JP3149133B2 - グルタメート受容体組成物および方法 - Google Patents
グルタメート受容体組成物および方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、一群の新規なDNA配列、およびグルタメ
ート神経伝達物質系を含むコードされた受容体タンパク
質に関する。さらに、この発明は、グルタメート受容体
を作製する方法、ならびにグルタメートのアゴニストお
よびアンタゴニストを同定して性質決定するために設計
された検定法にてこの受容体タンパク質を使用する方法
に関する。
ート神経伝達物質系を含むコードされた受容体タンパク
質に関する。さらに、この発明は、グルタメート受容体
を作製する方法、ならびにグルタメートのアゴニストお
よびアンタゴニストを同定して性質決定するために設計
された検定法にてこの受容体タンパク質を使用する方法
に関する。
発明の背景 アミノ酸のＬ−グルタメートは、哺乳動物の中枢神経
系における主要な刺激効果をもつ神経伝達物質である。
解剖学的、生化学的および電気生理学的解析によれば以
下のようなことが示唆される。グルタメート作動系が、
速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放出の調節、長
期の増強作用、学習および記憶、シナプス発生の柔軟
性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、ならびに数
種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわたる神経作
用に関与している。一般には、文献［Monaghan et al.,
Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.29.365−02（1989）］参
照。この広範な機能、特に、学習、神経毒性および神経
病理に関する機能は、グルタメートがその効果を発揮す
る機構を記載して定義しようとする最近の試行を刺激し
てきた。
系における主要な刺激効果をもつ神経伝達物質である。
解剖学的、生化学的および電気生理学的解析によれば以
下のようなことが示唆される。グルタメート作動系が、
速い刺激性シナプス伝達、神経伝達物質放出の調節、長
期の増強作用、学習および記憶、シナプス発生の柔軟
性、虚血性低酸素障害および線形細胞の死、ならびに数
種の神経変質性疾患の病因を含む、多岐にわたる神経作
用に関与している。一般には、文献［Monaghan et al.,
Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.29.365−02（1989）］参
照。この広範な機能、特に、学習、神経毒性および神経
病理に関する機能は、グルタメートがその効果を発揮す
る機構を記載して定義しようとする最近の試行を刺激し
てきた。
現在、グルタメート受容体の分類法は、以下の５つの
受容体サブタイプまたはクラスを規定するに役立つ薬理
学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパラギン酸（NMDA）、カイニン酸（KA）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（AMPA:かつては、キスカル酸、すなわ
ちQUIS受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホス
ホノ酪酸（AP4またはAPB）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−1,3−ジカルボン酸（ACPD）によって活性化
されるクラスである。グルタメートの作用は主に、カチ
オン選択性イオノトロピー受容体との相互作用によって
媒介される［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7,103−1
64（1984）;Strange,Biochem.J.249,309−318（198
8）］。例外は、メタボトロピー受容体の性質を有するA
CPD受容体サブタイプである。このクラスのグルタメー
ト受容体は、GTP−結合タンパク質、ならびに第２メッ
センジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール
1,4,5−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen,et al.,Proc.R.Soc.London Se
r.B 221,127（1984）;Sladeczek,et al.,Nature 317,71
7（1985）;Nicoletti et al.,J.Neurosci.6,1905（198
6）;Suguyama.et al.,Nature 325,531（1987）］。
受容体サブタイプまたはクラスを規定するに役立つ薬理
学的基準に基づいている。すなわち、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパラギン酸（NMDA）、カイニン酸（KA）、α−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４
−プロピオン酸（AMPA:かつては、キスカル酸、すなわ
ちQUIS受容体と呼ばれていた）、２−アミノ−４−ホス
ホノ酪酸（AP4またはAPB）、および１−アミノ−シクロ
ペンチル−1,3−ジカルボン酸（ACPD）によって活性化
されるクラスである。グルタメートの作用は主に、カチ
オン選択性イオノトロピー受容体との相互作用によって
媒介される［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7,103−1
64（1984）;Strange,Biochem.J.249,309−318（198
8）］。例外は、メタボトロピー受容体の性質を有するA
CPD受容体サブタイプである。このクラスのグルタメー
ト受容体は、GTP−結合タンパク質、ならびに第２メッ
センジャーのジアシルグリセロールおよびイノシトール
1,4,5−トリホスフェートを介したシナプス生理作用を
変化させる［Gundersen,et al.,Proc.R.Soc.London Se
r.B 221,127（1984）;Sladeczek,et al.,Nature 317,71
7（1985）;Nicoletti et al.,J.Neurosci.6,1905（198
6）;Suguyama.et al.,Nature 325,531（1987）］。
グルタメート受容体の電気生理学的および薬理学的性
質は、広範に研究されており、今ではよく確立されてい
る。例えば、文献［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7,
103（1984）;Cotman et al.,Trends Neurosci.10,263
（1987）;Mayer and Westbrook,Prog.Neurobiol.28,197
（1987）;Watkins and Olvermann,Trends Neurosci.10,
265（1987）；およびBlair et al.,Science 242,577（1
988）］参照。これは、分子レベルでのそれらの生化学
的特徴および構造とは対照的であり、これらは、この発
明が開示されるまでほとんど不明であった。
質は、広範に研究されており、今ではよく確立されてい
る。例えば、文献［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7,
103（1984）;Cotman et al.,Trends Neurosci.10,263
（1987）;Mayer and Westbrook,Prog.Neurobiol.28,197
（1987）;Watkins and Olvermann,Trends Neurosci.10,
265（1987）；およびBlair et al.,Science 242,577（1
988）］参照。これは、分子レベルでのそれらの生化学
的特徴および構造とは対照的であり、これらは、この発
明が開示されるまでほとんど不明であった。
定義 本明細書および特許請求の範囲では、ここでの使用で
明確に定義される語句および用語は以下の通りである。
明確に定義される語句および用語は以下の通りである。
ここで、使用される場合、グルタメート受容体とは、
Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活性化され
る神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これら受容体
タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて分類され
る。現在では、５つのクラスの受容体が存在する。すな
わち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（NMDA）、カイ
ニン酸（KA）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチ
ル−イソキサゾール−４−プロピオン酸（AMPA:かつて
は、キスカル酸、すなわちQUIS受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（AP4またはAP
B）、および１−アミノ−シクロペンチル−1,3−ジカル
ボン酸（ACPD）によって活性化される受容体クラスであ
る。
Ｌ−グルタメートおよび関連化合物によって活性化され
る神経伝達物質受容体タンパク質を指す。これら受容体
タンパク質は、それらの「薬理学」に基づいて分類され
る。現在では、５つのクラスの受容体が存在する。すな
わち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（NMDA）、カイ
ニン酸（KA）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチ
ル−イソキサゾール−４−プロピオン酸（AMPA:かつて
は、キスカル酸、すなわちQUIS受容体と呼ばれてい
た）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（AP4またはAP
B）、および１−アミノ−シクロペンチル−1,3−ジカル
ボン酸（ACPD）によって活性化される受容体クラスであ
る。
ここで、NMDAとは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート
を意味し、これは、NMDAグルタメート受容体サブタイプ
に対するリガンド（アゴニスト）である。
を意味し、これは、NMDAグルタメート受容体サブタイプ
に対するリガンド（アゴニスト）である。
ここで、AMPAとは、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５
−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネートを意味
し、これは、AMPAグルタメート受容体サブタイプに対す
るリガンド（アゴニスト）である。AMPA受容体はかつて
は、QUIS（キスカレート）受容体と呼ばれていた。
−メチル−イソキサゾール−４−プロピオネートを意味
し、これは、AMPAグルタメート受容体サブタイプに対す
るリガンド（アゴニスト）である。AMPA受容体はかつて
は、QUIS（キスカレート）受容体と呼ばれていた。
ここでQUISとは、かつてQUIS（キスカレート）受容体
と呼ばれていた、薬理学的に規定された受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）であるキスカル酸又
はキスカレートを意味する。以前QUIS受容体と呼ばれて
いた受容体は、今はAMPA受容体と称される。
と呼ばれていた、薬理学的に規定された受容体サブタイ
プに対するリガンド（アゴニスト）であるキスカル酸又
はキスカレートを意味する。以前QUIS受容体と呼ばれて
いた受容体は、今はAMPA受容体と称される。
KAとは、カイニン酸又はカイネートを意味し、これ
は、カイネートグルタメート受容体サブタイプに対する
リガンド（アゴニスト）である。
は、カイネートグルタメート受容体サブタイプに対する
リガンド（アゴニスト）である。
ここで、APBは、２−アミノ−４−ホスホノブチレー
トを意味し、APBグルタメート受容体サブタイプに対す
るリガンド（アゴニスト）である。また、略号AP4も２
−アミノ−４−ホスホノブチレートグルタメート受容体
サブタイプを指すためにときどき使用される。
トを意味し、APBグルタメート受容体サブタイプに対す
るリガンド（アゴニスト）である。また、略号AP4も２
−アミノ−４−ホスホノブチレートグルタメート受容体
サブタイプを指すためにときどき使用される。
ここで、ACPDとは、１−アミノ−シクロペンチル−1,
3−ジカルボン酸を意味し、これは、ACPDグルタメート
受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）であ
る。
3−ジカルボン酸を意味し、これは、ACPDグルタメート
受容体サブタイプに対するリガンド（アゴニスト）であ
る。
ここで、この発明のグルタメート受容体タンパク質の
修飾句として使用される場合、「グルタメート受容体に
特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を有する」と
いう語句は、グルタメートまたはグルタメート様リガン
ドへの応答で受容体タンパク質によって生じる神経シグ
ナルが、既知のグルタメート受容体のものに匹敵するこ
とを意味する。以下に示す「機能性」という語句の定義
も参照のこと。
修飾句として使用される場合、「グルタメート受容体に
特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を有する」と
いう語句は、グルタメートまたはグルタメート様リガン
ドへの応答で受容体タンパク質によって生じる神経シグ
ナルが、既知のグルタメート受容体のものに匹敵するこ
とを意味する。以下に示す「機能性」という語句の定義
も参照のこと。
ここで、ホモとは、単一型のサブユニットからなる受
容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型のサブユニッ
トからなる受容体を意味する。
容体を意味し、ヘテロとは、２つ以上の型のサブユニッ
トからなる受容体を意味する。
ここで、「機能性」という用語をこの発明のグルタメ
ート受容体タンパク質の修飾句として使用した場合、こ
れは、受容体タンパク質へのグルタメート（又はグルタ
メート様）リガンドの結合が膜の「イオンチャンネル」
を開かせることを意味する。この結合によってイオンが
膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神経シグナルが
生じる。別の言い方をすれば、「機能性」とは、神経シ
グナルが受容体タンパク質へのリガンド結合の結果とし
て生じることを意味する。
ート受容体タンパク質の修飾句として使用した場合、こ
れは、受容体タンパク質へのグルタメート（又はグルタ
メート様）リガンドの結合が膜の「イオンチャンネル」
を開かせることを意味する。この結合によってイオンが
膜を横断移動して、細胞が脱分極され、神経シグナルが
生じる。別の言い方をすれば、「機能性」とは、神経シ
グナルが受容体タンパク質へのリガンド結合の結果とし
て生じることを意味する。
ここで、GABAとはγ−アミノ酪酸を、γ−DGGとはγ
−Ｄ−グルタミルグリシンを、GAMSとはγ−Ｄ−グルタ
ミルアミノメチルスルホネートを、PDAとは2,3−シス−
ピペリジンジカルボン酸を、GDEEとはグルタミン酸ジメ
チルエステルを、TMDとはトランスメンブランドメイン
を、APVとは２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、CPPと
は３−（２−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピ
ル−１−ホスフェートを、nAChRとは神経のニコチン性
アセチルコリン受容体を、CNSとは中枢神経系を意味す
る。さらにここで、PNSとは末梢神経系を意味する。
−Ｄ−グルタミルグリシンを、GAMSとはγ−Ｄ−グルタ
ミルアミノメチルスルホネートを、PDAとは2,3−シス−
ピペリジンジカルボン酸を、GDEEとはグルタミン酸ジメ
チルエステルを、TMDとはトランスメンブランドメイン
を、APVとは２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸を、CPPと
は３−（２−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピ
ル−１−ホスフェートを、nAChRとは神経のニコチン性
アセチルコリン受容体を、CNSとは中枢神経系を意味す
る。さらにここで、PNSとは末梢神経系を意味する。
ここで、アゴニスト結合サブユニットとは、結合する
と受容体を活性化させる薬理学的化合物に対する結合部
位を含む受容体サブユニットのことであり、非アゴニス
ト結合サブユニットとはアゴニストと結合しない受容体
サブユニットのことである。
と受容体を活性化させる薬理学的化合物に対する結合部
位を含む受容体サブユニットのことであり、非アゴニス
ト結合サブユニットとはアゴニストと結合しない受容体
サブユニットのことである。
「アンタゴニスト」とは、受容体機能を阻害する物質
を指し、競合型および非競合型の２つの型がある。競合
型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知られてい
る）は、重複する結合部位に対してアゴニストと競合す
る。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴニスト結
合部位以外の受容体上の部位に結合することによって、
この受容体の機能を不活化する。
を指し、競合型および非競合型の２つの型がある。競合
型アゴニスト（競合型ブロッカーとしても知られてい
る）は、重複する結合部位に対してアゴニストと競合す
る。非競合アゴニスト（ブロッカー）は、アゴニスト結
合部位以外の受容体上の部位に結合することによって、
この受容体の機能を不活化する。
ここで、CluR1とは、Mr＝約99,769ダルトンを有する
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR1は、グルタメート受容
体サブユニットをコードする、初めて単離されたcDNAで
あって、従来、GluR−K1と呼ばれていた。GluR−K1は、
グルタメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単
純にGluR1と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、GluR
2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6、GluR7などと命名され
ている。GluR1のcDNAは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ATCC No.68134
と番号が付されている。
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR1は、グルタメート受容
体サブユニットをコードする、初めて単離されたcDNAで
あって、従来、GluR−K1と呼ばれていた。GluR−K1は、
グルタメート受容体サブユニット遺伝子１、又はより単
純にGluR1と改名された。さらに別のグルタメート受容
体サブユニットまたはサブユニット関連遺伝子は、GluR
2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6、GluR7などと命名され
ている。GluR1のcDNAは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託されており、ATCC No.68134
と番号が付されている。
ここで、GluR2とは、Mr＝約96,400ダルトンを有する
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR2のcDNAは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてお
り、ATCC No.68132と番号が付されている。
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR2のcDNAは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてお
り、ATCC No.68132と番号が付されている。
ここで、GluR3とは、Mr＝約98,000ダルトンを有する
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR3のcDNAは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてお
り、ATCC No.68133と番号が付されている。
同一名の単一グルタメート受容体サブユニットをコード
するcDNAクローンを指す。GluR3のcDNAは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてお
り、ATCC No.68133と番号が付されている。
ここで、GluR4とは、Mr＝約98,500ダルトンを有する
同一名の単一タンパク質をコードするcDNAクローンを指
す。GluR4のcDNAは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託されており、ATCC No.68375と番
号が付されている。
同一名の単一タンパク質をコードするcDNAクローンを指
す。GluR4のcDNAは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託されており、ATCC No.68375と番
号が付されている。
ここで、GluR5とは、Mr＝約100,000ダルトンを有する
同一名の単一タンパク質をコードするcDNAクローンを指
す。GluR5のcDNA（GluR5−１として）は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、
ATCC No.68374と番号が付されている。［GluR5cDNAには
長さの異なる２種類の変異体が存在しており、GluR5−
１およびGluR5−２と呼ばれている。GluR5のcDNAの翻訳
によって、920個のアミノ酸からなる単一の長いオープ
ンリーディングフレームの存在が予想される。GluR5−
１とGluR5−2DNAとの差異は、このオープンリーディン
グフレームをくずさないGluR5−1DNA中における、45個
のヌクレオチド（15個のアミノ酸に対応）の挿入に由来
する。GluR5−１受容体タンパク質におけるこの15個の
アミノ酸の挿入は、ここで開示された受容体タンパク質
の中では唯一のものである。したがって、短い方のGluR
5−２変異体は、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR6お
よびGluR7サブユニットの対応物である。］ ここで、GluR6とは、Mr＝約100,000を有する同一名の
単一タンパク質をコードするcDNAクローンをいう。ま
た、GluR7とは、同一名の単一タンパク質をコードするc
DNAクローンをいう。断片35−T3およびU35をコードする
GluR7を図12に示す。
同一名の単一タンパク質をコードするcDNAクローンを指
す。GluR5のcDNA（GluR5−１として）は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、
ATCC No.68374と番号が付されている。［GluR5cDNAには
長さの異なる２種類の変異体が存在しており、GluR5−
１およびGluR5−２と呼ばれている。GluR5のcDNAの翻訳
によって、920個のアミノ酸からなる単一の長いオープ
ンリーディングフレームの存在が予想される。GluR5−
１とGluR5−2DNAとの差異は、このオープンリーディン
グフレームをくずさないGluR5−1DNA中における、45個
のヌクレオチド（15個のアミノ酸に対応）の挿入に由来
する。GluR5−１受容体タンパク質におけるこの15個の
アミノ酸の挿入は、ここで開示された受容体タンパク質
の中では唯一のものである。したがって、短い方のGluR
5−２変異体は、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR6お
よびGluR7サブユニットの対応物である。］ ここで、GluR6とは、Mr＝約100,000を有する同一名の
単一タンパク質をコードするcDNAクローンをいう。ま
た、GluR7とは、同一名の単一タンパク質をコードするc
DNAクローンをいう。断片35−T3およびU35をコードする
GluR7を図12に示す。
ここで、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6
およびGluR7は、遺伝子、cDNAクローンおよびそれらが
コードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれを
も指すために用いる。
およびGluR7は、遺伝子、cDNAクローンおよびそれらが
コードするグルタメート受容体タンパク質をのいずれを
も指すために用いる。
本明細書および特許請求の範囲で使用される語句「実
質的配列相同性」は、ここに開示されて特許請求の範囲
にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的に異ならな
い配列変異を有するDNA、RNAまたはアミノ酸配列が、こ
の発明の配列と均等であるものとみなされ、従って、こ
の特許請求の範囲の領域内にはいることを意味する。こ
の点で「わずかでかつ機能的に異ならない配列変異」と
は、「相同」配列（すなわち、DNA、RNA、またはここで
開示されて特許請求の範囲にあるタンパク質と実質的な
相同性をもつ配列）が、この発明で開示され特許請求の
範囲にある配列と機能的に均等であることを意味する。
機能的に均等な配列は、実質的に同様に機能し、ここで
開示され特許請求の範囲にある核酸およびアミノ酸組成
物と同一の組成物を実質的に産生するであろう。
質的配列相同性」は、ここに開示されて特許請求の範囲
にある実際の配列とは、わずかでかつ機能的に異ならな
い配列変異を有するDNA、RNAまたはアミノ酸配列が、こ
の発明の配列と均等であるものとみなされ、従って、こ
の特許請求の範囲の領域内にはいることを意味する。こ
の点で「わずかでかつ機能的に異ならない配列変異」と
は、「相同」配列（すなわち、DNA、RNA、またはここで
開示されて特許請求の範囲にあるタンパク質と実質的な
相同性をもつ配列）が、この発明で開示され特許請求の
範囲にある配列と機能的に均等であることを意味する。
機能的に均等な配列は、実質的に同様に機能し、ここで
開示され特許請求の範囲にある核酸およびアミノ酸組成
物と同一の組成物を実質的に産生するであろう。
DNA、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾句と
して本明細書および特許請求の範囲で使用される語句
「実質的に純粋な」は、そのように形容されるDNA、RN
A、ポリペプチドまたはタンパク質が、人為的努力によ
ってそれら生体内の細胞環境から分離されてきたことを
意味する。その分離および精製の結果として、分離され
ない不純なDNA、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質が
有用ではない態様において、実質的に純粋なDNA、RNA、
ポリペプチドおよびタンパク質は有用である。
して本明細書および特許請求の範囲で使用される語句
「実質的に純粋な」は、そのように形容されるDNA、RN
A、ポリペプチドまたはタンパク質が、人為的努力によ
ってそれら生体内の細胞環境から分離されてきたことを
意味する。その分離および精製の結果として、分離され
ない不純なDNA、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質が
有用ではない態様において、実質的に純粋なDNA、RNA、
ポリペプチドおよびタンパク質は有用である。
ここで見られるさまざまなアミノ酸配列を成立させる
アミノ酸は、以下の３文字または１文字の略号に従って
同定することができる。
アミノ酸は、以下の３文字または１文字の略号に従って
同定することができる。
ここに見られるさまざまなヌクレオチド配列を成立さ
せるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使用される通
常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣおよびＵ）で表さ
れる。
せるヌクレオチドは、当該分野で定常的に使用される通
常１文字の記号体系（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣおよびＵ）で表さ
れる。
ここで、「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリ
ペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互換的に用い
られる。
ペプチド」とは、均等な用語とみなされ、互換的に用い
られる。
「bp」とは塩基対を意味する。「Kbp」とはキロ塩基
対、すなわち、1000個の塩基対を指す。
対、すなわち、1000個の塩基対を指す。
ここでは、特記しない限り、すべての温度は℃で表さ
れる。
れる。
寄託 この発明のそれぞれのグルタメート受容体タンパク質
をコードするcDNAは、米国メリーランド州ロックビルに
あるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群のさ
らなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製して
使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供される。
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布された規
則に従ってなされている。クローニングされたDNA配列
の試料は、この出願またはその優先権を主張する出願が
なされるか、こういった出願に付与されたいかなる特許
にも許可される。上記の「条約および規則」または米国
および他のすべての国もしくは国際機関の特許法および
規則に従って、特許事務所および他のこれらを法的に受
け取ることが許可された何人にも利用されており、また
利用されることになる。
をコードするcDNAは、米国メリーランド州ロックビルに
あるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）に寄託され、Ｌ−グルタメートの遺伝子群のさ
らなるメンバーを同定するに必要なプローブを作製して
使用する最良の方法が当該分野の技術者に提供される。
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約及びこの条約の下に公布された規
則に従ってなされている。クローニングされたDNA配列
の試料は、この出願またはその優先権を主張する出願が
なされるか、こういった出願に付与されたいかなる特許
にも許可される。上記の「条約および規則」または米国
および他のすべての国もしくは国際機関の特許法および
規則に従って、特許事務所および他のこれらを法的に受
け取ることが許可された何人にも利用されており、また
利用されることになる。
寄託された各cDNAクローンはATCC受託番号および寄託
日は以下の通りである。
日は以下の通りである。
・GluR1クローン:ATCC No.68134、1989年10月19日 ・GluR2クローン:ATCC No.68132、1989年10月19日 ・GluR3クローン:ATCC No.68133、1989年10月19日 ・GluR4クローン:ATCC No.68375、1990年８月２日 ・GluR5クローン:ATCC No.68374、1990年８月２日 発明の要約 本発明は、配列表の配列番号２、４又は６に記載され
たアミノ酸配列を有するか又は該アミノ酸配列のうち１
又は数個のアミノ酸が置換し、欠失し若しくは該アミノ
酸配列に１又は数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配
列を有し、グルタメート受容体サブユニットとして機能
するタンパク質を提供する。また、本発明は、上記本発
明のタンパク質をコードするDNAを提供する。さらに、
本発明は、配列表の配列番号１、３又は５に記載された
配列のコード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列
を有するDNAと高緊縮条件下においてハイブリダイズす
るDNAであってグルタメート受容体サブユニットとして
機能するタンパク質をコードするDNAを提供する。さら
に、本発明は、上記本発明のDNA又はその断片であって
少なくとも約20塩基対の長さを有するDNAを含むDNAプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のDNA
から転写されたセンス又はアンチセンスmRNAを提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のセンス又はアンチ
センスmRNAを発現する卵母細胞を提供する。さらに、本
発明は、被検DNAと上記本発明のプローブDNAとを高緊縮
ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、前記プロー
ブとハイブリダイズした被検DNAを、グルタメート受容
体タンパク質をコードするDNAと相同であると同定する
ことを含む、グルタメート受容体タンパク質をコードす
るDNAと相同なDNAを被検試料中で同定する方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク質の組合
せ体を被検物質と接触させ、イオンチャンネル活性をモ
ニターし、イオンチャンネル応答を行う物質を機能性リ
ガンドであると同定することを含む、被検物質がグルタ
メート受容体タンパク質のための機能性リガンドである
か否かを決定する方法を提供する。
たアミノ酸配列を有するか又は該アミノ酸配列のうち１
又は数個のアミノ酸が置換し、欠失し若しくは該アミノ
酸配列に１又は数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配
列を有し、グルタメート受容体サブユニットとして機能
するタンパク質を提供する。また、本発明は、上記本発
明のタンパク質をコードするDNAを提供する。さらに、
本発明は、配列表の配列番号１、３又は５に記載された
配列のコード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列
を有するDNAと高緊縮条件下においてハイブリダイズす
るDNAであってグルタメート受容体サブユニットとして
機能するタンパク質をコードするDNAを提供する。さら
に、本発明は、上記本発明のDNA又はその断片であって
少なくとも約20塩基対の長さを有するDNAを含むDNAプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のDNA
から転写されたセンス又はアンチセンスmRNAを提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のセンス又はアンチ
センスmRNAを発現する卵母細胞を提供する。さらに、本
発明は、被検DNAと上記本発明のプローブDNAとを高緊縮
ハイブリダイゼーション条件下で接触させ、前記プロー
ブとハイブリダイズした被検DNAを、グルタメート受容
体タンパク質をコードするDNAと相同であると同定する
ことを含む、グルタメート受容体タンパク質をコードす
るDNAと相同なDNAを被検試料中で同定する方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のタンパク質の組合
せ体を被検物質と接触させ、イオンチャンネル活性をモ
ニターし、イオンチャンネル応答を行う物質を機能性リ
ガンドであると同定することを含む、被検物質がグルタ
メート受容体タンパク質のための機能性リガンドである
か否かを決定する方法を提供する。
発明の記載 この発明は、一群のグルタメート受容体およびこれら
をコードする新規なDNA配列を開示する。
をコードする新規なDNA配列を開示する。
さらに詳細に言うと、この発明は、一局面において、
グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の機能性断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片
の機能性組合せ体を含む。
グルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の機能性断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片
の機能性組合せ体を含む。
この発明は、他の局面において、Ｎ−メチル−Ｄ−ア
スパルテート（NMDA）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−
５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸（AMP
A）、カイネート（KA）及び２−アミノ−４−ホスホノ
ブチレート（APB）からなる群より選ばれたグルタメー
ト受容体サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片の組合
せ体を含む。
スパルテート（NMDA）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−
５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸（AMP
A）、カイネート（KA）及び２−アミノ−４−ホスホノ
ブチレート（APB）からなる群より選ばれたグルタメー
ト受容体サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片の組合
せ体を含む。
この発明は、他の局面において、KA及び／又はAMPAサ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生
理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能
性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の組合せ体を含む。
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、グルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生
理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な機能
性タンパク質、その断片並びに前記タンパク質及び／又
は前記断片の組合せ体を含む。
この発明は、さらに他の局面において、GluR1DNA、Gl
uR2DNA、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよ
びGluR7DNAからなる群より選ばれる少なくとも１つに対
して少なくとも約40％のヌクレオチド配列相同性をもつ
DNAによってコードされている、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能タンパク質、その断片並びに
前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
uR2DNA、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよ
びGluR7DNAからなる群より選ばれる少なくとも１つに対
して少なくとも約40％のヌクレオチド配列相同性をもつ
DNAによってコードされている、グルタメート受容体サ
ブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学的性質を有
する、実質的に純粋な機能タンパク質、その断片並びに
前記タンパク質及び／又は前記断片の組合せ体を含む。
この発明は、さらに他の局面において、GluR1（図
１）、GluR2（図３）、GluR3（図４）、GluR4（図
９）、GluR5（図10）、GluR6（図11）およびGluR7（図1
2）からなる群より選ばれる少なくとも１つに対して少
なくとも約40％のアミノ酸相同性を有する、グルタメー
ト受容体サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片の組合
せ体を含む。
１）、GluR2（図３）、GluR3（図４）、GluR4（図
９）、GluR5（図10）、GluR6（図11）およびGluR7（図1
2）からなる群より選ばれる少なくとも１つに対して少
なくとも約40％のアミノ酸相同性を有する、グルタメー
ト受容体サブタイプに特徴的な電気生理学的及び薬理学
的性質を有する、実質的に純粋な機能性タンパク質、そ
の断片並びに前記タンパク質及び／又は前記断片の組合
せ体を含む。
この発明は、さらに他の局面において、GluR1、GluR
2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6およびGluR7タンパク質
から成る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並び
にグルタメート受容体として機能的なこれらの組合せ体
を含む。
2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6およびGluR7タンパク質
から成る群より選ばれる実質的に純粋なタンパク質並び
にグルタメート受容体として機能的なこれらの組合せ体
を含む。
さらに他の局面において、この発明は、約99,769（Gl
uR1）、約94,400（GluR2）、約98,000（GluR3）、約98,
500（GluR4）、約100,000（GluR5）及び約100,000（Glu
R6）のMrを有し、イオンチャンネルを形成し、KA及び／
又はAMPAサブタイプのグルタメート受容体に特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
タンパク質を含む。
uR1）、約94,400（GluR2）、約98,000（GluR3）、約98,
500（GluR4）、約100,000（GluR5）及び約100,000（Glu
R6）のMrを有し、イオンチャンネルを形成し、KA及び／
又はAMPAサブタイプのグルタメート受容体に特徴的な電
気生理学的及び薬理学的性質を有する、実質的に純粋な
タンパク質を含む。
さらに本発明は、他の局面において、本発明の実質的
に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相同性を有す
る実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
に純粋な機能性タンパク質と実質的な配列相同性を有す
る実質的に純粋な機能性タンパク質を含む。
またこの発明は、グルタメート受容体に特徴的な電気
生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タンパク質又
はその機能性断片をコードする実質的に純粋なDNAを含
む。
生理学的及び薬理学的性質を有する機能性タンパク質又
はその機能性断片をコードする実質的に純粋なDNAを含
む。
さらに、本発明は、他の局面において、Ｎ−メチル−
Ｄ−アスパルテート（NMDA）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（AMPA）、カイネート（KA）及び２−アミノ−４−ホス
ホノブチレート（APB）サブタイプからなる群より選ば
れたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する機能性タンパク質又はそ
の機能性断片をコードする実質的に純粋なDNAを含む。
Ｄ−アスパルテート（NMDA）、α−アミノ−３−ヒドロ
キシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸
（AMPA）、カイネート（KA）及び２−アミノ−４−ホス
ホノブチレート（APB）サブタイプからなる群より選ば
れたグルタメート受容体サブタイプに特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有する機能性タンパク質又はそ
の機能性断片をコードする実質的に純粋なDNAを含む。
さらにこの発明は、KAおよび／またはAMPAグルタメー
ト受容体をコードするDNAを含む。
ト受容体をコードするDNAを含む。
この発明は、他の局面において、GluR1DNA、GluR2DN
A、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよびGlu
R7DNAからなる群より選ばれる実質的に純粋なDNAを含
む。
A、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよびGlu
R7DNAからなる群より選ばれる実質的に純粋なDNAを含
む。
さらにこの発明は、他の局面において、GluR1DNA、Gl
uR2DNA、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよ
びGluR7DNAからなる群より選ばれる少なくとも１つに対
して少なくとも約40％のヌクレオチド配列相同性を有す
る、実質的に純粋なDNAを含む。
uR2DNA、GluR3DNA、GluR4DNA、GluR5DNA、GluR6DNAおよ
びGluR7DNAからなる群より選ばれる少なくとも１つに対
して少なくとも約40％のヌクレオチド配列相同性を有す
る、実質的に純粋なDNAを含む。
この発明は、関連する局面において、GluR1（Mr約99,
769）、GluR2（Mr約96,400）、GluR3（Mr約98,000）、G
luR4（Mr約98,500）、GluR5（Mr約100,000）、GluR6
（約Mr100,000）及びGluR7から成る群より選ばれるグル
タメート受容体タンパク質をコードする実質的に純粋な
DNAを含む。
769）、GluR2（Mr約96,400）、GluR3（Mr約98,000）、G
luR4（Mr約98,500）、GluR5（Mr約100,000）、GluR6
（約Mr100,000）及びGluR7から成る群より選ばれるグル
タメート受容体タンパク質をコードする実質的に純粋な
DNAを含む。
本発明は、さらに、約99,769（GluR1）、約94,400（G
luR2）、約98,000（GluR3）、約98,500（GluR4）、約10
0,000（GluR5）及び約100,000（GluR6）のMrを有し、イ
オンチャンネルを形成し、KA及び／又はAMPAサブタイプ
のグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理
学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質をコード
する実質的に純粋なDNAを含む。
luR2）、約98,000（GluR3）、約98,500（GluR4）、約10
0,000（GluR5）及び約100,000（GluR6）のMrを有し、イ
オンチャンネルを形成し、KA及び／又はAMPAサブタイプ
のグルタメート受容体に特徴的な電気生理学的及び薬理
学的性質を有する、実質的に純粋なタンパク質をコード
する実質的に純粋なDNAを含む。
さらにこの発明は、この発明の実質的に純粋なDNAの
いずれかに対して機能的に均等である実質的に純粋なDN
Aを含むが、ここで「機能的に均等な」とは、実質的に
純粋なDNAが、グルタメート受容体のリガンドに応答し
てイオンチャンネルを形成するタンパク質またはそれら
の機能性断片をコードすることを意味する。
いずれかに対して機能的に均等である実質的に純粋なDN
Aを含むが、ここで「機能的に均等な」とは、実質的に
純粋なDNAが、グルタメート受容体のリガンドに応答し
てイオンチャンネルを形成するタンパク質またはそれら
の機能性断片をコードすることを意味する。
この発明は、他の局面において、本発明のDNAから転
写される実質的に純粋なセンスまたはアンチセンスmRNA
を含むが、これらのDNAは、グルタメート受容体に特徴
的な電気生理学的および薬理学的性質を有する実質的に
純粋な機能性タンパク質をコードする。
写される実質的に純粋なセンスまたはアンチセンスmRNA
を含むが、これらのDNAは、グルタメート受容体に特徴
的な電気生理学的および薬理学的性質を有する実質的に
純粋な機能性タンパク質をコードする。
この発明は、他の局面において、グルタメート受容体
に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を有する機
能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む。
各クローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに寄託され、グルタメート受容体群のさらなる
メンバーを同定して分離するために必要な出発物質（す
なわち、プローブ）として当該分野の技術者に供与され
る。各cDNAクローンとして、GluR1（ATCC No.68134）、
GluR2（ATCC No.68132）、GluR3A（TCC No.68133）、Gl
uR4（ATCC No.68375）、およびGluR5（ATCC No.68374）
が挙げられる。完全な長さのcDNAクローンまたはそれら
の断片をプローブとして使用することができる。断片を
プローブとして使用する場合、DNA配列は、そのDNAのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
DNA配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが最
も好ましい。
に特徴的な電気生理学的および薬理学的性質を有する機
能性ペプチドのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む。
各クローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに寄託され、グルタメート受容体群のさらなる
メンバーを同定して分離するために必要な出発物質（す
なわち、プローブ）として当該分野の技術者に供与され
る。各cDNAクローンとして、GluR1（ATCC No.68134）、
GluR2（ATCC No.68132）、GluR3A（TCC No.68133）、Gl
uR4（ATCC No.68375）、およびGluR5（ATCC No.68374）
が挙げられる。完全な長さのcDNAクローンまたはそれら
の断片をプローブとして使用することができる。断片を
プローブとして使用する場合、DNA配列は、そのDNAのカ
ルボキシル基コード領域から始まることが好ましいが、
DNA配列のイオンチャンネルコード領域を含むことが最
も好ましい。
この発明は、他の局面において、この発明のDNAによ
ってコードされた機能性ペプチド断片およびこれらの機
能性組み合わせ体を含む。こういった機能性ペプチド断
片は、グルタメート受容体として機能するペプチドに必
須でない配列中のアミノ酸のいくつかまたはすべてを除
くことによって、過度の実験をともなわずに当該分野の
技術者によって作製可能である。グルタメート受容体機
能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上記のペプチド
をコードするDNAを体系的に消化すること、および／ま
たは上記のDNAへ欠失を導入することによって行われ
る。修飾（例えば、欠失または消化）されたDNAは、例
えば、DNAを転写してから、アフリカツメガエルの卵母
細胞中に得られたmRNAを導入することによって発現され
る。その卵母細胞では、mRNAの翻訳が行われることにな
る。こうして卵母細胞中で発現されたタンパク質の機能
的解析は、結合が予期されるリガンドおよび機能的に活
性なグルタメート受容体にその卵母細胞をさらしてか
ら、発現された断片がイオンチャンネルを形成するか否
か調べるために卵母細胞をモニターすることによって行
われる。イオンチャンネルが検出されれば、断片はグル
タメート受容体として機能している。
ってコードされた機能性ペプチド断片およびこれらの機
能性組み合わせ体を含む。こういった機能性ペプチド断
片は、グルタメート受容体として機能するペプチドに必
須でない配列中のアミノ酸のいくつかまたはすべてを除
くことによって、過度の実験をともなわずに当該分野の
技術者によって作製可能である。グルタメート受容体機
能に必須なアミノ酸の決定は、例えば、上記のペプチド
をコードするDNAを体系的に消化すること、および／ま
たは上記のDNAへ欠失を導入することによって行われ
る。修飾（例えば、欠失または消化）されたDNAは、例
えば、DNAを転写してから、アフリカツメガエルの卵母
細胞中に得られたmRNAを導入することによって発現され
る。その卵母細胞では、mRNAの翻訳が行われることにな
る。こうして卵母細胞中で発現されたタンパク質の機能
的解析は、結合が予期されるリガンドおよび機能的に活
性なグルタメート受容体にその卵母細胞をさらしてか
ら、発現された断片がイオンチャンネルを形成するか否
か調べるために卵母細胞をモニターすることによって行
われる。イオンチャンネルが検出されれば、断片はグル
タメート受容体として機能している。
この発明は、さらに別の態様で、この発明のDNAで形
質転換された細胞を含む。
質転換された細胞を含む。
この発明は、さらに別の態様で、この発明のmRNAが導
入（例えば注入によって）されたアフリカツメガエルの
卵母細胞を含む。
入（例えば注入によって）されたアフリカツメガエルの
卵母細胞を含む。
なおさらに、この発明には、この発明のDNA配列の発
現、または対応するmRNAの翻訳によって作られた新規な
グルタメート受容体を含む。こういった新規な受容体と
しては、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6お
よびGluR7の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
現、または対応するmRNAの翻訳によって作られた新規な
グルタメート受容体を含む。こういった新規な受容体と
しては、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6お
よびGluR7の各受容体、それらの断片、ならびに受容体
または断片の組み合わせ体が含まれる。
なおさらに、この発明は、この発明のDNA、RNAおよび
タンパク質に対して機能的に均等であるDNA、RNAおよび
タンパク質を含む。こういった機能的に均等なDNA、RNA
およびタンパク質は、この発明のDNA、RNAおよびタンパ
ク質と実質的に同様に機能することであろう。
タンパク質に対して機能的に均等であるDNA、RNAおよび
タンパク質を含む。こういった機能的に均等なDNA、RNA
およびタンパク質は、この発明のDNA、RNAおよびタンパ
ク質と実質的に同様に機能することであろう。
DNA、RNAおよびタンパク質組成物に加えて、この発明
はさまざまな方法も含む。この発明の１番目の方法は、
グルタメート受容体タンパク質をコードすることが分か
っているDNAに相同なDNAを同定する方法である。この方
法は、高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、DNAの
「未知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のDNA
プローブ（例えば、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR
5、GluR6、GluR7など）と接触させること、そして次い
で、グルタメートプローブのDNAとハイブリダイゼーシ
ョンする「未知」すなわち試験DNAをグルタメート受容
体の相同性DNAと同定することを含む。
はさまざまな方法も含む。この発明の１番目の方法は、
グルタメート受容体タンパク質をコードすることが分か
っているDNAに相同なDNAを同定する方法である。この方
法は、高緊縮ハイブリダイゼーション条件下、DNAの
「未知」すなわち被験検体をグルタメート受容体のDNA
プローブ（例えば、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR
5、GluR6、GluR7など）と接触させること、そして次い
で、グルタメートプローブのDNAとハイブリダイゼーシ
ョンする「未知」すなわち試験DNAをグルタメート受容
体の相同性DNAと同定することを含む。
この発明の２番目の方法は、機能性グルタメート受容
体（すなわち、イオンチャンネルを形成するグルタメー
ト受容体）を同定する方法に関する。この方法は、好ま
しくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグルタメート受
容体を活性化することが分かっている少なくとも１種類
のリガンドと接触させること、このリガンドに対するイ
オンチャンネル応答を測定すること、および接触の結果
としてイオンチャンネルの応答を示すタンパク質を機能
性グルタメート受容体と同定することを含む。
体（すなわち、イオンチャンネルを形成するグルタメー
ト受容体）を同定する方法に関する。この方法は、好ま
しくは卵母細胞発現系でのタンパク質とグルタメート受
容体を活性化することが分かっている少なくとも１種類
のリガンドと接触させること、このリガンドに対するイ
オンチャンネル応答を測定すること、および接触の結果
としてイオンチャンネルの応答を示すタンパク質を機能
性グルタメート受容体と同定することを含む。
この発明の３番目の方法は、ある物質がグルタメート
受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを決定する方
法である。この方法に従って、グルタメート受容体とし
て機能することが知られるタンパク質を「未知」すなち
被験物質と接触させ、既知のグルタメート受容体のイオ
ンチャンネル活性をその「未知」すなわち被験物質との
接触によってモニターして、既知のグルタメート受容体
におけるイオンチャンネル応答に作用するこれらの物質
を受容体タンパク質の機能性リガンドと同定する。
受容体タンパク質の機能性リガンドか否かを決定する方
法である。この方法に従って、グルタメート受容体とし
て機能することが知られるタンパク質を「未知」すなち
被験物質と接触させ、既知のグルタメート受容体のイオ
ンチャンネル活性をその「未知」すなわち被験物質との
接触によってモニターして、既知のグルタメート受容体
におけるイオンチャンネル応答に作用するこれらの物質
を受容体タンパク質の機能性リガンドと同定する。
この発明の特異的DNAのいくつかに着目すると、cDNA
クローンのGluR1は、アフリカツメガエルの卵母細胞の
カイネートでゲーティングされるイオンチャンネルの発
現を調べるスクリーニングによって、ラットの前脳のcD
NAライブラリーから単離された。グルタメート受容体群
の他のメンバーをコードするcDNAクローンを見い出すた
めに、クローンGluR1からの挿入片を、脳のcDNAライブ
ラリーをスクリーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼ
ーション条件下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション
条件下）するプローブとして使用した。GluR1プローブc
DNAを使用することによって、GluR2およびGluR3クロー
ンが同定および分離された。GluR2からのプローブ３を
使用してGluR4およびGluR5を同定および分離した。そし
て、GluR5を使用して、GluR6およびGluR7のためのクロ
ーンを分離した。
クローンのGluR1は、アフリカツメガエルの卵母細胞の
カイネートでゲーティングされるイオンチャンネルの発
現を調べるスクリーニングによって、ラットの前脳のcD
NAライブラリーから単離された。グルタメート受容体群
の他のメンバーをコードするcDNAクローンを見い出すた
めに、クローンGluR1からの挿入片を、脳のcDNAライブ
ラリーをスクリーニング（最初に低緊縮ハイブリダイゼ
ーション条件下、次いで高緊縮ハイブリダイゼーション
条件下）するプローブとして使用した。GluR1プローブc
DNAを使用することによって、GluR2およびGluR3クロー
ンが同定および分離された。GluR2からのプローブ３を
使用してGluR4およびGluR5を同定および分離した。そし
て、GluR5を使用して、GluR6およびGluR7のためのクロ
ーンを分離した。
cDNAクローンGluR1は、あらゆる翻訳後修飾の前で
は、Mrが約99,769の単一タンパク質からなる機能性グル
タメート受容体サブユニットをコードする。このタンパ
ク質は、KAおよびAMAP受容体の電気生理学的および薬理
学的性質を有するイオンチャンネルを形成する。GluR
1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6およびGluR7遺
伝子によってコードされるタンパク質を用いれば、かな
りの程度でサブユニット間のアミノ酸配列の確認ができ
る（表２参照）。これらタンパク質は、アフリカツメガ
エルの卵母細胞でホモおよびヘテロKA/AMPA感受性イオ
ンチャンネルを明確に形成することが分かっている。例
えば、グルタメート受容体の単一タンパクサブユニッ
ト、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4およびGluR5は、NMDA
およびAPBでは活性化されないが、KA、AMPA、QUISによ
って活性化された機能性受容体イオンチャンネルのホモ
複合体を確実に形成する。GluR2サブユニットは機能性
ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニットは、GluR
1またはGluR3とのヘテロ組み合わせ体で受容体イオンチ
ャンネル複合体をより効果的に組み立てる。
は、Mrが約99,769の単一タンパク質からなる機能性グル
タメート受容体サブユニットをコードする。このタンパ
ク質は、KAおよびAMAP受容体の電気生理学的および薬理
学的性質を有するイオンチャンネルを形成する。GluR
1、GluR2、GluR3、GluR4、GluR5、GluR6およびGluR7遺
伝子によってコードされるタンパク質を用いれば、かな
りの程度でサブユニット間のアミノ酸配列の確認ができ
る（表２参照）。これらタンパク質は、アフリカツメガ
エルの卵母細胞でホモおよびヘテロKA/AMPA感受性イオ
ンチャンネルを明確に形成することが分かっている。例
えば、グルタメート受容体の単一タンパクサブユニッ
ト、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4およびGluR5は、NMDA
およびAPBでは活性化されないが、KA、AMPA、QUISによ
って活性化された機能性受容体イオンチャンネルのホモ
複合体を確実に形成する。GluR2サブユニットは機能性
ホモ複合体を形成し得るが、このサブユニットは、GluR
1またはGluR3とのヘテロ組み合わせ体で受容体イオンチ
ャンネル複合体をより効果的に組み立てる。
グルタメートには弱く応答するが、Ｎ−メチル−Ｄ−
アスパルテート、カイネート、キスカレートおよび２−
アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホモイオンチ
ャンネルを、GluR5タンパク質はアフリカツメガエルの
卵母細胞中で形成する。GluR5を発現する卵母細胞がＬ
−グルタメートには応答し、KA、キスカレートまたはAM
PAには応答しないという事実は、このタンパク質が、KA
/AMPAサブユニットとは異なる薬理学的作用を有する受
容体の形成に関与し得ることが示しているかもしれな
い。こういった示唆は、in situハイブリダイゼーショ
ンデータによって支持されている。
アスパルテート、カイネート、キスカレートおよび２−
アミノ−４−ホスホノ酪酸には応答しないホモイオンチ
ャンネルを、GluR5タンパク質はアフリカツメガエルの
卵母細胞中で形成する。GluR5を発現する卵母細胞がＬ
−グルタメートには応答し、KA、キスカレートまたはAM
PAには応答しないという事実は、このタンパク質が、KA
/AMPAサブユニットとは異なる薬理学的作用を有する受
容体の形成に関与し得ることが示しているかもしれな
い。こういった示唆は、in situハイブリダイゼーショ
ンデータによって支持されている。
胚の発生および新生児の発育中に、GluR5遺伝子は、C
NSおよびPNS中の神経細胞のサブセットで発現され、Glu
R5遺伝子の空間的および時間的発現様式は、KA/AMPAサ
ブセットのGluR4と大きく重なっている。しかし、成熟
個体の脳では、GluR5遺伝子は、KA/AMPAサブユニット遺
伝子とは異なった様式で発現され、GluR5がKA/AMPA受容
体とは異なるグルタメート受容体の１サブタイプである
という示唆と一致する。
NSおよびPNS中の神経細胞のサブセットで発現され、Glu
R5遺伝子の空間的および時間的発現様式は、KA/AMPAサ
ブセットのGluR4と大きく重なっている。しかし、成熟
個体の脳では、GluR5遺伝子は、KA/AMPAサブユニット遺
伝子とは異なった様式で発現され、GluR5がKA/AMPA受容
体とは異なるグルタメート受容体の１サブタイプである
という示唆と一致する。
これ以上の考察を行わずとも、当該分野の技術者に
は、上記の記載、ならびに以降の実施例および図面の詳
細な説明を使って、この発明を完全に利用することがで
きる。実施例で開示される事項は、特記のない限り、例
示を目的として開示されるので、添付の特許請求の範囲
のいずれにも限定されると解釈すべきではない。
は、上記の記載、ならびに以降の実施例および図面の詳
細な説明を使って、この発明を完全に利用することがで
きる。実施例で開示される事項は、特記のない限り、例
示を目的として開示されるので、添付の特許請求の範囲
のいずれにも限定されると解釈すべきではない。
実施例 実施例１ 脳のcDNAライブラリーの作製 脳（例えば、哺乳動物の脳）または適切な細胞系（例
えば、NCB−20細胞系）から、グアニジンチオシアネー
ト−CsCl法［Chirgwin et al.,Biochem.18,5294（197
9）］によってポリ（Ａ）+RNAを精製する。精製されたR
NAを鋳型として用いて２本鎖のcDNAを調製する。プライ
マーとしてXho I制限酵素切断部位に連結したポリdTプ
ライマーを使用し、前駆体としてcCTPの代わりに５−メ
チルdCTPを使ってMoloneyの逆転写酵素に第１鎖の合成
を開始させる。RNアーゼＨおよびDNAポリメラーゼを添
加して第２鎖を完成させる。T4DNAポリメラーゼを用い
て、このcDNAを平滑末端にし、完全な長さのcDNAを作製
する機会を増す。EcoR Iアダプターをその平滑末端に連
結させて、末端をキナーゼ処理する。次いで、このcDNA
をXho I制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化DNAを切断し得ないので、mRNAの３′末端におい
てdTプライマーに結合させられた非メチル化Xho I制限
酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本鎖cD
NAには、mRNAの３′末端にXho I制限酵素切断部位があ
り、５′末端にはEcoR I部位がある。このcDNAをさら
に、Statagene社のλZAP−cDNAクローニングシステムの
一部であるλZAPベクターなどの適当なベクターに入れ
る。λZAPベクターを使用する場合、mRNAの５′末端がl
acZプロモーターの近傍となるように、そのcDNAをベク
ターに入れる。（λZAPベクターには、cDNA挿入片の一
端にT3RNAポリメラーゼプロモーターがあり、他端にT7R
NAポリメラーゼプロモーターがあり、これによって卵母
細胞での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアン
チセンスRNAの合成が可能となる。） 実施例２ 高及び低緊縮ハイブリダイゼーション cDNAライブラリーは、実施例１に記載されたλZAP−c
DNA系を用いて作製することが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションプローブは、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、
GluR5、GluR6もしくはGluR7クローン、または他の適切
なクローンもしくは材料から得られたDNAより作製する
ことが好ましい。このDNAは、好ましくはAmersham社の
マルチプライムDNAラベルキットを用いてランダムプラ
イム法によって標識される。少なくとも最初は、低緊縮
ハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。
適切なハイブリダイゼーション溶液は次のようなもので
ある。すなわち、1M NaCl、50mM Tris（pH8.0）、0.5
％SDS、0.1％ピロリン酸ナトリウム、100mg/mlのニシン
の変性精子DNA、それぞれ0.1％（w/v）のFicoll、ポリ
ビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミンである。低
緊縮スクリーニングでは、50℃の温度が好ましく、ライ
ブラリーフィルターは室温で２倍のSSPE（１倍のSSPE
は、180mM NaCl、9mM Na2HPO4、0.9mM NaH2PO4およ
び1mM EDTA、pH7.4）中で洗浄し、−70℃でKodak社のX
AR−５フィルムにさらす。高緊縮ハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングでは、温度は65℃にあわせ、フィルタ
ーはこの温度で0.5％ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.2
倍のSSPE中で洗浄する。フィルターは、Cronex Quanta
II/III増感スクリーン付きのKodak社のXAR−５フィルム
に−70℃で18〜48時間さらす。
えば、NCB−20細胞系）から、グアニジンチオシアネー
ト−CsCl法［Chirgwin et al.,Biochem.18,5294（197
9）］によってポリ（Ａ）+RNAを精製する。精製されたR
NAを鋳型として用いて２本鎖のcDNAを調製する。プライ
マーとしてXho I制限酵素切断部位に連結したポリdTプ
ライマーを使用し、前駆体としてcCTPの代わりに５−メ
チルdCTPを使ってMoloneyの逆転写酵素に第１鎖の合成
を開始させる。RNアーゼＨおよびDNAポリメラーゼを添
加して第２鎖を完成させる。T4DNAポリメラーゼを用い
て、このcDNAを平滑末端にし、完全な長さのcDNAを作製
する機会を増す。EcoR Iアダプターをその平滑末端に連
結させて、末端をキナーゼ処理する。次いで、このcDNA
をXho I制限酵素によって消化する。この酵素はヘミメ
チル化DNAを切断し得ないので、mRNAの３′末端におい
てdTプライマーに結合させられた非メチル化Xho I制限
酵素切断部位を切断するだけである。得られた２本鎖cD
NAには、mRNAの３′末端にXho I制限酵素切断部位があ
り、５′末端にはEcoR I部位がある。このcDNAをさら
に、Statagene社のλZAP−cDNAクローニングシステムの
一部であるλZAPベクターなどの適当なベクターに入れ
る。λZAPベクターを使用する場合、mRNAの５′末端がl
acZプロモーターの近傍となるように、そのcDNAをベク
ターに入れる。（λZAPベクターには、cDNA挿入片の一
端にT3RNAポリメラーゼプロモーターがあり、他端にT7R
NAポリメラーゼプロモーターがあり、これによって卵母
細胞での発現を含むさらなる実験用にセンスまたはアン
チセンスRNAの合成が可能となる。） 実施例２ 高及び低緊縮ハイブリダイゼーション cDNAライブラリーは、実施例１に記載されたλZAP−c
DNA系を用いて作製することが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションプローブは、GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、
GluR5、GluR6もしくはGluR7クローン、または他の適切
なクローンもしくは材料から得られたDNAより作製する
ことが好ましい。このDNAは、好ましくはAmersham社の
マルチプライムDNAラベルキットを用いてランダムプラ
イム法によって標識される。少なくとも最初は、低緊縮
ハイブリダイゼーション条件を用いることが好ましい。
適切なハイブリダイゼーション溶液は次のようなもので
ある。すなわち、1M NaCl、50mM Tris（pH8.0）、0.5
％SDS、0.1％ピロリン酸ナトリウム、100mg/mlのニシン
の変性精子DNA、それぞれ0.1％（w/v）のFicoll、ポリ
ビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミンである。低
緊縮スクリーニングでは、50℃の温度が好ましく、ライ
ブラリーフィルターは室温で２倍のSSPE（１倍のSSPE
は、180mM NaCl、9mM Na2HPO4、0.9mM NaH2PO4およ
び1mM EDTA、pH7.4）中で洗浄し、−70℃でKodak社のX
AR−５フィルムにさらす。高緊縮ハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングでは、温度は65℃にあわせ、フィルタ
ーはこの温度で0.5％ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.2
倍のSSPE中で洗浄する。フィルターは、Cronex Quanta
II/III増感スクリーン付きのKodak社のXAR−５フィルム
に−70℃で18〜48時間さらす。
このように低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
は、脳の2000個のcDNAクローン中の約１つが、GluR1cDN
A挿入片から作製されたプローブに対する若干のハイブ
リダイゼーションを示す。
は、脳の2000個のcDNAクローン中の約１つが、GluR1cDN
A挿入片から作製されたプローブに対する若干のハイブ
リダイゼーションを示す。
実施例３ ハイブリダイゼーションによって同定されたクローンの
解析 少なくとも２つの異なった方法を、低緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλZAPクローンを拾い、これらを約100個のクローン混
合物としてプールするものである。mRNAをこれらλZAP
クローンのプールからインビトロで作製し、機能性グル
タメート受容体の合成を指示するmRNAの活性を試験する
ためにこのmRNAを卵母細胞に注入する。陽性のクローン
が認められれば、この機能性クローンが分離されるまで
上記のプールを分割することによって、個々のλZAPcDN
Aクローンを分離する。（GluR1クローンを分離するため
のこの方法の実施についての考察は、以下の実施例５を
参照。）陽性クローンを評価するために使用し得る第２
の方法は、各挿入片をそれぞれ解析するものである。手
間はかかるが、この「個別クローン」方法には、最初か
ら機能性の発現を必要としないという利点がある。この
「個別クローン」方法を使用する場合、各クローンはプ
ラーク精製され、cDNA挿入片は個別に解析される。これ
は、少なくともλZAPcDNA系において、このcDNAがバク
テリオファージf1複製開始点によって隣接されたカセッ
トにクローニングされるという事実によって容易になさ
れる。このcDNAは、λZAPバクテリオファージからヘル
パーの感染によってpBluescriptプラスミド中に取り込
むことができる。（この方法が実施されると、cDNAは大
きなλバクテリオファージよりも操作がはるかに容易で
ある小さなpBluescriptプラスミド中に存在することと
なる。）センスまたはアンチセンスRNAは、T3（セン
ス）またはT7（アンチセンス）プロモーターを使ってpB
luescriptプラスミド中のcDNA挿入片から作製される。
解析 少なくとも２つの異なった方法を、低緊縮ハイブリダ
イゼーションスクリーニングによって同定されたクロー
ンの解析に使用することができる。１つの方法は、陽性
のλZAPクローンを拾い、これらを約100個のクローン混
合物としてプールするものである。mRNAをこれらλZAP
クローンのプールからインビトロで作製し、機能性グル
タメート受容体の合成を指示するmRNAの活性を試験する
ためにこのmRNAを卵母細胞に注入する。陽性のクローン
が認められれば、この機能性クローンが分離されるまで
上記のプールを分割することによって、個々のλZAPcDN
Aクローンを分離する。（GluR1クローンを分離するため
のこの方法の実施についての考察は、以下の実施例５を
参照。）陽性クローンを評価するために使用し得る第２
の方法は、各挿入片をそれぞれ解析するものである。手
間はかかるが、この「個別クローン」方法には、最初か
ら機能性の発現を必要としないという利点がある。この
「個別クローン」方法を使用する場合、各クローンはプ
ラーク精製され、cDNA挿入片は個別に解析される。これ
は、少なくともλZAPcDNA系において、このcDNAがバク
テリオファージf1複製開始点によって隣接されたカセッ
トにクローニングされるという事実によって容易になさ
れる。このcDNAは、λZAPバクテリオファージからヘル
パーの感染によってpBluescriptプラスミド中に取り込
むことができる。（この方法が実施されると、cDNAは大
きなλバクテリオファージよりも操作がはるかに容易で
ある小さなpBluescriptプラスミド中に存在することと
なる。）センスまたはアンチセンスRNAは、T3（セン
ス）またはT7（アンチセンス）プロモーターを使ってpB
luescriptプラスミド中のcDNA挿入片から作製される。
このcDNA挿入片は、制限酵素を用いてマッピングする
ことも好ましい。例えば、このcDNA挿入片は、よく用い
られる制限酵素によって切断される。得られた断片は、
ゲル上でサイズ分画され、その断片は、サザン法解析用
フィルターに転写される。これらフィルターは、既知の
グルタメート受容体、例えば、GluR1、GluR2、GluR3、G
luR4、GluR5、GluR6またはGluR7から作製されたプロー
ブとハイブリダイズされる。各クローンからのハイブリ
ダイズ断片を、単一鎖のベクターM13（mp18またはmp1
9）にサブクローニングし、この断片の配列を決定す
る。DNAの配列決定は、サンガーら［Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5463（1977）］のジデオキシヌクレオチド鎖
末端終止法、またはApplied Biosystems社によって製造
された機種のような自動シークエンサーを用いて行われ
る。配列の解析は、Intelligenetics社、Standen社およ
びウィスコンシン大学によって開発されたプログラムな
どのソフトウエアを用いたコンピューターによって行わ
れることが好ましい。
ことも好ましい。例えば、このcDNA挿入片は、よく用い
られる制限酵素によって切断される。得られた断片は、
ゲル上でサイズ分画され、その断片は、サザン法解析用
フィルターに転写される。これらフィルターは、既知の
グルタメート受容体、例えば、GluR1、GluR2、GluR3、G
luR4、GluR5、GluR6またはGluR7から作製されたプロー
ブとハイブリダイズされる。各クローンからのハイブリ
ダイズ断片を、単一鎖のベクターM13（mp18またはmp1
9）にサブクローニングし、この断片の配列を決定す
る。DNAの配列決定は、サンガーら［Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5463（1977）］のジデオキシヌクレオチド鎖
末端終止法、またはApplied Biosystems社によって製造
された機種のような自動シークエンサーを用いて行われ
る。配列の解析は、Intelligenetics社、Standen社およ
びウィスコンシン大学によって開発されたプログラムな
どのソフトウエアを用いたコンピューターによって行わ
れることが好ましい。
完全な長さのクローンがほぼ完全な長さのクローンか
ら作製されるmRNAを卵母細胞系で発現させ、新規な受容
体の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合ある
クローンが機能しなければ、これを、他のクローンから
作製したmRNAの存在下で試験する。
ら作製されるmRNAを卵母細胞系で発現させ、新規な受容
体の機能性を決定する。それ自体で発現させた場合ある
クローンが機能しなければ、これを、他のクローンから
作製したmRNAの存在下で試験する。
実施例４ アフリカツメガエル（xenous）の卵母細胞中での発現の
ためのクローニングおよび検定 この検定法は、Masuら［Nature 329,836（1987）］の
検定法の改良法である。これは、外来のmRNAがアフリカ
ツメガエルの卵母細胞に注入された場合、このmRNAは機
能性タンパク質に翻訳されるという事実に基づくもので
ある。
ためのクローニングおよび検定 この検定法は、Masuら［Nature 329,836（1987）］の
検定法の改良法である。これは、外来のmRNAがアフリカ
ツメガエルの卵母細胞に注入された場合、このmRNAは機
能性タンパク質に翻訳されるという事実に基づくもので
ある。
DNAの鋳型（λZAPcDNA調製物または被験cDNAを含むプ
ラスミド）を制限酵素によってcDNA挿入片から下流で切
断する。制限酵素使用後の消化産物を、プロテイナーゼ
Ｋで消化し、次いでフェノール／クロロホルム（1:1）
で２回の抽出によって抽出する。続いて、このDNA鋳型
をエタノール沈澱させてから、T3RNAポリメラーゼ（セ
ンス鎖作製用）またはT7RNAポリメラーゼ（アンチセン
ス鎖作製用）、rATP、rCTP、rGTP、rUTPおよびRNアーゼ
阻害剤と混合する。同時に、このRNAの転写物に7meGppp
Gキャップでキャップ構造を形成させる。操作中は手袋
をつけ、水をジエチルピロカーボネートで処理してRNア
ーゼを不活化させる。
ラスミド）を制限酵素によってcDNA挿入片から下流で切
断する。制限酵素使用後の消化産物を、プロテイナーゼ
Ｋで消化し、次いでフェノール／クロロホルム（1:1）
で２回の抽出によって抽出する。続いて、このDNA鋳型
をエタノール沈澱させてから、T3RNAポリメラーゼ（セ
ンス鎖作製用）またはT7RNAポリメラーゼ（アンチセン
ス鎖作製用）、rATP、rCTP、rGTP、rUTPおよびRNアーゼ
阻害剤と混合する。同時に、このRNAの転写物に7meGppp
Gキャップでキャップ構造を形成させる。操作中は手袋
をつけ、水をジエチルピロカーボネートで処理してRNア
ーゼを不活化させる。
インビトロで合成したmRNAの転写物をアフリカツメガ
エルの卵母細胞に注入する。50nlのRNA溶液（0.2〜0.6m
g/ml）をステージＶの卵母細胞に注入する。機能性受容
体が存在するか否かの分析に先立って、注射された卵母
細胞を２〜７日間Barthの培地中にて16℃でインキュベ
ーションする。
エルの卵母細胞に注入する。50nlのRNA溶液（0.2〜0.6m
g/ml）をステージＶの卵母細胞に注入する。機能性受容
体が存在するか否かの分析に先立って、注射された卵母
細胞を２〜７日間Barthの培地中にて16℃でインキュベ
ーションする。
電圧の記録は、3M KCLを充填し、適当な電圧クランプ
ユニット（例えば、Dagan 8500電圧クランプユニット）
に接続した微小電極を卵母細胞に突き刺すことによって
行われる。電極クランプ試験は、２つの電極、すなわ
ち、3M KCLを充填した電極および0.25M CsCl、0.25M Cs
Fおよび50mM EGTAを充填した電流電極を用いて行うこと
が好ましい。（KA/AMPAグルタメート受容体をコードす
るGluR1cDNAからのRNAを注入された卵母細胞より得られ
る記録結果の考察については実施例６参照。）注入に先
立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌成熟固体のアフリ
カツメガエルから卵巣を摘出することによって行った。
卵母組織をコラーゲナーゼ（2mg/ml）で２時間処理して
から、卵巣上皮および濾胞細胞を切除する。
ユニット（例えば、Dagan 8500電圧クランプユニット）
に接続した微小電極を卵母細胞に突き刺すことによって
行われる。電極クランプ試験は、２つの電極、すなわ
ち、3M KCLを充填した電極および0.25M CsCl、0.25M Cs
Fおよび50mM EGTAを充填した電流電極を用いて行うこと
が好ましい。（KA/AMPAグルタメート受容体をコードす
るGluR1cDNAからのRNAを注入された卵母細胞より得られ
る記録結果の考察については実施例６参照。）注入に先
立つ卵母細胞の調製は、麻酔された雌成熟固体のアフリ
カツメガエルから卵巣を摘出することによって行った。
卵母組織をコラーゲナーゼ（2mg/ml）で２時間処理して
から、卵巣上皮および濾胞細胞を切除する。
実施例５ GluR1受容体の発現のためのクローニング アフリカツメガエルの卵母細胞に、ラットの前脳から
分離したポリ（Ａ）+RNAを注入した。２〜10日間後、こ
の卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメート受
容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を調べ
た。グルタメート及びキスカレートの双方とも、リガン
ドゲーテッドイオンチャンネルによると思われる短期の
滑らかな応答、及び第２メッセンジャーの媒介型と思わ
れる長期の変動的応答からなる二相性のパターンを示す
誘起された脱分極を除去する。NMDAおよびKAは、短期の
刺激に対して滑らかな応答を引き起こすが、APBは応答
を生じない。
分離したポリ（Ａ）+RNAを注入した。２〜10日間後、こ
の卵母細胞を電気生理学的に試験して、グルタメート受
容体サブタイプの選択的アゴニストへの応答能を調べ
た。グルタメート及びキスカレートの双方とも、リガン
ドゲーテッドイオンチャンネルによると思われる短期の
滑らかな応答、及び第２メッセンジャーの媒介型と思わ
れる長期の変動的応答からなる二相性のパターンを示す
誘起された脱分極を除去する。NMDAおよびKAは、短期の
刺激に対して滑らかな応答を引き起こすが、APBは応答
を生じない。
44,000クローンの独立したサブライブラリー18個から
なる方向性のあるcDNAライブラリー（λZAP II RTB
I、複合度＝８×105要素）をバクテリオファージの発現
ベクターλZAP IIを使ってこのポリ（Ａ）+NAから構築
した。増幅された18個のサブライブラリーのすべてから
別個に作製された転写物を含むインビトロでの転写物の
プールを卵母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜3m
V）が、注入の10日後に100μＭカイネートを投与した卵
母細胞から電圧の記録として認められた。NMDAまたはキ
スカレートに対する応答は全く検出されなかった。未注
入の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメ
ート受容体のアゴニストに対していかなる応答も示さな
かった。続いて、44,000個のクローン（＝単一サブライ
ブラリー）、4,000個のクローン、400個のクローンおよ
び40個のクローンを試験した。これらの試験の各回で少
なくとも１つのプールがKAに応答した。最初に観察され
た非常に小さな応答が記録のアーチファクトでないこと
を確認するために、以下の基準をスクリーニング手順の
全般にわたって使用した。それらの基準とは、すなわ
ち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があった、
（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞のスーパーフュジョン（super fusion）に容易に可逆
的であった、（ｄ）10μＭのドーモエートの投与によっ
て、100μＭのカイネートの投与によって起こされた応
答と類似の応答が生じた。さらに細分類するために、各
ステージで最も大きな応答を起こすプールを選択した。
40クローンの最終的に陽性のプールにおけるクローン
を、それら挿入片のサイズについて解析した。そして、
最も大きな挿入片（すべて2kbを超える）を有する12個
のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を指示す
る能力についてそれぞれ試験した。3.0kbの挿入片を有
する唯一のクローンがカイネートに応答することが分か
り、これをλZAP II−GluR1と命名した。
なる方向性のあるcDNAライブラリー（λZAP II RTB
I、複合度＝８×105要素）をバクテリオファージの発現
ベクターλZAP IIを使ってこのポリ（Ａ）+NAから構築
した。増幅された18個のサブライブラリーのすべてから
別個に作製された転写物を含むインビトロでの転写物の
プールを卵母細胞に注入した。小さな脱分極（１〜3m
V）が、注入の10日後に100μＭカイネートを投与した卵
母細胞から電圧の記録として認められた。NMDAまたはキ
スカレートに対する応答は全く検出されなかった。未注
入の卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、グルタメ
ート受容体のアゴニストに対していかなる応答も示さな
かった。続いて、44,000個のクローン（＝単一サブライ
ブラリー）、4,000個のクローン、400個のクローンおよ
び40個のクローンを試験した。これらの試験の各回で少
なくとも１つのプールがKAに応答した。最初に観察され
た非常に小さな応答が記録のアーチファクトでないこと
を確認するために、以下の基準をスクリーニング手順の
全般にわたって使用した。それらの基準とは、すなわ
ち、（ａ）ある卵母細胞での応答に再現性があった、
（ｂ）応答が速かった（アゴニスト投与から１秒以
内）、（ｃ）応答が、対照のリンガー液を用いた卵母細
胞のスーパーフュジョン（super fusion）に容易に可逆
的であった、（ｄ）10μＭのドーモエートの投与によっ
て、100μＭのカイネートの投与によって起こされた応
答と類似の応答が生じた。さらに細分類するために、各
ステージで最も大きな応答を起こすプールを選択した。
40クローンの最終的に陽性のプールにおけるクローン
を、それら挿入片のサイズについて解析した。そして、
最も大きな挿入片（すべて2kbを超える）を有する12個
のクローンを、機能性カイネート受容体の合成を指示す
る能力についてそれぞれ試験した。3.0kbの挿入片を有
する唯一のクローンがカイネートに応答することが分か
り、これをλZAP II−GluR1と命名した。
実施例６ GluR1クローンの電気生理学的および薬理学的特徴づけ プラスミドのpGluR1を次いでバクテリオファージのλ
ZAP II−GluR1からレスキューした。そして、インビト
ロで転写させると、アンチセンスRNAではなくセンスRNA
が、卵母細胞に注入された場合、カイネートの応答を誘
起した。電圧クランプ条件下（−70mVの保持電圧）、Gl
uR1センス転写物わずか10pgによって、100μM KAに対す
る検出可能な応答が生じた。
ZAP II−GluR1からレスキューした。そして、インビト
ロで転写させると、アンチセンスRNAではなくセンスRNA
が、卵母細胞に注入された場合、カイネートの応答を誘
起した。電圧クランプ条件下（−70mVの保持電圧）、Gl
uR1センス転写物わずか10pgによって、100μM KAに対す
る検出可能な応答が生じた。
GluR1がある転写因子をコードするという可能性を除
去するために、インビトロでのpGluR1転写物を注入した
卵母細胞を、50μg/mlのアクチノマイシンＤを添加した
培地中に保持して、内因性の転写を阻害した。これらの
卵母細胞は、対照の培地に保持されたものと同一のカイ
ネートに対する応答を示した。したがって、卵母細胞ゲ
ノムからの注入誘導型転写は、観察された応答に寄与し
ないようである。
去するために、インビトロでのpGluR1転写物を注入した
卵母細胞を、50μg/mlのアクチノマイシンＤを添加した
培地中に保持して、内因性の転写を阻害した。これらの
卵母細胞は、対照の培地に保持されたものと同一のカイ
ネートに対する応答を示した。したがって、卵母細胞ゲ
ノムからの注入誘導型転写は、観察された応答に寄与し
ないようである。
Ｌ−グルタメートは、KAよりもはるかに小さな応答を
引き起こす。1mMのレベルでさえも、30μＭのKAで見ら
れた脱分極の50％を引き起こすだけであった。これは、
グルタメートがKA受容体サブタイプに対して弱いアゴニ
ストでしかないという従来の報告［Monaghan et al.,Na
ture 306,176（1983）］と一致する。NMDA、キスカレー
ト、およびＬ−アスパルテートといった他のグルタメー
ト受容体は、それぞれ150μＭ、10μＭおよび100μＭの
レベルで投与された場合、応答を引き起こさなかった。
グリシン、GABAA、セロトニンおよびニコチンといった
無関係な神経伝達物質受容体アゴニストも、1mMという
高濃度で試験した場合でさえ応答を引き起こさなかっ
た。グリシンは、KA応答を増強させなかった。KAおよび
ドーモエートについては、用量に依存した応答曲線が記
録され、それぞれのEC50値は39μＭおよび1.8μＭであ
った。平均の反転電圧は、０ないし−130mVの一連の維
持電圧で得られた、10μＭカイネートに対する電流応答
から外挿されたものであり、10mVを示した。KAに対する
応答は減感せず、高濃度（100μＭ）のアゴニストによ
る長時間（10分以内）のスーパーフュージョン後でさえ
減感しなかった。これらの所見も、総ポリ（Ａ）+RNAか
ら発現したKA受容体を用いた実験による初期の報告［Ve
rdoorn and Dingledine,Molecular Pharmacology 34,29
8（1988）］と一致する。同様に、GluR1の薬理学的プロ
フィル（表１参照）は、さまざまな既知のグルタメート
受容体アンタゴニストの阻害特性によって明らかにされ
たように、総ポリ（Ａ）+RNAがカイネート受容体のメッ
セージ源として使用された系でのKA受容体に関する従来
の報告［Hirono et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,20
83（1989）］と一致する。全被験化合物（それぞれ1m
M）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたGluR1RNAを注入した卵母細胞中でのカイネー
ト誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程度は低
いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−DGG）は、キ
スカレート受容体を阻害しないがKAおよびNMDA受容体を
選択的に阻害する物質であって［Davies and Watkins,B
rain Res.206,172（1981）］、KAおよびAMPA受容体を選
択的に阻害すると報告されている［Fagg,Trends Neuros
ci.8,207（1981）］λ−Ｄ−グルタミルアミノメチル−
スルフェート（GAMS）と同様に、カイネート受容体を阻
害する。同じく、2,3−シス−ピペリジンジカルボン酸
（PDA）は、グルタメート受容体のすべてのサブタイプ
を阻害することが知られており［Foster and Fagg,Brai
n Res.Rev.7.103（1984）］、GluR1の応答を遮断した。
グルタメートジエチルエステル（GDEE）は、AMPAタイプ
のグルタメート受容体を選択的に阻害すると見られてお
り［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7.103（198
4）］、その応答を有意に遮断せず、弱いアゴニストの
性質を示した。NMDA受容体アンタゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（APV）および３−（２−カルボ
キシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェー
ト（CPP）、ならびにNMDAそれ自体は、KA応答を若干阻
害するので、弱いアンタゴニストとして作用した。これ
らは、いかなるアゴニストの性質も示さなかった。
引き起こす。1mMのレベルでさえも、30μＭのKAで見ら
れた脱分極の50％を引き起こすだけであった。これは、
グルタメートがKA受容体サブタイプに対して弱いアゴニ
ストでしかないという従来の報告［Monaghan et al.,Na
ture 306,176（1983）］と一致する。NMDA、キスカレー
ト、およびＬ−アスパルテートといった他のグルタメー
ト受容体は、それぞれ150μＭ、10μＭおよび100μＭの
レベルで投与された場合、応答を引き起こさなかった。
グリシン、GABAA、セロトニンおよびニコチンといった
無関係な神経伝達物質受容体アゴニストも、1mMという
高濃度で試験した場合でさえ応答を引き起こさなかっ
た。グリシンは、KA応答を増強させなかった。KAおよび
ドーモエートについては、用量に依存した応答曲線が記
録され、それぞれのEC50値は39μＭおよび1.8μＭであ
った。平均の反転電圧は、０ないし−130mVの一連の維
持電圧で得られた、10μＭカイネートに対する電流応答
から外挿されたものであり、10mVを示した。KAに対する
応答は減感せず、高濃度（100μＭ）のアゴニストによ
る長時間（10分以内）のスーパーフュージョン後でさえ
減感しなかった。これらの所見も、総ポリ（Ａ）+RNAか
ら発現したKA受容体を用いた実験による初期の報告［Ve
rdoorn and Dingledine,Molecular Pharmacology 34,29
8（1988）］と一致する。同様に、GluR1の薬理学的プロ
フィル（表１参照）は、さまざまな既知のグルタメート
受容体アンタゴニストの阻害特性によって明らかにされ
たように、総ポリ（Ａ）+RNAがカイネート受容体のメッ
セージ源として使用された系でのKA受容体に関する従来
の報告［Hirono et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,20
83（1989）］と一致する。全被験化合物（それぞれ1m
M）の中で、広範な特異性を有するグルタメート受容体
アンタゴニストのキヌレン酸は明らかに、インビトロで
合成されたGluR1RNAを注入した卵母細胞中でのカイネー
ト誘導型脱分極の最も強力な阻害剤であった。程度は低
いが、λ−Ｄ−グルタミルグリシン（λ−DGG）は、キ
スカレート受容体を阻害しないがKAおよびNMDA受容体を
選択的に阻害する物質であって［Davies and Watkins,B
rain Res.206,172（1981）］、KAおよびAMPA受容体を選
択的に阻害すると報告されている［Fagg,Trends Neuros
ci.8,207（1981）］λ−Ｄ−グルタミルアミノメチル−
スルフェート（GAMS）と同様に、カイネート受容体を阻
害する。同じく、2,3−シス−ピペリジンジカルボン酸
（PDA）は、グルタメート受容体のすべてのサブタイプ
を阻害することが知られており［Foster and Fagg,Brai
n Res.Rev.7.103（1984）］、GluR1の応答を遮断した。
グルタメートジエチルエステル（GDEE）は、AMPAタイプ
のグルタメート受容体を選択的に阻害すると見られてお
り［Foster and Fagg,Brain Res.Rev.7.103（198
4）］、その応答を有意に遮断せず、弱いアゴニストの
性質を示した。NMDA受容体アンタゴニストの２−アミノ
−５−ホスホノ吉草酸（APV）および３−（２−カルボ
キシピペラジン−４−イル）プロピル−１−ホスフェー
ト（CPP）、ならびにNMDAそれ自体は、KA応答を若干阻
害するので、弱いアンタゴニストとして作用した。これ
らは、いかなるアゴニストの性質も示さなかった。
全体的にみれば、GluR1転写物を注入された卵母細胞
で認められる電気生理学的性質、および観察された薬理
学的性質によれば、GluR1が、総ポリ（Ａ）+RNAを注入
された母母細胞で観察されたものとは識別できない機能
性KA受容体であることが分かる。したがって、GluR1に
よってコードされた単一のタンパク質サブユニットは、
活性のある受容体イオンチャンネル複合体を形成するに
十分である。
で認められる電気生理学的性質、および観察された薬理
学的性質によれば、GluR1が、総ポリ（Ａ）+RNAを注入
された母母細胞で観察されたものとは識別できない機能
性KA受容体であることが分かる。したがって、GluR1に
よってコードされた単一のタンパク質サブユニットは、
活性のある受容体イオンチャンネル複合体を形成するに
十分である。
実施例７ GluR1の配列決定および１次構造 プラスミドpGluR1のcDNA挿入片をM13mp19にサブクロ
ーニングして、配列を決定した（図１）。2721bpのオー
プンリーディングフレームが、全長2992bp中に見い出さ
れた。したがって、予想されるタンパク質は、889個の
アミノ酸からなり、そのMrの計算値は約99,769である。
推定されるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸18
個の推定的シグナルペプチドが存在し、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne,Nucl.Ac
ids Res.14,4683（1986）］。したがって、このタンパ
ク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられる。
６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメインに
存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガンド
ゲーテッドイオンチャンネルである。ニコチン性アセチ
ルコリン受容体、GABAA受容体およびグリシン受容体と
の配列の比較によれば、全体的な相同性はほとんどない
ことが分かる。
ーニングして、配列を決定した（図１）。2721bpのオー
プンリーディングフレームが、全長2992bp中に見い出さ
れた。したがって、予想されるタンパク質は、889個の
アミノ酸からなり、そのMrの計算値は約99,769である。
推定されるタンパク質配列は、そのＮ末端にアミノ酸18
個の推定的シグナルペプチドが存在し、実験的規則に合
致する推定の切断部位も含まれる［von Heijne,Nucl.Ac
ids Res.14,4683（1986）］。したがって、このタンパ
ク質のＮ末端は、細胞外に存在するものと考えられる。
６つのＮ−グリコシル化部位が推定の細胞外ドメインに
存在する可能性がある。他の配列が決定されたリガンド
ゲーテッドイオンチャンネルである。ニコチン性アセチ
ルコリン受容体、GABAA受容体およびグリシン受容体と
の配列の比較によれば、全体的な相同性はほとんどない
ことが分かる。
この開示に先立って配列決定されたすべてのリガンド
ゲーテッドイオンチャンネルのサブユニットには、１つ
の細胞外の保存領域があり、その特徴はアミノ酸14個に
よって互いに隔てられたシステイン残基２個が存在する
ことである。そして、保存されたプロリンおよびアスパ
ルテート残基が、これらシステイン２残基の１番目から
下流へそれぞれアミノ酸８個および10個目に位置してい
る［Barnard et al.,Trends Neurosci.10,502（198
7）］。神経伝達物質受容体−イオンチャンネル複合体
に関するこの仮説的特徴は、GluR1によってコードされ
たタンパク質ではわずかしか保持されていない。上記の
プロリンおよびアスパルテート残基は存在するが、第１
のシステイン残基はプロリン残基から７残基上流に位置
し、第２のシステイン残基は存在しない。
ゲーテッドイオンチャンネルのサブユニットには、１つ
の細胞外の保存領域があり、その特徴はアミノ酸14個に
よって互いに隔てられたシステイン残基２個が存在する
ことである。そして、保存されたプロリンおよびアスパ
ルテート残基が、これらシステイン２残基の１番目から
下流へそれぞれアミノ酸８個および10個目に位置してい
る［Barnard et al.,Trends Neurosci.10,502（198
7）］。神経伝達物質受容体−イオンチャンネル複合体
に関するこの仮説的特徴は、GluR1によってコードされ
たタンパク質ではわずかしか保持されていない。上記の
プロリンおよびアスパルテート残基は存在するが、第１
のシステイン残基はプロリン残基から７残基上流に位置
し、第２のシステイン残基は存在しない。
GluR1のヒドロパシ（hydropathy）プロット解析によ
れば、トランスメンブランドメイン（TMD）の候補とな
る幾つかの領域が認められた。アミノ酸残基455番目と8
10番目との間の領域は、そのヒドロパシ（hydropathy）
プロフィルが他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
にみられるものと類似しているため、顕著である。すな
わち、３つの近接して位置する仮定的TMDは、このタン
パク質のＣ末端に近い４番目の仮定的TMDから約175個の
アミノ酸残基によって隔てられている。この領域内で以
下の４つのトランスメンブラン領域がGluR1中に配置し
ている。TMD I（アミノ酸残基463番目と480番目との間
に配置）、TDM II（アミノ酸残基521番目と539番目との
間に配置）、TMD III（アミノ酸残基596番目と614番目
との間に配置）、およびTMD IV（アミノ酸残基788番目
と808番目との間に配置）。
れば、トランスメンブランドメイン（TMD）の候補とな
る幾つかの領域が認められた。アミノ酸残基455番目と8
10番目との間の領域は、そのヒドロパシ（hydropathy）
プロフィルが他のリガンドゲーテッドイオンチャンネル
にみられるものと類似しているため、顕著である。すな
わち、３つの近接して位置する仮定的TMDは、このタン
パク質のＣ末端に近い４番目の仮定的TMDから約175個の
アミノ酸残基によって隔てられている。この領域内で以
下の４つのトランスメンブラン領域がGluR1中に配置し
ている。TMD I（アミノ酸残基463番目と480番目との間
に配置）、TDM II（アミノ酸残基521番目と539番目との
間に配置）、TMD III（アミノ酸残基596番目と614番目
との間に配置）、およびTMD IV（アミノ酸残基788番目
と808番目との間に配置）。
実施例８ GluR2およびGluR3の分離および特徴決定 GluR2およびGluR3遺伝子をコードするcDNAクローン
を、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリーニングプロ
トコール（実施例２参照）及びプローブとしてGluR1cDN
Aの放射能標識断片を使って、成熟ラットの前脳ライブ
ラリーから分離した。図３および４は、クローンλRB14
（GluR2）およびλRB312（GluR3）のヌクレオチド配列
およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す。GluR2
およびGluR3の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値
は、それぞれ96,400ダルトン（862個のアミノ酸）およ
び98,000ダルトン（866個のアミノ酸）である。潜在的
なＮグリコシル化部位は、GluR2タンパク質中ではAsn23
5、Asn349、Asn385、Asn392およびAsn835にあり、GluR3
タンパク質中では、Asn35、Asn238、Asn352、Asn387お
よびAsn394にある。GluR1と同様に、GluR2とGluR3との
両者の疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領
域が認められる。こういった１つのドメインは、各タン
パク質のアミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴
をもつ一方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜
ヘリックス（menbrane−spanning helix）（MSR Ｉ〜I
V）を形成し、各ポリペプチドのカルボキシ末端側半分
に位置する。
を、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリーニングプロ
トコール（実施例２参照）及びプローブとしてGluR1cDN
Aの放射能標識断片を使って、成熟ラットの前脳ライブ
ラリーから分離した。図３および４は、クローンλRB14
（GluR2）およびλRB312（GluR3）のヌクレオチド配列
およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す。GluR2
およびGluR3の成熟非グリコシル化型の分子量の計算値
は、それぞれ96,400ダルトン（862個のアミノ酸）およ
び98,000ダルトン（866個のアミノ酸）である。潜在的
なＮグリコシル化部位は、GluR2タンパク質中ではAsn23
5、Asn349、Asn385、Asn392およびAsn835にあり、GluR3
タンパク質中では、Asn35、Asn238、Asn352、Asn387お
よびAsn394にある。GluR1と同様に、GluR2とGluR3との
両者の疎水性プロフィルによれば、５つの強い疎水性領
域が認められる。こういった１つのドメインは、各タン
パク質のアミノ末端に位置し、シグナルペプチドの特徴
をもつ一方、さらに４つの疎水性領域はおそらく、経膜
ヘリックス（menbrane−spanning helix）（MSR Ｉ〜I
V）を形成し、各ポリペプチドのカルボキシ末端側半分
に位置する。
図５は、GluR1、GluR2およびGluR3（ならびにGluR4お
よびGluR5）遺伝子によってコードされたタンパク質の
推定アミノ酸配列を並べて示す。並べた配列が示すよう
に、GluR1とGluR2間（70％）、およびGluR1とGluR3間
（69％）、ならびにGluR2とGluR3間（74％）で有意な配
列の同一性が認められる（表２も参照）。配列の同一性
は、各タンパク質のカルボキシ末端側半分において最も
顕著である。
よびGluR5）遺伝子によってコードされたタンパク質の
推定アミノ酸配列を並べて示す。並べた配列が示すよう
に、GluR1とGluR2間（70％）、およびGluR1とGluR3間
（69％）、ならびにGluR2とGluR3間（74％）で有意な配
列の同一性が認められる（表２も参照）。配列の同一性
は、各タンパク質のカルボキシ末端側半分において最も
顕著である。
実施例９ GluR1、GluR2およびGluR3の電気生理学的比較 GluR1、GluR2およびGluR3によってコードされるタン
パク質間に高い類似性の見られることは、GluR1の場合
と同様に、GluR2およびGluR3タンパク質がアフリカツメ
ガエルの卵母細胞中でホモのカイネート感受性イオンチ
ャンネルとして機能する示唆を与えた。この仮説を調べ
るために、卵母細胞に、インビトロで合成したRNA転写
物（各cDNAクローン由来）を注入した。図6Aは、卵母細
胞中に注入されたGluR2およびGluR3が、100μM KAの槽
中投与に対する応答で脱分極することを示している。
パク質間に高い類似性の見られることは、GluR1の場合
と同様に、GluR2およびGluR3タンパク質がアフリカツメ
ガエルの卵母細胞中でホモのカイネート感受性イオンチ
ャンネルとして機能する示唆を与えた。この仮説を調べ
るために、卵母細胞に、インビトロで合成したRNA転写
物（各cDNAクローン由来）を注入した。図6Aは、卵母細
胞中に注入されたGluR2およびGluR3が、100μM KAの槽
中投与に対する応答で脱分極することを示している。
KA応答の大きさは、３種のグルタメート受容体サブユ
ニトに関して等価ではなかった。注入RNAが等量（2ng）
である場合、GluR3RNA注入卵母細胞での応答は、GluR1
応答より常に大きかった。GluR2注入卵母細胞でのKA誘
発脱分極は、もっとも弱く、はるか大量のRNA（10〜25n
g）を注入した卵母細胞で検出可能となるだけであっ
た。
ニトに関して等価ではなかった。注入RNAが等量（2ng）
である場合、GluR3RNA注入卵母細胞での応答は、GluR1
応答より常に大きかった。GluR2注入卵母細胞でのKA誘
発脱分極は、もっとも弱く、はるか大量のRNA（10〜25n
g）を注入した卵母細胞で検出可能となるだけであっ
た。
図6Bのデータは、KAの他に、GluR1またはGluR3RNAを
注入された卵母細胞がQUIS（10μＭ）、AMPA（50μ
Ｍ）、グルタメート（GLU,100μＭ）にも応答すること
を示している。検出可能な応答は、NMDA（300μＭ＋10
μＭグリシン）またはAPB（50μＭ）では得られなかっ
た。GluR2RNAを注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量に行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。GluR1注入の卵母細胞では、AMPAおよびQUI
Sに対する応答は一般に、KA応答の最大値の35〜40％で
あったが、GluR3ではKA応答の約10％であった。KAに対
して、ドーモイ酸（DOM、100μＭ）へのGluR1応答は、G
luR3で見られるものより約６倍大きい。全体的にみれ
ば、これらのデータは、GluR1またはGluR3サブユニット
から組み立てられた受容体は薬理学的に異なっているこ
とを示す。さらに、効率は低下しているものの、ホモの
GluR1およびGluR3受容体がQUISとAMPAの両者に応答する
という観察結果から、KA、QUISおよびAMPAが同一のグル
タメート受容体ポリペプチドに結合し得る直接の証拠が
得られる。
注入された卵母細胞がQUIS（10μＭ）、AMPA（50μ
Ｍ）、グルタメート（GLU,100μＭ）にも応答すること
を示している。検出可能な応答は、NMDA（300μＭ＋10
μＭグリシン）またはAPB（50μＭ）では得られなかっ
た。GluR2RNAを注入された卵母細胞から得られた応答
は、再現可能な定量に行うには小さすぎたので、解析か
ら除外した。GluR1注入の卵母細胞では、AMPAおよびQUI
Sに対する応答は一般に、KA応答の最大値の35〜40％で
あったが、GluR3ではKA応答の約10％であった。KAに対
して、ドーモイ酸（DOM、100μＭ）へのGluR1応答は、G
luR3で見られるものより約６倍大きい。全体的にみれ
ば、これらのデータは、GluR1またはGluR3サブユニット
から組み立てられた受容体は薬理学的に異なっているこ
とを示す。さらに、効率は低下しているものの、ホモの
GluR1およびGluR3受容体がQUISとAMPAの両者に応答する
という観察結果から、KA、QUISおよびAMPAが同一のグル
タメート受容体ポリペプチドに結合し得る直接の証拠が
得られる。
また、図6Bは、GluR1またはGluR3サブユニットRNAを
注入した卵母細胞の薬理学的プロフィールがラット前脳
海馬のポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で見られるも
のと有意に異なることを示す。この所見は、海馬RNAを
注入した卵母細胞で見られる応答が、GluR1、GluR2およ
びGluR3サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせから組み立てられたヘテログルタメート受容体によ
って媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３
種すべてのGluRサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
注入した卵母細胞の薬理学的プロフィールがラット前脳
海馬のポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で見られるも
のと有意に異なることを示す。この所見は、海馬RNAを
注入した卵母細胞で見られる応答が、GluR1、GluR2およ
びGluR3サブユニットポリペプチドのさまざまな組み合
わせから組み立てられたヘテログルタメート受容体によ
って媒介されることを示唆する。この示唆は、海馬で３
種すべてのGluRサブユニット遺伝子が活発に転写される
事実によって裏付けられる。
実施例10 GluR1、GluR2およびGluR3の薬理学的比較 GluR1、GluR2およびGluR3サブユニット遺伝子によっ
てコードされたタンパク質の混合物から組み立てられた
グルタメート受容体が、それぞれ互いに、または単一サ
ブユニット受容体で観察されるものとは有意に異なる薬
理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例で検討
する。
てコードされたタンパク質の混合物から組み立てられた
グルタメート受容体が、それぞれ互いに、または単一サ
ブユニット受容体で観察されるものとは有意に異なる薬
理学的性質を有するか否かの問題を、この実施例で検討
する。
図6Bおよび7Bのデータの比較によって、被験アゴニス
トでは、薬理学の面で実質的な差異がほとんどないこと
が示される。しかし、GluR1に比較して、QUIS、AMPAお
よびGLUへの応答は、サブユニットの組み合わせ体を発
現する卵母細胞中で有意に低下している。NMDA応答を例
外として、GluRサブユニット組み合わせ体を注入した卵
母細胞での全アゴニストプロフィールは、GluR1またはG
luR3サブユニットRNAのみ注入した卵母細胞よりも、海
馬ポリ（Ａ）+RNAを含む卵母細胞に類似している。
トでは、薬理学の面で実質的な差異がほとんどないこと
が示される。しかし、GluR1に比較して、QUIS、AMPAお
よびGLUへの応答は、サブユニットの組み合わせ体を発
現する卵母細胞中で有意に低下している。NMDA応答を例
外として、GluRサブユニット組み合わせ体を注入した卵
母細胞での全アゴニストプロフィールは、GluR1またはG
luR3サブユニットRNAのみ注入した卵母細胞よりも、海
馬ポリ（Ａ）+RNAを含む卵母細胞に類似している。
実施例11 GluR1、GluR2およびGluR3から記録されたKA誘起電流の
比較 図7Aは、GluR1、GluR2およびGluR3サブユニットの混
合物を注入した卵母細胞から記録されたKA誘起電流（斑
点カラム）と、個々のサブユニットに対して測定された
総電流（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な
所見は、GluR1とGluR2サブユニットを両方発現する卵母
細胞でのKA誘起電流の有意な増大（１つのみを注入した
卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、またはGl
uR2とGluR3サブユニットの場合（約２倍の増大）であ
る。３種類すべてのサブユニットRNAを注入した場合、K
A誘起電流は平均2.5倍の増大となる。
比較 図7Aは、GluR1、GluR2およびGluR3サブユニットの混
合物を注入した卵母細胞から記録されたKA誘起電流（斑
点カラム）と、個々のサブユニットに対して測定された
総電流（白抜きカラム）とを比較した図である。重要な
所見は、GluR1とGluR2サブユニットを両方発現する卵母
細胞でのKA誘起電流の有意な増大（１つのみを注入した
卵母細胞での総応答を上回る約４倍の増大）、またはGl
uR2とGluR3サブユニットの場合（約２倍の増大）であ
る。３種類すべてのサブユニットRNAを注入した場合、K
A誘起電流は平均2.5倍の増大となる。
これらの結果は、卵母細胞中では、個々のグルタメー
ト受容体サブユニットのポリペプチドが、それぞれ独立
した単純な様式で機能するのではなく、互いに相互作用
するという結論を裏付けるものである。こういった相互
作用の結果、単一のグルタメート受容体のサブユニット
からなる受容体とは異なる性質を有するヘテログルタメ
ート受容体が産生される。
ト受容体サブユニットのポリペプチドが、それぞれ独立
した単純な様式で機能するのではなく、互いに相互作用
するという結論を裏付けるものである。こういった相互
作用の結果、単一のグルタメート受容体のサブユニット
からなる受容体とは異なる性質を有するヘテログルタメ
ート受容体が産生される。
実施例12 KA誘起応答に関する電流−電圧の関係 この実施例では、個々のGluRのサブユニット、それら
の組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+RNAを注入し
た卵母細胞で測定したKA誘起応答に関して、電流−電圧
（I/V）の関係を調べる。
の組み合わせ体、または海馬のポリ（Ａ）+RNAを注入し
た卵母細胞で測定したKA誘起応答に関して、電流−電圧
（I/V）の関係を調べる。
I/Vデータを図８に示す。この図では、個々のグルタ
メート受容体サブユニットのRNAを注入した卵母細胞を
パネルＡに、サブユニットの組み合わせ体を注入した卵
母細胞をパネルＢおよびＣに示し、海馬のポリ（Ａ）+R
NAを発現する卵母細胞を比較のためにパネルＡに示す。
脳のポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で測定されたKA
応答は、約−10mVの反転電圧とほぼ線形のI/V関係を示
す。この結果は、単一のGluR1またはGluR3のサブユニッ
トRNAを注入した卵母細胞で得られたI/V曲線とは著しく
対照的である。GluR1およびGluR3は、強い内向きの整流
および約−40mVの反転電位を示す。これらのデータか
ら、海馬RNAを注入した卵母細胞に存在するKA感受性受
容体は、GluR1またはGluR3サブユニットのRNAを注入し
た卵母細胞によって組み立てられたものとは異なるのは
明らかである。
メート受容体サブユニットのRNAを注入した卵母細胞を
パネルＡに、サブユニットの組み合わせ体を注入した卵
母細胞をパネルＢおよびＣに示し、海馬のポリ（Ａ）+R
NAを発現する卵母細胞を比較のためにパネルＡに示す。
脳のポリ（Ａ）+RNAを注入した卵母細胞で測定されたKA
応答は、約−10mVの反転電圧とほぼ線形のI/V関係を示
す。この結果は、単一のGluR1またはGluR3のサブユニッ
トRNAを注入した卵母細胞で得られたI/V曲線とは著しく
対照的である。GluR1およびGluR3は、強い内向きの整流
および約−40mVの反転電位を示す。これらのデータか
ら、海馬RNAを注入した卵母細胞に存在するKA感受性受
容体は、GluR1またはGluR3サブユニットのRNAを注入し
た卵母細胞によって組み立てられたものとは異なるのは
明らかである。
図8Bでは、GluR1とGluR2の組み合わせ体に関するI/V
曲線がGluR1サブユニット単独で観察されるものとは顕
著に異なっている。この対のRNAを注入した卵母細胞
は、ほぼ線形のI/Vプロットを示し、約−10mVの反転電
位を有する。このプロットは、海馬のRNAを注入した卵
母細胞で見られるものと非常に類似している（パネル
Ａ）。対照的に、GluR1とGluR3の組み合わせ体のI/V曲
線は、個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定
されるものとは僅かにしか異なっていない。図8Cは、Gl
uR2とGluR3サブユニットの組み合わせ体のI/V曲線でい
くらか内向の整流がみられること、およびGluR1＋GluR2
または海馬RNAのI/V曲線で決定された反転電位（−10m
V）より若干大きい負（−20mV）の反転電位が生じるこ
とが示されている。これら３つのグルタメート受容体サ
ブユニットのRNAが単一の卵母細胞で組み合わされと
き、得られたI/V曲線は、反転電位と勾配の両面でGluR1
とGluR2の組み合わせ体でみられるI/V曲線と近似してい
るが、これらのサブユニットとの応答は、GluR1とGluR2
の組み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を
示す。
曲線がGluR1サブユニット単独で観察されるものとは顕
著に異なっている。この対のRNAを注入した卵母細胞
は、ほぼ線形のI/Vプロットを示し、約−10mVの反転電
位を有する。このプロットは、海馬のRNAを注入した卵
母細胞で見られるものと非常に類似している（パネル
Ａ）。対照的に、GluR1とGluR3の組み合わせ体のI/V曲
線は、個々のサブユニットを発現させる卵母細胞で測定
されるものとは僅かにしか異なっていない。図8Cは、Gl
uR2とGluR3サブユニットの組み合わせ体のI/V曲線でい
くらか内向の整流がみられること、およびGluR1＋GluR2
または海馬RNAのI/V曲線で決定された反転電位（−10m
V）より若干大きい負（−20mV）の反転電位が生じるこ
とが示されている。これら３つのグルタメート受容体サ
ブユニットのRNAが単一の卵母細胞で組み合わされと
き、得られたI/V曲線は、反転電位と勾配の両面でGluR1
とGluR2の組み合わせ体でみられるI/V曲線と近似してい
るが、これらのサブユニットとの応答は、GluR1とGluR2
の組み合わせ体では認められない顕著な内向きの整流を
示す。
実施例13 哺乳動物の中枢神経系におけるGluR1、GluR2およびGluR
3のmRNAの分布 インビボでGluR1、GluR2およびGluR3遺伝子によって
コードされるタンパク質が会合してヘテログルタメート
受容体を形成するという仮説は、個々のサブユニットの
遺伝子が異なった神経解剖学的部位で転写されることを
示せば誤りであることが証明され得る。したがって、成
熟ラットの脳におけるGluR1、GluR2およびGluR3のRNAの
分布を、標識アンチセンスRNAプローブおよび基本的に
は文献［Deneris et al.,J.Biol.Chem.264,6268（198
9）］に記載されているような、in situハイブリダイゼ
ーション組織化学を用いて調べた。この結果は、GluR
1、GluR2およびGluR3プローブで得られたハイブリダイ
ゼーションパターンが、海馬および歯状回のCA1−CA3領
域で認められる最も強いハイブリダイゼーションとほぼ
一致していたことを表していた。これらの領域の高分解
能解析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、CA1
−CA3領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どが全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、GluR1、G
luR2およびGluR3サブユニット遺伝子の全発現パターン
は実質的に一致していた。
3のmRNAの分布 インビボでGluR1、GluR2およびGluR3遺伝子によって
コードされるタンパク質が会合してヘテログルタメート
受容体を形成するという仮説は、個々のサブユニットの
遺伝子が異なった神経解剖学的部位で転写されることを
示せば誤りであることが証明され得る。したがって、成
熟ラットの脳におけるGluR1、GluR2およびGluR3のRNAの
分布を、標識アンチセンスRNAプローブおよび基本的に
は文献［Deneris et al.,J.Biol.Chem.264,6268（198
9）］に記載されているような、in situハイブリダイゼ
ーション組織化学を用いて調べた。この結果は、GluR
1、GluR2およびGluR3プローブで得られたハイブリダイ
ゼーションパターンが、海馬および歯状回のCA1−CA3領
域で認められる最も強いハイブリダイゼーションとほぼ
一致していたことを表していた。これらの領域の高分解
能解析から、ハイブリダイゼーションシグナルが、CA1
−CA3領域の錐体細胞層および歯状回の顆粒細胞層に由
来することが示唆される。梨状皮質、尾状核−被核、扁
桃および海馬で、３種すべてのプローブの若干弱いハイ
ブリダイゼーションが認められた。視床では低レベルの
ハイブリダイゼーションが検出されたが、線維路では殆
どが全く認められなかった。識別のハイブリダイゼーシ
ョンが中脳手綱および新皮質で認められたが、GluR1、G
luR2およびGluR3サブユニット遺伝子の全発現パターン
は実質的に一致していた。
実施例14 GluR4およびGluR5のcDNAの分離 プローブとしてGluR2cDNAの断片（ヌクレオチド1793
−2240）を用い、低緊縮ハイブリダイゼーションプロト
コールによって、数個のGluR4およびR5クローンをラッ
トの前脳ライブラリーから分離した。配列解析によっ
て、これらcDNAクローンのどれもが完全なオープンリー
ディングフレームを含まないことが示された。異なった
成熟ラットの前脳組織からのmRNAを用いたノーザン法か
ら、GluR4およびGluR5転写物が小脳で最も豊富であるこ
とが示された。従って、部分的なGluR4およびGluR5cDNA
クローンを高緊縮スクリーニング条件下でプローブとし
て使用して、成熟ラットの小脳のcDNAライブラリーから
大きなオープンリーディングフレームをコードするcDNA
を分離した。
−2240）を用い、低緊縮ハイブリダイゼーションプロト
コールによって、数個のGluR4およびR5クローンをラッ
トの前脳ライブラリーから分離した。配列解析によっ
て、これらcDNAクローンのどれもが完全なオープンリー
ディングフレームを含まないことが示された。異なった
成熟ラットの前脳組織からのmRNAを用いたノーザン法か
ら、GluR4およびGluR5転写物が小脳で最も豊富であるこ
とが示された。従って、部分的なGluR4およびGluR5cDNA
クローンを高緊縮スクリーニング条件下でプローブとし
て使用して、成熟ラットの小脳のcDNAライブラリーから
大きなオープンリーディングフレームをコードするcDNA
を分離した。
こうして分離されたcDNAクローンの中で、２つのGluR
4関連クローン（λCER112およびλCER121B）は、GluR4
遺伝子の一部だけをコードしていたが、pBS SK（＋）
ベクター（Stratagene Cloning Systems）での完全な長
さの発現可能な構築体を作り出すのに十分な重複をもっ
ていた。このGluR4構築体のヌクレオチド配列は、pK45
と命名され、決定された配列及びその推定アミノ酸配列
を図９に示す。
4関連クローン（λCER112およびλCER121B）は、GluR4
遺伝子の一部だけをコードしていたが、pBS SK（＋）
ベクター（Stratagene Cloning Systems）での完全な長
さの発現可能な構築体を作り出すのに十分な重複をもっ
ていた。このGluR4構築体のヌクレオチド配列は、pK45
と命名され、決定された配列及びその推定アミノ酸配列
を図９に示す。
小脳ライブラリーから分離した29個のGluR5関連cDNA
の中で、同一の大きなオープンリーディングフレームを
コードする３つのクローン（λRB12、λ当RB15およびλ
RB20）を同定した。cDNAクローンλRB20（GluR5−１）
の配列を図10に示す。λRB15およびλRB12は、５′末端
のところがλRB20より短かった。λRB20cDNAは、187bp
の５′末端非翻訳領域、2760bpの連続オープンリーディ
ングフレーム、および303bpの３′末端非翻訳領域から
なる。この５′末端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴
である配列AAGATGGで終わっている。
の中で、同一の大きなオープンリーディングフレームを
コードする３つのクローン（λRB12、λ当RB15およびλ
RB20）を同定した。cDNAクローンλRB20（GluR5−１）
の配列を図10に示す。λRB15およびλRB12は、５′末端
のところがλRB20より短かった。λRB20cDNAは、187bp
の５′末端非翻訳領域、2760bpの連続オープンリーディ
ングフレーム、および303bpの３′末端非翻訳領域から
なる。この５′末端非翻訳領域は、翻訳開始部位の特徴
である配列AAGATGGで終わっている。
前脳ライブラリーを起源として分離された更に３つの
cDNAクローンも調べた。これらcDNAの配列は、予想翻訳
開始領域部位でλRB20と同一である。配列決定によっ
て、GluR5cDNAの２つの変異体が前脳および小脳ライブ
ラリーに現れることが分かった。この異質性はλRB20及
び29個のGluR5関連cDNAクローンのうち17個にみられる4
5ヌクレオチドの挿入に由来する（図10）。この挿入に
よって、上記のオープンリーディングフレームは断絶さ
れない。さらに、共通のスプライスドナーおよびアクセ
プター部位は存在しない［Breathnach and Chambon,An
n.Rev.Biochem.50,349−383（1981）］。これは、その
挿入がスプライスされないイントロンから生じるのでは
なく、別のスプライス現象の結果である可能性が高いこ
とを示唆するものである。ヌクレオチド配列の解析は、
２つのGluR5変異体が他の点では同一であることを示
す。
cDNAクローンも調べた。これらcDNAの配列は、予想翻訳
開始領域部位でλRB20と同一である。配列決定によっ
て、GluR5cDNAの２つの変異体が前脳および小脳ライブ
ラリーに現れることが分かった。この異質性はλRB20及
び29個のGluR5関連cDNAクローンのうち17個にみられる4
5ヌクレオチドの挿入に由来する（図10）。この挿入に
よって、上記のオープンリーディングフレームは断絶さ
れない。さらに、共通のスプライスドナーおよびアクセ
プター部位は存在しない［Breathnach and Chambon,An
n.Rev.Biochem.50,349−383（1981）］。これは、その
挿入がスプライスされないイントロンから生じるのでは
なく、別のスプライス現象の結果である可能性が高いこ
とを示唆するものである。ヌクレオチド配列の解析は、
２つのGluR5変異体が他の点では同一であることを示
す。
全オープンリーディングフレームをコードするより短
いプライス変異体はcDNAクローン中に見い出されなかっ
た。したがって、λRB20（GluR5−１）に見られる45個
のヌクレオチドの挿入片を欠いているが、他の点ではそ
のクローンと同一のクローン（λRB△20）が構成され
た。このより短いスプライス変異体クローン（λRB△2
0）をGluR5−２と称する。λRB20とλRB△20の双方はア
フリカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され
（実施例16参照）、コードされた変異体タンパクをGluR
5−１およびGluR5−２とそれぞれ命名した。
いプライス変異体はcDNAクローン中に見い出されなかっ
た。したがって、λRB20（GluR5−１）に見られる45個
のヌクレオチドの挿入片を欠いているが、他の点ではそ
のクローンと同一のクローン（λRB△20）が構成され
た。このより短いスプライス変異体クローン（λRB△2
0）をGluR5−２と称する。λRB20とλRB△20の双方はア
フリカツメガエルの卵母細胞での発現実験に使用され
（実施例16参照）、コードされた変異体タンパクをGluR
5−１およびGluR5−２とそれぞれ命名した。
GluR4mRNAは、4.5kbとして、小脳RNAのノーザンブロ
ット上で検出された。よりサイズの小さいこのmRNAは、
スプライス変異体であるかもしれない。ノーザン法解析
によって、主要なGluR5mRNAは６キロベースのサイズを
有することも示された。
ット上で検出された。よりサイズの小さいこのmRNAは、
スプライス変異体であるかもしれない。ノーザン法解析
によって、主要なGluR5mRNAは６キロベースのサイズを
有することも示された。
実施例15 GluR5cDNAおよびタンパク質の構造的特徴 GluR5−１のcDNAヌクレオチド配列の翻訳から、920ア
ミノ酸残基からなる単一の長いオープンリーディングフ
レームの存在が予期される（図10）。GluR5の配列に
は、全体的アミノ酸配列の点で各KA/AMPAサブユニット
と同一性がある（図５および表２）。GluR5−１におけ
るこの15個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中
でも独特であるので、短い方のGluR5−２変異体は、特
徴の明らかなKA/AMPAサブユニットの対応物である。表
２は、GluR5がこれまで同定された中で最も類似性の低
いグルタメート受容体サブユニットであり、GluR5とKA/
AMPAサブユニットとの比較は最も保存的配列の要素を明
らかにすることを示す（図５）。他のリガンドゲーテッ
ドイオンチャンネル群、神経伝達物質のアセチルコリン
受容体およびGABAA受容体およびグリシン受容体群の中
では、Ｎ末端細胞外ドメインが最も保存されているが、
Ｃ末端配列は経膜領域（MSR）IIIとIVとの間で変異して
いる。グルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、
対照的に、提唱されたMSR I［Hollmann,et al.,Nature
342,643（1989）］のＮ末端領域にはわずか17％の同一
性しかなく、45％の同一性があるMSR IのＣ末端領域よ
りも類似していない。リガンドゲーティング神経伝達物
質の受容体チャンネル複合体［Barnard,et al.,Trends
Neurosci.10,502（1987）］の特徴である「Cys−Cysル
ープ」は、グルタメート受容体サブユニット群中には保
存されていない（図５）。グルタメート受容体サブユニ
ットの半分のＣ末端側は、チャンネル形成に関与してい
ることが示唆され、仮定された経膜ヘリックス（MSR I
〜IV、図５）［Hollmann,et al.,Natuer 342,643（198
9）］を含む。推定されたMSR IIIは、最も保存された連
続配列であって、GluR5タンパク質中で唯一の保存的ア
ミノ酸置換（ValからIle）を有する。上記のように、他
のリガンドゲーテッドチャンネル群で、MSR IIIとIVと
の間のセグメントは長さおよび配列の点で変異してい
る。グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定さ
れたセグメントの類似性は高く（48％）、GluR5だけが
配列の長さの変異を示す。KA/AMPA受容体およびGluR5タ
ンパク質は一般に、提唱されたMSR IVのＣ末端が変異し
ている。
ミノ酸残基からなる単一の長いオープンリーディングフ
レームの存在が予期される（図10）。GluR5の配列に
は、全体的アミノ酸配列の点で各KA/AMPAサブユニット
と同一性がある（図５および表２）。GluR5−１におけ
るこの15個のアミノ酸挿入は、掲示したタンパク質の中
でも独特であるので、短い方のGluR5−２変異体は、特
徴の明らかなKA/AMPAサブユニットの対応物である。表
２は、GluR5がこれまで同定された中で最も類似性の低
いグルタメート受容体サブユニットであり、GluR5とKA/
AMPAサブユニットとの比較は最も保存的配列の要素を明
らかにすることを示す（図５）。他のリガンドゲーテッ
ドイオンチャンネル群、神経伝達物質のアセチルコリン
受容体およびGABAA受容体およびグリシン受容体群の中
では、Ｎ末端細胞外ドメインが最も保存されているが、
Ｃ末端配列は経膜領域（MSR）IIIとIVとの間で変異して
いる。グルタメート受容体サブユニット遺伝子群では、
対照的に、提唱されたMSR I［Hollmann,et al.,Nature
342,643（1989）］のＮ末端領域にはわずか17％の同一
性しかなく、45％の同一性があるMSR IのＣ末端領域よ
りも類似していない。リガンドゲーティング神経伝達物
質の受容体チャンネル複合体［Barnard,et al.,Trends
Neurosci.10,502（1987）］の特徴である「Cys−Cysル
ープ」は、グルタメート受容体サブユニット群中には保
存されていない（図５）。グルタメート受容体サブユニ
ットの半分のＣ末端側は、チャンネル形成に関与してい
ることが示唆され、仮定された経膜ヘリックス（MSR I
〜IV、図５）［Hollmann,et al.,Natuer 342,643（198
9）］を含む。推定されたMSR IIIは、最も保存された連
続配列であって、GluR5タンパク質中で唯一の保存的ア
ミノ酸置換（ValからIle）を有する。上記のように、他
のリガンドゲーテッドチャンネル群で、MSR IIIとIVと
の間のセグメントは長さおよび配列の点で変異してい
る。グルタメート受容体サブユニット群で、この仮定さ
れたセグメントの類似性は高く（48％）、GluR5だけが
配列の長さの変異を示す。KA/AMPA受容体およびGluR5タ
ンパク質は一般に、提唱されたMSR IVのＣ末端が変異し
ている。
GluR5の疎水性プロットは、KA/AMPA受容体のそれに類
似しており、このタンパク質の提唱されたイオンチャン
ネル形成部分で保存性の２次構造が示唆される。しか
し、GluR5のＮ末端側の半分の疎水性プロットは一般的
ではない。この領域では、KA/AMPAサブユニットと比較
した場合、GluR5はより疎水性であって、膜を貫通し得
るいくつかのセグメントを含む。膜付随性のヘリックス
を探す計算法に基づくと、４つ［Rao and Argos,Biochi
m.Biophys.Acta 869,197−214（1986）］または７つ［E
isenberg et al.,J.Mol.Biol.179,125−142（1984）］
の仮定的トランスメンブラン領域がGluR5に付与され得
る。
似しており、このタンパク質の提唱されたイオンチャン
ネル形成部分で保存性の２次構造が示唆される。しか
し、GluR5のＮ末端側の半分の疎水性プロットは一般的
ではない。この領域では、KA/AMPAサブユニットと比較
した場合、GluR5はより疎水性であって、膜を貫通し得
るいくつかのセグメントを含む。膜付随性のヘリックス
を探す計算法に基づくと、４つ［Rao and Argos,Biochi
m.Biophys.Acta 869,197−214（1986）］または７つ［E
isenberg et al.,J.Mol.Biol.179,125−142（1984）］
の仮定的トランスメンブラン領域がGluR5に付与され得
る。
５つすべてのグルタメート受容体サブユニットを、カ
エルのKA結合タンパク質［Gregor,et al.,Nature 342.6
89（1989）］とニワトリのKA結合タンパク質［Wada et
al.,Nature 342,684（1989）］で比較すると、同じよう
な程度の配列保存性（35〜40％アミノ酸同一性）が示さ
れる。GluR5配列に関する、GenBank,EMBLおよびSWISS−
PROTデーターベースのFASTAサーチ［Pearson and Lipma
n,Proc.Natl.Acad.Sci.85,2444（1988）］により、他の
タンパク質との有意な類似性がないことが示された。
エルのKA結合タンパク質［Gregor,et al.,Nature 342.6
89（1989）］とニワトリのKA結合タンパク質［Wada et
al.,Nature 342,684（1989）］で比較すると、同じよう
な程度の配列保存性（35〜40％アミノ酸同一性）が示さ
れる。GluR5配列に関する、GenBank,EMBLおよびSWISS−
PROTデーターベースのFASTAサーチ［Pearson and Lipma
n,Proc.Natl.Acad.Sci.85,2444（1988）］により、他の
タンパク質との有意な類似性がないことが示された。
実施例16 Ｌ−グルタメートにさらされたGluR5mRNA注入卵母細胞
の電気生理学的性質 インビトロで合成したGluR5−１およびGluR5−2cRNA
をそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させ
た。いずれのcRNAについても、グルタメート受容体のア
ゴニストであるKA（100μＭ）、AMPA（50μＭ）、キス
カレート（10μＭ）、APB（100μＭ）およびNMDA（100
μＭ、10μＭのグリシンとともに投与）のいずれの投与
でも、cRNA注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。
しかし、Ｌ−グルタメート（100μＭ）によって誘起さ
れた弱い膜の脱分極が、GluR5−1cRNA（最大脱分極、3.
5mV）およびGluR5−2cRNA（最大脱分極、4.5mV）を注入
した卵母細胞で記録された。GluR5−２のみを注入した
卵母細胞に比較して、GluR5−１とGluR5−２とを同時に
注入した卵母細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意
に強い膜の脱分極は認められなかった。GluR5−１また
はGluR5−2cRNAを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、GluR5−１
（膜の脱分極、2.29±0.26mV s.e.m）では７個（７個
中）の卵母細胞で記録され、GluR5−２（2.27±0.19mV
s.e.m）では29個（33個中）の卵母細胞で記録された。
の電気生理学的性質 インビトロで合成したGluR5−１およびGluR5−2cRNA
をそれぞれアフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させ
た。いずれのcRNAについても、グルタメート受容体のア
ゴニストであるKA（100μＭ）、AMPA（50μＭ）、キス
カレート（10μＭ）、APB（100μＭ）およびNMDA（100
μＭ、10μＭのグリシンとともに投与）のいずれの投与
でも、cRNA注入卵母細胞中に膜脱分極は生じなかった。
しかし、Ｌ−グルタメート（100μＭ）によって誘起さ
れた弱い膜の脱分極が、GluR5−1cRNA（最大脱分極、3.
5mV）およびGluR5−2cRNA（最大脱分極、4.5mV）を注入
した卵母細胞で記録された。GluR5−２のみを注入した
卵母細胞に比較して、GluR5−１とGluR5−２とを同時に
注入した卵母細胞でＬ−グルタメートへの応答に、有意
に強い膜の脱分極は認められなかった。GluR5−１また
はGluR5−2cRNAを注入したいかなる特定の卵母細胞で
も、脱分極に再現性があり、速い反応を示し、アゴニス
トのスーパーフュージョンが緩衝液のスーパーフュージ
ョンに切り替えられた場合、徐々に（５分以内）反転し
た。非注入卵母細胞または水を注入した卵母細胞は、被
験グルタメート受容体アゴニストに対する応答を示さな
かった。Ｌ−グルタメートに対する応答は、GluR5−１
（膜の脱分極、2.29±0.26mV s.e.m）では７個（７個
中）の卵母細胞で記録され、GluR5−２（2.27±0.19mV
s.e.m）では29個（33個中）の卵母細胞で記録された。
実施例17 発生中の中枢および末梢神経系におけるGluR4およびGlu
R5mRNAの分布 GluR4およびR5遺伝子発現に関する発生面の研究のた
めに、胚10日目（E10）から誕生21日目（P21）にかけて
マウスの切片をin situハイブリダイゼーションおよび
組織化学によって解析した。
R5mRNAの分布 GluR4およびR5遺伝子発現に関する発生面の研究のた
めに、胚10日目（E10）から誕生21日目（P21）にかけて
マウスの切片をin situハイブリダイゼーションおよび
組織化学によって解析した。
全CNS中で、GluR4およびR5遺伝子の不鮮明な発現はE1
0で検出された。これら最初のハイブリダイゼーション
シグナルは、有糸分裂後のニューロンに由来する。これ
は、E12では脳髄で最もよく示される。この上衣層は、
神経腔に対面しており、分裂中の神経芽細胞を含む。こ
れらの細胞ではハイブリダイゼーションは検出できなか
った。有糸分裂後の細胞は神経管の外部に位置し、両方
の遺伝子を発現する。発生の後期に、GluR5の転写物
は、ニューロンが分化して会合し核となる領域に著しく
存在する。程度は低いがGluR4もこの領域に存在する。
このハイブリダイゼーションパターンの時間的変化は、
延髄の主要な感覚核および周囲の構造物よりも強くハイ
ブリダイズする橋の核においてGluR5で最もよく認めら
れる。E14では、GluR5遺伝子の発現は、いくつかの別々
の脳核で特に強く、GluR4遺伝子の発現は、脳の全吻部
および尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Gl
uR4遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般に
胚後期の段階よりも少量のmRNAが検出可能であった。対
照的に、GluR5遺伝子の発現は、発生の期間中空間的に
より制限されるようにみえ、転写物のレベルは下降調節
された。時間的GluR5ハイブリダイズパターンの顕著な
変化は、小脳皮質でみられた。P12まで、GluR5転写物の
高レベルが顆粒およびプルキンエ細胞層でみられた。そ
の後、顆粒細胞層でのハイブリダイゼーションシグナル
の強度はプルキンエ細胞層に比較して低下し、P14から
はかすかなハイブリダイゼーションシグナルが顆粒細胞
で検出された。一般に、胚の発生過程で強い標識を示す
脳のこれらの領域では、成熟ラットでも検出可能な転写
物レベルを有していた。P21の動物において、最高のGlu
R4転写物レベルが、臭覚球、海馬、小脳および網膜の細
胞層で認められた。網膜では、神経節細胞層および内核
層の無軸索細胞で強いハイブリダイゼーションが認めら
れた。ミュラー細胞での発現は検出されなかった。GluR
5では、P21での最も強いハイブリダイゼーションシグナ
ルが、臭覚球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認
められた。
0で検出された。これら最初のハイブリダイゼーション
シグナルは、有糸分裂後のニューロンに由来する。これ
は、E12では脳髄で最もよく示される。この上衣層は、
神経腔に対面しており、分裂中の神経芽細胞を含む。こ
れらの細胞ではハイブリダイゼーションは検出できなか
った。有糸分裂後の細胞は神経管の外部に位置し、両方
の遺伝子を発現する。発生の後期に、GluR5の転写物
は、ニューロンが分化して会合し核となる領域に著しく
存在する。程度は低いがGluR4もこの領域に存在する。
このハイブリダイゼーションパターンの時間的変化は、
延髄の主要な感覚核および周囲の構造物よりも強くハイ
ブリダイズする橋の核においてGluR5で最もよく認めら
れる。E14では、GluR5遺伝子の発現は、いくつかの別々
の脳核で特に強く、GluR4遺伝子の発現は、脳の全吻部
および尾部で検出可能であった。出生後の発育中に、Gl
uR4遺伝子転写物の空間的分布は変化しないが、一般に
胚後期の段階よりも少量のmRNAが検出可能であった。対
照的に、GluR5遺伝子の発現は、発生の期間中空間的に
より制限されるようにみえ、転写物のレベルは下降調節
された。時間的GluR5ハイブリダイズパターンの顕著な
変化は、小脳皮質でみられた。P12まで、GluR5転写物の
高レベルが顆粒およびプルキンエ細胞層でみられた。そ
の後、顆粒細胞層でのハイブリダイゼーションシグナル
の強度はプルキンエ細胞層に比較して低下し、P14から
はかすかなハイブリダイゼーションシグナルが顆粒細胞
で検出された。一般に、胚の発生過程で強い標識を示す
脳のこれらの領域では、成熟ラットでも検出可能な転写
物レベルを有していた。P21の動物において、最高のGlu
R4転写物レベルが、臭覚球、海馬、小脳および網膜の細
胞層で認められた。網膜では、神経節細胞層および内核
層の無軸索細胞で強いハイブリダイゼーションが認めら
れた。ミュラー細胞での発現は検出されなかった。GluR
5では、P21での最も強いハイブリダイゼーションシグナ
ルが、臭覚球、扁桃、小丘およびいくつかの視床核で認
められた。
発生段階の末梢神経系（PNS）では、ハイブリダイゼ
ーション検出法によって、GluR4およびR5遺伝子が、頭
蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴覚神経節）、脊髄神
経節および小腸の壁在性神経節にさまざまな程度で発現
する。CNSと同様に、PNSの転写物は、GluR4ではE10まで
に、またGluR5ではE11までに検出される。発生の間、Gl
uR4に対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生
後の初期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維
持される。GluR5に対するハイブリダイゼーションシグ
ナルは、E16まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（GluR
5）および小腸の壁在性神経節（GluR4およびGluR5）
が、CNSより高レベルのハイブリダイゼーションを示
す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグラフィーに
よれば、神経細胞でGluR5プローブのハイブリダイゼー
ションが示されるが、衛星細胞は標識されない。
ーション検出法によって、GluR4およびR5遺伝子が、頭
蓋神経節（例えば、三叉神経節、聴覚神経節）、脊髄神
経節および小腸の壁在性神経節にさまざまな程度で発現
する。CNSと同様に、PNSの転写物は、GluR4ではE10まで
に、またGluR5ではE11までに検出される。発生の間、Gl
uR4に対するハイブリダイゼーションシグナルは、出生
後の初期まで連続的に増加し、成長後は類似の強度で維
持される。GluR5に対するハイブリダイゼーションシグ
ナルは、E16まで増加し、発生の後期では同程度の強度
で維持される。出生後の動物では、脊髄神経節（GluR
5）および小腸の壁在性神経節（GluR4およびGluR5）
が、CNSより高レベルのハイブリダイゼーションを示
す。脊髄神経節での高解像度オートラジオグラフィーに
よれば、神経細胞でGluR5プローブのハイブリダイゼー
ションが示されるが、衛星細胞は標識されない。
実施例18 成熟の哺乳動物（ラット）の脳におけるGluR4およびGlu
R5mRNAの分布。
R5mRNAの分布。
成熟動物でのGluR4およびGluR5mRNAの分布をin situ
ハイブリダイゼーションによって調べた。前脳では、CA
Iおよび海馬の歯状回、中間手綱、そして特には網膜視
床核で高レベルのGluR4転写物か検出された。海馬は、G
luR5の弱い発現を示すのみで、中間手綱では転写物は全
く検出されなかった。GluR5ハイブリダイゼーションシ
グナルは、帯状および梨状皮質、いくつかの視床核、扁
桃、ならびに外側中隔で強かった。小脳では、GluR4お
よびR5プローブのハイブリダイゼーションパターンは重
複していたが区別された。両プローブは、プルキンエ細
胞層において高レベルで検出された。顆粒細胞層では、
GluR4プローブは強い標識を生じたが、GluR5プローブの
標識は弱かった。
ハイブリダイゼーションによって調べた。前脳では、CA
Iおよび海馬の歯状回、中間手綱、そして特には網膜視
床核で高レベルのGluR4転写物か検出された。海馬は、G
luR5の弱い発現を示すのみで、中間手綱では転写物は全
く検出されなかった。GluR5ハイブリダイゼーションシ
グナルは、帯状および梨状皮質、いくつかの視床核、扁
桃、ならびに外側中隔で強かった。小脳では、GluR4お
よびR5プローブのハイブリダイゼーションパターンは重
複していたが区別された。両プローブは、プルキンエ細
胞層において高レベルで検出された。顆粒細胞層では、
GluR4プローブは強い標識を生じたが、GluR5プローブの
標識は弱かった。
実施例19 GluR6およびGluR7の単離 GluR6およびGluR7遺伝子をコードするcDNAクローン
を、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリーニングプロ
トコール（実施例２参照）およびプローブとして約1.2k
bp（ヌクレオチド705〜2048）のGluR5cDNAの放射能標識
断片を用いて、成熟ラットの前脳ライブラリーから分離
した。この選択されたクローンを、制限酵素切断地図お
よびスクリーニングによって同定した。図11は、GluR6
クローンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸
配列を示し、図12は、GluR7クローンからの断片35−T3
（図12A）およびU35（図12B）に関するそれらの配列を
示す。
を、低緊縮ハイブリダイゼーションスクリーニングプロ
トコール（実施例２参照）およびプローブとして約1.2k
bp（ヌクレオチド705〜2048）のGluR5cDNAの放射能標識
断片を用いて、成熟ラットの前脳ライブラリーから分離
した。この選択されたクローンを、制限酵素切断地図お
よびスクリーニングによって同定した。図11は、GluR6
クローンのヌクレオチド配列およびそれ由来のアミノ酸
配列を示し、図12は、GluR7クローンからの断片35−T3
（図12A）およびU35（図12B）に関するそれらの配列を
示す。
実施例20 GluR関連検出法 GluRcDNA、mRNA、タンパク質およびそれらの機能性断
片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガンドを同定し
て性質決定するために設計されたさまざまな検出法で有
用である。例えば、cDNAは、グルタメートセレプター遺
伝子群の更なるメンバーを同定するためのプローブとし
て有用である。この発明のDNAから転写されたmRNAは、
機能性受容体およびリガンドを同定して特徴を決定する
ために設計された検定法で特に有用である。この利用
は、Ｌ−グルタメート受容体機能に影響を与える化合物
の同定および設計に特に重要である。
片は、Ｌ−グルタメート受容体およびリガンドを同定し
て性質決定するために設計されたさまざまな検出法で有
用である。例えば、cDNAは、グルタメートセレプター遺
伝子群の更なるメンバーを同定するためのプローブとし
て有用である。この発明のDNAから転写されたmRNAは、
機能性受容体およびリガンドを同定して特徴を決定する
ために設計された検定法で特に有用である。この利用
は、Ｌ−グルタメート受容体機能に影響を与える化合物
の同定および設計に特に重要である。
機能性受容体を同定して特徴を決定する検出法では、
mRNAがこの発明のDNA（完全な長さのDNA、または欠失、
置換、合成などによって生じたその断片）から転写さ
れ、続いて翻訳されてGluRタンパク質を産生する。好ま
しい態様では、mRNAは卵母細胞、好ましくはアフリカツ
メガエルの卵母細胞中で翻訳される。次いで、発現され
たグルタメート受容体タンパク質を、グルタメート受容
体に機能的に結合してこれを活性化することが知られて
いるリガンドにさらす。グルタメート受容体タンパク質
の電気生理学的特徴を測定し、機能性のイオンチャンネ
ルを形成するものは機能性グルタメート受容体であると
結論される。
mRNAがこの発明のDNA（完全な長さのDNA、または欠失、
置換、合成などによって生じたその断片）から転写さ
れ、続いて翻訳されてGluRタンパク質を産生する。好ま
しい態様では、mRNAは卵母細胞、好ましくはアフリカツ
メガエルの卵母細胞中で翻訳される。次いで、発現され
たグルタメート受容体タンパク質を、グルタメート受容
体に機能的に結合してこれを活性化することが知られて
いるリガンドにさらす。グルタメート受容体タンパク質
の電気生理学的特徴を測定し、機能性のイオンチャンネ
ルを形成するものは機能性グルタメート受容体であると
結論される。
グルタメート受容体の機能性リガンドを同定するため
に設計された関連検出法では、グルタメート受容体活性
化化合物に機能的に結合することが知られているタンパ
ク質を、化合物がイオンチャンネルを形成する誘導能の
測定が求められている少なくとも１つの「未知」すなわ
ち被験化合物と接触させる。被験化合物にさらした後、
グルタメート受容体の電気生理学的性質を測定し、イオ
ンチャンネル応答をもたらし得るものは、グルタメート
受容体の機能性リガンドであると結論づけられる。
に設計された関連検出法では、グルタメート受容体活性
化化合物に機能的に結合することが知られているタンパ
ク質を、化合物がイオンチャンネルを形成する誘導能の
測定が求められている少なくとも１つの「未知」すなわ
ち被験化合物と接触させる。被験化合物にさらした後、
グルタメート受容体の電気生理学的性質を測定し、イオ
ンチャンネル応答をもたらし得るものは、グルタメート
受容体の機能性リガンドであると結論づけられる。
図面 図面の簡単な説明 以下は図面の簡単な説明である。
図面は10図ある。
図１はクローンGluR1のヌクレオチド配列及びそれか
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
図２（ａ及びｂ）は２つの配列相同性検定を含む。図
2aは、GluR1のアミノ酸残基89と106との間の細胞外領域
と他の全てのリガンド−ゲート化（ligand−gated）イ
オンチャネルに見出される「Cys−Cys−ループ」とを比
較したものであり、配列の相同性を示す。図2bは、GluR
1の推定的TMD II領域と他のリガンド−ゲート化イオン
チャネルの推定的TMD IIとを比較したもので、タンパ
ク質配列の保存を示唆する。
2aは、GluR1のアミノ酸残基89と106との間の細胞外領域
と他の全てのリガンド−ゲート化（ligand−gated）イ
オンチャネルに見出される「Cys−Cys−ループ」とを比
較したものであり、配列の相同性を示す。図2bは、GluR
1の推定的TMD II領域と他のリガンド−ゲート化イオン
チャネルの推定的TMD IIとを比較したもので、タンパ
ク質配列の保存を示唆する。
図３はクローンGluR2のヌクレオチド配列及びそれか
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
図４はクローンGluR3のヌクレオチド配列及びそれか
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
ら演繹されるアミノ酸配列を示す。
図５は、グルタメートレセプター遺伝子ファミリーの
GluR1、GluR2、GluR3、GluR4及びGluR5（GluR5−１）サ
ブユニットの演繹アミノ酸配列を並べて示す図である。
GluR1、GluR2、GluR3、GluR4及びGluR5（GluR5−１）サ
ブユニットの演繹アミノ酸配列を並べて示す図である。
図６（Ａ及びＢ）は、個々のGluR1、GluR2及びGluR3
サブユニットRNA（図6A）又はラット脳海馬（図6B）を
注射したアフリカツメガエルの卵母細胞の電流応答を比
較した２つのグラフから成る。
サブユニットRNA（図6A）又はラット脳海馬（図6B）を
注射したアフリカツメガエルの卵母細胞の電流応答を比
較した２つのグラフから成る。
図７（Ａ及びＢ）は、GluR1、GluR2及びGluR3RNAの組
合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で測定さ
れた電流応答を比較する２つのグラフから成る。
合せを注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で測定さ
れた電流応答を比較する２つのグラフから成る。
図８は、100mM KAに対する電流応答の膜電位依存性
を示す３つのグラフから成る。
を示す３つのグラフから成る。
図９はクローンGluR4のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
図10は、グルタメート受容体サブユニットGluR5−１
をコードするcDNAクローンのヌクレオチド配列及び演繹
アミノ酸配列を示す図である。
をコードするcDNAクローンのヌクレオチド配列及び演繹
アミノ酸配列を示す図である。
図11はクローンGluR6のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
図12（Ａ及びＢ）はクローンGluR7からの35−T3断片
及びU35断片のヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列
を示す図である。
及びU35断片のヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列
を示す図である。
図面の詳細な説明 図１。クローンpGluR1のヌクレオチド配列及び演繹ア
ミノ酸配列。ヌクレオチドは５′−から３′−方向に番
号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の仮定的ア
ミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチドから始ま
る。仮定的シグナルペプチド（von Heijne,Nucl.Acids
Res.14,4683（1986））の開裂は部位１で起きると予想
される。予想される５′−末端塩基よりも上流のヌクレ
オチドには負の番号が付されている。−１〜−54のヌク
レオチドは仮定的シグナルペプチド（von Heijne、上
掲）をコードし、−55〜−251塩基は５′非翻訳領域を
表わす。クローンの３′−末端に、非翻訳配列の71ヌク
レオチドが見出された。GluR1についての演繹アミノ酸
配列がヌクレオチド配列の上に示されており、その番号
付けは成熟タンパク質の第１残基から始まる。可能性の
ある細胞外Ｎ−グリコシル化部位は、アミノ酸残基の上
に米印をつけて示した。２つの矢印により示される領域
（アミノ酸89〜103）は、他の研究者によって推定され
たリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルの特徴（Gren
ingloh et al.,Nature 330,25（1987）;Barnard et a
l.,TINS 10,502（1987））とある程度類似している。
ミノ酸配列。ヌクレオチドは５′−から３′−方向に番
号が付けられ、この番号は、成熟タンパク質の仮定的ア
ミノ末端残基をコードする第１のヌクレオチドから始ま
る。仮定的シグナルペプチド（von Heijne,Nucl.Acids
Res.14,4683（1986））の開裂は部位１で起きると予想
される。予想される５′−末端塩基よりも上流のヌクレ
オチドには負の番号が付されている。−１〜−54のヌク
レオチドは仮定的シグナルペプチド（von Heijne、上
掲）をコードし、−55〜−251塩基は５′非翻訳領域を
表わす。クローンの３′−末端に、非翻訳配列の71ヌク
レオチドが見出された。GluR1についての演繹アミノ酸
配列がヌクレオチド配列の上に示されており、その番号
付けは成熟タンパク質の第１残基から始まる。可能性の
ある細胞外Ｎ−グリコシル化部位は、アミノ酸残基の上
に米印をつけて示した。２つの矢印により示される領域
（アミノ酸89〜103）は、他の研究者によって推定され
たリガンド−ゲーテッドイオンチャンネルの特徴（Gren
ingloh et al.,Nature 330,25（1987）;Barnard et a
l.,TINS 10,502（1987））とある程度類似している。
図１の方法。バクテリオファージクローンλZAP II−
GluR−K1の挿入cDNAをEco R I/Xho Iで切り出し、平滑
末端化し、ベクターM13mp19（Messing et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,74,3642（1977））のSma I部位にサブ
クローニングして、両方向のcDNAを有するクローンを作
製した。USBからのサイクロン（登録商標）を用いて、
重複する欠失したサブクローンを、それぞれのストラン
ド方向について構築した。全ての45のサブクローンにつ
いて、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーショ
ン法（Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463
（1977））により１本鎖配列決定を行い、さらに、10個
のオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブ
クローンから誘導された配列に圧縮（compression）又
はギャップがある領域の配列決定を容易にした。このよ
うにして両ストランドについて完全な配列が得られた。
Intelli−Geneticsソフトウェアパッケージ（IntelliGe
neticsバージョン5.0及びPC/Gene（登録商標）を用いて
配列を分析した。
GluR−K1の挿入cDNAをEco R I/Xho Iで切り出し、平滑
末端化し、ベクターM13mp19（Messing et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,74,3642（1977））のSma I部位にサブ
クローニングして、両方向のcDNAを有するクローンを作
製した。USBからのサイクロン（登録商標）を用いて、
重複する欠失したサブクローンを、それぞれのストラン
ド方向について構築した。全ての45のサブクローンにつ
いて、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーショ
ン法（Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463
（1977））により１本鎖配列決定を行い、さらに、10個
のオリゴヌクレオチドプライマーを合成して、欠失サブ
クローンから誘導された配列に圧縮（compression）又
はギャップがある領域の配列決定を容易にした。このよ
うにして両ストランドについて完全な配列が得られた。
Intelli−Geneticsソフトウェアパッケージ（IntelliGe
neticsバージョン5.0及びPC/Gene（登録商標）を用いて
配列を分析した。
図2a。アミノ酸残基89と106の間に位置する細胞外領
域と、他の全てのリガンド−ゲーテッドイオンチャンネ
ル中に見出せる「Cys−Cys−ループ」との比較を、配列
相同性と共に示す。nAChRサブユニットα１、β１、γ
及びδの配列は、マウス筋肉からのものであり（Heinem
ann,et al.,in:Molecular Neurobiology:Recombinant D
NA Approaches（ed.Heinemann,S.＆ Patrick,J.）45−9
6（Plenum Press,New York,1987））、nAChRサブユニッ
トα２、α３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳か
らのものである（Deneris et al.,J.Biol.Chem.264,626
8（1989）;Duvoisin et al.,Neuron 3,487（1989）。GA
BAAサブユニットα及びβはウシ脳からのものである（B
arnard et al.,Trends Neurosci.10,502（1987））。Gl
yR 48kは、ラット脳からのグリシン受容体のMr＝48kDa
のサブユニットである（Grenningloh et al.,Nature 32
8,215−220（1987））。箱で囲んだアミノ酸残基はGluR
1及び他の受容体配列の少なくとも１つにおいて同一の
場所に見出されたものである。１つのギャップが任意に
導入されている。
域と、他の全てのリガンド−ゲーテッドイオンチャンネ
ル中に見出せる「Cys−Cys−ループ」との比較を、配列
相同性と共に示す。nAChRサブユニットα１、β１、γ
及びδの配列は、マウス筋肉からのものであり（Heinem
ann,et al.,in:Molecular Neurobiology:Recombinant D
NA Approaches（ed.Heinemann,S.＆ Patrick,J.）45−9
6（Plenum Press,New York,1987））、nAChRサブユニッ
トα２、α３、α４、β２、β３及びβ４はラット脳か
らのものである（Deneris et al.,J.Biol.Chem.264,626
8（1989）;Duvoisin et al.,Neuron 3,487（1989）。GA
BAAサブユニットα及びβはウシ脳からのものである（B
arnard et al.,Trends Neurosci.10,502（1987））。Gl
yR 48kは、ラット脳からのグリシン受容体のMr＝48kDa
のサブユニットである（Grenningloh et al.,Nature 32
8,215−220（1987））。箱で囲んだアミノ酸残基はGluR
1及び他の受容体配列の少なくとも１つにおいて同一の
場所に見出されたものである。１つのギャップが任意に
導入されている。
図2b。GluR1の仮定的TMD II領域と他のリガンド−ゲ
ーテッドイオンチャンネル（Barnard et al.,Trends Ne
urosci.10,502（1987）;Deneris et al.,J.Biol.chem.2
64,6268（1989）;Duvoisin et al.,Neuron 3,487（198
9）;Grenningloh et al.,Nature 328,215（1987）;Hein
emann et al.,in:Molecular Neurobiology:Recombinant
DNA Approaches（ed.Heinemann,S.＆ Patrick,J.）45
−96（Plenum Press,New York,1987））1987）のTMD II
領域との比較を示し、タンパク質配列の保存性（不変
性）を示す。
ーテッドイオンチャンネル（Barnard et al.,Trends Ne
urosci.10,502（1987）;Deneris et al.,J.Biol.chem.2
64,6268（1989）;Duvoisin et al.,Neuron 3,487（198
9）;Grenningloh et al.,Nature 328,215（1987）;Hein
emann et al.,in:Molecular Neurobiology:Recombinant
DNA Approaches（ed.Heinemann,S.＆ Patrick,J.）45
−96（Plenum Press,New York,1987））1987）のTMD II
領域との比較を示し、タンパク質配列の保存性（不変
性）を示す。
図３。ラットグルタメート受容体サブユニットをコー
ドする、遺伝子GluR2のcDNAクローン1RB14のヌクレオチ
ド配列及び演繹アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは
５′方向から３′方向に番号が付され、この番号は、成
熟タンパク質中の仮定的アミノ末端残基に対応するコド
ン中の最初のヌクレオチドから始まる。塩基１のさらに
５′側に存在するヌクレオチドには負の番号が付けら
れ、この部分には仮定的シグナルペプチドコード領域及
び５′−非翻訳領域が含まれる。可能性のあるＮ−グリ
コシル化部位が５つ（すなわち、Asn−235、Asn−349、
Asn−385、Asn−392及びAsn−835）存在する。成熟、非
グリコシル化GluR2タンパク質の分子量の計算値は96,40
0ダルトンである。米印は翻訳終止コドンを示す。
ドする、遺伝子GluR2のcDNAクローン1RB14のヌクレオチ
ド配列及び演繹アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは
５′方向から３′方向に番号が付され、この番号は、成
熟タンパク質中の仮定的アミノ末端残基に対応するコド
ン中の最初のヌクレオチドから始まる。塩基１のさらに
５′側に存在するヌクレオチドには負の番号が付けら
れ、この部分には仮定的シグナルペプチドコード領域及
び５′−非翻訳領域が含まれる。可能性のあるＮ−グリ
コシル化部位が５つ（すなわち、Asn−235、Asn−349、
Asn−385、Asn−392及びAsn−835）存在する。成熟、非
グリコシル化GluR2タンパク質の分子量の計算値は96,40
0ダルトンである。米印は翻訳終止コドンを示す。
図４。ラットグルタメート受容体サブユニットをコー
ドする。遺伝子GluR3のcDNAクローン1RB312のヌクレオ
チド配列及び演繹アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは
５′方向から３′方向に番号が付され、この番号は、成
熟タンパク質中の仮定的アミノ末端残基に対応するコド
ン中の最初のヌクレオチドから始まる。塩基１のさらに
５′側に存在するヌクレオチドには負の番号が付けら
れ、この部分には仮定的シグナルペプチドコード領域及
び５′−非翻訳領域が含まれる。可能性のあるＮ−グリ
コシル化部位が５つ（すなわち、Asn−35、Asn−238、A
sn−352、Asn−387及びAsn−394）存在する。成熟、非
グリコシル化GluR2タンパク質の分子量の計算値は98,00
0ダルトンである。米印は翻訳終止コドンを示す。
ドする。遺伝子GluR3のcDNAクローン1RB312のヌクレオ
チド配列及び演繹アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは
５′方向から３′方向に番号が付され、この番号は、成
熟タンパク質中の仮定的アミノ末端残基に対応するコド
ン中の最初のヌクレオチドから始まる。塩基１のさらに
５′側に存在するヌクレオチドには負の番号が付けら
れ、この部分には仮定的シグナルペプチドコード領域及
び５′−非翻訳領域が含まれる。可能性のあるＮ−グリ
コシル化部位が５つ（すなわち、Asn−35、Asn−238、A
sn−352、Asn−387及びAsn−394）存在する。成熟、非
グリコシル化GluR2タンパク質の分子量の計算値は98,00
0ダルトンである。米印は翻訳終止コドンを示す。
図５。ラットグルタメート受容体サブユニットの演繹
アミノ酸配列を並べたものを示す。全ての比較した配列
において同一の残基は箱で囲んで示した。この場合、相
同性を最大にするために、スペースを導入してある。予
想されるシグナルペプチド及び４つの提唱される経膜領
域（MSR I−IV）を示してある。２つの矢印の頭（▼）
で規定されるGluR1中の領域は、他のリガンド−ゲーテ
ッドイオンチャンネルサブユニット中に見出される「Cy
s−Cys」ループ（Barnard,et al.,Trends Neurosci.10,
502（1987））に対応することが提唱される領域であ
る。破線で示した部分は、GluR5−１中に見出されるがG
luR5−２中に見出されない15アミノ酸残基の挿入を示
す。
アミノ酸配列を並べたものを示す。全ての比較した配列
において同一の残基は箱で囲んで示した。この場合、相
同性を最大にするために、スペースを導入してある。予
想されるシグナルペプチド及び４つの提唱される経膜領
域（MSR I−IV）を示してある。２つの矢印の頭（▼）
で規定されるGluR1中の領域は、他のリガンド−ゲーテ
ッドイオンチャンネルサブユニット中に見出される「Cy
s−Cys」ループ（Barnard,et al.,Trends Neurosci.10,
502（1987））に対応することが提唱される領域であ
る。破線で示した部分は、GluR5−１中に見出されるがG
luR5−２中に見出されない15アミノ酸残基の挿入を示
す。
図６。GluR1、GluR2又はGluR3を別々に注射したアフ
リカツメガエルの卵母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）
+RNAを注射したアフリカツメガエル卵母細胞中で測定さ
れた電流応答の比較を示す。（Ａ）GluR1（2ng）、GluR
2（10ng）又はGluR3RNA（2ng）を注入した後３日後に測
定した、100mM KAに対する卵母細胞の応答を示す。挿
入した図はこのような卵母細胞から得られた電圧記録の
軌跡の例を示す。なお、GluR2応答は、25ngのRNAを注射
５日後に得られたものである。（Ｂ）GluR1（2ng）若し
くはGluR3（2ng）RNA又は成熟ラット脳海馬ポリ（Ａ）+
RNA（約50ng）を注射３日後に測定された、記載したア
ゴニストに対する卵母細胞の応答を示す。全ての値は10
0mM KAについて得られた応答に正規化され、ｎ≧３の
全ての測定について平均±S.E.M.で示されている。全て
の卵母細胞は電圧が−70mVにクランプされ、記録はHolm
an et al.,Nature 342,643（1989）に記載された通りに
行った。
リカツメガエルの卵母細胞又はラット脳海馬ポリ（Ａ）
+RNAを注射したアフリカツメガエル卵母細胞中で測定さ
れた電流応答の比較を示す。（Ａ）GluR1（2ng）、GluR
2（10ng）又はGluR3RNA（2ng）を注入した後３日後に測
定した、100mM KAに対する卵母細胞の応答を示す。挿
入した図はこのような卵母細胞から得られた電圧記録の
軌跡の例を示す。なお、GluR2応答は、25ngのRNAを注射
５日後に得られたものである。（Ｂ）GluR1（2ng）若し
くはGluR3（2ng）RNA又は成熟ラット脳海馬ポリ（Ａ）+
RNA（約50ng）を注射３日後に測定された、記載したア
ゴニストに対する卵母細胞の応答を示す。全ての値は10
0mM KAについて得られた応答に正規化され、ｎ≧３の
全ての測定について平均±S.E.M.で示されている。全て
の卵母細胞は電圧が−70mVにクランプされ、記録はHolm
an et al.,Nature 342,643（1989）に記載された通りに
行った。
図７。GluR1、GluR2及びGluR3RNAの組合せを注入した
アフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答の
比較を示す。（Ａ）記載したGluRサブユニットのそれぞ
れについて、2ngのRNAを注射３日後に測定された、100m
M KAに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカラム
は、GluRサブユニットRNAを別々に発現させた卵母細胞
中で測定された応答の合計を示し、斜線を施したカラム
は個々の卵母細胞中でGluRサブユニットRNAを一緒に発
現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記載したそれぞれの
GluRサブユニットのRNA2ng又は50ngのラット脳海馬ポリ
（Ａ）+RNAを注射３日後に測定した、記載したアゴニス
トに対する卵母細胞の応答を示す。全ての値は100mM K
Aについて得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての
測定について平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母
細胞は電圧が−70mVにクランプされ、記録はHolman et
al.,Nature 341,643（1989）に記載された通りに行っ
た。
アフリカツメガエル卵母細胞中で測定された電流応答の
比較を示す。（Ａ）記載したGluRサブユニットのそれぞ
れについて、2ngのRNAを注射３日後に測定された、100m
M KAに対する卵母細胞の応答を示す。白ぬきのカラム
は、GluRサブユニットRNAを別々に発現させた卵母細胞
中で測定された応答の合計を示し、斜線を施したカラム
は個々の卵母細胞中でGluRサブユニットRNAを一緒に発
現させた後の測定値を示す。（Ｂ）記載したそれぞれの
GluRサブユニットのRNA2ng又は50ngのラット脳海馬ポリ
（Ａ）+RNAを注射３日後に測定した、記載したアゴニス
トに対する卵母細胞の応答を示す。全ての値は100mM K
Aについて得られた応答に正規化され、ｎ≧３の全ての
測定について平均±S.E.M.で示されている。全ての卵母
細胞は電圧が−70mVにクランプされ、記録はHolman et
al.,Nature 341,643（1989）に記載された通りに行っ
た。
図８。100mM KAに対する電流応答の膜電位依存性を
示す。（Ａ）ラット脳海馬ポリ（Ａ）+RNA（50ng、黒塗
り四角■）、GluR1（白ぬき四角□）又はGluR3RNA（白
ぬき丸○）；（Ｂ）GluR1＋GluR2RNA（黒塗り四角■）
又はGluR1＋GluR3RNA（白ぬき四角□）；（Ｃ）GluR2＋
GluR3RNA（黒塗り四角■）又は全ての３種のGluRサブユ
ニットRNA（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのGluR
サブユニットのRNA2ngを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−150mVから＋50mVの間で10mV刻みに変
化させ、全ての値は−70mVで測定された応答に正規化し
て示してある。
示す。（Ａ）ラット脳海馬ポリ（Ａ）+RNA（50ng、黒塗
り四角■）、GluR1（白ぬき四角□）又はGluR3RNA（白
ぬき丸○）；（Ｂ）GluR1＋GluR2RNA（黒塗り四角■）
又はGluR1＋GluR3RNA（白ぬき四角□）；（Ｃ）GluR2＋
GluR3RNA（黒塗り四角■）又は全ての３種のGluRサブユ
ニットRNA（白ぬき四角□）。記録は、それぞれのGluR
サブユニットのRNA2ngを注射３日後の卵母細胞について
行った。電圧は−150mVから＋50mVの間で10mV刻みに変
化させ、全ての値は−70mVで測定された応答に正規化し
て示してある。
図10。ラットグルタメート受容体サブユニットGluR5
−１をコードする単一のcDNAクローン（λRB20）のヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配
列がヌクレオチド配列の上に示されている。仮定的シグ
ナルペプチドの開裂がアミノ酸１の位置で起きると予想
される（von Heijne,Nucl.Acids Res.14,4683（198
6））。この開裂部位はプロリン残基の後であり、これ
は一般的なことではない。シグナルペプチドをコードす
るアミノ酸には負の番号が付されている。ヌクレオチド
は５′から３′方向に番号が付されており、この番号は
成熟タンパク質の仮定的アミノ末端残基のコドンの最初
の残基から始まっている。アミノ酸残基１よりも５′側
のヌクレオチドは負の番号で示されている。オープンリ
ーディングフレーム（ORF）に隣接する停止コドンは「E
ND」で示され、ポリアデニル化シグナルには下線が付さ
れている。可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米
印（＊）によって示されている。２つの矢印の頭（▼）
は、λRB20中には見出されるが、単離した29のcDNAクロ
ーン中12のものにはみられない、ヌクレオチド1113と11
59の間の45のヌクレオチド挿入を規定する。
−１をコードする単一のcDNAクローン（λRB20）のヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列を示す。演繹アミノ酸配
列がヌクレオチド配列の上に示されている。仮定的シグ
ナルペプチドの開裂がアミノ酸１の位置で起きると予想
される（von Heijne,Nucl.Acids Res.14,4683（198
6））。この開裂部位はプロリン残基の後であり、これ
は一般的なことではない。シグナルペプチドをコードす
るアミノ酸には負の番号が付されている。ヌクレオチド
は５′から３′方向に番号が付されており、この番号は
成熟タンパク質の仮定的アミノ末端残基のコドンの最初
の残基から始まっている。アミノ酸残基１よりも５′側
のヌクレオチドは負の番号で示されている。オープンリ
ーディングフレーム（ORF）に隣接する停止コドンは「E
ND」で示され、ポリアデニル化シグナルには下線が付さ
れている。可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は米
印（＊）によって示されている。２つの矢印の頭（▼）
は、λRB20中には見出されるが、単離した29のcDNAクロ
ーン中12のものにはみられない、ヌクレオチド1113と11
59の間の45のヌクレオチド挿入を規定する。
卵母細胞は、GluR1のインビトロセンスRNA1.25ngを記
録の３日前に注射されていた。卵母細胞は、−70mVに電
圧が保持され、被検化合物（カイネート（30μＭ）を除
く全ての化合物は1mM）は迅速なスーパーフュージョン
により５分間隔で投与された。ピーク電流を測定し、そ
れぞれの数字は３つの異なる卵母細胞からの３つの記録
の平均±SEMで示した。100％の電流応答は、卵母細胞に
依存して40〜200nAに対応する。
録の３日前に注射されていた。卵母細胞は、−70mVに電
圧が保持され、被検化合物（カイネート（30μＭ）を除
く全ての化合物は1mM）は迅速なスーパーフュージョン
により５分間隔で投与された。ピーク電流を測定し、そ
れぞれの数字は３つの異なる卵母細胞からの３つの記録
の平均±SEMで示した。100％の電流応答は、卵母細胞に
依存して40〜200nAに対応する。
明細書要約 上述の記載から、当業者は、本発明がグルタメート受
容体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に
純粋なDNA領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（NMDA）、AMPA又はキスカレート、カイネート
（KA）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレート（AP
B）を包含するグルタメート受容体に特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又はその機能
性断片である。本発明の新規なグルタメート受容体は、
cDNAクローンGluR1、GluR2、GluR3、GluR4及びGluR5並
びにGluR6及びGluR7並びにこれらの機能性組合せによっ
てコードされるタンパク質並びにこれらによってコード
される機能性ペプチド断片により例示される。本発明の
グルタメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、
薬剤スクリーニングに有用である。さらに、GluR1〜Glu
R7のcDNAは、当業者によって、過度の実験を要すること
なく、他の新規なグルタメート受容体を同定し単離する
ためにプローブとして用いることができる。このような
他の新規なグルタメート受容体は、本発明の範囲内に明
示的に包含される。
容体サブユニットタンパク質の群をコードする実質的に
純粋なDNA領域を開示していることを理解できる。本発
明のグルタメート受容体は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパル
テート（NMDA）、AMPA又はキスカレート、カイネート
（KA）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレート（AP
B）を包含するグルタメート受容体に特徴的な電気生理
学的及び薬理学的性質を有するタンパク質又はその機能
性断片である。本発明の新規なグルタメート受容体は、
cDNAクローンGluR1、GluR2、GluR3、GluR4及びGluR5並
びにGluR6及びGluR7並びにこれらの機能性組合せによっ
てコードされるタンパク質並びにこれらによってコード
される機能性ペプチド断片により例示される。本発明の
グルタメート受容体遺伝子及びタンパク質の両方とも、
薬剤スクリーニングに有用である。さらに、GluR1〜Glu
R7のcDNAは、当業者によって、過度の実験を要すること
なく、他の新規なグルタメート受容体を同定し単離する
ためにプローブとして用いることができる。このような
他の新規なグルタメート受容体は、本発明の範囲内に明
示的に包含される。
本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者
は本発明に種々の変更及び修飾を加えて種々の用途及び
条件に適合させることができる。従って、このような変
更及び修飾は、適切に、誠実に、以下の請求範囲の均等
範囲に属するものであることを意図する。
は本発明に種々の変更及び修飾を加えて種々の用途及び
条件に適合させることができる。従って、このような変
更及び修飾は、適切に、誠実に、以下の請求範囲の均等
範囲に属するものであることを意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８３７５ (72)発明者 バルター ジェイムス リチャード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 サンディエゴ、カミニト デル カント 12996 (72)発明者 ホールマン マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 デル マー、ハーフ ムーン ベイ ドライブ 14175 (72)発明者 ベトラー バーンハード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ ＃151、アヴェニ ダ ナヴィダッド 7196 (72)発明者 ジェンセン ジャン エジビーグ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ ＃303、レジェン ツ ロード 8126 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249（1990. Ａｕｇ．）ｐ．556−560 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249（1990. Ｓｅｐ．）ｐ．1580−1585 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249（1990. Ａｕｇ．）ｐ．1033−1037 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．342（1989) ｐ．643−648 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/705 ZNA C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (22)
- 【請求項１】配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸
配列を有するか又は該アミノ酸配列のうち１又は数個の
アミノ酸が置換し、欠失し若しくは該アミノ酸配列に１
又は数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有し、
グルタメート受容体サブユニットとして機能するタンパ
ク質。 - 【請求項２】配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸
配列を有する請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸
配列を有するか又は該アミノ酸配列のうち１又は数個の
アミノ酸が置換し、欠失し若しくは該アミノ酸配列に１
又は数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有し、
グルタメート受容体サブユニットとして機能するタンパ
ク質。 - 【請求項４】配列表の配列番号４に記載されたアミノ酸
配列を有する請求項３記載のタンパク質。 - 【請求項５】配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸
配列を有するか又は該アミノ酸配列のうち１又は数個の
アミノ酸が置換し、欠失し若しくは該アミノ酸配列に１
又は数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有し、
グルタメート受容体サブユニットとして機能するタンパ
ク質。 - 【請求項６】配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸
配列を有する請求項５記載のタンパク質。 - 【請求項７】請求項１ないし６のいずれかに記載のタン
パク質を複数含み、グルタメート受容体として機能す
る、前記タンパク質の組合せ体。 - 【請求項８】Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（NMD
A）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソ
キサゾール−４−プロピオン酸（AMPA）、カイネート
（KA）及び２−アミノ−４−ホスホノブチレート（AP
B）からなる群より選ばれた化合物と結合することによ
り神経シグナルを生じる請求項７記載のタンパク質の組
合せ体。 - 【請求項９】請求項１ないし６のいずれか１項に記載の
タンパク質をコードするDNA。 - 【請求項１０】配列表の配列番号１に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列を有す
るDNAと高緊縮条件下においてハイブリダイズするDNAで
あってグルタメート受容体サブユニットとして機能する
タンパク質をコードするDNA。 - 【請求項１１】配列表の配列番号１に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有する請求項10記載のDNA。 - 【請求項１２】配列表の配列番号３に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列を有す
るDNAと高緊縮条件下においてハイブリダイズするDNAで
あってグルタメート受容体サブユニットとして機能する
タンパク質をコードするDNA。 - 【請求項１３】配列表の配列番号３に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有する請求項12記載のDNA。 - 【請求項１４】配列表の配列番号５に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有するか又は該塩基配列を有す
るDNAと高緊縮条件下においてハイブリダイズするDNAで
あってグルタメート受容体サブユニットとして機能する
タンパク質をコードするDNA。 - 【請求項１５】配列表の配列番号５に記載された配列の
コード領域の塩基配列を有する請求項14記載のDNA。 - 【請求項１６】請求項９ないし15のいずれか１項に記載
されたDNA又はその断片であって少なくとも20塩基対の
長さを有するDNAを含むDNAプローブ。 - 【請求項１７】前記タンパク質のカルボキシル末端コー
ド領域を起点とする請求項16記載のDNAプローブ。 - 【請求項１８】前記タンパク質のイオンチャンネルコー
ド領域を起点とする請求項16記載のDNAプローブ。 - 【請求項１９】前記９ないし15のいずれか１項に記載の
DNAから転写されたセンス又はアンチセンスmRNA。 - 【請求項２０】請求項19記載のセンス又はアンチセンス
mRNAを発現する卵母細胞。 - 【請求項２１】被検DNAと請求項16ないし18のいずれか
１項に記載のプローブDNAとを高緊縮ハイブリダイゼー
ション条件下で接触させ、前記プローブとハイブリダイ
ズした被検DNAを、グルタメート受容体タンパク質をコ
ードするDNAと相同であると同定することを含む、グル
タメート受容体タンパク質をコードするDNAと相同なDNA
を被検試料中で同定する方法。 - 【請求項２２】請求項７又は８に記載のタンパク質の組
合せ体を被検物質と接触させ、イオンチャンネル活性を
モニターし、イオンチャンネル応答を行う物質を機能性
リガンドであると同定することを含む、被検物質がグル
タメート受容体タンパク質のための機能性リガンドであ
るか否かを決定する方法。
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