant aux séquences suivantes : la séquence en 5'=112 nucléotides avant le codon d'initiation "ATG", la phase ouverte de lecture (exons 1 et 2), l'intron, ainsi que la séquence en 3' allant jusqu'au site EcoRI (=en tout 2649 pb).
L'insert EcoRI-XbaI n'a pas été séquencé en totalité mais juste la partie correspondant aux séquences suivantes : la séquence en 5'=112 nucléotides avant le codon d'initiation "ATG", la phase ouverte de lecture (exons 1 et 2), l'intron, ainsi que la séquence en 3' allant jusqu'au site EcoRI (=en tout 2649 pb).
Les résultats obtenus, montrent la séquence nucléotidique du gène ss3-adrénergique canin composée d'une région codant pour la protéine (1196 pb dans l'exon 1 plus 22 pb dans l'exon 2), et des régions non codantes (112 pb en 5' et 616 pb en 3'), ainsi que l'intron de 703 pb qui sépare les 2 exons.
Les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2649 pb sont positionnés sur les figures 7 et 8.
La comparaison des régions codantes des gènes ss3-adrénergique canin et humain indique une forte homologie (828) (figure 9) ; toutefois, les différences observées, tant structurelles que pharmacologiques, mettent en valeur l'importance de l'isolement du récepteur 3-adrénergique canin.
La séquence ss3-adrénergique canine code pour une protéine de 405 acides aminés et porte les caractéristiques structurales des récepteurs ss3-adrénergiques, notamment les sept régions hydrophobes qui correspondent probablement à des segments transmembranaires. Dans la partie extracellulaire (el) on trouve deux sites de glycosylation (NGS et NTS) communs aux autres récepteurs ss3- adrénergiques.
Ainsi 1'exon 1 code pour la majorité de la phase ouverte allant du codon d'initiation "ATG" en position 1, à la séquence GAC GG/ en position 1196 ; la séquence intronique comporte 703 pb.
L'épissage se fait comme suit pos.1189 CTC GAC GG/g t g g g t
Leu Asp Gly
ttttt c a a g/G GCT TCC TGG GGA ATC TCT TAG
Ala Ser Trp Gly Ile Ser (Stop)
par rapport au codon d'initiation ATG
L'exon 2 code pour les 6 acides aminés cidessus.
Leu Asp Gly
ttttt c a a g/G GCT TCC TGG GGA ATC TCT TAG
Ala Ser Trp Gly Ile Ser (Stop)
par rapport au codon d'initiation ATG
L'exon 2 code pour les 6 acides aminés cidessus.
Les signaux d'épissage sont soulignés / dt............. ag/ (voir aussi Maniatis vol. 3 page 16.7 et van Spronsen, Eur. J. Biochem. 213, 1117 - 1124 (1993)).
7) Sous-clonage dans un vecteur pour expression dans des cellules eucaryotes
Le vecteur pcDNA 3 (Invitrogene) peut transformer les cellules eucaryotes en culture de manière stable et transitoire et exprimer les gènes clonés, sous dépendance du promoteur CMV (Cytomegalovirus).
Le vecteur pcDNA 3 (Invitrogene) peut transformer les cellules eucaryotes en culture de manière stable et transitoire et exprimer les gènes clonés, sous dépendance du promoteur CMV (Cytomegalovirus).
La séquence ss3-adrénergique canine montre un site BspE I à 54 bases avant le codon ATG. Le sous-clo nage a été fait en prenant les sites BspE I en 5' et
EcoRI en 3' du gène.
EcoRI en 3' du gène.
Le fragment de 2590 pb a été ligué dans le vecteur pcDNA 3 comme suit
1) - En pratique. 1'ADN du clone 4S a été coupé par BspE I (New Enaland Biolabs). Le protocole comprend ensuite
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver 1 'enzyme,
- traitement à la Klenow polymérase (New
England Biolabs) d'après Maniatis,
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme,
- coupure par EcoRI (New England Biolabs) et inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C et
- dépôt de la totalité sur gel d'agarose et purification du fragment de 2,5 kb par Spin-X.
1) - En pratique. 1'ADN du clone 4S a été coupé par BspE I (New Enaland Biolabs). Le protocole comprend ensuite
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver 1 'enzyme,
- traitement à la Klenow polymérase (New
England Biolabs) d'après Maniatis,
- extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme,
- coupure par EcoRI (New England Biolabs) et inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C et
- dépôt de la totalité sur gel d'agarose et purification du fragment de 2,5 kb par Spin-X.
2) - Ligation de ce fragment dans le vecteur qui a été préparé comme suit:
Coupure par Bam HI (New England Biolabs) inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C ; traitement à la
Klenow polymérase (New England Biolabs) d'après
Maniatis ; extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme et coupure par EcoRI (New England Biolabs) inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C.
Coupure par Bam HI (New England Biolabs) inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C ; traitement à la
Klenow polymérase (New England Biolabs) d'après
Maniatis ; extraction phénol/chloroforme pour inactiver l'enzyme et coupure par EcoRI (New England Biolabs) inactivation de l'enzyme 15 min. à 650C.
On obtient ainsi plusieurs sous-clones, le nO 8 a été séquencé pour vérifier le codon d'initiation "ATG" afin d'être sûr qu'il n'y a pas d'empêchement de la traduction du messager en protéine après transformation dans les cellules.
ExemPle 3 : Propriétés pharmacologiques du produit d'expression du gène ss3 canin.
A. MATERIELS ET METHODES
I. Techniques de transfection
a) Transfection stable de cellules CHO-Ki
Le plasmide pcDNA3 contenant le gène du récepteur ss3 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 par une méthode de transfection à la lipofectine (Gibco) ; les cellules transfectées sont sélectionnées avec de la généticine (G418).
I. Techniques de transfection
a) Transfection stable de cellules CHO-Ki
Le plasmide pcDNA3 contenant le gène du récepteur ss3 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 par une méthode de transfection à la lipofectine (Gibco) ; les cellules transfectées sont sélectionnées avec de la généticine (G418).
Méthode de transfection
Les cellules CHO-K1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 50 % de milieu DMEM, 50 % de milieu Ham's F12, 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et de la glutamine 2 mM.
Les cellules CHO-K1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 50 % de milieu DMEM, 50 % de milieu Ham's F12, 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et de la glutamine 2 mM.
1 ug d'ADN du plasmide pcDNA3 ss3 canin est mélangé à 5 ul de lipofectine (GIBCO) et 1 ml du milieu de culture décrit, sans sérum. Ce mélange est ajouté aux cellules en culture, qui sont incubées 5 heures à 370C.
Le milieu est remplacé alors par le milieu de culture précité contenant du sérum et les cellules sont à nouveau incubées 48 heures.
Les cellules sont alors diluées et réparties dans des plaques de 96 puits et incubées en pression de sélection c'est-à-dire dans le milieu de culture précité contenant de la généticine (G418 GIBCO) 400 ug/ml pendant environ 20 jours, le milieu étant changé tous les deux jours.
Les clones obtenus sont ensuite sous-clonés et les sous-clones obtenus sont criblés pour leur capacité à lier de façon spécifique l' [125I]-cyanopindolol (ICYP) ainsi que leur capacité à stimuler l'adénylyl cyclase.
b) Transfection transitoire de cellules COS-1:
Méthode de transfection
Les cellules COS-1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 90% de milieu DMEM, 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, de la glutamine 2 mM et de 1'HEPES 10 mM. 48 heures avant la transfection les cellules sont lavées, décollées avec de la trypsine et ensemencées à 1,7 cellules/cm en plaques de 6 puits.
Méthode de transfection
Les cellules COS-1 sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant: 90% de milieu DMEM, 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, de la glutamine 2 mM et de 1'HEPES 10 mM. 48 heures avant la transfection les cellules sont lavées, décollées avec de la trypsine et ensemencées à 1,7 cellules/cm en plaques de 6 puits.
Le jour de la transfection, les cellules COS-1 sont lavées 2 fois en tampon PBS, chaque puits est incubé avec 1 ml de milieu DMEM de transfection contenant 1 ug de pcDNA3/rss3 (miniprep) et 20 ul de DEAE-Dextran (10 mg/ml) préalablement mélangés et 8 ul de chloroquine 10 mM, pendant 4 à 6 heures à 370C. Le milieu de transfection est aspiré et les cellules sont incubées avec 10 % de DMSO dans le milieu DMEM pendant exactement 90 secondes. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et 3 ml de milieu DMEM contenant 10 % de sérum sont ajoutés dans tous les puits. La préparation membranaire pour les essais de liaison et l'accumulation d'AMPc sur cellules entières sont réalisés 48 à 72 heures après la transfectien.
II. PréParation de membranes de cellules COS-1 agrès transfection
L'activité de 1'adénylyl cyclase et les essais de liaison sont réalisés sur des préparations membranaires de cellules COS-1 transfectées de façon transitoire comme expliqué ci-dessus.
L'activité de 1'adénylyl cyclase et les essais de liaison sont réalisés sur des préparations membranaires de cellules COS-1 transfectées de façon transitoire comme expliqué ci-dessus.
Le milieu de culture des cellules est enlevé, les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec 1 ml/puits dans un tampon de lyse (choc hypotonique) contenant Tris/HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM et les inhibiteurs de protéases PMSF (0,5 mM) et leupeptine (5 Rg/ml) pendant 10 minutes à 40C, puis homogénéisées, transférées dans des tubes pour centrifugation et incubées de nouveau 15 minutes à 40C. Les cellules sont ensuite centrifugées 60 minutes, à 40C, 20 000 rpm (50 000 g) rotor JA20. Les culots membranaires sont repris dans le tampon de stockage (Tris/HCl 25 mM pH 7,4, 1 mM d'EDTA, 10 % de glycérol et les inhibiteurs de protéases) et stockés à -800C.
III. Mesure de la Production d'AMPc
Les cellules préconfluentes (0,5 x 106 cellules/puits) sont lavées avec du milieu Ham's F12 pH 7,4 contenant de la 3-isobutyl-méthyl)xanthine (IBMX, Sigma) 1 mM et de 1'HEPES 20 mM. Les cellules sont incubées 25 min. à 370C dans 1 ml de milieu, en l'absence (niveau basal) ou en présence de 100 uM d'(-)-isoprotérénol (effet maximum), ou de 100 AM de forskoline (stimulation directe de l'adénylyl cyclase), ou 10 AM de ligand. L'activité antagoniste est testée, en pré-incubant les cellules avec 10 AM de ligand 10 min. avant l'ajout de 1' 1'(-)isoprotérénol à une concentration sous-maximale de 108 M. La réaction est arrêtée par un lavage avec 1 ml de
PBS (Phosphate Buffered Saline) et l'addition de 500 ul de soude 1 N. Après 20 min. à 370C. Les cellules décollées et lysées sont reprises, ajoutées à de l'acide acétique 1 N, pH 7,4 et centrifugées à 3 000 x g, 40C, 10 minutes. Le taux d'AMPc total contenu dans 50 ul de surnageant est déterminé en utilisant le kit de dosage
Amersham (Kit 3H-cAMP Amersham ref. TRK 432). Les expériences ont toutes été réalisées 2 ou 3 fois en duplicats.
Les cellules préconfluentes (0,5 x 106 cellules/puits) sont lavées avec du milieu Ham's F12 pH 7,4 contenant de la 3-isobutyl-méthyl)xanthine (IBMX, Sigma) 1 mM et de 1'HEPES 20 mM. Les cellules sont incubées 25 min. à 370C dans 1 ml de milieu, en l'absence (niveau basal) ou en présence de 100 uM d'(-)-isoprotérénol (effet maximum), ou de 100 AM de forskoline (stimulation directe de l'adénylyl cyclase), ou 10 AM de ligand. L'activité antagoniste est testée, en pré-incubant les cellules avec 10 AM de ligand 10 min. avant l'ajout de 1' 1'(-)isoprotérénol à une concentration sous-maximale de 108 M. La réaction est arrêtée par un lavage avec 1 ml de
PBS (Phosphate Buffered Saline) et l'addition de 500 ul de soude 1 N. Après 20 min. à 370C. Les cellules décollées et lysées sont reprises, ajoutées à de l'acide acétique 1 N, pH 7,4 et centrifugées à 3 000 x g, 40C, 10 minutes. Le taux d'AMPc total contenu dans 50 ul de surnageant est déterminé en utilisant le kit de dosage
Amersham (Kit 3H-cAMP Amersham ref. TRK 432). Les expériences ont toutes été réalisées 2 ou 3 fois en duplicats.
IV. Mesure de la liaison
a) Méthode de liaison sur les clones stables CHO 3 canin
Les études de liaison sur les cellules CHO-K1 p3 canin ont été menées suivant le protocole décrit dans
Tate et al., Eur. J. Biochem., 1991, 196, 357-361.
a) Méthode de liaison sur les clones stables CHO 3 canin
Les études de liaison sur les cellules CHO-K1 p3 canin ont été menées suivant le protocole décrit dans
Tate et al., Eur. J. Biochem., 1991, 196, 357-361.
b) Liaison sur préparation membranaire
Les mesures de liaison ont été menées sur des préparations membranaires réalisées à partir des cellules
COS-1 transfectées pendant 72 heures.
Les mesures de liaison ont été menées sur des préparations membranaires réalisées à partir des cellules
COS-1 transfectées pendant 72 heures.
Les aliquots membranaires, 10-15 Rg de protéines par point, sont incubés dans un tampon contenant une solution saline Hank's (réf. 010328 catalogue Eurobio), de 1'HEPES 20 mM et 0,1 % de BSA (bovine serum albumin), avec 1 nM d'ICYP (2 000 Ci/mmol) en présence ou en l'absence de concentrations croissantes de compétiteur (1 pM-100 WM) ; l'inhibition de 1'ICYP par le (-)-bupranonol M M permet d'estimer la liaison non spécifique.
Les courbes de saturation ont été réalisées en présence de concentrations croissantes d'ICYP (1 pM à 4 nM) en présence de (-)-bupranolol 10 M (liaison non spécifique).
Les tubes sont incubés 30 minutes à 370C sous agitation. L'arrêt de la réaction se fait par filtration des aliquots sur filtre en fibres de verre saturé préalablement avec 0,3 % de polyéthylèneimine, suivi par 3 lavages avec 3 ml de tampon PBS (phosphate buffered saline) glacé. La radioactivité retenue sur le filtre est mesurée dans un compteur gamma (CompuGamma LKB 1282).
B. RESULTATS
Expression stable du récepteur ss3 canin dans les cellules CHO-Ki.
Expression stable du récepteur ss3 canin dans les cellules CHO-Ki.
* Sélection des clones stables exprimant le récepteur ss3 canin
Le plasmide pcDNA3/rss3 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines, 30 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Le plasmide pcDNA3/rss3 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines, 30 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Ces clones ont été testés pour leur capacité à lier le radioligand ICYP suivant le protocole décrit à l'exemple 3. Ce test permet d'évaluer le niveau d'expression des récepteurs à la membrane des cellules.
Sept clones ont été ainsi sélectionnés pour leur bon niveau d'expression des récepteurs à la membrane plasmique (le rapport de la liaison spécifique sur la liaison non spécifique était au moins supérieur à 5).
* Mesure de l'accumulation d'AMPc
Deux clones ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adényîyl cyclase. La figure 10 présente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur ss3 canin (CHO-K1 ss3 canin).
Deux clones ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adényîyl cyclase. La figure 10 présente une expérience typique réalisée avec l'un des deux clones stables exprimant le récepteur ss3 canin (CHO-K1 ss3 canin).
L'accumulation d'AMPc a été mesurée simultanément sur ce clone et sur un clone stable CHO-K1 exprimant le récepteur ss3 humain comme contrôle positif (CHO-K1 ss3 humain).
L'(-)-isoprotérénol a été utilisé à la concentration de 10 M (iso-4) et deux ligands spécifiques du récepteur 53-adrénergique humain, le CGP12177A et le
CL316,243 à la concentration de 10 M. Cette expérience a été réalisée au moins deux fois en duplicats avec deux différents clones.
CL316,243 à la concentration de 10 M. Cette expérience a été réalisée au moins deux fois en duplicats avec deux différents clones.
Les résultats (figure 10) montrent que dans ce type cellulaire, à savoir les cellules CHO-K1, lorsque le récepteur ss3 canin est exprimé à la membrane des cellules, il est peu ou pas couplé à l'effecteur adénylyl cyclase.
Expression transitoire et activité du récepteur ss3 canin dans les cellules COS-1.
* Mesure de l'accumulation d'AMPc dans les cellules COS-1 exprimant le récepteur ss3 canin.
Les courbes dose-réponse ont permis de déterminer les valeurs des constantes d'activation (Kact) et les activités intrinsèques (IA, prenant comme référence l'activité maximale de l'(-)-isoprotérénol 10 M), pour chaque ligand testé (-)-norépinéphrine, épinéphrine, (-)-isoprotérénol, CGP 12177A et CL 316,243.
<tb>
<SEP> Ligands <SEP> K <SEP> <SEP> (nM) <SEP> IA <SEP>
<tb> (-)-isoprotérénol <SEP> 83+16 <SEP> l,lf0,1 <SEP>
<tb> (-)-épinéphrine <SEP> 1 <SEP> 560+940 <SEP> 0,71+0,09 <SEP>
<tb> (-)-norépinéphrine <SEP> 2381210 <SEP> 0,7010,30
<tb> CGP <SEP> l2177A <SEP> <SEP> 38118 <SEP> 0,5510,11 <SEP>
<tb> CL <SEP> 316,243
<tb> (-)-bupranolol <SEP> 13+4 <SEP> 0,7110,14
<tb> <SEP> antagoniste
<tb>
L'ordre de potentialité des catécholamines physiologiques : la (-)-norépinéphrine, l'(-)-épinéphrine, et synthétique : l'(-)-isoprotérénol, défini pour le récepteur ss3 canin est similaire à celui déjà décrit pour les récepteurs ss3 humain, de rongeurs et bovin (BLIN
N. et al., Br. J. Pharmacol., 1994, 112, 911-919
PIETRI-ROUXEL F. et al., Eur. J. Biochem., 1995, 230, 350-358). Les agonistes spécifiques du sous-type ss3 adrénergique comme le CGP 12177A et le CL 316,243 sont également décrits ici comme étant d protérénol, CGP 12177A et CL 316,243, pour lesquels les constantes d'inhibition (Ki) ont été déterminées.
<tb> (-)-isoprotérénol <SEP> 83+16 <SEP> l,lf0,1 <SEP>
<tb> (-)-épinéphrine <SEP> 1 <SEP> 560+940 <SEP> 0,71+0,09 <SEP>
<tb> (-)-norépinéphrine <SEP> 2381210 <SEP> 0,7010,30
<tb> CGP <SEP> l2177A <SEP> <SEP> 38118 <SEP> 0,5510,11 <SEP>
<tb> CL <SEP> 316,243
<tb> (-)-bupranolol <SEP> 13+4 <SEP> 0,7110,14
<tb> <SEP> antagoniste
<tb>
L'ordre de potentialité des catécholamines physiologiques : la (-)-norépinéphrine, l'(-)-épinéphrine, et synthétique : l'(-)-isoprotérénol, défini pour le récepteur ss3 canin est similaire à celui déjà décrit pour les récepteurs ss3 humain, de rongeurs et bovin (BLIN
N. et al., Br. J. Pharmacol., 1994, 112, 911-919
PIETRI-ROUXEL F. et al., Eur. J. Biochem., 1995, 230, 350-358). Les agonistes spécifiques du sous-type ss3 adrénergique comme le CGP 12177A et le CL 316,243 sont également décrits ici comme étant d protérénol, CGP 12177A et CL 316,243, pour lesquels les constantes d'inhibition (Ki) ont été déterminées.
<tb>
<SEP> Ligands <SEP> Ki <SEP> (nM)
<tb> (-)-isoprotérénol <SEP> 10 <SEP> 700+4 <SEP> 100
<tb> (-)-épinéphrine <SEP> 133 <SEP> 000+121 <SEP> 000
<tb> (-)-norépinéphrine <SEP> 60 <SEP> 0001800 <SEP>
<tb> CGP <SEP> 121772 <SEP>
<tb> CL <SEP> 316,243 <SEP> 279+137 <SEP>
<tb> bupranolol <SEP> 640+320
<tb> <SEP> 242+45
<tb> <SEP> ICYP <SEP> Kn <SEP> <SEP> = <SEP> 4,75+3,13 <SEP> nM
<tb>
L'ordre d'affinité des catécholamines (-)norépinéphrine, (-)-épinéphrine et (-)-isoprotérénol correspond au profil décrit pour les récepteurs ss3 adrénergiques humain, bovin et de rongeurs.
<tb> (-)-isoprotérénol <SEP> 10 <SEP> 700+4 <SEP> 100
<tb> (-)-épinéphrine <SEP> 133 <SEP> 000+121 <SEP> 000
<tb> (-)-norépinéphrine <SEP> 60 <SEP> 0001800 <SEP>
<tb> CGP <SEP> 121772 <SEP>
<tb> CL <SEP> 316,243 <SEP> 279+137 <SEP>
<tb> bupranolol <SEP> 640+320
<tb> <SEP> 242+45
<tb> <SEP> ICYP <SEP> Kn <SEP> <SEP> = <SEP> 4,75+3,13 <SEP> nM
<tb>
L'ordre d'affinité des catécholamines (-)norépinéphrine, (-)-épinéphrine et (-)-isoprotérénol correspond au profil décrit pour les récepteurs ss3 adrénergiques humain, bovin et de rongeurs.
Exemple 4 : Isolement et identification du gène ss2- adrénergique canin.
1) Préparation d'ARN
Le gène ss2-adrénergique canin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de chiots nouveaux-nés, construite dans le bactériophage x gt 11.
Le gène ss2-adrénergique canin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de chiots nouveaux-nés, construite dans le bactériophage x gt 11.
Pour ce faire, les ARN totaux ont été obtenus à partir de tissu adipeux brun de chiots par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidium. Ensuite, les ARN messagers poly A+ ont été purifiés à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. 27-9258-A).
2) Synthèse d'ADNc :
L'étape suivante a consisté à synthétiser l'ADNc en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo(dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis system" (Promega réf. C2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait à l'aide d'une enzyme (1'AMV reverse transcriptase), suivie par la synthèse du deuxième brin à l'aide de deux enzymes agissant en même temps (E. coli polymérase I et RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymérase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C2100 a été utilisé pour toutes ces réactions successives.
L'étape suivante a consisté à synthétiser l'ADNc en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo(dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis system" (Promega réf. C2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait à l'aide d'une enzyme (1'AMV reverse transcriptase), suivie par la synthèse du deuxième brin à l'aide de deux enzymes agissant en même temps (E. coli polymérase I et RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymérase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C2100 a été utilisé pour toutes ces réactions successives.
Une fois l'ADNc synthétisé, des adaptateurs comportant des sites EcoRi ont été ajoutés, afin de pouvoir l'insérer dans le bactériophage x gt 11. Pour ce faire, le kit "EcoRI Adaptor Ligation System I" (Promega réf. C1900) a été utilisé. D'abord l'ADNc a été centrifugé à travers une matrice Sephacryl S-400 (kit), pour enlever les molécules de petite taille, ensuite les adaptateurs ont été ajoutés aux molécules d'ADNc par ligation (T4 DNA Ligase du kit) durant la nuit et une nouvelle centrifugation à travers une colonne Sephacryl S-400 a permis d'éliminer les adaptateurs non fixés. Avant de pouvoir insérer l'ADNc ainsi traité dans le vecteur X gt 11, il faut phosphoryler ses adaptateurs à l'aide de l'enzyme T4 polynucléotide kinase, contenue dans le kit.
3) Sélection de molécules d'ADNc de grande taille
Avant de liguer les molécules d'ADNc dans le vecteur X gt 11, on sélectionne les fractions comprises entre 1,3 et 2,3 kilobases (kb). Cette étape sélective est considérée comme un enrichissement, mais ce n'est pas réellement une purification, autrement dit les molécules d'ADNc de tailles avoisinantes ne sont pas totalement exclues.
Avant de liguer les molécules d'ADNc dans le vecteur X gt 11, on sélectionne les fractions comprises entre 1,3 et 2,3 kilobases (kb). Cette étape sélective est considérée comme un enrichissement, mais ce n'est pas réellement une purification, autrement dit les molécules d'ADNc de tailles avoisinantes ne sont pas totalement exclues.
Pour ce faire, l'ADNc est déposé sur un gradient d'acétate de potassium (5 à 20%) et ensuite centrifugé à 50 000 rpm (correspond à 170 000-304 000 g dans ce rotor) pendant trois heures à 220C dans un rotor SW 55 (Beckman). Ensuite, 27 fractions d'ADNc ont été prélevées. Après dépôt d'une petite quantité de chaque fraction sur un gel 0,8% agarose, nous avons sélectionné 4 fractions correspondant aux tailles voulues. Ces frac tions ont été mélangées et ensuite liguées avec le vecteur X gt 11.
4) Insertion (ligation) dans le bactériophage x gt 11
Le bactériophage X gt 11, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gt 11 System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par
EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
Le bactériophage X gt 11, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gt 11 System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par
EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
Plusieurs ligations ont été faites avec des petites quantités variables d'ADNc, chacune liguée avec 0,5 ug d'ADN de vecteur. Les ligations ont été faites pendant trois heures à température ambiante, en prenant la T4 DNA Ligase du kit Promega C1900 (voir plus haut).
Tout de suite après, on procède à l'encapsidation in vitro à l'aide des extraits "Packagene" fournis par le kit Promega T301/0-2 (voir plus haut). Après une incubation à 220C durant deux heures et demie, les particules des phages ainsi reconstituées sont en mesure d'infecter des bactéries d'une souche appropriée. I1 s'agit de la souche Y 1090(r-) (Genotype: A(LacU169), proA+, A(lon); araD139, strA, SupF, (trpC22:TnlO (tetr), (pMC9), hsdR(rK-, mk+). Une colonie de ces bactéries a été mise en culture pour obtenir des cellules fraîches à infecter par les phages, le but étant de pouvoir étaler les bactéries infectées sur des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif, afin de pouvoir cribler avec une sonde radiomarquée. Pour ce faire, on dilue très fortement les phages encapsidés, avant de les mettre en contact avec les cellules bactériennes, afin de pouvoir les étaler à une densité voulue, c'est-à-dire de pouvoir déterminer le titre de la banque (=nombre des phages recombinants obtenus).
Parallèlement, le vecteur seul a aussi été ligué et encapsidé afin de pouvoir connaître le bruit de fond de ce lot de X gt 11.
Chaque dilution de phages a été incubée avec des cellules Y1090 (r-) à 370C durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées ont été étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de
Pétri. Les boîtes sont incubées une nuit à 37aC, et le lendemain on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant. En comptant le nombre de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, on peut ainsi déterminer le titre de la banque, qui est d'environ 340 000 phages recombinants.
Pétri. Les boîtes sont incubées une nuit à 37aC, et le lendemain on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant. En comptant le nombre de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, on peut ainsi déterminer le titre de la banque, qui est d'environ 340 000 phages recombinants.
(Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de 20 %).
5) Criblage des phages recombinants
En se basant sur ces chiffres, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîtes de Pétri (milieu LB agar) afin de pouvoir cribler avec une sonde radiomarquée. Cette fois, c'est la souche bactérienne LE 392 (Genotype: F, hdsR 574 mK+ , mu+) supE44, supF58, lacYl ou A < lacIZY)6, galK2, galT22, metBl, trpR55), qui a été utilisée.
En se basant sur ces chiffres, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîtes de Pétri (milieu LB agar) afin de pouvoir cribler avec une sonde radiomarquée. Cette fois, c'est la souche bactérienne LE 392 (Genotype: F, hdsR 574 mK+ , mu+) supE44, supF58, lacYl ou A < lacIZY)6, galK2, galT22, metBl, trpR55), qui a été utilisée.
Comme sonde radiomarquée, un fragment d'environ 600 paires de bases (pb) du gène ss3-adrénergique humain (L.J. Emorine et al., 1989, Science, 245, 11181121) a été utilisé. La sonde comprend la région codante allant du codon d'initiation (ATG) jusqu'au domaine transmembranaire 5 (TM 5).
Le radiomarquage de ce fragment a été fait par
Random Priming (Kit Boehringer réf. 1004 760), en incorporant 50 RCi de dATP < a32P) et de 50 RCi de dCTP(a32P) (Amersham réf. PB 10204 et réf. PB 10205 respectivement).
Random Priming (Kit Boehringer réf. 1004 760), en incorporant 50 RCi de dATP < a32P) et de 50 RCi de dCTP(a32P) (Amersham réf. PB 10204 et réf. PB 10205 respectivement).
D'abord, des empreintes d'ADN des plages de lyse sur des membranes Hybond N+ (Amersham réf. RPN 132B) ont été prises. Ces membranes ont ensuite été hybridées avec la sonde en question, puis lavées et exposées pendant une nuit sur film d'autoradiographie.
24 signaux d'hybridation ont été observés, dont 23 se sont par la suite révélés être de faux positifs. Le clone restant positif, appelé AD1, a été purifié par quatre isolements successifs, suivis d'une hybridation avec la sonde ss3-adrénergique humaine.
6) Analyse du clone positif
Pour identifier le clone contenant le gène ss2- adrénergique canin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, lfADN du phage kD1 a été préparé. Cet ADN a été coupé ensuite par l'enzyme de restriction EcoRI afin de vérifier la taille de l'insert. Il y a en effet lieu de noter que deux fragments ont été obtenus : un de 2,4 kb et un de 0,25 kb, ce qui laisse supposer la présence d'un site
EcoRI propre au gène ss2-adrénergique canin, car le site
EcoRI est unique sur le vecteur X gt 11.
Pour identifier le clone contenant le gène ss2- adrénergique canin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, lfADN du phage kD1 a été préparé. Cet ADN a été coupé ensuite par l'enzyme de restriction EcoRI afin de vérifier la taille de l'insert. Il y a en effet lieu de noter que deux fragments ont été obtenus : un de 2,4 kb et un de 0,25 kb, ce qui laisse supposer la présence d'un site
EcoRI propre au gène ss2-adrénergique canin, car le site
EcoRI est unique sur le vecteur X gt 11.
7) Sous-clonage des fragments EcoRI dans un vecteur M13
Les fragments EcoRI du clone kD1 ont été souscloné dans un bactériophage M13 (M13 tg 131) approprié pour faire le séquençage ; de cette manière, l'on obtient 4 sous-clones
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin sens, appelé "H",
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin anti-sens, appelé "D3",
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin sens, appelé "16,4", et
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin anti-sens, appelé "16,2".
Les fragments EcoRI du clone kD1 ont été souscloné dans un bactériophage M13 (M13 tg 131) approprié pour faire le séquençage ; de cette manière, l'on obtient 4 sous-clones
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin sens, appelé "H",
- un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin anti-sens, appelé "D3",
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin sens, appelé "16,4", et
- un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin anti-sens, appelé "16,2".
8) Séquençage du gène ss2-adrénergique canin
Les 4 sous-clones ont été entièrement séquencés à l'aide du kit Sequenase version 2.0 (Amersham
United States Biochemical réf. 70770). La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens (H et 16,4) ou sur le brin antisens (D3 et 16,2). Ces amorces sont représentées par les séquences suivantes
- amorces sens : SEQ ID NO:27SEQ ID NO:36
- amorces sens : SEQ ID NO:37SEQ ID NO:46.
Les 4 sous-clones ont été entièrement séquencés à l'aide du kit Sequenase version 2.0 (Amersham
United States Biochemical réf. 70770). La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens (H et 16,4) ou sur le brin antisens (D3 et 16,2). Ces amorces sont représentées par les séquences suivantes
- amorces sens : SEQ ID NO:27SEQ ID NO:36
- amorces sens : SEQ ID NO:37SEQ ID NO:46.
Les résultats obtenus à partir de la séquence des fragments EccRi, montrent la séquence nucléotidique du récepteur ss2-adrénergique canin (1248 pb) et des régions non-codantes (168 pb en 5' et 1262 pb en 3').
Les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb sont positionnés sur les figures 11 et 12.
La comparaison des régions codantes des gènes ss2-adrénergique canin et humain et des rongeurs (hamster, rat, souris), indique une forte homologie (87%) (figure 13).
La séquence ss2-adrénergique canine code pour une protéine de 415 acides aminés SEQ ID NO:2 et porte les caractéristiques structurales des récepteurs ss- adrénergiques, notamment les sept régions hydrophobes qui correspondent probablement à des segments transmembranaires. Dans la partie extracellulaire (el) on trouve deux sites de glycosylation (NRS et NGS) communs aux autres récepteurs ss2-adrénergiques.
La partie C-terminale intracellulaire (i4) est plus conservée entre les récepteurs ss2-adrénergiques qu'entre les récepteurs ss3-adrénergiques. Toutefois, la séquence humaine révèle une absence de 6 résidus en position 360. Trois résidus sont absents dans la séquence ss2- adrénergique canin en position 391 comparée aux autres séquences ss2-adrénergiques. La figure 13 montre la comparaison en acides aminés des différents récepteurs B2 adrénergiques.
9) Vérification de la présence du site EcoRI interne au gène
Pour vérifier que les deux fragments EcoRI composent le gène ss2-adrénergique canin, une amplification PCR a été réalisée sur l'ADN du phage kD1 avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du site EcoRI (SEQ
ID NO:35 et SEQ ID NO:37). Un fragment de 720 pb a ainsi pu être amplifié. Après sous-clonage dans le vecteur M13 tg 130 (clone nO 2) et séquençage de ce fragment, la certitude que le site EcoRI se trouve en position 2427 sur la séquence a été apportée.
Pour vérifier que les deux fragments EcoRI composent le gène ss2-adrénergique canin, une amplification PCR a été réalisée sur l'ADN du phage kD1 avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du site EcoRI (SEQ
ID NO:35 et SEQ ID NO:37). Un fragment de 720 pb a ainsi pu être amplifié. Après sous-clonage dans le vecteur M13 tg 130 (clone nO 2) et séquençage de ce fragment, la certitude que le site EcoRI se trouve en position 2427 sur la séquence a été apportée.
10) Préparation d'une sonde spécifique du gène ss2-adrénergique canin:
Le fragment EcoRI de 2427 pb du clone "H" a été purifié et utilisé comme sonde. Ce fragment d'ADN a été radiomarqué, comme décrit plus haut, par la méthode du Random Priming. La sonde ainsi préparée a été utilisée dans des expériences d'hybridation d'ADN génomique (Southern Blot), pour estimer sa spécificité vis-à-vis du gène ss2-adrénergique. L'ADN génomique canin a été coupé par les enzymes de restriction suivantes EcoRI, Hind
III, Bam HI, Xba I. Après séparation des fragments dans un champ électrophorétique sur gel d'agarose à 0,7 %, 1'ADN a été transféré sur une membrane de nylon (Amersham, Hybond N+). Cette membrane a été hybridée avec la sonde EcoRI puis lavée à faible stringence et ensuite autoradiographiée.
Le fragment EcoRI de 2427 pb du clone "H" a été purifié et utilisé comme sonde. Ce fragment d'ADN a été radiomarqué, comme décrit plus haut, par la méthode du Random Priming. La sonde ainsi préparée a été utilisée dans des expériences d'hybridation d'ADN génomique (Southern Blot), pour estimer sa spécificité vis-à-vis du gène ss2-adrénergique. L'ADN génomique canin a été coupé par les enzymes de restriction suivantes EcoRI, Hind
III, Bam HI, Xba I. Après séparation des fragments dans un champ électrophorétique sur gel d'agarose à 0,7 %, 1'ADN a été transféré sur une membrane de nylon (Amersham, Hybond N+). Cette membrane a été hybridée avec la sonde EcoRI puis lavée à faible stringence et ensuite autoradiographiée.
Les résultats indiquent, pour la coupure
EcoRI, un fragment de 8 à 8,5 kb, pour la coupure BamHI un fragment d'environ 20 kb, pour la coupure XbaI un fragment de 7,5 à 8 kb et pour la coupure Hind III un fragment de 4 kb. La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologues au gène ss2-adrénergique.
EcoRI, un fragment de 8 à 8,5 kb, pour la coupure BamHI un fragment d'environ 20 kb, pour la coupure XbaI un fragment de 7,5 à 8 kb et pour la coupure Hind III un fragment de 4 kb. La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologues au gène ss2-adrénergique.
Exemple 5 : Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur ss2-adrénergique canin.
La carte de restriction du gène ss2- adrénergique canin (figures 11 et 12) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Nae I, en position 154, soit 15 pb en amont de la région codante du gène ss2- adrénergique canin. L'ADN du clone M13 - H a été digéré avec les enzymes Nae I et EcoRI, pour libérer le fragment de 2273 pb contenant la région codante du gène ss2- adrénergique canin et une partie de la région 3' nontraduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pcDNA 3 (Invitrogene), aux sites de coupure Bam HI et EcoRI. Comme les extrémités
Nae I d'une part et Bam HI d'autre part, ne sont pas compatibles, les extrémités Bam HI du vecteur ont été traitées avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (Maniatis et al.,
Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43). La coupure Nae I génère des bouts francs et après ligation, on a ainsi obtenu le plasmide recombinant pcDNA 3/rss2- adrénergique canin (sous-clone 41). Le gène du récepteur ss2-adrénergique canin se trouve alors sous dépendance du promoteur fort CMV (cytomegalovirus), qui assure une surexpress ion du gène une fois introduit dans les cellules de mammifères.
Nae I d'une part et Bam HI d'autre part, ne sont pas compatibles, les extrémités Bam HI du vecteur ont été traitées avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (Maniatis et al.,
Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43). La coupure Nae I génère des bouts francs et après ligation, on a ainsi obtenu le plasmide recombinant pcDNA 3/rss2- adrénergique canin (sous-clone 41). Le gène du récepteur ss2-adrénergique canin se trouve alors sous dépendance du promoteur fort CMV (cytomegalovirus), qui assure une surexpress ion du gène une fois introduit dans les cellules de mammifères.
Exemple 6 : Etude de l'expression du récepteur ss2 canin dans les cellules CHO-K1.
* Sélection des clones stables exprimant le récepteur ss2 canin
Le plasmide pcDNA3/rss2 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines environ, 39 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Le plasmide pcDNA3/rss2 adrénergique canin a été transfecté dans des cellules CHO-K1 comme décrit à l'exemple 3. Après 3 semaines environ, 39 clones résistants à la généticine ont été sélectionnés.
Ces clones ont été testés pour leur capacité à lier le radioligand ICYP, suivant le protocole décrit à l'exemple 3. Ce test permet d'évaluer le niveau d'expression des récepteurs à la membrane des cellules.
Quatre clones ont été ainsi sélectionnés pour leur bon niveau d'expression des récepteurs à la membrane plasmique (le rapport de liaison spécifique sur la liaison non spécifique était au moins supérieur à 3). Le sous-clonage de ces clones a été entrepris afin de sélectionner une population homogène de cellules exprimant un taux élevé de récepteurs à la surface cellulaire. Sur ce critère, les expériences d'accumulation d'AMPc ont été réalisées sur les sous-clones obtenus du clone 65.
* Mesure de l'accumulation d'AMPc
10 sous-clones du clone 65 ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adénylyl cyclase.
10 sous-clones du clone 65 ont été choisis pour la poursuite des études de fonctionnalité par la mesure de l'activité de l'adénylyl cyclase.
L'accumulation d'AMPc a été mesurée sur ces sous-clones et sur un clone stable CHO exprimant le récepteur ss2 humain comme contrôle positif. L'(-)-isoprotérénol à la concentration de 10 M (iso-4) a été utilisé. Cette expérience a été réalisée en duplicats sur les 10 sousclones. La figure 14 présente une expérience typique réalisée avec 2 sous-clones exprimant le récepteur ss2 canin (CHO-K1 ss2 canin 10 et CHO-K1 2 canin 31). L'accumulation d'AMPc a été mesurée simultanément sur ces deux sousclones et sur un clone stable CHO exprimant le récepteur ss2 humain (CHO-B2 humain) comme contrôle positif. Les résultats montrent que dans ce type cellulaire, à savoir les cellules CHO-K1, lorsque le récepteur ss2 canin est exprimé à la membrane plasmique des cellules, il est peu ou pas couplé à l'effecteur adénylyl cyclase.
(2) INFORNATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: Séquence codant pour le RA-ss2 adrénergique canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2679 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCACTCCGGG GCGGCTTCTC GGGGCGCAGG CTGTGGGGGC CGCGCGGGCG AGCGCAGAGC 60 ACCCCGCGAG CTGGATGCGG CTTCCCGGCG CCCGCTCGCT GCCCGCGGCG CCGCCCCCGA 120 GGTCCGCCCG CTGAGGCGCC CGTGCGCTCA CCTGCCGGCC CGCGCGCCAT GGGCCAGCCC 180 GCGAACCGCA GCGTCTTCTT GCTGGCGCCC AACGGGAGCC ACGCGCCGGA CCAGGGAGAC 240 TCGCAGGAGC GGAGCGAGGC GTGGGTGGTG GGCATGGGCA TCGTCATGTC GCTCATCGTC 300
CTGGCCATCG TGTTCGGGAA CGTGCTGGTC ATCACGGCCA TCGCCAGGTT CGAGCGTCTG 360
CAGACGGTCA CCAACTACTT CATCACCTCC CTGGCCTGTG CTGACCTGGT CATGGGCCTG 420 GCGGTGGTGC CCTTTGGGGC CAGCCACATC CTCATGAAAA TGTGGACCTT CGGCAACTTC 480 TGGTGTGAGT TTTGGACTTC CATTGACGTA TTGTGCGTCA CGGCCAGCAT CGAGACCCTG 540
TGCGTGATCG CGGTGGACCG CTACTTTGCC ATCACCTCGC CCTTCAAGTA CCAGAGCCTG 600
CTGACCAAGA ATAAGGCCCG GGTGGTCATT CTGATGGTGT GGATCGTGTC CGGCCTCACC 660
TCCTTCTTGC CCATCCAGAT GCACTGGTAC CGGGCCACCC ACCAGGAAGC CATCAACTGC 720 TACGCCAAGG AGACGTGCTG TGACTTCTTC ACGAACCAAG CCTATGCCAT TGCCTCCTCC 780
ATCGTGTCCT TCTACCTACC CCTGGTGGTC ATGGTCTTCG TCTACTCCAG GGTCTTCCAG 840
GTGGCCCAGA GGCAGCTCCA GAAGATCGAC AGATCGGAGG GCCGCTTCCA TGCCCAAAAC 900
CTCAGCCAAG TGGAGCAGGA TGGGCGGAGC GGGCACGGAC ATCGGAGGTC CTCCAAGTTC 960 TGCTTGAAGG AACACAAGGC CCTCAAAACT CTGGGCATCA TCATGGGCAC TTTCACCCTG 1020 TGCTGGCTGC CCTTCTTCAT CGTCAACATA GTGCATGTGA TCCAGGATAA CCTCATCCCT 1080 AAGGAAGTTT ACATCCTCCT AAACTGGGTG GGCTACGTCA ACTCTGCTTT CAATCCCCTT 1140
ATCTACTGCC GGAGCCCTGA CTTCAGGATT GCCTTCCAGG AGCTTCTGTG CCTGCGCAGG 1200
TCTTCCCTGA AGGCCTATGG GAATGGCTAC TCCAACAACA GTAACAGCAG AAGCGACTAT 1260
GCTGGGGAGC ACAGTGGATG TCACCTGGGG CAGGAGAAAG ACAGCGAACT GCTGTGTGAG 1320
GACCCCCCAG GCACGGAAGA CCGTCAAGGT ACTGTGCCTA GCGATAGCGT TGATTCGCAG 1380
GGGAGGAATT GTAGTACAAA CGACTCACTG CTGTAATGCA GCTTTTCTAC TTTTTATAAC 1440
CCCCCTCCCC GCAACGAAAC ACTATACAGA CTATTTAACT TGAGTGTAAT AAATTTAGAA 1500
TAAAATTGTA TAGAGATGTG CAGGAGGAGG GACGGCCTTC TGCCTTTTTT TTTTATTTTT 1560
TTAAGCTGTA AAAAAAAGAG AAAGCATATT CGAGTGATTG TTTGTTGTAC AGTTCAGTTC 1620
CTTTTTTGCA TGGAACGTGT AAGTTTGTGT CTGAAGGGCT TTGGTCCCAG AGGACCTGGG 1680
GCTGCTATGT TTTGATGACT TTTCCGTGGG ATCTACCTCA TTTGATCAAG TATTAGGGGT 1740
AATATATATT GCTGCTGGTC ATCTGTATGT GAAGGAGTCT TTTCTTCCTG CACCCTTGCA 1800 CTGGAGGATC TTGAGTATCT CGGACCTTTC AGCTGTGAAC ACGGACTCTG CTGGCCCCTC 1860
TTATTTGCTC AAACAGGGTG TTGTTGTAGG CAGGGATTTG AGGGGCAGCT TCAGTTGTGT 1920 TCCTGAGCAA AGTCTAAAGT TTACAGTAAA TAAATTGTTT GACCATGACT TCATTGCACC 1980
TGTTTCTCCA AAACCCCTTG ACTGGAGTGT GGTCGCCTCC CCCCACTGGA AACCGCAGGG 2040
CTTTGCTGCC TCTTCTCACA TTCTCCTCCT GCTCTGGGCC CCACACCCAG AGGTGCGGGC 2100
AGCTTCTCCA GCCAGTCTTC ACCCTCCTGG TGGCCTCACA GGATCTTGGA CTTGAAAGAG 2160
CCCATAGAAA GCATTTGGCG TCCAAAGAGA CGAAAAATCT GTGAGGGGGA ATGACCTGCC 2220 CAAGGTAAGA AGCCAAGGAT GTCAGAGACG GGGCTGCAGC CGTAGAACCC AGCTGTCAGC 2280
TGTTATTCCT GGAACAGATG TCTTCCCTCC ACTGCATGGC CATTGACTTC TGTCCTCGCC 2340 CTCCATGGTG GCAGCTTTCT TTCCCTGGGG CTGTCACAGA ACAAACTCAT GTCAGTGGGT 2400 GTTACTGCTC TCAGGTCCTT AGCGCAGAAT TCAGGCAATG ACCAAATAAC CACAATAGGG 2460
ATAAGAGAAA GAATTGTTCT TTTACTCAGC AAGAGTCTAC TAGGATATCC TCAGCGTTGG 2520
GGAGGCGGGG GGACAGGGAG GAGCGGGGAA GAGATGCATG CTTCCTCGAC CCACCAGGAA 2580
TTATAAGCCA CTCCGGGTAG AAATTTCAAG GAGAAAAAAA TGTAAACTTT TCTGTCACCG 2640
TTGTAAGTCC TGTGGACAAT AAACGTGATT AACAACAAC 2679 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: Récepteur ss2 canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 415 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Gln Pro Ala Asn Arg Ser Val Phe Leu Leu Ala Pro Asn Gly
1 5 10 15
Ser His Ala Pro Asp Gln Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Glu Ala Trp
20 25 30
Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala Ile Val
35 40 45
Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Arg Phe Glu Arg Leu
50 55 60 Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu 65 70 75 80
Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly Ala Ser His Ile Leu Met
85 90 95
Lys Met Trp Thr Phe Gly Asn Phe Trp Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile
100 105 110
Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala
115 120 125
Val Asp Arg Tyr Phe Ala Ile Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Lys Ala Arg Val Val Ile Leu Met Val Trp Ile Val 145 150 155 160
Ser Gly Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala
165 170 175
Thr His Gln Glu Ala Ile Asn Cys Tyr Ala Lys Glu Thr Cys Cys Asp
180 185 190
Phe Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe
195 200 205
Tyr Leu Pro Leu Val Val Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln
210 215 220
Val Ala Gln Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Arg Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240
His Ala Gln Asn Leu Ser Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Ser Gly His
245 250 255
Gly His Arg Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Lys Glu His Lys Ala Leu
260 265 270
Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro
275 280 285
Phe Phe Ile Val Asn Ile Val His Val Ile Gln Asp Asn Leu Ile Pro
290 295 300
Lys Glu Val Tyr Ile Leu Leu Asn Trp Val Gly Tyr Val Asn Ser Ala 305 310 315 320
Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ile Ala Phe
325 330 335 Gln Glu Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Leu Lys Ala Tyr Gly Asn
340 345 350
Gly Tyr Ser Asn Asn Ser Asn Ser Arg Ser Asp Tyr Ala Gly Glu His
355 360 365
Ser Gly Cys His Leu Gly Gln Glu Lys Asp Ser Glu Leu Leu Cys Glu
370 375 380
Asp Pro Pro Gly Thr Glu Asp Arg Gln Gly Thr Val Pro Ser Asp Ser
385 390 395 400
Val Asp Ser Gln Gly Arg Asn Cys Ser Thr Asn Asp Ser Leu Leu
405 410 415 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: amorce RT1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGGCGGCAGT GGTCCTGGTG TGGGTCGTG 29 (2) INFORMTIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: amorce TR22
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGGCCTTGA GTCTGAGAA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: amorce TR12
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCTGAAGGAC ACTCAG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: amorce TR1S
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CTCAGGAAGA GAGAGACAAG AGG 23 (2) IMFORKLTIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: amorce TR24
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATTGACACTC ACAGTCCTC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: amorce TR21
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CGCCGCAGAG ACGTCTCC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: amorce 1263
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GGTAGAAGGA GAC GGAGG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: amorce TR7
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CCCGGGCGCG CCGTTT 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: amorce TR8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CCAGCGACGT CACGAA 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: amorce TR10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CAGCCCACTC GTGTTGGCGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: amorce TR25
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GTGAAGGTGC CCACGATGA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: amorce SG2
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CCGCCAACAC GAGTGGGCTG CC 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: amorce RT3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CCTTGGCGCT GACGGG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: amorce RT5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CCTTCCGCTT CTGGT 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: amorce RT6
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GGGCACCTTC ACTCTCTGCT GGTT 24 (2) INFORMXTIONS POUR LA SEQ ID NO: 18: amorce RT9
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GCTGGTTGCC CTTCTTCGTG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19: amorce RT26
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
CCTCCCAGAT CTCTTGCC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20: amorce RT17
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
GCGGAGTCCA GCCGGTGC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SHQ ID NO: 21: amorce RT27
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
AAGATATGTT ATCTCCAT 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22: amorce RT16
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: CCAGGACGGA AGCAAAGAGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23: amorce RT28
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: CCTCAGCAGC TGAAGTACC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SZQ ID NO: 24: Séquence codant pour le RA-B3 adrénergique canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2649 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
CCCGGGAAGC GCTCCCACGC CCCGCTGGCC CCTTCCCTGA GCTGGGGGAA GGGACCCGTC 60 CGGAAGGGAG ACCCCTCCTC CCTTCCCCTC CCGCCCCACT CGCGCCGCGG GGATGGCTCC 120 GTGGCCTCAC GGGAACGGCT CTGTGGCCTC GTGGCCGGCT GCCCCCACCC CGACGCCCGA 180 TGCCGCCAAC ACGAGTGGGC TGCCAGGGGC GCCCTGGGCG GTGGCCTTGG CGGGGGCGCT 240 GTTGGCGCTG GAGGTGCTGG CCACCGTGGG AGGCAACCTG CTGGTCATCG TGGCCATCGC 300 TCGGACGCCA AGACTGCAGA CCATGACCAA CGTGTTCGTG ACGTCGCTGG CCACCGCGGA 360 CCTGGTGGTG GGGCTCCTGG TAGTGCCGCC GGGGGCCACC TTGGCGCTGA CGGGCCGCTG 420
GCCTCTGGGC GCCACCGGTT GCGAGCTGTG GACCTCAGTG GACGTGCTGT GTGTGACAGC 480
CAGCATCGAA ACCCTGTGCG CCCTGGCGGT GGACCGCTAC CTGGCCGTGA CCAACCCGCT 540 GCGCTACGGC GCCCTGGTCA CCAAACGGCG CGCCCGGGCG GCAGTGGTCC TGGTGTGGGT 600 CGTGTCCGCC GCGGTGTCGT TCGCGCCCAT CATGAGCAAG TGGTGGCGCG TGGGAGCCGA 660 CGCCGAGGCG CAGCGCTGCC ACTCCAACCC GCACTGCTGC GCCTTCGCCT CCAACATACC 720 CTACGCGCTG CTCTCCTCCT CCGTCTCCTT CTACCTTCCG CTTCTGGTGA TGCTCTTCGT 780 CTACGCGCGC GTTTTCCTCG TGGCTACGCG CCAACTGCGC CTGCTGCGCC GGGAGCTGGG 840 CCGCTTCCCG CCCGCGGAGT CTCCGCCGGC CGCGTCTCGC TCCCGGTCCC CCGGCCCGGC 900
CCGGCGGTGC GCTTCGCCCG CCGCGGTGCC CTCCGACCGC CTGCGGCCCG CGCGCCTCCT 960
GCCTCTGCGG GAGCACCGGG CCCTGCGCAC CCTGGGCCTC ATCGTGGGCA CCTTCACTCT 1020 CTGCTGGTTG CCCTTCTTCG TGGCCAACGT GATGCGCGCT CTCGGGGGGC CCTCTCTGGT 1080 TCCCAGCCCG GCCCTCCTGG CCCTTAACTG GCTGGGCTAC GCCAACTCTG CCTTCAACCC 1140
GCTCATCTAC TGCCGCAGCC CCGACTTCCG CAGCGCTTTC CGCCGCCTAC TGTGCCGCTG 1200
CCGGCGGGAG GAGCACCGCG CCGCCGCCTC CCCGCCGGGC GACCCCTCGG CCGCCCCTGC 1260 GGCCCTGACC AGCCCCGCGG AGTCCAGCCG GTGCCAAGCG CTCGACGGGT GGGTAACTGA 1320 GGCGAGGAGG CCGGCGGTTC AGGGTCAGAA GGCATTCGGA GTCTCTTTGG GCCATTTCTC 1380
AGAGTTTGGG GTTCGGTAGG ATAAGGTGGG GTTGGAGACG TCTCTGCGGC GAAAGAAGGG 1440 GGGACCTGGA GTAGGGAACC AACATGGAAG CCCGGACCCT TCCGTCTCCC GCGGCCGAGC 1500 ACCTGCCCCA GGACGGAAGC AAAGAGGGCA GCAGATTGTT GTTCACCCCA GGACCTAGTG 1560 CGGTCCGGGG AATGCGGCTG TATCCTGAGC CGGCTCGGTC AGCTCCGCAT TTTCTAGCTG 1620 AGTTCTTTGG CCTCCCAGAT CTCTTGCCAC CCCTTGGGCC GGCTTTGACT TGCAGGGAAG 1680
ACGAGAGGCC TTCTCAGACT CAAGGCCTGA GCTCTGGTTT CTTTGAAAGG TGTGATAGCT 1740 ACGGAGTGAT GGTGAGAATC CACTCGAGGT CTGAAGGATA AGCGGGAGTT GGGGAGGGGG 1800 TGAGGACTGT GAGTGTCAAT TCTTCTCCTG GGTAGGAGCA GGCCCCGTTG GAGGTGGGGG 1860
GTGGGTATTT TGTGGCTGGG TGGAGCCCGG ATGCTTCTGC GAGATTGTGG ACAAATGCTT 1920
CCCAGCGTCC CTGACCTTTG CTCCTTCCCT CTACTGGCCC TGTCTCCACC CTGTGCCCCT 1980
CACCCCAAGA TATGTTATCT CCATTTTTCA GGGCTTCCTG GGGAATCTCT TAGGTCCTGA 2040
ACGACAAGAA ACAACTCTGT CAATCCAGAA CTTTTGGAAA GCCTCTCCTG GCCTCTGTTT 2100
AGAATGGGCC CTGTGGAACT TCCCAGCTGG AAATCTCTGA CCTCCAGAAA CTGATGACTT 2160
GGCCTTGGGG TGGGGAGGCG GAGGTTGGGA GGGGCAACCC TTACCAAGTG AGTTTTCACC 2220
ATCCTCTTGT CTCTCTCTTC CTGAGAAGAG TTTTCTAAAC CCCACCCCTG AATTTTACCA 2280 CTACCTCAGC AGCTGAAGTA CCCAGCAGCC TGCTCTCAGC TGCCCTCGGA GTCCCCATTA 2340 GCTTTGGTGG CCCACCTGTC ACCTTGCTCA CTTCTGTGCT GCGTGCTTAG GGCAAAGAGG 2400
TCTCTCCTCC TTCTATTCTT TCTGCTGCCT GTGGACCTGA TGGACCACTG AGTGTCCTTC 2460 AGGCTCGGTG GGCAAGGCTG GGAGCAGAAA GCTATAAAAG GTCCGGGTTT GGGGTTCTGT 2520
CCCTGACTCC ATCACTACAG ATTCCTAAGC ACCAGCCTTC CCCCCTTTGG ATACAGGACA 2580
GCTCTGATCT ACCTCACAGC AGTGTCAGGA GGACTTCTCC AGGGTTTGAG GAGGGTGGAG 2640
GGTGAATTC 2649 (2) INFORMATIONS POUR LA SZQ ID NO: 25: Récepteur ss3 adrénergique canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 405 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Met Ala Pro Trp Pro His Gly Asn Gly Ser Val Ala Ser Trp Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Thr Pro Asp Ala Ala Asn Thr Ser Gly Leu Pro Gly
20 25 30
Ala Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Glu Val
35 40 45
Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg
50 55 60
Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 80
Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr
85 90 95
Leu Ala Leu Thr Gly Arg Trp Pro Leu Gly Ala Thr Gly Cys Glu Leu
100 105 110
Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu
115 120 125
Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg
130 135 140
Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Arg Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 160
Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys
165 170 175
Trp Trp Arg Val Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn
180 185 190
Pro His Cys Cys Ala Phe Ala Ser Asn Ile Pro Tyr Ala Leu Leu Ser
195 200 205
Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr
210 215 220
Ala Arg Val Phe Leu Val Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 230 235 240
Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Ala Glu Ser Pro Pro Ala Ala Ser Arg
245 250 255
Ser Arg Ser Pro Gly Pro Ala Arg Arg Cys Ala Ser Pro Ala Ala Val
260 265 270
Pro Ser Asp Arg Leu Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His
275 280 285
Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Val Gly Thr Phe Thr Leu Cys
290 295 300
Trp Leu Pro Phe Phe Val Ala Asn Val Met Arg Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 315 320
Ser Leu Val Pro Ser Pro Ala Leu Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr
325 330 335
Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe
340 345 350
Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Arg Glu Glu His
355 360 365
Arg Ala Ala Ala Ser Pro Pro Gly Asp Pro Ser Ala Ala Pro Ala Ala
370 375 380
Leu Thr Ser Pro Ala Glu Ser Ser Arg Cys Gln Ala Leu Asp Gly Ala
385 390 395 400
Ser Trp Gly Ile Ser
405 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26: amorce 1269
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
ATGGCTCCGT GGCCTCAC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27: amorce SG3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: CCGAGGTCCG CCCGCTGAGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28: amorce SG4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: TCGAGACGGT CACCAACTAC TTCA 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29: amorce SG9
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
GTGCGTCACG GCCAGCATC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30: amorce SG10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: CTACGCCAAG GAGACGTG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31: amorce SG12
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
CCAGAAGATC GACAGATC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32: amorce SG16
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32: GGATAACCTC ATCCCTA 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33: amorce SGiS
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33:
GGGGAGCACA GTGGATGT 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34: amorce SG20
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34:
CACTATACAG ACTA 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35: amorce SG7
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35:
CTGTATGTGA AGGAGTC 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36: amorce SG21
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36:
CTAGGATATC CTCAGCG 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37: amorce GS19
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 37: AACGCTGAGG ATATCCTAG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38: amorce GS1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38:
GGACGCCAAA TGCTTCTATG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39: amorce GS5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39: GGTGCAATGA AGTCATGGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40: amorce GS8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40:
GTCCGTGTTC ACAGCTG 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41: amorce GSll
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41:
CAAACTTACA CGTTCCATGC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42: amorce GS13
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42:
CACTCAAGTT AAATAG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43: amorce GS14
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43:
CTGTTGTTGG AGTAGCC 17 < 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44: amorce GS15
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:
GAGTAGACGA AGACCATG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45: amorce Gs6
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45:
CACCGGATCA CGCACAGGG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46: amorce GS17
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46:
AACCTGGCGA TGGCCG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47: amorce TR2
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 47:
GCAGTAGATG AGCGGGTTGA AGGCA 25
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2679 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCACTCCGGG GCGGCTTCTC GGGGCGCAGG CTGTGGGGGC CGCGCGGGCG AGCGCAGAGC 60 ACCCCGCGAG CTGGATGCGG CTTCCCGGCG CCCGCTCGCT GCCCGCGGCG CCGCCCCCGA 120 GGTCCGCCCG CTGAGGCGCC CGTGCGCTCA CCTGCCGGCC CGCGCGCCAT GGGCCAGCCC 180 GCGAACCGCA GCGTCTTCTT GCTGGCGCCC AACGGGAGCC ACGCGCCGGA CCAGGGAGAC 240 TCGCAGGAGC GGAGCGAGGC GTGGGTGGTG GGCATGGGCA TCGTCATGTC GCTCATCGTC 300
CTGGCCATCG TGTTCGGGAA CGTGCTGGTC ATCACGGCCA TCGCCAGGTT CGAGCGTCTG 360
CAGACGGTCA CCAACTACTT CATCACCTCC CTGGCCTGTG CTGACCTGGT CATGGGCCTG 420 GCGGTGGTGC CCTTTGGGGC CAGCCACATC CTCATGAAAA TGTGGACCTT CGGCAACTTC 480 TGGTGTGAGT TTTGGACTTC CATTGACGTA TTGTGCGTCA CGGCCAGCAT CGAGACCCTG 540
TGCGTGATCG CGGTGGACCG CTACTTTGCC ATCACCTCGC CCTTCAAGTA CCAGAGCCTG 600
CTGACCAAGA ATAAGGCCCG GGTGGTCATT CTGATGGTGT GGATCGTGTC CGGCCTCACC 660
TCCTTCTTGC CCATCCAGAT GCACTGGTAC CGGGCCACCC ACCAGGAAGC CATCAACTGC 720 TACGCCAAGG AGACGTGCTG TGACTTCTTC ACGAACCAAG CCTATGCCAT TGCCTCCTCC 780
ATCGTGTCCT TCTACCTACC CCTGGTGGTC ATGGTCTTCG TCTACTCCAG GGTCTTCCAG 840
GTGGCCCAGA GGCAGCTCCA GAAGATCGAC AGATCGGAGG GCCGCTTCCA TGCCCAAAAC 900
CTCAGCCAAG TGGAGCAGGA TGGGCGGAGC GGGCACGGAC ATCGGAGGTC CTCCAAGTTC 960 TGCTTGAAGG AACACAAGGC CCTCAAAACT CTGGGCATCA TCATGGGCAC TTTCACCCTG 1020 TGCTGGCTGC CCTTCTTCAT CGTCAACATA GTGCATGTGA TCCAGGATAA CCTCATCCCT 1080 AAGGAAGTTT ACATCCTCCT AAACTGGGTG GGCTACGTCA ACTCTGCTTT CAATCCCCTT 1140
ATCTACTGCC GGAGCCCTGA CTTCAGGATT GCCTTCCAGG AGCTTCTGTG CCTGCGCAGG 1200
TCTTCCCTGA AGGCCTATGG GAATGGCTAC TCCAACAACA GTAACAGCAG AAGCGACTAT 1260
GCTGGGGAGC ACAGTGGATG TCACCTGGGG CAGGAGAAAG ACAGCGAACT GCTGTGTGAG 1320
GACCCCCCAG GCACGGAAGA CCGTCAAGGT ACTGTGCCTA GCGATAGCGT TGATTCGCAG 1380
GGGAGGAATT GTAGTACAAA CGACTCACTG CTGTAATGCA GCTTTTCTAC TTTTTATAAC 1440
CCCCCTCCCC GCAACGAAAC ACTATACAGA CTATTTAACT TGAGTGTAAT AAATTTAGAA 1500
TAAAATTGTA TAGAGATGTG CAGGAGGAGG GACGGCCTTC TGCCTTTTTT TTTTATTTTT 1560
TTAAGCTGTA AAAAAAAGAG AAAGCATATT CGAGTGATTG TTTGTTGTAC AGTTCAGTTC 1620
CTTTTTTGCA TGGAACGTGT AAGTTTGTGT CTGAAGGGCT TTGGTCCCAG AGGACCTGGG 1680
GCTGCTATGT TTTGATGACT TTTCCGTGGG ATCTACCTCA TTTGATCAAG TATTAGGGGT 1740
AATATATATT GCTGCTGGTC ATCTGTATGT GAAGGAGTCT TTTCTTCCTG CACCCTTGCA 1800 CTGGAGGATC TTGAGTATCT CGGACCTTTC AGCTGTGAAC ACGGACTCTG CTGGCCCCTC 1860
TTATTTGCTC AAACAGGGTG TTGTTGTAGG CAGGGATTTG AGGGGCAGCT TCAGTTGTGT 1920 TCCTGAGCAA AGTCTAAAGT TTACAGTAAA TAAATTGTTT GACCATGACT TCATTGCACC 1980
TGTTTCTCCA AAACCCCTTG ACTGGAGTGT GGTCGCCTCC CCCCACTGGA AACCGCAGGG 2040
CTTTGCTGCC TCTTCTCACA TTCTCCTCCT GCTCTGGGCC CCACACCCAG AGGTGCGGGC 2100
AGCTTCTCCA GCCAGTCTTC ACCCTCCTGG TGGCCTCACA GGATCTTGGA CTTGAAAGAG 2160
CCCATAGAAA GCATTTGGCG TCCAAAGAGA CGAAAAATCT GTGAGGGGGA ATGACCTGCC 2220 CAAGGTAAGA AGCCAAGGAT GTCAGAGACG GGGCTGCAGC CGTAGAACCC AGCTGTCAGC 2280
TGTTATTCCT GGAACAGATG TCTTCCCTCC ACTGCATGGC CATTGACTTC TGTCCTCGCC 2340 CTCCATGGTG GCAGCTTTCT TTCCCTGGGG CTGTCACAGA ACAAACTCAT GTCAGTGGGT 2400 GTTACTGCTC TCAGGTCCTT AGCGCAGAAT TCAGGCAATG ACCAAATAAC CACAATAGGG 2460
ATAAGAGAAA GAATTGTTCT TTTACTCAGC AAGAGTCTAC TAGGATATCC TCAGCGTTGG 2520
GGAGGCGGGG GGACAGGGAG GAGCGGGGAA GAGATGCATG CTTCCTCGAC CCACCAGGAA 2580
TTATAAGCCA CTCCGGGTAG AAATTTCAAG GAGAAAAAAA TGTAAACTTT TCTGTCACCG 2640
TTGTAAGTCC TGTGGACAAT AAACGTGATT AACAACAAC 2679 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: Récepteur ss2 canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 415 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Gln Pro Ala Asn Arg Ser Val Phe Leu Leu Ala Pro Asn Gly
1 5 10 15
Ser His Ala Pro Asp Gln Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Glu Ala Trp
20 25 30
Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala Ile Val
35 40 45
Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Arg Phe Glu Arg Leu
50 55 60 Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ala Cys Ala Asp Leu 65 70 75 80
Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly Ala Ser His Ile Leu Met
85 90 95
Lys Met Trp Thr Phe Gly Asn Phe Trp Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile
100 105 110
Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala
115 120 125
Val Asp Arg Tyr Phe Ala Ile Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Lys Ala Arg Val Val Ile Leu Met Val Trp Ile Val 145 150 155 160
Ser Gly Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala
165 170 175
Thr His Gln Glu Ala Ile Asn Cys Tyr Ala Lys Glu Thr Cys Cys Asp
180 185 190
Phe Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe
195 200 205
Tyr Leu Pro Leu Val Val Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln
210 215 220
Val Ala Gln Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Arg Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240
His Ala Gln Asn Leu Ser Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Ser Gly His
245 250 255
Gly His Arg Arg Ser Ser Lys Phe Cys Leu Lys Glu His Lys Ala Leu
260 265 270
Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro
275 280 285
Phe Phe Ile Val Asn Ile Val His Val Ile Gln Asp Asn Leu Ile Pro
290 295 300
Lys Glu Val Tyr Ile Leu Leu Asn Trp Val Gly Tyr Val Asn Ser Ala 305 310 315 320
Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ile Ala Phe
325 330 335 Gln Glu Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ser Ser Leu Lys Ala Tyr Gly Asn
340 345 350
Gly Tyr Ser Asn Asn Ser Asn Ser Arg Ser Asp Tyr Ala Gly Glu His
355 360 365
Ser Gly Cys His Leu Gly Gln Glu Lys Asp Ser Glu Leu Leu Cys Glu
370 375 380
Asp Pro Pro Gly Thr Glu Asp Arg Gln Gly Thr Val Pro Ser Asp Ser
385 390 395 400
Val Asp Ser Gln Gly Arg Asn Cys Ser Thr Asn Asp Ser Leu Leu
405 410 415 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: amorce RT1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGGCGGCAGT GGTCCTGGTG TGGGTCGTG 29 (2) INFORMTIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: amorce TR22
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGGCCTTGA GTCTGAGAA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: amorce TR12
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCTGAAGGAC ACTCAG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: amorce TR1S
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CTCAGGAAGA GAGAGACAAG AGG 23 (2) IMFORKLTIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: amorce TR24
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATTGACACTC ACAGTCCTC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: amorce TR21
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CGCCGCAGAG ACGTCTCC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: amorce 1263
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GGTAGAAGGA GAC GGAGG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: amorce TR7
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CCCGGGCGCG CCGTTT 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: amorce TR8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CCAGCGACGT CACGAA 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: amorce TR10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CAGCCCACTC GTGTTGGCGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: amorce TR25
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GTGAAGGTGC CCACGATGA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: amorce SG2
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CCGCCAACAC GAGTGGGCTG CC 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: amorce RT3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CCTTGGCGCT GACGGG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: amorce RT5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CCTTCCGCTT CTGGT 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: amorce RT6
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GGGCACCTTC ACTCTCTGCT GGTT 24 (2) INFORMXTIONS POUR LA SEQ ID NO: 18: amorce RT9
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GCTGGTTGCC CTTCTTCGTG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19: amorce RT26
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
CCTCCCAGAT CTCTTGCC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20: amorce RT17
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
GCGGAGTCCA GCCGGTGC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SHQ ID NO: 21: amorce RT27
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
AAGATATGTT ATCTCCAT 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22: amorce RT16
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: CCAGGACGGA AGCAAAGAGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23: amorce RT28
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: CCTCAGCAGC TGAAGTACC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SZQ ID NO: 24: Séquence codant pour le RA-B3 adrénergique canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2649 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
CCCGGGAAGC GCTCCCACGC CCCGCTGGCC CCTTCCCTGA GCTGGGGGAA GGGACCCGTC 60 CGGAAGGGAG ACCCCTCCTC CCTTCCCCTC CCGCCCCACT CGCGCCGCGG GGATGGCTCC 120 GTGGCCTCAC GGGAACGGCT CTGTGGCCTC GTGGCCGGCT GCCCCCACCC CGACGCCCGA 180 TGCCGCCAAC ACGAGTGGGC TGCCAGGGGC GCCCTGGGCG GTGGCCTTGG CGGGGGCGCT 240 GTTGGCGCTG GAGGTGCTGG CCACCGTGGG AGGCAACCTG CTGGTCATCG TGGCCATCGC 300 TCGGACGCCA AGACTGCAGA CCATGACCAA CGTGTTCGTG ACGTCGCTGG CCACCGCGGA 360 CCTGGTGGTG GGGCTCCTGG TAGTGCCGCC GGGGGCCACC TTGGCGCTGA CGGGCCGCTG 420
GCCTCTGGGC GCCACCGGTT GCGAGCTGTG GACCTCAGTG GACGTGCTGT GTGTGACAGC 480
CAGCATCGAA ACCCTGTGCG CCCTGGCGGT GGACCGCTAC CTGGCCGTGA CCAACCCGCT 540 GCGCTACGGC GCCCTGGTCA CCAAACGGCG CGCCCGGGCG GCAGTGGTCC TGGTGTGGGT 600 CGTGTCCGCC GCGGTGTCGT TCGCGCCCAT CATGAGCAAG TGGTGGCGCG TGGGAGCCGA 660 CGCCGAGGCG CAGCGCTGCC ACTCCAACCC GCACTGCTGC GCCTTCGCCT CCAACATACC 720 CTACGCGCTG CTCTCCTCCT CCGTCTCCTT CTACCTTCCG CTTCTGGTGA TGCTCTTCGT 780 CTACGCGCGC GTTTTCCTCG TGGCTACGCG CCAACTGCGC CTGCTGCGCC GGGAGCTGGG 840 CCGCTTCCCG CCCGCGGAGT CTCCGCCGGC CGCGTCTCGC TCCCGGTCCC CCGGCCCGGC 900
CCGGCGGTGC GCTTCGCCCG CCGCGGTGCC CTCCGACCGC CTGCGGCCCG CGCGCCTCCT 960
GCCTCTGCGG GAGCACCGGG CCCTGCGCAC CCTGGGCCTC ATCGTGGGCA CCTTCACTCT 1020 CTGCTGGTTG CCCTTCTTCG TGGCCAACGT GATGCGCGCT CTCGGGGGGC CCTCTCTGGT 1080 TCCCAGCCCG GCCCTCCTGG CCCTTAACTG GCTGGGCTAC GCCAACTCTG CCTTCAACCC 1140
GCTCATCTAC TGCCGCAGCC CCGACTTCCG CAGCGCTTTC CGCCGCCTAC TGTGCCGCTG 1200
CCGGCGGGAG GAGCACCGCG CCGCCGCCTC CCCGCCGGGC GACCCCTCGG CCGCCCCTGC 1260 GGCCCTGACC AGCCCCGCGG AGTCCAGCCG GTGCCAAGCG CTCGACGGGT GGGTAACTGA 1320 GGCGAGGAGG CCGGCGGTTC AGGGTCAGAA GGCATTCGGA GTCTCTTTGG GCCATTTCTC 1380
AGAGTTTGGG GTTCGGTAGG ATAAGGTGGG GTTGGAGACG TCTCTGCGGC GAAAGAAGGG 1440 GGGACCTGGA GTAGGGAACC AACATGGAAG CCCGGACCCT TCCGTCTCCC GCGGCCGAGC 1500 ACCTGCCCCA GGACGGAAGC AAAGAGGGCA GCAGATTGTT GTTCACCCCA GGACCTAGTG 1560 CGGTCCGGGG AATGCGGCTG TATCCTGAGC CGGCTCGGTC AGCTCCGCAT TTTCTAGCTG 1620 AGTTCTTTGG CCTCCCAGAT CTCTTGCCAC CCCTTGGGCC GGCTTTGACT TGCAGGGAAG 1680
ACGAGAGGCC TTCTCAGACT CAAGGCCTGA GCTCTGGTTT CTTTGAAAGG TGTGATAGCT 1740 ACGGAGTGAT GGTGAGAATC CACTCGAGGT CTGAAGGATA AGCGGGAGTT GGGGAGGGGG 1800 TGAGGACTGT GAGTGTCAAT TCTTCTCCTG GGTAGGAGCA GGCCCCGTTG GAGGTGGGGG 1860
GTGGGTATTT TGTGGCTGGG TGGAGCCCGG ATGCTTCTGC GAGATTGTGG ACAAATGCTT 1920
CCCAGCGTCC CTGACCTTTG CTCCTTCCCT CTACTGGCCC TGTCTCCACC CTGTGCCCCT 1980
CACCCCAAGA TATGTTATCT CCATTTTTCA GGGCTTCCTG GGGAATCTCT TAGGTCCTGA 2040
ACGACAAGAA ACAACTCTGT CAATCCAGAA CTTTTGGAAA GCCTCTCCTG GCCTCTGTTT 2100
AGAATGGGCC CTGTGGAACT TCCCAGCTGG AAATCTCTGA CCTCCAGAAA CTGATGACTT 2160
GGCCTTGGGG TGGGGAGGCG GAGGTTGGGA GGGGCAACCC TTACCAAGTG AGTTTTCACC 2220
ATCCTCTTGT CTCTCTCTTC CTGAGAAGAG TTTTCTAAAC CCCACCCCTG AATTTTACCA 2280 CTACCTCAGC AGCTGAAGTA CCCAGCAGCC TGCTCTCAGC TGCCCTCGGA GTCCCCATTA 2340 GCTTTGGTGG CCCACCTGTC ACCTTGCTCA CTTCTGTGCT GCGTGCTTAG GGCAAAGAGG 2400
TCTCTCCTCC TTCTATTCTT TCTGCTGCCT GTGGACCTGA TGGACCACTG AGTGTCCTTC 2460 AGGCTCGGTG GGCAAGGCTG GGAGCAGAAA GCTATAAAAG GTCCGGGTTT GGGGTTCTGT 2520
CCCTGACTCC ATCACTACAG ATTCCTAAGC ACCAGCCTTC CCCCCTTTGG ATACAGGACA 2580
GCTCTGATCT ACCTCACAGC AGTGTCAGGA GGACTTCTCC AGGGTTTGAG GAGGGTGGAG 2640
GGTGAATTC 2649 (2) INFORMATIONS POUR LA SZQ ID NO: 25: Récepteur ss3 adrénergique canin
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 405 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Met Ala Pro Trp Pro His Gly Asn Gly Ser Val Ala Ser Trp Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Thr Pro Asp Ala Ala Asn Thr Ser Gly Leu Pro Gly
20 25 30
Ala Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Glu Val
35 40 45
Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg
50 55 60
Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 80
Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr
85 90 95
Leu Ala Leu Thr Gly Arg Trp Pro Leu Gly Ala Thr Gly Cys Glu Leu
100 105 110
Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu
115 120 125
Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg
130 135 140
Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Arg Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 160
Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys
165 170 175
Trp Trp Arg Val Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn
180 185 190
Pro His Cys Cys Ala Phe Ala Ser Asn Ile Pro Tyr Ala Leu Leu Ser
195 200 205
Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr
210 215 220
Ala Arg Val Phe Leu Val Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 230 235 240
Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Ala Glu Ser Pro Pro Ala Ala Ser Arg
245 250 255
Ser Arg Ser Pro Gly Pro Ala Arg Arg Cys Ala Ser Pro Ala Ala Val
260 265 270
Pro Ser Asp Arg Leu Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His
275 280 285
Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Val Gly Thr Phe Thr Leu Cys
290 295 300
Trp Leu Pro Phe Phe Val Ala Asn Val Met Arg Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 315 320
Ser Leu Val Pro Ser Pro Ala Leu Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr
325 330 335
Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe
340 345 350
Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Arg Glu Glu His
355 360 365
Arg Ala Ala Ala Ser Pro Pro Gly Asp Pro Ser Ala Ala Pro Ala Ala
370 375 380
Leu Thr Ser Pro Ala Glu Ser Ser Arg Cys Gln Ala Leu Asp Gly Ala
385 390 395 400
Ser Trp Gly Ile Ser
405 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26: amorce 1269
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
ATGGCTCCGT GGCCTCAC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27: amorce SG3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: CCGAGGTCCG CCCGCTGAGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28: amorce SG4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: TCGAGACGGT CACCAACTAC TTCA 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29: amorce SG9
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
GTGCGTCACG GCCAGCATC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30: amorce SG10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: CTACGCCAAG GAGACGTG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31: amorce SG12
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31:
CCAGAAGATC GACAGATC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32: amorce SG16
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32: GGATAACCTC ATCCCTA 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33: amorce SGiS
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 33:
GGGGAGCACA GTGGATGT 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34: amorce SG20
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34:
CACTATACAG ACTA 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35: amorce SG7
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35:
CTGTATGTGA AGGAGTC 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36: amorce SG21
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 36:
CTAGGATATC CTCAGCG 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37: amorce GS19
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 37: AACGCTGAGG ATATCCTAG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38: amorce GS1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38:
GGACGCCAAA TGCTTCTATG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39: amorce GS5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39: GGTGCAATGA AGTCATGGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40: amorce GS8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40:
GTCCGTGTTC ACAGCTG 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41: amorce GSll
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41:
CAAACTTACA CGTTCCATGC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42: amorce GS13
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42:
CACTCAAGTT AAATAG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43: amorce GS14
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43:
CTGTTGTTGG AGTAGCC 17 < 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44: amorce GS15
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:
GAGTAGACGA AGACCATG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45: amorce Gs6
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45:
CACCGGATCA CGCACAGGG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46: amorce GS17
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46:
AACCTGGCGA TGGCCG 16 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47: amorce TR2
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 47:
GCAGTAGATG AGCGGGTTGA AGGCA 25
Claims (17)
10) Séquences nucléotidiques isolées, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une séquence d'ADN codant pour un récepteur ss-adrénergique canin sélectionné dans le groupe constitué par l'ADNc codant pour le récepteur ss2-adrénergique canin, de séquence SEQ
ID NO:1 et par l'ADN codant pour le récepteur ss3- adrénergique canin, de séquence SEQ ID NO:24.
20) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
30) Protéine, caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 et est sélectionnée dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:2 (récepteur RA-Cass2) et la SEQ ID NO:25 (RA-CaB3).
40) Protéine selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à un récepteur ss3- adrénergique canin et en ce qu'elle présente les activités pharmacologiques d'un récepteur ss3 lorsqu'elle est exprimée de façon transitoire dans les cellules de singe
COS-1.
50) Fragments des protéines selon la revendication 3, d'au moins 6 aminoacides, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un épitope apte à produire des anticorps dans des conditions convenables.
60) Anticorps dirigés spécifiquement contre le récepteur ss3-adrénergique canin ou l'un de ses épitopes selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisés en ce qu'ils ne reconnaissent que ledit récepteur ss3-adrénergique canin ou l'un de ses épitopes et ne reconnaissent ni les récepteurs ssl-, ni les récepteurs ss2- adrénergiques canins.
70) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1.
80) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un micro-organisme hôte convenable, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel vecteur est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence selon la revendication 1, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un récepteur ss2- ou ss3- adrénergique canin.
90) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit vecteur est constitué d'un plasmide recombinant d'expression dans lequel est insérée, au niveau d'un lieur multisite, la séquence codant pour le récepteur ss2- ou le récepteur ss3-adrénergique canin.
100) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence codant pour le récepteur ss3-adrénergique canin et en ce qu'il a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de
Micro-organismes (CNCM) tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 9 février 1996 sous le nO I-1672.
110) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10.
120) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est notamment constituée par les cellules CHO-K1 et les cellules COS-1.
130) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est notamment constituée par une bactérie, notamment Escherichia coli.
140) Procédé de criblage différentiel pour l'étude de l'affinité en liaison de substances et la sélection et l'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un récepteur ss3-adrénergique canin selon la revendication 3 ou la revendication 4, lequel procédé comprend
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, laquelle cellule hôte exprime ledit récepteur adrénergique t33 canin, le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu,
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un plasmide recombinant d'expression du récepteur ss2- adrénergique canin, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-protéine.
150) Procédé pour l'étude de l'efficacité et de l'activité d'une substance ayant une activité soit agoniste, soit antagoniste, vis-à-vis du récepteur étudié, lequel procédé comprend
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 exprimant le récepteur ss3-adrénergique canin
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur 3 codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur ss3 exprimé vers la membrane de ladite cellule, de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur ss3 soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée
- la mise en contact de ladite cellule hôte transformée avec ladite substance ; et
- la mesure de l'accumulation du second messager AMPc, induite par la liaison de ladite substance sur son récepteur et la stimulation de l'effecteur adénylyl cyclase par l'intermédiaire d'une protéine G.
160) Kit pour la détection de l'affinité de liaison éventuelle d'un ligand pour un récepteur selon la revendication 3 ou la revendication 4 et/ou pour la détection de l'activité dudit ligand vis-à-vis dudit récepteur, lequel kit comprend
- une culture de cellules hôtes transformées par un plasmide recombinant d'expression selon l'une quelconque des revendications 7 à 10
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'un récepteur ss3 canin codé par une séquence nucléotidique selon la revendication 1, contenue dans un plasmide recombinant dont le promoteur est inductible
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur ss3 ;
- l'affinité de ladite substance pour le récepteur est mesurée par compétition de la liaison du radioligand par des concentrations croissantes de ladite substance ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du récepteur ss3 exprime.
170) Réactif, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, les séquences SEQ ID NO:3-23 et les séquences SEQ ID NO:2746.
Priority Applications (3)
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Patent Citations (5)
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| CHUNG F.Z., LENTES K.U., GOCAYNE J., FITZGERALD M., ROBINSON D., KERLAVAGE A.R., FRASER C.M., VENTER J.C.: "Cloning and sequence analysis of the human brain beta-adrenergic receptor", FEBS LETTERS, vol. 211, 1987, AMSTERDAM NL, pages 200 - 206, XP002020684 * |
| KOBILKA B.K., DIXON R.A., FRIELLE T., DOHLMAN H.G., BOLANOWSKI M.A., SIGAL I.S., YANG-FENG T.L., FRANCKE U; CARON M.G.; LEFKOWITZ;: "cDNA for the human beta 2-adrenergic receptor: a protein with multiple membrane-spanning domains and encoded by a gene whose chromosomal location is shared with that of the receptor for platelet-derived growth factor", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 84, 1987, WASHINGTON US, pages 46 - 50, XP002020685 * |
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