JP4175846B2 - Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットの発現による脳腫瘍細胞の増殖と浸潤の抑制 - Google Patents
Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットの発現による脳腫瘍細胞の増殖と浸潤の抑制 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明の課題は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、Ca2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、及び動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
グルタミン酸は、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、グルタミン酸の受容体であるグルタミン酸受容体は中枢神経における興奮性シナプス伝達の中心的役割を担っている。更に、グルタミン酸受容体は、記憶、学習の細胞レベルにおける基盤と考えられているシナプス可塑性や、発達期のシナプス可塑性すなわち経験依存的な神経回路網の形成に関与していることが知られている。また、虚血など病的条件下における神経細胞死にも関与していることが示唆されている。
【0003】
グルタミン酸受容体はその構造とシグナル伝達機構から、イオンチャンネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチャンネル型グルタミン酸受容体と、Gタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝型グルタミン酸受容体とに大別される。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体は、グルタミン酸の結合により自身の陽イオンチャンネルを開口する受容体−イオンチャンネル複合体であり、高等動物の中枢神経系(CNS)における速い興奮性シナプス伝達を担っている。
【0004】
イオンチャンネル型受容体は、特異的アゴニストやアンタゴニストに対する反応性と内蔵するイオンチャンネルの電気生理学的特性により、N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA:N-methyl-D-aspartic acid)に感受性のNMDA受容体と非感受性の非NMDA受容体に大別される。アゴニストが結合するとNa+、K+に加えてCa2+ を通過させる。非NMDA受容体は、カイニン酸、AMPA(α−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソオキサゾールプロピオン酸:α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)に対する感受性の差により、カイニン酸受容体、AMPA受容体のサブタイプに分類され、アゴニストが結合するとNa+、K+を通過させる。
【0005】
AMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)は、中枢神経系(CNS)中のほとんどすべての興奮性シナプスにおける迅速な神経伝達を仲介している(Trends Neurosci., 16, 359-365, 1993;Annu. Rev. Neurosci., 17, 31-108, 1994、Prog. Neurobiol., 54, 581-618, 1998)。従来、該受容体は神経細胞にのみ存在すると考えられてきたが、最近、大半のグリア細胞(glial cell)中でも発現していることが明らかとなった(Trends Pharmacol. Sci., 21, 252-258, 2000)。
AMPA受容体(AMPAR)は、GluR1〜GluR4という4つのタンパク質から選択されるサブユニットから構成されていることが知られている。そして、AMPARのCa2+透過性は、そのサブユニットの組成によって決まる。
【0006】
GluR2サブユニットをもつ受容体は、Ca2+に対してほとんど透過性を示さないが、GluR2をもたない受容体は、高いCa2+透過性を示す。GluR2サブユニットが豊富に存在すると、Ca2+透過性が低下する(Trends Neurosci., 16, 359-365, 1993;Annu. Rev. Neurosci., 17, 31-108, 1994;Prog. Neurobiol., 54, 581-618, 1998)。このGluR2の固有の性質は、第2番目の疎水性領域(M2)にある1つのアミノ酸残基に起因する。このアミノ酸残基は、GluR2中ではアルギニン(R)であるが、他のサブユニットの相当する部位はグルタミン(Q)が占めている。この重要な部位(Q/R部位)のアルギニンがグルタミンに置換されると、変異したGluR2(Q)から集まった相同的な受容体は高いCa2+透過性を示す。
【0007】
生体中において、AMPA受容体(AMPAR)のサブユニットのうち、GluR2の疎水性領域(M2)にある1つのアミノ酸残基がアルギニン(R)となるメカニズムは、遺伝子の転写後に起こる「RNA編集(RNA editing)」という現象で知られている。すなわち、遺伝子(DNA)がmRNAに転写された後に1塩基が置換され、その結果、タンパク質レベルでも1アミノ酸残基の置換が生じる。遺伝子では、グルタミン酸(Q)がコードされているのに対して、実際にはアルギニン(R)に置き換っているという特異な現象である。しかしながら、この変換によって、Ca2+透過性が低下する。
【0008】
上記のように、グルタミン酸受容体は神経伝達物質受容体として機能しているので、これまでは主に精神的疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)や、記憶・学習の分野を中心に盛んに研究されてきており、種々の知見や、治療薬等の開発が行われてきた。それらの研究・開発の成果として、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中又はてんかんなどの神経変性疾患に関与する遺伝子を同定するための方法、及び神経変性疾患を有する動物を治療するための治療薬などの開発が行われてきた。
【0009】
一方で、脳腫瘍として、神経膠芽腫(glioblastoma)、乏突起膠腫(oligodendroglioma)髄膜腫(meningioma)などが良く知られている。特に、神経膠芽腫(glioblastoma)は、中枢神経系(CNS)で最もよく見受けられ、かつ最も悪性の腫瘍である。この種の腫瘍は、遊走性及び浸潤性が高いことで知られている(Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous Systems, 29-39, 2000(IARC press, Lyon, France))。遊走細胞は、密集した有髄の経路に沿って優先的な動きを示し、CNS中に広範囲に広がっていくため(Neurol. Med. Chir., 34, 91-94, 1994、Neurol. Med. Chir., 33, 425-428, 1993、Neuropathology, 17, 186-188, 1997)、外科的な処置を施しても好結果が得られていない。
【0010】
また、悪性神経膠腫(glioma)の二大特徴である細胞の増殖及び遊走は、神経膠腫の起源となる細胞の神経前駆細胞にも認められる(Glial Cell Development, 209-220, 1996(BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK.)、Glia, 15, 222-230, 1995)。神経膠腫細胞は、神経伝達物質、ホルモン、及び成長因子(Trends Pharmacol. Sci., 21, 252-258, 2000)などの各種外部刺激に反応するため、神経膠芽腫の悪性の特徴は表面受容体の活性化を通じて、少なくとも部分的に制御することができる。
近年、グルタミン酸受容体が、神経前駆細胞だけではなく神経膠腫においても発現することが報告されている(J. Neurosci., 17, 227-240, 1997、Glia, 10, 149-153, 1994、J. Neurosci., 16, 519-530, 1996、Eur. J. Neurosci., 10, 2153-2162, 1998、J. Neurosci. Res., 46, 164-178, 1996)。しかし、その病理生理学的重要性は、大部分が不明のままである。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、Ca2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法を提供すること、更には動物の発症する脳腫瘍細胞において、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、確立した脳細胞の培養系を用い、カルシウム透過型AMPA受容体のグリア細胞における役割について解析する中で、強いカルシウム透過性を有するGluR2(Q)遺伝子を強制発現させると細胞の突起形成が促進され、逆にカルシウム非透過性を有するGluR2(GluR2(R))遺伝子を導入すると、突起の退縮と細胞の扁平化が生じることを見い出し、報告した(NeuroReport 12(2001),745-748)。
【0013】
そして、本発明者は、AMPAR(AMPA受容体)がヒト神経膠腫細胞で発現しており、更にGluR2(Q)遺伝子を強制発現させた紡錘形細胞は、培養フラスコ内で重層しながら遊走するグリオーマ細胞や、摘出標本でしばしば認められる白質髄鞘線維内を走行する腫瘍細胞と形態学的に良く似ていることから、カルシウム透過型AMPARが腫瘍細胞の浸潤性に関与しているのではないかと推測し、更に、解析を進めた結果、(1)GluR1及び/又はGluR4サブユニットが、ヒト神経膠芽腫細胞のいたるところで発現しており、Ca2+透過性AMPARとして作用していること、(2)該神経膠芽腫細胞に、GluR2(GluR2(R))遺伝子を導入し、こうした内在性Ca2+透過性AMPARを、Ca2+非透過性AMPARに変換すると、腫瘍細胞中で遊走が阻害され、アポトーシスが、誘導されること、及び(3)これに対して、Ca2+透過性AMPARが過剰発現すると、腫瘍細胞の増殖だけでなく遊走行動も増大すること、を見い出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
すなわち、本発明においては、動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御するには、脳腫瘍細胞に、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子を導入することにより、行うことができる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供する。
【0015】
すなわち本発明は、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2のcDNA遺伝子を組込んだ発現ベクターからなり、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入し、該GluR2の遺伝子を発現することによりCa2+透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制するために用いる脳腫瘍治療用医薬組成物(請求項1)や、発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項1記載の脳腫瘍治療用医薬組成物(請求項2)からなる。
【0016】
また本発明は、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2のcDNA遺伝子を組込んだ発現ベクターをセットし、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入し、該GluR2の遺伝子を発現することによりCa 2+ 透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制するために用いる脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット(請求項3)からなる。
【0017】
さらに本発明は、発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項3記載の脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット(請求項4)からなる。
【0018】
【発明の実施の形態】
本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、発現するグルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。動物の発症する脳腫瘍細胞としては、神経膠芽腫(glioblastoma)、乏突起膠腫(oligodendroglioma)髄膜腫(meningioma)などが挙げられる。グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性の制御には、動物の発症する脳腫瘍細胞に、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことができる。該AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子としては、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2のcDNAを用いることができるが、該遺伝子は既に公知のものであり(Science 249, 1580-1585, 1990)、該遺伝子の塩基配列は、GenBankデーターベースにより、アクセッション・ナンバー:M38061として検索することができる。
【0019】
本発明において、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子を、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入するには、適宜の公知の遺伝子導入手段を用いることができる。その導入手段の好ましい方法としては、アデノウイルス発現用ベクターを用いることができる。そのようなアデノウイルス発現用ベクターとしては、一過性発現に用いられているアデノウイルスベクター(Science, 259, 988-990, 1993)が挙げられる。アデノウイルスベクターは、中枢神経系(CNS)のグリア細胞に対して、極めて高い親和性を持ち、小脳皮質に注入した場合は、選択的にベルクマングリアにGluR2の遺伝子を発現させることが可能である。また、アデノウイルスベクターに、Cre/loxP発現制御システムを使用した遺伝子導入ベクター(Nucl. Acids Res., 23, 3816-3821, 1995)を用いることもできる。Cre/loxPシステムを用いる理由の一つに、AxCALNLGluR2のみの感染では、Creが存在しないためGluR2が発現しない状態をつくり出せることを利用して、それをウイルス感染による影響を除外するためのコントロールとして使用できるというメリットがある。
【0020】
本発明においては、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子を、アデノウイルスベクターのような遺伝子発現用ベクターに組み込んで、脳腫瘍治療用遺伝子導入キットとして用意し、これを脳腫瘍の治療に用いることができる。
【0021】
本発明の他の実施の態様として、本発明の方法により、動物の発症する脳腫瘍細胞におけるグルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することにより脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することが可能である。中枢神経系(CNS)における神経膠芽腫のような脳腫瘍においてはGluR1〜4の4つのタンパク質からなるサブユニットが発現しており、その発現しているサブユニットの組成によって、細胞のCa2+透過性及び非透過性が決定される。そして、この細胞のCa2+透過性及び非透過性によって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性が相違してくる。サブユニットGluR1やGluR4が発現していると、細胞はCa2+透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤が促進され、サブユニットGluR2が発現すると、細胞はCa2+非透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤が抑制される。
【0022】
したがって、脳腫瘍細胞に発現するグルタミン酸受容体サブユニットを検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することができる。グルタミン酸受容体サブユニットの検出・測定には、適宜公知の検出・測定手段を用いることができる。サブユニットの遺伝子の測定には、それぞれのサブユニットの遺伝子の検出のためのプローブを用いることができる。また、サブユニットの発現の検出・測定には、それぞれのサブユニットに特異的に結合する抗体を作製し、用いるのが好ましい。グルタミン酸受容体サブユニットに特異的に結合する抗体としては、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体のいずれもが使用することができ、該抗体は常法により調製することができる。
【0023】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[グルタミン酸受容体サブユニットの発現、サブユニットGluR2の導入及び腫瘍細胞の増殖と浸潤]
【0024】
(神経膠芽腫の外科的試料及び細胞培養物におけるGluRの発現)
本発明者は、外科的試料のin situハイブリダイゼーション研究におけるAMPARサブユニットGluR1の発現について調べた(図1;参考写真1を参照)。図1aは、神経膠芽腫の外科的試料の代表的な組織構造を示しており、浸潤性の腫瘍細胞が認められる。GluR1のアンチセンスリボプローブでハイブリダイズしたシグナルを、遊走し増殖している未分化細胞中で検出した(図1b)。連続切片では、アフィニティー精製したGluR1抗体で免疫染色したGluR1タンパク質の発現が、腫瘍細胞中で検出された(図1c)。
【0025】
さらに本発明者らは、GluR1、GluR2、GluR2/3、及びGluR4に対する抗体を選択して免疫組織化学的染色を行うことにより、パラフィン包埋した神経膠芽腫の外科的試料(n=16)中のAMPARサブユニットの発現について調べた(表1)。調べた外科的試料(n=16)のすべてに、GluR1タンパク質の発現が認められた。これらの試料では、腫瘍細胞の大半(52±21%、n=16)に、GluR1タンパク質が発現していた。16個の神経膠芽腫の外科的試料のうち14個で、少数の細胞(21±7%、n=14)にGluR2の発現が観察された。抗GluR2/3抗体による染色を16個の外科的試料のうち14個(31±5%、n=14)で観察した。すべての外科的試料(55±7%、n=16)で、腫瘍細胞はGluR4にも陽性を示していた。
【0026】
図1dからgは、GluR1、GluR2、及びGluR4に対する抗体で処理した外科的試料原本の連続切片の一例を示す。これらの切片では、遊走する神経膠芽腫細胞が大脳皮質の軟膜下に広範囲に蓄積していた。これらの細胞はGluR1とGluR4の両方を発現していたが、GluR2の発現はごくわずかなものだった(図1d、e、f及びg)。隣接する脳組織(図1h、i、j及びk)では、浸潤性の未分化腫瘍細胞がGluR1とGluR4を発現していた(図1i及びk)のに対し、正常なニューロンはGluR2を大量に発現していた(図1j)。白質に浸潤していた紡錘状の腫瘍細胞は、未成熟の星状細胞のマーカーであるビメンチンとGluR1を発現していたが、GluR2の発現はごくわずかなものだった。
【0027】
本発明者は、外科的試料から神経膠芽腫細胞の一次培養細胞を調製し、AMPARサブユニットの発現について調べた(表1)。これらの培養細胞では、大半の細胞がGFAP免疫応答性を示していた。このことから、それらがグリア細胞に由来するものであり、ニューロンのマーカーであるニューロフィラメントタンパク質(NFP)(Nature, 298, 277-279, 1982、Acta Neuropathol., 64, 30-36, 1984)、及び小グリア細胞のマーカーであるKi−M1P(Pathol. Int., 46, 15-23, 1996)それぞれに対する免疫応答性の欠如からわかるとおり、ニューロンや小グリア細胞によって汚染されていないことがわかる。
【0028】
GluR1及びGluR4に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、大半の培養細胞は、両方のタンパク質を同時に発現していた(図1l、m、及びn)。しかし、GluR1及びGluR2又はGluR4及びGluR2に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、ほんの少数のGluR1発現細胞又はGluR4発現細胞が、GluR2免疫応答性を示すにとどまっていた(図1o、p、及びq)。
本発明者らは外科的試料から4つの神経膠芽腫細胞株を確立した。そのうち3つは、GluR1とGluR4、GluR1とGluR3、GluR3とGluR4をそれぞれ発現していた。1つの細胞株は、AMPARサブユニットを全く発現していなかった。市販のヒト神経膠芽腫細胞株であるU87 MGについても、AMPARサブユニットの発現を調べてみた。この細胞株ではGluR1とGluR3の発現が強く、GluR2の発現は弱かった(表1)。
【0029】
神経膠芽腫細胞でのGluR1〜4サブユニットの発現を確認するため、本発明者らは次に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)研究を行った(Neuron, 12, 383-388, 1994)。3つの外科的試料、4つの一次培養細胞、及び5つの細胞株について、逆転写を行い、ついでGluR1〜4に特異的なプライマーを用いて、PCR増幅を行った。各GluR1〜4断片に特異的な酵素を用いた制限酵素分析で、増幅産物を調べた(Neuron, 12, 383-388, 1994)。図1rは、腫瘍細胞の一次培養で得られた代表的な結果を示す。この事例では、すべてのGluR1〜4 mRNAの発現が検出されている。コントロールである腫瘍に隣接した脳組織でも、GluR1〜4 mRNAの発現が検出された(図1s)。GluR1〜4 mRNAの発現に関しては、RT−PCRで得た結果は、免疫組織化学法により得た結果と完全に一致している(表1)。
【0030】
【表1】
【0031】
これらの結果から、AMPARサブユニットがヒト神経膠芽腫細胞で発現すること、及び、GluR1とGluR4サブユニットがGluR2サブユニットよりも大量に、しかも安定的に発現していることがわかる。これらの結果は、GluR2を除外して集められたCa2+透過性AMPARがこれらの細胞中で形成することを強く示唆している。
【0032】
(神経膠芽腫細胞におけるCa2+透過性AMPARの機能的発現)
一次培養物中の神経膠芽腫細胞におけるCa2+透過性AMPARの機能的発現を調べるためfura−2AMを使用してAMPAが誘導する細胞内[Ca2+]i(Ca2+濃度)の変化を測定した(図2;参考写真2を参照)。AMPARの脱感作を弱める、200μMのAMPAと100μMのサイクロサイアザイド(CTZ)の投与により、培養細胞の[Ca2+]iが増大した(図2a、b及びc)。80±21から285±120nM(n=150)への[Ca2+]iの増大は、16個の個別培養皿の細胞中、65±15%の細胞で検出された。[Ca2+]iの急増は、移植片の周縁部に位置する長い突起を持つ細胞において時折認められた(図2d、e及びf)。
【0033】
[Ca2+]iの増大は、AMPAのアンタゴニスト、20μMの2,3−ジヒドロキシ−6−ニトロ−7−スルファモイル−ベンゾ(F)−キノキサリン(NBQX)又は10μMの[2,3−ジオキソ−7−(1H−イミダゾール−1−イル)−6−ニトロ−1,2,3,4−テトラヒドロキノキサリン−1−イル]酢酸一水和物(YM872)のいずれかにより、選択的に消滅した(J. Pharm. Pharmacol., 50, 795-801, 1998)。これら培養細胞において、100mMのK+が[Ca2+]iを増大させることはなかった。このことは、電位依存性Ca2+チャネルがこの[Ca2+]iの増大に関与していないことを示している。ビメンチンとGluR1の発現は、[Ca2+]i測定用に使われた一次培養細胞において、ともに検出された(図2g、h及びi)。
【0034】
(アデノウィルスが仲介するAMPARサブユニットの発現の作用)
神経膠芽腫細胞におけるCa2+透過性AMPARの病態生理学的意義を明らかにするため、本発明者は、まず、アデノウィルスを介したGluR2 cDNAの導入によってCa2+透過性AMPARをCa2+非透過性受容体に変換することを試みた(Science, 292, 926-929, 2001、NeuroReport, 12, 745-748, 2001)。以下の実験を、主に確立した神経膠芽腫細胞株で行った(図3;参考写真3を参照)。かかる細胞株はCGNH−89と称し、GluR1及び/又はGluR4サブユニットからなるCa2+透過性AMPARを保有していた。
【0035】
GluR2 cDNAを培養細胞に導入するため、本発明者は2つの組換えアデノウィルスを作製した。一方はCreリコンビナーゼ発現用の組換えアデノウイルス(AxCANCre)であり、他方はCAGプロモーター、一対のloxP配列、スタッファー遺伝子及びGluR2 cDNAからなり、CreによりGluR2の発現を制御するための切替装置を有するGluR2発現用組換えアデノウイルス(AxCALNLGluR2)である。また、アデノウィルス感染細胞のマーカーとして使用されるグリーン蛍光タンパク質(GFP)cDNAを有する組換えアデノウィルス(AxCAGFP)も作製した。図3aでは、GluR1タンパク質を発現する培養細胞(図3b)がAxCAGFPに感染していた。GluR1を発現する細胞の大半で、感染の2日後にGFPの蛍光が検出された(図3c)。また、細胞をAxCANCre、AxCALNLGluR2、AxCAGFPの3種類の組換えアデノウイルスで感染させると、GFPの蛍光を発するほとんどすべての細胞で、感染2日後にGluR2タンパク質が検出された(図3d、e及びf)。
【0036】
この結果、本発明者らはGluR2を発現する細胞の形態が著しく変化することに気付いた(図3d、e及びf)。細胞体は徐々に膨化し、扁平になり、細胞質の突起はウィルス感染後4日以内に退縮した。こうした特徴的な変化は、GluR2の発現が誘導されることのないAxCALNLGluR2及び/又はAxCAGFPを細胞に感染させた場合には決して見られないものであった。細胞体表面積の平均値は、AxCALNLGluR2及び/又はAxCAGFPを感染させたコントロール細胞では360±133μm2(n=30)だったのに対し、GluR2を発現する細胞では1230±350μm2(n=30)に増えていた(P<0.05)。
【0037】
また、本発明者らはGluR2(R)発現細胞の細胞骨格が崩壊していること(図3gのコントロール細胞に対する図3hのGluR2(R)発現細胞)、及び、核における泡状突起の出現やアポト−シス小体の形成といった、細胞がアポトーシスの徴候を示していることに気がついた(図3i)。こうした特徴的な変化は、GluR1又はGluR2(Q)cDNAのいずれかが導入され、Ca2+透過性AMPARが過剰発現した場合には、決して起こらないものであった。そのかわり、これらは、長い突起を有していることの多い、膨化した紡錘状細胞が高密度に増殖しているという、Ca2+透過性AMPARを過剰発現する細胞培養物に共通の特色に、本発明者らは着目した(図3j、k及びl)。
【0038】
アデノウィルスを介したGluR2(R)及びGluR2(Q)の発現が誘導した、CGNH−89細胞における上記の変化は、U87 MG細胞でも見られた。GluR2(R)遺伝子が導入されると、U87 MG細胞の細胞体が膨化し、扁平になった。これに対し、GluR2(Q)遺伝子が導入された場合は、長い突起を有する紡錘状細胞の数が増大した(図3m、n及びo)。
図3p〜xにおいて、本発明者らは、アデノウィルスを介したGluR2(R)又はGluR2(Q)の導入が誘導した、CGNH−89細胞におけるCa2+透過性の変化を確認した。200μMのAMPAと100μMのCTZの投与により、10個の培養皿中の52±14%のコントロール細胞で、[Ca2+]iが97±21から275±50nM(n=350)に増大した(図3p、q及びr)。これと同じ処理を行っても、4個の培養皿中のGluR2発現細胞(図3s、t及びu)では[Ca2+]iに何の作用も及ぼさなかったが、2個の培養皿中のGluR2(Q)発現細胞(図3v、w及びx)では[Ca2+]iが77±21から1185±240nM(n=40)に著しく増大した。
【0039】
本発明者らは、GluR2(R)を発現するCGNH−89細胞が、グリア細胞中でCa2+シグナル伝達を仲介することがわかっているATPに応答して、[Ca2+]iをコントロール細胞と同程度にまで増大させらるかどうかについても調べた(J. Neurosci., 18, 8794-8804, 1998)。25μMのATPの投与により、5個の培養皿中のGluR2(R)発現細胞では[Ca2+]iが70±24から1438±174nM(n=50)に増大した。この増大はコントロール細胞で検出されたものとよく似ていた。コントロール細胞では、同じ処理で[Ca2+]iが77±28から1574±161nM(n=50)に増大した。このことは、GluR2(R)遺伝子が導入された細胞が外部刺激に応答可能であることを示している。
【0040】
次に本発明者らは、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)仲介dUTPニック末端ラベリング(TUNEL)法(Science, 267, 1445-1449, 1995)を用いて、GluR2(R)を発現するCGNH−89細胞におけるアポトーシス指数を推定し、この値をAxCALNLGluR2(コントロール)だけを感染させた細胞における値と比較した。アポトーシス指数は、TUNEL陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジウム(PI)陽性核の合計数で割ったもの、と定義された。各培養皿の平均値を得るため、任意に選択した10から15の視野をサンプルにした。この指数は、GluR2(R)発現細胞(n=4)では20.2±4.3%であり、コントロール(5.2±1.2%、n=4、P<0.05)よりもかなり大きいものだった。
【0041】
本発明者らは、Ki−67染色指数(Ki−67陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジウム(PI)陽性核の合計数で割ったもの)を計算することで、GluR2(R)発現細胞の増殖活性についても調べてみた(Lab. Invest., 70, 125-129, 1994)。この指数は、コントロールでは12.3±2.3%で、GluR2発現細胞(R)では<0.1%(n=4、P<0.001)であった。これに対し、Ca2+透過性AMPARを過剰発現させるためのGluR2(Q)cDNAを導入したもの(NeuroReport, 12, 745-748, 2001)は、Ki−67染色指数を28.3±4.8%(n=4、P<0.01)に有意に増大させた。しかし、アポトーシス指数には、有意な変化が検出されなかった(4.3±1.3%)。Ca2+透過性AMPARを過剰発現させるための、アデノウィルスを介したGluR1遺伝子の移動によりGluR1が過剰発現した際、アポトーシス指数とKi−67染色指数はそれぞれ5.3±2.3%と26.3±4.5%だった。GluR2(Q)を発現する細胞と、GluR1を過剰発現する細胞の間には、これら2つの指数に有意な変化はなかった。
【0042】
上記結果から、Ca2+透過性AMPARを介したCa2+の流入遮断によって神経膠芽腫細胞中にアポトーシスの変化が起こることが強く示唆される。そのため本発明者は、CGNH−89細胞における細胞の形態、アポトーシス指数及びKi−67染色指数に対するAMPARアンタゴニストの作用を調べてみた。20μMのNBQX又は10μMのYM872を2日間用いると、細胞の形態に変化が生じた。つまり、細胞質の突起が退縮し、細胞体が膨化し扁平になり、これはその後のGluR2発現で見られたものと似ていた。さらに、NBQX及びYM872は、3.0±1.8%から13.0±2.0%(n=4、P<0.01)、及び3.8±2.3%から18.0±2.5%(n=4、P<0.01)へと、アポトーシス指数をそれぞれ有意に増大させた。それらは、18.5±3.0%から2.0±1.0%(n=4、P<0.01)、及び16.4±3.5%から<0.1%(n=4、P<0.01)へと、Ki−67染色指数をそれぞれ著しく低下させた。
【0043】
Ca2+透過性AMPARを発現する他の3つの細胞株(表1のCGNH−NM、MRCH−92及びU87 MG)では、GluR2(R)発現及び、NBQX又はYM872の使用によって、培養細胞における同様の形態的変化が生じ、アポトーシス指数が増大し、Ki−67染色指数が減少した。GluR2(R)遺伝子を導入した細胞に、こうしたAMPARアンタゴニストを用いると、実験した4つの細胞株すべてにおいて、細胞の形態とこれら2つの指数にそれ以上の変化が生じることはなかった。これは、ウィルスを介したGluR2(R)の発現とAMPARアンタゴニストが同一の標的に作用することを示している。
【0044】
(Ca2+透過性AMPARによる細胞遊走の促進)
脳白質の遊走腫瘍細胞は紡錘状の形態を呈しており、長い細胞突起を有している場合が多かった。腫瘍細胞のこうした形態は、細胞の遊走に適していると思われた。実際、腫瘍細胞中のGluR2の発現により細胞が扁平化し、その突起が退縮した際には、細胞の遊走が著しく阻害された。これに対し、アデノウィルスを介したGluR2(Q)の導入によるCa2+透過性AMPARの過剰発現は、細胞突起を伸長させ、細胞遊走挙動を促進しているようだった。細胞遊走の程度を定量的に評価するため、2つの実験を行った(図4;参考写真4を参照)。
【0045】
まず、トランスウェル二重チャンバー培養皿を用いて、Z軸方向の運動性活動を概算した。この培養皿は、直径8μmの孔が多数あいている多孔質膜で上下に仕切られたチャンバーを有していた。上部チャンバーの細胞に、AxCANCre(コントロール)を感染させずに、AxCAGFPとAxCALNLGluR2を感染させると、少数の細胞がかかる多孔質膜を通って24時間以内に下部チャンバーに移動した。顕微鏡下の10個の20倍の対物視野で計数した遊走細胞の、別個に行った5回の実験における平均値は、4.2±2.3だった(図4a)。しかし、GluR2(R)を発現する生存細胞はひとつとして下部に移動せず、ばらばらになった細胞の断片のみが、下部チャンバーで認められた(図4b)。これに対し、GluR2(Q)を導入したものは、下部チャンバーに移動する細胞の数を増加させた(31.2±8.3、n=5、P<0.02)(図4c)。
【0046】
次に、クローニングリング(直径7mm)を使用して、培養皿中央部の運動性活動を調べた。リングの内側で細胞を培養し、ウィルス感染の48時間後にリングを取り除いた。その後24時間以内にクローニングリングによる境界を横切った細胞の数を計数した。5回の実験の平均値は、GFP、GluR2、及びGluR2(Q)を発現する細胞で、それぞれ43.2±5.3、15.0±3.3、250.2±50.3だった(図4d、e及びf)。このように、GluR2の発現は、細胞の運動性を有意に抑制していた(P<0.002)のに対し、GluR2(Q)の発現は細胞の運動性を促進していた(P<0.01)。
腫瘍遊走に対する同様の阻害作用は、10μMのYM872を用いた場合も観察された。GluR2遺伝子の導入とYM872の使用により、Ca2+透過性AMPARを発現する他の3つの細胞株でも、細胞遊走が阻害された。
【0047】
(ヒト神経膠芽腫のヌードマウスモデルにおける、GluR2発現及びAMPAアンタゴニストによる腫瘍の浸潤の抑制)
本発明者は最後に、インビボでの神経膠芽腫の遊走及び増殖に、GluR2(R)の発現が影響するかどうかについて調べた(図5;参考写真5を参照)。この目的のため、まず本発明者は、AxCAGFPを用いてGFPを標識した2×105個のCGNH−89細胞をヌードマウスの大脳皮質下に移植したヒト神経膠芽腫のマウスモデルを使用した。これら移植した細胞は細胞の集合体を形成し、ヒトの外科的試料に見られるように脳梁の有髄経路に浸潤し、実験した15匹のヌードマウスすべてにおいて、脳全体に広範囲に広がっていた。ヌードマウス異種移植片の組織構造は、ヒト神経膠芽腫の特徴、つまり、多形性(図5a)、偽柵状配列(pseudopalisading)を伴う壊死(図5b)、及び微小血管の増殖(図5c)を示していた。
【0048】
図5dは、GFPだけを発現させるためにAxCAGFP及びAxCALNLGluR2を感染させた2×105個の細胞の移植から9日後に皮質下で形成された、腫瘍細胞集合を示している。細胞核をPIで染色したかかる腫瘍細胞は密度が高く、接種部位の細胞中にGFPが検出された(図5e)。これに対し、GluR2とGFPの両方を発現させるために、AxCAGFPとともにAxCALNLGluR2とAxCANCreを感染させた後で、同数の細胞を接種すると、実験した13匹のヌードマウスのいずれにも、固形の腫瘍細胞集合は形成されなかった(図5f)。PI染色後の核形態から判断したとおり、腫瘍細胞は増殖を停止し、アポトーシスが始まった(図5g)。
【0049】
Ca2+透過性AMPARを操作することでインビボでの腫瘍の成長に変化が生じるかどうかをさらに定量的に評価するため、CGNH−89細胞をヌードマウスの皮下組織に移植して作製した腫瘍の成長に対して、GluR2とGluR2(Q)の発現及び/又はAMPARアンタゴニストのYM872の使用が及ぼす作用を調べた(図6;参考写真6参照)(図6a及びb)。アデノウィルスを介したGluR2の発現は、腫瘍にAxCANCreを感染させずにAxCALNLGluR2を感染させた(n=12、P<0.001)場合と比較して、移植の22日後の腫瘍のサイズだけではなく腫瘍の成長速度を有意に抑制した。GluR2(Q)の発現は、腫瘍の成長を促進する傾向があったが、移植の22日後の腫瘍のサイズを増大させることはなかった。YM872を腹腔内投与すると、ビヒクル(リン酸緩衝液;PBS)(n=12、P<0.001)を投与した場合と比較して、腫瘍のサイズが有意に縮小した。GluR2(Q)を発現する腫瘍(n=12、P<0.001)の成長も阻害されたが、GluR2を発現する腫瘍についてはそれ以上の阻害作用を及ぼさなかった。
【0050】
組織学的分析により、ビヒクル単独で処理した腫瘍細胞に多数の分裂細胞が存在することがわかった(図6c)。YM872で処理した腫瘍組織(図6d)、又はGluR2を発現する腫瘍組織(図6e及びf)において、分裂細胞はほとんど検出されなかった。そのかわり、多数のアポトーシス細胞が観察された。GluR2(Q)を発現する腫瘍細胞の増殖はYM872の使用により阻害された(図6g、h及びi)。また、YM872による処理でGluR2を発現する細胞における腫瘍の増殖がそれ以上阻害されることはなかった(図6j)。
【0051】
[実験の考察]
神経膠芽腫の患者から得た外科的試料において、有髄経路中の遊走細胞は紡錘状又は両極性の形態を呈しており、GluR1及び/又GluR4タンパク質を豊富に発現していた。かかる外科的試料由来の移植体培養物の周辺部に位置する遊走細胞も、長い細胞突起を有する場合が多い紡錘状の形態を呈しており、GluR1を発現していた。アデノウィルスを介したGluR1又はGluR2(Q)の導入によってCa2+透過性AMPARが過剰発現すると、長い細胞突起を有する紡錘状の形態を呈している遊走細胞の数が増大した。これに対し、腫瘍細胞の運動性は、GluR2(R)の発現によって細胞の形態が多角形化し扁平化した後、著しく抑制された。紡錘状の形態や膨化した突起は、細胞遊走に適していると思われる。紡錘状の形態によって、密集した有髄経路又はCNS組織中の狭い空間に、腫瘍細胞が浸潤できると考えられるからである。
【0052】
細胞突起の伸長は、細胞遊走の第一歩と考えられ、その後で細胞体の移動及び後部突起の退縮が続く(Cell, 84, 371-379, 1996)。グリア細胞とCa2+透過性AMPARの形態間の因果関係について、GluR2(R)の発現がグリア突起の著しい退縮を引き起こす一方で、GluR2(Q)の過剰発現が、マウス小脳のベルクマングリア様培養細胞(Bergmann glia-like cultured cells)におけるそれらの膨化を引き起こすことを、本発明者は以前に示している(NeuroReport, 12, 745-748, 2001)。しかし、Ca2+透過性AMPARを介したグリア突起の膨化に関与する詳しい機構は、いまだ解明されていなかった。
【0053】
本実験において、本発明者は、Ca2+透過性AMPARのCa2+非透過性受容体への変換が、アポトーシス指数を増大させ、腫瘍細胞の増殖活性を抑制することを示した。このように、抗アポトーシスシグナル伝達カスケードを刺激するには、こうした受容体を通じたCa2+の流入が必要と思われる。この考察は、適量のCa2+の流入は、小脳顆粒細胞及びNB108神経芽細胞腫細胞など、いくつかの培養細胞の生存に必須であるという以前の知見により裏付けられる(J. Neurosci., 7, 2203-2213, 1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6421-6425, 1989、Nature, 396, 584-587, 1998)。Yano et al.(Nature, 396, 584-587, 1998)は、NB108神経芽細胞腫細胞において、N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)受容体を介したCa2+の流入により供給されたCa2+が、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ(CaM−KK)を活性化し、次にはそれがセリン/スレオニンキナーゼ、Akt(プロテインキナーゼB)をリン酸化することを明確に示した。Aktの活性化で各種抗アポトーシスシグナルが放出されることは知られており、それにより細胞の生存も促進される(Nature, 396, 584-587, 1998)。
【0054】
AMPARの内在性アゴニストはグルタミン酸である。本実験における培養培地にはウシ胎児血清(FCS)及び最大で100μMのグルタミン酸が添加されていた。グルタミン酸の存在は、腫瘍細胞の増殖のみならず、紡錘状の形態を維持するうえでも必須であった。10%の透析済FCSを添加したグルタミン酸を含まない培地で細胞を4〜5日培養すると、かかる細胞は多角形の形態を有するようになり、アポトーシス細胞の数が増加した。こうした変化は100μMのグルタミン酸を添加すると元に戻った。明らかな疑問点は、Ca2+透過性AMPARを活性化するのに充分な濃度のグルタミン酸が増殖し、遊走している脳内の腫瘍細胞に実際に供給されているのか否かということである。移植した神経膠腫細胞が引き続きグルタミン酸を分泌し、その結果、細胞外グルタミン酸が検出可能な程度に増大すること、及び、グルタミン酸の放出が多い神経膠腫は、明らかな成長上の優位性をもつことがわかっている(Nature Med., 7, 1010-1015, 2001)。星状細胞が各種サイトカイン及び成長因子を分泌する場合と同様に自己分泌という形で、神経膠芽腫細胞がグルタミン酸を分泌している可能性が高い(Nature, 391, 281-285, 1998、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57, 653-663, 1998)。
【0055】
NMDA及びAMPA受容体のアンタゴニストはともに、神経膠腫細胞及び神経芽細胞腫細胞を含む多様な型の腫瘍細胞の増殖と遊走を阻害することがわかっている(Nature Med., 7, 1010-1015, 2001、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6372-6377, 2001)。本研究において、本発明者らはCa2+透過性AMPARがヒト神経膠芽腫細胞の遊走及び増殖を促進するうえで重要な役割を果たしていること、及び、GluR2の発現又はYM872によるCa2+透過性AMPARの遮断が、腫瘍の成長を効果的に抑制することを示した。このように、Ca2+透過性グルタミン酸受容体は、脳腫瘍治療の標的となると考えられる。
【0056】
[実験に用いた手法]
(外科的試料と細胞培養物)
本実験で調べた16個の外科的試料の組織構造を、WHO分類に従って多形性神経膠芽腫と診断した。文献(Acta Neuropathol., 94, 425-435, 1997、J. Neurosci. Res., 51, 526-535, 1998)記載のとおり、細胞培養物を調製した。神経膠芽腫の4細胞株のうち、CGNH−89は高い発ガン性を示すため、ヌードマウスへの異種移植に使用した。10%のFCS及び2mMのグルタミンを添加したDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)(Life Technologies社製)で、細胞を培養した。酵素循環法により定量したこの培地のグルタミン酸濃度は、107±5μM(n=4)だった(Brain Res., 573, 197-203, 1992)。
【0057】
(アデノウィルスベクターを用いた遺伝子移植)
本発明者らは、下記の組換え型アデノウィルスを作製した(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320-1324, 1996、Nucl. Acids Res., 23, 3816-3821, 1995)。
(1)AxCALNLGluR1、AxCALNLGluR2及びAxCALNLGluR2(Q):それぞれ、ラットGluR1、GluR2及びGluR2(Q)を発現させるための発現切替ユニットで、CAGプロモーター、loxP配列、スタッファー(stuffer)遺伝子(ネオ耐性遺伝子)、ポリ(A)シグナル、第二loxP部位、GluR1、GluR2又はGluR2(Q)コーディング配列、及びもうひとつのポリ(A)シグナルで構成されている(Mol. Brain Res., 65, 176-185, 1999)。ラットGluR1及びGluR2cDNAは、S. Heinemann博士及びM. Hollmann博士より供与された。
(2)AxCANCre及びAxCAGFP:Creリコンビナーゼ及びEGFP(Clontech社製)をそれぞれ発現させるための組換え型アデノウィルス。実験の2〜5日前に、感染の多重度(MOI)5で、細胞を各組換え型アデノウィルスに感染させた。
【0058】
(組織構造)
文献(NeuroReport, 12, 745-748, 2001、Acta Neuropathol., 94, 425-435, 1997)記載のとおり、GluR1、GluR2、GluR2/GluR3、GluR4(Chemicon社製)、GFAP(Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol., 405, 299-310, 1985)、及びビメンチン(V9、Dakopatts A/S社製)に対する選択性抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行った。ジアミノベンチジンで、免疫応答性を視覚化した。二重免疫蛍光法のため、FITC、ローダミン、及びAlexa 594で標識した二次抗体(Molecular Probe社製)を用いて、結合した抗体を視覚化した。染色した細胞を、共焦点レーザー顕微鏡(MRC-1024E、Bio-Rad社製)で観察した。Kondo et al.(J. Neurosci., 17, 1570-1581, 1997)が記載したものと同じ方法で、in situハイブリダイゼーションを行った。
【0059】
(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR))
試料から調製したRNAの部分標本100ngをランダムヘキサマー(ロッシュ・ディアグノティクス社製)を用いて逆転写し、GluR1からGluR4(Neuron, 12, 383-388, 1994)を同時に増幅したプライマー(センスプライマー:5′−CCTTTGGCCTATGAGATCTGGATGTG−3′(配列番号1)、アンチセンスプライマー:5′−TCGTACCACCATTTGTTTTTCA−3′(配列番号2))を用いて、逆転写産物を94℃で20秒間変性させ、50℃で20秒間アニーリングし、72℃で20秒間伸長反応させるという条件下でPCRサイクルを35回繰り返した。
【0060】
GluR1(1712から1733番目の塩基配列:5′−AAGAGGGACGAGACCAGACAAC−3′(コーディング配列の最初のヌクレオチドである位置1;配列番号3))、GluR2(1732から1755番目の塩基配列:5′−GAAGATGGAAGAGAAACACAAAGT−3′(配列番号4))、GluR3(1749から1771番目の塩基配列:5′−GGAAGACAACAATGAAGAACCTC−3′(配列番号5))か、またはGluR4(1747から1766番目の塩基配列:5′−GAAGGACCCAGCGACCAGCC−3′(配列番号6))の特異的なセンスプライマー、及び、1回目の増幅に使用した共通アンチセンスプライマーを用いて、サブユニットを特異的に増幅するための2回目のPCR(35サイクル)を行った。この2回目の増幅による産物(GluR1は637bp、GluR2は638bp、GluR3は657bp、GluR4は626bp)を、GluR1にはBglI、GluR2にはBsp1286I、GluR3にはAvaI、及びGluR4にはPvuIIというように、特異的な制限酵素を用いて分解した。
【0061】
(細胞内Ca2+イメージング)
室温で40分間、細胞にfura−2AM(Dojin社製)を負荷した。Argus/HiSCA system(Hamamatsu Photonics社製)を使用して、励起波長340nmと380nmで、蛍光イメージを得た。340/380の蛍光比を、文献(Cell, 88, 49-55, 1997)記載のとおりに[Ca2+]iに変換した。
【0062】
(TUNEL、増殖及び遊走の分析)
TUNEL及び細胞増殖の分析のため、標準培養培地を満たしたLab-Tek 4-wellガラススライドに、2×104個/ウェルの密度で細胞を載せた。載せてから6時間後に培地をグルタミン酸を含まないものと取り替え、細胞にアデノウィルスを感染させた。載せてから48時間後、グルタミン酸(100μM)を培地に添加し、感染5日後に細胞を固定した。In Situ Cell Death Detection kit(MBI社製)を用いてTUNEL分析を行い、抗Ki−67モノクローナル抗体(Dako社製)染色指数を用いて細胞増殖分析を行った。遊走分析は、トランスウェル・チャンバー(孔径8μm)(Corning Corstar Corp.社製)中で行った。
【0063】
上部チャンバーに5×104個/ウェルの密度で細胞を載せた。載せてから6時間後に、10%の透析済FCSを添加した、グルタミン酸を含まない培地で、かかる細胞に組換え型アデノウィルスを感染させた。感染の48時間後、グルタミン酸(100μM)を培地に添加した。細胞をさらに24時間培養し、多孔質膜を通過して遊走した細胞の数を対物20倍の顕微鏡で計数した。
また、別の遊走分析実験で、一方の端部をシリコングリースでコーティングしたガラス製クローニングシリンダー(直径7mm)を培養皿の中央に置いた。シリンダーの中に2×104個の細胞を入れた。感染の48時間後、クローニングリングを除去し、細胞をさらに24時間培養した。その後、クローニングリングによる境界を越えた細胞の数を計数した。
【0064】
(動物モデル)
培養培地中にCGNH−89細胞を1×107/100μlで懸濁した。AxCAGFP及びAxCALNLGluR2を感染させ、さらにAxCANCreを感染させた懸濁液、或いは感染させなかった懸濁液の部分標本2μlを、エーテル麻酔下のヌードマウスの脳に定位的に注入した。そして、注入の9〜14日後に脳組織を調べた。
また、腫瘍の成長に対するアデノウィルスによるGluR2(R)及びGluR2(Q)の発現の効果を、AMPA型グルタミン酸受容体拮抗薬であるYM872を用いたものと、用いないものについて、皮下腫瘍中で定量的に評価した。細胞懸濁液(1×107/100μl)を、5〜6週齢(体重18〜20g)のヌードマウスの脇腹に皮下注射した。アデノウィルス(1×107PFU、全量にして100μlのPBSで稀釈)を、腫瘍接種後5日目に、27番の針を用いて腫瘍内に一度投与した。AxCANCreを含まないAxCALNLGluR2を、コントロール用に投与した。
【0065】
Yamanouchi Pharmaceutical Companyより供与されたYM872をPBSに溶解させた。投与量10mg/kg、50mg/kg、及び100mg/kgでYM872を2週間にわたって毎日腹腔内注射した(腫瘍接種の1日後に開始した)ところ、腫瘍の成長が投与量依存的に阻害されているのが観察された。この一連の実験では、100mg/kgのYM872を使用した。コントロールとして、PBS(100μl)を腹腔内に投与した。(縦×横2)/2という公式にしたがい、腫瘍の容積を計算した。各実験の最後に、腫瘍組織の組織学的分析を行った。
【0066】
(データ分析)
データは、平均±s.e.mとして表されている。無対t検定又は一元配置分散分析(ANOVAs: Scheffe's test for post-hoc comparison)により、統計上の比較を行った。
【0067】
[図の説明]
(図1 ヒト神経膠芽腫細胞で発現したAMPA受容体を示す図;参考写真1)
a〜c;外科的標本原本の連続切片である。a;ヘマトキシリン−エオシン(HE)で染色した浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積を示す。b;in situハイブリダイゼーションで検出したGluR1 mRNAの発現(ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、青色)を示す。c;GluR1の免疫蛍光法(ローダミン、赤色)によるイメージを示す。
d〜g;外科的標本原本の連続切片(GNS−3148)である。d;浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積(HE染色)を示す。e;抗GluR1抗体を用いた免疫染色である。f;抗GluR2抗体を用いた免疫染色である。g;抗GluR4抗体を用いた免疫染色である。
【0068】
h〜k;d〜gと同じ標本の隣接組織である。h;大脳皮質の浸潤腫瘍細胞(HE染色)である。i、j及びk;抗GluR1抗体、抗GluR2抗体及び抗GluR4抗体をそれぞれ用いた免疫染色を表す。
l〜n;抗GluR1抗体(Alexa 594、赤色)(l)及び抗GluR4抗体(FITC、緑色)(m)を用いた免疫染色、並びに一次培養の腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ(n)を表す。
o〜q;抗GluR1抗体(Alexa 594、赤色)(o)及び抗GluR2抗体(FITC、緑色)(p)を用いた免疫染色、並びに腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ(q)を示す。q中のスケールバーは、a〜gについては100μm、h〜qについては50μm。
【0069】
r〜s;一次培養の腫瘍細胞(r)及び切除前の腫瘍細胞に隣接していた正常な脳組織(s)における、GluR1〜4に特異的なプライマーを用いたRT−PCR分析結果である。rとsの両方において、右と左の4レーン(R1からR4)は、各GluR1〜4DNAに特異的な制限酵素による分断の前後におけるPCR産物の電気泳動を、それぞれ示すものである。右側のレーンにある分断した断片の大きさ:BglIで切断したGluR1については189及び448bp、Bsp1286Iで切断したGluR2については368及び270bp、AvaIで切断したGluR3については420及び237bp、PvuIIで切断したGluR4については379及び247bp。レーンφは、密集した500bpバンドをそなえたDNAサイズマーカーを示す。
【0070】
(図2 培養腫瘍細胞における、AMPAが誘導した[Ca2+]iの変化を示す図;参考写真2)
a〜c;fura−2 AMを負荷した一次培養の腫瘍細胞における、AMPAが誘導した[Ca2+]iの増加を示す。励起波長340nmでの蛍光イメージ(a)、並びに200μMのAMPA及び100μMのCTZに曝露する前(b)及び曝露中(c)における、340/380nm比の仮染色イメージを示す。
d〜f;移植片培養物から取り出された単層中の細胞における、AMPAが誘導した[Ca2+]iの増加を示す。これは、a〜cと同じ装置でイメージを撮影した。
g〜i;ビメンチン(g、FITC、緑色)及びGluR1(h、ローダミン、赤色)の二重免疫蛍光法並びにそれらを組み合わせたイメージ(i)を表す。f中のスケールバーは、d〜fについて20μm、i中のスケールバーは、a〜c及びg〜iについて100μmを示す。
【0071】
(図3 アデノウィルスが介するAMPA受容体サブユニットの発現の作用を示す図;参考写真3)
a〜c;コントロール。培養細胞(CGNH−89)にAxCAGFPとAxCALNLGluR2を感染させ、AxCANCreを感染させなかった。GFP蛍光(a)、GluR1の免疫蛍光法(b)、及びそれらを組み合わせたイメージ(c)である。
d〜f;GluR2を発現する細胞である。AxCAGFP、AxCALNLGluR2、及びAxCANCreを感染させた。GFP蛍光(d)、GluR2の免疫蛍光法(e)及びそれらを組み合わせたイメージ(f)である。
g;コントロール用にAxCALNLGluR2のみを感染させ、ビメンチン(FITC、緑色)とヨウ化プロピジウム(PI)(赤色)で二重染色した細胞である。
【0072】
h;AxCALNLGluR2とAxCANCreを細胞に感染させ、ビメンチン(FITC、緑)とGluR2(ローダミン、赤)を対象として二重染色した細胞である。GluR2タンパク質発現細胞中の分断したビメンチンフィラメントに注目のこと。
i;AxCAGFP、AxCALNLGluR2及びAxCANCreを細胞に感染させ、PIで染色した細胞である。アポト−シス小体及び核における泡状突起形成に注目のこと。
j〜l;GluR1を過剰発現する細胞である。それらの細胞を、AxCALNLGluR1及びAxCANCreを用いて感染させた。ビメンチン(j、FITC、緑色)及びGluR1(k、ローダミン、赤色)の免疫蛍光法及びそれらを組み合わせたイメージ(l)を示す。
【0073】
m〜o;AxCAGFP(m)、AxCAGFP、AxCALNLGluR2及びAxCANCre(n)、並びにAxCAGFP、AxCALNLGluR2(Q)及びAxCANCre(o)を感染させたU87−MG細胞である。それらをGluR2(ローダミン、赤色)を対象として染色した。GFP及びGluR2の免疫蛍光法の、組み合わせたイメージを示す。i中のスケールバーは、a〜f及びj〜oについては100μm、g〜iについては20μm。
p〜x;fura−2AMを用いた[Ca2+]iの測定の結果を表す。コントロールのCGNH−89細胞(p〜r)並びにGluR2(s〜u)及びGluR2(Q)(v〜x)を発現する細胞である。左から右に向かって、励起波長340nmでの蛍光イメージ、200μMのAMPA及び100μMのCTZに曝露する前及び曝露中における、340/380nm比の仮染色イメージである。
【0074】
(図4 GluR2及びGluR2(Q)の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す図;参考写真4)
a〜c;トランスウェル二重チャンバーを用いて調べた腫瘍細胞の運動性を示す図である。多孔質膜下にある下部チャンバー中の細胞の共焦点顕微鏡像である。抗GluR2抗体(ローダミン、赤色)及び抗ビメンチン抗体(FITC、緑色)で細胞を染色した。a;AxCALNLGluR2を感染させ、AxCANCreを感染させなかった細胞である。ビメンチンを発現する細胞のいくつかは遊走して、24時間以内に多孔質膜を通過していた。b;GluR2を発現させるためにAxCANCreとAxCALNLGluR2を感染させた細胞である。24時間後に下部チャンバーで認められたのは、分断された細胞の断片のみであった。c;GluR2(Q)を発現させるためにAxCANCre及びAxCALNLGluR2(Q)を感染させた細胞である。aよりも多数の腫瘍細胞が遊走して、24時間以内に多孔質膜を通過していた。
【0075】
d〜f;クローニングリングを用いて調べた腫瘍細胞の運動性を表す。AxCALNLGluR2のみ(d、コントロール)、GluR2発現細胞(e)、又はGluR2(Q)発現細胞(f)を感染させた細胞の、クローニングリング除去後24時間以内の遊走を示す。抗ビメンチン抗体及び抗GluR2抗体で細胞を染色した。白線はクローニングリングによる境界を示す。f中のスケールバーは、a〜cについては50μm、d〜fについては100μmを示す。
【0076】
(図5 GluR2の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す図;参考写真5)
a〜c;培養した神経膠芽腫細胞のヌードマウス皮下への移植により形成された腫瘍の組織病理を表す。かかる腫瘍は、多形性(a)、pseudopalisadingを伴う壊死(b)、及び微小血管の増殖(c)を特徴としている。図中「v」は腫瘍血管(HE染色)を示す。
d;2×105個の培養神経膠芽腫細胞の、ヌードマウスの大脳皮質下領域への移植後9日目における腫瘍形成状況を表している。GFP(緑色)を発現させるため、移植の2日前に、AxCAGFP及びAxCALNLGluR2を培養細胞にそれぞれMOI 5で感染させ、PI(赤色)で染色していた。e;dのボックス部分の拡大図である。
【0077】
f;2×105個の培養神経膠芽腫細胞の移植後14日目における細胞である。GFPとGluR2をともに発現させるため、移植の2日前に、AxCAGFP、AxCALNLGluR2、及びAxCANCreを培養細胞にそれぞれMOI 5で感染させていた。
g;fのボックス部分の拡大図である。GluR2の発現により生じた核のアポトーシス状形態に注目のこと。g中のスケールバーは、a、e及びgについては50μm、bについては100μm、cについては75μm、dについては1500μm、及びfについては1000μmを示す。
【0078】
(図6 AMPA受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図;参考写真6)
a;各種の処理が、ヌードマウスの皮下組織に移植した腫瘍の成長速度に及ぼす作用:PBSの注入(YM872の使用に対するコントロールとしてのビヒクル、(▽);GluR2(Q)の発現(□);AxCANCreを含まないAxCALNLGluR2の注入(GluR2及びGluR2(Q)を発現させるためのコントロールとしてのベクター、(●);GluR2(Q)の発現及びYM872の使用(△);GluR2の発現(◆);YM872の使用(■);GluR2の発現及びYM872の使用(▲)。各処理には、12匹の動物を使用した。各区画は腫瘍容積の平均±s.e.m.(n=12)を表す。
【0079】
b;接種の22日後に測定した腫瘍容積の区画を表す。各処理のため、12匹の動物から得た生データを割り振った。*はコントロール(ビヒクル又はベクターのいずれか)に関するp<0.001での有意な差異を示す。
c〜f;ビヒクル(c)及びYM872(d)で処理した腫瘍組織、及びGluR2遺伝子が送達された腫瘍組織(e、f)の組織構造を表す。c、d及びe;HE染色である。f;抗GluR2抗体を用いた免疫染色である。
g〜h;GluR2(Q)遺伝子が送達された腫瘍組織におけるHE染色(g)及び抗GluR2抗体を用いた免疫染色(h)である。
i;YM872で処理した、GluR2(Q)を発現する腫瘍組織のHE染色を表す。
j;YM872で処理した、GluR2を発現する腫瘍組織のHE染色を表す。c〜jの組織は、腫瘍接種の22日後に採取したものである。j中のスケールバーは、c〜jについて50μmを示す。
【0080】
【発明の効果】
本発明により、動物の発症する脳腫瘍細胞において、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットによるCa2+透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができる。特に、本発明により、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2の遺伝子を脳腫瘍細胞に導入することにより、脳腫瘍細胞におけるCa2+透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができるため、最も悪性であり、遊走性及び湿潤性の高い腫瘍として知られている神経膠芽腫のような脳腫瘍の治療に有効な手段となる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することにより、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することを可能とするため、該方法を用いて、脳腫瘍の悪性度を把握することが可能であり、脳腫瘍の診断や予防或いは治療のための有力な手段となる。
【0081】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明において、ヒト神経膠芽腫細胞におけるAMPA受容体の発現を示す図である(参考写真1)。
【図2】本発明において、培養腫瘍細胞における、AMPAが誘導した[Ca2+]iの変化を示す図である(参考写真2)。
【図3】本発明において、アデノウィルスが介するAMPA受容体サブユニットの発現の作用を示す図である(参考写真3)。
【図4】本発明において、GluR2及びGluR2(Q)の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す図である(参考写真4)。
【図5】本発明において、GluR2の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す図である(参考写真5)。
【図6】本発明において、AMPA受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図である(参考写真6)。
Claims (4)
- AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2のcDNA遺伝子を組込んだ発現ベクターからなり、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入し、該GluR2の遺伝子を発現することによりCa2+透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制するために用いる脳腫瘍治療用医薬組成物。
- 発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項1記載の脳腫瘍治療用医薬組成物。
- AMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluR2のcDNA遺伝子を組込んだ発現ベクターをセットし、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入し、該GluR2の遺伝子を発現することによりCa 2+ 透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制するために用いる脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット。
- 発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項3記載の脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット。
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