JP2000217584A - グルタメ―ト受容体組成物および方法 - Google Patents
グルタメ―ト受容体組成物および方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グルタメート受容体の特徴的な電気生理学的
及び薬理学的性質を有するタンパク質をコードする新規
なＤＮＡを提供すること。 【解決手段】 グルタメート受容体は、代表的なｃＤＮ
ＡクローンであるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕ
Ｒ７、これらの断片並びにこれらのグルタメート受容体
タンパク質及び／又は断片の機能性組合せ体によって代
表される。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、Ｇｌ
ｕＲ４及びＧｌｕＲ５のｃＤＮＡクローンからのＤＮＡ
配列は特にプローブとして有用であり、これらにより、
当業者はＬ−グルタメート受容体群の他のメンバーを過
度の実験を行うことなく同定することが可能になる。
及び薬理学的性質を有するタンパク質をコードする新規
なＤＮＡを提供すること。 【解決手段】 グルタメート受容体は、代表的なｃＤＮ
ＡクローンであるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕ
Ｒ７、これらの断片並びにこれらのグルタメート受容体
タンパク質及び／又は断片の機能性組合せ体によって代
表される。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、Ｇｌ
ｕＲ４及びＧｌｕＲ５のｃＤＮＡクローンからのＤＮＡ
配列は特にプローブとして有用であり、これらにより、
当業者はＬ−グルタメート受容体群の他のメンバーを過
度の実験を行うことなく同定することが可能になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、一群の新規なＤ
ＮＡ配列、およびグルタメート神経伝達物質系を含むコ
ードされた受容体タンパク質に関する。さらに、この発
明は、グルタメート受容体を作製する方法、ならびにグ
ルタメートのアゴニストおよびアンタゴニストを同定し
て性質決定するために設計された検定法にてこの受容体
タンパク質を使用する方法に関する。
ＮＡ配列、およびグルタメート神経伝達物質系を含むコ
ードされた受容体タンパク質に関する。さらに、この発
明は、グルタメート受容体を作製する方法、ならびにグ
ルタメートのアゴニストおよびアンタゴニストを同定し
て性質決定するために設計された検定法にてこの受容体
タンパク質を使用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸のＬ−グルタメートは、哺乳動
物の中枢神経系における主要な刺激効果をもつ神経伝達
物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的解
析によれば以下のようなことが示唆される。グルタメー
ト作動系が、速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放
出の調節、長期の増強作用、学習および記憶、シナプス
発生の柔軟性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、
ならびに数種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわ
たる神経作用に関与している。一般には、文献［Monagh
an et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29. 365-4
02 (1989)］参照。この広範な機能、特に、学習、神経
毒性および神経病理に関する機能は、グルタメートがそ
の効果を発揮する機構を記載して定義しようとする最近
の試行を刺激してきた。
物の中枢神経系における主要な刺激効果をもつ神経伝達
物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的解
析によれば以下のようなことが示唆される。グルタメー
ト作動系が、速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放
出の調節、長期の増強作用、学習および記憶、シナプス
発生の柔軟性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、
ならびに数種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわ
たる神経作用に関与している。一般には、文献［Monagh
an et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29. 365-4
02 (1989)］参照。この広範な機能、特に、学習、神経
毒性および神経病理に関する機能は、グルタメートがそ
の効果を発揮する機構を記載して定義しようとする最近
の試行を刺激してきた。
【０００３】現在、グルタメート受容体の分類法は、以
下の５つの受容体サブタイプまたはクラスを規定するに
役立つ薬理学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、カイニン酸
（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−
イソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ：かつて
は、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ＡＰ４またはＡ
ＰＢ）、および１−アミノ−シクロペンチル−１，３−
ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって活性化されるクラス
である。グルタメートの作用は主に、カチオン選択性イ
オノトロピー受容体との相互作用によって媒介される
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103-164 (198
4); Strange,Biochem. J. 249, 309-318 (1988)］。例
外は、メタボトロピー受容体の性質を有するＡＣＰＤ受
容体サブタイプである。このクラスのグルタメート受容
体は、ＧＴＰ−結合タンパク質、ならびに第２メッセン
ジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール１，
４，５−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen, et al., Proc. R. Soc. Londo
n Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek, et al., Natur
e 317, 717(1985); Nicoletti et al., J. Neurosci.
6, 1905 (1986); Suguyama. et al., Nature 325, 531
(1987) ］。
下の５つの受容体サブタイプまたはクラスを規定するに
役立つ薬理学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、カイニン酸
（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−
イソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ：かつて
は、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ＡＰ４またはＡ
ＰＢ）、および１−アミノ−シクロペンチル−１，３−
ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって活性化されるクラス
である。グルタメートの作用は主に、カチオン選択性イ
オノトロピー受容体との相互作用によって媒介される
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103-164 (198
4); Strange,Biochem. J. 249, 309-318 (1988)］。例
外は、メタボトロピー受容体の性質を有するＡＣＰＤ受
容体サブタイプである。このクラスのグルタメート受容
体は、ＧＴＰ−結合タンパク質、ならびに第２メッセン
ジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール１，
４，５−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen, et al., Proc. R. Soc. Londo
n Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek, et al., Natur
e 317, 717(1985); Nicoletti et al., J. Neurosci.
6, 1905 (1986); Suguyama. et al., Nature 325, 531
(1987) ］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】グルタメート受容体の
電気生理学的および薬理学的性質は、広範に研究されて
おり、今ではよく確立されている。例えば、文献［Fost
er and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman
et al., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer an
d Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watk
ins and Olvermann, Trends Neurosci. 10, 265 (198
7); およびBlair et al., Science 242, 577(1988) ］
参照。 これは、分子レベルでのそれらの生化学的特徴お
よび構造とは対照的であり、これらは、この発明が開示
されるまでほとんど不明であった。
電気生理学的および薬理学的性質は、広範に研究されて
おり、今ではよく確立されている。例えば、文献［Fost
er and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman
et al., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer an
d Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watk
ins and Olvermann, Trends Neurosci. 10, 265 (198
7); およびBlair et al., Science 242, 577(1988) ］
参照。 これは、分子レベルでのそれらの生化学的特徴お
よび構造とは対照的であり、これらは、この発明が開示
されるまでほとんど不明であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】定義 本明細書および特許請求の範囲では、ここでの使用で明
確に定義される語句および用語は以下の通りである。
確に定義される語句および用語は以下の通りである。
【０００６】ここで使用される場合、グルタメート受容
体とは、Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活
性化される神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これ
ら受容体タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて
分類される。現在では、５つのクラスの受容体が存在す
る。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭ
ＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（ＡＭＰＡ：かつては、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ
受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホスホノ酪
酸（ＡＰ４またはＡＰＢ）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって
活性化される受容体クラスである。
体とは、Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活
性化される神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これ
ら受容体タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて
分類される。現在では、５つのクラスの受容体が存在す
る。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭ
ＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（ＡＭＰＡ：かつては、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ
受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホスホノ酪
酸（ＡＰ４またはＡＰＢ）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって
活性化される受容体クラスである。
【０００７】ここで、ＮＭＤＡとは、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパルテートを意味し、これは、ＮＭＤＡグルタメー
ト受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）で
ある。
アスパルテートを意味し、これは、ＮＭＤＡグルタメー
ト受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）で
ある。
【０００８】ここで、ＡＭＰＡとは、α−アミノ−３−
ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピ
オネートを意味し、これは、ＡＭＰＡグルタメート受容
体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。
ＡＭＰＡ受容体はかつては、ＱＵＩＳ（キスカレート）
受容体と呼ばれていた。
ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピ
オネートを意味し、これは、ＡＭＰＡグルタメート受容
体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。
ＡＭＰＡ受容体はかつては、ＱＵＩＳ（キスカレート）
受容体と呼ばれていた。
【０００９】ここで、ＱＵＩＳとは、かつてＱＵＩＳ
（キスカレート）受容体と呼ばれていた、薬理学的に規
定された受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニス
ト）であるキスカル酸又はキスカレートを意味する。以
前ＱＵＩＳ受容体と呼ばれていた受容体は、今はＡＭＰ
Ａ受容体と称される。
（キスカレート）受容体と呼ばれていた、薬理学的に規
定された受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニス
ト）であるキスカル酸又はキスカレートを意味する。以
前ＱＵＩＳ受容体と呼ばれていた受容体は、今はＡＭＰ
Ａ受容体と称される。
【００１０】ＫＡとは、カイニン酸又はカイネートを意
味し、これは、カイネートグルタメート受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）である。
味し、これは、カイネートグルタメート受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）である。
【００１１】ここで、ＡＰＢは、２−アミノ−４−ホス
ホノブチレートを意味し、ＡＰＢグルタメート受容体サ
ブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。ま
た、略号ＡＰ４も２−アミノ−４−ホスホノブチレート
グルタメート受容体サブタイプを指すためにときどき使
用される。
ホノブチレートを意味し、ＡＰＢグルタメート受容体サ
ブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。ま
た、略号ＡＰ４も２−アミノ−４−ホスホノブチレート
グルタメート受容体サブタイプを指すためにときどき使
用される。
【００１２】ここで、ＡＣＰＤとは、１−アミノ−シク
ロペンチル−１，３−ジカルボン酸を意味し、これは、
ＡＣＰＤグルタメート受容体サブタイプに対するリガン
ド（アゴニスト）である。
ロペンチル−１，３−ジカルボン酸を意味し、これは、
ＡＣＰＤグルタメート受容体サブタイプに対するリガン
ド（アゴニスト）である。
【００１３】ここで、この発明のグルタメート受容体タ
ンパク質の修飾句として使用される場合、「グルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を
有する」という語句は、グルタメートまたはグルタメー
ト様リガンドへの応答で受容体タンパク質によって生じ
る神経シグナルが、既知のグルタメート受容体のものに
匹敵することを意味する。以下に示す「機能性」という
語句の定義も参照のこと。
ンパク質の修飾句として使用される場合、「グルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を
有する」という語句は、グルタメートまたはグルタメー
ト様リガンドへの応答で受容体タンパク質によって生じ
る神経シグナルが、既知のグルタメート受容体のものに
匹敵することを意味する。以下に示す「機能性」という
語句の定義も参照のこと。
【００１４】ここで、ホモとは、単一型のサブユニット
からなる受容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型の
サブユニットからなる受容体を意味する。
からなる受容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型の
サブユニットからなる受容体を意味する。
【００１５】ここで、「機能性」という用語をこの発明
のグルタメート受容体タンパク質の修飾句として使用し
た場合、これは、受容体タンパク質へのグルタメート
（又はグルタメート様）リガンドの結合が膜の「イオン
チャンネル」を開かせることを意味する。この結合によ
ってイオンが膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神
経シグナルが生じる。別の言い方をすれば、「機能性」
とは、神経シグナルが受容体タンパク質へのリガンド結
合の結果として生じることを意味する。
のグルタメート受容体タンパク質の修飾句として使用し
た場合、これは、受容体タンパク質へのグルタメート
（又はグルタメート様）リガンドの結合が膜の「イオン
チャンネル」を開かせることを意味する。この結合によ
ってイオンが膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神
経シグナルが生じる。別の言い方をすれば、「機能性」
とは、神経シグナルが受容体タンパク質へのリガンド結
合の結果として生じることを意味する。
【００１６】ここで、ＧＡＢＡとはγ−アミノ酪酸を、
γ−ＤＧＧとはγ−Ｄ−グルタミルグリシンを、ＧＡＭ
Ｓとはγ−Ｄ−グルタミルアミノメチルスルホネート
を、ＰＤＡとは２，３−シス−ピペリジンジカルボン酸
を、ＧＤＥＥとはグルタミン酸ジメチルエステルを、Ｔ
ＭＤとはトランスメンブランドメインを、ＡＰＶとは２
−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、ＣＰＰとは３−（２
−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホ
スフェートを、ｎＡＣｈＲとは神経のニコチン性アセチ
ルコリン受容体を、ＣＮＳとは中枢神経系を意味する。
さらにここで、ＰＮＳとは末梢神経系を意味する。
γ−ＤＧＧとはγ−Ｄ−グルタミルグリシンを、ＧＡＭ
Ｓとはγ−Ｄ−グルタミルアミノメチルスルホネート
を、ＰＤＡとは２，３−シス−ピペリジンジカルボン酸
を、ＧＤＥＥとはグルタミン酸ジメチルエステルを、Ｔ
ＭＤとはトランスメンブランドメインを、ＡＰＶとは２
−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、ＣＰＰとは３−（２
−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホ
スフェートを、ｎＡＣｈＲとは神経のニコチン性アセチ
ルコリン受容体を、ＣＮＳとは中枢神経系を意味する。
さらにここで、ＰＮＳとは末梢神経系を意味する。
【００１７】ここで、アゴニスト結合サブユニットと
は、結合すると受容体を活性化させる薬理学的化合物に
対する結合部位を含む受容体サブユニットのことであ
り、非アゴニスト結合サブユニットとはアゴニストと結
合しない受容体サブユニットのことである。
は、結合すると受容体を活性化させる薬理学的化合物に
対する結合部位を含む受容体サブユニットのことであ
り、非アゴニスト結合サブユニットとはアゴニストと結
合しない受容体サブユニットのことである。
【００１８】「アンタゴニスト」とは、受容体機能を阻
害する物質を指し、競合型および非競合型の２つの型が
ある。競合型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知
られている）は、重複する結合部位に対してアゴニスト
と競合する。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴ
ニスト結合部位以外の受容体上の部位に結合することに
よって、この受容体の機能を不活化する。
害する物質を指し、競合型および非競合型の２つの型が
ある。競合型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知
られている）は、重複する結合部位に対してアゴニスト
と競合する。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴ
ニスト結合部位以外の受容体上の部位に結合することに
よって、この受容体の機能を不活化する。
【００１９】ここで、ＧｌｕＲ１とは、Ｍr ＝約９９，
７６９ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ１は、グルタメート受容体サブユニットをコー
ドする、初めて単離されたｃＤＮＡであって、従来、Ｇ
ｌｕＲ−Ｋ１と呼ばれていた。ＧｌｕＲ−Ｋ１は、グル
タメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単純に
ＧｌｕＲ１と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、Ｇｌ
ｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、Ｇｌｕ
Ｒ６、ＧｌｕＲ７などと命名されている。ＧｌｕＲ１の
ｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８１３４と番
号が付されている。
７６９ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ１は、グルタメート受容体サブユニットをコー
ドする、初めて単離されたｃＤＮＡであって、従来、Ｇ
ｌｕＲ−Ｋ１と呼ばれていた。ＧｌｕＲ−Ｋ１は、グル
タメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単純に
ＧｌｕＲ１と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、Ｇｌ
ｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、Ｇｌｕ
Ｒ６、ＧｌｕＲ７などと命名されている。ＧｌｕＲ１の
ｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８１３４と番
号が付されている。
【００２０】ここで、ＧｌｕＲ２とは、Ｍr ＝約９６，
４００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３２と番号が付されている。
４００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３２と番号が付されている。
【００２１】ここで、ＧｌｕＲ３とは、Ｍr ＝約９８，
０００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ３のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３３と番号が付されている。
０００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ３のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３３と番号が付されている。
【００２２】ここで、ＧｌｕＲ４とは、Ｍr ＝約９８，
５００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ４のｃＤＮＡ
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８３７５と番号が付さ
れている。
５００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ４のｃＤＮＡ
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８３７５と番号が付さ
れている。
【００２３】ここで、ＧｌｕＲ５とは、Ｍr ＝約１０
０，０００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質を
コードするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ５のｃＤ
ＮＡ（ＧｌｕＲ５−１として）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣ
ＣNo. ６８３７４と番号が付されている。［ＧｌｕＲ５
ｃＤＮＡには長さの異なる２種類の変異体が存在してお
り、ＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５−２と呼ばれてい
る。ＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの翻訳によって、９２０個の
アミノ酸からなる単一の長いオープンリーディングフレ
ームの存在が予想される。ＧｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５
−２ＤＮＡとの差異は、このオープンリーディングフレ
ームをくずさないＧｌｕＲ５−１ＤＮＡ中における、４
５個のヌクレオチド（１５個のアミノ酸に対応）の挿入
に由来する。ＧｌｕＲ５−１受容体タンパク質における
この１５個のアミノ酸の挿入は、ここで開示された受容
体タンパク質の中では唯一のものである。したがって、
短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、ＧｌｕＲ１、Ｇｌｕ
Ｒ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７サブユニットの対応物である。］
０，０００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質を
コードするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ５のｃＤ
ＮＡ（ＧｌｕＲ５−１として）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣ
ＣNo. ６８３７４と番号が付されている。［ＧｌｕＲ５
ｃＤＮＡには長さの異なる２種類の変異体が存在してお
り、ＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５−２と呼ばれてい
る。ＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの翻訳によって、９２０個の
アミノ酸からなる単一の長いオープンリーディングフレ
ームの存在が予想される。ＧｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５
−２ＤＮＡとの差異は、このオープンリーディングフレ
ームをくずさないＧｌｕＲ５−１ＤＮＡ中における、４
５個のヌクレオチド（１５個のアミノ酸に対応）の挿入
に由来する。ＧｌｕＲ５−１受容体タンパク質における
この１５個のアミノ酸の挿入は、ここで開示された受容
体タンパク質の中では唯一のものである。したがって、
短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、ＧｌｕＲ１、Ｇｌｕ
Ｒ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７サブユニットの対応物である。］
【００２４】ここで、ＧｌｕＲ６とは、Ｍr ＝約１０
０，０００を有する同一名の単一タンパク質をコードす
るｃＤＮＡクローンをいう。また、ＧｌｕＲ７とは、同
一名の単一タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを
いう。断片３５−Ｔ３およびＵ３５をコードするＧｌｕ
Ｒ７を図５１、５２に示す。
０，０００を有する同一名の単一タンパク質をコードす
るｃＤＮＡクローンをいう。また、ＧｌｕＲ７とは、同
一名の単一タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを
いう。断片３５−Ｔ３およびＵ３５をコードするＧｌｕ
Ｒ７を図５１、５２に示す。
【００２５】ここで、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７は、遺伝子、ｃＤＮＡクローンおよびそれらがコ
ードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれをも
指すために用いる。
Ｒ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７は、遺伝子、ｃＤＮＡクローンおよびそれらがコ
ードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれをも
指すために用いる。
【００２６】本明細書および特許請求の範囲で使用され
る語句「実質的配列相同性」は、ここに開示されて特許
請求の範囲にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的
に異ならない配列変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはア
ミノ酸配列が、この発明の配列と均等であるものとみな
され、従って、この特許請求の範囲の領域内にはいるこ
とを意味する。この点で「わずかでかつ機能的に異なら
ない配列変異」とは、「相同」配列（すなわち、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、またはここで開示されて特許請求の範囲に
あるタンパク質と実質的な相同性をもつ配列）が、この
発明で開示され特許請求の範囲にある配列と機能的に均
等であることを意味する。機能的に均等な配列は、実質
的に同様に機能し、ここで開示され特許請求の範囲にあ
る核酸およびアミノ酸組成物と同一の組成物を実質的に
産生するであろう。
る語句「実質的配列相同性」は、ここに開示されて特許
請求の範囲にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的
に異ならない配列変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはア
ミノ酸配列が、この発明の配列と均等であるものとみな
され、従って、この特許請求の範囲の領域内にはいるこ
とを意味する。この点で「わずかでかつ機能的に異なら
ない配列変異」とは、「相同」配列（すなわち、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、またはここで開示されて特許請求の範囲に
あるタンパク質と実質的な相同性をもつ配列）が、この
発明で開示され特許請求の範囲にある配列と機能的に均
等であることを意味する。機能的に均等な配列は、実質
的に同様に機能し、ここで開示され特許請求の範囲にあ
る核酸およびアミノ酸組成物と同一の組成物を実質的に
産生するであろう。
【００２７】ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタン
パク質の修飾句として本明細書および特許請求の範囲で
使用される語句「実質的に純粋な」は、そのように形容
されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質
が、人為的努力によってそれら生体内の細胞環境から分
離されてきたことを意味する。その分離および精製の結
果として、分離されない不純なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペ
プチドまたはタンパク質が有用ではない態様において、
実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタ
ンパク質は有用である。
パク質の修飾句として本明細書および特許請求の範囲で
使用される語句「実質的に純粋な」は、そのように形容
されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質
が、人為的努力によってそれら生体内の細胞環境から分
離されてきたことを意味する。その分離および精製の結
果として、分離されない不純なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペ
プチドまたはタンパク質が有用ではない態様において、
実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタ
ンパク質は有用である。
【００２８】ここで見られるさまざまなアミノ酸配列を
成立させるアミノ酸は、以下の３文字または１文字の略
号に従って同定することができる。
成立させるアミノ酸は、以下の３文字または１文字の略
号に従って同定することができる。
【００２９】
【表１】 アミノ酸 ３文字略号 １文字略号 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システイン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−グリシン Ｇｌｙ Ｇ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｙｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ
【００３０】ここに見られるさまざまなヌクレオチド配
列を成立させるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使
用される通常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃおよび
Ｕ）で表される。
列を成立させるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使
用される通常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃおよび
Ｕ）で表される。
【００３１】ここで、「タンパク質」、「ペプチド」お
よび「ポリペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互
換的に用いられる。
よび「ポリペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互
換的に用いられる。
【００３２】「bp」とは塩基対を意味する。「Kbp 」と
はキロ塩基対、すなわち、１０００個の塩基対を指す。
はキロ塩基対、すなわち、１０００個の塩基対を指す。
【００３３】ここでは、特記しない限り、すべての温度
は℃で表される。
は℃で表される。
【００３４】寄託 この発明のそれぞれのグルタメート受容体タンパク質を
コードするｃＤＮＡは、米国メリーランド州ロックビル
にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群
のさらなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製
して使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供され
る。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布され
た規則に従ってなされている。クローニングされたＤＮ
Ａ配列の試料は、この出願またはその優先権を主張する
出願がなされるか、こういった出願に付与されたいかな
る特許にも許可される、上記の「条約および規則」また
は米国および他のすべての国もしくは国際機関の特許法
および規則に従って、特許事務所および他のこれらを法
的に受け取ることが許可された何人にも利用されてお
り、また利用されることになる。
コードするｃＤＮＡは、米国メリーランド州ロックビル
にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群
のさらなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製
して使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供され
る。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布され
た規則に従ってなされている。クローニングされたＤＮ
Ａ配列の試料は、この出願またはその優先権を主張する
出願がなされるか、こういった出願に付与されたいかな
る特許にも許可される、上記の「条約および規則」また
は米国および他のすべての国もしくは国際機関の特許法
および規則に従って、特許事務所および他のこれらを法
的に受け取ることが許可された何人にも利用されてお
り、また利用されることになる。
【００３５】寄託された各ｃＤＮＡクローンのＡＴＣＣ
受託番号および寄託日は以下の通りである。 ・ＧｌｕＲ１クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３４、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ２クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３２、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ３クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３３、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ４クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７５、１９
９０年８月２日 ・ＧｌｕＲ５クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７４、１９
９０年８月２日
受託番号および寄託日は以下の通りである。 ・ＧｌｕＲ１クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３４、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ２クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３２、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ３クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３３、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ４クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７５、１９
９０年８月２日 ・ＧｌｕＲ５クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７４、１９
９０年８月２日
【００３６】発明の要約 この発明は、一群の新規なグルタメート受容体タンパク
質およびこれらをコードするＤＮＡ配列を開示する。こ
の発明のグルタメート受容体は、中枢神経系のグルタメ
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する。この発明のグルタメート受容体は、ｃＤＮＡ
クローンであるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、
ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７
によってコードされるカチオン選択的イオンチャンネル
型タンパク質に代表される。グルタメート受容体タンパ
ク質の産生に有用である他、これらｃＤＮＡはプローブ
としても有用であるので、当該分野の技術者は、過度の
実験をせずに、グルタメート受容体群に属するさらなる
のタンパク質を同定して分離することができる。
質およびこれらをコードするＤＮＡ配列を開示する。こ
の発明のグルタメート受容体は、中枢神経系のグルタメ
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する。この発明のグルタメート受容体は、ｃＤＮＡ
クローンであるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、
ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７
によってコードされるカチオン選択的イオンチャンネル
型タンパク質に代表される。グルタメート受容体タンパ
ク質の産生に有用である他、これらｃＤＮＡはプローブ
としても有用であるので、当該分野の技術者は、過度の
実験をせずに、グルタメート受容体群に属するさらなる
のタンパク質を同定して分離することができる。
【００３７】この発明の新規なグルタメート受容体は、
個々のＧｌｕＲサブユニット（ホモ）からか、またはサ
ブユニットポリペプチドの組み合わせ（ヘテロ）から組
み立てることができる。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌ
ｕＲ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ホモ受容体を
形成するために現在のところ好ましいサブユニットの例
であり、一方、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、
ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５の組み合わせ体は、ヘテロ
受容体を形成するために現在のところ好ましいサブユニ
ットの例である。
個々のＧｌｕＲサブユニット（ホモ）からか、またはサ
ブユニットポリペプチドの組み合わせ（ヘテロ）から組
み立てることができる。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌ
ｕＲ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ホモ受容体を
形成するために現在のところ好ましいサブユニットの例
であり、一方、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、
ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５の組み合わせ体は、ヘテロ
受容体を形成するために現在のところ好ましいサブユニ
ットの例である。
【００３８】新規なＤＮＡおよびタンパク質を開示する
他、この発明は、グルタメート受容体を作製する方法お
よびグルタメート受容体機能のアゴニストおよびアンタ
ゴニストを同定して性質決定するためにグルタメート受
容体を使用する方法をも含む。またこの発明は、未知の
タンパク質がグルタメート受容体として機能するか否か
測定する方法を含む。
他、この発明は、グルタメート受容体を作製する方法お
よびグルタメート受容体機能のアゴニストおよびアンタ
ゴニストを同定して性質決定するためにグルタメート受
容体を使用する方法をも含む。またこの発明は、未知の
タンパク質がグルタメート受容体として機能するか否か
測定する方法を含む。
【００３９】発明の記載 この発明は、一群のグルタメート受容体およびこれらを
コードする新規なＤＮＡ配列を開示する。
コードする新規なＤＮＡ配列を開示する。
【００４０】さらに詳細に言うと、この発明は、一局面
において、グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的
及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性タン
パク質、その機能性断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の機能性組合せ体を含む。
において、グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的
及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性タン
パク質、その機能性断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の機能性組合せ体を含む。
【００４１】この発明は、他の局面において、Ｎ−メチ
ル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３
−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロ
ピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び２−ア
ミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）からなる群よ
り選ばれたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
機能性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び
／又は前記断片の組合せ体を含む。
ル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３
−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロ
ピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び２−ア
ミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）からなる群よ
り選ばれたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
機能性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び
／又は前記断片の組合せ体を含む。
【００４２】この発明は、他の局面において、ＫＡ及び
／又はＡＭＰＡサブタイプに特徴的な電気生理学的及び
薬理学的性質を有する、グルタメート受容体サブタイプ
に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する、実
質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並びに前記タ
ンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
／又はＡＭＰＡサブタイプに特徴的な電気生理学的及び
薬理学的性質を有する、グルタメート受容体サブタイプ
に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する、実
質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並びに前記タ
ンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
【００４３】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性をもつＤＮＡによってコードされてい
る、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性
タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又は
前記断片の組合せ体を含む。
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性をもつＤＮＡによってコードされてい
る、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性
タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又は
前記断片の組合せ体を含む。
【００４４】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１（図１〜６）、ＧｌｕＲ２（図９〜１４）、Ｇ
ｌｕＲ３（図１５〜２０）、ＧｌｕＲ４（図３２〜３
５）、ＧｌｕＲ５（図３６〜４３）、ＧｌｕＲ６（図４
４〜５０）およびＧｌｕＲ７（図５１、５２）からなる
群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも約４
０％のアミノ酸相同性を有する、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並び
に前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含
む。
ｌｕＲ１（図１〜６）、ＧｌｕＲ２（図９〜１４）、Ｇ
ｌｕＲ３（図１５〜２０）、ＧｌｕＲ４（図３２〜３
５）、ＧｌｕＲ５（図３６〜４３）、ＧｌｕＲ６（図４
４〜５０）およびＧｌｕＲ７（図５１、５２）からなる
群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも約４
０％のアミノ酸相同性を有する、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並び
に前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含
む。
【００４５】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７タンパク質から成
る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並びにグル
タメート受容体として機能的なこれらの組合せ体を含
む。
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７タンパク質から成
る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並びにグル
タメート受容体として機能的なこれらの組合せ体を含
む。
【００４６】さらに他の局面において、この発明は、約
９９，７６９（ＧｌｕＲ１）、約９４，４００（Ｇｌｕ
Ｒ２）、約９８，０００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５０
０（ＧｌｕＲ４）、約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及
び約１００，０００（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イ
オンチャンネルを形成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブ
タイプのグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及
び薬理学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質を
含む。
９９，７６９（ＧｌｕＲ１）、約９４，４００（Ｇｌｕ
Ｒ２）、約９８，０００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５０
０（ＧｌｕＲ４）、約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及
び約１００，０００（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イ
オンチャンネルを形成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブ
タイプのグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及
び薬理学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質を
含む。
【００４７】さらに本発明は、他の局面において、本発
明の実質的に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相
同性を有する実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
明の実質的に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相
同性を有する実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
【００４８】またこの発明は、グルタメート受容体に特
徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タ
ンパク質又はその機能性断片をコードする実質的に純粋
なＤＮＡを含む。
徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タ
ンパク質又はその機能性断片をコードする実質的に純粋
なＤＮＡを含む。
【００４９】さらに、本発明は、他の局面において、Ｎ
−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び
２−アミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）サブタ
イプからなる群より選ばれたグルタメート受容体サブタ
イプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する
機能性タンパク質又はその機能性断片をコードする実質
的に純粋なＤＮＡを含む。
−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び
２−アミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）サブタ
イプからなる群より選ばれたグルタメート受容体サブタ
イプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する
機能性タンパク質又はその機能性断片をコードする実質
的に純粋なＤＮＡを含む。
【００５０】さらにこの発明は、ＫＡおよび／またはＡ
ＭＰＡグルタメート受容体をコードするＤＮＡを含む。
ＭＰＡグルタメート受容体をコードするＤＮＡを含む。
【００５１】この発明は、他の局面において、ＧｌｕＲ
１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、Ｇｌ
ｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡお
よびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、Ｇｌ
ｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡお
よびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
【００５２】さらにこの発明は、他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性を有する、実質的に純粋なＤＮＡを含
む。
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性を有する、実質的に純粋なＤＮＡを含
む。
【００５３】この発明は、関連する局面において、Ｇｌ
ｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６９）、ＧｌｕＲ２（Ｍｒ 約
９６，４００）、ＧｌｕＲ３（Ｍｒ 約９８，００
０）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ 約９８，５００）、ＧｌｕＲ
５（Ｍｒ 約１００，０００）、ＧｌｕＲ６（約Ｍｒ １
００，０００）及びＧｌｕＲ７から成る群より選ばれる
グルタメート受容体タンパク質をコードする実質的に純
粋なＤＮＡを含む。
ｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６９）、ＧｌｕＲ２（Ｍｒ 約
９６，４００）、ＧｌｕＲ３（Ｍｒ 約９８，００
０）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ 約９８，５００）、ＧｌｕＲ
５（Ｍｒ 約１００，０００）、ＧｌｕＲ６（約Ｍｒ １
００，０００）及びＧｌｕＲ７から成る群より選ばれる
グルタメート受容体タンパク質をコードする実質的に純
粋なＤＮＡを含む。
【００５４】本発明は、さらに、約９９，７６９（Ｇｌ
ｕＲ１）、約９４，４００（ＧｌｕＲ２）、約９８，０
００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５００（ＧｌｕＲ４）、
約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及び約１００，０００
（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イオンチャンネルを形
成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプのグルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋なタンパク質をコードする実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
ｕＲ１）、約９４，４００（ＧｌｕＲ２）、約９８，０
００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５００（ＧｌｕＲ４）、
約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及び約１００，０００
（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イオンチャンネルを形
成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプのグルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋なタンパク質をコードする実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
【００５５】さらにこの発明は、この発明の実質的に純
粋なＤＮＡのいずれかに対して機能的に均等である実質
的に純粋なＤＮＡを含むが、ここで「機能的に均等な」
とは、実質的に純粋なＤＮＡが、グルタメート受容体の
リガンドに応答してイオンチャンネルを形成するタンパ
ク質またはそれらの機能性断片をコードすることを意味
する。
粋なＤＮＡのいずれかに対して機能的に均等である実質
的に純粋なＤＮＡを含むが、ここで「機能的に均等な」
とは、実質的に純粋なＤＮＡが、グルタメート受容体の
リガンドに応答してイオンチャンネルを形成するタンパ
ク質またはそれらの機能性断片をコードすることを意味
する。
【００５６】この発明は、他の局面において、本発明の
ＤＮＡから転写される実質的に純粋なセンスまたはアン
チセンスｍＲＮＡを含むが、これらのＤＮＡは、グルタ
メート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性
質を有する実質的に純粋な機能性タンパク質をコードす
る。
ＤＮＡから転写される実質的に純粋なセンスまたはアン
チセンスｍＲＮＡを含むが、これらのＤＮＡは、グルタ
メート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性
質を有する実質的に純粋な機能性タンパク質をコードす
る。
【００５７】この発明は、他の局面において、グルタメ
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する機能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡを含む。各クローンは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、グルタメート受容
体群のさらなるメンバ−を同定して分離するために必要
な出発物質（すなわち、プローブ）として当該分野の技
術者に供与される。各ｃＤＮＡクローンとして、Ｇｌｕ
Ｒ１（ＡＴＣＣNo. ６８１３４）、ＧｌｕＲ２（ＡＴＣ
ＣNo. ６８１３２）、ＧｌｕＲ３Ａ（ＴＣＣNo. ６８１
３３）、ＧｌｕＲ４（ＡＴＣＣNo. ６８３７５）、およ
びＧｌｕＲ５（ＡＴＣＣNo. ６８３７４）が挙げられ
る。完全な長さのｃＤＮＡクローンまたはそれらの断片
をプローブとして使用することができる。断片をプロー
ブとして使用する場合、ＤＮＡ配列は、そのＤＮＡのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
ＤＮＡ配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが
最も好ましい。
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する機能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡを含む。各クローンは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、グルタメート受容
体群のさらなるメンバ−を同定して分離するために必要
な出発物質（すなわち、プローブ）として当該分野の技
術者に供与される。各ｃＤＮＡクローンとして、Ｇｌｕ
Ｒ１（ＡＴＣＣNo. ６８１３４）、ＧｌｕＲ２（ＡＴＣ
ＣNo. ６８１３２）、ＧｌｕＲ３Ａ（ＴＣＣNo. ６８１
３３）、ＧｌｕＲ４（ＡＴＣＣNo. ６８３７５）、およ
びＧｌｕＲ５（ＡＴＣＣNo. ６８３７４）が挙げられ
る。完全な長さのｃＤＮＡクローンまたはそれらの断片
をプローブとして使用することができる。断片をプロー
ブとして使用する場合、ＤＮＡ配列は、そのＤＮＡのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
ＤＮＡ配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが
最も好ましい。
【００５８】この発明は、他の局面において、この発明
のＤＮＡによってコードされた機能性ペプチド断片およ
びこれらの機能性組み合わせ体を含む。こういった機能
性ペプチド断片は、グルタメート受容体として機能する
ペプチドに必須でない配列中のアミノ酸のいくつかまた
はすべてを除くことによって、過度の実験をともなわず
に当該分野の技術者によって作製可能である。グルタメ
ート受容体機能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上
記のペプチドをコードするＤＮＡを体系的に消化するこ
と、および／または上記のＤＮＡへ欠失を導入すること
によって行われる。修飾（例えば、欠失または消化）さ
れたＤＮＡは、例えば、ＤＮＡを転写してから、アフリ
カツメガエルの卵母細胞中に得られたｍＲＮＡを導入す
ることによって発現される。その卵母細胞では、ｍＲＮ
Ａの翻訳が行われることになる。こうして卵母細胞中で
発現されたタンパク質の機能的解析は、結合が予期され
るリガンドおよび機能的に活性なグルタメート受容体に
その卵母細胞をさらしてから、発現された断片がイオン
チャンネルを形成するか否か調べるために卵母細胞をモ
ニターすることによって行われる。イオンチャンネルが
検出されれば、断片はグルタメート受容体として機能し
ている。
のＤＮＡによってコードされた機能性ペプチド断片およ
びこれらの機能性組み合わせ体を含む。こういった機能
性ペプチド断片は、グルタメート受容体として機能する
ペプチドに必須でない配列中のアミノ酸のいくつかまた
はすべてを除くことによって、過度の実験をともなわず
に当該分野の技術者によって作製可能である。グルタメ
ート受容体機能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上
記のペプチドをコードするＤＮＡを体系的に消化するこ
と、および／または上記のＤＮＡへ欠失を導入すること
によって行われる。修飾（例えば、欠失または消化）さ
れたＤＮＡは、例えば、ＤＮＡを転写してから、アフリ
カツメガエルの卵母細胞中に得られたｍＲＮＡを導入す
ることによって発現される。その卵母細胞では、ｍＲＮ
Ａの翻訳が行われることになる。こうして卵母細胞中で
発現されたタンパク質の機能的解析は、結合が予期され
るリガンドおよび機能的に活性なグルタメート受容体に
その卵母細胞をさらしてから、発現された断片がイオン
チャンネルを形成するか否か調べるために卵母細胞をモ
ニターすることによって行われる。イオンチャンネルが
検出されれば、断片はグルタメート受容体として機能し
ている。
【００５９】この発明は、さらに別の態様で、この発明
のＤＮＡで形質転換された細胞を含む。
のＤＮＡで形質転換された細胞を含む。
【００６０】この発明は、さらに別の態様で、この発明
のｍＲＮＡが導入（例えば注入によって）されたアフリ
カツメガエルの卵母細胞を含む。
のｍＲＮＡが導入（例えば注入によって）されたアフリ
カツメガエルの卵母細胞を含む。
【００６１】なおさらに、この発明には、この発明のＤ
ＮＡ配列の発現、または対応するｍＲＮＡの翻訳によっ
て作られた新規なグルタメート受容体を含む。こういっ
た新規な受容体としては、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
ＮＡ配列の発現、または対応するｍＲＮＡの翻訳によっ
て作られた新規なグルタメート受容体を含む。こういっ
た新規な受容体としては、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
【００６２】なおさらに、この発明は、この発明のＤＮ
Ａ、ＲＮＡおよびタンパク質に対して機能的に均等であ
るＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。こういった
機能的に均等なＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、こ
の発明のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質と実質的に同
様に機能することであろう。
Ａ、ＲＮＡおよびタンパク質に対して機能的に均等であ
るＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。こういった
機能的に均等なＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、こ
の発明のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質と実質的に同
様に機能することであろう。
【００６３】
【発明の実施の形態】ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質
組成物に加えて、この発明はさまざまな方法も含む。こ
の発明の１番目の方法は、グルタメート受容体タンパク
質をコードすることが分かっているＤＮＡに相同なＤＮ
Ａを同定する方法である。この方法は、低および／また
は高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡの「未
知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のＤＮＡプ
ローブ（例えば、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７
など）と接触させること、そして次いで、グルタメート
プローブのＤＮＡとハイブリダイゼーションする「未
知」すなわち試験ＤＮＡをグルタメート受容体の相同性
ＤＮＡと同定することを含む。
組成物に加えて、この発明はさまざまな方法も含む。こ
の発明の１番目の方法は、グルタメート受容体タンパク
質をコードすることが分かっているＤＮＡに相同なＤＮ
Ａを同定する方法である。この方法は、低および／また
は高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡの「未
知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のＤＮＡプ
ローブ（例えば、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７
など）と接触させること、そして次いで、グルタメート
プローブのＤＮＡとハイブリダイゼーションする「未
知」すなわち試験ＤＮＡをグルタメート受容体の相同性
ＤＮＡと同定することを含む。
【００６４】この発明の２番目の方法は、機能性グルタ
メート受容体（すなわち、イオンチャンネルを形成する
グルタメート受容体）を同定する方法に関する。この方
法は、好ましくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグル
タメート受容体を活性化することが分かっている少なく
とも１種類のリガンドと接触させること、このリガンド
に対するイオンチャンネル応答を測定すること、および
接触の結果としてイオンチャンネルの応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体と同定することを含
む。
メート受容体（すなわち、イオンチャンネルを形成する
グルタメート受容体）を同定する方法に関する。この方
法は、好ましくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグル
タメート受容体を活性化することが分かっている少なく
とも１種類のリガンドと接触させること、このリガンド
に対するイオンチャンネル応答を測定すること、および
接触の結果としてイオンチャンネルの応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体と同定することを含
む。
【００６５】この発明の３番目の方法は、ある物質がグ
ルタメート受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを
決定する方法である。この方法に従って、グルタメート
受容体として機能することが知られるタンパク質を「未
知」すなわち被験物質と接触させ、既知のグルタメート
受容体のイオンチャンネル活性をその「未知」すなわち
被験物質との接触によってモニターして、既知のグルタ
メート受容体におけるイオンチャンネル応答に作用する
これらの物質を受容体タンパク質の機能性リガンドと同
定する。
ルタメート受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを
決定する方法である。この方法に従って、グルタメート
受容体として機能することが知られるタンパク質を「未
知」すなわち被験物質と接触させ、既知のグルタメート
受容体のイオンチャンネル活性をその「未知」すなわち
被験物質との接触によってモニターして、既知のグルタ
メート受容体におけるイオンチャンネル応答に作用する
これらの物質を受容体タンパク質の機能性リガンドと同
定する。
【００６６】この発明の特異的ＤＮＡのいくつかに着目
すると、ｃＤＮＡクローンのＧｌｕＲ１は、アフリカツ
メガエルの卵母細胞のカイネートでゲーティングされる
イオンチャンネルの発現を調べるスクリーニングによっ
て、ラットの前脳のｃＤＮＡライブラリーから単離され
た。グルタメート受容体群の他のメンバーをコードする
ｃＤＮＡクローンを見い出すために、クローンＧｌｕＲ
１からの挿入片を、脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼーション条件
下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション条件下）する
プローブとして使用した。ＧｌｕＲ１プローブｃＤＮＡ
を使用することによって、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３
クローンが同定および分離された。ＧｌｕＲ２からのプ
ローブ３を使用してＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５を同定
および分離した。そして、ＧｌｕＲ５を使用して、Ｇｌ
ｕＲ６およびＧｌｕＲ７のためのクローンを分離した。
すると、ｃＤＮＡクローンのＧｌｕＲ１は、アフリカツ
メガエルの卵母細胞のカイネートでゲーティングされる
イオンチャンネルの発現を調べるスクリーニングによっ
て、ラットの前脳のｃＤＮＡライブラリーから単離され
た。グルタメート受容体群の他のメンバーをコードする
ｃＤＮＡクローンを見い出すために、クローンＧｌｕＲ
１からの挿入片を、脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼーション条件
下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション条件下）する
プローブとして使用した。ＧｌｕＲ１プローブｃＤＮＡ
を使用することによって、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３
クローンが同定および分離された。ＧｌｕＲ２からのプ
ローブ３を使用してＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５を同定
および分離した。そして、ＧｌｕＲ５を使用して、Ｇｌ
ｕＲ６およびＧｌｕＲ７のためのクローンを分離した。
【００６７】ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１は、あらゆる
翻訳後修飾の前では、Ｍr が約９９，７６９の単一タン
パク質からなる機能性グルタメート受容体サブユニット
をコードする。このタンパク質は、ＫＡおよびＡＭＡＰ
受容体の電気生理学的および薬理学的性質を有するイオ
ンチャンネルを形成する。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７遺伝子によってコードされるタンパク質を用
いれば、かなりの程度でサブユニット間のアミノ酸配列
の確認ができる（表３参照）。これらタンパク質は、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でホモおよびヘテロＫＡ／
ＡＭＰＡ感受性イオンチャンネルを明確に形成すること
が分かっている。例えば、グルタメート受容体の単一タ
ンパクサブユニット、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ＮＭＤＡおよび
ＡＰＢでは活性化されないが、ＫＡ、ＡＭＰＡ、ＱＵＩ
Ｓによって活性化された機能性受容体イオンチャンネル
のホモ複合体を確実に形成する。ＧｌｕＲ２サブユニッ
トは機能性ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニッ
トは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３とのヘテロ組み合わ
せ体で受容体イオンチャンネル複合体をより効果的に組
み立てる。
翻訳後修飾の前では、Ｍr が約９９，７６９の単一タン
パク質からなる機能性グルタメート受容体サブユニット
をコードする。このタンパク質は、ＫＡおよびＡＭＡＰ
受容体の電気生理学的および薬理学的性質を有するイオ
ンチャンネルを形成する。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７遺伝子によってコードされるタンパク質を用
いれば、かなりの程度でサブユニット間のアミノ酸配列
の確認ができる（表３参照）。これらタンパク質は、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でホモおよびヘテロＫＡ／
ＡＭＰＡ感受性イオンチャンネルを明確に形成すること
が分かっている。例えば、グルタメート受容体の単一タ
ンパクサブユニット、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ＮＭＤＡおよび
ＡＰＢでは活性化されないが、ＫＡ、ＡＭＰＡ、ＱＵＩ
Ｓによって活性化された機能性受容体イオンチャンネル
のホモ複合体を確実に形成する。ＧｌｕＲ２サブユニッ
トは機能性ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニッ
トは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３とのヘテロ組み合わ
せ体で受容体イオンチャンネル複合体をより効果的に組
み立てる。
【００６８】グルタメートには弱く応答するが、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパルテート、カイネート、キスカレート
および２−アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホ
モイオンチャンネルを、ＧｌｕＲ５タンパク質はアフリ
カツメガエルの卵母細胞中で形成する。ＧｌｕＲ５を発
現する卵母細胞がＬ−グルタメートには応答し、ＫＡ、
キスカレートまたはＡＭＰＡには応答しないという事実
は、このタンパク質が、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと
は異なる薬理学的作用を有する受容体の形成に関与し得
ることが示しているかもしれない。こういった示唆は、
in situ ハイブリダイゼーションデータによって支持さ
れている。
チル−Ｄ−アスパルテート、カイネート、キスカレート
および２−アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホ
モイオンチャンネルを、ＧｌｕＲ５タンパク質はアフリ
カツメガエルの卵母細胞中で形成する。ＧｌｕＲ５を発
現する卵母細胞がＬ−グルタメートには応答し、ＫＡ、
キスカレートまたはＡＭＰＡには応答しないという事実
は、このタンパク質が、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと
は異なる薬理学的作用を有する受容体の形成に関与し得
ることが示しているかもしれない。こういった示唆は、
in situ ハイブリダイゼーションデータによって支持さ
れている。
【００６９】胚の発生および新生児の発育中に、Ｇｌｕ
Ｒ５遺伝子は、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の神経細胞のサブ
セットで発現され、ＧｌｕＲ５遺伝子の空間的および時
間的発現様式は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブセットのＧｌｕＲ
４と大きく重なっている。しかし、成熟個体の脳では、
ＧｌｕＲ５遺伝子は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニット遺伝
子とは異なった様式で発現され、ＧｌｕＲ５がＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体とは異なるグルタメート受容体の１サブタ
イプであるという示唆と一致する。
Ｒ５遺伝子は、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の神経細胞のサブ
セットで発現され、ＧｌｕＲ５遺伝子の空間的および時
間的発現様式は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブセットのＧｌｕＲ
４と大きく重なっている。しかし、成熟個体の脳では、
ＧｌｕＲ５遺伝子は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニット遺伝
子とは異なった様式で発現され、ＧｌｕＲ５がＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体とは異なるグルタメート受容体の１サブタ
イプであるという示唆と一致する。
【００７０】これ以上の考察を行わずとも、当該分野の
技術者には、上記の記載、ならびに以降の実施例および
図面の詳細な説明を使って、この発明を完全に利用する
ことができる。実施例で開示される事項は、特記のない
限り、例示を目的として開示されるので、添付の特許請
求の範囲のいずれにも限定されると解釈すべきではな
い。
技術者には、上記の記載、ならびに以降の実施例および
図面の詳細な説明を使って、この発明を完全に利用する
ことができる。実施例で開示される事項は、特記のない
限り、例示を目的として開示されるので、添付の特許請
求の範囲のいずれにも限定されると解釈すべきではな
い。
【００７１】
【実施例】実施例１ 脳のｃＤＮＡライブラリーの作製 脳（例えば、哺乳動物の脳）または適切な細胞系（例え
ば、ＮＣＢ−２０細胞系）から、グアニジンチオシアネ
ート−ＣｓＣｌ法［Chirgwin et al., Biochem. 18, 52
94 (1979) ］によってポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製する。
精製されたＲＮＡを鋳型として用いて２本鎖のｃＤＮＡ
を調製する。プライマーとしてＸｈｏＩ制限酵素切断部
位に連結したポリｄＴプライマーを使用し、前駆体とし
てｃＣＴＰの代わりにｄＣＴＰを使ってMoloney の逆転
写酵素に第１鎖の合成を開始させる。ＲＮアーゼＨおよ
びＤＮＡポリメラーゼ を添加して第２鎖を完成させ
る。完全な長さのｃＤＮＡを作製する機会を増すＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、このｃＤＮＡを平滑末端に
する。ＥcoＲ アダプターをその平滑末端に連結させ
て、末端をキナーゼ処理する。次いで、このｃＤＮＡを
ＸｈｏＩ制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化ＤＮＡを切断し得ないので、ｍＲＮＡの３’末端
にｄＴプライマーに結合させられた非メチル化ＸｈｏＩ
制限酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本
鎖ｃＤＮＡには、ｍＲＮＡの３’末端にＸｈｏＩ制限酵
素切断部位があり、５’末端にはＥcoＲ がある。この
ｃＤＮＡをさらに、Statagene 社のλＺＡＰ- ｃＤＮＡ
クローニングシステムの一部であるλＺＡＰベクターな
どの適当なベクターに入れる。λＺＡＰベクターを使用
する場合、ｍＲＮＡの５’末端がｌａｃＺプロモーター
の近傍となるように、そのｃＤＮＡをベクターに入れ
る。（λＺＡＰベクターには、ｃＤＮＡ挿入片の一方に
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがあり、卵母細胞
での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアンチセ
ンスＲＮＡの合成を可能とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターが他端にある。）
ば、ＮＣＢ−２０細胞系）から、グアニジンチオシアネ
ート−ＣｓＣｌ法［Chirgwin et al., Biochem. 18, 52
94 (1979) ］によってポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製する。
精製されたＲＮＡを鋳型として用いて２本鎖のｃＤＮＡ
を調製する。プライマーとしてＸｈｏＩ制限酵素切断部
位に連結したポリｄＴプライマーを使用し、前駆体とし
てｃＣＴＰの代わりにｄＣＴＰを使ってMoloney の逆転
写酵素に第１鎖の合成を開始させる。ＲＮアーゼＨおよ
びＤＮＡポリメラーゼ を添加して第２鎖を完成させ
る。完全な長さのｃＤＮＡを作製する機会を増すＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、このｃＤＮＡを平滑末端に
する。ＥcoＲ アダプターをその平滑末端に連結させ
て、末端をキナーゼ処理する。次いで、このｃＤＮＡを
ＸｈｏＩ制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化ＤＮＡを切断し得ないので、ｍＲＮＡの３’末端
にｄＴプライマーに結合させられた非メチル化ＸｈｏＩ
制限酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本
鎖ｃＤＮＡには、ｍＲＮＡの３’末端にＸｈｏＩ制限酵
素切断部位があり、５’末端にはＥcoＲ がある。この
ｃＤＮＡをさらに、Statagene 社のλＺＡＰ- ｃＤＮＡ
クローニングシステムの一部であるλＺＡＰベクターな
どの適当なベクターに入れる。λＺＡＰベクターを使用
する場合、ｍＲＮＡの５’末端がｌａｃＺプロモーター
の近傍となるように、そのｃＤＮＡをベクターに入れ
る。（λＺＡＰベクターには、ｃＤＮＡ挿入片の一方に
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがあり、卵母細胞
での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアンチセ
ンスＲＮＡの合成を可能とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターが他端にある。）
【００７２】実施例２ 強弱の緊縮ハイブリダイゼーション ｃＤＮＡライブラリーは、実施例１に記載されたλＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ系を用いて作製することが好ましい。ハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ
２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６
もしくはＧｌｕＲ７クローン、または他の適切なクロー
ンもしくは材料から得られたＤＮＡより作製する。この
ＤＮＡは、好ましくはAmersham Multiprime 社のＤＮＡ
ラベルキットを用いてランダムプライム法によって標識
される。 少なくとも初めのうちは、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーション条件を用いることが好ましい。適切なハイ
ブリダイゼーション溶液は次のようなものである。すな
わち、１M ＮａＣｌ、５０mM Ｔris （ｐＨ８．０）、
０．５％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１０
０mg/ml のニシンの変性精子ＤＮＡ、それぞれ０．１％
（w/v ）のFicol、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清
アルブミンである。弱い緊縮スクリーニングでは、５０
℃の温度が好ましく、ライブラリーフィルターは室温で
２倍のＳＳＰＥ（１倍のＳＳＰＥは、１８０mM ＮａＣ
ｌ、９mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．９mM ＮａＨ2 ＰＯ4
よび１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、−７０
℃でkodak 社のＸＡＲ−５フィルムにさらす。強い緊縮
ハイブリダイゼーションスクリーニングでは、 温度は５
０℃にあわせ、フィルターはこの温度で０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含む０．２倍のＳＳＰＥ中で洗浄す
る。フィルターは、Cronex Quanta II/III強化スクリー
ン付きのKodak 社のＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１
８〜４８時間さらす。
Ｐ−ｃＤＮＡ系を用いて作製することが好ましい。ハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ
２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６
もしくはＧｌｕＲ７クローン、または他の適切なクロー
ンもしくは材料から得られたＤＮＡより作製する。この
ＤＮＡは、好ましくはAmersham Multiprime 社のＤＮＡ
ラベルキットを用いてランダムプライム法によって標識
される。 少なくとも初めのうちは、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーション条件を用いることが好ましい。適切なハイ
ブリダイゼーション溶液は次のようなものである。すな
わち、１M ＮａＣｌ、５０mM Ｔris （ｐＨ８．０）、
０．５％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１０
０mg/ml のニシンの変性精子ＤＮＡ、それぞれ０．１％
（w/v ）のFicol、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清
アルブミンである。弱い緊縮スクリーニングでは、５０
℃の温度が好ましく、ライブラリーフィルターは室温で
２倍のＳＳＰＥ（１倍のＳＳＰＥは、１８０mM ＮａＣ
ｌ、９mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．９mM ＮａＨ2 ＰＯ4
よび１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、−７０
℃でkodak 社のＸＡＲ−５フィルムにさらす。強い緊縮
ハイブリダイゼーションスクリーニングでは、 温度は５
０℃にあわせ、フィルターはこの温度で０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含む０．２倍のＳＳＰＥ中で洗浄す
る。フィルターは、Cronex Quanta II/III強化スクリー
ン付きのKodak 社のＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１
８〜４８時間さらす。
【００７３】弱い緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
は、脳の２０００個のｃＤＮＡクローン中の約１つが、
ＧｌｕＲ１ｃＤＮＡ挿入片から作製されたプローブに対
する若干のハイブリダイゼーションを示す。
は、脳の２０００個のｃＤＮＡクローン中の約１つが、
ＧｌｕＲ１ｃＤＮＡ挿入片から作製されたプローブに対
する若干のハイブリダイゼーションを示す。
【００７４】実施例３ ハイブリダイゼーションによって同定されたクローンの
解析 少なくとも２つの異なった方法を、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλＺＡＰクローンを拾い、これらを約１００個のクロ
ーン混合物中にプールするものである。ｍＲＮＡをこれ
らλＺＡＰのプールからインビトロで作製し、機能性グ
ルタメート受容体の合成を規定するｍＲＮＡの活性を試
験するためにこのｍＲＮＡを卵母細胞に注入する。陽性
のクローンが認められれば、この機能性クローンが分離
されるまで上記のプールを分割することによって、個々
のλＺＡＰｃＤＮＡクローンを分離する。（ＧｌｕＲ１
クローンを分離するためのこの方法の実施についての考
察は、以下の実施例５を参照。）陽性クローンを評価す
るために使用し得る第２の方法は、各挿入片をそれぞれ
解析するものである。手間はかかるが、この「個別クロ
ーン」方法には、最初から機能性の発現を必要としない
という利点がある。この「個別クローン」方法を使用す
る場合、各クローンはプラーク精製され、ｃＤＮＡ挿入
片は個別に解析される。これは、少なくともλＺＡＰｃ
ＤＮＡ系において、このｃＤＮＡが複製のバクテリオフ
ァージｆ１起源によって隣接されたカセットにクローニ
ングされるという事実によって容易に理解される。この
ｃＤＮＡは、λＺＡＰバクテリオファージからヘルパー
の感染によって修復可能なプラスミドのｐBluescript中
に含まれている。（この方法が実施されると、ｃＤＮＡ
は大きなλバクテリオファージよりも操作が容易である
小さなＰBluescriptプラスミド中に存在することとな
る。 ）センスまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３（セン
ス）またはＴ７（アンチセンス）プロモーターを使って
ＰBluescriptプラスミド中のｃＤＮＡ挿入片から作製さ
れる。
解析 少なくとも２つの異なった方法を、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλＺＡＰクローンを拾い、これらを約１００個のクロ
ーン混合物中にプールするものである。ｍＲＮＡをこれ
らλＺＡＰのプールからインビトロで作製し、機能性グ
ルタメート受容体の合成を規定するｍＲＮＡの活性を試
験するためにこのｍＲＮＡを卵母細胞に注入する。陽性
のクローンが認められれば、この機能性クローンが分離
されるまで上記のプールを分割することによって、個々
のλＺＡＰｃＤＮＡクローンを分離する。（ＧｌｕＲ１
クローンを分離するためのこの方法の実施についての考
察は、以下の実施例５を参照。）陽性クローンを評価す
るために使用し得る第２の方法は、各挿入片をそれぞれ
解析するものである。手間はかかるが、この「個別クロ
ーン」方法には、最初から機能性の発現を必要としない
という利点がある。この「個別クローン」方法を使用す
る場合、各クローンはプラーク精製され、ｃＤＮＡ挿入
片は個別に解析される。これは、少なくともλＺＡＰｃ
ＤＮＡ系において、このｃＤＮＡが複製のバクテリオフ
ァージｆ１起源によって隣接されたカセットにクローニ
ングされるという事実によって容易に理解される。この
ｃＤＮＡは、λＺＡＰバクテリオファージからヘルパー
の感染によって修復可能なプラスミドのｐBluescript中
に含まれている。（この方法が実施されると、ｃＤＮＡ
は大きなλバクテリオファージよりも操作が容易である
小さなＰBluescriptプラスミド中に存在することとな
る。 ）センスまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３（セン
ス）またはＴ７（アンチセンス）プロモーターを使って
ＰBluescriptプラスミド中のｃＤＮＡ挿入片から作製さ
れる。
【００７５】このｃＤＮＡ挿入片も、制限酵素を用いて
マッピングすることが好ましい。例えば、このｃＤＮＡ
挿入片は、頻繁に切断する制限酵素によって切り出され
る。得られた断片は、ゲル上でサイズ分画され、その断
片は、サザン法解析用フィルターに転写される。これら
フィルターは、既知のグルタメート受容体、例えば、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６またはＧｌｕＲ７から作製されたプ
ローブでハイブリダイズされる。各クローンからのハイ
ブリダイズ断片を、単一鎖のベクターＭ１３（ｍｐ１８
またはｍｐ１９）にサブクローニングし、この断片の配
列を決定する。ＤＮＡの配列決定は、サンガーら［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)］のジデオ
キシヌクレオチド鎖末端終始法、 またはAppleid Biosys
tems社によって製造された機種のような自動シークエン
サーを用いて行われる。 配列の解析は、Intelligenetic
s 社、 Standen 社およびウィスコンシン大学によって開
発されたプログラムなどのソフトウエアを用いたコンピ
ューターによって行われることが好ましい。完全な長さ
のクローンかほぼ完全な長さのクローンから作製される
ｍＲＮＡを上記の卵母細胞系で発現させ、新規な受容体
の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合あるク
ローンが機能しなければ、これを、他の有力なクローン
から作製したｍＲＮＡの存在下で試験する。
マッピングすることが好ましい。例えば、このｃＤＮＡ
挿入片は、頻繁に切断する制限酵素によって切り出され
る。得られた断片は、ゲル上でサイズ分画され、その断
片は、サザン法解析用フィルターに転写される。これら
フィルターは、既知のグルタメート受容体、例えば、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６またはＧｌｕＲ７から作製されたプ
ローブでハイブリダイズされる。各クローンからのハイ
ブリダイズ断片を、単一鎖のベクターＭ１３（ｍｐ１８
またはｍｐ１９）にサブクローニングし、この断片の配
列を決定する。ＤＮＡの配列決定は、サンガーら［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)］のジデオ
キシヌクレオチド鎖末端終始法、 またはAppleid Biosys
tems社によって製造された機種のような自動シークエン
サーを用いて行われる。 配列の解析は、Intelligenetic
s 社、 Standen 社およびウィスコンシン大学によって開
発されたプログラムなどのソフトウエアを用いたコンピ
ューターによって行われることが好ましい。完全な長さ
のクローンかほぼ完全な長さのクローンから作製される
ｍＲＮＡを上記の卵母細胞系で発現させ、新規な受容体
の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合あるク
ローンが機能しなければ、これを、他の有力なクローン
から作製したｍＲＮＡの存在下で試験する。
【００７６】実施例４ アフリカツメガエルの卵母細胞中での発現のためのクロ
ーニングおよび検出この検出法は、Masuら［Nature 32
9, 836 (1987)］の検出法の改良法である。これは、外
来のｍＲＮＡがアフリカツメガエルの卵母細胞に注入さ
れた場合、このｍＲＮＡは機能性タンパク質に翻訳され
るという事実に基づくものである。
ーニングおよび検出この検出法は、Masuら［Nature 32
9, 836 (1987)］の検出法の改良法である。これは、外
来のｍＲＮＡがアフリカツメガエルの卵母細胞に注入さ
れた場合、このｍＲＮＡは機能性タンパク質に翻訳され
るという事実に基づくものである。
【００７７】ＤＮＡの鋳型（λＺＡＰｃＤＮＡ調製物ま
たは被験ｃＤＮＡを含むプラスミド）を制限酵素によっ
てｃＤＮＡ挿入片から下流で切断する。制限酵素使用後
の消化産物を、プロテアーゼＫで消化し、次いでフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で２回の抽出によって抽
出する。続いて、このＤＮＡ鋳型をエタノール沈澱させ
てから、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（センス鎖作製用）ま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンス鎖作製
用）、ｒＡＴＰ。ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよび
ＲＮアーゼ阻害剤と混合する。同時に、このＲＮＡの転
写物に７ｍｅＧｐｐｐＧキャップでキャップ構造を形成
させる。操作中に手袋がきれるので、水をジエチルピロ
カーボネートで処理してＲＮアーゼを不活化させる。
たは被験ｃＤＮＡを含むプラスミド）を制限酵素によっ
てｃＤＮＡ挿入片から下流で切断する。制限酵素使用後
の消化産物を、プロテアーゼＫで消化し、次いでフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で２回の抽出によって抽
出する。続いて、このＤＮＡ鋳型をエタノール沈澱させ
てから、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（センス鎖作製用）ま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンス鎖作製
用）、ｒＡＴＰ。ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよび
ＲＮアーゼ阻害剤と混合する。同時に、このＲＮＡの転
写物に７ｍｅＧｐｐｐＧキャップでキャップ構造を形成
させる。操作中に手袋がきれるので、水をジエチルピロ
カーボネートで処理してＲＮアーゼを不活化させる。
【００７８】インビトロで合成したｍＲＮＡの転写物を
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入する。５０nlのＲ
ＮＡ溶液（０．２〜０．６mg/ml ）をステージＶの卵母
細胞に注入する。機能性受容体の存在下での解析に先立
って、２〜７日間 Barthの培地中にて１６℃でインキュ
ベーションする。電圧の記録は、３M ＫＣＬを充填し、
適当な電圧クランプユニット（例えば、Dagen 8500 電
圧クランプユニット）に接続した微小電極を卵母細胞に
突き刺すことによって行われる。電極クランプ試験は、
２つの電極、すなわち、３M ＫＣＬを充填した電極およ
び０．２５M ＣｓＣｌ、０．２５M ＣｓＦおよび５０mM
ＥＧＴＡを充填した電流電極を用いて行われることが
好ましい。（ＫＡ／ＡＭＰＡグルタメート受容体をコー
ドするＧｌｕＲ１ｃＤＮＡからのＲＮＡを注入された卵
母細胞より得られる記録結果の考察については実施例６
参照。）注入に先立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌
親のアフリカツメガエルから卵巣を摘出することによっ
て行った。卵巣組織をコラーゲナーゼ（２mg/ml ）で２
時間処理してから、卵巣上皮および濾胞細胞を切除す
る。
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入する。５０nlのＲ
ＮＡ溶液（０．２〜０．６mg/ml ）をステージＶの卵母
細胞に注入する。機能性受容体の存在下での解析に先立
って、２〜７日間 Barthの培地中にて１６℃でインキュ
ベーションする。電圧の記録は、３M ＫＣＬを充填し、
適当な電圧クランプユニット（例えば、Dagen 8500 電
圧クランプユニット）に接続した微小電極を卵母細胞に
突き刺すことによって行われる。電極クランプ試験は、
２つの電極、すなわち、３M ＫＣＬを充填した電極およ
び０．２５M ＣｓＣｌ、０．２５M ＣｓＦおよび５０mM
ＥＧＴＡを充填した電流電極を用いて行われることが
好ましい。（ＫＡ／ＡＭＰＡグルタメート受容体をコー
ドするＧｌｕＲ１ｃＤＮＡからのＲＮＡを注入された卵
母細胞より得られる記録結果の考察については実施例６
参照。）注入に先立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌
親のアフリカツメガエルから卵巣を摘出することによっ
て行った。卵巣組織をコラーゲナーゼ（２mg/ml ）で２
時間処理してから、卵巣上皮および濾胞細胞を切除す
る。
【００７９】実施例５ ＧｌｕＲ１受容体の発現のためのクローニング アフリカツメガエルの卵母細胞に、ラットの前脳から分
離したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを注入した。２〜１０日間
後、この卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメ
ート受容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を
調べた。グルタメートとキスカレートの双方を除くと、
リガンドゲーティングイオンチャンネルによると思われ
る短期の滑らかな応答、および第２メッセンジャーの媒
介型と思われる長期の変動的応答からなる二相性のパタ
ーンが示される。ＮＭＤＡおよびＫＡは、短期の刺激に
対して滑らかな応答を引き起こすが、ＡＰＢは、応答を
生じない。
離したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを注入した。２〜１０日間
後、この卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメ
ート受容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を
調べた。グルタメートとキスカレートの双方を除くと、
リガンドゲーティングイオンチャンネルによると思われ
る短期の滑らかな応答、および第２メッセンジャーの媒
介型と思われる長期の変動的応答からなる二相性のパタ
ーンが示される。ＮＭＤＡおよびＫＡは、短期の刺激に
対して滑らかな応答を引き起こすが、ＡＰＢは、応答を
生じない。
【００８０】方向性のあるｃＤＮＡライブラリー（λＺ
ＡＰII ＲＴＢＩ、複合度＝８×１０5 要素）は、４
４，０００クローンの独立したサブライブラリー１８個
からなり、バクテリオファージの発現ベクターλＺＡＰ
II を使ってポリ（Ａ）+ ＮＡから構成させた。増幅さ
れた１８個のサブライブラリーのすべてから別個に作製
された転写物を含むインビトロでの転写物のプールを卵
母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜３mV）が、注入
の１０日後に１００μM カイネートを投与した卵母細胞
から電圧の記録として認められた。ＮＭＤＡまたはキス
カレートに対する応答は全く検出されなかった。未注入
の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメー
ト受容体のアンタゴニストに対していかなる応答も示さ
なかった。続いて、４４，０００個のクローン（＝単一
サブライブラリー）、４，０００個のクローン、４００
個のクローンおよび４０個のクローンを検出した。これ
らの試験の各回で少なくとも１つのプールを試験した。
以下の基準をスクリーニング手順の全般にわたって使用
し、最初に観察された非常に小さな応答が記録のアーチ
ファクトでないことを確認した。それらの基準とは、す
なわち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があっ
た、（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞の過融解時に容易に可逆的であった、（ｄ）１０μM
のドモエートの投与によって、１００μMのカイネート
の投与によって起こされた応答と類似の応答が生じた。
さらに細分類するために、各ステージで最も大きな応答
を起こすプールを選択した。４０クローンの最終的に陽
性のプールにおけるクローンを、それら挿入片のサイズ
について解析した。そして、最も大きな挿入片を有する
１２個のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を
規定する能力についてそれぞれ試験した。３．０kbの挿
入片を有する唯一のクローンがカイネートに応答するこ
とが分かり、これをλＺＡＰII−ＧｌｕＲ１と命名し
た。
ＡＰII ＲＴＢＩ、複合度＝８×１０5 要素）は、４
４，０００クローンの独立したサブライブラリー１８個
からなり、バクテリオファージの発現ベクターλＺＡＰ
II を使ってポリ（Ａ）+ ＮＡから構成させた。増幅さ
れた１８個のサブライブラリーのすべてから別個に作製
された転写物を含むインビトロでの転写物のプールを卵
母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜３mV）が、注入
の１０日後に１００μM カイネートを投与した卵母細胞
から電圧の記録として認められた。ＮＭＤＡまたはキス
カレートに対する応答は全く検出されなかった。未注入
の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメー
ト受容体のアンタゴニストに対していかなる応答も示さ
なかった。続いて、４４，０００個のクローン（＝単一
サブライブラリー）、４，０００個のクローン、４００
個のクローンおよび４０個のクローンを検出した。これ
らの試験の各回で少なくとも１つのプールを試験した。
以下の基準をスクリーニング手順の全般にわたって使用
し、最初に観察された非常に小さな応答が記録のアーチ
ファクトでないことを確認した。それらの基準とは、す
なわち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があっ
た、（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞の過融解時に容易に可逆的であった、（ｄ）１０μM
のドモエートの投与によって、１００μMのカイネート
の投与によって起こされた応答と類似の応答が生じた。
さらに細分類するために、各ステージで最も大きな応答
を起こすプールを選択した。４０クローンの最終的に陽
性のプールにおけるクローンを、それら挿入片のサイズ
について解析した。そして、最も大きな挿入片を有する
１２個のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を
規定する能力についてそれぞれ試験した。３．０kbの挿
入片を有する唯一のクローンがカイネートに応答するこ
とが分かり、これをλＺＡＰII−ＧｌｕＲ１と命名し
た。
【００８１】実施例６ ＧｌｕＲ１クローンの電気生理学的および薬理学的特徴 プラスミドのＧｌｕＲ１を連続的にバクテリオファージ
のλＺＡＰII- ＧｌｕＲ１からレスキューした。そし
て、インビトロでの転写時、アンチセンスＲＮＡではな
くセンスＲＮＡが、卵母細胞に注入された場合、カイネ
ートの応答を誘起した。電圧クランプ条件下（−７０mV
の保持電圧）、ＧｌｕＲ１センス転写物１０pg 程度の
少量によって、１００μM ＫＡに対する検出可能な応答
が生じた。
のλＺＡＰII- ＧｌｕＲ１からレスキューした。そし
て、インビトロでの転写時、アンチセンスＲＮＡではな
くセンスＲＮＡが、卵母細胞に注入された場合、カイネ
ートの応答を誘起した。電圧クランプ条件下（−７０mV
の保持電圧）、ＧｌｕＲ１センス転写物１０pg 程度の
少量によって、１００μM ＫＡに対する検出可能な応答
が生じた。
【００８２】ＧｌｕＲ１がある転写因子をコードすると
いう可能性を除去するために、インビトロでの転写物中
のｐＧｌｕＲ１を注入した卵母細胞を、５０μg/mlのア
クリノマイシンＤを添加した培地中に放置して、内因性
の転写を阻害した。これらの卵母細胞は、対照の培地に
放置されたものと同一のカイネートに対する応答を示し
た。したがって、卵母細胞ゲノムからの注入誘導型転写
は、観察された応答に寄与しないようである。
いう可能性を除去するために、インビトロでの転写物中
のｐＧｌｕＲ１を注入した卵母細胞を、５０μg/mlのア
クリノマイシンＤを添加した培地中に放置して、内因性
の転写を阻害した。これらの卵母細胞は、対照の培地に
放置されたものと同一のカイネートに対する応答を示し
た。したがって、卵母細胞ゲノムからの注入誘導型転写
は、観察された応答に寄与しないようである。
【００８３】Ｌ−グルタメートは、ＫＡよりもさらに小
さな応答を引き起こすが、１mM のレベルでさえも、３
０μM のＫＡで見られた脱分極の５０％を引き起こすだ
けであった。これは、グルタメートがＫＡ受容体サブタ
イプに対する唯一の弱いアゴニストであるという従来の
報告［Monaghan et al., Nature 306, 176 (1983) ］と
一致する。 ＮＭＤＡ、キスカレート、およびＬ−アスパ
ルテートといった他のグルタメート受容体は、それぞれ
１５０μM 、１０μM および１００μM のレベルで投与
された場合、応答しなかった。グリシン、ＧＡＢＧA 、
セロトニンおよびニコチンといった無関係な神経伝達物
質受容体アゴニストも、１mM 程度の高濃度で試験した
場合でさえ応答しなかった。グリシンは、ＫＡの応答を
増強させなかった。ＫＡおよびドモエートに関する用量
−応答曲線を記録したところ、それぞれのＥＣ50値は３
９μM および１．８μM であった。平均の反転電圧は、
０ないし−１３０mVの一連の維持電圧で得られた、１０
μM カに対する電流応答から外挿されたものであり、１
０mVを示した。ＫＡに対する応答は減感せず、高濃度
（１００μM ）のアゴニストによる長時間（１０分以
内）の過融解後でさえ減感しなかった。これらの所見
も、総ポリ（Ａ）+ ＲＮＡから発現したＫＡ受容体を用
いた実験による初期の報告［Verdoorn and Dingledine,
Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)］と一致す
る。同様に、ＧｌｕＲ１の薬理学的プロフィル（表２参
照）は、さまざまな既知のグルタメート受容体アンタゴ
ニストの阻害特性によって明らかにされたように、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡがカイネート受容体のメッセージ源と
して使用された系でのＫＡ受容体に関する従来の報告
［Hirono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 20
83 (1989) ］と一致する。全被験化合物（それぞれ１mM
）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたＧｌｕＲ１ＲＮＡを注入した卵母細胞中での
キネート誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程
度は低いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−ＤＧ
Ｇ）は、キヌレート受容体を阻害しないがＫＡおよびＮ
ＭＤＡ受容体を選択的に阻害する物質であって［Davies
and Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)］、 ＫＡお
よびＡＭＰＡ受容体を選択的に阻害すると報告されてい
る［Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1981)］λ−Ｄ−
グルタミルアミノメチル−スルフェート（ＧＡＭＳ）と
同様に、キヌレート受容体を阻害する。同じく、２，３
−シス−ピペリジンジカルボン酸（ＰＤＡ）は、グルタ
メート受容体のすべてのサブタイプを阻害することが知
られており［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 10
3 (1984)］、 ＧｌｕＲ１の応答を遮断した。グルタメー
トジエチルエステル（ＧＤＥＥ）は、ＡＭＰＡタイプの
グルタメート受容体を選択的に阻害すると見られており
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 103 (198
4)］、 その応答を有意に遮断するが、弱いアゴニストの
性質を示した。ＮＭＤＡ受容体アゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）および３−（２−カル
ボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェ
ート（ＣＰＰ）、ならびにＮＭＤＡはそれ自体、ＫＡ応
答を若干阻害するので、弱いアンタゴニストとして作用
した。これらは、いかなるアゴニストの性質も示さなか
った。
さな応答を引き起こすが、１mM のレベルでさえも、３
０μM のＫＡで見られた脱分極の５０％を引き起こすだ
けであった。これは、グルタメートがＫＡ受容体サブタ
イプに対する唯一の弱いアゴニストであるという従来の
報告［Monaghan et al., Nature 306, 176 (1983) ］と
一致する。 ＮＭＤＡ、キスカレート、およびＬ−アスパ
ルテートといった他のグルタメート受容体は、それぞれ
１５０μM 、１０μM および１００μM のレベルで投与
された場合、応答しなかった。グリシン、ＧＡＢＧA 、
セロトニンおよびニコチンといった無関係な神経伝達物
質受容体アゴニストも、１mM 程度の高濃度で試験した
場合でさえ応答しなかった。グリシンは、ＫＡの応答を
増強させなかった。ＫＡおよびドモエートに関する用量
−応答曲線を記録したところ、それぞれのＥＣ50値は３
９μM および１．８μM であった。平均の反転電圧は、
０ないし−１３０mVの一連の維持電圧で得られた、１０
μM カに対する電流応答から外挿されたものであり、１
０mVを示した。ＫＡに対する応答は減感せず、高濃度
（１００μM ）のアゴニストによる長時間（１０分以
内）の過融解後でさえ減感しなかった。これらの所見
も、総ポリ（Ａ）+ ＲＮＡから発現したＫＡ受容体を用
いた実験による初期の報告［Verdoorn and Dingledine,
Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)］と一致す
る。同様に、ＧｌｕＲ１の薬理学的プロフィル（表２参
照）は、さまざまな既知のグルタメート受容体アンタゴ
ニストの阻害特性によって明らかにされたように、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡがカイネート受容体のメッセージ源と
して使用された系でのＫＡ受容体に関する従来の報告
［Hirono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 20
83 (1989) ］と一致する。全被験化合物（それぞれ１mM
）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたＧｌｕＲ１ＲＮＡを注入した卵母細胞中での
キネート誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程
度は低いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−ＤＧ
Ｇ）は、キヌレート受容体を阻害しないがＫＡおよびＮ
ＭＤＡ受容体を選択的に阻害する物質であって［Davies
and Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)］、 ＫＡお
よびＡＭＰＡ受容体を選択的に阻害すると報告されてい
る［Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1981)］λ−Ｄ−
グルタミルアミノメチル−スルフェート（ＧＡＭＳ）と
同様に、キヌレート受容体を阻害する。同じく、２，３
−シス−ピペリジンジカルボン酸（ＰＤＡ）は、グルタ
メート受容体のすべてのサブタイプを阻害することが知
られており［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 10
3 (1984)］、 ＧｌｕＲ１の応答を遮断した。グルタメー
トジエチルエステル（ＧＤＥＥ）は、ＡＭＰＡタイプの
グルタメート受容体を選択的に阻害すると見られており
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 103 (198
4)］、 その応答を有意に遮断するが、弱いアゴニストの
性質を示した。ＮＭＤＡ受容体アゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）および３−（２−カル
ボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェ
ート（ＣＰＰ）、ならびにＮＭＤＡはそれ自体、ＫＡ応
答を若干阻害するので、弱いアンタゴニストとして作用
した。これらは、いかなるアゴニストの性質も示さなか
った。
【００８４】全体的にみれば、ＧｌｕＲ１転写物を注入
された卵母細胞で認められる電気生理学的性質、および
観察された薬理学的性質によれば、ＧｌｕＲ１が、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡを注入された卵母細胞で観察されたも
のとは異なる機能性ＫＡ受容体であることが分かる。し
たがって、ＧｌｕＲ１によってコードされた単一のタン
パク質サブユニットは、活性のある受容体イオンチャン
ネル複合体を形成するに十分である。
された卵母細胞で認められる電気生理学的性質、および
観察された薬理学的性質によれば、ＧｌｕＲ１が、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡを注入された卵母細胞で観察されたも
のとは異なる機能性ＫＡ受容体であることが分かる。し
たがって、ＧｌｕＲ１によってコードされた単一のタン
パク質サブユニットは、活性のある受容体イオンチャン
ネル複合体を形成するに十分である。
【００８５】実施例７ ＧｌｕＲ１の配列決定および１次構造 プラスミドｐＧｌｕＲ１のｃＤＮＡ挿入片をＭ１３ｍｐ
１９にサブクローニングして、配列を決定した（図１〜
６）。２７２１ｂｐのオープンリーディングフレーム
が、全長２９９２ｂｐ中に見い出された。したがって、
予想されるタンパク質は、８８９個のアミノ酸からな
り、そのＭr の計算値は約９９，７６９である。推定さ
れるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸１８個の
シグナルペプチドが存在するとみられ、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne, Nucl.
Acids Res. 14, 4683 (1986)］。 したがって、このタン
パク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられ
る。６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメイ
ンに存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガ
ンドゲーティングイオンチャンネル、ニコチン酸アセチ
ルコリン受容体、ＧＡＢＡA 受容体およびグリシン受容
体との配列の比較によれば、全体的な相同性は余りない
ことが分かる。
１９にサブクローニングして、配列を決定した（図１〜
６）。２７２１ｂｐのオープンリーディングフレーム
が、全長２９９２ｂｐ中に見い出された。したがって、
予想されるタンパク質は、８８９個のアミノ酸からな
り、そのＭr の計算値は約９９，７６９である。推定さ
れるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸１８個の
シグナルペプチドが存在するとみられ、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne, Nucl.
Acids Res. 14, 4683 (1986)］。 したがって、このタン
パク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられ
る。６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメイ
ンに存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガ
ンドゲーティングイオンチャンネル、ニコチン酸アセチ
ルコリン受容体、ＧＡＢＡA 受容体およびグリシン受容
体との配列の比較によれば、全体的な相同性は余りない
ことが分かる。
【００８６】この開示に先立って配列決定されたすべて
のリガンドゲーティングイオンチャンネルのサブユニッ
トには、１つの細胞外の保存領域があり、その特徴はア
ミノ酸１４個によって互いに隔てられたシステイン残基
２個が存在することである。そして、保存されたプロリ
ンおよびアスパルテート残基が、これらシステイン２残
基の１番目から下流へそれぞれアミノ酸８個および１０
個目に位置している［Barnard et al., Trends Neurosc
i. 10, 502 (1987) ］。 神経伝達物質受容体−イオンチ
ャンネル複合体に関するこの仮説的特徴は、ＧｌｕＲ１
によってコードされたタンパク質での保存性がよくない
ことである。上記のプロリンおよびアスパルテート残基
は存在するが、第１のシステイン残基はプロリン残基か
ら７残基上流に位置するが、第２のシステイン残基は存
在しない。
のリガンドゲーティングイオンチャンネルのサブユニッ
トには、１つの細胞外の保存領域があり、その特徴はア
ミノ酸１４個によって互いに隔てられたシステイン残基
２個が存在することである。そして、保存されたプロリ
ンおよびアスパルテート残基が、これらシステイン２残
基の１番目から下流へそれぞれアミノ酸８個および１０
個目に位置している［Barnard et al., Trends Neurosc
i. 10, 502 (1987) ］。 神経伝達物質受容体−イオンチ
ャンネル複合体に関するこの仮説的特徴は、ＧｌｕＲ１
によってコードされたタンパク質での保存性がよくない
ことである。上記のプロリンおよびアスパルテート残基
は存在するが、第１のシステイン残基はプロリン残基か
ら７残基上流に位置するが、第２のシステイン残基は存
在しない。
【００８７】ＧｌｕＲ１のヒドロパシ(hydropathy)プロ
ット解析によれば、トランスメンブランドメイン（ＴＭ
Ｄ）の候補となる幾つかの領域が分かる。アミノ酸残基
４５５番目と８１０番目との間の領域は、そのヒドロパ
シ(hydropathy)プロフィルが他のリガンドゲーティング
イオンチャンネルにみられるものと類似しているため、
顕著である。すなわち、３つの近接して位置する仮定的
ＴＭＤは、このタンパク質のＣ末端に近い４番目の仮定
的ＴＭＤから約１７５個のアミノ酸残基によって隔てら
れている。この領域内で以下の４つのトランスメンブラ
ン領域がＧｌｕＲ１中に配置している。ＴＭＤ１（アミ
ノ酸残基４６３番目と４８０番目との間に配置）、ＴＭ
Ｄ２（アミノ酸残基５２１番目と５３９番目との間に配
置）、ＴＭＤ３（アミノ酸残基５９６番目と６１４番目
との間に配置）、およびＴＭＤ４（アミノ酸残基７８８
番目と８０８番目との間に配置）。
ット解析によれば、トランスメンブランドメイン（ＴＭ
Ｄ）の候補となる幾つかの領域が分かる。アミノ酸残基
４５５番目と８１０番目との間の領域は、そのヒドロパ
シ(hydropathy)プロフィルが他のリガンドゲーティング
イオンチャンネルにみられるものと類似しているため、
顕著である。すなわち、３つの近接して位置する仮定的
ＴＭＤは、このタンパク質のＣ末端に近い４番目の仮定
的ＴＭＤから約１７５個のアミノ酸残基によって隔てら
れている。この領域内で以下の４つのトランスメンブラ
ン領域がＧｌｕＲ１中に配置している。ＴＭＤ１（アミ
ノ酸残基４６３番目と４８０番目との間に配置）、ＴＭ
Ｄ２（アミノ酸残基５２１番目と５３９番目との間に配
置）、ＴＭＤ３（アミノ酸残基５９６番目と６１４番目
との間に配置）、およびＴＭＤ４（アミノ酸残基７８８
番目と８０８番目との間に配置）。
【００８８】実施例８ ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の分離および特徴決定 ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子をコードするｃＤＮ
Ａクローンを、弱い緊縮ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングプロトコール（実施例２参照）を使って、親ラ
ットの前脳ライブラリーから分離し、プローブとしてＧ
ｌｕＲ１ｃＤＮＡの放射能標識断片を分離した。図９〜
１４および１５〜２０は、クローンλＲＢ１４（Ｇｌｕ
Ｒ２）およびλＲＢ３１２（ＧｌｕＲ３）のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を示す。ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値は、それ
ぞれ９６，０００ダルトン（８６２個のアミノ酸）およ
び９８，０００ダルトン（８６６個のアミノ酸）であ
る。潜在的なＮグリコシル化部位は、ＧｌｕＲ２タンパ
ク質中ではＡｓｎ２３５、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３８
５、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ８３５にあり、ＧｌｕＲ
３タンパク質中では、Ａｓｎ３５、Ａｓｎ２３８、Ａｓ
ｎ３５２、Ａｓｎ３８７およびＡｓｎ３９４にある。Ｇ
ｌｕＲ１と同様に、ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３との両者の
疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領域が分
かる。こういった１つのドメインは、各タンパク質のア
ミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴をもつ一
方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜ヘリック
ス（ＭＳＲ Ｉ〜ＩＶ）を形成し、各ポリペプチドのカ
ルボキシ末端側半分に位置する。
Ａクローンを、弱い緊縮ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングプロトコール（実施例２参照）を使って、親ラ
ットの前脳ライブラリーから分離し、プローブとしてＧ
ｌｕＲ１ｃＤＮＡの放射能標識断片を分離した。図９〜
１４および１５〜２０は、クローンλＲＢ１４（Ｇｌｕ
Ｒ２）およびλＲＢ３１２（ＧｌｕＲ３）のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を示す。ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値は、それ
ぞれ９６，０００ダルトン（８６２個のアミノ酸）およ
び９８，０００ダルトン（８６６個のアミノ酸）であ
る。潜在的なＮグリコシル化部位は、ＧｌｕＲ２タンパ
ク質中ではＡｓｎ２３５、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３８
５、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ８３５にあり、ＧｌｕＲ
３タンパク質中では、Ａｓｎ３５、Ａｓｎ２３８、Ａｓ
ｎ３５２、Ａｓｎ３８７およびＡｓｎ３９４にある。Ｇ
ｌｕＲ１と同様に、ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３との両者の
疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領域が分
かる。こういった１つのドメインは、各タンパク質のア
ミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴をもつ一
方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜ヘリック
ス（ＭＳＲ Ｉ〜ＩＶ）を形成し、各ポリペプチドのカ
ルボキシ末端側半分に位置する。
【００８９】図２１〜２４は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２
およびＧｌｕＲ３（ならびにＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５）遺伝子によってコードされたタンパク質の推定アミ
ノ酸配列を示す。配列が示すように、ＧｌｕＲ１とＧｌ
ｕＲ２間（７０％）、およびＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３間
（６９％）、ならびにＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３間（７４
％）で有意な配列の同一性が認められる（表３も参
照）。配列の同一性は、各タンパク質のカルボキシ末端
側半分において最も顕著である。
およびＧｌｕＲ３（ならびにＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５）遺伝子によってコードされたタンパク質の推定アミ
ノ酸配列を示す。配列が示すように、ＧｌｕＲ１とＧｌ
ｕＲ２間（７０％）、およびＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３間
（６９％）、ならびにＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３間（７４
％）で有意な配列の同一性が認められる（表３も参
照）。配列の同一性は、各タンパク質のカルボキシ末端
側半分において最も顕著である。
【００９０】実施例９ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の電気生理学
的比較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３によってコー
ドされるタンパク質間に高い類似性の見られることは、
ＧｌｕＲ１の場合と同様に、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ
３タンパク質がアフリカツメガエルの卵母細胞中でモホ
のカイネート感受性イオンチャンネルとして機能する示
唆を与えた。この仮説を調べるために、卵母細胞に、イ
ンビトロで合成したＲＮＡ転写物（各ｃＤＮＡクローン
由来）を注入した。図２５は、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３が、１００μM ＫＡのバッチ中投与に対する応答で
脱分極することを示している。
的比較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３によってコー
ドされるタンパク質間に高い類似性の見られることは、
ＧｌｕＲ１の場合と同様に、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ
３タンパク質がアフリカツメガエルの卵母細胞中でモホ
のカイネート感受性イオンチャンネルとして機能する示
唆を与えた。この仮説を調べるために、卵母細胞に、イ
ンビトロで合成したＲＮＡ転写物（各ｃＤＮＡクローン
由来）を注入した。図２５は、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３が、１００μM ＫＡのバッチ中投与に対する応答で
脱分極することを示している。
【００９１】ＫＡ応答の大きさは、３種のグルタメート
受容体サブユニトに関して等価ではなかった。注入ＲＮ
Ａが当量（２ng）である場合、ＧｌｕＲ３ＲＮＡ注入卵
母細胞での応答は、ＧｌｕＲ１応答より常に大きかっ
た。ＧｌｕＲ２注入卵母細胞でのＫＡ誘発脱分極は、も
っとも弱く、さらに大量のＲＮＡ（１０〜２５ng）を注
入した卵母細胞で検出可能となるだけであった。
受容体サブユニトに関して等価ではなかった。注入ＲＮ
Ａが当量（２ng）である場合、ＧｌｕＲ３ＲＮＡ注入卵
母細胞での応答は、ＧｌｕＲ１応答より常に大きかっ
た。ＧｌｕＲ２注入卵母細胞でのＫＡ誘発脱分極は、も
っとも弱く、さらに大量のＲＮＡ（１０〜２５ng）を注
入した卵母細胞で検出可能となるだけであった。
【００９２】図２６でのデータは、ＫＡの他に、Ｇｌｕ
Ｒ１またはＧｌｕＲ３を注入された卵母細胞がＱＵＩＳ
（１０μM ）、ＡＭＰＡ（５０μM ）、グルタメート
（ＧＬＵ、１００μM ）にも応答することを示してい
る。検出可能な応答は、ＮＭＤＡ（３０μM ＋１０μM
グリシン）またはＡＰＢ（５０μM ）では得られなかっ
た。ＧｌｕＲ２を注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量を行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。ＧｌｕＲ１注入の卵母細胞では、ＡＭＰＡ
およびＱＵＩＳに対する応答は一般に、ＫＡ応答の最大
値の３５〜４０％であったが、ＧｌｕＲ３ではＫＡ応答
の約１０％であった。ＫＡに対して、ドモ酸（ＤＯＭ、
１００μM ）へのＧｌｕＲ１応答は、ＧｌｕＲ３で見ら
れるものより約６倍大きい。全体的にみれば、これらの
データは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３サブユニットか
ら会合した受容体は薬理学的に異なっていることを示
す。さらに、効率は低下しているものの、ホモのＧｌｕ
Ｒ１およびＧｌｕＲ３受容体がＱＵＩＳとＡＭＰＡの両
者に応答するという観察結果から、ＫＡ、ＱＵＩＳおよ
びＡＭＰＡが同一のグルタメート受容体ポリペプチドに
結合し得る直接の証拠が得られる。
Ｒ１またはＧｌｕＲ３を注入された卵母細胞がＱＵＩＳ
（１０μM ）、ＡＭＰＡ（５０μM ）、グルタメート
（ＧＬＵ、１００μM ）にも応答することを示してい
る。検出可能な応答は、ＮＭＤＡ（３０μM ＋１０μM
グリシン）またはＡＰＢ（５０μM ）では得られなかっ
た。ＧｌｕＲ２を注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量を行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。ＧｌｕＲ１注入の卵母細胞では、ＡＭＰＡ
およびＱＵＩＳに対する応答は一般に、ＫＡ応答の最大
値の３５〜４０％であったが、ＧｌｕＲ３ではＫＡ応答
の約１０％であった。ＫＡに対して、ドモ酸（ＤＯＭ、
１００μM ）へのＧｌｕＲ１応答は、ＧｌｕＲ３で見ら
れるものより約６倍大きい。全体的にみれば、これらの
データは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３サブユニットか
ら会合した受容体は薬理学的に異なっていることを示
す。さらに、効率は低下しているものの、ホモのＧｌｕ
Ｒ１およびＧｌｕＲ３受容体がＱＵＩＳとＡＭＰＡの両
者に応答するという観察結果から、ＫＡ、ＱＵＩＳおよ
びＡＭＰＡが同一のグルタメート受容体ポリペプチドに
結合し得る直接の証拠が得られる。
【００９３】また、図２５、２６は、ＧｌｕＲ１または
ＧｌｕＲ３サブユニットＲＮＡを注入した卵母細胞の薬
理学的プロフィールがラット前脳海馬のポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡを注入した卵母細胞で見られるものと有意に異なる
ことを示す。この所見は、海馬ＲＮＡを注入した卵母細
胞で見られる応答が、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧ
ｌｕＲ３サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせ体から会合したヘテログルタメート受容体によって
媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３種す
べてのＧｌｕＲサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
ＧｌｕＲ３サブユニットＲＮＡを注入した卵母細胞の薬
理学的プロフィールがラット前脳海馬のポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡを注入した卵母細胞で見られるものと有意に異なる
ことを示す。この所見は、海馬ＲＮＡを注入した卵母細
胞で見られる応答が、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧ
ｌｕＲ３サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせ体から会合したヘテログルタメート受容体によって
媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３種す
べてのＧｌｕＲサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
【００９４】実施例１０ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の薬理学的比
較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット
遺伝子によってコードされたタンパク質の混合物から会
合したグルタメート受容体が、それぞれ互いに、または
単一サブユニット受容体で観察されるものとは有意に異
なる薬理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例
で解説する。
較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット
遺伝子によってコードされたタンパク質の混合物から会
合したグルタメート受容体が、それぞれ互いに、または
単一サブユニット受容体で観察されるものとは有意に異
なる薬理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例
で解説する。
【００９５】図２５および２６でのデータの比較によっ
て、被験アゴニストでは、薬理学の面で実質的な差異が
ほとんどないことが示唆される。しかし、ＧｌｕＲ１に
比較して、ＱＵＩＳ、ＡＭＰＡおよびＧＬＵへの応答
は、サブユニットの組み合わせ体を発現する卵母細胞中
で有意に低下している。ＮＭＤＡ応答を例外として、Ｇ
ｌｕＲサブユニット組み合わせ体を注入した卵母細胞で
の全アゴニストプロフィールは、ＧｌｕＲ１またはＧｌ
ｕＲ３サブユニットＲＮＡのみを注入した卵母細胞より
も、海馬ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを含む卵母細胞に類似して
いる。
て、被験アゴニストでは、薬理学の面で実質的な差異が
ほとんどないことが示唆される。しかし、ＧｌｕＲ１に
比較して、ＱＵＩＳ、ＡＭＰＡおよびＧＬＵへの応答
は、サブユニットの組み合わせ体を発現する卵母細胞中
で有意に低下している。ＮＭＤＡ応答を例外として、Ｇ
ｌｕＲサブユニット組み合わせ体を注入した卵母細胞で
の全アゴニストプロフィールは、ＧｌｕＲ１またはＧｌ
ｕＲ３サブユニットＲＮＡのみを注入した卵母細胞より
も、海馬ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを含む卵母細胞に類似して
いる。
【００９６】実施例１１ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３から記録され
たＫＡ誘起電流の比較図２７、２８は、ＧｌｕＲ１、Ｇ
ｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニットの混合物を注入
した卵母細胞から記録されたＫＡ誘起電流（斑点カラ
ム）と、個々のサブユニットに対して測定された総電流
（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な所見
は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２サブユニットを両方発現す
る卵母細胞でのＫＡ誘起電流の有意な増大（１回注入し
た卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、または
ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３サブユニットの場合（約２倍の
増大）である。３種類すべてのサブユニットＲＮＡの注
入の結果は、ＫＡ誘起電流の平均２．５倍の増大とな
る。
たＫＡ誘起電流の比較図２７、２８は、ＧｌｕＲ１、Ｇ
ｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニットの混合物を注入
した卵母細胞から記録されたＫＡ誘起電流（斑点カラ
ム）と、個々のサブユニットに対して測定された総電流
（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な所見
は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２サブユニットを両方発現す
る卵母細胞でのＫＡ誘起電流の有意な増大（１回注入し
た卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、または
ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３サブユニットの場合（約２倍の
増大）である。３種類すべてのサブユニットＲＮＡの注
入の結果は、ＫＡ誘起電流の平均２．５倍の増大とな
る。
【００９７】これらの結果は、卵母細胞中では、個々の
グルタメート受容体サブユニットのポリペプチドが、そ
れぞれ独立した単純な様式で機能するのではなく、互い
に相互作用するという結論を裏付けるものである。こう
いった相互作用の結果、単一のグルタメート受容体のサ
ブユニットからなる受容体とは異なる性質を有するヘテ
ログルタメート受容体が産生される。
グルタメート受容体サブユニットのポリペプチドが、そ
れぞれ独立した単純な様式で機能するのではなく、互い
に相互作用するという結論を裏付けるものである。こう
いった相互作用の結果、単一のグルタメート受容体のサ
ブユニットからなる受容体とは異なる性質を有するヘテ
ログルタメート受容体が産生される。
【００９８】実施例１２ ＫＡ誘起応答に関する電流−電圧の関係 この実施例では、個々のＧｌｕＲのサブユニット、それ
らの組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定したＫＡ誘起応答に関して、電
流−電圧（Ｉ／Ｖ）の関係を調べる。
らの組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定したＫＡ誘起応答に関して、電
流−電圧（Ｉ／Ｖ）の関係を調べる。
【００９９】Ｉ／Ｖデータを図２９〜３１に示す。この
図では、個々のグルタメート受容体サブユニットのＲＮ
Ａを注入した卵母細胞をパネルＡに、サブユニットの組
み合わせ体を注入した卵母細胞をパネルＢおよびＣに示
し、海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを発現する卵母細胞を比
較のためにパネルＡに示す。脳のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定されたＫＡ応答は、約−１０mV
の反転電圧とほぼ線形Ｉ／Ｖの関係を示す。この結果
は、単一のＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３のサブユニット
ＲＮＡを注入した卵母細胞で得られたＩ／Ｖ曲線とは著
しく対照的である。ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ３は、強
い内向きの整流および約−４０mVの反転電圧を示す。こ
れらのデータから、海馬ＲＮＡを注入した卵母細胞に存
在するＫＡ感受性受容体は、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ
３サブユニットのＲＮＡを注入した卵母細胞によって会
合されたものとは異なるのは明らかである。
図では、個々のグルタメート受容体サブユニットのＲＮ
Ａを注入した卵母細胞をパネルＡに、サブユニットの組
み合わせ体を注入した卵母細胞をパネルＢおよびＣに示
し、海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを発現する卵母細胞を比
較のためにパネルＡに示す。脳のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定されたＫＡ応答は、約−１０mV
の反転電圧とほぼ線形Ｉ／Ｖの関係を示す。この結果
は、単一のＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３のサブユニット
ＲＮＡを注入した卵母細胞で得られたＩ／Ｖ曲線とは著
しく対照的である。ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ３は、強
い内向きの整流および約−４０mVの反転電圧を示す。こ
れらのデータから、海馬ＲＮＡを注入した卵母細胞に存
在するＫＡ感受性受容体は、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ
３サブユニットのＲＮＡを注入した卵母細胞によって会
合されたものとは異なるのは明らかである。
【０１００】図３０では、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体に関するＩ／Ｖ曲線がＧｌｕＲ１サブユニッ
ト単独で観察されるものとは顕著に異なっている。この
対のＲＮＡを注入した卵母細胞は、ほぼ線形のＩ／Ｖプ
ロットを示し、約−１０mVの反転電位を有する。このプ
ロットは、海馬のＲＮＡを注入した卵母細胞で見られる
ものと非常に類似している（パネルＡ）。対照的に、Ｇ
ｌｕＲ１とＧｌｕＲ３の組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線は、
個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定される
ものとは僅かに異なっている。図３１は、ＧｌｕＲ２と
ＧｌｕＲ３サブユニットの組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線で
いくらか内向の整流がみられること、およびＧｌｕＲ１
＋ＧｌｕＲ２または海馬ＲＮＡのＩ／Ｖ曲線で決定され
た反転電圧（−１０mV）より若干大きい負（−２０mV）
の反転電圧が生じることが示されている。これら３つの
グルタメート受容体サブユニットのＲＮＡが単一の卵母
細胞で組み合わされとき、得られたＩ／Ｖ曲線は、反転
電圧と勾配の両面でＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組み合わ
せ体でみられるＩ／Ｖ曲線と近似しているが、これらの
サブユニットとの応答は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を示
す。
み合わせ体に関するＩ／Ｖ曲線がＧｌｕＲ１サブユニッ
ト単独で観察されるものとは顕著に異なっている。この
対のＲＮＡを注入した卵母細胞は、ほぼ線形のＩ／Ｖプ
ロットを示し、約−１０mVの反転電位を有する。このプ
ロットは、海馬のＲＮＡを注入した卵母細胞で見られる
ものと非常に類似している（パネルＡ）。対照的に、Ｇ
ｌｕＲ１とＧｌｕＲ３の組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線は、
個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定される
ものとは僅かに異なっている。図３１は、ＧｌｕＲ２と
ＧｌｕＲ３サブユニットの組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線で
いくらか内向の整流がみられること、およびＧｌｕＲ１
＋ＧｌｕＲ２または海馬ＲＮＡのＩ／Ｖ曲線で決定され
た反転電圧（−１０mV）より若干大きい負（−２０mV）
の反転電圧が生じることが示されている。これら３つの
グルタメート受容体サブユニットのＲＮＡが単一の卵母
細胞で組み合わされとき、得られたＩ／Ｖ曲線は、反転
電圧と勾配の両面でＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組み合わ
せ体でみられるＩ／Ｖ曲線と近似しているが、これらの
サブユニットとの応答は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を示
す。
【０１０１】実施例１３ 哺乳動物の中枢神経系におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２
およびＧｌｕＲ３のｍＲＮＡの分布 インビボでヘテログルタメート受容体を形成するＧｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子の会合体は、
個々のサブユニットの遺伝子が異なった神経解剖学的部
位で転写されることを示せば証明され得る。したがっ
て、親ラットの脳におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およ
びＧｌｕＲ３のＲＮＡの分布を、標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブおよび基本的には文献［Deneris et al., J.
Biol. Chem. 264, 6268 (1989) ］に記載されているよ
うな、in situ でのハイブリダイゼーション組織化学を
用いて調べた。この結果は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２お
よびＧｌｕＲ３プローブで得られたハイブリダイゼーシ
ョンパターンが、海馬および歯状回のＣＡ１−ＣＡ３領
域で認められる強いハイブリダイゼーションとほぼ一致
していたことを表していた。これらの領域の高分解能解
析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、ＣＡ１−
ＣＡ３領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どか全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、ＧｌｕＲ
１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット遺伝子の
全発現パターンは実質的に一致していた。
およびＧｌｕＲ３のｍＲＮＡの分布 インビボでヘテログルタメート受容体を形成するＧｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子の会合体は、
個々のサブユニットの遺伝子が異なった神経解剖学的部
位で転写されることを示せば証明され得る。したがっ
て、親ラットの脳におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およ
びＧｌｕＲ３のＲＮＡの分布を、標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブおよび基本的には文献［Deneris et al., J.
Biol. Chem. 264, 6268 (1989) ］に記載されているよ
うな、in situ でのハイブリダイゼーション組織化学を
用いて調べた。この結果は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２お
よびＧｌｕＲ３プローブで得られたハイブリダイゼーシ
ョンパターンが、海馬および歯状回のＣＡ１−ＣＡ３領
域で認められる強いハイブリダイゼーションとほぼ一致
していたことを表していた。これらの領域の高分解能解
析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、ＣＡ１−
ＣＡ３領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どか全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、ＧｌｕＲ
１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット遺伝子の
全発現パターンは実質的に一致していた。
【０１０２】実施例１４ ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの分離 プローブとしてＧｌｕＲ２ｃＤＮＡの断片（ヌクレオチ
ド１７９３−２２４０）を用い、弱い緊縮ハイブリダイ
ゼーションプロトコールによって、数個のＧｌｕＲ４お
よびＲ５クローンをラットの前脳ライブラリーから分離
した。配列解析によって、これらｃＤＮＡクローンのど
れもが全オープンリーディングフレームを含まないこと
が示された。異なった親ラットの前脳組織からのｍＲＮ
Ａを用いたノーザン法から、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５転写物が小脳で最も豊富であることが示された。続い
て、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｃＤＮＡクローンの一
部を強い緊縮スクリーニング条件下でプローブとして使
用して、親ラットの小脳のｃＤＮＡライブラリーから大
きなオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。
ド１７９３−２２４０）を用い、弱い緊縮ハイブリダイ
ゼーションプロトコールによって、数個のＧｌｕＲ４お
よびＲ５クローンをラットの前脳ライブラリーから分離
した。配列解析によって、これらｃＤＮＡクローンのど
れもが全オープンリーディングフレームを含まないこと
が示された。異なった親ラットの前脳組織からのｍＲＮ
Ａを用いたノーザン法から、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５転写物が小脳で最も豊富であることが示された。続い
て、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｃＤＮＡクローンの一
部を強い緊縮スクリーニング条件下でプローブとして使
用して、親ラットの小脳のｃＤＮＡライブラリーから大
きなオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。
【０１０３】こうして分離されたｃＤＮＡクローンの中
で、２つのＧｌｕＲ４関連クローン（λＣＥＲ１１２お
よびλＣＥＲ１２１Ｂ）は、ＧｌｕＲ４遺伝子の一部だ
けをコードしていたが、ｐＢＳ ＳＫ（＋）ベクター
（Stratagene Cloning Systems）での完全な長さの発現
可能な構造体を加工するに十分な重複はもっていなかっ
た。このＧｌｕＲ４構造体のヌクレオチド配列は、ｐＫ
４５と命名され、配列決定されたので、その推定アミノ
酸配列を図３２〜３５に示す。
で、２つのＧｌｕＲ４関連クローン（λＣＥＲ１１２お
よびλＣＥＲ１２１Ｂ）は、ＧｌｕＲ４遺伝子の一部だ
けをコードしていたが、ｐＢＳ ＳＫ（＋）ベクター
（Stratagene Cloning Systems）での完全な長さの発現
可能な構造体を加工するに十分な重複はもっていなかっ
た。このＧｌｕＲ４構造体のヌクレオチド配列は、ｐＫ
４５と命名され、配列決定されたので、その推定アミノ
酸配列を図３２〜３５に示す。
【０１０４】小脳ライブラリーから分離した２９個のＧ
ｌｕＲ５関連ｃＤＮＡの中で、同一の大きなオープンリ
ーディングフレームをコードする３つのクローン（λＲ
Ｂ１２、λＲＢ１５およびλＲＢ２０）を同定した。ｃ
ＤＮＡクローンλＲＢ２０（ＧｌｕＲ５−１）の配列を
図３６〜４３に示す。λＲＢ１５およびλＲＢ１２は、
５’末端のところがλＲＢ２０より短かった。λＲＢ２
０ｃＤＮＡは、１８７ｋｂの５’末端非翻訳領域、２７
６０ｂｐの連続オープンリーディングフレーム、および
３０３ｂｐの３’末端非翻訳領域からなる。この５’末
端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴である配列ＡＡＧ
ＡＴＧＧで終わっている。
ｌｕＲ５関連ｃＤＮＡの中で、同一の大きなオープンリ
ーディングフレームをコードする３つのクローン（λＲ
Ｂ１２、λＲＢ１５およびλＲＢ２０）を同定した。ｃ
ＤＮＡクローンλＲＢ２０（ＧｌｕＲ５−１）の配列を
図３６〜４３に示す。λＲＢ１５およびλＲＢ１２は、
５’末端のところがλＲＢ２０より短かった。λＲＢ２
０ｃＤＮＡは、１８７ｋｂの５’末端非翻訳領域、２７
６０ｂｐの連続オープンリーディングフレーム、および
３０３ｂｐの３’末端非翻訳領域からなる。この５’末
端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴である配列ＡＡＧ
ＡＴＧＧで終わっている。
【０１０５】前脳ライブラリーを起源として分離された
更に３つのｃＤＮＡクローンも調べた。これらｃＤＮＡ
の配列は、予想翻訳開始領域部位でλＲＢ２０と同一で
ある。配列決定によって、ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの２つの
変異体が前脳および小脳ライブラリーに現れることが分
かった。この異質性はλＲＢ２０にみられる４５ヌクレ
オチドの挿入に由来し、２９個のＧｌｕＲ５関連ｃＤＮ
Ａクローンのうち１７個が分離された（図３６〜４
３）。この挿入によって、上記のオープンリーディング
フレームは断絶されない。さらに、共通のスプライスド
ナーおよびアクセプター部位は存在しない［Breathnach
and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (198
1) ］。これは、その挿入がスプライスされないイント
ロンから生じるのではなく、別のスプライス現象の結果
である可能性が高いことを示唆するものである。ヌクレ
オチド配列の解析は、２つのＧｌｕＲ５変異体が他の点
では同一であることを示す。
更に３つのｃＤＮＡクローンも調べた。これらｃＤＮＡ
の配列は、予想翻訳開始領域部位でλＲＢ２０と同一で
ある。配列決定によって、ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの２つの
変異体が前脳および小脳ライブラリーに現れることが分
かった。この異質性はλＲＢ２０にみられる４５ヌクレ
オチドの挿入に由来し、２９個のＧｌｕＲ５関連ｃＤＮ
Ａクローンのうち１７個が分離された（図３６〜４
３）。この挿入によって、上記のオープンリーディング
フレームは断絶されない。さらに、共通のスプライスド
ナーおよびアクセプター部位は存在しない［Breathnach
and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (198
1) ］。これは、その挿入がスプライスされないイント
ロンから生じるのではなく、別のスプライス現象の結果
である可能性が高いことを示唆するものである。ヌクレ
オチド配列の解析は、２つのＧｌｕＲ５変異体が他の点
では同一であることを示す。
【０１０６】全オープンリーディングフレームをコード
する短いスプライス変異体を調べるためのｃＤＮＡクロ
ーンは見い出されていない。したがって、λＲＢ２０
（ＧｌｕＲ５−１）に見られる４５個のヌクレオチドの
挿入片を欠いているが、他の点ではそのクローンと同一
のクローン（λＲＢ△２０）が構成された。この短いス
プライス変異体クローン（λＲＢ△２０）をＧｌｕＲ５
−２と称する。λＲＢ２０とλＲＢ△２０の双方はアフ
リカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され（実
施例１６参照）、コードされた変異体タンパクをＧｌｕ
Ｒ５−１およびＧｌｕＲ５−２とそれぞれ命名した。
する短いスプライス変異体を調べるためのｃＤＮＡクロ
ーンは見い出されていない。したがって、λＲＢ２０
（ＧｌｕＲ５−１）に見られる４５個のヌクレオチドの
挿入片を欠いているが、他の点ではそのクローンと同一
のクローン（λＲＢ△２０）が構成された。この短いス
プライス変異体クローン（λＲＢ△２０）をＧｌｕＲ５
−２と称する。λＲＢ２０とλＲＢ△２０の双方はアフ
リカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され（実
施例１６参照）、コードされた変異体タンパクをＧｌｕ
Ｒ５−１およびＧｌｕＲ５−２とそれぞれ命名した。
【０１０７】ＧｌｕＲ４ｍＲＮＡは、４．５ｋｂの１種
として、小脳ＲＮＡをノーザン法にかけて検出されたも
のである。よりサイズの小さいこのｍＲＮＡは、スプラ
イス変異体を表すこともある。ノーザン法解析によっ
て、主要なＧｌｕＲ５ｍＲＮＡは６キロベースのサイズ
を有することも示された。
として、小脳ＲＮＡをノーザン法にかけて検出されたも
のである。よりサイズの小さいこのｍＲＮＡは、スプラ
イス変異体を表すこともある。ノーザン法解析によっ
て、主要なＧｌｕＲ５ｍＲＮＡは６キロベースのサイズ
を有することも示された。
【０１０８】実施例１５ ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡおよびタンパク質の構造的特徴 ＧｌｕＲ５−１のｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳か
ら、９２０アミノ酸残基からなる単一の長いオープンリ
ーディングフレームの存在が予期される（図３６〜４
３）。ＧｌｕＲ５の配列には、全体的アミノ酸配列の点
で各ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと同一性がある（図２
１〜２４および表３）。ＧｌｕＲ５−１におけるこの１
５個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中でも独
特であるので、短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、特徴
の明らかなＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットの対応物であ
る。表３は、ＧｌｕＲ５がこれまで同定された中で最も
類似性の低いグルタメート受容体サブユニットであり、
ＧｌｕＲ５とＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットとの比較は最
も保存的配列の要素を明らかにすることを示す（図２１
〜２４）。他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
群、神経伝達物質のアセチルコリン受容体およびＧＡＢ
ＡＡ 受容体およびグリシン受容体群の中では、Ｎ末端
細胞外ドメインが最も保存されているが、Ｃ末端配列は
経膜領域（ＭＳＲ）III とIVとの間で変異している。グ
ルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、対照的
に、提唱されたＭＳＲＩ［Hollmann, et al., Nature 3
42, 643 (1989)］のＮ末端領域にはわずか１７％の同一
性しかなく、４５％の同一性があるＭＳＲＩのＣ末端領
域よりも類似していない。リガンドゲーティング神経伝
達物質の受容体チャンネル複合体［Barnard, et al., T
rends Neurosci. 10, 502 (1987)］の特徴である「 Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓループ」は、グルタメート受容体サブユニッ
ト群中には保存されていない（図２１〜２４）。グルタ
メート受容体サブユニットの半分のＣ末端側は、チャン
ネル形成に関与していることが示唆され、仮定された経
膜ヘリックス（ＭＳＲ I〜IV、図２１〜２４）［Hollma
nn, et al., Natuer 342, 643 (1989)］を含む。 推定さ
れたＭＳＲIII は、最も保存された連続配列であって、
ＧｌｕＲ５タンパク質中で唯一の保存的アミノ酸置換
（ＶａｌからＩｌｅ）を有する。上記のように、他のリ
ガンドゲーテッドチャンネル群で、ＭＳＲIII とIVとの
間のセグメントは長さおよび配列の点で変異している。
グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定された
セグメントの類似性は高く（４８％）、ＧｌｕＲ５だけ
が配列の長さの変異を示す。ＫＡ／ＡＭＰＡ受容体およ
びＧｌｕＲ５タンパク質は一般に、提唱されたＭＳＲIV
のＣ末端が変異している。
ら、９２０アミノ酸残基からなる単一の長いオープンリ
ーディングフレームの存在が予期される（図３６〜４
３）。ＧｌｕＲ５の配列には、全体的アミノ酸配列の点
で各ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと同一性がある（図２
１〜２４および表３）。ＧｌｕＲ５−１におけるこの１
５個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中でも独
特であるので、短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、特徴
の明らかなＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットの対応物であ
る。表３は、ＧｌｕＲ５がこれまで同定された中で最も
類似性の低いグルタメート受容体サブユニットであり、
ＧｌｕＲ５とＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットとの比較は最
も保存的配列の要素を明らかにすることを示す（図２１
〜２４）。他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
群、神経伝達物質のアセチルコリン受容体およびＧＡＢ
ＡＡ 受容体およびグリシン受容体群の中では、Ｎ末端
細胞外ドメインが最も保存されているが、Ｃ末端配列は
経膜領域（ＭＳＲ）III とIVとの間で変異している。グ
ルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、対照的
に、提唱されたＭＳＲＩ［Hollmann, et al., Nature 3
42, 643 (1989)］のＮ末端領域にはわずか１７％の同一
性しかなく、４５％の同一性があるＭＳＲＩのＣ末端領
域よりも類似していない。リガンドゲーティング神経伝
達物質の受容体チャンネル複合体［Barnard, et al., T
rends Neurosci. 10, 502 (1987)］の特徴である「 Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓループ」は、グルタメート受容体サブユニッ
ト群中には保存されていない（図２１〜２４）。グルタ
メート受容体サブユニットの半分のＣ末端側は、チャン
ネル形成に関与していることが示唆され、仮定された経
膜ヘリックス（ＭＳＲ I〜IV、図２１〜２４）［Hollma
nn, et al., Natuer 342, 643 (1989)］を含む。 推定さ
れたＭＳＲIII は、最も保存された連続配列であって、
ＧｌｕＲ５タンパク質中で唯一の保存的アミノ酸置換
（ＶａｌからＩｌｅ）を有する。上記のように、他のリ
ガンドゲーテッドチャンネル群で、ＭＳＲIII とIVとの
間のセグメントは長さおよび配列の点で変異している。
グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定された
セグメントの類似性は高く（４８％）、ＧｌｕＲ５だけ
が配列の長さの変異を示す。ＫＡ／ＡＭＰＡ受容体およ
びＧｌｕＲ５タンパク質は一般に、提唱されたＭＳＲIV
のＣ末端が変異している。
【０１０９】ＧｌｕＲ５の疎水性プロットは、ＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体のそれに類似しており、このタンパク質の
提唱されたイオンチャンネル形成部分で保存性の２次構
造が示唆される。しかし、ＧｌｕＲ５のＮ末端側の半分
の疎水性プロットは一般的ではない。この領域では、Ｋ
Ａ／ＡＭＰＡサブユニットと比較した場合、ＧｌｕＲ５
はより疎水性であって、膜を貫通し得るいくつかのセグ
メントを含む。膜付随性のヘリックスを探す計算法に基
づくと、４つ［Rao and Argos, Biochim. Biophys. Act
a 869, 197-214 (1986) ］または７つ［Eisenberg et a
l., J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984) ］の仮定的ト
ランスメンブラン領域がＧｌｕＲ５に付与され得る。
ＭＰＡ受容体のそれに類似しており、このタンパク質の
提唱されたイオンチャンネル形成部分で保存性の２次構
造が示唆される。しかし、ＧｌｕＲ５のＮ末端側の半分
の疎水性プロットは一般的ではない。この領域では、Ｋ
Ａ／ＡＭＰＡサブユニットと比較した場合、ＧｌｕＲ５
はより疎水性であって、膜を貫通し得るいくつかのセグ
メントを含む。膜付随性のヘリックスを探す計算法に基
づくと、４つ［Rao and Argos, Biochim. Biophys. Act
a 869, 197-214 (1986) ］または７つ［Eisenberg et a
l., J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984) ］の仮定的ト
ランスメンブラン領域がＧｌｕＲ５に付与され得る。
【０１１０】５つすべてのグルタメート受容体サブユニ
ットを、カエルのＫＡ結合タンパク質［Gregor, et a
l., Nature 342. 689 (1989)］とニワトリのＫＡ結合タ
ンパク質［Wada et al., Nature 342, 684 (1989) ］で
比較すると、 同じような程度の配列保存性（３５〜４０
％アミノ酸同一性）が示される。ＧｌｕＲ５配列に関す
る、GenBank, EMBL およびSWISS-PROTデーターベースの
FASTA サーチ［Pearsonand Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. 85, 2444 (1988)］により、他のタンパク質との
有意な類似性がないことが示された。
ットを、カエルのＫＡ結合タンパク質［Gregor, et a
l., Nature 342. 689 (1989)］とニワトリのＫＡ結合タ
ンパク質［Wada et al., Nature 342, 684 (1989) ］で
比較すると、 同じような程度の配列保存性（３５〜４０
％アミノ酸同一性）が示される。ＧｌｕＲ５配列に関す
る、GenBank, EMBL およびSWISS-PROTデーターベースの
FASTA サーチ［Pearsonand Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. 85, 2444 (1988)］により、他のタンパク質との
有意な類似性がないことが示された。
【０１１１】実施例１６ Ｌ−グルタメートにさらされたＧｌｕＲ５ｍＲＮＡ注入
卵母細胞の電気生理学的性質 インビトロで合成したＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５
−２ｃＲＮＡをそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞
中で発現させた。いずれのｃＲＮＡについても、グルタ
メート受容体のアゴニストであるＫＡ（１００μM ）、
ＡＭＰＡ（５０μM ）、キスカレート（１０μM ）、Ａ
ＰＢ（１００μM ）およびＮＭＤＡ（１００μM 、１０
μM のグリシンとともに投与）のいずれの投与でも、ｃ
ＲＮＡ注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。しか
し、Ｌ−グルタメート（１００μM ）によって誘起され
た弱い膜の脱分極が、ＧｌｕＲ５−１ｃＲＮＡ（最大脱
分極、３．５mV）およびＧｌｕＲ５−２ｃＲＮＡ（最大
脱分極、４．５mV）を注入した卵母細胞で記録された。
ＧｌｕＲ５−２のみを注入した卵母細胞に比較して、Ｇ
ｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５−２とを同時に注入した卵母
細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意に強い膜の脱
分極は認められなかった。ＧｌｕＲ５−１またはＧｌｕ
Ｒ５−２ｃＲＮＡを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、ＧｌｕＲ５
−１（膜の脱分極、２．２９±０．２６mV s.e.m）では
７個（７個中）の卵母細胞で記録され、ＧｌｕＲ５−２
（２．２７±０．１９mV s.e.m）では２９個（３３個
中）の卵母細胞で記録された。
卵母細胞の電気生理学的性質 インビトロで合成したＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５
−２ｃＲＮＡをそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞
中で発現させた。いずれのｃＲＮＡについても、グルタ
メート受容体のアゴニストであるＫＡ（１００μM ）、
ＡＭＰＡ（５０μM ）、キスカレート（１０μM ）、Ａ
ＰＢ（１００μM ）およびＮＭＤＡ（１００μM 、１０
μM のグリシンとともに投与）のいずれの投与でも、ｃ
ＲＮＡ注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。しか
し、Ｌ−グルタメート（１００μM ）によって誘起され
た弱い膜の脱分極が、ＧｌｕＲ５−１ｃＲＮＡ（最大脱
分極、３．５mV）およびＧｌｕＲ５−２ｃＲＮＡ（最大
脱分極、４．５mV）を注入した卵母細胞で記録された。
ＧｌｕＲ５−２のみを注入した卵母細胞に比較して、Ｇ
ｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５−２とを同時に注入した卵母
細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意に強い膜の脱
分極は認められなかった。ＧｌｕＲ５−１またはＧｌｕ
Ｒ５−２ｃＲＮＡを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、ＧｌｕＲ５
−１（膜の脱分極、２．２９±０．２６mV s.e.m）では
７個（７個中）の卵母細胞で記録され、ＧｌｕＲ５−２
（２．２７±０．１９mV s.e.m）では２９個（３３個
中）の卵母細胞で記録された。
【０１１２】実施例１７ 発生中の中枢および末梢神経系におけるＧｌｕＲ４およ
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝子発現に関する発生面の研究
のために、胚１０日目（Ｅ１０）から誕生２１日目（Ｐ
２１）にかけてマウスの切片をin situ ハイブリダイゼ
ーションおよび組織化学によって解析した。
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝子発現に関する発生面の研究
のために、胚１０日目（Ｅ１０）から誕生２１日目（Ｐ
２１）にかけてマウスの切片をin situ ハイブリダイゼ
ーションおよび組織化学によって解析した。
【０１１３】全ＣＮＳ中で、ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝
子の不鮮明な発現はＥ１０で検出された。これら最初の
ハイブリダイゼーションシグナルは、有糸分裂後のニュ
ーロンに由来する。これは、Ｅ１２では脳髄で最もよく
示される。この上衣層は、神経腔に対面しており、分裂
中の神経芽細胞を含む。これらの細胞ではハイブリダイ
ゼーションは検出できなかった。有糸分裂後の細胞は神
経管の外部に位置し、両方の遺伝子を発現する。発生の
後期に、ＧｌｕＲ５の転写物は、ニューロンが分化して
会合し核となる領域に著しく存在する。程度は低いがＧ
ｌｕＲ４もこの領域に存在する。このハイブリダイゼー
ションパターンの時間的変化は、延髄の主要な感覚核お
よび周囲の構造物よりも強くハイブリダイズする橋の核
においてＧｌｕＲ５で最もよく認められる。Ｅ１４で
は、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、いくつかの別々の脳核
で特に強く、ＧｌｕＲ４遺伝子の発現は、脳の全吻部お
よび尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Ｇｌ
ｕＲ４遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般
に胚後期の段階よりも少量のｍＲＮＡが検出可能であっ
た。対照的に、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、発生の期間
中空間的により制限されるようにみえ、転写物のレベル
は下降調節された。時間的ＧｌｕＲ５ハイブリダイズパ
ターンの顕著な変化は、小脳皮質でみられた。Ｐ１２ま
で、ＧｌｕＲ５転写物の高レベルが顆粒およびプルキン
エ細胞層でみられた。その後、顆粒細胞層でのハイブリ
ダイゼーションシグナルの強度はプルキンエ細胞層に比
較して低下し、Ｐ１４からはかすかなハイブリダイゼー
ションシグナルが顆粒細胞で検出された。一般に、胚の
発生過程で強い標識を示す脳のこれらの領域では、成熟
ラットでも検出可能な転写物レベルを有していた。Ｐ２
１の動物において、最高のＧｌｕＲ４転写物レベルが、
臭覚球、海馬、小脳および網膜の細胞層で認められた。
網膜では、神経節細胞層および内核層の無軸索細胞で強
いハイブリダイゼーションが認められた。ミュラー細胞
での発現は検出されなかった。ＧｌｕＲ５では、Ｐ２１
での最も強いハイブリダイゼーションシグナルが、臭覚
球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認められた。
子の不鮮明な発現はＥ１０で検出された。これら最初の
ハイブリダイゼーションシグナルは、有糸分裂後のニュ
ーロンに由来する。これは、Ｅ１２では脳髄で最もよく
示される。この上衣層は、神経腔に対面しており、分裂
中の神経芽細胞を含む。これらの細胞ではハイブリダイ
ゼーションは検出できなかった。有糸分裂後の細胞は神
経管の外部に位置し、両方の遺伝子を発現する。発生の
後期に、ＧｌｕＲ５の転写物は、ニューロンが分化して
会合し核となる領域に著しく存在する。程度は低いがＧ
ｌｕＲ４もこの領域に存在する。このハイブリダイゼー
ションパターンの時間的変化は、延髄の主要な感覚核お
よび周囲の構造物よりも強くハイブリダイズする橋の核
においてＧｌｕＲ５で最もよく認められる。Ｅ１４で
は、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、いくつかの別々の脳核
で特に強く、ＧｌｕＲ４遺伝子の発現は、脳の全吻部お
よび尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Ｇｌ
ｕＲ４遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般
に胚後期の段階よりも少量のｍＲＮＡが検出可能であっ
た。対照的に、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、発生の期間
中空間的により制限されるようにみえ、転写物のレベル
は下降調節された。時間的ＧｌｕＲ５ハイブリダイズパ
ターンの顕著な変化は、小脳皮質でみられた。Ｐ１２ま
で、ＧｌｕＲ５転写物の高レベルが顆粒およびプルキン
エ細胞層でみられた。その後、顆粒細胞層でのハイブリ
ダイゼーションシグナルの強度はプルキンエ細胞層に比
較して低下し、Ｐ１４からはかすかなハイブリダイゼー
ションシグナルが顆粒細胞で検出された。一般に、胚の
発生過程で強い標識を示す脳のこれらの領域では、成熟
ラットでも検出可能な転写物レベルを有していた。Ｐ２
１の動物において、最高のＧｌｕＲ４転写物レベルが、
臭覚球、海馬、小脳および網膜の細胞層で認められた。
網膜では、神経節細胞層および内核層の無軸索細胞で強
いハイブリダイゼーションが認められた。ミュラー細胞
での発現は検出されなかった。ＧｌｕＲ５では、Ｐ２１
での最も強いハイブリダイゼーションシグナルが、臭覚
球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認められた。
【０１１４】発生段階の末梢神経系（ＰＮＳ）では、ハ
イブリダイゼーション検出法によって、ＧｌｕＲ４およ
びＲ５遺伝子が、頭蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴
覚神経節）、脊髄神経節および小腸の壁在性神経節にさ
まざまな程度で発現する。ＣＮＳと同様に、ＰＮＳの転
写物は、ＧｌｕＲ４ではＥ１０までに、またＧｌｕＲ５
ではＥ１１までに検出される。発生の間、ＧｌｕＲ４に
対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生後の初
期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維持され
る。ＧｌｕＲ５に対するハイブリダイゼーションシグナ
ルは、Ｅ１６まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（Ｇｌｕ
Ｒ５）および小腸の壁在性神経節（ＧｌｕＲ４およびＧ
ｌｕＲ５）が、ＣＮＳより高レベルのハイブリダイゼー
ションを示す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグ
ラフィーによれば、神経細胞でＧｌｕＲ５プローブのハ
イブリダイゼーションが示されるが、衛星細胞は標識さ
れない。
イブリダイゼーション検出法によって、ＧｌｕＲ４およ
びＲ５遺伝子が、頭蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴
覚神経節）、脊髄神経節および小腸の壁在性神経節にさ
まざまな程度で発現する。ＣＮＳと同様に、ＰＮＳの転
写物は、ＧｌｕＲ４ではＥ１０までに、またＧｌｕＲ５
ではＥ１１までに検出される。発生の間、ＧｌｕＲ４に
対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生後の初
期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維持され
る。ＧｌｕＲ５に対するハイブリダイゼーションシグナ
ルは、Ｅ１６まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（Ｇｌｕ
Ｒ５）および小腸の壁在性神経節（ＧｌｕＲ４およびＧ
ｌｕＲ５）が、ＣＮＳより高レベルのハイブリダイゼー
ションを示す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグ
ラフィーによれば、神経細胞でＧｌｕＲ５プローブのハ
イブリダイゼーションが示されるが、衛星細胞は標識さ
れない。
【０１１５】実施例１８ 成熟の哺乳動物（ラット）の脳におけるＧｌｕＲ４およ
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 。 成熟動物でのＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分
布をin situ ハイブリダイゼーションによって調べた。
前脳では、ＣＡＩおよび海馬の歯状回、中間手綱、そし
て特には網膜視床核で高レベルのＧｌｕＲ４転写物か検
出された。海馬は、ＧｌｕＲ５の弱い発現を示すのみ
で、中間手綱では転写物は全く検出されなかった。Ｇｌ
ｕＲ５ハイブリダイゼーションシグナルは、帯状および
梨状皮質、いくつかの視床核、扁桃、ならびに外側中隔
で強かった。小脳では、ＧｌｕＲ４およびＲ５プローブ
のハイブリダイゼーションパターンは重複していたが区
別された。両プローブは、プルキンエ細胞層において高
レベルで検出された。顆粒細胞層では、ＧｌｕＲ４プロ
ーブは強い標識を生じたが、ＧｌｕＲ５プローブの標識
は弱かった。
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 。 成熟動物でのＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分
布をin situ ハイブリダイゼーションによって調べた。
前脳では、ＣＡＩおよび海馬の歯状回、中間手綱、そし
て特には網膜視床核で高レベルのＧｌｕＲ４転写物か検
出された。海馬は、ＧｌｕＲ５の弱い発現を示すのみ
で、中間手綱では転写物は全く検出されなかった。Ｇｌ
ｕＲ５ハイブリダイゼーションシグナルは、帯状および
梨状皮質、いくつかの視床核、扁桃、ならびに外側中隔
で強かった。小脳では、ＧｌｕＲ４およびＲ５プローブ
のハイブリダイゼーションパターンは重複していたが区
別された。両プローブは、プルキンエ細胞層において高
レベルで検出された。顆粒細胞層では、ＧｌｕＲ４プロ
ーブは強い標識を生じたが、ＧｌｕＲ５プローブの標識
は弱かった。
【０１１６】実施例１９ ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７の単離 ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７遺伝子をコードするｃＤＮ
Ａクローンを、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリー
ニングプロトコール（実施例２参照）およびプローブと
して約１．２ｋｂｐ（ヌクレオチド７０５〜２０４８）
のＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの放射能標識断片を用いて、成熟
ラットの前脳ライブラリーから分離した。この選択され
たクローンを、制限酵素切断地図およびスクリーニング
によって同定した。図４４〜５０は、ＧｌｕＲ６クロー
ンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸配列を
示し、図５１、５２は、ＧｌｕＲ７クローンからの断片
３５−Ｔ３（図５１）およびＵ３５（図５２）に関する
それらの配列を示す。
Ａクローンを、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリー
ニングプロトコール（実施例２参照）およびプローブと
して約１．２ｋｂｐ（ヌクレオチド７０５〜２０４８）
のＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの放射能標識断片を用いて、成熟
ラットの前脳ライブラリーから分離した。この選択され
たクローンを、制限酵素切断地図およびスクリーニング
によって同定した。図４４〜５０は、ＧｌｕＲ６クロー
ンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸配列を
示し、図５１、５２は、ＧｌｕＲ７クローンからの断片
３５−Ｔ３（図５１）およびＵ３５（図５２）に関する
それらの配列を示す。
【０１１７】実施例２０ ＧｌｕＲ関連検出法 ＧｌｕＲｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質およびそれら
の機能性断片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガン
ドを同定して性質決定するために設計されたさまざまな
検出法で有用である。例えば、ｃＤＮＡは、グルタメー
トセレプター遺伝子群の更なるメンバーを同定するため
のプローブとして有用である。この発明のＤＮＡから転
写されたｍＲＮＡは、機能性受容体およびリガンドを同
定して特徴を決定するために設計された検定法で特に有
用である。この利用は、Ｌ−グルタメート受容体機能に
影響を与える化合物の同定および設計に特に重要であ
る。
の機能性断片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガン
ドを同定して性質決定するために設計されたさまざまな
検出法で有用である。例えば、ｃＤＮＡは、グルタメー
トセレプター遺伝子群の更なるメンバーを同定するため
のプローブとして有用である。この発明のＤＮＡから転
写されたｍＲＮＡは、機能性受容体およびリガンドを同
定して特徴を決定するために設計された検定法で特に有
用である。この利用は、Ｌ−グルタメート受容体機能に
影響を与える化合物の同定および設計に特に重要であ
る。
【０１１８】機能性受容体を同定して特徴を決定する検
出法では、ｍＲＮＡがこの発明のＤＮＡ（完全な長さの
ＤＮＡ、または欠失、置換、合成などによって生じたそ
の断片）から転写され、続いて翻訳されてＧｌｕＲタン
パク質を産生する。好ましい態様では、ｍＲＮＡは卵母
細胞、好ましくはアフリカツメガエルの卵母細胞中で翻
訳される。次いで、発現されたグルタメート受容体タン
パク質を、グルタメート受容体に機能的に結合してこれ
を活性化することが知られているリガンドにさらす。グ
ルタメート受容体タンパク質の電気生理学的特徴を測定
し、機能性のイオンチャンネルを形成するものは機能性
グルタメート受容体であると結論される。
出法では、ｍＲＮＡがこの発明のＤＮＡ（完全な長さの
ＤＮＡ、または欠失、置換、合成などによって生じたそ
の断片）から転写され、続いて翻訳されてＧｌｕＲタン
パク質を産生する。好ましい態様では、ｍＲＮＡは卵母
細胞、好ましくはアフリカツメガエルの卵母細胞中で翻
訳される。次いで、発現されたグルタメート受容体タン
パク質を、グルタメート受容体に機能的に結合してこれ
を活性化することが知られているリガンドにさらす。グ
ルタメート受容体タンパク質の電気生理学的特徴を測定
し、機能性のイオンチャンネルを形成するものは機能性
グルタメート受容体であると結論される。
【０１１９】グルタメート受容体の機能性リガンドを同
定するために設計された関連検出法では、グルタメート
受容体活性化化合物に機能的に結合することが知られて
いるタンパク質を、化合物がイオンチャンネルを形成す
る誘導能の測定が求められている少なくとも１つの「未
知」すなわち被験化合物と接触させる。被験化合物にさ
らした後、グルタメート受容体の電気生理学的性質を測
定し、イオンチャンネル応答をもたらし得るものは、グ
ルタメート受容体の機能性リガンドであると結論づけら
れる。
定するために設計された関連検出法では、グルタメート
受容体活性化化合物に機能的に結合することが知られて
いるタンパク質を、化合物がイオンチャンネルを形成す
る誘導能の測定が求められている少なくとも１つの「未
知」すなわち被験化合物と接触させる。被験化合物にさ
らした後、グルタメート受容体の電気生理学的性質を測
定し、イオンチャンネル応答をもたらし得るものは、グ
ルタメート受容体の機能性リガンドであると結論づけら
れる。
【０１２０】図面 図１〜６。クローンｐＧｌｕＲ１のヌクレオチド配列及
び演繹アミノ酸配列。ヌクレオチドは５’−から３’−
方向に番号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の
仮定的アミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチド
から始まる。仮定的シグナルペプチド（von Heijne, Nu
cl. Acids Res. 14, 4683 (1986)）の開裂は部位１で起
きると予想される。予想される５’−末端塩基よりも上
流のヌクレオチドには負の番号が付されている。−１〜
−５４のヌクレオチドは仮定的シグナルペプチド（von
Heijne、上掲) をコードし、−５５〜−２５１塩基は
５’非翻訳領域を表わす。クローンの３’−末端に、非
翻訳配列の７１ヌクレオチドが見出された。ＧｌｕＲ１
についての演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に
示されており、その番号付けは成熟タンパク質の第１残
基から始まる。可能性のある細胞外Ｎ−グリコシル化部
位は、アミノ酸残基の上に米印をつけて示した。２つの
矢印により示される領域（アミノ酸８９〜１０３）は、
他の研究者によって推定されたリガンド−ゲーテッドイ
オンチャンネルの特徴（Greningloh etal., Nature 33
0, 25 (1987); Barnard et al., TINS 10, 502 (1987))
とある程度類似している。
び演繹アミノ酸配列。ヌクレオチドは５’−から３’−
方向に番号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の
仮定的アミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチド
から始まる。仮定的シグナルペプチド（von Heijne, Nu
cl. Acids Res. 14, 4683 (1986)）の開裂は部位１で起
きると予想される。予想される５’−末端塩基よりも上
流のヌクレオチドには負の番号が付されている。−１〜
−５４のヌクレオチドは仮定的シグナルペプチド（von
Heijne、上掲) をコードし、−５５〜−２５１塩基は
５’非翻訳領域を表わす。クローンの３’−末端に、非
翻訳配列の７１ヌクレオチドが見出された。ＧｌｕＲ１
についての演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に
示されており、その番号付けは成熟タンパク質の第１残
基から始まる。可能性のある細胞外Ｎ−グリコシル化部
位は、アミノ酸残基の上に米印をつけて示した。２つの
矢印により示される領域（アミノ酸８９〜１０３）は、
他の研究者によって推定されたリガンド−ゲーテッドイ
オンチャンネルの特徴（Greningloh etal., Nature 33
0, 25 (1987); Barnard et al., TINS 10, 502 (1987))
とある程度類似している。
【０１２１】図１〜６の方法。バクテリオファージクロ
ーンλZAPII-GluR-K1 の挿入ｃＤＮＡをEco RI/Xho Iで
切り出し、平滑末端化し、ベクターＭ１３ｍｐ１９（Me
ssing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642
(1977)) のSma I 部位にサブクローニングして、両方向
のｃＤＮＡを有するクローンを作製した。ＵＳＢからの
サイクロン（登録商標）を用いて、重複する欠失したサ
ブクローンを、それぞれのストランド方向について構築
した。全ての４５のサブクローンについて、ジデオキシ
ヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977) ）
により１本鎖配列決定を行い、さらに、１０個のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブクローン
から誘導された配列に圧縮（compression)又はギャップ
がある領域の配列決定を容易にした。このようにして両
ストランドについて完全な配列が得られた。Intelli-Ge
neticsソフトウェアパッケージ（IntelliGenetics バー
ジョン５．０及びPC/Gene（登録商標）を用いて配列を
分析した。
ーンλZAPII-GluR-K1 の挿入ｃＤＮＡをEco RI/Xho Iで
切り出し、平滑末端化し、ベクターＭ１３ｍｐ１９（Me
ssing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642
(1977)) のSma I 部位にサブクローニングして、両方向
のｃＤＮＡを有するクローンを作製した。ＵＳＢからの
サイクロン（登録商標）を用いて、重複する欠失したサ
ブクローンを、それぞれのストランド方向について構築
した。全ての４５のサブクローンについて、ジデオキシ
ヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977) ）
により１本鎖配列決定を行い、さらに、１０個のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブクローン
から誘導された配列に圧縮（compression)又はギャップ
がある領域の配列決定を容易にした。このようにして両
ストランドについて完全な配列が得られた。Intelli-Ge
neticsソフトウェアパッケージ（IntelliGenetics バー
ジョン５．０及びPC/Gene（登録商標）を用いて配列を
分析した。
【０１２２】図７。アミノ酸残基８９と１０６の間に位
置する細胞外領域と、他の全てのリガンド−ゲーテッド
イオンチャンネル中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ル
ープ」との比較を、配列相同性と共に示す。ｎＡＣｈＲ
サブユニットα１、β１、γ及びδの配列は、マウス筋
肉からのものであり（Heinemann, et al., in: Molecul
ar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. H
einemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, N
ew York, 1987)) 、ｎＡＣｈＲサブユニットα２、α
３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳からのもので
ある（Deneris etal., J. Biol. Chem. 264, 6268 (198
9); Duvoisin et al., Neuron 3, 487 (1989)。ＧＡＢ
ＡＡ サブユニットα及びβはウシ脳からのものである
（Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (198
7))。ＧｌｙＲ ４８ｋは、ラット脳からのグリシン受
容体のＭｒ ＝４８ｋＤａのサブユニットである（Grenn
ingloh et al., Nature 328, 215-220 (1987)) 。箱で
囲んだアミノ酸残基はＧｌｕＲ１及び他の受容体配列の
少なくとも１つにおいて同一の場所に見出されたもので
ある。１つのギャップが任意に導入されている。
置する細胞外領域と、他の全てのリガンド−ゲーテッド
イオンチャンネル中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ル
ープ」との比較を、配列相同性と共に示す。ｎＡＣｈＲ
サブユニットα１、β１、γ及びδの配列は、マウス筋
肉からのものであり（Heinemann, et al., in: Molecul
ar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. H
einemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, N
ew York, 1987)) 、ｎＡＣｈＲサブユニットα２、α
３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳からのもので
ある（Deneris etal., J. Biol. Chem. 264, 6268 (198
9); Duvoisin et al., Neuron 3, 487 (1989)。ＧＡＢ
ＡＡ サブユニットα及びβはウシ脳からのものである
（Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (198
7))。ＧｌｙＲ ４８ｋは、ラット脳からのグリシン受
容体のＭｒ ＝４８ｋＤａのサブユニットである（Grenn
ingloh et al., Nature 328, 215-220 (1987)) 。箱で
囲んだアミノ酸残基はＧｌｕＲ１及び他の受容体配列の
少なくとも１つにおいて同一の場所に見出されたもので
ある。１つのギャップが任意に導入されている。
【０１２３】図８。ＧｌｕＲ１の仮定的ＴＭＤII領域と
他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネル（Barnard
et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris e
t al., J. Biol. chem. 264, 6268(1989); Duvoisin et
al., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh et al., Na
ture 328, 215 (1987); Heinemann et al., in: Molecu
lar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed.
Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press,
New York, 1987))1987) のＴＭＤII領域との比較を示
し、タンパク質配列の保存性（不変性）を示す。
他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネル（Barnard
et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris e
t al., J. Biol. chem. 264, 6268(1989); Duvoisin et
al., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh et al., Na
ture 328, 215 (1987); Heinemann et al., in: Molecu
lar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed.
Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press,
New York, 1987))1987) のＴＭＤII領域との比較を示
し、タンパク質配列の保存性（不変性）を示す。
【０１２４】図９〜１４。ラットグルタメート受容体サ
ブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡ
クローン１ＲＢ１４のヌクレオチド配列及び演繹アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方向に
番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮定的
アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレオチ
ドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌクレ
オチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定的シ
グナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が含ま
れる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ（すな
わち、Asn-235、Asn-349、 Asn-385、 Asn-392及びAsn-835
）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２タンパ
ク質の分子量の計算値は９６，４００ダルトンである。
米印は翻訳終止コドンを示す。
ブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡ
クローン１ＲＢ１４のヌクレオチド配列及び演繹アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方向に
番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮定的
アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレオチ
ドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌクレ
オチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定的シ
グナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が含ま
れる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ（すな
わち、Asn-235、Asn-349、 Asn-385、 Asn-392及びAsn-835
）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２タンパ
ク質の分子量の計算値は９６，４００ダルトンである。
米印は翻訳終止コドンを示す。
【０１２５】図１５〜２０。ラットグルタメート受容体
サブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ３のｃＤＮ
Ａクローン１ＲＢ３１２のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方
向に番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮
定的アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレ
オチドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌ
クレオチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定
的シグナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が
含まれる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ
（すなわち、Asn-35、 Asn-238、 Asn-352、 Asn-387 及び
Asn-394 ）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２
タンパク質の分子量の計算値は９８，０００ダルトンで
ある。米印は翻訳終止コドンを示す。
サブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ３のｃＤＮ
Ａクローン１ＲＢ３１２のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方
向に番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮
定的アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレ
オチドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌ
クレオチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定
的シグナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が
含まれる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ
（すなわち、Asn-35、 Asn-238、 Asn-352、 Asn-387 及び
Asn-394 ）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２
タンパク質の分子量の計算値は９８，０００ダルトンで
ある。米印は翻訳終止コドンを示す。
【０１２６】図２１〜２４。ラットグルタメート受容体
サブユニットの演繹アミノ酸配列を並べたものを示す。
全ての比較した配列において同一の残基は箱で囲んで示
した。この場合、相同性を最大にするために、スペース
を導入してある。予想されるシグナルペプチド及び４つ
の提唱される経膜領域（ＭＳＲI-IV) を示してある。２
つの矢印の頭（▼）で規定されるＧｌｕＲ１中の領域
は、他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルサブユ
ニット中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ」ループ（Barn
ard, et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)) に対
応することが提唱される領域である。破線で示した部分
は、ＧｌｕＲ５−１中に見出されるがＧｌｕＲ５−２中
に見出されない１５アミノ酸残基の挿入を示す。
サブユニットの演繹アミノ酸配列を並べたものを示す。
全ての比較した配列において同一の残基は箱で囲んで示
した。この場合、相同性を最大にするために、スペース
を導入してある。予想されるシグナルペプチド及び４つ
の提唱される経膜領域（ＭＳＲI-IV) を示してある。２
つの矢印の頭（▼）で規定されるＧｌｕＲ１中の領域
は、他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルサブユ
ニット中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ」ループ（Barn
ard, et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)) に対
応することが提唱される領域である。破線で示した部分
は、ＧｌｕＲ５−１中に見出されるがＧｌｕＲ５−２中
に見出されない１５アミノ酸残基の挿入を示す。
【０１２７】図２５、２６。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２又
はＧｌｕＲ３を別々に注射したアフリカツメガエルの卵
母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注射し
たアフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答
の比較を示す。（Ａ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）、ＧｌｕＲ
２（１０ｎｇ）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（２ｎｇ）を注入
した後３日後に測定した、１００ｍＭ ＫＡに対する卵
母細胞の応答を示す。挿入した図はこのような卵母細胞
から得られた電圧記録の軌跡の例を示す。なお、Ｇｌｕ
Ｒ２応答は、２５ｎｇのＲＮＡを注射５日後に得られた
ものである。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）若しくはＧｌ
ｕＲ３（２ｎｇ）ＲＮＡ又は成熟ラット脳海馬ポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ（約５０ｎｇ）を注射３日後に測定さ
れた、記載したアゴニストに対する卵母細胞の応答を示
す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて得られた応答
に正規化され、ｎ≧３の全ての測定について平均±S.E.
M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧が−７０ｍＶ
にクランプされ、記録はHolmanet al., Nature 342, 64
3 (1989) に記載された通りに行った。
はＧｌｕＲ３を別々に注射したアフリカツメガエルの卵
母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注射し
たアフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答
の比較を示す。（Ａ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）、ＧｌｕＲ
２（１０ｎｇ）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（２ｎｇ）を注入
した後３日後に測定した、１００ｍＭ ＫＡに対する卵
母細胞の応答を示す。挿入した図はこのような卵母細胞
から得られた電圧記録の軌跡の例を示す。なお、Ｇｌｕ
Ｒ２応答は、２５ｎｇのＲＮＡを注射５日後に得られた
ものである。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）若しくはＧｌ
ｕＲ３（２ｎｇ）ＲＮＡ又は成熟ラット脳海馬ポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ（約５０ｎｇ）を注射３日後に測定さ
れた、記載したアゴニストに対する卵母細胞の応答を示
す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて得られた応答
に正規化され、ｎ≧３の全ての測定について平均±S.E.
M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧が−７０ｍＶ
にクランプされ、記録はHolmanet al., Nature 342, 64
3 (1989) に記載された通りに行った。
【０１２８】図２７、２８。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及
びＧｌｕＲ３ＲＮＡの組合せを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞中で測定された電流応答の比較を示す。
（Ａ）記載したＧｌｕＲサブユニットのそれぞれについ
て、２ｎｇのＲＮＡを注射３日後に測定された、１００
ｍＭ ＫＡに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカ
ラムは、ＧｌｕＲサブユニットＲＮＡを別々に発現させ
た卵母細胞中で測定された応答の合計を示し、斜線を施
したカラムは個々の卵母細胞中でＧｌｕＲサブユニット
ＲＮＡを一緒に発現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記
載したそれぞれのＧｌｕＲサブユニットのＲＮＡ２ｎｇ
又は５０ｎｇのラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを注射
３日後に測定した、記載したアゴニストに対する卵母細
胞の応答を示す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて
得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての測定につい
て平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧
が−７０ｍＶにクランプされ、記録はHolman et al., N
ature 341, 643 (1989) に記載された通りに行った。
びＧｌｕＲ３ＲＮＡの組合せを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞中で測定された電流応答の比較を示す。
（Ａ）記載したＧｌｕＲサブユニットのそれぞれについ
て、２ｎｇのＲＮＡを注射３日後に測定された、１００
ｍＭ ＫＡに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカ
ラムは、ＧｌｕＲサブユニットＲＮＡを別々に発現させ
た卵母細胞中で測定された応答の合計を示し、斜線を施
したカラムは個々の卵母細胞中でＧｌｕＲサブユニット
ＲＮＡを一緒に発現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記
載したそれぞれのＧｌｕＲサブユニットのＲＮＡ２ｎｇ
又は５０ｎｇのラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを注射
３日後に測定した、記載したアゴニストに対する卵母細
胞の応答を示す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて
得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての測定につい
て平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧
が−７０ｍＶにクランプされ、記録はHolman et al., N
ature 341, 643 (1989) に記載された通りに行った。
【０１２９】図２９〜３１。１００ｍＭ ＫＡに対する
電流応答の膜電位依存性を示す。（Ａ）ラット脳海馬ポ
リ（Ａ）＋ ＲＮＡ（５０ｎｇ、黒塗り四角■）、Ｇｌ
ｕＲ１（白ぬき四角□）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき
丸○）；（Ｂ）ＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ２ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又はＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき四
角□）；（Ｃ）ＧｌｕＲ２＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又は全ての３種のＧｌｕＲサブユニットＲＮＡ
（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのＧｌｕＲサブユ
ニットのＲＮＡ２ｎｇを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−１５０ｍＶから＋５０ｍＶの間で１０
ｍＶ刻みに変化させ、全ての値は−７０ｍＶで測定され
た応答に正規化して示してある。
電流応答の膜電位依存性を示す。（Ａ）ラット脳海馬ポ
リ（Ａ）＋ ＲＮＡ（５０ｎｇ、黒塗り四角■）、Ｇｌ
ｕＲ１（白ぬき四角□）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき
丸○）；（Ｂ）ＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ２ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又はＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき四
角□）；（Ｃ）ＧｌｕＲ２＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又は全ての３種のＧｌｕＲサブユニットＲＮＡ
（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのＧｌｕＲサブユ
ニットのＲＮＡ２ｎｇを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−１５０ｍＶから＋５０ｍＶの間で１０
ｍＶ刻みに変化させ、全ての値は−７０ｍＶで測定され
た応答に正規化して示してある。
【０１３０】図３６〜４３。ラットグルタメート受容体
サブユニットＧｌｕＲ５−１をコードする単一のｃＤＮ
Ａクローン（λＲＢ２０）のヌクレオチド配列及びアミ
ノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列
の上に示されている。仮定的シグナルペプチドの開裂が
アミノ酸１の位置で起きると予想される（von Heijne,
Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)) 。この開裂部位は
プロリン残基の後であり、これは一般的なことではな
い。シグナルペプチドをコードするアミノ酸には負の番
号が付されている。ヌクレオチドは５’から３’方向に
番号が付されており、この番号は成熟タンパク質の仮定
的アミノ末端残基のコドンの最初の残基から始まってい
る。アミノ酸残基１よりも５’側のヌクレオチドは負の
番号で示されている。オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）に隣接する停止コドンは「ＥＮＤ」で示さ
れ、ポリアデニル化シグナルには下線が付されている。
可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米印（＊）に
よって示されている。２つの矢印の頭（▼）は、λＲＢ
２０中には見出されるが、単離した２９のｃＤＮＡクロ
ーン中１２のものにはみられない、ヌクレオチド１１１
３と１１５９の間の４５のヌクレオチド挿入を規定す
る。
サブユニットＧｌｕＲ５−１をコードする単一のｃＤＮ
Ａクローン（λＲＢ２０）のヌクレオチド配列及びアミ
ノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列
の上に示されている。仮定的シグナルペプチドの開裂が
アミノ酸１の位置で起きると予想される（von Heijne,
Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)) 。この開裂部位は
プロリン残基の後であり、これは一般的なことではな
い。シグナルペプチドをコードするアミノ酸には負の番
号が付されている。ヌクレオチドは５’から３’方向に
番号が付されており、この番号は成熟タンパク質の仮定
的アミノ末端残基のコドンの最初の残基から始まってい
る。アミノ酸残基１よりも５’側のヌクレオチドは負の
番号で示されている。オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）に隣接する停止コドンは「ＥＮＤ」で示さ
れ、ポリアデニル化シグナルには下線が付されている。
可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米印（＊）に
よって示されている。２つの矢印の頭（▼）は、λＲＢ
２０中には見出されるが、単離した２９のｃＤＮＡクロ
ーン中１２のものにはみられない、ヌクレオチド１１１
３と１１５９の間の４５のヌクレオチド挿入を規定す
る。
【０１３１】
【表２】表２ 表２ ＧｌｕＲ１によりコードされるグルタメート受容体の薬理学：ＧｌｕＲ １インビトロＲＮＡを注射された卵母細胞中で測定された、種々のグルタメート 受容体アンタゴニストの性質 被検化合物 化合物単独 化合物＋カイネート （％）ａ （％）ｂ カイネート（アゴニスト対照） 100.0 100.0 キヌレン酸 3.4 ±0.2 9.6 ±1.3 γ−ＤＧＧ -0.1 ±0.5 30.8 ±1.1 ＧＡＭＳ 1.0 ±0.6 30.7 ±1.1 ＧＤＥＥ 24.8 ±5.7 97.8 ±6.6 ＰＤＡ 2.5 ±0.7 31.3 ±2.0 ＡＰＶ 3.1 ±1.4 73.7 ±3.2 ＣＰＰ 9.1 ±0.7 78.8 ±0.9 ａ：薬剤投与の直前に３０μＭのカイネートにより誘起された応答の％。 ｂ：薬剤／カイネート混合物の投与の直前に３０μＭのカイネートにより誘起さ れた応答の％。
【０１３２】卵母細胞は、ＧｌｕＲ１のインビトロセン
スＲＮＡ1.25 ng を記録の３日前に注射されていた。卵
母細胞は、−７０ｍＶに電圧が保持され、被検化合物
（カイネート（３０μＭ）を除く全ての化合物は１ｍ
Ｍ）は迅速なスーパーフュージョンにより５分間隔で投
与された。ピーク電流を測定し、それぞれの数字は３つ
の異なる卵母細胞からの３つの記録の平均±ＳＥＭで示
した。１００％の電流応答は、卵母細胞に依存して４０
〜２００ｎＡに対応する。 表３ グルタメート受容体サブユニット遺伝子群のメンバーの各対の間のアミ ノ酸配列同一性のパーセント ＧｌｕＲ１ ＧｌｕＲ２ ＧｌｕＲ３ ＧｌｕＲ４ ＧｌｕＲ５ ＧｌｕＲ１ １００ ７０ ６９ ６８ ４０ ＧｌｕＲ２ １００ ７３ ７２ ４０ ＧｌｕＲ３ １００ ７３ ４１ ＧｌｕＲ４ １００ ４１ ＧｌｕＲ５ １００ 配列は、ウィスコンシン州立大学ジェネティクスコンピ
ューターグループからの配列分析ソフトウェア（Devere
ux, et al., Nucl. Acids Res. 12, 387(1984)）を用い
て比較した。配列の各対間の配列同一性パーセントは、
同一のアミノ酸が並んだ位置の数を、調べた最も短い配
列中での並んだ位置の総数で除し、得られた商を１００
倍することにより計算した。 上述の記載から、当業者は、本発明がグルタメート受容
体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に純
粋なＤＮＡ領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（ＮＭＤＡ）、ＡＭＰＡ又はキスカレート、カイ
ネート（ＫＡ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレー
ト（ＡＰＢ）を包含するグルタメート受容体に特徴的な
電気生理学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又は
その機能性断片である。本発明の新規なグルタメート受
容体は、ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及びＧｌｕＲ５並びにＧｌｕＲ６
及びＧｌｕＲ７並びにこれらの機能性組合せによってコ
ードされるタンパク質並びにこれらによってコードされ
る機能性ペプチド断片により例示される。本発明のグル
タメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、薬剤
スクリーニングに有用である。さらに、ＧｌｕＲ１〜Ｇ
ｌｕＲ７のｃＤＮＡは、当業者によって、過度の実験を
要することなく、他の新規なグルタメート受容体を同定
し単離するためにプローブとして用いることができる。
このような他の新規なグルタメート受容体は、本発明の
範囲内に明示的に包含される。本発明の精神及び範囲か
ら逸脱することなく、当業者は本発明に種々の変更及び
修飾を加えて種々の用途及び条件に適合させることがで
きる。従って、このような変更及び修飾は、適切に、誠
実に、特許請求範囲の均等範囲に属するものであること
を意図する。
スＲＮＡ1.25 ng を記録の３日前に注射されていた。卵
母細胞は、−７０ｍＶに電圧が保持され、被検化合物
（カイネート（３０μＭ）を除く全ての化合物は１ｍ
Ｍ）は迅速なスーパーフュージョンにより５分間隔で投
与された。ピーク電流を測定し、それぞれの数字は３つ
の異なる卵母細胞からの３つの記録の平均±ＳＥＭで示
した。１００％の電流応答は、卵母細胞に依存して４０
〜２００ｎＡに対応する。 表３ グルタメート受容体サブユニット遺伝子群のメンバーの各対の間のアミ ノ酸配列同一性のパーセント ＧｌｕＲ１ ＧｌｕＲ２ ＧｌｕＲ３ ＧｌｕＲ４ ＧｌｕＲ５ ＧｌｕＲ１ １００ ７０ ６９ ６８ ４０ ＧｌｕＲ２ １００ ７３ ７２ ４０ ＧｌｕＲ３ １００ ７３ ４１ ＧｌｕＲ４ １００ ４１ ＧｌｕＲ５ １００ 配列は、ウィスコンシン州立大学ジェネティクスコンピ
ューターグループからの配列分析ソフトウェア（Devere
ux, et al., Nucl. Acids Res. 12, 387(1984)）を用い
て比較した。配列の各対間の配列同一性パーセントは、
同一のアミノ酸が並んだ位置の数を、調べた最も短い配
列中での並んだ位置の総数で除し、得られた商を１００
倍することにより計算した。 上述の記載から、当業者は、本発明がグルタメート受容
体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に純
粋なＤＮＡ領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（ＮＭＤＡ）、ＡＭＰＡ又はキスカレート、カイ
ネート（ＫＡ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレー
ト（ＡＰＢ）を包含するグルタメート受容体に特徴的な
電気生理学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又は
その機能性断片である。本発明の新規なグルタメート受
容体は、ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及びＧｌｕＲ５並びにＧｌｕＲ６
及びＧｌｕＲ７並びにこれらの機能性組合せによってコ
ードされるタンパク質並びにこれらによってコードされ
る機能性ペプチド断片により例示される。本発明のグル
タメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、薬剤
スクリーニングに有用である。さらに、ＧｌｕＲ１〜Ｇ
ｌｕＲ７のｃＤＮＡは、当業者によって、過度の実験を
要することなく、他の新規なグルタメート受容体を同定
し単離するためにプローブとして用いることができる。
このような他の新規なグルタメート受容体は、本発明の
範囲内に明示的に包含される。本発明の精神及び範囲か
ら逸脱することなく、当業者は本発明に種々の変更及び
修飾を加えて種々の用途及び条件に適合させることがで
きる。従って、このような変更及び修飾は、適切に、誠
実に、特許請求範囲の均等範囲に属するものであること
を意図する。
【図１】クローンＧｌｕＲ１のヌクレオチド配列及びそ
れから演繹されるアミノ酸配列を示す。
れから演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図２】図１の続きを示す。
【図３】図２の続きを示す。
【図４】図３の続きを示す。
【図５】図４の続きを示す。
【図６】図５の続きを示す。
【図７】配列相同性検定の結果を示す図であって、Ｇｌ
ｕＲ１のアミノ酸残基８９と１０６との間の細胞外領域
と他の全てのリガンド−ゲ−ト化(ligand-gated)イオン
チャネルに見出される「Cys-Cys-ループ」とを比較した
ものであり、配列の相同性を示す。
ｕＲ１のアミノ酸残基８９と１０６との間の細胞外領域
と他の全てのリガンド−ゲ−ト化(ligand-gated)イオン
チャネルに見出される「Cys-Cys-ループ」とを比較した
ものであり、配列の相同性を示す。
【図８】配列相同性検定の結果を示す図であって、Ｇｌ
ｕＲ１の推定的ＴＭＤII領域と他のリガンド−ゲート化
イオンチャネルの推定的ＴＭＤIIとを比較したもので、
タンパク質配列の保存を示唆する。
ｕＲ１の推定的ＴＭＤII領域と他のリガンド−ゲート化
イオンチャネルの推定的ＴＭＤIIとを比較したもので、
タンパク質配列の保存を示唆する。
【図９】クローンＧｌｕＲ２のヌクレオチド配列及びそ
れから演繹されるアミノ酸配列を示す。
れから演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図１０】図９の続きを示す。
【図１１】図１０の続きを示す。
【図１２】図１１の続きを示す。
【図１３】図１２の続きを示す。
【図１４】図１３の続きを示す。
【図１５】クローンＧｌｕＲ３のヌクレオチド配列及び
それから演繹されるアミノ酸配列を示す。
それから演繹されるアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１５の続きを示す。
【図１７】図１６の続きを示す。
【図１８】図１７の続きを示す。
【図１９】図１８の続きを示す。
【図２０】図１９の続きを示す。
【図２１】グルタメートレセプター遺伝子ファミリーの
ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及び
ＧｌｕＲ５（ＧｌｕＲ５−１）サブユニットの演繹アミ
ノ酸配列を並べて示す図である。
ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及び
ＧｌｕＲ５（ＧｌｕＲ５−１）サブユニットの演繹アミ
ノ酸配列を並べて示す図である。
【図２２】図２１の続きを示す。
【図２３】図２２の続きを示す。
【図２４】図２３の続きを示す。
【図２５】個々のＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ
３サブユニットＲＮＡを注射したアフリカツメガエルの
卵母細胞の電流応答を比較したグラフである。
３サブユニットＲＮＡを注射したアフリカツメガエルの
卵母細胞の電流応答を比較したグラフである。
【図２６】ラット脳海馬を注射したアフリカツメガエル
の卵母細胞の電流応答を比較したグラフである。
の卵母細胞の電流応答を比較したグラフである。
【図２７】ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３ＲＮ
Ａの組合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で
測定された電流応答を示すグラフである。
Ａの組合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で
測定された電流応答を示すグラフである。
【図２８】ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ３ＲＮ
Ａの組合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で
測定された電流応答を示す、図２７と比較されるグラフ
である
Ａの組合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で
測定された電流応答を示す、図２７と比較されるグラフ
である
【図２９】１００ｍＭ ＫＡに対する電流応答の膜電位
依存性を示すグラフである。
依存性を示すグラフである。
【図３０】１００ｍＭ ＫＡに対する電流応答の膜電位
依存性を示す、図２９及び図３１と比較されるグラフで
ある。
依存性を示す、図２９及び図３１と比較されるグラフで
ある。
【図３１】１００ｍＭ ＫＡに対する電流応答の膜電位
依存性を示す、図２９及び図３０と比較されるグラフで
ある。
依存性を示す、図２９及び図３０と比較されるグラフで
ある。
【図３２】クローンＧｌｕＲ４のヌクレオチド配列及び
演繹アミノ酸配列を示す図である。
演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図３３】図３２の続きを示す図である。
【図３４】図３３の続きを示す図である。
【図３５】図３４の続きを示す図である。
【図３６】グルタメート受容体サブユニットＧｌｕＲ５
−１をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列
及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
−１をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列
及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図３７】図３６の続きを示す図である。
【図３８】図３７の続きを示す図である。
【図３９】図３８の続きを示す図である。
【図４０】図３９の続きを示す図である。
【図４１】図４０の続きを示す図である。
【図４２】図４１の続きを示す図である。
【図４３】図４２の続きを示す図である。
【図４４】クローンＧｌｕＲ６のヌクレオチド配列及び
演繹アミノ酸配列を示す図である。
演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図４５】図４４の続きを示す図である。
【図４６】図４５の続きを示す図である。
【図４７】図４６の続きを示す図である。
【図４８】図４７の続きを示す図である。
【図４９】図４８の続きを示す図である。
【図５０】図４９の続きを示す図である。
【図５１】クローンＧｌｕＲ７からの３５−Ｔ３断片の
ヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図であ
る。
ヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図であ
る。
【図５２】クローンＧｌｕＲ７からのＵ３５断片のヌク
レオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
レオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年２月１４日（２０００．２．１
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、一群の新規なＤ
ＮＡ配列、およびグルタメート神経伝達物質系を含むコ
ードされた受容体タンパク質に関する。さらに、この発
明は、グルタメート受容体を作製する方法、ならびにグ
ルタメートのアゴニストおよびアンタゴニストを同定し
て性質決定するために設計された検定法にてこの受容体
タンパク質を使用する方法に関する。
ＮＡ配列、およびグルタメート神経伝達物質系を含むコ
ードされた受容体タンパク質に関する。さらに、この発
明は、グルタメート受容体を作製する方法、ならびにグ
ルタメートのアゴニストおよびアンタゴニストを同定し
て性質決定するために設計された検定法にてこの受容体
タンパク質を使用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸のＬ−グルタメートは、哺乳動
物の中枢神経系における主要な刺激効果をもつ神経伝達
物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的解
析によれば以下のようなことが示唆される。グルタメー
ト作動系が、速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放
出の調節、長期の増強作用、学習および記憶、シナプス
発生の柔軟性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、
ならびに数種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわ
たる神経作用に関与している。一般には、文献［Monagh
an et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29. 365-4
02 (1989)］参照。この広範な機能、特に、学習、神経
毒性および神経病理に関する機能は、グルタメートがそ
の効果を発揮する機構を記載して定義しようとする最近
の試行を刺激してきた。
物の中枢神経系における主要な刺激効果をもつ神経伝達
物質である。解剖学的、生化学的および電気生理学的解
析によれば以下のようなことが示唆される。グルタメー
ト作動系が、速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放
出の調節、長期の増強作用、学習および記憶、シナプス
発生の柔軟性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、
ならびに数種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわ
たる神経作用に関与している。一般には、文献［Monagh
an et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29. 365-4
02 (1989)］参照。この広範な機能、特に、学習、神経
毒性および神経病理に関する機能は、グルタメートがそ
の効果を発揮する機構を記載して定義しようとする最近
の試行を刺激してきた。
【０００３】現在、グルタメート受容体の分類法は、以
下の５つの受容体サブタイプまたはクラスを規定するに
役立つ薬理学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、カイニン酸
（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−
イソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ：かつて
は、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ＡＰ４またはＡ
ＰＢ）、および１−アミノ−シクロペンチル−１，３−
ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって活性化されるクラス
である。グルタメートの作用は主に、カチオン選択性イ
オノトロピー受容体との相互作用によって媒介される
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103-164 (198
4); Strange,Biochem. J. 249, 309-318 (1988)］。例
外は、メタボトロピー受容体の性質を有するＡＣＰＤ受
容体サブタイプである。このクラスのグルタメート受容
体は、ＧＴＰ−結合タンパク質、ならびに第２メッセン
ジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール１，
４，５−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen, et al., Proc. R. Soc. Londo
n Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek, et al., Natur
e 317, 717(1985); Nicoletti et al., J. Neurosci.
6, 1905 (1986); Suguyama. et al., Nature 325, 531
(1987) ］。
下の５つの受容体サブタイプまたはクラスを規定するに
役立つ薬理学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、カイニン酸
（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−
イソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ：かつて
は、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ＡＰ４またはＡ
ＰＢ）、および１−アミノ−シクロペンチル−１，３−
ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって活性化されるクラス
である。グルタメートの作用は主に、カチオン選択性イ
オノトロピー受容体との相互作用によって媒介される
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103-164 (198
4); Strange,Biochem. J. 249, 309-318 (1988)］。例
外は、メタボトロピー受容体の性質を有するＡＣＰＤ受
容体サブタイプである。このクラスのグルタメート受容
体は、ＧＴＰ−結合タンパク質、ならびに第２メッセン
ジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール１，
４，５−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen, et al., Proc. R. Soc. Londo
n Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek, et al., Natur
e 317, 717(1985); Nicoletti et al., J. Neurosci.
6, 1905 (1986); Suguyama. et al., Nature 325, 531
(1987) ］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】グルタメート受容体の
電気生理学的および薬理学的性質は、広範に研究されて
おり、今ではよく確立されている。例えば、文献［Fost
er and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman
et al., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer an
d Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watk
ins and Olvermann, Trends Neurosci. 10, 265 (198
7); およびBlair et al., Science 242, 577(1988) ］
参照。 これは、分子レベルでのそれらの生化学的特徴お
よび構造とは対照的であり、これらは、この発明が開示
されるまでほとんど不明であった。
電気生理学的および薬理学的性質は、広範に研究されて
おり、今ではよく確立されている。例えば、文献［Fost
er and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman
et al., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer an
d Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watk
ins and Olvermann, Trends Neurosci. 10, 265 (198
7); およびBlair et al., Science 242, 577(1988) ］
参照。 これは、分子レベルでのそれらの生化学的特徴お
よび構造とは対照的であり、これらは、この発明が開示
されるまでほとんど不明であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】定義 本明細書および特許請求の範囲では、ここでの使用で明
確に定義される語句および用語は以下の通りである。
確に定義される語句および用語は以下の通りである。
【０００６】ここで使用される場合、グルタメート受容
体とは、Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活
性化される神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これ
ら受容体タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて
分類される。現在では、５つのクラスの受容体が存在す
る。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭ
ＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（ＡＭＰＡ：かつては、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ
受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホスホノ酪
酸（ＡＰ４またはＡＰＢ）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって
活性化される受容体クラスである。
体とは、Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活
性化される神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これ
ら受容体タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて
分類される。現在では、５つのクラスの受容体が存在す
る。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭ
ＤＡ）、カイニン酸（ＫＡ）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（ＡＭＰＡ：かつては、キスカル酸、すなわちＱＵＩＳ
受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホスホノ酪
酸（ＡＰ４またはＡＰＢ）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−１，３−ジカルボン酸（ＡＣＰＤ）によって
活性化される受容体クラスである。
【０００７】ここで、ＮＭＤＡとは、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパルテートを意味し、これは、ＮＭＤＡグルタメー
ト受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）で
ある。
アスパルテートを意味し、これは、ＮＭＤＡグルタメー
ト受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）で
ある。
【０００８】ここで、ＡＭＰＡとは、α−アミノ−３−
ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピ
オネートを意味し、これは、ＡＭＰＡグルタメート受容
体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。
ＡＭＰＡ受容体はかつては、ＱＵＩＳ（キスカレート）
受容体と呼ばれていた。
ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピ
オネートを意味し、これは、ＡＭＰＡグルタメート受容
体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。
ＡＭＰＡ受容体はかつては、ＱＵＩＳ（キスカレート）
受容体と呼ばれていた。
【０００９】ここで、ＱＵＩＳとは、かつてＱＵＩＳ
（キスカレート）受容体と呼ばれていた、薬理学的に規
定された受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニス
ト）であるキスカル酸又はキスカレートを意味する。以
前ＱＵＩＳ受容体と呼ばれていた受容体は、今はＡＭＰ
Ａ受容体と称される。
（キスカレート）受容体と呼ばれていた、薬理学的に規
定された受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニス
ト）であるキスカル酸又はキスカレートを意味する。以
前ＱＵＩＳ受容体と呼ばれていた受容体は、今はＡＭＰ
Ａ受容体と称される。
【００１０】ＫＡとは、カイニン酸又はカイネートを意
味し、これは、カイネートグルタメート受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）である。
味し、これは、カイネートグルタメート受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）である。
【００１１】ここで、ＡＰＢは、２−アミノ−４−ホス
ホノブチレートを意味し、ＡＰＢグルタメート受容体サ
ブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。ま
た、略号ＡＰ４も２−アミノ−４−ホスホノブチレート
グルタメート受容体サブタイプを指すためにときどき使
用される。
ホノブチレートを意味し、ＡＰＢグルタメート受容体サ
ブタイプに対するリガンド（アゴニスト）である。ま
た、略号ＡＰ４も２−アミノ−４−ホスホノブチレート
グルタメート受容体サブタイプを指すためにときどき使
用される。
【００１２】ここで、ＡＣＰＤとは、１−アミノ−シク
ロペンチル−１，３−ジカルボン酸を意味し、これは、
ＡＣＰＤグルタメート受容体サブタイプに対するリガン
ド（アゴニスト）である。
ロペンチル−１，３−ジカルボン酸を意味し、これは、
ＡＣＰＤグルタメート受容体サブタイプに対するリガン
ド（アゴニスト）である。
【００１３】ここで、この発明のグルタメート受容体タ
ンパク質の修飾句として使用される場合、「グルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を
有する」という語句は、グルタメートまたはグルタメー
ト様リガンドへの応答で受容体タンパク質によって生じ
る神経シグナルが、既知のグルタメート受容体のものに
匹敵することを意味する。以下に示す「機能性」という
語句の定義も参照のこと。
ンパク質の修飾句として使用される場合、「グルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を
有する」という語句は、グルタメートまたはグルタメー
ト様リガンドへの応答で受容体タンパク質によって生じ
る神経シグナルが、既知のグルタメート受容体のものに
匹敵することを意味する。以下に示す「機能性」という
語句の定義も参照のこと。
【００１４】ここで、ホモとは、単一型のサブユニット
からなる受容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型の
サブユニットからなる受容体を意味する。
からなる受容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型の
サブユニットからなる受容体を意味する。
【００１５】ここで、「機能性」という用語をこの発明
のグルタメート受容体タンパク質の修飾句として使用し
た場合、これは、受容体タンパク質へのグルタメート
（又はグルタメート様）リガンドの結合が膜の「イオン
チャンネル」を開かせることを意味する。この結合によ
ってイオンが膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神
経シグナルが生じる。別の言い方をすれば、「機能性」
とは、神経シグナルが受容体タンパク質へのリガンド結
合の結果として生じることを意味する。
のグルタメート受容体タンパク質の修飾句として使用し
た場合、これは、受容体タンパク質へのグルタメート
（又はグルタメート様）リガンドの結合が膜の「イオン
チャンネル」を開かせることを意味する。この結合によ
ってイオンが膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神
経シグナルが生じる。別の言い方をすれば、「機能性」
とは、神経シグナルが受容体タンパク質へのリガンド結
合の結果として生じることを意味する。
【００１６】ここで、ＧＡＢＡとはγ−アミノ酪酸を、
γ−ＤＧＧとはγ−Ｄ−グルタミルグリシンを、ＧＡＭ
Ｓとはγ−Ｄ−グルタミルアミノメチルスルホネート
を、ＰＤＡとは２，３−シス−ピペリジンジカルボン酸
を、ＧＤＥＥとはグルタミン酸ジメチルエステルを、Ｔ
ＭＤとはトランスメンブランドメインを、ＡＰＶとは２
−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、ＣＰＰとは３−（２
−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホ
スフェートを、ｎＡＣｈＲとは神経のニコチン性アセチ
ルコリン受容体を、ＣＮＳとは中枢神経系を意味する。
さらにここで、ＰＮＳとは末梢神経系を意味する。
γ−ＤＧＧとはγ−Ｄ−グルタミルグリシンを、ＧＡＭ
Ｓとはγ−Ｄ−グルタミルアミノメチルスルホネート
を、ＰＤＡとは２，３−シス−ピペリジンジカルボン酸
を、ＧＤＥＥとはグルタミン酸ジメチルエステルを、Ｔ
ＭＤとはトランスメンブランドメインを、ＡＰＶとは２
−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、ＣＰＰとは３−（２
−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホ
スフェートを、ｎＡＣｈＲとは神経のニコチン性アセチ
ルコリン受容体を、ＣＮＳとは中枢神経系を意味する。
さらにここで、ＰＮＳとは末梢神経系を意味する。
【００１７】ここで、アゴニスト結合サブユニットと
は、結合すると受容体を活性化させる薬理学的化合物に
対する結合部位を含む受容体サブユニットのことであ
り、非アゴニスト結合サブユニットとはアゴニストと結
合しない受容体サブユニットのことである。
は、結合すると受容体を活性化させる薬理学的化合物に
対する結合部位を含む受容体サブユニットのことであ
り、非アゴニスト結合サブユニットとはアゴニストと結
合しない受容体サブユニットのことである。
【００１８】「アンタゴニスト」とは、受容体機能を阻
害する物質を指し、競合型および非競合型の２つの型が
ある。競合型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知
られている）は、重複する結合部位に対してアゴニスト
と競合する。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴ
ニスト結合部位以外の受容体上の部位に結合することに
よって、この受容体の機能を不活化する。
害する物質を指し、競合型および非競合型の２つの型が
ある。競合型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知
られている）は、重複する結合部位に対してアゴニスト
と競合する。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴ
ニスト結合部位以外の受容体上の部位に結合することに
よって、この受容体の機能を不活化する。
【００１９】ここで、ＧｌｕＲ１とは、Ｍr ＝約９９，
７６９ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ１は、グルタメート受容体サブユニットをコー
ドする、初めて単離されたｃＤＮＡであって、従来、Ｇ
ｌｕＲ−Ｋ１と呼ばれていた。ＧｌｕＲ−Ｋ１は、グル
タメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単純に
ＧｌｕＲ１と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、Ｇｌ
ｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、Ｇｌｕ
Ｒ６、ＧｌｕＲ７などと命名されている。ＧｌｕＲ１の
ｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８１３４と番
号が付されている。
７６９ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ１は、グルタメート受容体サブユニットをコー
ドする、初めて単離されたｃＤＮＡであって、従来、Ｇ
ｌｕＲ−Ｋ１と呼ばれていた。ＧｌｕＲ−Ｋ１は、グル
タメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単純に
ＧｌｕＲ１と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、Ｇｌ
ｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、Ｇｌｕ
Ｒ６、ＧｌｕＲ７などと命名されている。ＧｌｕＲ１の
ｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８１３４と番
号が付されている。
【００２０】ここで、ＧｌｕＲ２とは、Ｍr ＝約９６，
４００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３２と番号が付されている。
４００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３２と番号が付されている。
【００２１】ここで、ＧｌｕＲ３とは、Ｍr ＝約９８，
０００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ３のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３３と番号が付されている。
０００ダルトンを有する同一名の単一グルタメート受容
体サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを指す。
ＧｌｕＲ３のｃＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６
８１３３と番号が付されている。
【００２２】ここで、ＧｌｕＲ４とは、Ｍr ＝約９８，
５００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ４のｃＤＮＡ
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８３７５と番号が付さ
れている。
５００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ４のｃＤＮＡ
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託されており、ＡＴＣＣNo. ６８３７５と番号が付さ
れている。
【００２３】ここで、ＧｌｕＲ５とは、Ｍr ＝約１０
０，０００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質を
コードするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ５のｃＤ
ＮＡ（ＧｌｕＲ５−１として）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣ
ＣNo. ６８３７４と番号が付されている。［ＧｌｕＲ５
ｃＤＮＡには長さの異なる２種類の変異体が存在してお
り、ＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５−２と呼ばれてい
る。ＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの翻訳によって、９２０個の
アミノ酸からなる単一の長いオープンリーディングフレ
ームの存在が予想される。ＧｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５
−２ＤＮＡとの差異は、このオープンリーディングフレ
ームをくずさないＧｌｕＲ５−１ＤＮＡ中における、４
５個のヌクレオチド（１５個のアミノ酸に対応）の挿入
に由来する。ＧｌｕＲ５−１受容体タンパク質における
この１５個のアミノ酸の挿入は、ここで開示された受容
体タンパク質の中では唯一のものである。したがって、
短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、ＧｌｕＲ１、Ｇｌｕ
Ｒ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７サブユニットの対応物である。］
０，０００ダルトンを有する同一名の単一タンパク質を
コードするｃＤＮＡクローンを指す。ＧｌｕＲ５のｃＤ
ＮＡ（ＧｌｕＲ５−１として）は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託されており、ＡＴＣ
ＣNo. ６８３７４と番号が付されている。［ＧｌｕＲ５
ｃＤＮＡには長さの異なる２種類の変異体が存在してお
り、ＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５−２と呼ばれてい
る。ＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの翻訳によって、９２０個の
アミノ酸からなる単一の長いオープンリーディングフレ
ームの存在が予想される。ＧｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５
−２ＤＮＡとの差異は、このオープンリーディングフレ
ームをくずさないＧｌｕＲ５−１ＤＮＡ中における、４
５個のヌクレオチド（１５個のアミノ酸に対応）の挿入
に由来する。ＧｌｕＲ５−１受容体タンパク質における
この１５個のアミノ酸の挿入は、ここで開示された受容
体タンパク質の中では唯一のものである。したがって、
短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、ＧｌｕＲ１、Ｇｌｕ
Ｒ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７サブユニットの対応物である。］
【００２４】ここで、ＧｌｕＲ６とは、Ｍr ＝約１０
０，０００を有する同一名の単一タンパク質をコードす
るｃＤＮＡクローンをいう。また、ＧｌｕＲ７とは、同
一名の単一タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを
いう。断片３５−Ｔ３およびＵ３５をコードするＧｌｕ
Ｒ７を図５１、５２に示す。
０，０００を有する同一名の単一タンパク質をコードす
るｃＤＮＡクローンをいう。また、ＧｌｕＲ７とは、同
一名の単一タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを
いう。断片３５−Ｔ３およびＵ３５をコードするＧｌｕ
Ｒ７を図５１、５２に示す。
【００２５】ここで、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７は、遺伝子、ｃＤＮＡクローンおよびそれらがコ
ードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれをも
指すために用いる。
Ｒ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌ
ｕＲ７は、遺伝子、ｃＤＮＡクローンおよびそれらがコ
ードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれをも
指すために用いる。
【００２６】本明細書および特許請求の範囲で使用され
る語句「実質的配列相同性」は、ここに開示されて特許
請求の範囲にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的
に異ならない配列変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはア
ミノ酸配列が、この発明の配列と均等であるものとみな
され、従って、この特許請求の範囲の領域内にはいるこ
とを意味する。この点で「わずかでかつ機能的に異なら
ない配列変異」とは、「相同」配列（すなわち、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、またはここで開示されて特許請求の範囲に
あるタンパク質と実質的な相同性をもつ配列）が、この
発明で開示され特許請求の範囲にある配列と機能的に均
等であることを意味する。機能的に均等な配列は、実質
的に同様に機能し、ここで開示され特許請求の範囲にあ
る核酸およびアミノ酸組成物と同一の組成物を実質的に
産生するであろう。
る語句「実質的配列相同性」は、ここに開示されて特許
請求の範囲にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的
に異ならない配列変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはア
ミノ酸配列が、この発明の配列と均等であるものとみな
され、従って、この特許請求の範囲の領域内にはいるこ
とを意味する。この点で「わずかでかつ機能的に異なら
ない配列変異」とは、「相同」配列（すなわち、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、またはここで開示されて特許請求の範囲に
あるタンパク質と実質的な相同性をもつ配列）が、この
発明で開示され特許請求の範囲にある配列と機能的に均
等であることを意味する。機能的に均等な配列は、実質
的に同様に機能し、ここで開示され特許請求の範囲にあ
る核酸およびアミノ酸組成物と同一の組成物を実質的に
産生するであろう。
【００２７】ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタン
パク質の修飾句として本明細書および特許請求の範囲で
使用される語句「実質的に純粋な」は、そのように形容
されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質
が、人為的努力によってそれら生体内の細胞環境から分
離されてきたことを意味する。その分離および精製の結
果として、分離されない不純なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペ
プチドまたはタンパク質が有用ではない態様において、
実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタ
ンパク質は有用である。
パク質の修飾句として本明細書および特許請求の範囲で
使用される語句「実質的に純粋な」は、そのように形容
されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質
が、人為的努力によってそれら生体内の細胞環境から分
離されてきたことを意味する。その分離および精製の結
果として、分離されない不純なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペ
プチドまたはタンパク質が有用ではない態様において、
実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタ
ンパク質は有用である。
【００２８】ここで見られるさまざまなアミノ酸配列を
成立させるアミノ酸は、以下の３文字または１文字の略
号に従って同定することができる。
成立させるアミノ酸は、以下の３文字または１文字の略
号に従って同定することができる。
【００２９】
【表１】 アミノ酸 ３文字略号 １文字略号 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システイン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−グリシン Ｇｌｙ Ｇ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｙｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ
【００３０】ここに見られるさまざまなヌクレオチド配
列を成立させるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使
用される通常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃおよび
Ｕ）で表される。
列を成立させるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使
用される通常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃおよび
Ｕ）で表される。
【００３１】ここで、「タンパク質」、「ペプチド」お
よび「ポリペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互
換的に用いられる。
よび「ポリペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互
換的に用いられる。
【００３２】「bp」とは塩基対を意味する。「Kbp 」と
はキロ塩基対、すなわち、１０００個の塩基対を指す。
はキロ塩基対、すなわち、１０００個の塩基対を指す。
【００３３】ここでは、特記しない限り、すべての温度
は℃で表される。
は℃で表される。
【００３４】寄託 この発明のそれぞれのグルタメート受容体タンパク質を
コードするｃＤＮＡは、米国メリーランド州ロックビル
にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群
のさらなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製
して使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供され
る。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布され
た規則に従ってなされている。クローニングされたＤＮ
Ａ配列の試料は、この出願またはその優先権を主張する
出願がなされるか、こういった出願に付与されたいかな
る特許にも許可される、上記の「条約および規則」また
は米国および他のすべての国もしくは国際機関の特許法
および規則に従って、特許事務所および他のこれらを法
的に受け取ることが許可された何人にも利用されてお
り、また利用されることになる。
コードするｃＤＮＡは、米国メリーランド州ロックビル
にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群
のさらなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製
して使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供され
る。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布され
た規則に従ってなされている。クローニングされたＤＮ
Ａ配列の試料は、この出願またはその優先権を主張する
出願がなされるか、こういった出願に付与されたいかな
る特許にも許可される、上記の「条約および規則」また
は米国および他のすべての国もしくは国際機関の特許法
および規則に従って、特許事務所および他のこれらを法
的に受け取ることが許可された何人にも利用されてお
り、また利用されることになる。
【００３５】寄託された各ｃＤＮＡクローンのＡＴＣＣ
受託番号および寄託日は以下の通りである。 ・ＧｌｕＲ１クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３４、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ２クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３２、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ３クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３３、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ４クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７５、１９
９０年８月２日 ・ＧｌｕＲ５クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７４、１９
９０年８月２日
受託番号および寄託日は以下の通りである。 ・ＧｌｕＲ１クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３４、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ２クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３２、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ３クローン：ＡＴＣＣNo. ６８１３３、１９
８９年１０月１９日 ・ＧｌｕＲ４クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７５、１９
９０年８月２日 ・ＧｌｕＲ５クローン：ＡＴＣＣNo. ６８３７４、１９
９０年８月２日
【００３６】本発明は、配列表の配列番号２、４、６又
は８に記載されたアミノ酸配列を有するか又は該アミノ
酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換し、欠失し若
しくは該アミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が挿入さ
れたアミノ酸配列を有し、グルタメート受容体サブユニ
ットとして機能するタンパク質を提供する。
は８に記載されたアミノ酸配列を有するか又は該アミノ
酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換し、欠失し若
しくは該アミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が挿入さ
れたアミノ酸配列を有し、グルタメート受容体サブユニ
ットとして機能するタンパク質を提供する。
【００３７】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
をコードするＤＮＡを提供する。さらに、本発明は、配
列表の配列番号１、３、５又は７に記載された配列のコ
ード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列を有する
ＤＮＡと高又は低緊縮条件下においてハイブリダイズす
るＤＮＡであってグルタメート受容体サブユニットとし
て機能するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
をコードするＤＮＡを提供する。さらに、本発明は、配
列表の配列番号１、３、５又は７に記載された配列のコ
ード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列を有する
ＤＮＡと高又は低緊縮条件下においてハイブリダイズす
るＤＮＡであってグルタメート受容体サブユニットとし
て機能するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００３８】さらに、本発明は、上記本発明のＤＮＡ又
はその断片であって少なくとも約２０塩基対の長さを有
するＤＮＡを含むＤＮＡプローブを提供する。さらに、
本発明は、上記本発明のＤＮＡから転写されたセンス又
はアンチセンスｍＲＮＡを提供する。さらに、本発明
は、上記本発明のセンス又はアンチセンスｍＲＮＡを発
現する卵母細胞を提供する。さらに、本発明は、被検Ｄ
ＮＡと上記本発明のプローブＤＮＡとを高又は低緊縮ハ
イブリダイゼーション条件下で接触させ、前記プローブ
とハイブリダイズした被検ＤＮＡを、グルタメート受容
体タンパク質をコードするＤＮＡと相同であると同定す
ることを含む、グルタメート受容体タンパク質をコード
するＤＮＡと相同なＤＮＡを被検試料中で同定する方法
を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク
質の組合せ体を被検物質と接触させ、イオンチャンネル
活性をモニターし、イオンチャンネル応答を行う物質を
機能性リガンドであると同定することを含む、被検物質
がグルタメート受容体タンパク質のための機能性リガン
ドであるか否かを決定する方法を提供する。さらに、本
発明は、グルタメート受容体を活性化することが知られ
ている少なくとも１つのリガンドとタンパク質を接触さ
せ、前記リガンドに対するイオンチャンネル応答を測定
し、前記接触によりイオンチャンネル応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体であると同定すること
を含む、イオンチャンネルとして機能するグルタメート
受容体を同定する方法を提供する。
はその断片であって少なくとも約２０塩基対の長さを有
するＤＮＡを含むＤＮＡプローブを提供する。さらに、
本発明は、上記本発明のＤＮＡから転写されたセンス又
はアンチセンスｍＲＮＡを提供する。さらに、本発明
は、上記本発明のセンス又はアンチセンスｍＲＮＡを発
現する卵母細胞を提供する。さらに、本発明は、被検Ｄ
ＮＡと上記本発明のプローブＤＮＡとを高又は低緊縮ハ
イブリダイゼーション条件下で接触させ、前記プローブ
とハイブリダイズした被検ＤＮＡを、グルタメート受容
体タンパク質をコードするＤＮＡと相同であると同定す
ることを含む、グルタメート受容体タンパク質をコード
するＤＮＡと相同なＤＮＡを被検試料中で同定する方法
を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク
質の組合せ体を被検物質と接触させ、イオンチャンネル
活性をモニターし、イオンチャンネル応答を行う物質を
機能性リガンドであると同定することを含む、被検物質
がグルタメート受容体タンパク質のための機能性リガン
ドであるか否かを決定する方法を提供する。さらに、本
発明は、グルタメート受容体を活性化することが知られ
ている少なくとも１つのリガンドとタンパク質を接触さ
せ、前記リガンドに対するイオンチャンネル応答を測定
し、前記接触によりイオンチャンネル応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体であると同定すること
を含む、イオンチャンネルとして機能するグルタメート
受容体を同定する方法を提供する。
【００３９】発明の記載 この発明は、一群のグルタメート受容体およびこれらを
コードする新規なＤＮＡ配列を開示する。
コードする新規なＤＮＡ配列を開示する。
【００４０】さらに詳細に言うと、この発明は、一局面
において、グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的
及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性タン
パク質、その機能性断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の機能性組合せ体を含む。
において、グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的
及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性タン
パク質、その機能性断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の機能性組合せ体を含む。
【００４１】この発明は、他の局面において、Ｎ−メチ
ル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３
−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロ
ピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び２−ア
ミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）からなる群よ
り選ばれたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
機能性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び
／又は前記断片の組合せ体を含む。
ル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３
−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロ
ピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び２−ア
ミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）からなる群よ
り選ばれたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
機能性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び
／又は前記断片の組合せ体を含む。
【００４２】この発明は、他の局面において、ＫＡ及び
／又はＡＭＰＡサブタイプに特徴的な電気生理学的及び
薬理学的性質を有する、グルタメート受容体サブタイプ
に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する、実
質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並びに前記タ
ンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
／又はＡＭＰＡサブタイプに特徴的な電気生理学的及び
薬理学的性質を有する、グルタメート受容体サブタイプ
に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する、実
質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並びに前記タ
ンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
【００４３】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性をもつＤＮＡによってコードされてい
る、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性
タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又は
前記断片の組合せ体を含む。
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性をもつＤＮＡによってコードされてい
る、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性
タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又は
前記断片の組合せ体を含む。
【００４４】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１（図１〜６）、ＧｌｕＲ２（図９〜１４）、Ｇ
ｌｕＲ３（図１５〜２０）、ＧｌｕＲ４（図３２〜３
５）、ＧｌｕＲ５（図３６〜４３）、ＧｌｕＲ６（図４
４〜５０）およびＧｌｕＲ７（図５１、５２）からなる
群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも約４
０％のアミノ酸相同性を有する、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並び
に前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含
む。
ｌｕＲ１（図１〜６）、ＧｌｕＲ２（図９〜１４）、Ｇ
ｌｕＲ３（図１５〜２０）、ＧｌｕＲ４（図３２〜３
５）、ＧｌｕＲ５（図３６〜４３）、ＧｌｕＲ６（図４
４〜５０）およびＧｌｕＲ７（図５１、５２）からなる
群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも約４
０％のアミノ酸相同性を有する、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能性タンパク質、その断片並び
に前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含
む。
【００４５】この発明は、さらに他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７タンパク質から成
る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並びにグル
タメート受容体として機能的なこれらの組合せ体を含
む。
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７タンパク質から成
る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並びにグル
タメート受容体として機能的なこれらの組合せ体を含
む。
【００４６】さらに他の局面において、この発明は、約
９９，７６９（ＧｌｕＲ１）、約９４，４００（Ｇｌｕ
Ｒ２）、約９８，０００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５０
０（ＧｌｕＲ４）、約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及
び約１００，０００（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イ
オンチャンネルを形成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブ
タイプのグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及
び薬理学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質を
含む。
９９，７６９（ＧｌｕＲ１）、約９４，４００（Ｇｌｕ
Ｒ２）、約９８，０００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５０
０（ＧｌｕＲ４）、約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及
び約１００，０００（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イ
オンチャンネルを形成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブ
タイプのグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及
び薬理学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質を
含む。
【００４７】さらに本発明は、他の局面において、本発
明の実質的に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相
同性を有する実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
明の実質的に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相
同性を有する実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
【００４８】またこの発明は、グルタメート受容体に特
徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タ
ンパク質又はその機能性断片をコードする実質的に純粋
なＤＮＡを含む。
徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タ
ンパク質又はその機能性断片をコードする実質的に純粋
なＤＮＡを含む。
【００４９】さらに、本発明は、他の局面において、Ｎ
−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び
２−アミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）サブタ
イプからなる群より選ばれたグルタメート受容体サブタ
イプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する
機能性タンパク質又はその機能性断片をコードする実質
的に純粋なＤＮＡを含む。
−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（ＫＡ）及び
２−アミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰＢ）サブタ
イプからなる群より選ばれたグルタメート受容体サブタ
イプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する
機能性タンパク質又はその機能性断片をコードする実質
的に純粋なＤＮＡを含む。
【００５０】さらにこの発明は、ＫＡおよび／またはＡ
ＭＰＡグルタメート受容体をコードするＤＮＡを含む。
ＭＰＡグルタメート受容体をコードするＤＮＡを含む。
【００５１】この発明は、他の局面において、ＧｌｕＲ
１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、Ｇｌ
ｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡお
よびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、Ｇｌ
ｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡお
よびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
【００５２】さらにこの発明は、他の局面において、Ｇ
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性を有する、実質的に純粋なＤＮＡを含
む。
ｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６
ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる群より選ばれる
少なくとも１つに対して少なくとも約４０％のヌクレオ
チド配列相同性を有する、実質的に純粋なＤＮＡを含
む。
【００５３】この発明は、関連する局面において、Ｇｌ
ｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６９）、ＧｌｕＲ２（Ｍｒ 約
９６，４００）、ＧｌｕＲ３（Ｍｒ 約９８，００
０）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ 約９８，５００）、ＧｌｕＲ
５（Ｍｒ 約１００，０００）、ＧｌｕＲ６（約Ｍｒ １
００，０００）及びＧｌｕＲ７から成る群より選ばれる
グルタメート受容体タンパク質をコードする実質的に純
粋なＤＮＡを含む。
ｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６９）、ＧｌｕＲ２（Ｍｒ 約
９６，４００）、ＧｌｕＲ３（Ｍｒ 約９８，００
０）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ 約９８，５００）、ＧｌｕＲ
５（Ｍｒ 約１００，０００）、ＧｌｕＲ６（約Ｍｒ １
００，０００）及びＧｌｕＲ７から成る群より選ばれる
グルタメート受容体タンパク質をコードする実質的に純
粋なＤＮＡを含む。
【００５４】本発明は、さらに、約９９，７６９（Ｇｌ
ｕＲ１）、約９４，４００（ＧｌｕＲ２）、約９８，０
００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５００（ＧｌｕＲ４）、
約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及び約１００，０００
（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イオンチャンネルを形
成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプのグルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋なタンパク質をコードする実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
ｕＲ１）、約９４，４００（ＧｌｕＲ２）、約９８，０
００（ＧｌｕＲ３）、約９８，５００（ＧｌｕＲ４）、
約１００，０００（ＧｌｕＲ５）及び約１００，０００
（ＧｌｕＲ６）のＭｒ を有し、イオンチャンネルを形
成し、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプのグルタメー
ト受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋なタンパク質をコードする実質的に
純粋なＤＮＡを含む。
【００５５】さらにこの発明は、この発明の実質的に純
粋なＤＮＡのいずれかに対して機能的に均等である実質
的に純粋なＤＮＡを含むが、ここで「機能的に均等な」
とは、実質的に純粋なＤＮＡが、グルタメート受容体の
リガンドに応答してイオンチャンネルを形成するタンパ
ク質またはそれらの機能性断片をコードすることを意味
する。
粋なＤＮＡのいずれかに対して機能的に均等である実質
的に純粋なＤＮＡを含むが、ここで「機能的に均等な」
とは、実質的に純粋なＤＮＡが、グルタメート受容体の
リガンドに応答してイオンチャンネルを形成するタンパ
ク質またはそれらの機能性断片をコードすることを意味
する。
【００５６】この発明は、他の局面において、本発明の
ＤＮＡから転写される実質的に純粋なセンスまたはアン
チセンスｍＲＮＡを含むが、これらのＤＮＡは、グルタ
メート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性
質を有する実質的に純粋な機能性タンパク質をコードす
る。
ＤＮＡから転写される実質的に純粋なセンスまたはアン
チセンスｍＲＮＡを含むが、これらのＤＮＡは、グルタ
メート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性
質を有する実質的に純粋な機能性タンパク質をコードす
る。
【００５７】この発明は、他の局面において、グルタメ
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する機能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡを含む。各クローンは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、グルタメート受容
体群のさらなるメンバ−を同定して分離するために必要
な出発物質（すなわち、プローブ）として当該分野の技
術者に供与される。各ｃＤＮＡクローンとして、Ｇｌｕ
Ｒ１（ＡＴＣＣNo. ６８１３４）、ＧｌｕＲ２（ＡＴＣ
ＣNo. ６８１３２）、ＧｌｕＲ３Ａ（ＴＣＣNo. ６８１
３３）、ＧｌｕＲ４（ＡＴＣＣNo. ６８３７５）、およ
びＧｌｕＲ５（ＡＴＣＣNo. ６８３７４）が挙げられ
る。完全な長さのｃＤＮＡクローンまたはそれらの断片
をプローブとして使用することができる。断片をプロー
ブとして使用する場合、ＤＮＡ配列は、そのＤＮＡのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
ＤＮＡ配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが
最も好ましい。
ート受容体に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質
を有する機能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡを含む。各クローンは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、グルタメート受容
体群のさらなるメンバ−を同定して分離するために必要
な出発物質（すなわち、プローブ）として当該分野の技
術者に供与される。各ｃＤＮＡクローンとして、Ｇｌｕ
Ｒ１（ＡＴＣＣNo. ６８１３４）、ＧｌｕＲ２（ＡＴＣ
ＣNo. ６８１３２）、ＧｌｕＲ３Ａ（ＴＣＣNo. ６８１
３３）、ＧｌｕＲ４（ＡＴＣＣNo. ６８３７５）、およ
びＧｌｕＲ５（ＡＴＣＣNo. ６８３７４）が挙げられ
る。完全な長さのｃＤＮＡクローンまたはそれらの断片
をプローブとして使用することができる。断片をプロー
ブとして使用する場合、ＤＮＡ配列は、そのＤＮＡのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
ＤＮＡ配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが
最も好ましい。
【００５８】この発明は、他の局面において、この発明
のＤＮＡによってコードされた機能性ペプチド断片およ
びこれらの機能性組み合わせ体を含む。こういった機能
性ペプチド断片は、グルタメート受容体として機能する
ペプチドに必須でない配列中のアミノ酸のいくつかまた
はすべてを除くことによって、過度の実験をともなわず
に当該分野の技術者によって作製可能である。グルタメ
ート受容体機能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上
記のペプチドをコードするＤＮＡを体系的に消化するこ
と、および／または上記のＤＮＡへ欠失を導入すること
によって行われる。修飾（例えば、欠失または消化）さ
れたＤＮＡは、例えば、ＤＮＡを転写してから、アフリ
カツメガエルの卵母細胞中に得られたｍＲＮＡを導入す
ることによって発現される。その卵母細胞では、ｍＲＮ
Ａの翻訳が行われることになる。こうして卵母細胞中で
発現されたタンパク質の機能的解析は、結合が予期され
るリガンドおよび機能的に活性なグルタメート受容体に
その卵母細胞をさらしてから、発現された断片がイオン
チャンネルを形成するか否か調べるために卵母細胞をモ
ニターすることによって行われる。イオンチャンネルが
検出されれば、断片はグルタメート受容体として機能し
ている。
のＤＮＡによってコードされた機能性ペプチド断片およ
びこれらの機能性組み合わせ体を含む。こういった機能
性ペプチド断片は、グルタメート受容体として機能する
ペプチドに必須でない配列中のアミノ酸のいくつかまた
はすべてを除くことによって、過度の実験をともなわず
に当該分野の技術者によって作製可能である。グルタメ
ート受容体機能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上
記のペプチドをコードするＤＮＡを体系的に消化するこ
と、および／または上記のＤＮＡへ欠失を導入すること
によって行われる。修飾（例えば、欠失または消化）さ
れたＤＮＡは、例えば、ＤＮＡを転写してから、アフリ
カツメガエルの卵母細胞中に得られたｍＲＮＡを導入す
ることによって発現される。その卵母細胞では、ｍＲＮ
Ａの翻訳が行われることになる。こうして卵母細胞中で
発現されたタンパク質の機能的解析は、結合が予期され
るリガンドおよび機能的に活性なグルタメート受容体に
その卵母細胞をさらしてから、発現された断片がイオン
チャンネルを形成するか否か調べるために卵母細胞をモ
ニターすることによって行われる。イオンチャンネルが
検出されれば、断片はグルタメート受容体として機能し
ている。
【００５９】この発明は、さらに別の態様で、この発明
のＤＮＡで形質転換された細胞を含む。
のＤＮＡで形質転換された細胞を含む。
【００６０】この発明は、さらに別の態様で、この発明
のｍＲＮＡが導入（例えば注入によって）されたアフリ
カツメガエルの卵母細胞を含む。
のｍＲＮＡが導入（例えば注入によって）されたアフリ
カツメガエルの卵母細胞を含む。
【００６１】なおさらに、この発明には、この発明のＤ
ＮＡ配列の発現、または対応するｍＲＮＡの翻訳によっ
て作られた新規なグルタメート受容体を含む。こういっ
た新規な受容体としては、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
ＮＡ配列の発現、または対応するｍＲＮＡの翻訳によっ
て作られた新規なグルタメート受容体を含む。こういっ
た新規な受容体としては、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
【００６２】なおさらに、この発明は、この発明のＤＮ
Ａ、ＲＮＡおよびタンパク質に対して機能的に均等であ
るＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。こういった
機能的に均等なＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、こ
の発明のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質と実質的に同
様に機能することであろう。
Ａ、ＲＮＡおよびタンパク質に対して機能的に均等であ
るＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む。こういった
機能的に均等なＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質は、こ
の発明のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質と実質的に同
様に機能することであろう。
【００６３】
【発明の実施の形態】ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質
組成物に加えて、この発明はさまざまな方法も含む。こ
の発明の１番目の方法は、グルタメート受容体タンパク
質をコードすることが分かっているＤＮＡに相同なＤＮ
Ａを同定する方法である。この方法は、低および／また
は高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡの「未
知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のＤＮＡプ
ローブ（例えば、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７
など）と接触させること、そして次いで、グルタメート
プローブのＤＮＡとハイブリダイゼーションする「未
知」すなわち試験ＤＮＡをグルタメート受容体の相同性
ＤＮＡと同定することを含む。
組成物に加えて、この発明はさまざまな方法も含む。こ
の発明の１番目の方法は、グルタメート受容体タンパク
質をコードすることが分かっているＤＮＡに相同なＤＮ
Ａを同定する方法である。この方法は、低および／また
は高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡの「未
知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のＤＮＡプ
ローブ（例えば、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７
など）と接触させること、そして次いで、グルタメート
プローブのＤＮＡとハイブリダイゼーションする「未
知」すなわち試験ＤＮＡをグルタメート受容体の相同性
ＤＮＡと同定することを含む。
【００６４】この発明の２番目の方法は、機能性グルタ
メート受容体（すなわち、イオンチャンネルを形成する
グルタメート受容体）を同定する方法に関する。この方
法は、好ましくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグル
タメート受容体を活性化することが分かっている少なく
とも１種類のリガンドと接触させること、このリガンド
に対するイオンチャンネル応答を測定すること、および
接触の結果としてイオンチャンネルの応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体と同定することを含
む。
メート受容体（すなわち、イオンチャンネルを形成する
グルタメート受容体）を同定する方法に関する。この方
法は、好ましくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグル
タメート受容体を活性化することが分かっている少なく
とも１種類のリガンドと接触させること、このリガンド
に対するイオンチャンネル応答を測定すること、および
接触の結果としてイオンチャンネルの応答を示すタンパ
ク質を機能性グルタメート受容体と同定することを含
む。
【００６５】この発明の３番目の方法は、ある物質がグ
ルタメート受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを
決定する方法である。この方法に従って、グルタメート
受容体として機能することが知られるタンパク質を「未
知」すなわち被験物質と接触させ、既知のグルタメート
受容体のイオンチャンネル活性をその「未知」すなわち
被験物質との接触によってモニターして、既知のグルタ
メート受容体におけるイオンチャンネル応答に作用する
これらの物質を受容体タンパク質の機能性リガンドと同
定する。
ルタメート受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを
決定する方法である。この方法に従って、グルタメート
受容体として機能することが知られるタンパク質を「未
知」すなわち被験物質と接触させ、既知のグルタメート
受容体のイオンチャンネル活性をその「未知」すなわち
被験物質との接触によってモニターして、既知のグルタ
メート受容体におけるイオンチャンネル応答に作用する
これらの物質を受容体タンパク質の機能性リガンドと同
定する。
【００６６】この発明の特異的ＤＮＡのいくつかに着目
すると、ｃＤＮＡクローンのＧｌｕＲ１は、アフリカツ
メガエルの卵母細胞のカイネートでゲーティングされる
イオンチャンネルの発現を調べるスクリーニングによっ
て、ラットの前脳のｃＤＮＡライブラリーから単離され
た。グルタメート受容体群の他のメンバーをコードする
ｃＤＮＡクローンを見い出すために、クローンＧｌｕＲ
１からの挿入片を、脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼーション条件
下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション条件下）する
プローブとして使用した。ＧｌｕＲ１プローブｃＤＮＡ
を使用することによって、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３
クローンが同定および分離された。ＧｌｕＲ２からのプ
ローブ３を使用してＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５を同定
および分離した。そして、ＧｌｕＲ５を使用して、Ｇｌ
ｕＲ６およびＧｌｕＲ７のためのクローンを分離した。
すると、ｃＤＮＡクローンのＧｌｕＲ１は、アフリカツ
メガエルの卵母細胞のカイネートでゲーティングされる
イオンチャンネルの発現を調べるスクリーニングによっ
て、ラットの前脳のｃＤＮＡライブラリーから単離され
た。グルタメート受容体群の他のメンバーをコードする
ｃＤＮＡクローンを見い出すために、クローンＧｌｕＲ
１からの挿入片を、脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼーション条件
下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション条件下）する
プローブとして使用した。ＧｌｕＲ１プローブｃＤＮＡ
を使用することによって、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３
クローンが同定および分離された。ＧｌｕＲ２からのプ
ローブ３を使用してＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５を同定
および分離した。そして、ＧｌｕＲ５を使用して、Ｇｌ
ｕＲ６およびＧｌｕＲ７のためのクローンを分離した。
【００６７】ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１は、あらゆる
翻訳後修飾の前では、Ｍr が約９９，７６９の単一タン
パク質からなる機能性グルタメート受容体サブユニット
をコードする。このタンパク質は、ＫＡおよびＡＭＡＰ
受容体の電気生理学的および薬理学的性質を有するイオ
ンチャンネルを形成する。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７遺伝子によってコードされるタンパク質を用
いれば、かなりの程度でサブユニット間のアミノ酸配列
の確認ができる（表３参照）。これらタンパク質は、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でホモおよびヘテロＫＡ／
ＡＭＰＡ感受性イオンチャンネルを明確に形成すること
が分かっている。例えば、グルタメート受容体の単一タ
ンパクサブユニット、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ＮＭＤＡおよび
ＡＰＢでは活性化されないが、ＫＡ、ＡＭＰＡ、ＱＵＩ
Ｓによって活性化された機能性受容体イオンチャンネル
のホモ複合体を確実に形成する。ＧｌｕＲ２サブユニッ
トは機能性ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニッ
トは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３とのヘテロ組み合わ
せ体で受容体イオンチャンネル複合体をより効果的に組
み立てる。
翻訳後修飾の前では、Ｍr が約９９，７６９の単一タン
パク質からなる機能性グルタメート受容体サブユニット
をコードする。このタンパク質は、ＫＡおよびＡＭＡＰ
受容体の電気生理学的および薬理学的性質を有するイオ
ンチャンネルを形成する。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６および
ＧｌｕＲ７遺伝子によってコードされるタンパク質を用
いれば、かなりの程度でサブユニット間のアミノ酸配列
の確認ができる（表３参照）。これらタンパク質は、ア
フリカツメガエルの卵母細胞でホモおよびヘテロＫＡ／
ＡＭＰＡ感受性イオンチャンネルを明確に形成すること
が分かっている。例えば、グルタメート受容体の単一タ
ンパクサブユニット、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇｌｕ
Ｒ３、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５は、ＮＭＤＡおよび
ＡＰＢでは活性化されないが、ＫＡ、ＡＭＰＡ、ＱＵＩ
Ｓによって活性化された機能性受容体イオンチャンネル
のホモ複合体を確実に形成する。ＧｌｕＲ２サブユニッ
トは機能性ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニッ
トは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３とのヘテロ組み合わ
せ体で受容体イオンチャンネル複合体をより効果的に組
み立てる。
【００６８】グルタメートには弱く応答するが、Ｎ−メ
チル−Ｄ−アスパルテート、カイネート、キスカレート
および２−アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホ
モイオンチャンネルを、ＧｌｕＲ５タンパク質はアフリ
カツメガエルの卵母細胞中で形成する。ＧｌｕＲ５を発
現する卵母細胞がＬ−グルタメートには応答し、ＫＡ、
キスカレートまたはＡＭＰＡには応答しないという事実
は、このタンパク質が、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと
は異なる薬理学的作用を有する受容体の形成に関与し得
ることが示しているかもしれない。こういった示唆は、
in situ ハイブリダイゼーションデータによって支持さ
れている。
チル−Ｄ−アスパルテート、カイネート、キスカレート
および２−アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホ
モイオンチャンネルを、ＧｌｕＲ５タンパク質はアフリ
カツメガエルの卵母細胞中で形成する。ＧｌｕＲ５を発
現する卵母細胞がＬ−グルタメートには応答し、ＫＡ、
キスカレートまたはＡＭＰＡには応答しないという事実
は、このタンパク質が、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと
は異なる薬理学的作用を有する受容体の形成に関与し得
ることが示しているかもしれない。こういった示唆は、
in situ ハイブリダイゼーションデータによって支持さ
れている。
【００６９】胚の発生および新生児の発育中に、Ｇｌｕ
Ｒ５遺伝子は、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の神経細胞のサブ
セットで発現され、ＧｌｕＲ５遺伝子の空間的および時
間的発現様式は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブセットのＧｌｕＲ
４と大きく重なっている。しかし、成熟個体の脳では、
ＧｌｕＲ５遺伝子は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニット遺伝
子とは異なった様式で発現され、ＧｌｕＲ５がＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体とは異なるグルタメート受容体の１サブタ
イプであるという示唆と一致する。
Ｒ５遺伝子は、ＣＮＳおよびＰＮＳ中の神経細胞のサブ
セットで発現され、ＧｌｕＲ５遺伝子の空間的および時
間的発現様式は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブセットのＧｌｕＲ
４と大きく重なっている。しかし、成熟個体の脳では、
ＧｌｕＲ５遺伝子は、ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニット遺伝
子とは異なった様式で発現され、ＧｌｕＲ５がＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体とは異なるグルタメート受容体の１サブタ
イプであるという示唆と一致する。
【００７０】これ以上の考察を行わずとも、当該分野の
技術者には、上記の記載、ならびに以降の実施例および
図面の詳細な説明を使って、この発明を完全に利用する
ことができる。実施例で開示される事項は、特記のない
限り、例示を目的として開示されるので、添付の特許請
求の範囲のいずれにも限定されると解釈すべきではな
い。
技術者には、上記の記載、ならびに以降の実施例および
図面の詳細な説明を使って、この発明を完全に利用する
ことができる。実施例で開示される事項は、特記のない
限り、例示を目的として開示されるので、添付の特許請
求の範囲のいずれにも限定されると解釈すべきではな
い。
【００７１】
【実施例】実施例１ 脳のｃＤＮＡライブラリーの作製 脳（例えば、哺乳動物の脳）または適切な細胞系（例え
ば、ＮＣＢ−２０細胞系）から、グアニジンチオシアネ
ート−ＣｓＣｌ法［Chirgwin et al., Biochem. 18, 52
94 (1979) ］によってポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製する。
精製されたＲＮＡを鋳型として用いて２本鎖のｃＤＮＡ
を調製する。プライマーとしてＸｈｏＩ制限酵素切断部
位に連結したポリｄＴプライマーを使用し、前駆体とし
てｃＣＴＰの代わりにｄＣＴＰを使ってMoloney の逆転
写酵素に第１鎖の合成を開始させる。ＲＮアーゼＨおよ
びＤＮＡポリメラーゼ を添加して第２鎖を完成させ
る。完全な長さのｃＤＮＡを作製する機会を増すＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、このｃＤＮＡを平滑末端に
する。ＥcoＲ アダプターをその平滑末端に連結させ
て、末端をキナーゼ処理する。次いで、このｃＤＮＡを
ＸｈｏＩ制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化ＤＮＡを切断し得ないので、ｍＲＮＡの３’末端
にｄＴプライマーに結合させられた非メチル化ＸｈｏＩ
制限酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本
鎖ｃＤＮＡには、ｍＲＮＡの３’末端にＸｈｏＩ制限酵
素切断部位があり、５’末端にはＥcoＲ がある。この
ｃＤＮＡをさらに、Statagene 社のλＺＡＰ- ｃＤＮＡ
クローニングシステムの一部であるλＺＡＰベクターな
どの適当なベクターに入れる。λＺＡＰベクターを使用
する場合、ｍＲＮＡの５’末端がｌａｃＺプロモーター
の近傍となるように、そのｃＤＮＡをベクターに入れ
る。（λＺＡＰベクターには、ｃＤＮＡ挿入片の一方に
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがあり、卵母細胞
での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアンチセ
ンスＲＮＡの合成を可能とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターが他端にある。）
ば、ＮＣＢ−２０細胞系）から、グアニジンチオシアネ
ート−ＣｓＣｌ法［Chirgwin et al., Biochem. 18, 52
94 (1979) ］によってポリ（Ａ）+ ＲＮＡを精製する。
精製されたＲＮＡを鋳型として用いて２本鎖のｃＤＮＡ
を調製する。プライマーとしてＸｈｏＩ制限酵素切断部
位に連結したポリｄＴプライマーを使用し、前駆体とし
てｃＣＴＰの代わりにｄＣＴＰを使ってMoloney の逆転
写酵素に第１鎖の合成を開始させる。ＲＮアーゼＨおよ
びＤＮＡポリメラーゼ を添加して第２鎖を完成させ
る。完全な長さのｃＤＮＡを作製する機会を増すＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、このｃＤＮＡを平滑末端に
する。ＥcoＲ アダプターをその平滑末端に連結させ
て、末端をキナーゼ処理する。次いで、このｃＤＮＡを
ＸｈｏＩ制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化ＤＮＡを切断し得ないので、ｍＲＮＡの３’末端
にｄＴプライマーに結合させられた非メチル化ＸｈｏＩ
制限酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本
鎖ｃＤＮＡには、ｍＲＮＡの３’末端にＸｈｏＩ制限酵
素切断部位があり、５’末端にはＥcoＲ がある。この
ｃＤＮＡをさらに、Statagene 社のλＺＡＰ- ｃＤＮＡ
クローニングシステムの一部であるλＺＡＰベクターな
どの適当なベクターに入れる。λＺＡＰベクターを使用
する場合、ｍＲＮＡの５’末端がｌａｃＺプロモーター
の近傍となるように、そのｃＤＮＡをベクターに入れ
る。（λＺＡＰベクターには、ｃＤＮＡ挿入片の一方に
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがあり、卵母細胞
での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアンチセ
ンスＲＮＡの合成を可能とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターが他端にある。）
【００７２】実施例２ 強弱の緊縮ハイブリダイゼーション ｃＤＮＡライブラリーは、実施例１に記載されたλＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ系を用いて作製することが好ましい。ハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ
２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６
もしくはＧｌｕＲ７クローン、または他の適切なクロー
ンもしくは材料から得られたＤＮＡより作製する。この
ＤＮＡは、好ましくはAmersham Multiprime 社のＤＮＡ
ラベルキットを用いてランダムプライム法によって標識
される。 少なくとも初めのうちは、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーション条件を用いることが好ましい。適切なハイ
ブリダイゼーション溶液は次のようなものである。すな
わち、１M ＮａＣｌ、５０mM Ｔris （ｐＨ８．０）、
０．５％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１０
０mg/ml のニシンの変性精子ＤＮＡ、それぞれ０．１％
（w/v ）のFicol、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清
アルブミンである。弱い緊縮スクリーニングでは、５０
℃の温度が好ましく、ライブラリーフィルターは室温で
２倍のＳＳＰＥ（１倍のＳＳＰＥは、１８０mM ＮａＣ
ｌ、９mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．９mM ＮａＨ2 ＰＯ4
よび１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、−７０
℃でkodak 社のＸＡＲ−５フィルムにさらす。強い緊縮
ハイブリダイゼーションスクリーニングでは、 温度は５
０℃にあわせ、フィルターはこの温度で０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含む０．２倍のＳＳＰＥ中で洗浄す
る。フィルターは、Cronex Quanta II/III強化スクリー
ン付きのKodak 社のＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１
８〜４８時間さらす。
Ｐ−ｃＤＮＡ系を用いて作製することが好ましい。ハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ
２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６
もしくはＧｌｕＲ７クローン、または他の適切なクロー
ンもしくは材料から得られたＤＮＡより作製する。この
ＤＮＡは、好ましくはAmersham Multiprime 社のＤＮＡ
ラベルキットを用いてランダムプライム法によって標識
される。 少なくとも初めのうちは、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーション条件を用いることが好ましい。適切なハイ
ブリダイゼーション溶液は次のようなものである。すな
わち、１M ＮａＣｌ、５０mM Ｔris （ｐＨ８．０）、
０．５％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１０
０mg/ml のニシンの変性精子ＤＮＡ、それぞれ０．１％
（w/v ）のFicol、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清
アルブミンである。弱い緊縮スクリーニングでは、５０
℃の温度が好ましく、ライブラリーフィルターは室温で
２倍のＳＳＰＥ（１倍のＳＳＰＥは、１８０mM ＮａＣ
ｌ、９mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．９mM ＮａＨ2 ＰＯ4
よび１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、−７０
℃でkodak 社のＸＡＲ−５フィルムにさらす。強い緊縮
ハイブリダイゼーションスクリーニングでは、 温度は５
０℃にあわせ、フィルターはこの温度で０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含む０．２倍のＳＳＰＥ中で洗浄す
る。フィルターは、Cronex Quanta II/III強化スクリー
ン付きのKodak 社のＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１
８〜４８時間さらす。
【００７３】弱い緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
は、脳の２０００個のｃＤＮＡクローン中の約１つが、
ＧｌｕＲ１ｃＤＮＡ挿入片から作製されたプローブに対
する若干のハイブリダイゼーションを示す。
は、脳の２０００個のｃＤＮＡクローン中の約１つが、
ＧｌｕＲ１ｃＤＮＡ挿入片から作製されたプローブに対
する若干のハイブリダイゼーションを示す。
【００７４】実施例３ ハイブリダイゼーションによって同定されたクローンの
解析 少なくとも２つの異なった方法を、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλＺＡＰクローンを拾い、これらを約１００個のクロ
ーン混合物中にプールするものである。ｍＲＮＡをこれ
らλＺＡＰのプールからインビトロで作製し、機能性グ
ルタメート受容体の合成を規定するｍＲＮＡの活性を試
験するためにこのｍＲＮＡを卵母細胞に注入する。陽性
のクローンが認められれば、この機能性クローンが分離
されるまで上記のプールを分割することによって、個々
のλＺＡＰｃＤＮＡクローンを分離する。（ＧｌｕＲ１
クローンを分離するためのこの方法の実施についての考
察は、以下の実施例５を参照。）陽性クローンを評価す
るために使用し得る第２の方法は、各挿入片をそれぞれ
解析するものである。手間はかかるが、この「個別クロ
ーン」方法には、最初から機能性の発現を必要としない
という利点がある。この「個別クローン」方法を使用す
る場合、各クローンはプラーク精製され、ｃＤＮＡ挿入
片は個別に解析される。これは、少なくともλＺＡＰｃ
ＤＮＡ系において、このｃＤＮＡが複製のバクテリオフ
ァージｆ１起源によって隣接されたカセットにクローニ
ングされるという事実によって容易に理解される。この
ｃＤＮＡは、λＺＡＰバクテリオファージからヘルパー
の感染によって修復可能なプラスミドのｐBluescript中
に含まれている。（この方法が実施されると、ｃＤＮＡ
は大きなλバクテリオファージよりも操作が容易である
小さなＰBluescriptプラスミド中に存在することとな
る。 ）センスまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３（セン
ス）またはＴ７（アンチセンス）プロモーターを使って
ＰBluescriptプラスミド中のｃＤＮＡ挿入片から作製さ
れる。
解析 少なくとも２つの異なった方法を、弱い緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλＺＡＰクローンを拾い、これらを約１００個のクロ
ーン混合物中にプールするものである。ｍＲＮＡをこれ
らλＺＡＰのプールからインビトロで作製し、機能性グ
ルタメート受容体の合成を規定するｍＲＮＡの活性を試
験するためにこのｍＲＮＡを卵母細胞に注入する。陽性
のクローンが認められれば、この機能性クローンが分離
されるまで上記のプールを分割することによって、個々
のλＺＡＰｃＤＮＡクローンを分離する。（ＧｌｕＲ１
クローンを分離するためのこの方法の実施についての考
察は、以下の実施例５を参照。）陽性クローンを評価す
るために使用し得る第２の方法は、各挿入片をそれぞれ
解析するものである。手間はかかるが、この「個別クロ
ーン」方法には、最初から機能性の発現を必要としない
という利点がある。この「個別クローン」方法を使用す
る場合、各クローンはプラーク精製され、ｃＤＮＡ挿入
片は個別に解析される。これは、少なくともλＺＡＰｃ
ＤＮＡ系において、このｃＤＮＡが複製のバクテリオフ
ァージｆ１起源によって隣接されたカセットにクローニ
ングされるという事実によって容易に理解される。この
ｃＤＮＡは、λＺＡＰバクテリオファージからヘルパー
の感染によって修復可能なプラスミドのｐBluescript中
に含まれている。（この方法が実施されると、ｃＤＮＡ
は大きなλバクテリオファージよりも操作が容易である
小さなＰBluescriptプラスミド中に存在することとな
る。 ）センスまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３（セン
ス）またはＴ７（アンチセンス）プロモーターを使って
ＰBluescriptプラスミド中のｃＤＮＡ挿入片から作製さ
れる。
【００７５】このｃＤＮＡ挿入片も、制限酵素を用いて
マッピングすることが好ましい。例えば、このｃＤＮＡ
挿入片は、頻繁に切断する制限酵素によって切り出され
る。得られた断片は、ゲル上でサイズ分画され、その断
片は、サザン法解析用フィルターに転写される。これら
フィルターは、既知のグルタメート受容体、例えば、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６またはＧｌｕＲ７から作製されたプ
ローブでハイブリダイズされる。各クローンからのハイ
ブリダイズ断片を、単一鎖のベクターＭ１３（ｍｐ１８
またはｍｐ１９）にサブクローニングし、この断片の配
列を決定する。ＤＮＡの配列決定は、サンガーら［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)］のジデオ
キシヌクレオチド鎖末端終始法、 またはAppleid Biosys
tems社によって製造された機種のような自動シークエン
サーを用いて行われる。 配列の解析は、Intelligenetic
s 社、 Standen 社およびウィスコンシン大学によって開
発されたプログラムなどのソフトウエアを用いたコンピ
ューターによって行われることが好ましい。完全な長さ
のクローンかほぼ完全な長さのクローンから作製される
ｍＲＮＡを上記の卵母細胞系で発現させ、新規な受容体
の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合あるク
ローンが機能しなければ、これを、他の有力なクローン
から作製したｍＲＮＡの存在下で試験する。
マッピングすることが好ましい。例えば、このｃＤＮＡ
挿入片は、頻繁に切断する制限酵素によって切り出され
る。得られた断片は、ゲル上でサイズ分画され、その断
片は、サザン法解析用フィルターに転写される。これら
フィルターは、既知のグルタメート受容体、例えば、Ｇ
ｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、Ｇｌ
ｕＲ５、ＧｌｕＲ６またはＧｌｕＲ７から作製されたプ
ローブでハイブリダイズされる。各クローンからのハイ
ブリダイズ断片を、単一鎖のベクターＭ１３（ｍｐ１８
またはｍｐ１９）にサブクローニングし、この断片の配
列を決定する。ＤＮＡの配列決定は、サンガーら［Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)］のジデオ
キシヌクレオチド鎖末端終始法、 またはAppleid Biosys
tems社によって製造された機種のような自動シークエン
サーを用いて行われる。 配列の解析は、Intelligenetic
s 社、 Standen 社およびウィスコンシン大学によって開
発されたプログラムなどのソフトウエアを用いたコンピ
ューターによって行われることが好ましい。完全な長さ
のクローンかほぼ完全な長さのクローンから作製される
ｍＲＮＡを上記の卵母細胞系で発現させ、新規な受容体
の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合あるク
ローンが機能しなければ、これを、他の有力なクローン
から作製したｍＲＮＡの存在下で試験する。
【００７６】実施例４ アフリカツメガエルの卵母細胞中での発現のためのクロ
ーニングおよび検出 この検出法は、Masuら［Nature 329, 836 (1987)］の検
出法の改良法である。これは、外来のｍＲＮＡがアフリ
カツメガエルの卵母細胞に注入された場合、このｍＲＮ
Ａは機能性タンパク質に翻訳されるという事実に基づく
ものである。
ーニングおよび検出 この検出法は、Masuら［Nature 329, 836 (1987)］の検
出法の改良法である。これは、外来のｍＲＮＡがアフリ
カツメガエルの卵母細胞に注入された場合、このｍＲＮ
Ａは機能性タンパク質に翻訳されるという事実に基づく
ものである。
【００７７】ＤＮＡの鋳型（λＺＡＰｃＤＮＡ調製物ま
たは被験ｃＤＮＡを含むプラスミド）を制限酵素によっ
てｃＤＮＡ挿入片から下流で切断する。制限酵素使用後
の消化産物を、プロテアーゼＫで消化し、次いでフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で２回の抽出によって抽
出する。続いて、このＤＮＡ鋳型をエタノール沈澱させ
てから、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（センス鎖作製用）ま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンス鎖作製
用）、ｒＡＴＰ。ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよび
ＲＮアーゼ阻害剤と混合する。同時に、このＲＮＡの転
写物に７ｍｅＧｐｐｐＧキャップでキャップ構造を形成
させる。操作中に手袋がきれるので、水をジエチルピロ
カーボネートで処理してＲＮアーゼを不活化させる。
たは被験ｃＤＮＡを含むプラスミド）を制限酵素によっ
てｃＤＮＡ挿入片から下流で切断する。制限酵素使用後
の消化産物を、プロテアーゼＫで消化し、次いでフェノ
ール／クロロホルム（１：１）で２回の抽出によって抽
出する。続いて、このＤＮＡ鋳型をエタノール沈澱させ
てから、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（センス鎖作製用）ま
たはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンス鎖作製
用）、ｒＡＴＰ。ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰおよび
ＲＮアーゼ阻害剤と混合する。同時に、このＲＮＡの転
写物に７ｍｅＧｐｐｐＧキャップでキャップ構造を形成
させる。操作中に手袋がきれるので、水をジエチルピロ
カーボネートで処理してＲＮアーゼを不活化させる。
【００７８】インビトロで合成したｍＲＮＡの転写物を
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入する。５０nlのＲ
ＮＡ溶液（０．２〜０．６mg/ml ）をステージＶの卵母
細胞に注入する。機能性受容体の存在下での解析に先立
って、２〜７日間 Barthの培地中にて１６℃でインキュ
ベーションする。電圧の記録は、３M ＫＣＬを充填し、
適当な電圧クランプユニット（例えば、Dagen 8500 電
圧クランプユニット）に接続した微小電極を卵母細胞に
突き刺すことによって行われる。電極クランプ試験は、
２つの電極、すなわち、３M ＫＣＬを充填した電極およ
び０．２５M ＣｓＣｌ、０．２５M ＣｓＦおよび５０mM
ＥＧＴＡを充填した電流電極を用いて行われることが
好ましい。（ＫＡ／ＡＭＰＡグルタメート受容体をコー
ドするＧｌｕＲ１ｃＤＮＡからのＲＮＡを注入された卵
母細胞より得られる記録結果の考察については実施例６
参照。）注入に先立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌
親のアフリカツメガエルから卵巣を摘出することによっ
て行った。卵巣組織をコラーゲナーゼ（２mg/ml ）で２
時間処理してから、卵巣上皮および濾胞細胞を切除す
る。
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入する。５０nlのＲ
ＮＡ溶液（０．２〜０．６mg/ml ）をステージＶの卵母
細胞に注入する。機能性受容体の存在下での解析に先立
って、２〜７日間 Barthの培地中にて１６℃でインキュ
ベーションする。電圧の記録は、３M ＫＣＬを充填し、
適当な電圧クランプユニット（例えば、Dagen 8500 電
圧クランプユニット）に接続した微小電極を卵母細胞に
突き刺すことによって行われる。電極クランプ試験は、
２つの電極、すなわち、３M ＫＣＬを充填した電極およ
び０．２５M ＣｓＣｌ、０．２５M ＣｓＦおよび５０mM
ＥＧＴＡを充填した電流電極を用いて行われることが
好ましい。（ＫＡ／ＡＭＰＡグルタメート受容体をコー
ドするＧｌｕＲ１ｃＤＮＡからのＲＮＡを注入された卵
母細胞より得られる記録結果の考察については実施例６
参照。）注入に先立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌
親のアフリカツメガエルから卵巣を摘出することによっ
て行った。卵巣組織をコラーゲナーゼ（２mg/ml ）で２
時間処理してから、卵巣上皮および濾胞細胞を切除す
る。
【００７９】実施例５ ＧｌｕＲ１受容体の発現のためのクローニング アフリカツメガエルの卵母細胞に、ラットの前脳から分
離したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを注入した。２〜１０日間
後、この卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメ
ート受容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を
調べた。グルタメートとキスカレートの双方を除くと、
リガンドゲーティングイオンチャンネルによると思われ
る短期の滑らかな応答、および第２メッセンジャーの媒
介型と思われる長期の変動的応答からなる二相性のパタ
ーンが示される。ＮＭＤＡおよびＫＡは、短期の刺激に
対して滑らかな応答を引き起こすが、ＡＰＢは、応答を
生じない。
離したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを注入した。２〜１０日間
後、この卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメ
ート受容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を
調べた。グルタメートとキスカレートの双方を除くと、
リガンドゲーティングイオンチャンネルによると思われ
る短期の滑らかな応答、および第２メッセンジャーの媒
介型と思われる長期の変動的応答からなる二相性のパタ
ーンが示される。ＮＭＤＡおよびＫＡは、短期の刺激に
対して滑らかな応答を引き起こすが、ＡＰＢは、応答を
生じない。
【００８０】方向性のあるｃＤＮＡライブラリー（λＺ
ＡＰII ＲＴＢＩ、複合度＝８×１０5 要素）は、４
４，０００クローンの独立したサブライブラリー１８個
からなり、バクテリオファージの発現ベクターλＺＡＰ
II を使ってポリ（Ａ）+ ＮＡから構成させた。増幅さ
れた１８個のサブライブラリーのすべてから別個に作製
された転写物を含むインビトロでの転写物のプールを卵
母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜３mV）が、注入
の１０日後に１００μM カイネートを投与した卵母細胞
から電圧の記録として認められた。ＮＭＤＡまたはキス
カレートに対する応答は全く検出されなかった。未注入
の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメー
ト受容体のアンタゴニストに対していかなる応答も示さ
なかった。続いて、４４，０００個のクローン（＝単一
サブライブラリー）、４，０００個のクローン、４００
個のクローンおよび４０個のクローンを検出した。これ
らの試験の各回で少なくとも１つのプールを試験した。
以下の基準をスクリーニング手順の全般にわたって使用
し、最初に観察された非常に小さな応答が記録のアーチ
ファクトでないことを確認した。それらの基準とは、す
なわち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があっ
た、（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞の過融解時に容易に可逆的であった、（ｄ）１０μM
のドモエートの投与によって、１００μMのカイネート
の投与によって起こされた応答と類似の応答が生じた。
さらに細分類するために、各ステージで最も大きな応答
を起こすプールを選択した。４０クローンの最終的に陽
性のプールにおけるクローンを、それら挿入片のサイズ
について解析した。そして、最も大きな挿入片を有する
１２個のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を
規定する能力についてそれぞれ試験した。３．０kbの挿
入片を有する唯一のクローンがカイネートに応答するこ
とが分かり、これをλＺＡＰII−ＧｌｕＲ１と命名し
た。
ＡＰII ＲＴＢＩ、複合度＝８×１０5 要素）は、４
４，０００クローンの独立したサブライブラリー１８個
からなり、バクテリオファージの発現ベクターλＺＡＰ
II を使ってポリ（Ａ）+ ＮＡから構成させた。増幅さ
れた１８個のサブライブラリーのすべてから別個に作製
された転写物を含むインビトロでの転写物のプールを卵
母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜３mV）が、注入
の１０日後に１００μM カイネートを投与した卵母細胞
から電圧の記録として認められた。ＮＭＤＡまたはキス
カレートに対する応答は全く検出されなかった。未注入
の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメー
ト受容体のアンタゴニストに対していかなる応答も示さ
なかった。続いて、４４，０００個のクローン（＝単一
サブライブラリー）、４，０００個のクローン、４００
個のクローンおよび４０個のクローンを検出した。これ
らの試験の各回で少なくとも１つのプールを試験した。
以下の基準をスクリーニング手順の全般にわたって使用
し、最初に観察された非常に小さな応答が記録のアーチ
ファクトでないことを確認した。それらの基準とは、す
なわち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があっ
た、（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞の過融解時に容易に可逆的であった、（ｄ）１０μM
のドモエートの投与によって、１００μMのカイネート
の投与によって起こされた応答と類似の応答が生じた。
さらに細分類するために、各ステージで最も大きな応答
を起こすプールを選択した。４０クローンの最終的に陽
性のプールにおけるクローンを、それら挿入片のサイズ
について解析した。そして、最も大きな挿入片を有する
１２個のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を
規定する能力についてそれぞれ試験した。３．０kbの挿
入片を有する唯一のクローンがカイネートに応答するこ
とが分かり、これをλＺＡＰII−ＧｌｕＲ１と命名し
た。
【００８１】実施例６ ＧｌｕＲ１クローンの電気生理学的および薬理学的特徴 プラスミドのＧｌｕＲ１を連続的にバクテリオファージ
のλＺＡＰII- ＧｌｕＲ１からレスキューした。そし
て、インビトロでの転写時、アンチセンスＲＮＡではな
くセンスＲＮＡが、卵母細胞に注入された場合、カイネ
ートの応答を誘起した。電圧クランプ条件下（−７０mV
の保持電圧）、ＧｌｕＲ１センス転写物１０pg 程度の
少量によって、１００μM ＫＡに対する検出可能な応答
が生じた。
のλＺＡＰII- ＧｌｕＲ１からレスキューした。そし
て、インビトロでの転写時、アンチセンスＲＮＡではな
くセンスＲＮＡが、卵母細胞に注入された場合、カイネ
ートの応答を誘起した。電圧クランプ条件下（−７０mV
の保持電圧）、ＧｌｕＲ１センス転写物１０pg 程度の
少量によって、１００μM ＫＡに対する検出可能な応答
が生じた。
【００８２】ＧｌｕＲ１がある転写因子をコードすると
いう可能性を除去するために、インビトロでの転写物中
のｐＧｌｕＲ１を注入した卵母細胞を、５０μg/mlのア
クリノマイシンＤを添加した培地中に放置して、内因性
の転写を阻害した。これらの卵母細胞は、対照の培地に
放置されたものと同一のカイネートに対する応答を示し
た。したがって、卵母細胞ゲノムからの注入誘導型転写
は、観察された応答に寄与しないようである。
いう可能性を除去するために、インビトロでの転写物中
のｐＧｌｕＲ１を注入した卵母細胞を、５０μg/mlのア
クリノマイシンＤを添加した培地中に放置して、内因性
の転写を阻害した。これらの卵母細胞は、対照の培地に
放置されたものと同一のカイネートに対する応答を示し
た。したがって、卵母細胞ゲノムからの注入誘導型転写
は、観察された応答に寄与しないようである。
【００８３】Ｌ−グルタメートは、ＫＡよりもさらに小
さな応答を引き起こすが、１mM のレベルでさえも、３
０μM のＫＡで見られた脱分極の５０％を引き起こすだ
けであった。これは、グルタメートがＫＡ受容体サブタ
イプに対する唯一の弱いアゴニストであるという従来の
報告［Monaghan et al., Nature 306, 176 (1983) ］と
一致する。 ＮＭＤＡ、キスカレート、およびＬ−アスパ
ルテートといった他のグルタメート受容体は、それぞれ
１５０μM 、１０μM および１００μM のレベルで投与
された場合、応答しなかった。グリシン、ＧＡＢＧA 、
セロトニンおよびニコチンといった無関係な神経伝達物
質受容体アゴニストも、１mM 程度の高濃度で試験した
場合でさえ応答しなかった。グリシンは、ＫＡの応答を
増強させなかった。ＫＡおよびドモエートに関する用量
−応答曲線を記録したところ、それぞれのＥＣ50値は３
９μM および１．８μM であった。平均の反転電圧は、
０ないし−１３０mVの一連の維持電圧で得られた、１０
μM カに対する電流応答から外挿されたものであり、１
０mVを示した。ＫＡに対する応答は減感せず、高濃度
（１００μM ）のアゴニストによる長時間（１０分以
内）の過融解後でさえ減感しなかった。これらの所見
も、総ポリ（Ａ）+ ＲＮＡから発現したＫＡ受容体を用
いた実験による初期の報告［Verdoorn and Dingledine,
Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)］と一致す
る。同様に、ＧｌｕＲ１の薬理学的プロフィル（表２参
照）は、さまざまな既知のグルタメート受容体アンタゴ
ニストの阻害特性によって明らかにされたように、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡがカイネート受容体のメッセージ源と
して使用された系でのＫＡ受容体に関する従来の報告
［Hirono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 20
83 (1989) ］と一致する。全被験化合物（それぞれ１mM
）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたＧｌｕＲ１ＲＮＡを注入した卵母細胞中での
キネート誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程
度は低いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−ＤＧ
Ｇ）は、キヌレート受容体を阻害しないがＫＡおよびＮ
ＭＤＡ受容体を選択的に阻害する物質であって［Davies
and Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)］、 ＫＡお
よびＡＭＰＡ受容体を選択的に阻害すると報告されてい
る［Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1981)］λ−Ｄ−
グルタミルアミノメチル−スルフェート（ＧＡＭＳ）と
同様に、キヌレート受容体を阻害する。同じく、２，３
−シス−ピペリジンジカルボン酸（ＰＤＡ）は、グルタ
メート受容体のすべてのサブタイプを阻害することが知
られており［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 10
3 (1984)］、 ＧｌｕＲ１の応答を遮断した。グルタメー
トジエチルエステル（ＧＤＥＥ）は、ＡＭＰＡタイプの
グルタメート受容体を選択的に阻害すると見られており
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 103 (198
4)］、 その応答を有意に遮断するが、弱いアゴニストの
性質を示した。ＮＭＤＡ受容体アゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）および３−（２−カル
ボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェ
ート（ＣＰＰ）、ならびにＮＭＤＡはそれ自体、ＫＡ応
答を若干阻害するので、弱いアンタゴニストとして作用
した。これらは、いかなるアゴニストの性質も示さなか
った。
さな応答を引き起こすが、１mM のレベルでさえも、３
０μM のＫＡで見られた脱分極の５０％を引き起こすだ
けであった。これは、グルタメートがＫＡ受容体サブタ
イプに対する唯一の弱いアゴニストであるという従来の
報告［Monaghan et al., Nature 306, 176 (1983) ］と
一致する。 ＮＭＤＡ、キスカレート、およびＬ−アスパ
ルテートといった他のグルタメート受容体は、それぞれ
１５０μM 、１０μM および１００μM のレベルで投与
された場合、応答しなかった。グリシン、ＧＡＢＧA 、
セロトニンおよびニコチンといった無関係な神経伝達物
質受容体アゴニストも、１mM 程度の高濃度で試験した
場合でさえ応答しなかった。グリシンは、ＫＡの応答を
増強させなかった。ＫＡおよびドモエートに関する用量
−応答曲線を記録したところ、それぞれのＥＣ50値は３
９μM および１．８μM であった。平均の反転電圧は、
０ないし−１３０mVの一連の維持電圧で得られた、１０
μM カに対する電流応答から外挿されたものであり、１
０mVを示した。ＫＡに対する応答は減感せず、高濃度
（１００μM ）のアゴニストによる長時間（１０分以
内）の過融解後でさえ減感しなかった。これらの所見
も、総ポリ（Ａ）+ ＲＮＡから発現したＫＡ受容体を用
いた実験による初期の報告［Verdoorn and Dingledine,
Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)］と一致す
る。同様に、ＧｌｕＲ１の薬理学的プロフィル（表２参
照）は、さまざまな既知のグルタメート受容体アンタゴ
ニストの阻害特性によって明らかにされたように、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡがカイネート受容体のメッセージ源と
して使用された系でのＫＡ受容体に関する従来の報告
［Hirono et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 20
83 (1989) ］と一致する。全被験化合物（それぞれ１mM
）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたＧｌｕＲ１ＲＮＡを注入した卵母細胞中での
キネート誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程
度は低いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−ＤＧ
Ｇ）は、キヌレート受容体を阻害しないがＫＡおよびＮ
ＭＤＡ受容体を選択的に阻害する物質であって［Davies
and Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)］、 ＫＡお
よびＡＭＰＡ受容体を選択的に阻害すると報告されてい
る［Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1981)］λ−Ｄ−
グルタミルアミノメチル−スルフェート（ＧＡＭＳ）と
同様に、キヌレート受容体を阻害する。同じく、２，３
−シス−ピペリジンジカルボン酸（ＰＤＡ）は、グルタ
メート受容体のすべてのサブタイプを阻害することが知
られており［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 10
3 (1984)］、 ＧｌｕＲ１の応答を遮断した。グルタメー
トジエチルエステル（ＧＤＥＥ）は、ＡＭＰＡタイプの
グルタメート受容体を選択的に阻害すると見られており
［Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7. 103 (198
4)］、 その応答を有意に遮断するが、弱いアゴニストの
性質を示した。ＮＭＤＡ受容体アゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）および３−（２−カル
ボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェ
ート（ＣＰＰ）、ならびにＮＭＤＡはそれ自体、ＫＡ応
答を若干阻害するので、弱いアンタゴニストとして作用
した。これらは、いかなるアゴニストの性質も示さなか
った。
【００８４】全体的にみれば、ＧｌｕＲ１転写物を注入
された卵母細胞で認められる電気生理学的性質、および
観察された薬理学的性質によれば、ＧｌｕＲ１が、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡを注入された卵母細胞で観察されたも
のとは異なる機能性ＫＡ受容体であることが分かる。し
たがって、ＧｌｕＲ１によってコードされた単一のタン
パク質サブユニットは、活性のある受容体イオンチャン
ネル複合体を形成するに十分である。
された卵母細胞で認められる電気生理学的性質、および
観察された薬理学的性質によれば、ＧｌｕＲ１が、総ポ
リ（Ａ）+ ＲＮＡを注入された卵母細胞で観察されたも
のとは異なる機能性ＫＡ受容体であることが分かる。し
たがって、ＧｌｕＲ１によってコードされた単一のタン
パク質サブユニットは、活性のある受容体イオンチャン
ネル複合体を形成するに十分である。
【００８５】実施例７ ＧｌｕＲ１の配列決定および１次構造 プラスミドｐＧｌｕＲ１のｃＤＮＡ挿入片をＭ１３ｍｐ
１９にサブクローニングして、配列を決定した（図１〜
６）。２７２１ｂｐのオープンリーディングフレーム
が、全長２９９２ｂｐ中に見い出された。したがって、
予想されるタンパク質は、８８９個のアミノ酸からな
り、そのＭr の計算値は約９９，７６９である。推定さ
れるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸１８個の
シグナルペプチドが存在するとみられ、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne, Nucl.
Acids Res. 14, 4683 (1986)］。 したがって、このタン
パク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられ
る。６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメイ
ンに存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガ
ンドゲーティングイオンチャンネル、ニコチン酸アセチ
ルコリン受容体、ＧＡＢＡA 受容体およびグリシン受容
体との配列の比較によれば、全体的な相同性は余りない
ことが分かる。
１９にサブクローニングして、配列を決定した（図１〜
６）。２７２１ｂｐのオープンリーディングフレーム
が、全長２９９２ｂｐ中に見い出された。したがって、
予想されるタンパク質は、８８９個のアミノ酸からな
り、そのＭr の計算値は約９９，７６９である。推定さ
れるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸１８個の
シグナルペプチドが存在するとみられ、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne, Nucl.
Acids Res. 14, 4683 (1986)］。 したがって、このタン
パク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられ
る。６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメイ
ンに存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガ
ンドゲーティングイオンチャンネル、ニコチン酸アセチ
ルコリン受容体、ＧＡＢＡA 受容体およびグリシン受容
体との配列の比較によれば、全体的な相同性は余りない
ことが分かる。
【００８６】この開示に先立って配列決定されたすべて
のリガンドゲーティングイオンチャンネルのサブユニッ
トには、１つの細胞外の保存領域があり、その特徴はア
ミノ酸１４個によって互いに隔てられたシステイン残基
２個が存在することである。そして、保存されたプロリ
ンおよびアスパルテート残基が、これらシステイン２残
基の１番目から下流へそれぞれアミノ酸８個および１０
個目に位置している［Barnard et al., Trends Neurosc
i. 10, 502 (1987) ］。 神経伝達物質受容体−イオンチ
ャンネル複合体に関するこの仮説的特徴は、ＧｌｕＲ１
によってコードされたタンパク質での保存性がよくない
ことである。上記のプロリンおよびアスパルテート残基
は存在するが、第１のシステイン残基はプロリン残基か
ら７残基上流に位置するが、第２のシステイン残基は存
在しない。
のリガンドゲーティングイオンチャンネルのサブユニッ
トには、１つの細胞外の保存領域があり、その特徴はア
ミノ酸１４個によって互いに隔てられたシステイン残基
２個が存在することである。そして、保存されたプロリ
ンおよびアスパルテート残基が、これらシステイン２残
基の１番目から下流へそれぞれアミノ酸８個および１０
個目に位置している［Barnard et al., Trends Neurosc
i. 10, 502 (1987) ］。 神経伝達物質受容体−イオンチ
ャンネル複合体に関するこの仮説的特徴は、ＧｌｕＲ１
によってコードされたタンパク質での保存性がよくない
ことである。上記のプロリンおよびアスパルテート残基
は存在するが、第１のシステイン残基はプロリン残基か
ら７残基上流に位置するが、第２のシステイン残基は存
在しない。
【００８７】ＧｌｕＲ１のヒドロパシ(hydropathy)プロ
ット解析によれば、トランスメンブランドメイン（ＴＭ
Ｄ）の候補となる幾つかの領域が分かる。アミノ酸残基
４５５番目と８１０番目との間の領域は、そのヒドロパ
シ(hydropathy)プロフィルが他のリガンドゲーティング
イオンチャンネルにみられるものと類似しているため、
顕著である。すなわち、３つの近接して位置する仮定的
ＴＭＤは、このタンパク質のＣ末端に近い４番目の仮定
的ＴＭＤから約１７５個のアミノ酸残基によって隔てら
れている。この領域内で以下の４つのトランスメンブラ
ン領域がＧｌｕＲ１中に配置している。ＴＭＤ１（アミ
ノ酸残基４６３番目と４８０番目との間に配置）、ＴＭ
Ｄ２（アミノ酸残基５２１番目と５３９番目との間に配
置）、ＴＭＤ３（アミノ酸残基５９６番目と６１４番目
との間に配置）、およびＴＭＤ４（アミノ酸残基７８８
番目と８０８番目との間に配置）。
ット解析によれば、トランスメンブランドメイン（ＴＭ
Ｄ）の候補となる幾つかの領域が分かる。アミノ酸残基
４５５番目と８１０番目との間の領域は、そのヒドロパ
シ(hydropathy)プロフィルが他のリガンドゲーティング
イオンチャンネルにみられるものと類似しているため、
顕著である。すなわち、３つの近接して位置する仮定的
ＴＭＤは、このタンパク質のＣ末端に近い４番目の仮定
的ＴＭＤから約１７５個のアミノ酸残基によって隔てら
れている。この領域内で以下の４つのトランスメンブラ
ン領域がＧｌｕＲ１中に配置している。ＴＭＤ１（アミ
ノ酸残基４６３番目と４８０番目との間に配置）、ＴＭ
Ｄ２（アミノ酸残基５２１番目と５３９番目との間に配
置）、ＴＭＤ３（アミノ酸残基５９６番目と６１４番目
との間に配置）、およびＴＭＤ４（アミノ酸残基７８８
番目と８０８番目との間に配置）。
【００８８】実施例８ ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の分離および特徴決定 ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子をコードするｃＤＮ
Ａクローンを、弱い緊縮ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングプロトコール（実施例２参照）を使って、親ラ
ットの前脳ライブラリーから分離し、プローブとしてＧ
ｌｕＲ１ｃＤＮＡの放射能標識断片を分離した。図９〜
１４および１５〜２０は、クローンλＲＢ１４（Ｇｌｕ
Ｒ２）およびλＲＢ３１２（ＧｌｕＲ３）のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を示す。ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値は、それ
ぞれ９６，０００ダルトン（８６２個のアミノ酸）およ
び９８，０００ダルトン（８６６個のアミノ酸）であ
る。潜在的なＮグリコシル化部位は、ＧｌｕＲ２タンパ
ク質中ではＡｓｎ２３５、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３８
５、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ８３５にあり、ＧｌｕＲ
３タンパク質中では、Ａｓｎ３５、Ａｓｎ２３８、Ａｓ
ｎ３５２、Ａｓｎ３８７およびＡｓｎ３９４にある。Ｇ
ｌｕＲ１と同様に、ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３との両者の
疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領域が分
かる。こういった１つのドメインは、各タンパク質のア
ミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴をもつ一
方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜ヘリック
ス（ＭＳＲ Ｉ〜ＩＶ）を形成し、各ポリペプチドのカ
ルボキシ末端側半分に位置する。
Ａクローンを、弱い緊縮ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングプロトコール（実施例２参照）を使って、親ラ
ットの前脳ライブラリーから分離し、プローブとしてＧ
ｌｕＲ１ｃＤＮＡの放射能標識断片を分離した。図９〜
１４および１５〜２０は、クローンλＲＢ１４（Ｇｌｕ
Ｒ２）およびλＲＢ３１２（ＧｌｕＲ３）のヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を示す。ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値は、それ
ぞれ９６，０００ダルトン（８６２個のアミノ酸）およ
び９８，０００ダルトン（８６６個のアミノ酸）であ
る。潜在的なＮグリコシル化部位は、ＧｌｕＲ２タンパ
ク質中ではＡｓｎ２３５、Ａｓｎ３４９、Ａｓｎ３８
５、Ａｓｎ３９２およびＡｓｎ８３５にあり、ＧｌｕＲ
３タンパク質中では、Ａｓｎ３５、Ａｓｎ２３８、Ａｓ
ｎ３５２、Ａｓｎ３８７およびＡｓｎ３９４にある。Ｇ
ｌｕＲ１と同様に、ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３との両者の
疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領域が分
かる。こういった１つのドメインは、各タンパク質のア
ミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴をもつ一
方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜ヘリック
ス（ＭＳＲ Ｉ〜ＩＶ）を形成し、各ポリペプチドのカ
ルボキシ末端側半分に位置する。
【００８９】図２１〜２４は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２
およびＧｌｕＲ３（ならびにＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５）遺伝子によってコードされたタンパク質の推定アミ
ノ酸配列を示す。配列が示すように、ＧｌｕＲ１とＧｌ
ｕＲ２間（７０％）、およびＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３間
（６９％）、ならびにＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３間（７４
％）で有意な配列の同一性が認められる（表３も参
照）。配列の同一性は、各タンパク質のカルボキシ末端
側半分において最も顕著である。
およびＧｌｕＲ３（ならびにＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５）遺伝子によってコードされたタンパク質の推定アミ
ノ酸配列を示す。配列が示すように、ＧｌｕＲ１とＧｌ
ｕＲ２間（７０％）、およびＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３間
（６９％）、ならびにＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３間（７４
％）で有意な配列の同一性が認められる（表３も参
照）。配列の同一性は、各タンパク質のカルボキシ末端
側半分において最も顕著である。
【００９０】実施例９ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の電気生理学
的比較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３によってコー
ドされるタンパク質間に高い類似性の見られることは、
ＧｌｕＲ１の場合と同様に、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ
３タンパク質がアフリカツメガエルの卵母細胞中でモホ
のカイネート感受性イオンチャンネルとして機能する示
唆を与えた。この仮説を調べるために、卵母細胞に、イ
ンビトロで合成したＲＮＡ転写物（各ｃＤＮＡクローン
由来）を注入した。図２５は、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３が、１００μM ＫＡのバッチ中投与に対する応答で
脱分極することを示している。
的比較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３によってコー
ドされるタンパク質間に高い類似性の見られることは、
ＧｌｕＲ１の場合と同様に、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ
３タンパク質がアフリカツメガエルの卵母細胞中でモホ
のカイネート感受性イオンチャンネルとして機能する示
唆を与えた。この仮説を調べるために、卵母細胞に、イ
ンビトロで合成したＲＮＡ転写物（各ｃＤＮＡクローン
由来）を注入した。図２５は、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕ
Ｒ３が、１００μM ＫＡのバッチ中投与に対する応答で
脱分極することを示している。
【００９１】ＫＡ応答の大きさは、３種のグルタメート
受容体サブユニトに関して等価ではなかった。注入ＲＮ
Ａが当量（２ng）である場合、ＧｌｕＲ３ＲＮＡ注入卵
母細胞での応答は、ＧｌｕＲ１応答より常に大きかっ
た。ＧｌｕＲ２注入卵母細胞でのＫＡ誘発脱分極は、も
っとも弱く、さらに大量のＲＮＡ（１０〜２５ng）を注
入した卵母細胞で検出可能となるだけであった。
受容体サブユニトに関して等価ではなかった。注入ＲＮ
Ａが当量（２ng）である場合、ＧｌｕＲ３ＲＮＡ注入卵
母細胞での応答は、ＧｌｕＲ１応答より常に大きかっ
た。ＧｌｕＲ２注入卵母細胞でのＫＡ誘発脱分極は、も
っとも弱く、さらに大量のＲＮＡ（１０〜２５ng）を注
入した卵母細胞で検出可能となるだけであった。
【００９２】図２６でのデータは、ＫＡの他に、Ｇｌｕ
Ｒ１またはＧｌｕＲ３を注入された卵母細胞がＱＵＩＳ
（１０μM ）、ＡＭＰＡ（５０μM ）、グルタメート
（ＧＬＵ、１００μM ）にも応答することを示してい
る。検出可能な応答は、ＮＭＤＡ（３０μM ＋１０μM
グリシン）またはＡＰＢ（５０μM ）では得られなかっ
た。ＧｌｕＲ２を注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量を行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。ＧｌｕＲ１注入の卵母細胞では、ＡＭＰＡ
およびＱＵＩＳに対する応答は一般に、ＫＡ応答の最大
値の３５〜４０％であったが、ＧｌｕＲ３ではＫＡ応答
の約１０％であった。ＫＡに対して、ドモ酸（ＤＯＭ、
１００μM ）へのＧｌｕＲ１応答は、ＧｌｕＲ３で見ら
れるものより約６倍大きい。全体的にみれば、これらの
データは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３サブユニットか
ら会合した受容体は薬理学的に異なっていることを示
す。さらに、効率は低下しているものの、ホモのＧｌｕ
Ｒ１およびＧｌｕＲ３受容体がＱＵＩＳとＡＭＰＡの両
者に応答するという観察結果から、ＫＡ、ＱＵＩＳおよ
びＡＭＰＡが同一のグルタメート受容体ポリペプチドに
結合し得る直接の証拠が得られる。
Ｒ１またはＧｌｕＲ３を注入された卵母細胞がＱＵＩＳ
（１０μM ）、ＡＭＰＡ（５０μM ）、グルタメート
（ＧＬＵ、１００μM ）にも応答することを示してい
る。検出可能な応答は、ＮＭＤＡ（３０μM ＋１０μM
グリシン）またはＡＰＢ（５０μM ）では得られなかっ
た。ＧｌｕＲ２を注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量を行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。ＧｌｕＲ１注入の卵母細胞では、ＡＭＰＡ
およびＱＵＩＳに対する応答は一般に、ＫＡ応答の最大
値の３５〜４０％であったが、ＧｌｕＲ３ではＫＡ応答
の約１０％であった。ＫＡに対して、ドモ酸（ＤＯＭ、
１００μM ）へのＧｌｕＲ１応答は、ＧｌｕＲ３で見ら
れるものより約６倍大きい。全体的にみれば、これらの
データは、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３サブユニットか
ら会合した受容体は薬理学的に異なっていることを示
す。さらに、効率は低下しているものの、ホモのＧｌｕ
Ｒ１およびＧｌｕＲ３受容体がＱＵＩＳとＡＭＰＡの両
者に応答するという観察結果から、ＫＡ、ＱＵＩＳおよ
びＡＭＰＡが同一のグルタメート受容体ポリペプチドに
結合し得る直接の証拠が得られる。
【００９３】また、図２５、２６は、ＧｌｕＲ１または
ＧｌｕＲ３サブユニットＲＮＡを注入した卵母細胞の薬
理学的プロフィールがラット前脳海馬のポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡを注入した卵母細胞で見られるものと有意に異なる
ことを示す。この所見は、海馬ＲＮＡを注入した卵母細
胞で見られる応答が、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧ
ｌｕＲ３サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせ体から会合したヘテログルタメート受容体によって
媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３種す
べてのＧｌｕＲサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
ＧｌｕＲ３サブユニットＲＮＡを注入した卵母細胞の薬
理学的プロフィールがラット前脳海馬のポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡを注入した卵母細胞で見られるものと有意に異なる
ことを示す。この所見は、海馬ＲＮＡを注入した卵母細
胞で見られる応答が、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧ
ｌｕＲ３サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせ体から会合したヘテログルタメート受容体によって
媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３種す
べてのＧｌｕＲサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
【００９４】実施例１０ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３の薬理学的比
較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット
遺伝子によってコードされたタンパク質の混合物から会
合したグルタメート受容体が、それぞれ互いに、または
単一サブユニット受容体で観察されるものとは有意に異
なる薬理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例
で解説する。
較 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット
遺伝子によってコードされたタンパク質の混合物から会
合したグルタメート受容体が、それぞれ互いに、または
単一サブユニット受容体で観察されるものとは有意に異
なる薬理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例
で解説する。
【００９５】図２５および２６でのデータの比較によっ
て、被験アゴニストでは、薬理学の面で実質的な差異が
ほとんどないことが示唆される。しかし、ＧｌｕＲ１に
比較して、ＱＵＩＳ、ＡＭＰＡおよびＧＬＵへの応答
は、サブユニットの組み合わせ体を発現する卵母細胞中
で有意に低下している。ＮＭＤＡ応答を例外として、Ｇ
ｌｕＲサブユニット組み合わせ体を注入した卵母細胞で
の全アゴニストプロフィールは、ＧｌｕＲ１またはＧｌ
ｕＲ３サブユニットＲＮＡのみを注入した卵母細胞より
も、海馬ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを含む卵母細胞に類似して
いる。
て、被験アゴニストでは、薬理学の面で実質的な差異が
ほとんどないことが示唆される。しかし、ＧｌｕＲ１に
比較して、ＱＵＩＳ、ＡＭＰＡおよびＧＬＵへの応答
は、サブユニットの組み合わせ体を発現する卵母細胞中
で有意に低下している。ＮＭＤＡ応答を例外として、Ｇ
ｌｕＲサブユニット組み合わせ体を注入した卵母細胞で
の全アゴニストプロフィールは、ＧｌｕＲ１またはＧｌ
ｕＲ３サブユニットＲＮＡのみを注入した卵母細胞より
も、海馬ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを含む卵母細胞に類似して
いる。
【００９６】実施例１１ ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３から記録され
たＫＡ誘起電流の比較図２７、２８は、ＧｌｕＲ１、Ｇ
ｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニットの混合物を注入
した卵母細胞から記録されたＫＡ誘起電流（斑点カラ
ム）と、個々のサブユニットに対して測定された総電流
（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な所見
は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２サブユニットを両方発現す
る卵母細胞でのＫＡ誘起電流の有意な増大（１回注入し
た卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、または
ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３サブユニットの場合（約２倍の
増大）である。３種類すべてのサブユニットＲＮＡの注
入の結果は、ＫＡ誘起電流の平均２．５倍の増大とな
る。
たＫＡ誘起電流の比較図２７、２８は、ＧｌｕＲ１、Ｇ
ｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニットの混合物を注入
した卵母細胞から記録されたＫＡ誘起電流（斑点カラ
ム）と、個々のサブユニットに対して測定された総電流
（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な所見
は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２サブユニットを両方発現す
る卵母細胞でのＫＡ誘起電流の有意な増大（１回注入し
た卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、または
ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ３サブユニットの場合（約２倍の
増大）である。３種類すべてのサブユニットＲＮＡの注
入の結果は、ＫＡ誘起電流の平均２．５倍の増大とな
る。
【００９７】これらの結果は、卵母細胞中では、個々の
グルタメート受容体サブユニットのポリペプチドが、そ
れぞれ独立した単純な様式で機能するのではなく、互い
に相互作用するという結論を裏付けるものである。こう
いった相互作用の結果、単一のグルタメート受容体のサ
ブユニットからなる受容体とは異なる性質を有するヘテ
ログルタメート受容体が産生される。
グルタメート受容体サブユニットのポリペプチドが、そ
れぞれ独立した単純な様式で機能するのではなく、互い
に相互作用するという結論を裏付けるものである。こう
いった相互作用の結果、単一のグルタメート受容体のサ
ブユニットからなる受容体とは異なる性質を有するヘテ
ログルタメート受容体が産生される。
【００９８】実施例１２ ＫＡ誘起応答に関する電流−電圧の関係 この実施例では、個々のＧｌｕＲのサブユニット、それ
らの組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定したＫＡ誘起応答に関して、電
流−電圧（Ｉ／Ｖ）の関係を調べる。
らの組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定したＫＡ誘起応答に関して、電
流−電圧（Ｉ／Ｖ）の関係を調べる。
【００９９】Ｉ／Ｖデータを図２９〜３１に示す。この
図では、個々のグルタメート受容体サブユニットのＲＮ
Ａを注入した卵母細胞をパネルＡに、サブユニットの組
み合わせ体を注入した卵母細胞をパネルＢおよびＣに示
し、海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを発現する卵母細胞を比
較のためにパネルＡに示す。脳のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定されたＫＡ応答は、約−１０mV
の反転電圧とほぼ線形Ｉ／Ｖの関係を示す。この結果
は、単一のＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３のサブユニット
ＲＮＡを注入した卵母細胞で得られたＩ／Ｖ曲線とは著
しく対照的である。ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ３は、強
い内向きの整流および約−４０mVの反転電圧を示す。こ
れらのデータから、海馬ＲＮＡを注入した卵母細胞に存
在するＫＡ感受性受容体は、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ
３サブユニットのＲＮＡを注入した卵母細胞によって会
合されたものとは異なるのは明らかである。
図では、個々のグルタメート受容体サブユニットのＲＮ
Ａを注入した卵母細胞をパネルＡに、サブユニットの組
み合わせ体を注入した卵母細胞をパネルＢおよびＣに示
し、海馬のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを発現する卵母細胞を比
較のためにパネルＡに示す。脳のポリ（Ａ）+ ＲＮＡを
注入した卵母細胞で測定されたＫＡ応答は、約−１０mV
の反転電圧とほぼ線形Ｉ／Ｖの関係を示す。この結果
は、単一のＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ３のサブユニット
ＲＮＡを注入した卵母細胞で得られたＩ／Ｖ曲線とは著
しく対照的である。ＧｌｕＲ１およびＧｌｕＲ３は、強
い内向きの整流および約−４０mVの反転電圧を示す。こ
れらのデータから、海馬ＲＮＡを注入した卵母細胞に存
在するＫＡ感受性受容体は、ＧｌｕＲ１またはＧｌｕＲ
３サブユニットのＲＮＡを注入した卵母細胞によって会
合されたものとは異なるのは明らかである。
【０１００】図３０では、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体に関するＩ／Ｖ曲線がＧｌｕＲ１サブユニッ
ト単独で観察されるものとは顕著に異なっている。この
対のＲＮＡを注入した卵母細胞は、ほぼ線形のＩ／Ｖプ
ロットを示し、約−１０mVの反転電位を有する。このプ
ロットは、海馬のＲＮＡを注入した卵母細胞で見られる
ものと非常に類似している（パネルＡ）。対照的に、Ｇ
ｌｕＲ１とＧｌｕＲ３の組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線は、
個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定される
ものとは僅かに異なっている。図３１は、ＧｌｕＲ２と
ＧｌｕＲ３サブユニットの組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線で
いくらか内向の整流がみられること、およびＧｌｕＲ１
＋ＧｌｕＲ２または海馬ＲＮＡのＩ／Ｖ曲線で決定され
た反転電圧（−１０mV）より若干大きい負（−２０mV）
の反転電圧が生じることが示されている。これら３つの
グルタメート受容体サブユニットのＲＮＡが単一の卵母
細胞で組み合わされとき、得られたＩ／Ｖ曲線は、反転
電圧と勾配の両面でＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組み合わ
せ体でみられるＩ／Ｖ曲線と近似しているが、これらの
サブユニットとの応答は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を示
す。
み合わせ体に関するＩ／Ｖ曲線がＧｌｕＲ１サブユニッ
ト単独で観察されるものとは顕著に異なっている。この
対のＲＮＡを注入した卵母細胞は、ほぼ線形のＩ／Ｖプ
ロットを示し、約−１０mVの反転電位を有する。このプ
ロットは、海馬のＲＮＡを注入した卵母細胞で見られる
ものと非常に類似している（パネルＡ）。対照的に、Ｇ
ｌｕＲ１とＧｌｕＲ３の組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線は、
個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定される
ものとは僅かに異なっている。図３１は、ＧｌｕＲ２と
ＧｌｕＲ３サブユニットの組み合わせ体のＩ／Ｖ曲線で
いくらか内向の整流がみられること、およびＧｌｕＲ１
＋ＧｌｕＲ２または海馬ＲＮＡのＩ／Ｖ曲線で決定され
た反転電圧（−１０mV）より若干大きい負（−２０mV）
の反転電圧が生じることが示されている。これら３つの
グルタメート受容体サブユニットのＲＮＡが単一の卵母
細胞で組み合わされとき、得られたＩ／Ｖ曲線は、反転
電圧と勾配の両面でＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組み合わ
せ体でみられるＩ／Ｖ曲線と近似しているが、これらの
サブユニットとの応答は、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ２の組
み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を示
す。
【０１０１】実施例１３ 哺乳動物の中枢神経系におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２
およびＧｌｕＲ３のｍＲＮＡの分布 インビボでヘテログルタメート受容体を形成するＧｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子の会合体は、
個々のサブユニットの遺伝子が異なった神経解剖学的部
位で転写されることを示せば証明され得る。したがっ
て、親ラットの脳におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およ
びＧｌｕＲ３のＲＮＡの分布を、標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブおよび基本的には文献［Deneris et al., J.
Biol. Chem. 264, 6268 (1989) ］に記載されているよ
うな、in situ でのハイブリダイゼーション組織化学を
用いて調べた。この結果は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２お
よびＧｌｕＲ３プローブで得られたハイブリダイゼーシ
ョンパターンが、海馬および歯状回のＣＡ１−ＣＡ３領
域で認められる強いハイブリダイゼーションとほぼ一致
していたことを表していた。これらの領域の高分解能解
析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、ＣＡ１−
ＣＡ３領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どか全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、ＧｌｕＲ
１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット遺伝子の
全発現パターンは実質的に一致していた。
およびＧｌｕＲ３のｍＲＮＡの分布 インビボでヘテログルタメート受容体を形成するＧｌｕ
Ｒ１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３遺伝子の会合体は、
個々のサブユニットの遺伝子が異なった神経解剖学的部
位で転写されることを示せば証明され得る。したがっ
て、親ラットの脳におけるＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２およ
びＧｌｕＲ３のＲＮＡの分布を、標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブおよび基本的には文献［Deneris et al., J.
Biol. Chem. 264, 6268 (1989) ］に記載されているよ
うな、in situ でのハイブリダイゼーション組織化学を
用いて調べた。この結果は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２お
よびＧｌｕＲ３プローブで得られたハイブリダイゼーシ
ョンパターンが、海馬および歯状回のＣＡ１−ＣＡ３領
域で認められる強いハイブリダイゼーションとほぼ一致
していたことを表していた。これらの領域の高分解能解
析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、ＣＡ１−
ＣＡ３領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どか全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、ＧｌｕＲ
１、ＧｌｕＲ２およびＧｌｕＲ３サブユニット遺伝子の
全発現パターンは実質的に一致していた。
【０１０２】実施例１４ ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５のｃＤＮＡの分離 プローブとしてＧｌｕＲ２ｃＤＮＡの断片（ヌクレオチ
ド１７９３−２２４０）を用い、弱い緊縮ハイブリダイ
ゼーションプロトコールによって、数個のＧｌｕＲ４お
よびＲ５クローンをラットの前脳ライブラリーから分離
した。配列解析によって、これらｃＤＮＡクローンのど
れもが全オープンリーディングフレームを含まないこと
が示された。異なった親ラットの前脳組織からのｍＲＮ
Ａを用いたノーザン法から、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５転写物が小脳で最も豊富であることが示された。続い
て、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｃＤＮＡクローンの一
部を強い緊縮スクリーニング条件下でプローブとして使
用して、親ラットの小脳のｃＤＮＡライブラリーから大
きなオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。
ド１７９３−２２４０）を用い、弱い緊縮ハイブリダイ
ゼーションプロトコールによって、数個のＧｌｕＲ４お
よびＲ５クローンをラットの前脳ライブラリーから分離
した。配列解析によって、これらｃＤＮＡクローンのど
れもが全オープンリーディングフレームを含まないこと
が示された。異なった親ラットの前脳組織からのｍＲＮ
Ａを用いたノーザン法から、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ
５転写物が小脳で最も豊富であることが示された。続い
て、ＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｃＤＮＡクローンの一
部を強い緊縮スクリーニング条件下でプローブとして使
用して、親ラットの小脳のｃＤＮＡライブラリーから大
きなオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。
【０１０３】こうして分離されたｃＤＮＡクローンの中
で、２つのＧｌｕＲ４関連クローン（λＣＥＲ１１２お
よびλＣＥＲ１２１Ｂ）は、ＧｌｕＲ４遺伝子の一部だ
けをコードしていたが、ｐＢＳ ＳＫ（＋）ベクター
（Stratagene Cloning Systems）での完全な長さの発現
可能な構造体を加工するに十分な重複はもっていなかっ
た。このＧｌｕＲ４構造体のヌクレオチド配列は、ｐＫ
４５と命名され、配列決定されたので、その推定アミノ
酸配列を図３２〜３５に示す。
で、２つのＧｌｕＲ４関連クローン（λＣＥＲ１１２お
よびλＣＥＲ１２１Ｂ）は、ＧｌｕＲ４遺伝子の一部だ
けをコードしていたが、ｐＢＳ ＳＫ（＋）ベクター
（Stratagene Cloning Systems）での完全な長さの発現
可能な構造体を加工するに十分な重複はもっていなかっ
た。このＧｌｕＲ４構造体のヌクレオチド配列は、ｐＫ
４５と命名され、配列決定されたので、その推定アミノ
酸配列を図３２〜３５に示す。
【０１０４】小脳ライブラリーから分離した２９個のＧ
ｌｕＲ５関連ｃＤＮＡの中で、同一の大きなオープンリ
ーディングフレームをコードする３つのクローン（λＲ
Ｂ１２、λＲＢ１５およびλＲＢ２０）を同定した。ｃ
ＤＮＡクローンλＲＢ２０（ＧｌｕＲ５−１）の配列を
図３６〜４３に示す。λＲＢ１５およびλＲＢ１２は、
５’末端のところがλＲＢ２０より短かった。λＲＢ２
０ｃＤＮＡは、１８７ｋｂの５’末端非翻訳領域、２７
６０ｂｐの連続オープンリーディングフレーム、および
３０３ｂｐの３’末端非翻訳領域からなる。この５’末
端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴である配列ＡＡＧ
ＡＴＧＧで終わっている。
ｌｕＲ５関連ｃＤＮＡの中で、同一の大きなオープンリ
ーディングフレームをコードする３つのクローン（λＲ
Ｂ１２、λＲＢ１５およびλＲＢ２０）を同定した。ｃ
ＤＮＡクローンλＲＢ２０（ＧｌｕＲ５−１）の配列を
図３６〜４３に示す。λＲＢ１５およびλＲＢ１２は、
５’末端のところがλＲＢ２０より短かった。λＲＢ２
０ｃＤＮＡは、１８７ｋｂの５’末端非翻訳領域、２７
６０ｂｐの連続オープンリーディングフレーム、および
３０３ｂｐの３’末端非翻訳領域からなる。この５’末
端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴である配列ＡＡＧ
ＡＴＧＧで終わっている。
【０１０５】前脳ライブラリーを起源として分離された
更に３つのｃＤＮＡクローンも調べた。これらｃＤＮＡ
の配列は、予想翻訳開始領域部位でλＲＢ２０と同一で
ある。配列決定によって、ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの２つの
変異体が前脳および小脳ライブラリーに現れることが分
かった。この異質性はλＲＢ２０にみられる４５ヌクレ
オチドの挿入に由来し、２９個のＧｌｕＲ５関連ｃＤＮ
Ａクローンのうち１７個が分離された（図３６〜４
３）。この挿入によって、上記のオープンリーディング
フレームは断絶されない。さらに、共通のスプライスド
ナーおよびアクセプター部位は存在しない［Breathnach
and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (198
1) ］。これは、その挿入がスプライスされないイント
ロンから生じるのではなく、別のスプライス現象の結果
である可能性が高いことを示唆するものである。ヌクレ
オチド配列の解析は、２つのＧｌｕＲ５変異体が他の点
では同一であることを示す。
更に３つのｃＤＮＡクローンも調べた。これらｃＤＮＡ
の配列は、予想翻訳開始領域部位でλＲＢ２０と同一で
ある。配列決定によって、ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの２つの
変異体が前脳および小脳ライブラリーに現れることが分
かった。この異質性はλＲＢ２０にみられる４５ヌクレ
オチドの挿入に由来し、２９個のＧｌｕＲ５関連ｃＤＮ
Ａクローンのうち１７個が分離された（図３６〜４
３）。この挿入によって、上記のオープンリーディング
フレームは断絶されない。さらに、共通のスプライスド
ナーおよびアクセプター部位は存在しない［Breathnach
and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (198
1) ］。これは、その挿入がスプライスされないイント
ロンから生じるのではなく、別のスプライス現象の結果
である可能性が高いことを示唆するものである。ヌクレ
オチド配列の解析は、２つのＧｌｕＲ５変異体が他の点
では同一であることを示す。
【０１０６】全オープンリーディングフレームをコード
する短いスプライス変異体を調べるためのｃＤＮＡクロ
ーンは見い出されていない。したがって、λＲＢ２０
（ＧｌｕＲ５−１）に見られる４５個のヌクレオチドの
挿入片を欠いているが、他の点ではそのクローンと同一
のクローン（λＲＢ△２０）が構成された。この短いス
プライス変異体クローン（λＲＢ△２０）をＧｌｕＲ５
−２と称する。λＲＢ２０とλＲＢ△２０の双方はアフ
リカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され（実
施例１６参照）、コードされた変異体タンパクをＧｌｕ
Ｒ５−１およびＧｌｕＲ５−２とそれぞれ命名した。
する短いスプライス変異体を調べるためのｃＤＮＡクロ
ーンは見い出されていない。したがって、λＲＢ２０
（ＧｌｕＲ５−１）に見られる４５個のヌクレオチドの
挿入片を欠いているが、他の点ではそのクローンと同一
のクローン（λＲＢ△２０）が構成された。この短いス
プライス変異体クローン（λＲＢ△２０）をＧｌｕＲ５
−２と称する。λＲＢ２０とλＲＢ△２０の双方はアフ
リカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され（実
施例１６参照）、コードされた変異体タンパクをＧｌｕ
Ｒ５−１およびＧｌｕＲ５−２とそれぞれ命名した。
【０１０７】ＧｌｕＲ４ｍＲＮＡは、４．５ｋｂの１種
として、小脳ＲＮＡをノーザン法にかけて検出されたも
のである。よりサイズの小さいこのｍＲＮＡは、スプラ
イス変異体を表すこともある。ノーザン法解析によっ
て、主要なＧｌｕＲ５ｍＲＮＡは６キロベースのサイズ
を有することも示された。
として、小脳ＲＮＡをノーザン法にかけて検出されたも
のである。よりサイズの小さいこのｍＲＮＡは、スプラ
イス変異体を表すこともある。ノーザン法解析によっ
て、主要なＧｌｕＲ５ｍＲＮＡは６キロベースのサイズ
を有することも示された。
【０１０８】実施例１５ ＧｌｕＲ５ｃＤＮＡおよびタンパク質の構造的特徴 ＧｌｕＲ５−１のｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳か
ら、９２０アミノ酸残基からなる単一の長いオープンリ
ーディングフレームの存在が予期される（図３６〜４
３）。ＧｌｕＲ５の配列には、全体的アミノ酸配列の点
で各ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと同一性がある（図２
１〜２４および表３）。ＧｌｕＲ５−１におけるこの１
５個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中でも独
特であるので、短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、特徴
の明らかなＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットの対応物であ
る。表３は、ＧｌｕＲ５がこれまで同定された中で最も
類似性の低いグルタメート受容体サブユニットであり、
ＧｌｕＲ５とＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットとの比較は最
も保存的配列の要素を明らかにすることを示す（図２１
〜２４）。他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
群、神経伝達物質のアセチルコリン受容体およびＧＡＢ
ＡＡ 受容体およびグリシン受容体群の中では、Ｎ末端
細胞外ドメインが最も保存されているが、Ｃ末端配列は
経膜領域（ＭＳＲ）III とIVとの間で変異している。グ
ルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、対照的
に、提唱されたＭＳＲＩ［Hollmann, et al., Nature 3
42, 643 (1989)］のＮ末端領域にはわずか１７％の同一
性しかなく、４５％の同一性があるＭＳＲＩのＣ末端領
域よりも類似していない。リガンドゲーティング神経伝
達物質の受容体チャンネル複合体［Barnard, et al., T
rends Neurosci. 10, 502 (1987)］の特徴である「 Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓループ」は、グルタメート受容体サブユニッ
ト群中には保存されていない（図２１〜２４）。グルタ
メート受容体サブユニットの半分のＣ末端側は、チャン
ネル形成に関与していることが示唆され、仮定された経
膜ヘリックス（ＭＳＲ I〜IV、図２１〜２４）［Hollma
nn, et al., Natuer 342, 643 (1989)］を含む。 推定さ
れたＭＳＲIII は、最も保存された連続配列であって、
ＧｌｕＲ５タンパク質中で唯一の保存的アミノ酸置換
（ＶａｌからＩｌｅ）を有する。上記のように、他のリ
ガンドゲーテッドチャンネル群で、ＭＳＲIII とIVとの
間のセグメントは長さおよび配列の点で変異している。
グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定された
セグメントの類似性は高く（４８％）、ＧｌｕＲ５だけ
が配列の長さの変異を示す。ＫＡ／ＡＭＰＡ受容体およ
びＧｌｕＲ５タンパク質は一般に、提唱されたＭＳＲIV
のＣ末端が変異している。
ら、９２０アミノ酸残基からなる単一の長いオープンリ
ーディングフレームの存在が予期される（図３６〜４
３）。ＧｌｕＲ５の配列には、全体的アミノ酸配列の点
で各ＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットと同一性がある（図２
１〜２４および表３）。ＧｌｕＲ５−１におけるこの１
５個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中でも独
特であるので、短い方のＧｌｕＲ５−２変異体は、特徴
の明らかなＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットの対応物であ
る。表３は、ＧｌｕＲ５がこれまで同定された中で最も
類似性の低いグルタメート受容体サブユニットであり、
ＧｌｕＲ５とＫＡ／ＡＭＰＡサブユニットとの比較は最
も保存的配列の要素を明らかにすることを示す（図２１
〜２４）。他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
群、神経伝達物質のアセチルコリン受容体およびＧＡＢ
ＡＡ 受容体およびグリシン受容体群の中では、Ｎ末端
細胞外ドメインが最も保存されているが、Ｃ末端配列は
経膜領域（ＭＳＲ）III とIVとの間で変異している。グ
ルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、対照的
に、提唱されたＭＳＲＩ［Hollmann, et al., Nature 3
42, 643 (1989)］のＮ末端領域にはわずか１７％の同一
性しかなく、４５％の同一性があるＭＳＲＩのＣ末端領
域よりも類似していない。リガンドゲーティング神経伝
達物質の受容体チャンネル複合体［Barnard, et al., T
rends Neurosci. 10, 502 (1987)］の特徴である「 Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓループ」は、グルタメート受容体サブユニッ
ト群中には保存されていない（図２１〜２４）。グルタ
メート受容体サブユニットの半分のＣ末端側は、チャン
ネル形成に関与していることが示唆され、仮定された経
膜ヘリックス（ＭＳＲ I〜IV、図２１〜２４）［Hollma
nn, et al., Natuer 342, 643 (1989)］を含む。 推定さ
れたＭＳＲIII は、最も保存された連続配列であって、
ＧｌｕＲ５タンパク質中で唯一の保存的アミノ酸置換
（ＶａｌからＩｌｅ）を有する。上記のように、他のリ
ガンドゲーテッドチャンネル群で、ＭＳＲIII とIVとの
間のセグメントは長さおよび配列の点で変異している。
グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定された
セグメントの類似性は高く（４８％）、ＧｌｕＲ５だけ
が配列の長さの変異を示す。ＫＡ／ＡＭＰＡ受容体およ
びＧｌｕＲ５タンパク質は一般に、提唱されたＭＳＲIV
のＣ末端が変異している。
【０１０９】ＧｌｕＲ５の疎水性プロットは、ＫＡ／Ａ
ＭＰＡ受容体のそれに類似しており、このタンパク質の
提唱されたイオンチャンネル形成部分で保存性の２次構
造が示唆される。しかし、ＧｌｕＲ５のＮ末端側の半分
の疎水性プロットは一般的ではない。この領域では、Ｋ
Ａ／ＡＭＰＡサブユニットと比較した場合、ＧｌｕＲ５
はより疎水性であって、膜を貫通し得るいくつかのセグ
メントを含む。膜付随性のヘリックスを探す計算法に基
づくと、４つ［Rao and Argos, Biochim. Biophys. Act
a 869, 197-214 (1986) ］または７つ［Eisenberg et a
l., J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984) ］の仮定的ト
ランスメンブラン領域がＧｌｕＲ５に付与され得る。
ＭＰＡ受容体のそれに類似しており、このタンパク質の
提唱されたイオンチャンネル形成部分で保存性の２次構
造が示唆される。しかし、ＧｌｕＲ５のＮ末端側の半分
の疎水性プロットは一般的ではない。この領域では、Ｋ
Ａ／ＡＭＰＡサブユニットと比較した場合、ＧｌｕＲ５
はより疎水性であって、膜を貫通し得るいくつかのセグ
メントを含む。膜付随性のヘリックスを探す計算法に基
づくと、４つ［Rao and Argos, Biochim. Biophys. Act
a 869, 197-214 (1986) ］または７つ［Eisenberg et a
l., J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984) ］の仮定的ト
ランスメンブラン領域がＧｌｕＲ５に付与され得る。
【０１１０】５つすべてのグルタメート受容体サブユニ
ットを、カエルのＫＡ結合タンパク質［Gregor, et a
l., Nature 342. 689 (1989)］とニワトリのＫＡ結合タ
ンパク質［Wada et al., Nature 342, 684 (1989) ］で
比較すると、 同じような程度の配列保存性（３５〜４０
％アミノ酸同一性）が示される。ＧｌｕＲ５配列に関す
る、GenBank, EMBL およびSWISS-PROTデーターベースの
FASTA サーチ［Pearsonand Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. 85, 2444 (1988)］により、他のタンパク質との
有意な類似性がないことが示された。
ットを、カエルのＫＡ結合タンパク質［Gregor, et a
l., Nature 342. 689 (1989)］とニワトリのＫＡ結合タ
ンパク質［Wada et al., Nature 342, 684 (1989) ］で
比較すると、 同じような程度の配列保存性（３５〜４０
％アミノ酸同一性）が示される。ＧｌｕＲ５配列に関す
る、GenBank, EMBL およびSWISS-PROTデーターベースの
FASTA サーチ［Pearsonand Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. 85, 2444 (1988)］により、他のタンパク質との
有意な類似性がないことが示された。
【０１１１】実施例１６ Ｌ−グルタメートにさらされたＧｌｕＲ５ｍＲＮＡ注入
卵母細胞の電気生理学的性質 インビトロで合成したＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５
−２ｃＲＮＡをそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞
中で発現させた。いずれのｃＲＮＡについても、グルタ
メート受容体のアゴニストであるＫＡ（１００μM ）、
ＡＭＰＡ（５０μM ）、キスカレート（１０μM ）、Ａ
ＰＢ（１００μM ）およびＮＭＤＡ（１００μM 、１０
μM のグリシンとともに投与）のいずれの投与でも、ｃ
ＲＮＡ注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。しか
し、Ｌ−グルタメート（１００μM ）によって誘起され
た弱い膜の脱分極が、ＧｌｕＲ５−１ｃＲＮＡ（最大脱
分極、３．５mV）およびＧｌｕＲ５−２ｃＲＮＡ（最大
脱分極、４．５mV）を注入した卵母細胞で記録された。
ＧｌｕＲ５−２のみを注入した卵母細胞に比較して、Ｇ
ｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５−２とを同時に注入した卵母
細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意に強い膜の脱
分極は認められなかった。ＧｌｕＲ５−１またはＧｌｕ
Ｒ５−２ｃＲＮＡを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、ＧｌｕＲ５
−１（膜の脱分極、２．２９±０．２６mV s.e.m）では
７個（７個中）の卵母細胞で記録され、ＧｌｕＲ５−２
（２．２７±０．１９mV s.e.m）では２９個（３３個
中）の卵母細胞で記録された。
卵母細胞の電気生理学的性質 インビトロで合成したＧｌｕＲ５−１およびＧｌｕＲ５
−２ｃＲＮＡをそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞
中で発現させた。いずれのｃＲＮＡについても、グルタ
メート受容体のアゴニストであるＫＡ（１００μM ）、
ＡＭＰＡ（５０μM ）、キスカレート（１０μM ）、Ａ
ＰＢ（１００μM ）およびＮＭＤＡ（１００μM 、１０
μM のグリシンとともに投与）のいずれの投与でも、ｃ
ＲＮＡ注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。しか
し、Ｌ−グルタメート（１００μM ）によって誘起され
た弱い膜の脱分極が、ＧｌｕＲ５−１ｃＲＮＡ（最大脱
分極、３．５mV）およびＧｌｕＲ５−２ｃＲＮＡ（最大
脱分極、４．５mV）を注入した卵母細胞で記録された。
ＧｌｕＲ５−２のみを注入した卵母細胞に比較して、Ｇ
ｌｕＲ５−１とＧｌｕＲ５−２とを同時に注入した卵母
細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意に強い膜の脱
分極は認められなかった。ＧｌｕＲ５−１またはＧｌｕ
Ｒ５−２ｃＲＮＡを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、ＧｌｕＲ５
−１（膜の脱分極、２．２９±０．２６mV s.e.m）では
７個（７個中）の卵母細胞で記録され、ＧｌｕＲ５−２
（２．２７±０．１９mV s.e.m）では２９個（３３個
中）の卵母細胞で記録された。
【０１１２】実施例１７ 発生中の中枢および末梢神経系におけるＧｌｕＲ４およ
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝子発現に関する発生面の研究
のために、胚１０日目（Ｅ１０）から誕生２１日目（Ｐ
２１）にかけてマウスの切片をin situ ハイブリダイゼ
ーションおよび組織化学によって解析した。
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝子発現に関する発生面の研究
のために、胚１０日目（Ｅ１０）から誕生２１日目（Ｐ
２１）にかけてマウスの切片をin situ ハイブリダイゼ
ーションおよび組織化学によって解析した。
【０１１３】全ＣＮＳ中で、ＧｌｕＲ４およびＲ５遺伝
子の不鮮明な発現はＥ１０で検出された。これら最初の
ハイブリダイゼーションシグナルは、有糸分裂後のニュ
ーロンに由来する。これは、Ｅ１２では脳髄で最もよく
示される。この上衣層は、神経腔に対面しており、分裂
中の神経芽細胞を含む。これらの細胞ではハイブリダイ
ゼーションは検出できなかった。有糸分裂後の細胞は神
経管の外部に位置し、両方の遺伝子を発現する。発生の
後期に、ＧｌｕＲ５の転写物は、ニューロンが分化して
会合し核となる領域に著しく存在する。程度は低いがＧ
ｌｕＲ４もこの領域に存在する。このハイブリダイゼー
ションパターンの時間的変化は、延髄の主要な感覚核お
よび周囲の構造物よりも強くハイブリダイズする橋の核
においてＧｌｕＲ５で最もよく認められる。Ｅ１４で
は、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、いくつかの別々の脳核
で特に強く、ＧｌｕＲ４遺伝子の発現は、脳の全吻部お
よび尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Ｇｌ
ｕＲ４遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般
に胚後期の段階よりも少量のｍＲＮＡが検出可能であっ
た。対照的に、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、発生の期間
中空間的により制限されるようにみえ、転写物のレベル
は下降調節された。時間的ＧｌｕＲ５ハイブリダイズパ
ターンの顕著な変化は、小脳皮質でみられた。Ｐ１２ま
で、ＧｌｕＲ５転写物の高レベルが顆粒およびプルキン
エ細胞層でみられた。その後、顆粒細胞層でのハイブリ
ダイゼーションシグナルの強度はプルキンエ細胞層に比
較して低下し、Ｐ１４からはかすかなハイブリダイゼー
ションシグナルが顆粒細胞で検出された。一般に、胚の
発生過程で強い標識を示す脳のこれらの領域では、成熟
ラットでも検出可能な転写物レベルを有していた。Ｐ２
１の動物において、最高のＧｌｕＲ４転写物レベルが、
臭覚球、海馬、小脳および網膜の細胞層で認められた。
網膜では、神経節細胞層および内核層の無軸索細胞で強
いハイブリダイゼーションが認められた。ミュラー細胞
での発現は検出されなかった。ＧｌｕＲ５では、Ｐ２１
での最も強いハイブリダイゼーションシグナルが、臭覚
球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認められた。
子の不鮮明な発現はＥ１０で検出された。これら最初の
ハイブリダイゼーションシグナルは、有糸分裂後のニュ
ーロンに由来する。これは、Ｅ１２では脳髄で最もよく
示される。この上衣層は、神経腔に対面しており、分裂
中の神経芽細胞を含む。これらの細胞ではハイブリダイ
ゼーションは検出できなかった。有糸分裂後の細胞は神
経管の外部に位置し、両方の遺伝子を発現する。発生の
後期に、ＧｌｕＲ５の転写物は、ニューロンが分化して
会合し核となる領域に著しく存在する。程度は低いがＧ
ｌｕＲ４もこの領域に存在する。このハイブリダイゼー
ションパターンの時間的変化は、延髄の主要な感覚核お
よび周囲の構造物よりも強くハイブリダイズする橋の核
においてＧｌｕＲ５で最もよく認められる。Ｅ１４で
は、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、いくつかの別々の脳核
で特に強く、ＧｌｕＲ４遺伝子の発現は、脳の全吻部お
よび尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Ｇｌ
ｕＲ４遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般
に胚後期の段階よりも少量のｍＲＮＡが検出可能であっ
た。対照的に、ＧｌｕＲ５遺伝子の発現は、発生の期間
中空間的により制限されるようにみえ、転写物のレベル
は下降調節された。時間的ＧｌｕＲ５ハイブリダイズパ
ターンの顕著な変化は、小脳皮質でみられた。Ｐ１２ま
で、ＧｌｕＲ５転写物の高レベルが顆粒およびプルキン
エ細胞層でみられた。その後、顆粒細胞層でのハイブリ
ダイゼーションシグナルの強度はプルキンエ細胞層に比
較して低下し、Ｐ１４からはかすかなハイブリダイゼー
ションシグナルが顆粒細胞で検出された。一般に、胚の
発生過程で強い標識を示す脳のこれらの領域では、成熟
ラットでも検出可能な転写物レベルを有していた。Ｐ２
１の動物において、最高のＧｌｕＲ４転写物レベルが、
臭覚球、海馬、小脳および網膜の細胞層で認められた。
網膜では、神経節細胞層および内核層の無軸索細胞で強
いハイブリダイゼーションが認められた。ミュラー細胞
での発現は検出されなかった。ＧｌｕＲ５では、Ｐ２１
での最も強いハイブリダイゼーションシグナルが、臭覚
球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認められた。
【０１１４】発生段階の末梢神経系（ＰＮＳ）では、ハ
イブリダイゼーション検出法によって、ＧｌｕＲ４およ
びＲ５遺伝子が、頭蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴
覚神経節）、脊髄神経節および小腸の壁在性神経節にさ
まざまな程度で発現する。ＣＮＳと同様に、ＰＮＳの転
写物は、ＧｌｕＲ４ではＥ１０までに、またＧｌｕＲ５
ではＥ１１までに検出される。発生の間、ＧｌｕＲ４に
対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生後の初
期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維持され
る。ＧｌｕＲ５に対するハイブリダイゼーションシグナ
ルは、Ｅ１６まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（Ｇｌｕ
Ｒ５）および小腸の壁在性神経節（ＧｌｕＲ４およびＧ
ｌｕＲ５）が、ＣＮＳより高レベルのハイブリダイゼー
ションを示す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグ
ラフィーによれば、神経細胞でＧｌｕＲ５プローブのハ
イブリダイゼーションが示されるが、衛星細胞は標識さ
れない。
イブリダイゼーション検出法によって、ＧｌｕＲ４およ
びＲ５遺伝子が、頭蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴
覚神経節）、脊髄神経節および小腸の壁在性神経節にさ
まざまな程度で発現する。ＣＮＳと同様に、ＰＮＳの転
写物は、ＧｌｕＲ４ではＥ１０までに、またＧｌｕＲ５
ではＥ１１までに検出される。発生の間、ＧｌｕＲ４に
対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生後の初
期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維持され
る。ＧｌｕＲ５に対するハイブリダイゼーションシグナ
ルは、Ｅ１６まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（Ｇｌｕ
Ｒ５）および小腸の壁在性神経節（ＧｌｕＲ４およびＧ
ｌｕＲ５）が、ＣＮＳより高レベルのハイブリダイゼー
ションを示す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグ
ラフィーによれば、神経細胞でＧｌｕＲ５プローブのハ
イブリダイゼーションが示されるが、衛星細胞は標識さ
れない。
【０１１５】実施例１８ 成熟の哺乳動物（ラット）の脳におけるＧｌｕＲ４およ
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 。 成熟動物でのＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分
布をin situ ハイブリダイゼーションによって調べた。
前脳では、ＣＡＩおよび海馬の歯状回、中間手綱、そし
て特には網膜視床核で高レベルのＧｌｕＲ４転写物か検
出された。海馬は、ＧｌｕＲ５の弱い発現を示すのみ
で、中間手綱では転写物は全く検出されなかった。Ｇｌ
ｕＲ５ハイブリダイゼーションシグナルは、帯状および
梨状皮質、いくつかの視床核、扁桃、ならびに外側中隔
で強かった。小脳では、ＧｌｕＲ４およびＲ５プローブ
のハイブリダイゼーションパターンは重複していたが区
別された。両プローブは、プルキンエ細胞層において高
レベルで検出された。顆粒細胞層では、ＧｌｕＲ４プロ
ーブは強い標識を生じたが、ＧｌｕＲ５プローブの標識
は弱かった。
びＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分布 。 成熟動物でのＧｌｕＲ４およびＧｌｕＲ５ｍＲＮＡの分
布をin situ ハイブリダイゼーションによって調べた。
前脳では、ＣＡＩおよび海馬の歯状回、中間手綱、そし
て特には網膜視床核で高レベルのＧｌｕＲ４転写物か検
出された。海馬は、ＧｌｕＲ５の弱い発現を示すのみ
で、中間手綱では転写物は全く検出されなかった。Ｇｌ
ｕＲ５ハイブリダイゼーションシグナルは、帯状および
梨状皮質、いくつかの視床核、扁桃、ならびに外側中隔
で強かった。小脳では、ＧｌｕＲ４およびＲ５プローブ
のハイブリダイゼーションパターンは重複していたが区
別された。両プローブは、プルキンエ細胞層において高
レベルで検出された。顆粒細胞層では、ＧｌｕＲ４プロ
ーブは強い標識を生じたが、ＧｌｕＲ５プローブの標識
は弱かった。
【０１１６】実施例１９ ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７の単離 ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７遺伝子をコードするｃＤＮ
Ａクローンを、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリー
ニングプロトコール（実施例２参照）およびプローブと
して約１．２ｋｂｐ（ヌクレオチド７０５〜２０４８）
のＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの放射能標識断片を用いて、成熟
ラットの前脳ライブラリーから分離した。この選択され
たクローンを、制限酵素切断地図およびスクリーニング
によって同定した。図４４〜５０は、ＧｌｕＲ６クロー
ンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸配列を
示し、図５１、５２は、ＧｌｕＲ７クローンからの断片
３５−Ｔ３（図５１）およびＵ３５（図５２）に関する
それらの配列を示す。
Ａクローンを、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリー
ニングプロトコール（実施例２参照）およびプローブと
して約１．２ｋｂｐ（ヌクレオチド７０５〜２０４８）
のＧｌｕＲ５ｃＤＮＡの放射能標識断片を用いて、成熟
ラットの前脳ライブラリーから分離した。この選択され
たクローンを、制限酵素切断地図およびスクリーニング
によって同定した。図４４〜５０は、ＧｌｕＲ６クロー
ンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸配列を
示し、図５１、５２は、ＧｌｕＲ７クローンからの断片
３５−Ｔ３（図５１）およびＵ３５（図５２）に関する
それらの配列を示す。
【０１１７】実施例２０ ＧｌｕＲ関連検出法 ＧｌｕＲｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質およびそれら
の機能性断片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガン
ドを同定して性質決定するために設計されたさまざまな
検出法で有用である。例えば、ｃＤＮＡは、グルタメー
トセレプター遺伝子群の更なるメンバーを同定するため
のプローブとして有用である。この発明のＤＮＡから転
写されたｍＲＮＡは、機能性受容体およびリガンドを同
定して特徴を決定するために設計された検定法で特に有
用である。この利用は、Ｌ−グルタメート受容体機能に
影響を与える化合物の同定および設計に特に重要であ
る。
の機能性断片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガン
ドを同定して性質決定するために設計されたさまざまな
検出法で有用である。例えば、ｃＤＮＡは、グルタメー
トセレプター遺伝子群の更なるメンバーを同定するため
のプローブとして有用である。この発明のＤＮＡから転
写されたｍＲＮＡは、機能性受容体およびリガンドを同
定して特徴を決定するために設計された検定法で特に有
用である。この利用は、Ｌ−グルタメート受容体機能に
影響を与える化合物の同定および設計に特に重要であ
る。
【０１１８】機能性受容体を同定して特徴を決定する検
出法では、ｍＲＮＡがこの発明のＤＮＡ（完全な長さの
ＤＮＡ、または欠失、置換、合成などによって生じたそ
の断片）から転写され、続いて翻訳されてＧｌｕＲタン
パク質を産生する。好ましい態様では、ｍＲＮＡは卵母
細胞、好ましくはアフリカツメガエルの卵母細胞中で翻
訳される。次いで、発現されたグルタメート受容体タン
パク質を、グルタメート受容体に機能的に結合してこれ
を活性化することが知られているリガンドにさらす。グ
ルタメート受容体タンパク質の電気生理学的特徴を測定
し、機能性のイオンチャンネルを形成するものは機能性
グルタメート受容体であると結論される。
出法では、ｍＲＮＡがこの発明のＤＮＡ（完全な長さの
ＤＮＡ、または欠失、置換、合成などによって生じたそ
の断片）から転写され、続いて翻訳されてＧｌｕＲタン
パク質を産生する。好ましい態様では、ｍＲＮＡは卵母
細胞、好ましくはアフリカツメガエルの卵母細胞中で翻
訳される。次いで、発現されたグルタメート受容体タン
パク質を、グルタメート受容体に機能的に結合してこれ
を活性化することが知られているリガンドにさらす。グ
ルタメート受容体タンパク質の電気生理学的特徴を測定
し、機能性のイオンチャンネルを形成するものは機能性
グルタメート受容体であると結論される。
【０１１９】グルタメート受容体の機能性リガンドを同
定するために設計された関連検出法では、グルタメート
受容体活性化化合物に機能的に結合することが知られて
いるタンパク質を、化合物がイオンチャンネルを形成す
る誘導能の測定が求められている少なくとも１つの「未
知」すなわち被験化合物と接触させる。被験化合物にさ
らした後、グルタメート受容体の電気生理学的性質を測
定し、イオンチャンネル応答をもたらし得るものは、グ
ルタメート受容体の機能性リガンドであると結論づけら
れる。
定するために設計された関連検出法では、グルタメート
受容体活性化化合物に機能的に結合することが知られて
いるタンパク質を、化合物がイオンチャンネルを形成す
る誘導能の測定が求められている少なくとも１つの「未
知」すなわち被験化合物と接触させる。被験化合物にさ
らした後、グルタメート受容体の電気生理学的性質を測
定し、イオンチャンネル応答をもたらし得るものは、グ
ルタメート受容体の機能性リガンドであると結論づけら
れる。
【０１２０】図面 図１〜６。クローンｐＧｌｕＲ１のヌクレオチド配列及
び演繹アミノ酸配列。ヌクレオチドは５’−から３’−
方向に番号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の
仮定的アミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチド
から始まる。仮定的シグナルペプチド（von Heijne, Nu
cl. Acids Res. 14, 4683 (1986)）の開裂は部位１で起
きると予想される。予想される５’−末端塩基よりも上
流のヌクレオチドには負の番号が付されている。−１〜
−５４のヌクレオチドは仮定的シグナルペプチド（von
Heijne、上掲) をコードし、−５５〜−２５１塩基は
５’非翻訳領域を表わす。クローンの３’−末端に、非
翻訳配列の７１ヌクレオチドが見出された。ＧｌｕＲ１
についての演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に
示されており、その番号付けは成熟タンパク質の第１残
基から始まる。可能性のある細胞外Ｎ−グリコシル化部
位は、アミノ酸残基の上に米印をつけて示した。２つの
矢印により示される領域（アミノ酸８９〜１０３）は、
他の研究者によって推定されたリガンド−ゲーテッドイ
オンチャンネルの特徴（Greningloh etal., Nature 33
0, 25 (1987); Barnard et al., TINS 10, 502 (1987))
とある程度類似している。
び演繹アミノ酸配列。ヌクレオチドは５’−から３’−
方向に番号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の
仮定的アミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチド
から始まる。仮定的シグナルペプチド（von Heijne, Nu
cl. Acids Res. 14, 4683 (1986)）の開裂は部位１で起
きると予想される。予想される５’−末端塩基よりも上
流のヌクレオチドには負の番号が付されている。−１〜
−５４のヌクレオチドは仮定的シグナルペプチド（von
Heijne、上掲) をコードし、−５５〜−２５１塩基は
５’非翻訳領域を表わす。クローンの３’−末端に、非
翻訳配列の７１ヌクレオチドが見出された。ＧｌｕＲ１
についての演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に
示されており、その番号付けは成熟タンパク質の第１残
基から始まる。可能性のある細胞外Ｎ−グリコシル化部
位は、アミノ酸残基の上に米印をつけて示した。２つの
矢印により示される領域（アミノ酸８９〜１０３）は、
他の研究者によって推定されたリガンド−ゲーテッドイ
オンチャンネルの特徴（Greningloh etal., Nature 33
0, 25 (1987); Barnard et al., TINS 10, 502 (1987))
とある程度類似している。
【０１２１】図１〜６の方法。バクテリオファージクロ
ーンλZAPII-GluR-K1 の挿入ｃＤＮＡをEco RI/Xho Iで
切り出し、平滑末端化し、ベクターＭ１３ｍｐ１９（Me
ssing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642
(1977)) のSma I 部位にサブクローニングして、両方向
のｃＤＮＡを有するクローンを作製した。ＵＳＢからの
サイクロン（登録商標）を用いて、重複する欠失したサ
ブクローンを、それぞれのストランド方向について構築
した。全ての４５のサブクローンについて、ジデオキシ
ヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977) ）
により１本鎖配列決定を行い、さらに、１０個のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブクローン
から誘導された配列に圧縮（compression)又はギャップ
がある領域の配列決定を容易にした。このようにして両
ストランドについて完全な配列が得られた。Intelli-Ge
neticsソフトウェアパッケージ（IntelliGenetics バー
ジョン５．０及びPC/Gene（登録商標）を用いて配列を
分析した。
ーンλZAPII-GluR-K1 の挿入ｃＤＮＡをEco RI/Xho Iで
切り出し、平滑末端化し、ベクターＭ１３ｍｐ１９（Me
ssing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642
(1977)) のSma I 部位にサブクローニングして、両方向
のｃＤＮＡを有するクローンを作製した。ＵＳＢからの
サイクロン（登録商標）を用いて、重複する欠失したサ
ブクローンを、それぞれのストランド方向について構築
した。全ての４５のサブクローンについて、ジデオキシ
ヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977) ）
により１本鎖配列決定を行い、さらに、１０個のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブクローン
から誘導された配列に圧縮（compression)又はギャップ
がある領域の配列決定を容易にした。このようにして両
ストランドについて完全な配列が得られた。Intelli-Ge
neticsソフトウェアパッケージ（IntelliGenetics バー
ジョン５．０及びPC/Gene（登録商標）を用いて配列を
分析した。
【０１２２】図７。アミノ酸残基８９と１０６の間に位
置する細胞外領域と、他の全てのリガンド−ゲーテッド
イオンチャンネル中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ル
ープ」との比較を、配列相同性と共に示す。ｎＡＣｈＲ
サブユニットα１、β１、γ及びδの配列は、マウス筋
肉からのものであり（Heinemann, et al., in: Molecul
ar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. H
einemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, N
ew York, 1987)) 、ｎＡＣｈＲサブユニットα２、α
３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳からのもので
ある（Deneris etal., J. Biol. Chem. 264, 6268 (198
9); Duvoisin et al., Neuron 3, 487 (1989)。ＧＡＢ
ＡＡ サブユニットα及びβはウシ脳からのものである
（Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (198
7))。ＧｌｙＲ ４８ｋは、ラット脳からのグリシン受
容体のＭｒ ＝４８ｋＤａのサブユニットである（Grenn
ingloh et al., Nature 328, 215-220 (1987)) 。箱で
囲んだアミノ酸残基はＧｌｕＲ１及び他の受容体配列の
少なくとも１つにおいて同一の場所に見出されたもので
ある。１つのギャップが任意に導入されている。
置する細胞外領域と、他の全てのリガンド−ゲーテッド
イオンチャンネル中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ル
ープ」との比較を、配列相同性と共に示す。ｎＡＣｈＲ
サブユニットα１、β１、γ及びδの配列は、マウス筋
肉からのものであり（Heinemann, et al., in: Molecul
ar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed. H
einemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press, N
ew York, 1987)) 、ｎＡＣｈＲサブユニットα２、α
３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳からのもので
ある（Deneris etal., J. Biol. Chem. 264, 6268 (198
9); Duvoisin et al., Neuron 3, 487 (1989)。ＧＡＢ
ＡＡ サブユニットα及びβはウシ脳からのものである
（Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (198
7))。ＧｌｙＲ ４８ｋは、ラット脳からのグリシン受
容体のＭｒ ＝４８ｋＤａのサブユニットである（Grenn
ingloh et al., Nature 328, 215-220 (1987)) 。箱で
囲んだアミノ酸残基はＧｌｕＲ１及び他の受容体配列の
少なくとも１つにおいて同一の場所に見出されたもので
ある。１つのギャップが任意に導入されている。
【０１２３】図８。ＧｌｕＲ１の仮定的ＴＭＤII領域と
他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネル（Barnard
et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris e
t al., J. Biol. chem. 264, 6268(1989); Duvoisin et
al., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh et al., Na
ture 328, 215 (1987); Heinemann et al., in: Molecu
lar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed.
Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press,
New York, 1987))1987) のＴＭＤII領域との比較を示
し、タンパク質配列の保存性（不変性）を示す。
他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネル（Barnard
et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris e
t al., J. Biol. chem. 264, 6268(1989); Duvoisin et
al., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh et al., Na
ture 328, 215 (1987); Heinemann et al., in: Molecu
lar Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (ed.
Heinemann, S. & Patrick, J.) 45-96 (Plenum Press,
New York, 1987))1987) のＴＭＤII領域との比較を示
し、タンパク質配列の保存性（不変性）を示す。
【０１２４】図９〜１４。ラットグルタメート受容体サ
ブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡ
クローン１ＲＢ１４のヌクレオチド配列及び演繹アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方向に
番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮定的
アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレオチ
ドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌクレ
オチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定的シ
グナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が含ま
れる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ（すな
わち、Asn-235、Asn-349、 Asn-385、 Asn-392及びAsn-835
）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２タンパ
ク質の分子量の計算値は９６，４００ダルトンである。
米印は翻訳終止コドンを示す。
ブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ２のｃＤＮＡ
クローン１ＲＢ１４のヌクレオチド配列及び演繹アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方向に
番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮定的
アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレオチ
ドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌクレ
オチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定的シ
グナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が含ま
れる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ（すな
わち、Asn-235、Asn-349、 Asn-385、 Asn-392及びAsn-835
）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２タンパ
ク質の分子量の計算値は９６，４００ダルトンである。
米印は翻訳終止コドンを示す。
【０１２５】図１５〜２０。ラットグルタメート受容体
サブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ３のｃＤＮ
Ａクローン１ＲＢ３１２のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方
向に番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮
定的アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレ
オチドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌ
クレオチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定
的シグナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が
含まれる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ
（すなわち、Asn-35、 Asn-238、 Asn-352、 Asn-387 及び
Asn-394 ）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２
タンパク質の分子量の計算値は９８，０００ダルトンで
ある。米印は翻訳終止コドンを示す。
サブユニットをコードする、遺伝子ＧｌｕＲ３のｃＤＮ
Ａクローン１ＲＢ３１２のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは５’方向から３’方
向に番号が付され、この番号は、成熟タンパク質中の仮
定的アミノ末端残基に対応するコドン中の最初のヌクレ
オチドから始まる。塩基１のさらに５’側に存在するヌ
クレオチドには負の番号が付けられ、この部分には仮定
的シグナルペプチドコード領域及び５’−非翻訳領域が
含まれる。可能性のあるＮ−グリコシル化部位が５つ
（すなわち、Asn-35、 Asn-238、 Asn-352、 Asn-387 及び
Asn-394 ）存在する。成熟、非グリコシル化ＧｌｕＲ２
タンパク質の分子量の計算値は９８，０００ダルトンで
ある。米印は翻訳終止コドンを示す。
【０１２６】図２１〜２４。ラットグルタメート受容体
サブユニットの演繹アミノ酸配列を並べたものを示す。
全ての比較した配列において同一の残基は箱で囲んで示
した。この場合、相同性を最大にするために、スペース
を導入してある。予想されるシグナルペプチド及び４つ
の提唱される経膜領域（ＭＳＲI-IV) を示してある。２
つの矢印の頭（▼）で規定されるＧｌｕＲ１中の領域
は、他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルサブユ
ニット中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ」ループ（Barn
ard, et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)) に対
応することが提唱される領域である。破線で示した部分
は、ＧｌｕＲ５−１中に見出されるがＧｌｕＲ５−２中
に見出されない１５アミノ酸残基の挿入を示す。
サブユニットの演繹アミノ酸配列を並べたものを示す。
全ての比較した配列において同一の残基は箱で囲んで示
した。この場合、相同性を最大にするために、スペース
を導入してある。予想されるシグナルペプチド及び４つ
の提唱される経膜領域（ＭＳＲI-IV) を示してある。２
つの矢印の頭（▼）で規定されるＧｌｕＲ１中の領域
は、他のリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルサブユ
ニット中に見出される「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ」ループ（Barn
ard, et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)) に対
応することが提唱される領域である。破線で示した部分
は、ＧｌｕＲ５−１中に見出されるがＧｌｕＲ５−２中
に見出されない１５アミノ酸残基の挿入を示す。
【０１２７】図２５、２６。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２又
はＧｌｕＲ３を別々に注射したアフリカツメガエルの卵
母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注射し
たアフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答
の比較を示す。（Ａ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）、ＧｌｕＲ
２（１０ｎｇ）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（２ｎｇ）を注入
した後３日後に測定した、１００ｍＭ ＫＡに対する卵
母細胞の応答を示す。挿入した図はこのような卵母細胞
から得られた電圧記録の軌跡の例を示す。なお、Ｇｌｕ
Ｒ２応答は、２５ｎｇのＲＮＡを注射５日後に得られた
ものである。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）若しくはＧｌ
ｕＲ３（２ｎｇ）ＲＮＡ又は成熟ラット脳海馬ポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ（約５０ｎｇ）を注射３日後に測定さ
れた、記載したアゴニストに対する卵母細胞の応答を示
す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて得られた応答
に正規化され、ｎ≧３の全ての測定について平均±S.E.
M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧が−７０ｍＶ
にクランプされ、記録はHolmanet al., Nature 342, 64
3 (1989) に記載された通りに行った。
はＧｌｕＲ３を別々に注射したアフリカツメガエルの卵
母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを注射し
たアフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答
の比較を示す。（Ａ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）、ＧｌｕＲ
２（１０ｎｇ）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（２ｎｇ）を注入
した後３日後に測定した、１００ｍＭ ＫＡに対する卵
母細胞の応答を示す。挿入した図はこのような卵母細胞
から得られた電圧記録の軌跡の例を示す。なお、Ｇｌｕ
Ｒ２応答は、２５ｎｇのＲＮＡを注射５日後に得られた
ものである。（Ｂ）ＧｌｕＲ１（２ｎｇ）若しくはＧｌ
ｕＲ３（２ｎｇ）ＲＮＡ又は成熟ラット脳海馬ポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ（約５０ｎｇ）を注射３日後に測定さ
れた、記載したアゴニストに対する卵母細胞の応答を示
す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて得られた応答
に正規化され、ｎ≧３の全ての測定について平均±S.E.
M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧が−７０ｍＶ
にクランプされ、記録はHolmanet al., Nature 342, 64
3 (1989) に記載された通りに行った。
【０１２８】図２７、２８。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及
びＧｌｕＲ３ＲＮＡの組合せを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞中で測定された電流応答の比較を示す。
（Ａ）記載したＧｌｕＲサブユニットのそれぞれについ
て、２ｎｇのＲＮＡを注射３日後に測定された、１００
ｍＭ ＫＡに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカ
ラムは、ＧｌｕＲサブユニットＲＮＡを別々に発現させ
た卵母細胞中で測定された応答の合計を示し、斜線を施
したカラムは個々の卵母細胞中でＧｌｕＲサブユニット
ＲＮＡを一緒に発現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記
載したそれぞれのＧｌｕＲサブユニットのＲＮＡ２ｎｇ
又は５０ｎｇのラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを注射
３日後に測定した、記載したアゴニストに対する卵母細
胞の応答を示す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて
得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての測定につい
て平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧
が−７０ｍＶにクランプされ、記録はHolman et al., N
ature 341, 643 (1989) に記載された通りに行った。
びＧｌｕＲ３ＲＮＡの組合せを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞中で測定された電流応答の比較を示す。
（Ａ）記載したＧｌｕＲサブユニットのそれぞれについ
て、２ｎｇのＲＮＡを注射３日後に測定された、１００
ｍＭ ＫＡに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカ
ラムは、ＧｌｕＲサブユニットＲＮＡを別々に発現させ
た卵母細胞中で測定された応答の合計を示し、斜線を施
したカラムは個々の卵母細胞中でＧｌｕＲサブユニット
ＲＮＡを一緒に発現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記
載したそれぞれのＧｌｕＲサブユニットのＲＮＡ２ｎｇ
又は５０ｎｇのラット脳海馬ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを注射
３日後に測定した、記載したアゴニストに対する卵母細
胞の応答を示す。全ての値は１００ｍＭ ＫＡについて
得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての測定につい
て平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母細胞は電圧
が−７０ｍＶにクランプされ、記録はHolman et al., N
ature 341, 643 (1989) に記載された通りに行った。
【０１２９】図２９〜３１。１００ｍＭ ＫＡに対する
電流応答の膜電位依存性を示す。（Ａ）ラット脳海馬ポ
リ（Ａ）＋ ＲＮＡ（５０ｎｇ、黒塗り四角■）、Ｇｌ
ｕＲ１（白ぬき四角□）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき
丸○）；（Ｂ）ＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ２ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又はＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき四
角□）；（Ｃ）ＧｌｕＲ２＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又は全ての３種のＧｌｕＲサブユニットＲＮＡ
（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのＧｌｕＲサブユ
ニットのＲＮＡ２ｎｇを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−１５０ｍＶから＋５０ｍＶの間で１０
ｍＶ刻みに変化させ、全ての値は−７０ｍＶで測定され
た応答に正規化して示してある。
電流応答の膜電位依存性を示す。（Ａ）ラット脳海馬ポ
リ（Ａ）＋ ＲＮＡ（５０ｎｇ、黒塗り四角■）、Ｇｌ
ｕＲ１（白ぬき四角□）又はＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき
丸○）；（Ｂ）ＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ２ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又はＧｌｕＲ１＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（白ぬき四
角□）；（Ｃ）ＧｌｕＲ２＋ＧｌｕＲ３ＲＮＡ（黒塗り
四角■）又は全ての３種のＧｌｕＲサブユニットＲＮＡ
（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのＧｌｕＲサブユ
ニットのＲＮＡ２ｎｇを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−１５０ｍＶから＋５０ｍＶの間で１０
ｍＶ刻みに変化させ、全ての値は−７０ｍＶで測定され
た応答に正規化して示してある。
【０１３０】図３６〜４３。ラットグルタメート受容体
サブユニットＧｌｕＲ５−１をコードする単一のｃＤＮ
Ａクローン（λＲＢ２０）のヌクレオチド配列及びアミ
ノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列
の上に示されている。仮定的シグナルペプチドの開裂が
アミノ酸１の位置で起きると予想される（von Heijne,
Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)) 。この開裂部位は
プロリン残基の後であり、これは一般的なことではな
い。シグナルペプチドをコードするアミノ酸には負の番
号が付されている。ヌクレオチドは５’から３’方向に
番号が付されており、この番号は成熟タンパク質の仮定
的アミノ末端残基のコドンの最初の残基から始まってい
る。アミノ酸残基１よりも５’側のヌクレオチドは負の
番号で示されている。オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）に隣接する停止コドンは「ＥＮＤ」で示さ
れ、ポリアデニル化シグナルには下線が付されている。
可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米印（＊）に
よって示されている。２つの矢印の頭（▼）は、λＲＢ
２０中には見出されるが、単離した２９のｃＤＮＡクロ
ーン中１２のものにはみられない、ヌクレオチド１１１
３と１１５９の間の４５のヌクレオチド挿入を規定す
る。
サブユニットＧｌｕＲ５−１をコードする単一のｃＤＮ
Ａクローン（λＲＢ２０）のヌクレオチド配列及びアミ
ノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配列がヌクレオチド配列
の上に示されている。仮定的シグナルペプチドの開裂が
アミノ酸１の位置で起きると予想される（von Heijne,
Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)) 。この開裂部位は
プロリン残基の後であり、これは一般的なことではな
い。シグナルペプチドをコードするアミノ酸には負の番
号が付されている。ヌクレオチドは５’から３’方向に
番号が付されており、この番号は成熟タンパク質の仮定
的アミノ末端残基のコドンの最初の残基から始まってい
る。アミノ酸残基１よりも５’側のヌクレオチドは負の
番号で示されている。オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）に隣接する停止コドンは「ＥＮＤ」で示さ
れ、ポリアデニル化シグナルには下線が付されている。
可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米印（＊）に
よって示されている。２つの矢印の頭（▼）は、λＲＢ
２０中には見出されるが、単離した２９のｃＤＮＡクロ
ーン中１２のものにはみられない、ヌクレオチド１１１
３と１１５９の間の４５のヌクレオチド挿入を規定す
る。
【０１３１】
【表２】表２ 表２ ＧｌｕＲ１によりコードされるグルタメート受容体の薬理学：ＧｌｕＲ １インビトロＲＮＡを注射された卵母細胞中で測定された、種々のグルタメート 受容体アンタゴニストの性質 被検化合物 化合物単独 化合物＋カイネート （％）ａ （％）ｂ カイネート（アゴニスト対照） 100.0 100.0 キヌレン酸 3.4 ±0.2 9.6 ±1.3 γ−ＤＧＧ -0.1 ±0.5 30.8 ±1.1 ＧＡＭＳ 1.0 ±0.6 30.7 ±1.1 ＧＤＥＥ 24.8 ±5.7 97.8 ±6.6 ＰＤＡ 2.5 ±0.7 31.3 ±2.0 ＡＰＶ 3.1 ±1.4 73.7 ±3.2 ＣＰＰ 9.1 ±0.7 78.8 ±0.9 ａ：薬剤投与の直前に３０μＭのカイネートにより誘起された応答の％。 ｂ：薬剤／カイネート混合物の投与の直前に３０μＭのカイネートにより誘起さ れた応答の％。
【０１３２】卵母細胞は、ＧｌｕＲ１のインビトロセン
スＲＮＡ1.25 ng を記録の３日前に注射されていた。卵
母細胞は、−７０ｍＶに電圧が保持され、被検化合物
（カイネート（３０μＭ）を除く全ての化合物は１ｍ
Ｍ）は迅速なスーパーフュージョンにより５分間隔で投
与された。ピーク電流を測定し、それぞれの数字は３つ
の異なる卵母細胞からの３つの記録の平均±ＳＥＭで示
した。１００％の電流応答は、卵母細胞に依存して４０
〜２００ｎＡに対応する。 表３ グルタメート受容体サブユニット遺伝子群のメンバーの各対の間のアミ ノ酸配列同一性のパーセント ＧｌｕＲ１ ＧｌｕＲ２ ＧｌｕＲ３ ＧｌｕＲ４ ＧｌｕＲ５ ＧｌｕＲ１ １００ ７０ ６９ ６８ ４０ ＧｌｕＲ２ １００ ７３ ７２ ４０ ＧｌｕＲ３ １００ ７３ ４１ ＧｌｕＲ４ １００ ４１ ＧｌｕＲ５ １００ 配列は、ウィスコンシン州立大学ジェネティクスコンピ
ューターグループからの配列分析ソフトウェア（Devere
ux, et al., Nucl. Acids Res. 12, 387(1984)）を用い
て比較した。配列の各対間の配列同一性パーセントは、
同一のアミノ酸が並んだ位置の数を、調べた最も短い配
列中での並んだ位置の総数で除し、得られた商を１００
倍することにより計算した。 上述の記載から、当業者は、本発明がグルタメート受容
体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に純
粋なＤＮＡ領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（ＮＭＤＡ）、ＡＭＰＡ又はキスカレート、カイ
ネート（ＫＡ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレー
ト（ＡＰＢ）を包含するグルタメート受容体に特徴的な
電気生理学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又は
その機能性断片である。本発明の新規なグルタメート受
容体は、ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及びＧｌｕＲ５並びにＧｌｕＲ６
及びＧｌｕＲ７並びにこれらの機能性組合せによってコ
ードされるタンパク質並びにこれらによってコードされ
る機能性ペプチド断片により例示される。本発明のグル
タメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、薬剤
スクリーニングに有用である。さらに、ＧｌｕＲ１〜Ｇ
ｌｕＲ７のｃＤＮＡは、当業者によって、過度の実験を
要することなく、他の新規なグルタメート受容体を同定
し単離するためにプローブとして用いることができる。
このような他の新規なグルタメート受容体は、本発明の
範囲内に明示的に包含される。本発明の精神及び範囲か
ら逸脱することなく、当業者は本発明に種々の変更及び
修飾を加えて種々の用途及び条件に適合させることがで
きる。従って、このような変更及び修飾は、適切に、誠
実に、特許請求範囲の均等範囲に属するものであること
を意図する。
スＲＮＡ1.25 ng を記録の３日前に注射されていた。卵
母細胞は、−７０ｍＶに電圧が保持され、被検化合物
（カイネート（３０μＭ）を除く全ての化合物は１ｍ
Ｍ）は迅速なスーパーフュージョンにより５分間隔で投
与された。ピーク電流を測定し、それぞれの数字は３つ
の異なる卵母細胞からの３つの記録の平均±ＳＥＭで示
した。１００％の電流応答は、卵母細胞に依存して４０
〜２００ｎＡに対応する。 表３ グルタメート受容体サブユニット遺伝子群のメンバーの各対の間のアミ ノ酸配列同一性のパーセント ＧｌｕＲ１ ＧｌｕＲ２ ＧｌｕＲ３ ＧｌｕＲ４ ＧｌｕＲ５ ＧｌｕＲ１ １００ ７０ ６９ ６８ ４０ ＧｌｕＲ２ １００ ７３ ７２ ４０ ＧｌｕＲ３ １００ ７３ ４１ ＧｌｕＲ４ １００ ４１ ＧｌｕＲ５ １００ 配列は、ウィスコンシン州立大学ジェネティクスコンピ
ューターグループからの配列分析ソフトウェア（Devere
ux, et al., Nucl. Acids Res. 12, 387(1984)）を用い
て比較した。配列の各対間の配列同一性パーセントは、
同一のアミノ酸が並んだ位置の数を、調べた最も短い配
列中での並んだ位置の総数で除し、得られた商を１００
倍することにより計算した。 上述の記載から、当業者は、本発明がグルタメート受容
体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に純
粋なＤＮＡ領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（ＮＭＤＡ）、ＡＭＰＡ又はキスカレート、カイ
ネート（ＫＡ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレー
ト（ＡＰＢ）を包含するグルタメート受容体に特徴的な
電気生理学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又は
その機能性断片である。本発明の新規なグルタメート受
容体は、ｃＤＮＡクローンＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、Ｇ
ｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４及びＧｌｕＲ５並びにＧｌｕＲ６
及びＧｌｕＲ７並びにこれらの機能性組合せによってコ
ードされるタンパク質並びにこれらによってコードされ
る機能性ペプチド断片により例示される。本発明のグル
タメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、薬剤
スクリーニングに有用である。さらに、ＧｌｕＲ１〜Ｇ
ｌｕＲ７のｃＤＮＡは、当業者によって、過度の実験を
要することなく、他の新規なグルタメート受容体を同定
し単離するためにプローブとして用いることができる。
このような他の新規なグルタメート受容体は、本発明の
範囲内に明示的に包含される。本発明の精神及び範囲か
ら逸脱することなく、当業者は本発明に種々の変更及び
修飾を加えて種々の用途及び条件に適合させることがで
きる。従って、このような変更及び修飾は、適切に、誠
実に、特許請求範囲の均等範囲に属するものであること
を意図する。
【０１３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Salk Institute for Biological Studies <120> GLUTAMATE RECEPTOR COMPOSITIONS AND METHODS <130> 92PJ025D <150> US 428116 <151> 1990-10-25 <160> 8
【０１３５】 <210> 1 <211> 2971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GluR4 <221> CDS <222> (162)...(2870) <400> 1 gtaatggagt gtacgcaaaa tcctctgtct gtggactcgc accagagcct cccagaaaac 60 ctgggcgatc tgcgccatcg tcttcaatgc ctctctgaaa agcctttagc aagactgaga 120 gaaagagaaa agagagcgcg ccagagagag gagcaaagaa g atg agg att att tgc 176 Met Arg Ile Ile Cys 1 5 agg cag att gtc ttg ttg ttt tct gga ttt tgg gga ctc gcc atg gga 224 Arg Gln Ile Val Leu Leu Phe Ser Gly Phe Trp Gly Leu Ala Met Gly 10 15 20 gcc ttt cca agc agc gtt caa ata ggt ggt ctc ttc atc cga aac aca 272 Ala Phe Pro Ser Ser Val Gln Ile Gly Gly Leu Phe Ile Arg Asn Thr 25 30 35 gac cag gaa tac act gct ttt aga ctg gca atc ttt ctt cat aac acc 320 Asp Gln Glu Tyr Thr Ala Phe Arg Leu Ala Ile Phe Leu His Asn Thr 40 45 50 agc ccc aat gca tcg gaa gct cct ttc aat ttg gta cct cat gtg gac 368 Ser Pro Asn Ala Ser Glu Ala Pro Phe Asn Leu Val Pro His Val Asp 55 60 65 aac att gag act gcc aac agt ttt gct gtg aca aac gcc ttc tgt tcc 416 Asn Ile Glu Thr Ala Asn Ser Phe Ala Val Thr Asn Ala Phe Cys Ser 70 75 80 85 cag tat tct aga ggg gtg ttt gcc att ttt gga ctc tat gac aag aga 464 Gln Tyr Ser Arg Gly Val Phe Ala Ile Phe Gly Leu Tyr Asp Lys Arg 90 95 100 tcc gtg cat acc ttg acc tcg ttc tgc agg cgt ctg cac atc tct ctc 512 Ser Val His Thr Leu Thr Ser Phe Cys Arg Arg Leu His Ile Ser Leu 105 110 115 atc aca cca agc ttt ccc act gaa ggg gag agc cag ttt gtg ctg cag 560 Ile Thr Pro Ser Phe Pro Thr Glu Gly Glu Ser Gln Phe Val Leu Gln 120 125 130 cta aga cct tca ctg aga ggt gca ctc ctg agc ctc ctg gat cac tat 608 Leu Arg Pro Ser Leu Arg Gly Ala Leu Leu Ser Leu Leu Asp His Tyr 135 140 145 gag tgg aac tgt ttc gtc ttc ctg tat gat aca gac agg ggg tat tca 656 Glu Trp Asn Cys Phe Val Phe Leu Tyr Asp Thr Asp Arg Gly Tyr Ser 150 155 160 165 ata ctt caa gct ata atg gaa aaa gca gga caa aat gga tgg cat gtc 704 Ile Leu Gln Ala Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Asn Gly Trp His Val 170 175 180 agt gca ata tgt gtg gaa aat ttt aat gat gtc agc tac agg caa ctg 752 Ser Ala Ile Cys Val Glu Asn Phe Asn Asp Val Ser Tyr Arg Gln Leu 185 190 195 cta gaa gag ctt gac aga aga caa gag aag aaa ttt gtg ata gat tgt 800 Leu Glu Glu Leu Asp Arg Arg Gln Glu Lys Lys Phe Val Ile Asp Cys 200 205 210 gag ata gag agg ctt caa aac att tta gaa caa att gtg agt gtt ggg 848 Glu Ile Glu Arg Leu Gln Asn Ile Leu Glu Gln Ile Val Ser Val Gly 215 220 225 aag cat gtc aaa ggc tac cat tat atc atc gca aat ttg ggt ttc aag 896 Lys His Val Lys Gly Tyr His Tyr Ile Ile Ala Asn Leu Gly Phe Lys 230 235 240 245 gat att tct ctt gag aga ttt ata cat gga gga gca aat gta aca gga 944 Asp Ile Ser Leu Glu Arg Phe Ile His Gly Gly Ala Asn Val Thr Gly 250 255 260 ttc cag ttg gta gat ttt aat aca ccc atg gta acc aaa cta atg gat 992 Phe Gln Leu Val Asp Phe Asn Thr Pro Met Val Thr Lys Leu Met Asp 265 270 275 cgg tgg aag aaa cta gat cag aga gaa tat cca ggt tct gaa aca cct 1040 Arg Trp Lys Lys Leu Asp Gln Arg Glu Tyr Pro Gly Ser Glu Thr Pro 280 285 290 cca aag tac acc tct gct ctc act tat gat gga gtc ctg gtg atg gct 1088 Pro Lys Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Tyr Asp Gly Val Leu Val Met Ala 295 300 305 gaa act ttc cga agt ctc aga aga cag aaa att gat att tca agg aga 1136 Glu Thr Phe Arg Ser Leu Arg Arg Gln Lys Ile Asp Ile Ser Arg Arg 310 315 320 325 gga aat gct ggg gac tgt ctg gca aac cct gct gct ccc tgg ggc cag 1184 Gly Asn Ala Gly Asp Cys Leu Ala Asn Pro Ala Ala Pro Trp Gly Gln 330 335 340 gga att gac atg gag agg aca ctg aag cag gtt cga att caa ggg ctg 1232 Gly Ile Asp Met Glu Arg Thr Leu Lys Gln Val Arg Ile Gln Gly Leu 345 350 355 act ggg aat gtt caa ttt gac cat tat gga cgt aga gtt aat tac aca 1280 Thr Gly Asn Val Gln Phe Asp His Tyr Gly Arg Arg Val Asn Tyr Thr 360 365 370 atg gat gtg ttt gaa cta aaa agc aca gga cct cga aag gtt ggc tac 1328 Met Asp Val Phe Glu Leu Lys Ser Thr Gly Pro Arg Lys Val Gly Tyr 375 380 385 tgg aat gat atg gat aaa tta gtc ttg att caa gat atg cct act ctg 1376 Trp Asn Asp Met Asp Lys Leu Val Leu Ile Gln Asp Met Pro Thr Leu 390 395 400 405 ggc aat gac aca gca gct att gag aac aga aca gtg gtt gta acc aca 1424 Gly Asn Asp Thr Ala Ala Ile Glu Asn Arg Thr Val Val Val Thr Thr 410 415 420 att atg gaa tct ccc tat gtt atg tac aag aaa aat cat gaa atg ttt 1472 Ile Met Glu Ser Pro Tyr Val Met Tyr Lys Lys Asn His Glu Met Phe 425 430 435 gaa gga aat gac aag tac gaa ggc tac tgt gta gat ctg gca tcg gaa 1520 Glu Gly Asn Asp Lys Tyr Glu Gly Tyr Cys Val Asp Leu Ala Ser Glu 440 445 450 agt gca aaa cat att ggt atc aaa tat aaa att gcc att gtt cct gat 1568 Ser Ala Lys His Ile Gly Ile Lys Tyr Lys Ile Ala Ile Val Pro Asp 455 460 465 gga aaa tat gga gca agg gac gca gac act aag atc tgg aat ggg atg 1616 Gly Lys Tyr Gly Ala Arg Asp Ala Asp Thr Lys Ile Trp Asn Gly Met 470 475 480 485 gta gga gag ctt gtg tat ggg aaa gca gag att gct att gcc cct ctg 1664 Val Gly Glu Leu Val Tyr Gly Lys Ala Glu Ile Ala Ile Ala Pro Leu 490 495 500 aca atc aca ttg gtt cga gag gaa gtc atc gat ttt tct aag cct ttt 1712 Thr Ile Thr Leu Val Arg Glu Glu Val Ile Asp Phe Ser Lys Pro Phe 505 510 515 atg agt tta ggc atc tct atc atg atc aaa aaa cct cag aaa tct aaa 1760 Met Ser Leu Gly Ile Ser Ile Met Ile Lys Lys Pro Gln Lys Ser Lys 520 525 530 cca gga gtc ttt tcc ttc ttg gac cct ctg gcc tat gag atc tgg atg 1808 Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asp Pro Leu Ala Tyr Glu Ile Trp Met 535 540 545 tgc ata gtg ttt gca tac att ggt gtc agt gtg gtc ttg ttc cta gtc 1856 Cys Ile Val Phe Ala Tyr Ile Gly Val Ser Val Val Leu Phe Leu Val 550 555 560 565 agt agg ttt agc cca tat gag tgg cac aca gaa gaa cct gag gat ggg 1904 Ser Arg Phe Ser Pro Tyr Glu Trp His Thr Glu Glu Pro Glu Asp Gly 570 575 580 aag gaa gga ccc agt gac cag cct ccc aat gaa ttt ggc atc ttt aac 1952 Lys Glu Gly Pro Ser Asp Gln Pro Pro Asn Glu Phe Gly Ile Phe Asn 585 590 595 agc ctt tgg ttt tcc ctg ggt gcc ttt atg caa caa gga tgt gac att 2000 Ser Leu Trp Phe Ser Leu Gly Ala Phe Met Gln Gln Gly Cys Asp Ile 600 605 610 tca ccc aga tcc ctg tca ggt cgg att gtt gga ggc gtg tgg tgg ttc 2048 Ser Pro Arg Ser Leu Ser Gly Arg Ile Val Gly Gly Val Trp Trp Phe 615 620 625 ttc aca ctc atc att ata tcg tcc tac act gct aat ctg gct gca ttc 2096 Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe 630 635 640 645 ctt act gtg gag aga atg gtc tcc ccc ata gaa agt gca gaa gac ctg 2144 Leu Thr Val Glu Arg Met Val Ser Pro Ile Glu Ser Ala Glu Asp Leu 650 655 660 gcc aaa caa aca gaa att gcc tat gga aca ctt gat tct ggg tca aca 2192 Ala Lys Gln Thr Glu Ile Ala Tyr Gly Thr Leu Asp Ser Gly Ser Thr 665 670 675 aaa gaa ttc ttc aga aga tca aaa ata gca gtg tat gaa aag atg tgg 2240 Lys Glu Phe Phe Arg Arg Ser Lys Ile Ala Val Tyr Glu Lys Met Trp 680 685 690 acc tac atg cga tcg gca gag ccg tct gtg ttc act aga act aca gct 2288 Thr Tyr Met Arg Ser Ala Glu Pro Ser Val Phe Thr Arg Thr Thr Ala 695 700 705 gag ggc gtg gct cgt gtc cgc aag tcc aag ggc aaa ttt gcc ttt ctc 2336 Glu Gly Val Ala Arg Val Arg Lys Ser Lys Gly Lys Phe Ala Phe Leu 710 715 720 725 ctg gag tcc acg atg aat gaa tac att gag cag cga aag ccc tgt gac 2384 Leu Glu Ser Thr Met Asn Glu Tyr Ile Glu Gln Arg Lys Pro Cys Asp 730 735 740 acg atg aaa gtg gga gga aac ctg gat tcc aaa ggc tat ggt gta gca 2432 Thr Met Lys Val Gly Gly Asn Leu Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val Ala 745 750 755 acg ccc aag ggt tcc tca tta aga act cct gta aac ctt gcc gtt ttg 2480 Thr Pro Lys Gly Ser Ser Leu Arg Thr Pro Val Asn Leu Ala Val Leu 760 765 770 aaa ctc agt gag gca ggc gtc tta gac aag ctg aaa aac aaa tgg tgg 2528 Lys Leu Ser Glu Ala Gly Val Leu Asp Lys Leu Lys Asn Lys Trp Trp 775 780 785 tac gat aaa ggt gaa tgt gga ccc aag gac tcg gga agc aag gac aag 2576 Tyr Asp Lys Gly Glu Cys Gly Pro Lys Asp Ser Gly Ser Lys Asp Lys 790 795 800 805 acg agt gcc ttg agc ctg agc aac gta gca ggc gtc ttc tac att ctg 2624 Thr Ser Ala Leu Ser Leu Ser Asn Val Ala Gly Val Phe Tyr Ile Leu 810 815 820 gtt ggc ggc ctg ggc ttg gca atg ctg gtg gct ttg ata gag ttc tgt 2672 Val Gly Gly Leu Gly Leu Ala Met Leu Val Ala Leu Ile Glu Phe Cys 825 830 835 tac aag tcc agg gca gag gcg aag aga atg aag ctg act ttt tcc gaa 2720 Tyr Lys Ser Arg Ala Glu Ala Lys Arg Met Lys Leu Thr Phe Ser Glu 840 845 850 gcc ata aga aac aaa gcc agg tta tcc atc act ggg agt gtg gga gaa 2768 Ala Ile Arg Asn Lys Ala Arg Leu Ser Ile Thr Gly Ser Val Gly Glu 855 860 865 aac ggc cgt gtg ctt acc cct gac tgc ccc aag gcc gta cac aca gga 2816 Asn Gly Arg Val Leu Thr Pro Asp Cys Pro Lys Ala Val His Thr Gly 870 875 880 885 act gca att aga caa agt tcg gga ttg gct gtc att gca tcg gac cta 2864 Thr Ala Ile Arg Gln Ser Ser Gly Leu Ala Val Ile Ala Ser Asp Leu 890 895 900 cca taa aaaccaaaaa aataattgag tgccttaatc aaactgtgtt ggtgactgac 2920 Pro * tgaaacgcag ccctgaggga aaggccaaga gtgggtcttg actaaatcca t 2971
【０１３６】 <210> 2 <211> 902 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Arg Ile Ile Cys Arg Gln Ile Val Leu Leu Phe Ser Gly Phe Trp 1 5 10 15 Gly Leu Ala Met Gly Ala Phe Pro Ser Ser Val Gln Ile Gly Gly Leu 20 25 30 Phe Ile Arg Asn Thr Asp Gln Glu Tyr Thr Ala Phe Arg Leu Ala Ile 35 40 45 Phe Leu His Asn Thr Ser Pro Asn Ala Ser Glu Ala Pro Phe Asn Leu 50 55 60 Val Pro His Val Asp Asn Ile Glu Thr Ala Asn Ser Phe Ala Val Thr 65 70 75 80 Asn Ala Phe Cys Ser Gln Tyr Ser Arg Gly Val Phe Ala Ile Phe Gly 85 90 95 Leu Tyr Asp Lys Arg Ser Val His Thr Leu Thr Ser Phe Cys Arg Arg 100 105 110 Leu His Ile Ser Leu Ile Thr Pro Ser Phe Pro Thr Glu Gly Glu Ser 115 120 125 Gln Phe Val Leu Gln Leu Arg Pro Ser Leu Arg Gly Ala Leu Leu Ser 130 135 140 Leu Leu Asp His Tyr Glu Trp Asn Cys Phe Val Phe Leu Tyr Asp Thr 145 150 155 160 Asp Arg Gly Tyr Ser Ile Leu Gln Ala Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln 165 170 175 Asn Gly Trp His Val Ser Ala Ile Cys Val Glu Asn Phe Asn Asp Val 180 185 190 Ser Tyr Arg Gln Leu Leu Glu Glu Leu Asp Arg Arg Gln Glu Lys Lys 195 200 205 Phe Val Ile Asp Cys Glu Ile Glu Arg Leu Gln Asn Ile Leu Glu Gln 210 215 220 Ile Val Ser Val Gly Lys His Val Lys Gly Tyr His Tyr Ile Ile Ala 225 230 235 240 Asn Leu Gly Phe Lys Asp Ile Ser Leu Glu Arg Phe Ile His Gly Gly 245 250 255 Ala Asn Val Thr Gly Phe Gln Leu Val Asp Phe Asn Thr Pro Met Val 260 265 270 Thr Lys Leu Met Asp Arg Trp Lys Lys Leu Asp Gln Arg Glu Tyr Pro 275 280 285 Gly Ser Glu Thr Pro Pro Lys Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Tyr Asp Gly 290 295 300 Val Leu Val Met Ala Glu Thr Phe Arg Ser Leu Arg Arg Gln Lys Ile 305 310 315 320 Asp Ile Ser Arg Arg Gly Asn Ala Gly Asp Cys Leu Ala Asn Pro Ala 325 330 335 Ala Pro Trp Gly Gln Gly Ile Asp Met Glu Arg Thr Leu Lys Gln Val 340 345 350 Arg Ile Gln Gly Leu Thr Gly Asn Val Gln Phe Asp His Tyr Gly Arg 355 360 365 Arg Val Asn Tyr Thr Met Asp Val Phe Glu Leu Lys Ser Thr Gly Pro 370 375 380 Arg Lys Val Gly Tyr Trp Asn Asp Met Asp Lys Leu Val Leu Ile Gln 385 390 395 400 Asp Met Pro Thr Leu Gly Asn Asp Thr Ala Ala Ile Glu Asn Arg Thr 405 410 415 Val Val Val Thr Thr Ile Met Glu Ser Pro Tyr Val Met Tyr Lys Lys 420 425 430 Asn His Glu Met Phe Glu Gly Asn Asp Lys Tyr Glu Gly Tyr Cys Val 435 440 445 Asp Leu Ala Ser Glu Ser Ala Lys His Ile Gly Ile Lys Tyr Lys Ile 450 455 460 Ala Ile Val Pro Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Arg Asp Ala Asp Thr Lys 465 470 475 480 Ile Trp Asn Gly Met Val Gly Glu Leu Val Tyr Gly Lys Ala Glu Ile 485 490 495 Ala Ile Ala Pro Leu Thr Ile Thr Leu Val Arg Glu Glu Val Ile Asp 500 505 510 Phe Ser Lys Pro Phe Met Ser Leu Gly Ile Ser Ile Met Ile Lys Lys 515 520 525 Pro Gln Lys Ser Lys Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asp Pro Leu Ala 530 535 540 Tyr Glu Ile Trp Met Cys Ile Val Phe Ala Tyr Ile Gly Val Ser Val 545 550 555 560 Val Leu Phe Leu Val Ser Arg Phe Ser Pro Tyr Glu Trp His Thr Glu 565 570 575 Glu Pro Glu Asp Gly Lys Glu Gly Pro Ser Asp Gln Pro Pro Asn Glu 580 585 590 Phe Gly Ile Phe Asn Ser Leu Trp Phe Ser Leu Gly Ala Phe Met Gln 595 600 605 Gln Gly Cys Asp Ile Ser Pro Arg Ser Leu Ser Gly Arg Ile Val Gly 610 615 620 Gly Val Trp Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala 625 630 635 640 Asn Leu Ala Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Val Ser Pro Ile Glu 645 650 655 Ser Ala Glu Asp Leu Ala Lys Gln Thr Glu Ile Ala Tyr Gly Thr Leu 660 665 670 Asp Ser Gly Ser Thr Lys Glu Phe Phe Arg Arg Ser Lys Ile Ala Val 675 680 685 Tyr Glu Lys Met Trp Thr Tyr Met Arg Ser Ala Glu Pro Ser Val Phe 690 695 700 Thr Arg Thr Thr Ala Glu Gly Val Ala Arg Val Arg Lys Ser Lys Gly 705 710 715 720 Lys Phe Ala Phe Leu Leu Glu Ser Thr Met Asn Glu Tyr Ile Glu Gln 725 730 735 Arg Lys Pro Cys Asp Thr Met Lys Val Gly Gly Asn Leu Asp Ser Lys 740 745 750 Gly Tyr Gly Val Ala Thr Pro Lys Gly Ser Ser Leu Arg Thr Pro Val 755 760 765 Asn Leu Ala Val Leu Lys Leu Ser Glu Ala Gly Val Leu Asp Lys Leu 770 775 780 Lys Asn Lys Trp Trp Tyr Asp Lys Gly Glu Cys Gly Pro Lys Asp Ser 785 790 795 800 Gly Ser Lys Asp Lys Thr Ser Ala Leu Ser Leu Ser Asn Val Ala Gly 805 810 815 Val Phe Tyr Ile Leu Val Gly Gly Leu Gly Leu Ala Met Leu Val Ala 820 825 830 Leu Ile Glu Phe Cys Tyr Lys Ser Arg Ala Glu Ala Lys Arg Met Lys 835 840 845 Leu Thr Phe Ser Glu Ala Ile Arg Asn Lys Ala Arg Leu Ser Ile Thr 850 855 860 Gly Ser Val Gly Glu Asn Gly Arg Val Leu Thr Pro Asp Cys Pro Lys 865 870 875 880 Ala Val His Thr Gly Thr Ala Ile Arg Gln Ser Ser Gly Leu Ala Val 885 890 895 Ile Ala Ser Asp Leu Pro 900
【０１３７】 <210> 3 <211> 3250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GluR5 <221> CDS <222> (188)...(2950) <400> 3 ggctaggaag cccgcttcac gtccccacgc ttgttccctc cacctcgctc tcctgagagc 60 agagagcgcg cggtgtgcag actcggagca ttccgggagg atgaggcggg gacccagccc 120 aagttgggtg catcttgcgg gcgtgaggcc acaactgggt ttcggcatga attaagaagc 180 ttgaaag atg gag cgc agc aca gtc ctt atc caa ccc ggg ctc tgg acc 229 Met Glu Arg Ser Thr Val Leu Ile Gln Pro Gly Leu Trp Thr 1 5 10 agg gac acc agc tgg aca ctc ctc tat ttc ctg tgc tac atc ctc cct 277 Arg Asp Thr Ser Trp Thr Leu Leu Tyr Phe Leu Cys Tyr Ile Leu Pro 15 20 25 30 cag acc tcc cct caa gtg ctc agg atc gga ggg att ttt gaa act gtg 325 Gln Thr Ser Pro Gln Val Leu Arg Ile Gly Gly Ile Phe Glu Thr Val 35 40 45 gaa aat gaa cct gtt aat gtt gaa gaa tta gct ttc aag ttt gca gtc 373 Glu Asn Glu Pro Val Asn Val Glu Glu Leu Ala Phe Lys Phe Ala Val 50 55 60 acc agt att aac cga aac cga acc ttg atg ccc aat acc aca tta acc 421 Thr Ser Ile Asn Arg Asn Arg Thr Leu Met Pro Asn Thr Thr Leu Thr 65 70 75 tat gac atc cag aga att aat ctt ttt gat agt ttt gaa gcc tcc cga 469 Tyr Asp Ile Gln Arg Ile Asn Leu Phe Asp Ser Phe Glu Ala Ser Arg 80 85 90 aga gca tgc gac cag ctg gct ctc ggg gtg gcc gca ctc ttc ggc cct 517 Arg Ala Cys Asp Gln Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Leu Phe Gly Pro 95 100 105 110 tcc cac agc tcc tcc gtc agt gct gta cag tct att tgc aat gct ctg 565 Ser His Ser Ser Ser Val Ser Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu 115 120 125 gaa gtt cca cac att cag act cgc tgg aaa cac cct tcc gtg gac agc 613 Glu Val Pro His Ile Gln Thr Arg Trp Lys His Pro Ser Val Asp Ser 130 135 140 aga gac cta ttt tat atc aac ctc tac ccg gac tat gcg gct atc agc 661 Arg Asp Leu Phe Tyr Ile Asn Leu Tyr Pro Asp Tyr Ala Ala Ile Ser 145 150 155 agg gcg gtc ctg gat ttg gtc ctc tat tac aac tgg aaa aca gtg acg 709 Arg Ala Val Leu Asp Leu Val Leu Tyr Tyr Asn Trp Lys Thr Val Thr 160 165 170 gtg gtg tat gaa gat agc aca ggt cta att cgt ctg caa gag ctc atc 757 Val Val Tyr Glu Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg 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Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu 290 295 300 cag gcc ccg ccc aga ccc gag act ggt ctt ctg gat ggc atg atg aca 1141 Gln Ala Pro Pro Arg Pro Glu Thr Gly Leu Leu Asp Gly Met Met Thr 305 310 315 act gaa gca gcg ctg atg tac gat gct gtg tac atg gta gcc att gcg 1189 Thr Glu Ala Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val Tyr Met Val Ala Ile Ala 320 325 330 tcc cac cgt gcc tct cag ctg acc gtc agc tcc ctg cag tgc cat cga 1237 Ser His Arg Ala Ser Gln Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Cys His Arg 335 340 345 350 cat aag cca tgg cgc ctt gga ccc aga ttt atg aac ctc atc aaa gag 1285 His Lys Pro Trp Arg Leu Gly Pro Arg Phe Met Asn Leu Ile Lys Glu 355 360 365 gct cgg tgg gac ggc ttg act ggg cgg atc acc ttc aat aag acc gat 1333 Ala Arg Trp Asp Gly Leu Thr Gly Arg Ile Thr Phe Asn Lys Thr Asp 370 375 380 ggc ttg aga aag gat ttt gac ctg gac att atc agt ctc aaa gag gaa 1381 Gly Leu Arg Lys Asp Phe Asp Leu Asp Ile Ile Ser Leu Lys Glu Glu 385 390 395 gga act gaa aag gcc tct ggt gaa gtg tct aaa cac ttg tat aaa gtg 1429 Gly Thr Glu Lys Ala Ser Gly Glu Val Ser Lys His Leu Tyr Lys Val 400 405 410 tgg aag aag att ggg att tgg aac tcc aac agt ggg ctg aac atg acg 1477 Trp Lys Lys Ile Gly Ile Trp Asn Ser Asn Ser Gly Leu Asn Met Thr 415 420 425 430 gat ggc aac aga gac agg tcc aac aat atc acg gac tcg ctg gct aac 1525 Asp Gly Asn Arg Asp Arg Ser Asn Asn Ile Thr Asp Ser Leu Ala Asn 435 440 445 cgc aca ctc att gtc acc act att ctg gaa gag ccc tac gtg atg tac 1573 Arg Thr Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Met Tyr 450 455 460 agg aaa tcc gat aag ccc ttg tat gga aac gac agg ttt gaa gga tat 1621 Arg Lys Ser Asp Lys Pro Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe Glu Gly Tyr 465 470 475 tgc ctg gat ctg ctg aaa gaa ctg tcc aat atc ctg ggt ttt ctt tac 1669 Cys Leu Asp Leu Leu Lys Glu Leu Ser Asn Ile Leu Gly Phe Leu Tyr 480 485 490 gat gtt aaa ctg gtt cct gat ggc aaa tat gga gca cag aat gac aaa 1717 Asp Val Lys Leu Val Pro Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asn Asp Lys 495 500 505 510 ggg gaa tgg aat ggg atg gta aaa gaa ctc atc gac cac aga gct gac 1765 Gly Glu Trp Asn Gly Met Val Lys Glu Leu Ile Asp His Arg Ala Asp 515 520 525 ctg gca gtg gcc cct ctc acc atc aca tac gta cgg gag aaa gtc att 1813 Leu Ala Val Ala Pro Leu Thr Ile Thr Tyr Val Arg Glu Lys Val Ile 530 535 540 gac ttc tcc aag ccc ttc atg acc ctg ggc att agc atc ctt tac cgg 1861 Asp Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Tyr Arg 545 550 555 aag ccc aat gga acc aac ccg ggt gtc ttc tcc ttc ctc aac ccc cta 1909 Lys Pro Asn Gly Thr Asn Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asn Pro Leu 560 565 570 tct ccg gac att tgg atg tac gtg ctg ctc gcc tgc cta gga gtc agt 1957 Ser Pro Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Cys Leu Gly Val Ser 575 580 585 590 tgt gta ctg ttt gtg att gcg agg ttc aca ccc tac gag tgg tat aac 2005 Cys Val Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Thr Pro Tyr Glu Trp Tyr Asn 595 600 605 ccc cac cca tgc aac ccc gac tca gac gtg gtg gaa aac aat ttc act 2053 Pro His Pro Cys Asn Pro Asp Ser Asp Val Val Glu Asn Asn Phe Thr 610 615 620 ttg cta aat agt ttc tgg ttt gga gtt gga gct ctc atg cag caa gga 2101 Leu Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Gln Gln Gly 625 630 635 tca gag ctg atg ccc aag gct cta tcg acc aga ata gtt gga gga ata 2149 Ser Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile 640 645 650 tgg tgg ttt ttc acc cta atc atc att tca tcc tac acg gcc aac ctg 2197 Trp Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu 655 660 665 670 gct gcc ttc ttg acg gta gaa aga atg gaa tcc ccc atc gat tcc gca 2245 Ala Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala 675 680 685 gac gat ctg gcc aaa caa acc aag ata gaa tat ggg gca gtc aga gat 2293 Asp Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Arg Asp 690 695 700 ggc tcg acg atg acc ttc ttc aag aaa tca aag atc tcc acc tat gag 2341 Gly Ser Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser Thr Tyr Glu 705 710 715 aaa atg tgg gct ttc atg agc agt aga cag cag agc gca ctg gtt aaa 2389 Lys Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Gln Gln Ser Ala Leu Val Lys 720 725 730 aac agt gac gag ggg atc caa agg gtg ctc acc acc gac tac gca ctg 2437 Asn Ser Asp Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Thr Asp Tyr Ala Leu 735 740 745 750 ctg atg gag tcc acc agc att gag tat gtg acg cag agg aac tgc aac 2485 Leu Met Glu Ser Thr Ser Ile Glu Tyr Val Thr Gln Arg Asn Cys Asn 755 760 765 ctc act cag atc ggg ggc ctc ata gac tcc aaa ggc tat gga gtg ggg 2533 Leu Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val Gly 770 775 780 acg cct atc ggc tcc cct tac cgg gat aaa att acg att gcc att ctt 2581 Thr Pro Ile Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile Leu 785 790 795 caa ctg caa gaa gaa ggg aag ctt cat atg atg aaa gag aag tgg tgg 2629 Gln Leu Gln Glu Glu Gly Lys Leu His Met Met Lys Glu Lys Trp Trp 800 805 810 agg ggg aat ggc tgc cct gaa gaa gac agt aag gaa gcc agt gct ctg 2677 Arg Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Asp Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu 815 820 825 830 gga gtg gaa aat atc ggc ggc atc ttc att gtt ctg gct gca gga ctc 2725 Gly Val Glu Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu 835 840 845 gtg ctt tct gtg ttt gta gcc att gga gaa ttt tta tac aaa tca cgg 2773 Val Leu Ser Val Phe Val Ala Ile Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Arg 850 855 860 aag aac aat gac gtt gag cag tgt ctc tct ttc aat gcc atc atg gaa 2821 Lys Asn Asn Asp Val Glu Gln Cys Leu Ser Phe Asn Ala Ile Met Glu 865 870 875 gag ctg gga ata tcc ctc aag aat cag aaa aaa tta aag aaa aag tca 2869 Glu Leu Gly Ile Ser Leu Lys Asn Gln Lys Lys Leu Lys Lys Lys Ser 880 885 890 aga act aag ggc aaa tct tct ttc aca agt atc ctt act tgt cac cag 2917 Arg Thr Lys Gly Lys Ser Ser Phe Thr Ser Ile Leu Thr Cys His Gln 895 900 905 910 aga cga act cag aga aaa gag aca gtg gcg tga tcaaagaaca cacctgtaag 2970 Arg Arg Thr Gln Arg Lys Glu Thr Val Ala * 915 920 aagaaaaagc ccacacgtcc gctgcacata tttggaggac agatttcaga ggactatgtc 3030 tttatccata accccagtcg tggacagagg gggaagaaat gcacaatttt taaagctcac 3090 atagatatta cttgagaagt gaaactgatt cttttcagat gaatttgtat gcacacttat 3150 tttgaatttt tccatttcct ccgataaatt gctatgtgtg ctttctaaat aataataaac 3210 aagcggactt tgtttttcat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3250
【０１３８】 <210> 4 <211> 920 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Glu Arg Ser Thr Val Leu Ile Gln Pro Gly Leu Trp Thr Arg Asp 1 5 10 15 Thr Ser Trp Thr Leu Leu Tyr Phe Leu Cys Tyr Ile Leu Pro Gln Thr 20 25 30 Ser Pro Gln Val Leu Arg Ile Gly Gly Ile Phe Glu Thr Val Glu Asn 35 40 45 Glu Pro Val Asn Val Glu Glu Leu Ala Phe Lys Phe Ala Val Thr Ser 50 55 60 Ile Asn Arg Asn Arg Thr Leu Met Pro Asn Thr Thr Leu Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ile Gln Arg Ile Asn Leu Phe Asp Ser Phe Glu Ala Ser Arg Arg Ala 85 90 95 Cys Asp Gln Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Leu Phe Gly Pro Ser His 100 105 110 Ser Ser Ser Val Ser Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Glu Val 115 120 125 Pro His Ile Gln Thr Arg Trp Lys His Pro Ser Val Asp Ser Arg Asp 130 135 140 Leu Phe Tyr Ile Asn Leu Tyr Pro Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Arg Ala 145 150 155 160 Val Leu Asp Leu Val Leu Tyr Tyr Asn Trp Lys Thr Val Thr Val Val 165 170 175 Tyr Glu Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys Ala 180 185 190 Pro Ser Arg Tyr Asn Ile Lys Ile Lys Ile Arg Gln Leu Pro Pro Ala 195 200 205 Asn Lys Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Phe Tyr Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Thr Ala Ala Glu Ile Leu 225 230 235 240 Lys Gln Ile Leu Phe Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr Phe 245 250 255 Phe Thr Thr Leu Asp Leu Phe Ala Leu Asp Leu Glu Leu Tyr Arg Tyr 260 265 270 Ser Gly Val Asn Met Thr Gly Phe Arg Leu Leu Asn Ile Asp Asn Pro 275 280 285 His Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln Ala 290 295 300 Pro Pro Arg Pro Glu Thr Gly Leu Leu Asp Gly Met Met Thr Thr Glu 305 310 315 320 Ala Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val Tyr Met Val Ala Ile Ala Ser His 325 330 335 Arg Ala Ser Gln Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Cys His Arg His Lys 340 345 350 Pro Trp Arg Leu Gly Pro Arg Phe Met Asn Leu Ile Lys Glu Ala Arg 355 360 365 Trp Asp Gly Leu Thr Gly Arg Ile Thr Phe Asn Lys Thr Asp Gly Leu 370 375 380 Arg Lys Asp Phe Asp Leu Asp Ile Ile Ser Leu Lys Glu Glu Gly Thr 385 390 395 400 Glu Lys Ala Ser Gly Glu Val Ser Lys His Leu Tyr Lys Val Trp Lys 405 410 415 Lys Ile Gly Ile Trp Asn Ser Asn Ser Gly Leu Asn Met Thr Asp Gly 420 425 430 Asn Arg Asp Arg Ser Asn Asn Ile Thr Asp Ser Leu Ala Asn Arg Thr 435 440 445 Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Met Tyr Arg Lys 450 455 460 Ser Asp Lys Pro Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe Glu Gly Tyr Cys Leu 465 470 475 480 Asp Leu Leu Lys Glu Leu Ser Asn Ile Leu Gly Phe Leu Tyr Asp Val 485 490 495 Lys Leu Val Pro Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asn Asp Lys Gly Glu 500 505 510 Trp Asn Gly Met Val Lys Glu Leu Ile Asp His Arg Ala Asp Leu Ala 515 520 525 Val Ala Pro Leu Thr Ile Thr Tyr Val Arg Glu Lys Val Ile Asp Phe 530 535 540 Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Pro 545 550 555 560 Asn Gly Thr Asn Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asn Pro Leu Ser Pro 565 570 575 Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Cys Leu Gly Val Ser Cys Val 580 585 590 Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Thr Pro Tyr Glu Trp Tyr Asn Pro His 595 600 605 Pro Cys Asn Pro Asp Ser Asp Val Val Glu Asn Asn Phe Thr Leu Leu 610 615 620 Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Gln Gln Gly Ser Glu 625 630 635 640 Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile Trp Trp 645 650 655 Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala 660 665 670 Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala Asp Asp 675 680 685 Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Arg Asp Gly Ser 690 695 700 Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser Thr Tyr Glu Lys Met 705 710 715 720 Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Gln Gln Ser Ala Leu Val Lys Asn Ser 725 730 735 Asp Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Thr Asp Tyr Ala Leu Leu Met 740 745 750 Glu Ser Thr Ser Ile Glu Tyr Val Thr Gln Arg Asn Cys Asn Leu Thr 755 760 765 Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val Gly Thr Pro 770 775 780 Ile Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile Leu Gln Leu 785 790 795 800 Gln Glu Glu Gly Lys Leu His Met Met Lys Glu Lys Trp Trp Arg Gly 805 810 815 Asn Gly Cys Pro Glu Glu Asp Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly Val 820 825 830 Glu Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val Leu 835 840 845 Ser Val Phe Val Ala Ile Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Arg Lys Asn 850 855 860 Asn Asp Val Glu Gln Cys Leu Ser Phe Asn Ala Ile Met Glu Glu Leu 865 870 875 880 Gly Ile Ser Leu Lys Asn Gln Lys Lys Leu Lys Lys Lys Ser Arg Thr 885 890 895 Lys Gly Lys Ser Ser Phe Thr Ser Ile Leu Thr Cys His Gln Arg Arg 900 905 910 Thr Gln Arg Lys Glu Thr Val Ala 915 920
【０１３９】 <210> 5 <211> 4608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GluR6 <221> CDS <222> (307)...(2961) <400> 5 gaattcgggc tcgcaagggc ttcgcaggct ggacattgtg cttgctggat ttttcccgga 60 tgctcccgga ctaacatgga tgtcccacca tcccttgcag tggaagcttg ctccttggcg 120 cagtgagagt gaagaacatg cagcgactgc taatgggttt gggaagcgga gactccttcc 180 tctttctgtg accatgccgt gattgtgtct gcggccacta ctccacgcat cttccttctc 240 gtccaagccc ggagcctaac gctagatcgg ggaagtgggt gccgcgcgcg caggcacgga 300 aacatc atg aag att att tcc cca gtt tta agt aat cta gtc ttc agt 348 Met Lys Ile Ile Ser Pro Val Leu Ser Asn Leu Val Phe Ser 1 5 10 cgc tcc att aaa gtc ctg ctc tgc tta ttg tgg atc gga tat tcg caa 396 Arg Ser Ile Lys Val Leu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Gln 15 20 25 30 gga acc aca cat gtg tta aga ttc ggt ggt ata ttt gaa tat gtg gaa 444 Gly Thr Thr His Val Leu Arg Phe Gly Gly Ile Phe Glu Tyr Val Glu 35 40 45 tct ggc ccc atg gga gca gaa gaa ctt gca ttc aga ttt gct gtg aat 492 Ser Gly Pro Met Gly Ala Glu Glu Leu Ala Phe Arg Phe Ala Val Asn 50 55 60 acc atc aac aga aac agg act ttg ctg ccc aac acc act tta act tat 540 Thr Ile Asn Arg Asn Arg Thr Leu Leu Pro Asn Thr Thr Leu Thr Tyr 65 70 75 gat act cag aag atc aat ctc tat gac agt ttt gaa gca tct aag aaa 588 Asp Thr Gln Lys Ile Asn Leu Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Ser Lys Lys 80 85 90 gct tgt gat cag ctg tct ctt ggg gtg gct gct atc ttc ggt cct tca 636 Ala Cys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Val Ala Ala Ile Phe Gly Pro Ser 95 100 105 110 cac agt tca tca gcc aat gct gtg cag tcc atc tgc aat gct ctg ggg 684 His Ser Ser Ser Ala Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Gly 115 120 125 gtt ccc cac ata cag acc cgc tgg aag cac cag gtg tca gac aac aag 732 Val Pro His Ile Gln Thr Arg Trp Lys His Gln Val Ser Asp Asn Lys 130 135 140 gat tcc ttc tac gtc agt ctc tac cca gac ttc tct tcc ctg agc cgc 780 Asp Ser Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg 145 150 155 gcc atc ttg gat ttg gtg cag ttt ttt aag tgg aaa act gtc aca gtt 828 Ala Ile Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val 160 165 170 gtg tat gac gac agc act ggt ctc att cgc ttg caa gag ctc atc aaa 876 Val Tyr Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys 175 180 185 190 gct cca tcg agg tac aat ctt cga ctt aaa att cgt cag ctg cca gct 924 Ala Pro Ser Arg Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ile Arg Gln Leu Pro Ala 195 200 205 gat acc aaa gat gca aaa cct ttg ctg aag gag atg aaa aga ggc aag 972 Asp Thr Lys Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys Arg Gly Lys 210 215 220 gag ttc cac gtg atc ttc gac tgc agc cat gag atg gca gca ggc att 1020 Glu Phe His Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Met Ala Ala Gly Ile 225 230 235 tta aaa cag gca tta gct atg gga atg atg aca gaa tac tat cac tat 1068 Leu Lys Gln Ala Leu Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr 240 245 250 ata ttt aca act ctg gac ctc ttt gct ctt gac gtg gag ccc tac aga 1116 Ile Phe Thr Thr Leu Asp Leu Phe Ala Leu Asp Val Glu Pro Tyr Arg 255 260 265 270 tac agt ggc gta aat atg aca ggg ttc agg ata cta aat aca gag aat 1164 Tyr Ser Gly Val Asn Met Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn Thr Glu Asn 275 280 285 acc caa gtc tcc tcc atc atc gaa aag tgg tct atg gaa cgg tta cag 1212 Thr Gln Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln 290 295 300 gcg cct cca aaa cct gac tca ggt ttg ctg gat gga ttt atg acg act 1260 Ala Pro Pro Lys Pro Asp Ser Gly Leu Leu Asp Gly Phe Met Thr Thr 305 310 315 gat gct gct ctg atg tat gat gca gtg cac gtt gtg tct gtg gct gtc 1308 Asp Ala Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val His Val Val Ser Val Ala Val 320 325 330 caa cag ttt ccc cag atg aca gtc agc tcc ttg caa tgc aat cga cac 1356 Gln Gln Phe Pro Gln Met Thr Val Ser Ser Leu Gln Cys Asn Arg His 335 340 345 350 aaa ccc tgg cgc ttt ggg acc cgc ttc atg agt cta att aaa gag gct 1404 Lys Pro Trp Arg Phe Gly Thr Arg Phe Met Ser Leu Ile Lys Glu Ala 355 360 365 cac tgg gaa ggt ctc aca ggc aga ata aca ttt aac aaa acc aat gga 1452 His Trp Glu Gly Leu Thr Gly Arg Ile Thr Phe Asn Lys Thr Asn Gly 370 375 380 tta cgg aca gat ttt gat ttg gat gtg atc agt ctc aag gaa gaa ggt 1500 Leu Arg Thr Asp Phe Asp Leu Asp Val Ile Ser Leu Lys Glu Glu Gly 385 390 395 ctg gag aag att gga act tgg gat cca gcc agt ggc ctg aat atg aca 1548 Leu Glu Lys Ile Gly Thr Trp Asp Pro Ala Ser Gly Leu Asn Met Thr 400 405 410 gaa agt cag aaa gga aag cca gca aat atc aca gac tca ttg tct aat 1596 Glu Ser Gln Lys Gly Lys Pro Ala Asn Ile Thr Asp Ser Leu Ser Asn 415 420 425 430 cgt tct ttg att gtt acc acc att ttg gaa gaa ccg tat gtt ctg ttt 1644 Arg Ser Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Leu Phe 435 440 445 aag aag tct gac aaa cca ctc tat ggg aat gat cga ttt gaa ggc tac 1692 Lys Lys Ser Asp Lys Pro Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe Glu Gly Tyr 450 455 460 tgt att gat ctc cta cga gag tta tct aca atc ctt ggc ttt aca tat 1740 Cys Ile Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ser Thr Ile Leu Gly Phe Thr Tyr 465 470 475 gag att agg ctt gtg gag gat ggg aaa tat gga gcc cag gat gat gtg 1788 Glu Ile Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asp Asp Val 480 485 490 aac gga caa tgg aat gga atg gtt cgt gaa cta atc gat cat aaa gct 1836 Asn Gly Gln Trp Asn Gly Met Val Arg Glu Leu Ile Asp His Lys Ala 495 500 505 510 gac ctt gca gtt gct cca ctg gct ata acc tat gtt cgt gag aag gtc 1884 Asp Leu Ala Val Ala Pro Leu Ala Ile Thr Tyr Val Arg Glu Lys Val 515 520 525 atc gac ttt tca aag ccg ttt atg aca ctt gga ata agt att ttg tac 1932 Ile Asp Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Tyr 530 535 540 cgc aag ccc aat ggt aca aac cca ggc gtc ttc tcc ttc ctg aat cct 1980 Arg Lys Pro Asn Gly Thr Asn Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asn Pro 545 550 555 ctc tcc cct gat atc tgg atg tat gtt ctg ctg gct tgc ttg ggt gtc 2028 Leu Ser Pro Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Cys Leu Gly Val 560 565 570 agt tgt gtg ctc ttt gtc ata gcc agg ttt agt ccc tat gag tgg tat 2076 Ser Cys Val Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Ser Pro Tyr Glu Trp Tyr 575 580 585 590 aac cca cac cct tgc aac cct gac tca gac gtg gtg gaa aac aat ttt 2124 Asn Pro His Pro Cys Asn Pro Asp Ser Asp Val Val Glu Asn Asn Phe 595 600 605 acc ttg cta aat agt ttc tgg ttt gga gtt gga gct ctc atg cgg caa 2172 Thr Leu Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Arg Gln 610 615 620 ggt tct gag ctc atg ccc aaa gca ctc tcc acc agg ata gtg gga ggc 2220 Gly Ser Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly 625 630 635 att tgg tgg ttt ttc aca ctt atc atc att tct tcg tat acc gct aac 2268 Ile Trp Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn 640 645 650 cta gcc gcc ttt ctg act gtg gaa cgc atg gag tcg ccc att gac tct 2316 Leu Ala Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser 655 660 665 670 gct gac gat tta gct aag caa acc aag ata gag tat gga gca gtg gag 2364 Ala Asp Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Glu 675 680 685 gac ggc gca acc atg acg ttt ttt aag aaa tca aaa att tca acg tat 2412 Asp Gly Ala Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser Thr Tyr 690 695 700 gat aaa atg tgg gcg ttt atg agc agc agg aga cag tct gtg ctt gtc 2460 Asp Lys Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val 705 710 715 aaa agc aat gag gaa ggg atc caa cga gtc ctc acc tcg gat tat gct 2508 Lys Ser Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Ser Asp Tyr Ala 720 725 730 ttc tta atg gag tca aca acc atc gag ttt gtt aca cag cgg aac tgt 2556 Phe Leu Met Glu Ser Thr Thr Ile Glu Phe Val Thr Gln Arg Asn Cys 735 740 745 750 aac ctc acg cag att ggc ggc ctt ata gac tcc aaa ggc tat ggc gtt 2604 Asn Leu Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val 755 760 765 ggc act cct atg ggc tct cca tat cga gac aaa atc acc ata gca att 2652 Gly Thr Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile 770 775 780 ctt cag ctg cag gag gaa ggc aag ctg cac atg atg aag gag aaa tgg 2700 Leu Gln Leu Gln Glu Glu Gly Lys Leu His Met Met Lys Glu Lys Trp 785 790 795 tgg cgg ggc aat ggc tgc cca gag gag gag agc aaa gag gcc agt gct 2748 Trp Arg Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala 800 805 810 ctg ggg gtg cag aat att ggt ggt atc ttc att gtc ctg gca gcc ggc 2796 Leu Gly Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly 815 820 825 830 ttg gtg ctc tca gtt ttt gtg gca gtg gga gag ttt tta tac aaa tcc 2844 Leu Val Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser 835 840 845 aaa aaa aac gct caa ttg gaa aag agg tcc ttc tgt agc gct atg gtg 2892 Lys Lys Asn Ala Gln Leu Glu Lys Arg Ser Phe Cys Ser Ala Met Val 850 855 860 gaa gag ctg aga atg tcc ctg aag tgc cag cgt cgg ctc aaa cat aag 2940 Glu Glu Leu Arg Met Ser Leu Lys Cys Gln Arg Arg Leu Lys His Lys 865 870 875 cca cag ccc cag tta ttg tga aaacagaaga agttatcaac atgcacacat 2991 Pro Gln Pro Gln Leu Leu * 880 ttaacgacag aaggttgcca ggtaaagaaa ccatggcatg aagctgggag gccaatcacc 3051 caagcacaaa ctgtcgtctt tttttttttt ttttccaaac aatttagcga gaatgtttcc 3111 tgtggaaata tgcaacctgt gcaaaataaa atgagttacc tcatgccgct gtgtctatga 3171 actagagact ctgtgatcta agcagtttca gtgatcagac ttgatttaca agcaccgtgg 3231 atcaaccaag ttacacgggg ttacactgtt tatcataggt tcctcccttc ctttgagtga 3291 atgttacatg caaatgttgt ggctggtttc aaatgcagtc cagggagaaa ctgctggttc 3351 cttctgaagc tcagctgtcg tcaggagatg gaatgccggt gcccaaaagg gtaaccaata 3411 aaaatgccat aaaaatttta aaaaaatgcg tgagatcggc aaaaattata gtgttacaag 3471 aaacagtaca gtcccatggt caccaacaca atagaggtga taatgttact agcccccaat 3531 actcagtaaa atcgtcatct gaatagataa tatgtgttca tagaatgtga aaaaaaatgt 3591 aatgcgagac acaccagtat caatagaagt ggaactgaag gcagaacatc atcagttact 3651 tttctttttc aatagtctgt gtcatggatt gtgatataga tggcaattat caagccaata 3711 attttttttc tgaaaatacc tatggcaaat attttaatag gcaacttgct cccacaaatc 3771 cctactctaa cctcccccag aaatataaaa ggaaccattg gtttagagat tggtatgtaa 3831 gagatgatgt tttgcaagcc ttgtcgtgca ttgtaaaagg gctcagtgtt actggttaca 3891 gggaagactg aagctttcac cctgacattc tgaaatgtca accgaaactc tccttcctcc 3951 tgtaaaggac cttgatgggg cagattccat tgatcaaaga atggggactt gtcacctata 4011 caatggtacg tgacagaact ttgaggtgga ctgcatttaa taatagtcac aatgttaaaa 4071 gaacaaaatt cttgagcagt tttttttttt tgttttgttt tgttttcaaa aaatgttcag 4131 gtttatttgt ggaaatgcaa gatttctata aaatagtttt tgtatggaaa tttttgtaat 4191 actttttatc aacaaaataa gaacacatgt ttctgtcagg ggtgtgaggt caagcatgaa 4251 cggtagtgcg tgtgcaccac caacgtttgg tgaaactatt tttatcaaga aaaaggaatc 4311 atagaagaga aatattttca agttagatac tataaaagct aggtgcacta ccaccacggc 4371 ttgtcgcgcc acacccctga gtccacaagg tggataacat attgtaatga acagttgtgt 4431 gtaaaatggc aaaagacaca gacctcttga caacattgtg aaaacagttg agtgcacaca 4491 gtttgctgtt tgaatccaat gcacaaaaat tttacaaaaa tccattaaaa ttatgtccgt 4551 tttaaaacct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc cggtgcccaa ttcgccc 4608
【０１４０】 <210> 6 <211> 884 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Met Lys Ile Ile Ser Pro Val Leu Ser Asn Leu Val Phe Ser Arg Ser 1 5 10 15 Ile Lys Val Leu Leu Cys Leu Leu Trp Ile Gly Tyr Ser Gln Gly Thr 20 25 30 Thr His Val Leu Arg Phe Gly Gly Ile Phe Glu Tyr Val Glu Ser Gly 35 40 45 Pro Met Gly Ala Glu Glu Leu Ala Phe Arg Phe Ala Val Asn Thr Ile 50 55 60 Asn Arg Asn Arg Thr Leu Leu Pro Asn Thr Thr Leu Thr Tyr Asp Thr 65 70 75 80 Gln Lys Ile Asn Leu Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Ser Lys Lys Ala Cys 85 90 95 Asp Gln Leu Ser Leu Gly Val Ala Ala Ile Phe Gly Pro Ser His Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn Ala Leu Gly Val Pro 115 120 125 His Ile Gln Thr Arg Trp Lys His Gln Val Ser Asp Asn Lys Asp Ser 130 135 140 Phe Tyr Val Ser Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Ser Leu Ser Arg Ala Ile 145 150 155 160 Leu Asp Leu Val Gln Phe Phe Lys Trp Lys Thr Val Thr Val Val Tyr 165 170 175 Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu Leu Ile Lys Ala Pro 180 185 190 Ser Arg Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ile Arg Gln Leu Pro Ala Asp Thr 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys Arg Gly Lys Glu Phe 210 215 220 His Val Ile Phe Asp Cys Ser His Glu Met Ala Ala Gly Ile Leu Lys 225 230 235 240 Gln Ala Leu Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr Tyr His Tyr Ile Phe 245 250 255 Thr Thr Leu Asp Leu Phe Ala Leu Asp Val Glu Pro Tyr Arg Tyr Ser 260 265 270 Gly Val Asn Met Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn Thr Glu Asn Thr Gln 275 280 285 Val Ser Ser Ile Ile Glu Lys Trp Ser Met Glu Arg Leu Gln Ala Pro 290 295 300 Pro Lys Pro Asp Ser Gly Leu Leu Asp Gly Phe Met Thr Thr Asp Ala 305 310 315 320 Ala Leu Met Tyr Asp Ala Val His Val Val Ser Val Ala Val Gln Gln 325 330 335 Phe Pro Gln Met Thr Val Ser Ser Leu Gln Cys Asn Arg His Lys Pro 340 345 350 Trp Arg Phe Gly Thr Arg Phe Met Ser Leu Ile Lys Glu Ala His Trp 355 360 365 Glu Gly Leu Thr Gly Arg Ile Thr Phe Asn Lys Thr Asn Gly Leu Arg 370 375 380 Thr Asp Phe Asp Leu Asp Val Ile Ser Leu Lys Glu Glu Gly Leu Glu 385 390 395 400 Lys Ile Gly Thr Trp Asp Pro Ala Ser Gly Leu Asn Met Thr Glu Ser 405 410 415 Gln Lys Gly Lys Pro Ala Asn Ile Thr Asp Ser Leu Ser Asn Arg Ser 420 425 430 Leu Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu Glu Pro Tyr Val Leu Phe Lys Lys 435 440 445 Ser Asp Lys Pro Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe Glu Gly Tyr Cys Ile 450 455 460 Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ser Thr Ile Leu Gly Phe Thr Tyr Glu Ile 465 470 475 480 Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln Asp Asp Val Asn Gly 485 490 495 Gln Trp Asn Gly Met Val Arg Glu Leu Ile Asp His Lys Ala Asp Leu 500 505 510 Ala Val Ala Pro Leu Ala Ile Thr Tyr Val Arg Glu Lys Val Ile Asp 515 520 525 Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Ile Ser Ile Leu Tyr Arg Lys 530 535 540 Pro Asn Gly Thr Asn Pro Gly Val Phe Ser Phe Leu Asn Pro Leu Ser 545 550 555 560 Pro Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Cys Leu Gly Val Ser Cys 565 570 575 Val Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Ser Pro Tyr Glu Trp Tyr Asn Pro 580 585 590 His Pro Cys Asn Pro Asp Ser Asp Val Val Glu Asn Asn Phe Thr Leu 595 600 605 Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Val Gly Ala Leu Met Arg Gln Gly Ser 610 615 620 Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Val Gly Gly Ile Trp 625 630 635 640 Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala 645 650 655 Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile Asp Ser Ala Asp 660 665 670 Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala Val Glu Asp Gly 675 680 685 Ala Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser Thr Tyr Asp Lys 690 695 700 Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Arg Arg Gln Ser Val Leu Val Lys Ser 705 710 715 720 Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Val Leu Thr Ser Asp Tyr Ala Phe Leu 725 730 735 Met Glu Ser Thr Thr Ile Glu Phe Val Thr Gln Arg Asn Cys Asn Leu 740 745 750 Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Val Gly Thr 755 760 765 Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala Ile Leu Gln 770 775 780 Leu Gln Glu Glu Gly Lys Leu His Met Met Lys Glu Lys Trp Trp Arg 785 790 795 800 Gly Asn Gly Cys Pro Glu Glu Glu Ser Lys Glu Ala Ser Ala Leu Gly 805 810 815 Val Gln Asn Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala Gly Leu Val 820 825 830 Leu Ser Val Phe Val Ala Val Gly Glu Phe Leu Tyr Lys Ser Lys Lys 835 840 845 Asn Ala Gln Leu Glu Lys Arg Ser Phe Cys Ser Ala Met Val Glu Glu 850 855 860 Leu Arg Met Ser Leu Lys Cys Gln Arg Arg Leu Lys His Lys Pro Gln 865 870 875 880 Pro Gln Leu Leu
【０１４１】 <210> 7 <211> 3344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GluR7 <221> CDS <222> (1)...(2766) <400> 7 ggg gcc gtg gcg ggc tcc ctg ggg cgc ctc cgg agt ctg gtt tgg gaa 48 Gly Ala Val Ala Gly Ser Leu Gly Arg Leu Arg Ser Leu Val Trp Glu 1 5 10 15 tac tgg gcc ggg ttc ctc gtg tgc gcc ttc tgg atc cca gac tcg cgc 96 Tyr Trp Ala Gly Phe Leu Val Cys Ala Phe Trp Ile Pro Asp Ser Arg 20 25 30 ggg atg ccc cac gtc atc cgg atc ggc gga atc ttt gag tac gcg gac 144 Gly Met Pro His Val Ile Arg Ile Gly Gly Ile Phe Glu Tyr Ala Asp 35 40 45 ggc ccc aac gcc cag gtc atg aac gct gag gag cac gcc ttt cgg ttt 192 Gly Pro Asn Ala Gln Val Met Asn Ala Glu Glu His Ala Phe Arg Phe 50 55 60 tct gcc aat atc atc aac agg aac aga act ctg ctg ccc aac acg acc 240 Ser Ala Asn Ile Ile Asn Arg Asn Arg Thr Leu Leu Pro Asn Thr Thr 65 70 75 80 ctg acc tac gac att cag agg att cac ttc cat gac agt ttt gag gcc 288 Leu Thr Tyr Asp Ile Gln Arg Ile His Phe His Asp Ser Phe Glu Ala 85 90 95 acc aag aag gcc tgt gac cag ttg gcg ctc ggt gtg gta gcc atc ttt 336 Thr Lys Lys Ala Cys Asp Gln Leu Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Phe 100 105 110 ggg cca tcc cag ggc tcc tgc atc aat gcc gtc cag tcc atc tgc aat 384 Gly Pro Ser Gln Gly Ser Cys Ile Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn 115 120 125 gcc ttg gag gtt cct cac atc caa ctg cgc tgg aag cac cac ccc ctg 432 Ala Leu Glu Val Pro His Ile Gln Leu Arg Trp Lys His His Pro Leu 130 135 140 gac aac aag gac acc ttc tac gtg aac ctc tac ccc gac tac gcc tct 480 Asp Asn Lys Asp Thr Phe Tyr Val Asn Leu Tyr Pro Asp Tyr Ala Ser 145 150 155 160 ctc agc cac gcc atc ctc gac ttg gtc cag tcc ctc aag tgg cgg tca 528 Leu Ser His Ala Ile Leu Asp Leu Val Gln Ser Leu Lys Trp Arg Ser 165 170 175 gcc acc gta gtc tat gat gac agt aca ggt ctc atc cgg ctg cag gag 576 Ala Thr Val Val Tyr Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu 180 185 190 ctc atc atg gct cca tct agg tac aac atc cgc ctg aag att cgc cag 624 Leu Ile Met Ala Pro Ser Arg Tyr Asn Ile Arg Leu Lys Ile Arg Gln 195 200 205 ctc ccc atc gac tcc gat gac tca cgc ccc ttg ctc aaa gag atg aag 672 Leu Pro Ile Asp Ser Asp Asp Ser Arg Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys 210 215 220 cgg ggc cgg gag ttc cgt atc atc ttt gac tgc agt cac acc atg gca 720 Arg Gly Arg Glu Phe Arg Ile Ile Phe Asp Cys Ser His Thr Met Ala 225 230 235 240 gcc cag atc ctc aag cag gcc atg gcc atg ggc atg atg acg gaa tac 768 Ala Gln Ile Leu Lys Gln Ala Met Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr 245 250 255 tac cac ttc atc ttc acc act ctg gat ctc tat gcg cta gac ctg gaa 816 Tyr His Phe Ile Phe Thr Thr Leu Asp Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Glu 260 265 270 ccc tac cgc tac tcg gga gtg aac ctg act ggg ttc cgc ata ctc aac 864 Pro Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Asn Leu Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn 275 280 285 gtg gac aac ccc cat gtc tca gcc att gtg gag aag tgg tcc atg gag 912 Val Asp Asn Pro His Val Ser Ala Ile Val Glu Lys Trp Ser Met Glu 290 295 300 cgg cta cag gca gct ccc cgg gca gag tca ggc ctg ctg gat gga gtg 960 Arg Leu Gln Ala Ala Pro Arg Ala Glu Ser Gly Leu Leu Asp Gly Val 305 310 315 320 atg atg acc gat gca gcc ctg ctc tac gat gcg gtc cac att gtg tct 1008 Met Met Thr Asp Ala Ala Leu Leu Tyr Asp Ala Val His Ile Val Ser 325 330 335 gtg tgc tac cag cga gcg ccg cag atg act gtg aac tcc cta cag tgc 1056 Val Cys Tyr Gln Arg Ala Pro Gln Met Thr Val Asn Ser Leu Gln Cys 340 345 350 cat cgg cac aag gcc tgg cgc ttc ggt ggc cgc ttc atg aac ttc atc 1104 His Arg His Lys Ala Trp Arg Phe Gly Gly Arg Phe Met Asn Phe Ile 355 360 365 aag gag gct caa tgg gaa gga tta act gga cgg att gtt ttc aac aaa 1152 Lys Glu Ala Gln Trp Glu Gly Leu Thr Gly Arg Ile Val Phe Asn Lys 370 375 380 acc agt ggc ttg cgg act gat ttt gat ctg gac atc atc agc ctc aag 1200 Thr Ser Gly Leu Arg Thr Asp Phe Asp Leu Asp Ile Ile Ser Leu Lys 385 390 395 400 gaa gat ggc ctc gag aag gtc ggg gtg tgg agt cca gct gac ggt ctc 1248 Glu Asp Gly Leu Glu Lys Val Gly Val Trp Ser Pro Ala Asp Gly Leu 405 410 415 aat atc act gag gtt gcc aaa ggc cga ggt cct aat gtc acc gac tct 1296 Asn Ile Thr Glu Val Ala Lys Gly Arg Gly Pro Asn Val Thr Asp Ser 420 425 430 ctg acc aac agg tca ctc atc gtc acc act ctg ctg gag gag cct ttt 1344 Leu Thr Asn Arg Ser Leu Ile Val Thr Thr Leu Leu Glu Glu Pro Phe 435 440 445 gtc atg ttc cgc aag tct gat agg acc ctt tac ggc aat gac cgg ttc 1392 Val Met Phe Arg Lys Ser Asp Arg Thr Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe 450 455 460 gag ggc tac tgc atc gac ttg ctc aag gag ctg gcg cac atc ctg ggc 1440 Glu Gly Tyr Cys Ile Asp Leu Leu Lys Glu Leu Ala His Ile Leu Gly 465 470 475 480 ttc tcc tac gag atc cgg ctg gtg gaa gac ggc aag tac ggg gca cag 1488 Phe Ser Tyr Glu Ile Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln 485 490 495 gac gac aag ggc cag tgg aac ggc atg gtc aag gaa ctc att gac cac 1536 Asp Asp Lys Gly Gln Trp Asn Gly Met Val Lys Glu Leu Ile Asp His 500 505 510 aaa gca gat ctg gct gtg gct ccc ctg acc atc acc cat gtc cga gag 1584 Lys Ala Asp Leu Ala Val Ala Pro Leu Thr Ile Thr His Val Arg Glu 515 520 525 aag gcc att gac ttc tct aag cct ttt atg acc ctc gga gtg agc atc 1632 Lys Ala Ile Asp Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Val Ser Ile 530 535 540 tta tat cga aaa ccc aat ggc acc aac ccc agt gtc ttc tcc ttc ctc 1680 Leu Tyr Arg Lys Pro Asn Gly Thr Asn Pro Ser Val Phe Ser Phe Leu 545 550 555 560 aac ccc ctg tcc cca gac atc tgg atg tac gtg cta ctc gcc tac ctg 1728 Asn Pro Leu Ser Pro Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Tyr Leu 565 570 575 ggt gtc agc tgt gtc ctc ttc gtc att gcc aga ttc agc cct tat gaa 1776 Gly Val Ser Cys Val Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Ser Pro Tyr Glu 580 585 590 tgg tat gat gcc cac ccc tgc aac ccc ggc tct gag gtg gtg gag aat 1824 Trp Tyr Asp Ala His Pro Cys Asn Pro Gly Ser Glu Val Val Glu Asn 595 600 605 aac ttc acg ctg ctc aac agc ttc tgg ttt gga atg ggc tcc ctg atg 1872 Asn Phe Thr Leu Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Met Gly Ser Leu Met 610 615 620 caa caa gga tct gaa ctg atg ccc aaa gct ctg tct acc cgc atc att 1920 Gln Gln Gly Ser Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Ile 625 630 635 640 ggc ggc atc tgg tgg ttc ttc acc ctt att atc atc tcc tcc tac acg 1968 Gly Gly Ile Trp Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr 645 650 655 gcc aac ctg gct gcc ttc ctg acc gtg gag cgc atg gag tca ccc atc 2016 Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile 660 665 670 gac tct gcc gat gac ctg gcc aag cag acc aaa ata gag tac ggt gct 2064 Asp Ser Ala Asp Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala 675 680 685 gtc aag gat ggg gcc acc atg acc ttc ttc aag aaa tcc aag atc tcc 2112 Val Lys Asp Gly Ala Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser 690 695 700 acc ttt gag aag atg tgg gcc ttc atg agc agc aag ccc tcg gct ctg 2160 Thr Phe Glu Lys Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Lys Pro Ser Ala Leu 705 710 715 720 gtg aag aac aat gag gag ggc atc cag cgg aca ctc aca gct gac tac 2208 Val Lys Asn Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Thr Leu Thr Ala Asp Tyr 725 730 735 gct ctg ctc atg gag tcc acg acc ata gag tac atc aca caa agg aac 2256 Ala Leu Leu Met Glu Ser Thr Thr Ile Glu Tyr Ile Thr Gln Arg Asn 740 745 750 tgc aat ctc acc cag atc ggc ggc ctc atc gat tcc aag ggc tac ggc 2304 Cys Asn Leu Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly 755 760 765 atc ggc acg ccc atg ggc tcc ccc tac agg gac aaa atc acc atc gcc 2352 Ile Gly Thr Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala 770 775 780 att ctg cag ctg cag gag gag gac aag ctg cac atc atg aag gag aag 2400 Ile Leu Gln Leu Gln Glu Glu Asp Lys Leu His Ile Met Lys Glu Lys 785 790 795 800 tgg tgg cga ggc agc ggg tgc ccc gag gag gag aac aag gag gcc agc 2448 Trp Trp Arg Gly Ser Gly Cys Pro Glu Glu Glu Asn Lys Glu Ala Ser 805 810 815 gca ctg ggc atc cag aag att ggc ggc atc ttc atc gtc ctg gct gcc 2496 Ala Leu Gly Ile Gln Lys Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala 820 825 830 ggc tta gtc ctg tcc gtg ttg gtg gca gtg ggc gag ttt ata tac aaa 2544 Gly Leu Val Leu Ser Val Leu Val Ala Val Gly Glu Phe Ile Tyr Lys 835 840 845 ctc cgc aag aca gcg gaa cgg gag cag cgc tct ttc tgc agc aca gtg 2592 Leu Arg Lys Thr Ala Glu Arg Glu Gln Arg Ser Phe Cys Ser Thr Val 850 855 860 gcc gac gag atc cgc ttc tcc ctc acc tgc cag cgg cgt ctc aag cac 2640 Ala Asp Glu Ile Arg Phe Ser Leu Thr Cys Gln Arg Arg Leu Lys His 865 870 875 880 aag cca cag cct cct atg atg gtc aag aca gat gcg gtt atc aac atg 2688 Lys Pro Gln Pro Pro Met Met Val Lys Thr Asp Ala Val Ile Asn Met 885 890 895 cac acc ttt aat gac cga agg ctt cca ggc aag gac agc atg agc tgc 2736 His Thr Phe Asn Asp Arg Arg Leu Pro Gly Lys Asp Ser Met Ser Cys 900 905 910 agc acc tcg cta gcc cct gtc ttc cct tag acttgggtcc agcggggact 2786 Ser Thr Ser Leu Ala Pro Val Phe Pro * 915 920 tcaggcccgg tccacgcaga ggaaggcaaa ggagacccga aaggacatcc tcatctcatg 2846 ctggccttgg ggatggagct gctgcccgca tccggctgtg aaccatcagc tcttacctac 2906 cggggaaacc catgggccct cagcagctgc ttgggcttca tctcctcttg tcttttttgt 2966 ggctttctga agctgtgaag gccagcggaa gcacacgcct ctcaggctgc actcaccgac 3026 catctccata gccagctact tcggccaggg ctctgcagag gcctcggaac accagagata 3086 gctcttacac ctccctccct cccctcaagt ccaggccttc tagcacgcac ccatgagagc 3146 agagactcca gctcagaacg ccttgagggt gttctgagga ggccaccagt gggagcccca 3206 aggcagccat ccatacctgg acagaagcaa agcttcagcc cttaagggct attcacctgg 3266 gtctgccctc cccaacgtgg cttcgccctc gtgccgaatt cgatatcaag cttatcgata 3326 ccgtcgacct cgaggggg 3344
【０１４２】 <210> 8 <211> 921 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Gly Ala Val Ala Gly Ser Leu Gly Arg Leu Arg Ser Leu Val Trp Glu 1 5 10 15 Tyr Trp Ala Gly Phe Leu Val Cys Ala Phe Trp Ile Pro Asp Ser Arg 20 25 30 Gly Met Pro His Val Ile Arg Ile Gly Gly Ile Phe Glu Tyr Ala Asp 35 40 45 Gly Pro Asn Ala Gln Val Met Asn Ala Glu Glu His Ala Phe Arg Phe 50 55 60 Ser Ala Asn Ile Ile Asn Arg Asn Arg Thr Leu Leu Pro Asn Thr Thr 65 70 75 80 Leu Thr Tyr Asp Ile Gln Arg Ile His Phe His Asp Ser Phe Glu Ala 85 90 95 Thr Lys Lys Ala Cys Asp Gln Leu Ala Leu Gly Val Val Ala Ile Phe 100 105 110 Gly Pro Ser Gln Gly Ser Cys Ile Asn Ala Val Gln Ser Ile Cys Asn 115 120 125 Ala Leu Glu Val Pro His Ile Gln Leu Arg Trp Lys His His Pro Leu 130 135 140 Asp Asn Lys Asp Thr Phe Tyr Val Asn Leu Tyr Pro Asp Tyr Ala Ser 145 150 155 160 Leu Ser His Ala Ile Leu Asp Leu Val Gln Ser Leu Lys Trp Arg Ser 165 170 175 Ala Thr Val Val Tyr Asp Asp Ser Thr Gly Leu Ile Arg Leu Gln Glu 180 185 190 Leu Ile Met Ala Pro Ser Arg Tyr Asn Ile Arg Leu Lys Ile Arg Gln 195 200 205 Leu Pro Ile Asp Ser Asp Asp Ser Arg Pro Leu Leu Lys Glu Met Lys 210 215 220 Arg Gly Arg Glu Phe Arg Ile Ile Phe Asp Cys Ser His Thr Met Ala 225 230 235 240 Ala Gln Ile Leu Lys Gln Ala Met Ala Met Gly Met Met Thr Glu Tyr 245 250 255 Tyr His Phe Ile Phe Thr Thr Leu Asp Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Glu 260 265 270 Pro Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Asn Leu Thr Gly Phe Arg Ile Leu Asn 275 280 285 Val Asp Asn Pro His Val Ser Ala Ile Val Glu Lys Trp Ser Met Glu 290 295 300 Arg Leu Gln Ala Ala Pro Arg Ala Glu Ser Gly Leu Leu Asp Gly Val 305 310 315 320 Met Met Thr Asp Ala Ala Leu Leu Tyr Asp Ala Val His Ile Val Ser 325 330 335 Val Cys Tyr Gln Arg Ala Pro Gln Met Thr Val Asn Ser Leu Gln Cys 340 345 350 His Arg His Lys Ala Trp Arg Phe Gly Gly Arg Phe Met Asn Phe Ile 355 360 365 Lys Glu Ala Gln Trp Glu Gly Leu Thr Gly Arg Ile Val Phe Asn Lys 370 375 380 Thr Ser Gly Leu Arg Thr Asp Phe Asp Leu Asp Ile Ile Ser Leu Lys 385 390 395 400 Glu Asp Gly Leu Glu Lys Val Gly Val Trp Ser Pro Ala Asp Gly Leu 405 410 415 Asn Ile Thr Glu Val Ala Lys Gly Arg Gly Pro Asn Val Thr Asp Ser 420 425 430 Leu Thr Asn Arg Ser Leu Ile Val Thr Thr Leu Leu Glu Glu Pro Phe 435 440 445 Val Met Phe Arg Lys Ser Asp Arg Thr Leu Tyr Gly Asn Asp Arg Phe 450 455 460 Glu Gly Tyr Cys Ile Asp Leu Leu Lys Glu Leu Ala His Ile Leu Gly 465 470 475 480 Phe Ser Tyr Glu Ile Arg Leu Val Glu Asp Gly Lys Tyr Gly Ala Gln 485 490 495 Asp Asp Lys Gly Gln Trp Asn Gly Met Val Lys Glu Leu Ile Asp His 500 505 510 Lys Ala Asp Leu Ala Val Ala Pro Leu Thr Ile Thr His Val Arg Glu 515 520 525 Lys Ala Ile Asp Phe Ser Lys Pro Phe Met Thr Leu Gly Val Ser Ile 530 535 540 Leu Tyr Arg Lys Pro Asn Gly Thr Asn Pro Ser Val Phe Ser Phe Leu 545 550 555 560 Asn Pro Leu Ser Pro Asp Ile Trp Met Tyr Val Leu Leu Ala Tyr Leu 565 570 575 Gly Val Ser Cys Val Leu Phe Val Ile Ala Arg Phe Ser Pro Tyr Glu 580 585 590 Trp Tyr Asp Ala His Pro Cys Asn Pro Gly Ser Glu Val Val Glu Asn 595 600 605 Asn Phe Thr Leu Leu Asn Ser Phe Trp Phe Gly Met Gly Ser Leu Met 610 615 620 Gln Gln Gly Ser Glu Leu Met Pro Lys Ala Leu Ser Thr Arg Ile Ile 625 630 635 640 Gly Gly Ile Trp Trp Phe Phe Thr Leu Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr 645 650 655 Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Thr Val Glu Arg Met Glu Ser Pro Ile 660 665 670 Asp Ser Ala Asp Asp Leu Ala Lys Gln Thr Lys Ile Glu Tyr Gly Ala 675 680 685 Val Lys Asp Gly Ala Thr Met Thr Phe Phe Lys Lys Ser Lys Ile Ser 690 695 700 Thr Phe Glu Lys Met Trp Ala Phe Met Ser Ser Lys Pro Ser Ala Leu 705 710 715 720 Val Lys Asn Asn Glu Glu Gly Ile Gln Arg Thr Leu Thr Ala Asp Tyr 725 730 735 Ala Leu Leu Met Glu Ser Thr Thr Ile Glu Tyr Ile Thr Gln Arg Asn 740 745 750 Cys Asn Leu Thr Gln Ile Gly Gly Leu Ile Asp Ser Lys Gly Tyr Gly 755 760 765 Ile Gly Thr Pro Met Gly Ser Pro Tyr Arg Asp Lys Ile Thr Ile Ala 770 775 780 Ile Leu Gln Leu Gln Glu Glu Asp Lys Leu His Ile Met Lys Glu Lys 785 790 795 800 Trp Trp Arg Gly Ser Gly Cys Pro Glu Glu Glu Asn Lys Glu Ala Ser 805 810 815 Ala Leu Gly Ile Gln Lys Ile Gly Gly Ile Phe Ile Val Leu Ala Ala 820 825 830 Gly Leu Val Leu Ser Val Leu Val Ala Val Gly Glu Phe Ile Tyr Lys 835 840 845 Leu Arg Lys Thr Ala Glu Arg Glu Gln Arg Ser Phe Cys Ser Thr Val 850 855 860 Ala Asp Glu Ile Arg Phe Ser Leu Thr Cys Gln Arg Arg Leu Lys His 865 870 875 880 Lys Pro Gln Pro Pro Met Met Val Lys Thr Asp Ala Val Ile Asn Met 885 890 895 His Thr Phe Asn Asp Arg Arg Leu Pro Gly Lys Asp Ser Met Ser Cys 900 905 910 Ser Thr Ser Leu Ala Pro Val Phe Pro 915 920
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (71)出願人 596086505 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ヘイネマン ステフェン フォックス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ、クリフリッジ レー ン 8481 (72)発明者 バルター ジェイムス リチャード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 サンディエゴ、カミニト デル カント 12996 (72)発明者 ホールマン マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 デル マー、ハーフ ムーン ベ イ ドライブ 14175 (72)発明者 ベトラー バーンハード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ ナンバー151、 ア ヴェニダ ナヴィダッド 7196 (72)発明者 ジェンセン ジャン エジビーグ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ ナンバー303、 レ ジェンツ ロード 8126
Claims (27)
- 【請求項１】 グルタメート受容体に特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能性
タンパク質、その機能性断片並びに前記タンパク質及び
／又は前記断片の機能性組合せ体。 - 【請求項２】 Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭ
ＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イ
ソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネ
ート（ＫＡ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレート
（ＡＰＢ）からなる群より選ばれたグルタメート受容体
サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を
有する請求項１記載のタンパク質、その断片並びに前記
タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体。 - 【請求項３】 ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプに特
徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有する、請求項
２記載のタンパク質、その断片並びに前記タンパク質及
び／又は前記断片の組合せ体。 - 【請求項４】 ＧｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮＡ、
ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡからなる
群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも約４
０％のヌクレオチド配列相同性をもつＤＮＡによってコ
ードされている、請求項１記載のタンパク質、その断片
並びに前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体。 - 【請求項５】 ＧｌｕＲ１（図１〜６）、ＧｌｕＲ２
（図９〜１４）、ＧｌｕＲ３（図１５〜２０）、Ｇｌｕ
Ｒ４（図３２〜３５）、ＧｌｕＲ５（図３６〜４３）、
ＧｌｕＲ６（図４４〜５０）およびＧｌｕＲ７（図５
１、５２）からなる群より選ばれる少なくとも１つに対
して少なくとも約４０％のアミノ酸相同性を有する、請
求項１記載のタンパク質、その断片並びに前記タンパク
質及び／又は前記断片の組合せ体。 - 【請求項６】 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、
ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７
タンパク質から成る群より選ばれる実質的に純粋なタン
パク質並びにグルタメート受容体として機能的なこれら
の組合せ体。 - 【請求項７】 ＧｌｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６９）、
ＧｌｕＲ２（Ｍｒ 約９６，４００）、ＧｌｕＲ３（Ｍ
ｒ 約９８，０００）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ ９８，５０
０）、ＧｌｕＲ５（Ｍｒ １００，０００）、ＧｌｕＲ
６（Ｍｒ １００，０００）及びＧｌｕＲ７から成る群
より選ばれる、請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項８】 グルタメート受容体に特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する機能性タンパク質又はそ
の機能性断片をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項９】 前記コードされるタンパク質又は断片
は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）、α
−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾー
ル−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、カイネート（Ｋ
Ａ）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレート（ＡＰ
Ｂ）サブタイプからなる群より選ばれたグルタメート受
容体サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性
質を有する、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項１０】 前記コードされるタンパク質又は断片
は、ＫＡ及び／又はＡＭＰＡサブタイプに特徴的な電気
生理学的及び薬理学的性質を有する、請求項９記載のＤ
ＮＡ。 - 【請求項１１】 前記ＤＮＡは、ＧｌｕＲ１ＤＮＡ、Ｇ
ｌｕＲ２ＤＮＡ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、ＧｌｕＲ４ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ５ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡおよびＧｌｕ
Ｒ７ＤＮＡからなる群より選ばれる、請求項８記載のＤ
ＮＡ。 - 【請求項１２】 ＧｌｕＲ１ＤＮＡ、ＧｌｕＲ２ＤＮ
Ａ、ＧｌｕＲ３ＤＮＡ、ＧｌｕＲ４ＤＮＡ、ＧｌｕＲ５
ＤＮＡ、ＧｌｕＲ６ＤＮＡおよびＧｌｕＲ７ＤＮＡから
なる群より選ばれる少なくとも１つに対して少なくとも
約４０％のヌクレオチド配列相同性を有する、請求項８
記載のＤＮＡ。 - 【請求項１３】 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕ
Ｒ７からなる群より選ばれる少なくとも１つに対して少
なくとも約４０％のアミノ酸相同性を有するタンパク質
をコードする、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項１４】 ＧｌｕＲ１（Ｍｒ 約９９，７６
９）、ＧｌｕＲ２（Ｍｒ約９６，４００）、ＧｌｕＲ３
（Ｍｒ 約９８，０００）、ＧｌｕＲ４（Ｍｒ 約９８，
５００）、ＧｌｕＲ５（Ｍｒ 約１００，０００）、Ｇ
ｌｕＲ６（約Ｍｒ１００，０００）及びＧｌｕＲ７から
成る群より選ばれるグルタメート受容体タンパク質をコ
ードする、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項１５】 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕ
Ｒ７からなる群より選ばれるＤＮＡと機能的に均等であ
る、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項１６】 ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ
３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６若しくはＧｌ
ｕＲ７ｃＤＮＡ又はその断片を含むＤＮＡプローブ。 - 【請求項１７】 少なくとも約２０塩基対の長さを有す
る請求項１６記載のプローブ。 - 【請求項１８】 前記ｃＤＮＡ配列の、カルボキシル末
端コード領域を起点とする請求項１６記載のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項１９】 前記ｃＤＮＡ配列のイオンチャンネル
コード領域を起点とする請求項１６記載のＤＮＡプロー
ブ。 - 【請求項２０】 請求項８記載のＤＮＡから転写された
センス又はアンチセンスｍＲＮＡ配列。 - 【請求項２１】 請求項２０記載のセンス又はアンチセ
ンスｍＲＮＡを発現する卵母細胞。 - 【請求項２２】 被検ＤＮＡと請求項１６記載のプロー
ブＤＮＡとを高又は低緊縮ハイブリダイゼーション条件
下で接触させ、前記プローブとハイブリダイズした被検
ＤＮＡを、グルタメート受容体タンパク質をコードする
ＤＮＡと相同であると同定することを含む、グルタメー
ト受容体タンパク質をコードするＤＮＡと相同なＤＮＡ
を被検試料中で同定する方法。 - 【請求項２３】 プローブとして用いる前記ＤＮＡ配列
は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ
４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７受容体の
カルボキシル末端をコードするｃＤＮＡ配列である、請
求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 プローブとして用いる前記ＤＮＡ配列
は、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ
４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６およびＧｌｕＲ７のイオン
チャンネルをコードする領域を含む、請求項２２記載の
方法。 - 【請求項２５】 グルタメート受容体を活性化すること
が知られている少なくとも１つのリガンドとタンパク質
を接触させ、前記リガンドに対するイオンチャンネル応
答を測定し、前記接触によりイオンチャンネル応答を示
すタンパク質を機能性グルタメート受容体であると同定
することを含む、イオンチャンネルとして機能するグル
タメート受容体を同定する方法。 - 【請求項２６】 前記タンパク質は前記リガンドと卵母
細胞発現系中で接触させられる、請求項２５記載の方
法。 - 【請求項２７】 機能性グルタメート受容体を被検物質
と接触させ、イオンチャンネル活性をモニターし、イオ
ンチャンネル応答を行う物質を機能性リガンドであると
同定することを含む、被検物質がグルタメート受容体タ
ンパク質のための機能性リガンドであるか否かを決定す
る方法。
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