WO2004014433A1

WO2004014433A1 - Ａｍｐａ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現による脳腫瘍細胞の増殖と浸潤の抑制

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Publication number: WO2004014433A1
Application number: PCT/JP2003/010143
Authority: WO
Inventors: Seiji Ozawa; Shogo Ishiuchi
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2004-02-19
Also published as: CA2494063C; EP1552852B1; JP4175846B2; ATE429931T1; ES2324780T3; US20060128645A1; DE60327449D1; JP2004067627A; EP1552852A4; EP1552852A1; CA2494063A1

Description

明細書

A M P A型ダルタミン酸受容体サブュニッ卜の発現による脳腫瘍細胞の増殖と浸潤の抑制技術分野

本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、 C a ^{2 +}透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、 A M P A型ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ² +透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、及び動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブュニットの発現を検出 · 測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖 · 浸潤活性を測定する方法に関する。背景技術

ダルタミン酸は、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、ダルタミン酸の受容体であるダルタミン酸受容体は中枢神経における興奮性シナプス伝達の中心的役割を担っている。更に、グルタミン酸受容体は、記憶、学習の細胞レベルにおける基盤と考えられているシナプス可塑性や、発達期のシナプス可塑性すなわち経験依存的な神経回路網の形成に関与していることが知られている。また、虚血など病的条件下における神経細胞死にも関与していることが示唆されている。

ダルタミン酸受容体はその構造とシグナル伝達機構から、イオンチヤンネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチヤンネル型ダルタミン酸受容体と、 Gタンパク質と共役することにより間接的に伝える代謝型ダルタミン酸受容体とに大別される。イオンチャンネル型ダル夕ミン酸受容体は、グルタミン酸の結合により自身の陽イオンチヤンネルを開口する受容体—イオンチャンネル複合体であり、高等動物の中枢神経系（CN S) における速い興奮性シナプス伝達を担っている。イオンチャンネル型受容体は、特異的ァゴニストやアンタゴニス卜に対する反応性と内蔵するイオンチャンネルの電気生理学的特性により、 N -メチル _ D—ァスパラギン酸（ N M D A ： N-methyl-D-aspartic acid) に感受性の NMD A受容体と非感受性の非 NMD A受容体に大別される。ァゴニストが結合すると N a +、 K +に加えて C a ^{2 +} を通過させる。非 NMDA受容体は、カイニン酸、 AMPA ( α—ァミノ _ 3— ヒドロキシ— 5 —メチル _ 4一イソォキサゾールプロピオン酸：ひ - amino - 3 - hydroxy- 5 - methyl_4 - isoxazole propionic acid) に対する感受性の差により、カイニン酸受容体、 AM P A受容体のサブタイプに分類され、ァゴニストが結合すると N a ⁺、 K +を通過させる。

AM P A型グルタミン酸受容体（AMPAR) は、中枢神経系（CN S ) 中のほとんどすベての興奮性シナプスにおける迅速な神経伝達を仲介している（Trends Neurosci.， 16, 359-365, 1993;Annu. Rev. Neurosci., 17, 31-108, 1994、 Prog. Neurobiol. , 54, 581-618， 1998)。従来、該受容体は神経細胞にのみ存在すると考えられてきたが、最近、大半のグリア細胞（glial cell) 中でも発現していることが明らかとなった (Trends Pharmacol. Sci. , 21, 252-258, 2000)。

AMP Α受容体（AMPAR) は、 G l u R l〜G l u R 4という 4 つのタンパク質から選択されるサブュニッ卜から構成されていることが知られている。そして、 AMPARの C a ² +透過性は、そのサブュニッ卜の組成によって決まる。

G 1 u R 2サブュニットをもつ受容体は、 C a ^{2 +}に対してほとんど透過性を示さないが、 G 1 u R 2をもたない受容体は、高い C a ^{2 +}透過性を示す。 G 1 u R 2サブュニッ卜が豊富に存在すると、 C a ^{2 +}透過性が低下する (Trends Neurosci. , 16, 359-365, 1993;A画. Rev. Neurosci. , 17, 31-108, 1994;Prog. Neurobiol. , 54, 581-618, 1998)。この G 1 u R 2の固有の性質は、第 2番目の疎水性領域（M 2 ) にある 1つのアミノ酸残基に起因する。このアミノ酸残基は、 G l u R 2中ではアルギニン（R) であるが、他のサブュニッ卜の相当する部位はグルタミン（ Q ) が占めている。この重要な部位（QZR部位）のアルギニンがダルタミンに置換されると、変異した G l u R 2 (Q) から集まった相同的な受容体は高い C a ^{2 +}透過性を示す。

生体中において、 AMP A受容体（AMPAR) のサブユニットのうち、 G l u R 2の疎水性領域（M 2) にある 1つのアミノ酸残基がアルギニン（R) となるメカニズムは、遺伝子の転写後に起こる「RNA編集（RNA editing)」という現象で知られている。すなわち、遺伝子（D N A) が mRN Aに転写された後に 1塩基が置換され、その結果、タンパク質レベルでも 1アミノ酸残基の置換が生じる。遺伝子では、ダル夕ミン酸（Q) がコードされているのに対して、実際にはアルギニン（R) に置き換っているという特異な現象である。しかしながら、この変換によって、 C a ^{2 +}透過性が低下する。

上記のように、グルタミン酸受容体は神経伝達物質受容体として機能しているので、これまでは主に精神的疾患、筋萎縮性側索硬化症（AL S ) や、記憶 ·学習の分野を中心に盛んに研究されてきており、種々の知見や、治療薬等の開発が行われてきた。それらの研究 · 開発の成果として、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中又はてんかんなどの神経変性疾患に関与する遺伝子を同定するための方法、及び神経変性疾患を有する動物を治療するための治療薬などの開発が行われてきた。

一方で、脳腫瘍として、神経膠芽腫（glioblastoma^ 乏突起膠腫 (oligodendroglioma) 髄膜腫（meningioma) などが良く知られている。特に、神経膠芽腫（glioblastoma) は、中枢神経系（CN S) で最もよく見受けられ、かつ最も悪性の腫瘍である。この種の腫瘍は、遊走性及び浸潤性が高いことで知られている（Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous Systems, 29-39, 2000 (IARC press, Lyon, France) )₀ 遊走細胞は、密集した有髄の経路に沿って優先的な動きを示し、 CN S 中に広範囲に広がっていくため (Neurol. Med. Chir. , 34, 91-94, 1994、 Neurol. Med. Chir. , 33, 425-428, 1993、 Neuropathology, 17, 186-188， 1997)、外科的な処置を施しても好結果が得られていない。

また、悪性神経膠腫（glioma) のニ大特徴である細胞の増殖及び遊走は、神経膠腫の起源となる細胞の神経前駆細胞にも認められる（Glial Cel 1 Development, 209-220, 1996 (BIOS Sc i ent i f i c Publ i shers, Oxford, UK.), Glia, 15, 222-230, 1995)。神経膠腫細胞は、神経伝達物質、ホルモン、及び成長因子（Trends Pharmacol. Sci. , 21, 252-258, 2000) などの各種外部刺激に反応するため、神経膠芽腫の悪性の特徴は表面受容体の活性化を通じて、少なくとも部分的に制御することができる。近年、グルタミン酸受容体が、神経前駆細胞だけではなく神経膠腫においても発現することが報告されている（J. Neurosci. , 17, 227-240, 1997、 Glia, 10, 149-153, 1994、 J. Neurosci. , 16, 519-530, 1996、 Eur. J. Neurosci. , 10, 2153-2162, 1998、 J. Neurosci. Res. , 46, 164-178, 1996)。しかし、その病理生理学的重要性は、大部分が不明のままである。

本発明の課題は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、 C a ^{2 +}透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、 AM P A型ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ² +透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法を提供すること、更には動物の発症する脳腫瘍細胞において、 AMP A型グルタミン酸受容体サブュニットの発現を検出 ·測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性を測定する方法を提供することにある。

本発明者は、確立した脳細胞の培養系を用い、カルシウム透過型 AM P A受容体のダリァ細胞における役割について解析する中で、強いカルシゥム透過性を有する G 1 u R 2 (Q) 遺伝子を強制発現させると細胞の突起形成が促進され、逆にカルシウム非透過性を有する G 1 u R 2 (G 1 u R 2 (R)) 遺伝子を導入すると、突起の退縮と細胞の扁平化が生じることを見い出し、報告した（NeuroReport 1 (2001) , 745-748) ₀ そして、本発明者は、 AMPAR (AMP A受容体）がヒト神経膠腫細胞で発現しており、更に G l u R 2 (Q) 遺伝子を強制発現させた紡錘形細胞は、培養フラスコ内で重層しながら遊走するダリォーマ細胞や、摘出標本でしばしば認められる白質髄鞘線維内を走行する腫瘍細胞と形態学的に良く似ていることから、カルシウム透過型 AM P A Rが腫瘍細胞の浸潤性に関与しているのではないかと推測し、更に、解析を進めた結果、（ 1 ) G 1 u R 1及びノ又は G 1 u R 4サブュニッ卜が、ヒト神経膠芽腫細胞のいたるところで発現しており、 C a ² +透過性 AMP ARとして作用していること、（ 2 ) 該神経膠芽腫細胞に、 G 1 u R 2 (G 1 u R 2 (R)) 遺伝子を導入し、こうした内在性 C a ^{2 +}透過性 AM P A R を、 C a ^{2 +}非透過性 AM PARに変換すると、腫瘍細胞中で遊走が阻害され、アポト一シスが、誘導されること、及び（ 3 ) これに対して、 C a ² +透過性 AMP A Rが過剰発現すると、腫瘍細胞の増殖だけでなく遊走行動も増大すること、を見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明においては、動物の発症する脳腫瘍細胞において、ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。グルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性を制御するには、脳腫瘍細胞に. AM P A型グルタミン酸受容体サブュニッ卜 G 1 u R 2の遺伝子を導入することにより、行うことができる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブュニットの発現を検出 · 測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性を測定する方法を提供する。発明の開示

すなわち本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において発現する AM P A型ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 1 )や、グルタミン酸受容体サブュニットによる C a ² +透過性の制御を、動物の発症する脳腫瘍細胞に、 AMP A型グルタミン酸受容体サブユニット G 1 u R 2の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことを特徴とする請求項 1記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 2 ) や、 AMP A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子が、 AMP A型ダルタミン酸受容体サブュニット G l u R 2の c DNAであることを特徴とする請求項 2記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 3 ) や、動物の発症する脳腫瘍細胞に、発現べクタ一を用いて、 AM P A型ダル夕ミン酸受容体サブュニッ卜 G 1 u R 2の遺伝子を導入し、発現させることを特徴とする請求項 2又は 3記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 4) や、発現ベクターが、アデノウィルスを用いたベクタ一であることを特徴とする請求項 4記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 5 ) や、脳腫瘍細胞が、神経膠芽腫細胞であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項 6 ) からなる。

また本発明は、 AMP A型ダル夕ミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を、脳腫瘍細への遺伝子導入 ·発現用ベクターに組み込んだことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター（請求項 7 ) や、発現べクタ一が、アデノウイルスベクタ一であることを特徴とする請求項 7記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター（請求項 8 ) や、請求項 7又は 8記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現べクタ一をセッ卜したことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット（請求項 9) からなる。

さらに本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞における AMP A型グル夕ミン酸受容体サブュニットの発現を検出 ·測定することを特徴とする脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性の測定方法（請求項 1 0 ) や、グルタミン酸受容体サブュニットの発現の検出 ·測定が、 AMP A型ダル夕ミン酸受容体サブュニッ卜 G 1 u R 2の検出 '測定であることを特徴とする請求項 1 0記載の脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性の測定方法（請求項 1 1 ) からなる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明において、ヒト神経膠芽腫細胞における AMP A受容体の発現を示す写真である。

第 2図は、本発明において、培養腫瘍細胞における、 AMP Aが誘導した [C a ²⁺] iの変化を示す写真である。

第 3図は、本発明において、アデノウイルスが介する AMP A受容体サブュニッ卜の発現の作用を示す写真である。

第 4図は、本発明において、 G l u R 2及び G l u R 2 (Q) の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す図である。第 5図は、本発明において、 G l u R 2の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す写真である。

第 6図は、本発明において、 AMP A受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、発現するグルタミン酸受容体サブュニットによる C a ² +透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。動物の発症する脳腫瘍細胞としては、神経膠芽腫（ glioblastoma ) 、乏突起膠腫 (oligodendroglioma) 髄膜腫（meningioma) などが挙げられる。グルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性の制御には、動物の発症する脳腫瘍細胞に、 AMP A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことができる。該 A MP A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子としては. AMP A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の c DNAを用いることができるが、該遺伝子は既に公知のものであり（Science 249, 1580-1585, 1990)、該遺伝子の塩基配列は、 G e n B a n kデータ一ベ —スにより、ァクセッシン 'ナンバー： M 3 8 0 6 1 として検索することができる。

本発明において、 AM P A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入するには、適宜の公知の遺伝子導入手段を用いることができる。その導入手段の好ましい方法としては、アデノウイルス発現用べクタ一を用いることができる。そのようなアデノウイルス発現用べクタ一としては、一過性発現に用いられているアデノウイルスベクタ一（Science, 259, 988-990, 1993) が挙げられる。アデノウイルスベクターは、中枢神経系（CN S) のグリア細胞に対して、極めて高い親和性を持ち、小脳皮質に注入した場合は、選択的にベルクマングリァに G 1 u R 2の遺伝子を発現させることが可能である。また、アデノウイルスベクターに、 C r e Z 1 o x P発現制御システムを使用した遺伝子導入ベクター（Nucl. Acids Res. , 23, 3816-3821， 1995) を用いることもできる。 C r e Z l o x Pシステムを用いる理由の一つに、 A X C AL N L G 1 u R 2のみの感染では、 C r eが存在しないため G 1 u 2が発現しない状態をつくり出せることを利用して、それをウィルス感染による影響を除外するためのコントロ一ルとして使用できるというメリットがある。

本発明においては、 AMP A型ダル夕ミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を、アデノウイルスベクタ一のような遺伝子発現用べクターに組み込んで、脳腫瘍治療用遺伝子導入キットとして用意し、これを脳腫瘍の治療に用いることができる。

本発明の他の実施の態様として、本発明の方法により、動物の発症する脳腫瘍細胞におけるグルタミン酸受容体サブュニットの発現を検出 · 測定することにより脳腫瘍細胞の増殖 · 浸潤活性を測定することが可能である。中枢神経系（CN S) における神経膠芽腫のような脳腫瘍においては G 1 u R 1〜 4の 4つのタンパク質からなるサブュニットが発現しており、その発現しているサブユニットの組成によって、細胞の C a ^{2 +}透過性及び非透過性が決定される。そして、この細胞の C a ^{2 +}透過性及び非透過性によって、脳腫瘍細胞の増殖'浸潤活性が相違してくる。サブュニット G l u R lや G l u R 4が発現していると、細胞は C a ^{2 +} 透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖 ' 浸潤が促進され、サブユニット G 1 u R 2が発現すると、細胞は C a ^{2 +}非透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤が抑制される。したがって、脳腫瘍細胞に発現するダルタミン酸受容体サブュニッ卜を検出 ·測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖 ' 浸潤活性を測定することができる。ダル夕ミン酸受容体サブュニットの検出 ·測定には、適宜公知の検出 ·測定手段を用いることができる。サブュニットの遺伝子の測定には、それぞれのサブユニットの遺伝子の検出のためのプロ一ブを用いることができる。また、サブュニットの発現の検出'測定には、それぞれのサブュニットに特異的に結合する抗体を作製し、用いるのが好ましい。グルタミン酸受容体サブュニッ卜に特異的に結合する抗体としては、ポリクロ一ナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれもが使用することができ、該抗体は常法により調製することができる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

[ダルタミン酸受容体サブュニットの発現、サブュニット G 1 U R 2の導入及び腫瘍細胞の増殖と浸潤]

(神経膠芽腫の外科的試料及び細胞培養物における G 1 u Rの発現）本発明者は、外科的試料の in situハイブリダィゼ一シヨン研究における AMP A Rサブュニット G 1 u R 1の発現について調べた（第 1図参照）。第 1図の aは、神経膠芽腫の外科的試料の代表的な組織構造を示しており、浸潤性の腫瘍細胞が認められる。 G l u R lのアンチセンスリポプローブでハイブリダィズしたシグナルを、遊走し増殖している未分化細胞中で検出した（第 1図 b)。連続切片では、ァフィ二ティー精製した G 1 u R 1抗体で免疫染色した G 1 u R 1タンパク質の発現が、腫瘍細胞中で検出された（第 1図 c )。

さらに本発明者らは、 G l u R l、 G 1 u 2 G l u R 2Z 3、及び G 1 u R 4に対する抗体を選択して免疫組織化学的染色を行うことに

0 より、パラフィン包埋した神経膠芽腫の外科的試料（n= 1 6) 中の A MP ARサブュニットの発現について調べた（表 1 )。調べた外科的試料 (n = 1 6 ) のすべてに、 G 1 u R 1タンパク質の発現が認められた。これらの試料では、腫瘍細胞の大半 ( 5 2 ± 2 1 %、 n = 1 6 ) に、 G 1 u R 1タンパク質が発現していた。 1 6個の神経膠芽腫の外科的試料のうち 1 4個で、少数の細胞（ 2 1 ± 7 %、 n = 1 4 ) に G l u R 2の発現が観察された。抗 G 1 u R 2/ 3抗体による染色を 1 6個の外科的試料のうち 1 4個 ( 3 1 ± 5 %、 n = 1 4 ) で観察した。すべての外科的試料（ 5 5 ± 7 %、 n = 1 6 ) で、腫瘍細胞は G 1 u R 4にも陽性を示していた。

図 I dから gは、 G l u R l、 G l u R 2、及び G 1 u R 4に対する抗体で処理した外科的試料原本の連続切片の一例を示す。これらの切片では、遊走する神経膠芽腫細胞が大脳皮質の軟膜下に広範囲に蓄積していた。これらの細胞は G l u R lと G l u R 4の両方を発現していたが、 G 1 u R 2の発現はごくわずかなものだった（第 1図 d、 e、 f 及び g)。隣接する脳組織（第 1図 h、 i、 j 及び k) では、浸潤性の未分化腫瘍細胞が G 1 u R 1と G 1 u R 4を発現していた（第 1図 i及び k) のに対し、正常なニューロンは G 1 u R 2を大量に発現していた（第 1図！）。白質に浸潤していた紡錘状の腫瘍細胞は、未成熟の星状細胞のマーカ一であるビメンチンと G 1 u R 1を発現していたが、 G l u R 2の発現はごくわずかなものだった。

本発明者は、外科的試料から神経膠芽腫細胞の一次培養細胞を調製し、 AMP A Rサブュニットの発現について調べた（表 1 )。これらの培養細胞では、大半の細胞が G F A P免疫応答性を示していた。このことから、それらがグリア細胞に由来するものであり、ニュ一ロンのマ一カーであるニューロフィラメントタンパク質（N F P) (Nature, 298, 277-279, 1982, Acta Neuropathol. , 64, 30-36, 1984)、及びミクログリアのマーカーである K i 一 M 1 P (Pathol. Int. , 46, 15-23, 1996) それぞれに対する免疫応答性の欠如からわかるとおり、ニューロンやミクログリアによって汚染されていないことがわかる。

G 1 u R 1及び G 1 u R 4に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、大半の培養細胞は、両方のタンパク質を同時に発現していた（第 1図 1、 m、及び n)。しかし、 0 1 111^ 1及び0 1 111^ 2又は 1 11尺 4及び G 1 u 2に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、ほんの少数の G 1 u R 1発現細胞又は G 1 u R 4発現細胞が、 G 1 u R 2 免疫応答性を示すにとどまっていた（第 1図 o、 p、及び q)。

本発明者らは外科的試料から 4つの神経膠芽腫細胞株を確立した。そのうち 3つは、 G l u R lと G l u R 4、 G l u R l と G l u R 3、 G 1 u R 3と G 1 u R 4をそれぞれ発現していた。 1つの細胞株は、 AM PARサブュニットを全く発現していなかった。市販のヒト神経膠芽腫細胞株である U'8 7 MGについても、 AMP ARサブユニットの発現を調べてみた。この細胞株では G l u R lと G l u R 3の発現が強く、 G 1 u R 2の発現は弱かった（表 1 )。

神経膠芽腫細胞での G 1 u R 1〜 4サブュニットの発現を確認するため、本発明者らは次に逆転写ポリメラ一ゼ連鎖反応（RT— P C R) 研究を行った（Neuron, 12, 383-388, 1994)。 3つの外科的試料、 4つの一次培養細胞、及び 5つの細胞株について、逆転写を行い、ついで G 1 u R 1〜 4に特異的なプライマ一を用いて、 P C R増幅を行った。各 G 1 u R ；!〜 4断片に特異的な酵素を用いた制限酵素分析で、増幅産物を調べた（Neuron, 12, 383-388, 1994)。第 1図 rは、腫瘍細胞の一次培養で得られた代表的な結果を示す。この事例では、すべての G l u R l 〜4 mRNAの発現が検出されている。コントロールである腫瘍に隣

2 接した脳組織でも、 G l u R l 4 mRN Aの発現が検出された（第 1図 s ) o。 G l u R l 4 mRN Aの発現に関しては、 RT— P C Rで得た結果は、免疫組織化学法により得た結果と完全に一致している（表 1 )₀

(表 1 )

免疫組織化学法 RT- - PCR

R 1 R 2 R 2 R 3 R4 R 1 R 2 R3 R4 外科的試料

+ + + + + + +

GNS-3114 + + + + + + + + + + + + +

GNS-3148 + + + /— +ノー + +

GNS-3186 + + 4- + + +

GNS-3195 + + + + + +

GNS-3199 + + + + + +

GNS-3210 + + + + + + + +

+ + + + + +

GNS-3243 + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + +

GNS-3296 + + + + + +

+ + + + + + + + + + + +

G - 22 + +

G- 87535 + + +

培養細胞

+ + + + + + + +

+ + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + 細胞株

CGNH-89 + + + + + +

CGNH-NM + + + + +

MRCH-92 + + + +

TATE - 87

U87 G + + + + + + + + + これらの結果から、 AMP A Rサブュニットがヒ卜神経膠芽腫細胞で発現すること、及び、 G l u R lと G l u R 4サブュニッ卜が G 1 u R 2サブュニットよりも大量に、しかも安定的に発現していることがわかる。これらの結果は、 G 1 u R 2を除外して集められた C a ²⁺透過性 A MPARがこれらの細胞中で形成することを強く示唆している。

(神経膠芽腫細胞における C a ²⁺透過性 AMP ARの機能的発現）一次培養物中の神経膠芽腫細胞における C a ²⁺透過性 AMP A Rの機能的発現を調べるため f u r a _ 2 AMを使用して AM P Aが誘導する細胞内 [C a ²⁺] i (C a ²⁺濃度）の変化を測定した（第 2図参照）。 AM P ARの脱感作を弱める、 2 0 0 MのAMPAと 1 0 0 Mのサィク口サイァザイド（C T Z) の投与により、培養細胞の [C a ²⁺] iが増大した（第 2図 a、 b及び。；)。 8 0 ± 2 1から 2 8 5 ± 1 2 0 nM (n = 1 5 0 ) への [C a ²⁺] iの増大は、 1 6個の個別培養皿の細胞中、 6 5 ± 1 5 %の細胞で検出された。 [C a ²⁺] iの急増は、移植片の周縁部に位置する長い突起を持つ細胞において時折認められた（第 2図 d、 e及び。

[C a ²⁴] !の増大は、 AM P Aのアン夕ゴニスト、 2 0 Mの 2 , 3 —ジヒドロキシ一 6—二トロ— 7—スルファモイルーベンゾ（F) —キノキサリン（N B Q X) 又は 1 0 Mの [2 , 3—ジォキソ _ 7— ( 1 H 一イミダゾ一ル— 1—ィル）一 6 _ニトロ一 1， 2， 3 , 4—テトラヒドロキノキサリン— 1—ィル]酢酸一水和物（YM 8 7 2 ) のいずれかにより、選択的に消滅した（J. Pharm. Pharmacol. , 50, 795-801, 1998)。これら培養細胞において、 1 0 0 mMの K +が [C a ²⁺]；を増大させることはなかった。このことは、電位依存性 C a ²⁺チャネルがこの [C a ²⁺] iの増大に関与していないことを示している。ビメンチンと G l u R l の発現は、 [C a ²⁺] 則定用に使われた一次培養細胞において、ともに検出された（第 2図 g、 h及び i )。

(アデノウイルスが仲介する AM P A Rサブュニットの発現の作用）神経膠芽腫細胞における C a ² +透過性 AMP ARの病態生理学的意義を明らかにするため、本発明者は、まず、アデノウイルスを介した G 1 u R 2 c D N Aの導入によって C a ²⁺透過性 AM P A Rを C a ²⁺非透過性受容体に変換することを試みた（Science, 292, 926-929, 2001、 NeuroReport, 12, 745-748, 2001)。以下の実験を、主に確立した神経膠芽腫細胞株で行った（第 3図）。かかる細胞株は C GNH— 8 9と称し、 G 1 u R 1及び/又は G 1 u R 4サ 1ブュニットからなる C a ²⁺透過性 A M PARを保有していた。

G 1 u R 2 c D N Aを培養細胞に導入するため、本発明者は 2つの組換えアデノウイルスを作製した。一方は C r e リコンビナ一ゼ発現用の組換えアデ.ノウィルス（Ax CANC r e) であり、他方は C A Gプロモ—夕—、一対の 1 o X p配列、スタッファ一遺伝子及び G 1 u R 2 c DNAからなり、 C r eにより G 1 u R 2の発現を制御するための切替装置を有する G 1 u R 2発現用組換えアデノウイルス（Ax CAL N L G 1 u R 2 ) である。また、アデノウィルス感染細胞のマーカ一として使用されるグリーン蛍光タンパク質（G F P) c DNAを有する組換えアデノウイルス（Ax CAGF P) も作製した。第 3図の aでは、 G 1 u R 1タンパク質を発現する培養細胞（第 3図 b) が Ax CAG F P に感染していた。 G 1 u R 1を発現する細胞の大半で、感染の 2日後に G F Pの蛍光が検出された（第 3図 c )。また、細胞を A x CAN C r e、 Ax CAL NL G 1 u R 2、 Ax CAG F Pの 3種類の組換えアデノウィルスで感染させると、 G F Pの蛍光を発するほとんどすべての細胞で、感染 2日後に G 1 u R 2タンパク質が検出された（第 3図 d、 e及び f )。

この結果、本発明者らは G 1 u R を発現する細胞の形態が著しく変化することに気付いた（第 3図 d、 e及び f )。細胞体は徐々に膨化し、扁平になり、細胞質の突起はウィルス感染後 4日以内に退縮した。こうした特徴的な変化は、 G 1 u R 2の発現が誘導されることのない A X C ALNL G l u R 2及び/又は A x C A G F Pを細胞に感染させた場合には決して見られないものであった。細胞体表面積の平均値は、 Ax C ALNL G l u R 2及び Z又は A x C A G F Pを感染させたコントロール細胞では 3 6 0 ± 1 3 3 m² ( η = 3 0 ) だつたのに対し、 G 1 u R 2を発現する細胞では 1 2 3 0 ± 3 5 0 m² ( n = 3 0 ) に増えていた（ P < 0. 0 5 )。

また、本発明者らは G l u R 2 (R) 発現細胞の細胞骨格が崩壊していること（第 3図 gのコントロール細胞に対する第 3図 hの G 1 u R 2 (R) 発現細胞）、及び、核における泡状突起の出現やアポト一シス小体の形成といった、細胞がアポトーシスの徴候を示していることに気がついた第 3図 i；)。こうした特徴的な変化は、 1 11111又は 1 111 2 (Q) c D N Aのいずれかが導入され、 C a ²⁺透過性 AM P A Rが過剰発現した場合には、決して起こらないものであった。そのかわり、これらは、長い突起を有していることの多い、膨化した紡錘状細胞が高密度に増殖しているという、 C a ²⁺透過性 AMP ARを過剰発現する細胞培養物に共通の特色に、本発明者らは着目した（第 3図：！、 k及び 1 )。

アデノウイルスを介した G l u R 2 (R) 及び G l u R 2 (Q) の発現が誘導した、 C GNH— 8 9細胞における上記の変化は、 U 8 7 M G細胞でも見られた。 G 1 u R 2 (R) 遺伝子が導入されると、 U 8 7 MG細胞の細胞体が膨化し、扁平になった。これに対し、 G l u R 2 (Q) 遺伝子が導入された場合は、長い突起を有する紡錘状細胞の数が増大した（第 3図 m、 n及び o)。

第 3図 p〜xにおいて、本発明者らは、アデノウイルスを介した G 1 u R 2 (R) 又は G l u R 2 (Q) の導入が誘導した、 C GNH— 8 9 細胞における C a ²⁺透過性の変化を確認した。 2 0 0 X Mの AM P Aと I O O Mの C T Zの投与により、 1 0個の培養皿中の 5 2 ± 1 4 %のコント口一ル細胞で、 [C a ²⁺] 9 7 ± 2 1から 2 7 5 ± 5 0 nM (n = 3 5 0 ) に増大した（第 3図 p、 Q及び r )。これと同じ処理を行っても、 4個の培養皿中の G 1 u R 2発現細胞（第 3図 s、 t及び u )では [C a ²⁺]；に何の作用も及ぼさなかったが、 2個の培養皿中の G 1 u R 2 ( Q ) 発現細胞（第 3図 v、 w及び X ) では [C a ²⁺] iが 7 7 ± 2 1から 1 1 8 5 ± 24 0 nM ( n = 4 0 ) に著しく増大した。

本発明者らは、 G l u R 2 (R) を発現する C GNH— 8 9細胞が、ダリァ細胞中で C a ^{2 +}シグナル伝達を仲介することがわかっている AT Pに応答して、 [C a ²⁺] iをコントロ一ル細胞と同程度にまで増大させらるかどうかについても調べた（J. Neurosci. , 18, 8794-8804, 1998)。 2 5 Mの AT Pの投与により、 5個の培養皿中の G 1 u R 2 (R) 発現細胞では [C a ²⁺] iが 7 0 ± 2 4から 1 4 3 8 ± 1 7 4 nM ( n = 5 0 ) に増大した。この増大はコントロール細胞で検出されたものとよく似ていた。コント口一ル細胞では、同じ処理で [C a ^{2 +}]；が 7 7 ± 2 8 から 1 5 7 4 ± 1 6 1 nM (n= 5 0 ) に増大した。このことは、 G 1 u R 2 (R) 遺伝子が導入された細胞が外部刺激に応答可能であることを示している。

次に本発明者らは、ターミナルデォキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（T d T) 仲介 d UT Pニック末端ラベリング（TUN E L) 法 (Science, 267, 1445-1449, 1995) を用いて、 G 1 u R 2 (R) を発現する C GNH— 8 9細胞におけるアポトーシス指数を推定し、この値を Ax CAL NL G l u R 2 (コントロール）'だけを感染させた細胞における値と比較した。アポトーシス指数は、 TUNE L陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジゥム（P I ) 陽性核の合計数で割つたもの、と定義された。各培養皿の平均値を得るため、任意に選択した

1 0から 1 5の視野をサンプルにした。この指数は、 G l u R 2 (R) 発現細胞（n = 4) では 2 0. 2 ±4. 3 %であり、コントロール（ 5. 2 ± 1. 2 %、 n = 4、 P < 0. 0 5 ) よりもかなり大きいものだった。本発明者らは、 K i 一 6 7染色指数（K i 一 6 7陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジゥム（P I ) 陽性核の合計数で割ったもの）を計算することで、 G l u R 2 (R) 発現細胞の増殖活性についても調べてみた（Lab. Invest. , 70, 125-129, 1994)。この指数は、コントロールでは 1 2. 3 ± 2. 3 %で、 G l u R 2発現細胞（R) では < 0. 1 % (n = 4、 Pく 0. 0 0 1 ) であった。これに対し、 C a ^{2 +} 透過性 AMP ARを過剰発現させるための G 1 u R 2 (Q) c DNAを導入したもの（NeuroReport, 12， 745-748, 2001) は、 K i — 6 7染色指数を 2 8. 3 ±4. 8 % (n = 4、 P < 0. 0 1 ) に有意に増大させた。しかし、アポトーシス指数には、有意な変化が検出されなかった（4. 3 ± 1. 3 %)。 C a ²⁺透過性 AMP ARを過剰発現させるための、アデノウィルスを介した G 1 u R 1遺伝子の移動により G 1 u R 1が過剰発現した際、アポトーシス指数と K i 一 6 7染色指数はそれぞれ 5. 3土 2. 3 %と 2 6. 3 ± 4. 5 %だった。 G l u R 2 (Q) を発現する細胞と、 G 1 u R 1を過剰発現する細胞の間には、これら 2つの指数に有意な変化はなかつた。

上記結果から、 C a ²⁺透過性 AMP ARを介した C a ²⁺の流入遮断によつて神経膠芽腫細胞中にアポトーシスの変化が起こることが強く示唆される。そのため本発明者は、 C GNH— 8 9細胞における細胞の形態、アポトーシス指数及び K i 一 6 7染色指数に対する AM PARアン夕ゴニス卜の作用を調べてみた。 2 O Mの N B Q X又は 1 O Mの YM 8 7 2を 2日間用いると、細胞の形態に変化が生じた。つまり、細胞質の突起が退縮し、細胞体が膨化し扁平になり、これはその後の G l u R 2 発現で見られたものと似ていた。さらに、 N B Q X及び YM 8 7 2は、 3. 0 ± 1. 8 %から 1 3. 0 ± 2. 0 % (n = 4 , P < 0. 0 1 )、及び 3. 8土 2. 3 %から 1 8. 0 ± 2. 5 % (n = 4、 P < 0. 0 1 ) へと、アポト一シス指数をそれぞれ有意に増大させた。それらは、 1 8. 5 ± 3. 0 %から 2. 0 ± 1. 0 % (n = 4、 Pく 0. 0 1 )、及び 1 6. 4 ± 3. 5 %から < 0. 1 % (η = 4、 Ρ< 0. 0 1 ) へと、 K i — 6 7染色指数をそれぞれ著しく低下させた。

C a ² +透過性 AMP ARを発現する他の 3つの細胞株（表 1の C GN H— NM、 MR CH— 9 2及び U 8 7 MG) では、 G l u R 2 (R) 発現及び、 N B Q X又は YM.8 7 2の使用によって、培養細胞における同様の形態的変化が生じ、アポト一シス指数が増大し、 1 ー 6 7染色指数が減少した。 G l u R 2 (R) 遺伝子を導入した細胞に、こうした AMP ARアン夕ゴニストを用いると、実験した 4つの細胞株すべてにおいて、細胞の形態とこれら 2つの指数にそれ以上の変化が生じることはなかった。これは、ウィルスを介した G 1 u R 2 (R) の発現と AM P ARアンタゴニストが同一の標的に作用することを示している。

(C a ²⁺透過性 AMP ARによる細胞遊走の促進） '

脳白質の遊走腫瘍細胞は紡錘状の形態を呈しており、長い細胞突起を有している場合が多かった。腫瘍細胞のこうした形態は、細胞の遊走に適していると思われた。実際、腫瘍細胞中の G 1 U R 2の発現により細胞が扁平化し、その突起が退縮した際には、細胞の遊走が著しく阻害された。これに対し、アデノウイルスを介した G 1 u R 2 (Q) の導入による C a ²⁺透過性 AM PARの過剰発現は、細胞突起を伸長させ、細胞遊走挙動を促進しているようだった。細胞遊走の程度を定量的に評価す

9 るため、 2つの実験を行った（第 4図）。

まず、卜ランスゥエルニ重チャンバ一培養皿を用いて、 Z軸方向の運動性活動を概算した。この培養皿は、直径 8 zmの孔が多数あいている多孔質膜で上下に仕切られたチヤンバ一を有していた。上部チャンバ一の細胞に、 Ax CANC r e (コントロール）を感染させずに、 Ax C AG F Pと Ax CALNL G 1 u R 2を感染させると、少数の細胞がかかる多孔質膜を通って 2 4時間以内に下部チャンバ一に移動した。顕微鏡下の 1 0個の 2 0倍の対物視野で計数した遊走細胞の、別個に行った 5回の実験における平均値は、 4. 2 ± 2. 3だった（第 4図 a)。しかし、 G l u R 2 (R) を発現する生存細胞はひとつとして下部に移動せず、ばらばらになった細胞の断片のみが、下部チャンバ一で認められた (第 4図 b；)。これに対し、 G 1 u R 2 (Q) を導入したものは、下部チャンバ一に移動する細胞の数を増加させた（ 3 1. 2 ± 8. 3、 n= 5、 P< 0. 0 2) (第 4図 c )。

次に、クローニングリング (直径 7 mm) を使用して、培養皿中央部の運動性活動を調べた。リングの内側で細胞を培養し、ウィルス感染の 48時間後にリングを取り除いた。その後 24時間以内にクロ一ニングリングによる境界を横切った細胞の数を計数した。 5回の実験の平均値は、 GF P、 G l u R 2、及び G l u R 2 (Q) を発現する細胞で、それぞれ 43. 2 ± 5. 3、 1 5. 0 ± 3. 3、 2 5 0. 2 ± 5 0. 3だつた（第 4図 d、 e及び f )。このように、 G 1 u R 2の発現は、細胞の運動性を有意に抑制していた（P< 0. 0 0 2 ) のに対し、 G l u R 2 (Q) の発現は細胞の運動性を促進していた（P< 0. 0 1 )。

腫瘍遊走に対する同様の阻害作用は、 1 0 の YM 8 7 2を用いた場合も観察された。 G 1 u R 2遺伝子の導入と YM 8 7 2の使用により、 C a ²⁺透過性 AMP ARを発現する他の 3つの細胞株でも、細胞遊走が阻害された。

(ヒト神経膠芽腫のヌ一ドマウスモデルにおける、 G 1 u R 2発現及び AMP Aアンタゴニストによる腫瘍の浸潤の抑制）

本発明者は最後に、インビポでの神経膠芽腫の遊走及び増殖に、 G 1 u R 2 (R) の発現が影響するかどうかについて調べた（第 5図）。この目的のため、まず本発明者は、 Ax C AGF Pを用いて GF Pを標識した 2 X 1 0⁵個の C GNH— 8 9細胞をヌ一ドマウスの大脳皮質下に移植したヒト神経膠芽腫のマウスモデルを使用した。これら移植した細胞は細胞の集合体を形成し、ヒトの外科的試料に見られるように脳梁の有髄経路に浸潤し、実験した 1 5匹のヌードマウスすべてにおいて、脳全体に広範囲に広がっていた。ヌードマウス異種移植片の組織構造は、ヒト神経膠芽腫の特徴、つまり、多形性（第 5 図 a )、偽柵状配列 (pseudopalisading) を伴う壊死（第 5図 b)、及び微小血管の増殖（第 5図 c ) を示していた。

第 5図 bは、 G F Pだけを発現させるために A X C A G F P及び A X CALNL G 1 U R 2を感染させた 2 X 1 0⁵個の細胞の移植から 9 日後に皮質下で形成された、腫瘍細胞集合を示している。細胞核を P Iで染色したかかる腫瘍細胞は密度が高く、接種部位の細胞中に G F Pが検出された（第 5図 e )。これに対し、 G l u R 2と G F Pの両方を発現させるために、 Ax CAG F Pとともに Ax CAL NL G l u R 2 と A x C AN C r eを感染させた後で、同数の細胞を接種すると、実験した 1 3匹のヌードマウスのいずれにも、固形の腫瘍細胞集合は形成されなかつた（第 5図： f )。 P I染色後の核形態から判断したとおり、腫瘍細胞は増殖を停止し、アポトーシスが始まった（第 5図 g)。

C a ²⁺透過性 AM P ARを操作することでィンビポでの腫瘍の成長に変化が生じるかどうかをさらに定量的に評価するため、 C GNH— 8 9 細胞をヌードマウスの皮下組織に移植して作製した腫瘍の成長に対して.

0 1 11 2と 1 11 .2 (Q) の発現及び/又は A M P A Rアンタゴニストの YM 8 7 2の使用が及ぼす作用を調べた（第 6図） - (第 6図 a及び b )₀ アデノウイルスを介した G 1 u R 2の発現は、腫瘍に Ax C AN C r eを感染させずに Ax CALNL G l u R 2を感染させた（n= 1 2、 P< 0. 0 0 1 ) 場合と比較して、移植の 2 2 日後の腫瘍のサイズだけではなく腫瘍の成長速度を有意に抑制した。 G 1 u R 2 (Q)の発現は、腫瘍の成長を促進する傾向があつたが、移植の 2 2 日後の腫瘍のサイズを増大させることはなかった。 YM 8 7 2を腹腔内投与すると、ビヒクル（リン酸緩衝液； P B S) (n= 1 2、 P< 0. 0 0 1 ) を投与した場合と比較して、腫瘍のサイズが有意に縮小した。 G l ii R 2 (Q) を発現する腫瘍（n = 1 2、 P< 0. 0 0 1 ) の成長も阻害されたが、 G 1 u R 2を発現する腫瘍についてはそれ以上の阻害作用を及ぼさなかった, 組織学的分析により、ビヒクル単独で処理した腫瘍細胞に多数の分裂細胞が存在することがわかった（第 6図 c )。 YM 8 7 2で処理した腫瘍組織（第 6図 d)、又は G 1 u R 2を発現する腫瘍組織（第 6図 e及び f ) において、分裂細胞はほとんど検出されなかった。そのかわり、多数のアポトーシス細胞が観察された。 G l u R 2 (Q) を発現する腫瘍細胞の増殖は YM 8 7 2の使用により阻害された（第 6図 g、 h及び i )。また、 YM 8 7 2による処理で G 1 u R 2を発現する細胞における腫瘍の増殖がそれ以上阻害されることはなかった（第 6図：！）。

[実験の考察]

神経膠芽腫の患者から得た外科的試料において、有髄経路中の遊走細胞は紡錘状又は両極性の形態を呈しており、 G 1 u R 1及び Z又 G 1 u R 4タンパク質を豊富に発現していた。かかる外科的試料由来の移植体培養物の周辺部に位置する遊走細胞も、長い細胞突起を有する場合が多い紡錘状の形態を呈しており、 G 1 u R 1を発現していた。アデノウィルスを介した G 1 u R 1又は G 1 u R 2 (Q) の導入によって C a ²⁺透過性 AMP A Rが過剰発現すると、長い細胞突起を有する紡錘状の形態を呈している遊走細胞の数が増大した。これに対し、腫瘍細胞の運動性は、 G l u R 2 (R) の発現によって細胞の形態が多角形化し扁平化した後、著しく抑制された。紡錘状の形態ゃ膨化した突起は、細胞遊走に適していると思われる。紡錘状の形態によって、密集した有髄経路又は CN S組織中の狭い空間に、腫瘍細胞が浸潤できると考えられるからである。

細胞突起の伸長は、細胞遊走の第一歩と考えられ、その後で細胞体の移動及び後部突起の退縮が続く（Cell, 84， 371-379, 1996)。グリア細胞と C a ^{2 +}透過性 A M P A Rの形態間の因果関係について、 G 1 u R 2 (R) の発現がグリア突起の著しい退縮を引き起こす一方で、 G l u R 2 (Q) の過剰発現が、マウス小脳のベルクマングリア様培養細胞 (Bergmann glia-like cultured cells) におけるそれらの膨化を引き起こすことを、本発明者は以前に示している（NeuroReport, 12, 745-748, 2001)。しかし、 C a ^{2 +}透過性 AMP ARを介したグリア突起の膨化に関与する詳しい機構は、いまだ解明されていなかった。

本実験において、本発明者は、 C a ^{2 +}透過性 AM P A Rの C a ^{2 +}非透過性受容体への変換が、アポ卜一シス指数を増大させ、腫瘍細胞の増殖活性を抑制することを示した。このように、抗アポトーシスシグナル伝達カスケ一ドを刺激するには、こうした受容体を通じた C a ² +の流入が必要と思われる。この考察は、適量の C a ^{2 +}の流入は、小脳顆粒細胞及び N B 1 0 8神経芽細胞腫細胞など、いくつかの培養細胞の生存に必須であるという以前の知見により裏付けられる（J. Neurosci. , 7, 2203-2213, 1987、 Pro Nat 1. Acad. Sci. USA, 86, 6421-6425, 1989、 Nature, 396, 584-587, 1998)。 Yano et al · (Nature, 396, 584-587, 1998) は、 N B 1 0 8神経芽細胞腫細胞において、 N—メチル—D—ァスパラギン酸（NMD A) 受容体を介した C a ² +の流入により供給された C a ^{2 +}が、 C a ^{2 +}/カルモジユリン依存性プロティンキナ一ゼキナーゼ（C a M- KK) を活性化し、次にはそれがセリン/スレオニンキナーゼ、 A k t (プロテインキナーゼ B) をリン酸化することを明確に示した。 A k tの活性化で各種抗アポトーシスシグナルが放出されることは知られており、それにより細胞の生存も促進される（Nature, 396, 584-587, 1998

AM P ARの内在性ァゴニストはグルタミン酸である。本実験における培養培地にはゥシ胎児血清（F C S) 及び最大で 1 0 0 Mのグルタミン酸が添加されていた。グルタミン酸の存在は、腫瘍細胞の増殖のみならず、紡錘状の形態を維持するうえでも必須であった。 1 0 %の透析済 F'C Sを添加したダルタミン酸を含まない培地で細胞を 4〜 5 日培養すると、かかる細胞は多角形の形態を有するようになり、アポト一シス細胞の数が増加した。こうした変化は 1 0 0 Mのダルタミン酸を添加すると元に戻った。明らかな疑問点は、 C a ^{2 +}透過性 AMP ARを活性化するのに充分な濃度のグルタミン酸が増殖し、遊走している脳内の腫瘍細胞に実際に供給されているのか否かということである。移植した神経膠腫細胞が引き続きグルタミン酸を分泌し、その結果、細胞外ダル夕ミン酸が検出可能な程度に増大すること、及び、グルタミン酸の放出が多い神経膠腫は、明らかな成長上の優位性をもつことがわかっている (Nature Med. , 7, 1010-1015, 2001)。星状細胞が各種サイト力イン及び成長因子を分泌する場合と同様に自己分泌という形で、神経膠芽腫細胞がグルタミン酸を分泌している可能性が高い（Nature, 391, 281- 285, 1998、 J. Neuropathol. Exp. Neurol. , 57, 653-663, 1998)。 NMD A及び AM PA受容体のアン夕ゴニストはともに、神経膠腫細胞及び神経芽細胞腫細胞を含む多様な型の腫瘍細胞の増殖と遊走を阻害することがわかっている（Nature Med. , 7, 1010-1015, 200K Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6372-6377, 2001)。本研究において、本発明者らはじ a ^{2 +}透過性 AM P ARがヒト神経膠芽腫細胞の遊走及び増殖を促進するうえで重要な役割を果たしていること、及び、 G l u R 2の発現又は YM 8 7 2による C a ² +透過性 AMP A Rの遮断が、腫瘍の成長を効果的に抑制することを示した。このように、 C a ^{2 +}透過性グルタミン酸受容体は、脳腫瘍治療の標的となると考えられる。

[実験に用いた手法]

(外科的試料と細胞培養物）

本実験で調べた 1 6個の外科的試料の組織構造を、 WHO分類に従つて多形性神経膠芽腫と診断した。文献（Acta Neuropathol.， 94, 425-435, 1997、 J. Neurosci. Res. , 51, 526-535, 1998) 記載のとおり、細胞培養物を調製した。神経膠芽腫の 4細胞株のうち、 C GNH— 8 9は高い発ガン性を示すため、ヌードマウスへの異種移植に使用した。 1 0 %の F C S及び 2 m Μのグルタミンを添加した Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) (Li fe Technologies社製）で、細胞を培養した。酵素循環法により定量したこの培地のグルタミン酸濃度は、 1 0 7 ± 5 xM ( n = 4 ) だった（Brain Res., 573, 197-203, 1992)。

(アデノウイルスベクタ一を用いた遺伝子移植）

本発明者らは、下記の組換え型アデノウイルスを作製した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320-1324, 1996、 Nucl. Acids Res. , 23, 3816-3821, 1995)。

( 1 ) Ax CAL NL G 1 u R l , Ax CAL NL G 1 u R 2及び A x CAL NL G l u R 2 (Q)：それぞれ、ラット G l u R l、 G l u R 2 及び G l u R 2 (Q) を発現させるための発現切替ユニットで、 CAG プロモータ一、 1 o x P配列、スタッファー（stuffer) 遺伝子（ネオ耐性遺伝子）、ポリ（A) シグナル、第二 1 o X P部位、 G 1 u R 1、 G 1 u R 2又は G l u R 2 (Q) コーディング配列、及びもうひとつのポリ (A)シグナルで構成されている（Mol. Brain Res. , 65, 176-185, 1999)。ラット G 1 u R 1及び G 1 u R 2 c D N Aは、 S. Heineraann博士及び M. Hollmann博士より供与された。

( 2) Ax CAN C r e及び A x CAGF P : C r e リコンビナ一ゼ及び E GF P (Clontech社製）をそれぞれ発現させるための組換え型アデノウィルス。実験の 2〜 5日前に、感染の多重度（MO I ) 5で、細胞を各組換え型アデノウイルスに感染させた。

(組織構造）

文献（NeuroReport, 12, 745-748, 2001、 Acta Neuropatho 1. , 94, 425-435, 1997) 記載のとおり、 G l u R l、 G l u R 2、 G 1 u R 2 / G l u R 3、 G l u R 4 (Chemicon社製）、 G F A P (Virchows Arch. A Pathol. Anat. His topathol. , 405, 299-310, 1985)、及びビメンチン（V 9、 Dakopatts A/S 社製）に対する選択性抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行った。ジァミノベンチジンで、免疫応答性を視覚化した。二重免疫蛍光法のため、 F I T C、口一ダミン、及び Alexa 594で標識した二次抗体（Molecular Probe 社製）を用いて、結合した坊体を視覚化した。染色した細胞を、共焦点レーザ一顕微鏡（MRC-1024E、 Bio- Rad社製）で観察した。 Kondo et al. (J. Neurosci. , 17, 1570-1581, 1997) が記載したものと同じ方法で、 in situ ハイブリダィゼーシヨンを行つた。

(逆転写ポリメラ一ゼ連鎖反応（RT— P C R))

試料から調製した RN Aの部分標本 1 0 O n gをランダムへキサマー (ロッシュ · ディアグノテイクス社製）を用いて逆転写し、 G l u R l から G l u R 4 (Neuron, 12, 383-388, 1994) を同時に増幅したプライマー（センスプライマー： 5 ' - C CTTTGGC CTAT GAGAT C TGGATGTG- 3 ' (配列番号 1 )、ァンチセンスプライマ一: 5 ' - T C GTA C C A C C ATT T GTTTTT CA- 3 ' (配列番号 2 )) を用いて、逆転写産物を 94°Cで 2 0秒間変性させ、 5 0°Cで 2 0 秒間ァニーリングし、 7 2°Cで 2 0秒間伸長反応させるという条件下で P C Rサイクルを 3 5回繰り返した。

G 1 u R 1 ( 1 7 1 2から 1 7 3 3番目の塩基配列： 5 ' - A AG A G G G A C G AG A C C AG A C A A C— 3 ' (コーディング配列の最初のヌクレオチドである位置 1 ；配列番号 3))、 G 1 u R 2 ( 1 7 3 2 から 1 7 5 5番目の塩基配列： 5 ' -GAAGATGGAAGAGAA AC AC AAAGT- 3 ' (配列番号 4))、 G 1 u R 3 ( 1 74 9から 1 7 7 1番目の塩基配列： 5 ' — GGAAGACAACAATGAAG AAC CT C— 3 ' (配列番号 5 )) 力、、または G 1 u R 4 ( 1 7 47から 1 7 6 6番目の塩基配列： 5 ' — GAAGGAC C CAGC GAC C AGC C— 3 ' (配列番号 6)) の特異的なセンスプライマー、及び、 1 回目の増幅に使用した共通アンチセンスプライマーを用いて、サブュニットを特異的に増幅するための 2回目の P C R ( 3 5サイクル）を行つた。この 2回目の増幅による産物（G l u R lは 6 3 7 b p、 G 1 u R 2は 6 3 8 b p、 G l u R 3は 6 5 7 b p、 G l u R 4は 6 2 6 b p) を、 G l u R lには B g l l、 G l u R 2には B s p l 2 8 6 I、 G 1 u R 3には A v a I、及び G 1 u R 4には P v u II というように、特異的な制限酵素を用いて分解した。

(細胞内 C a ²⁺イメージング）

室温で 4 0分間、細胞に f u r a _ 2 AM (Dojin社製）を負荷した。 W

Argus/HiSCA system (Hamamatsu Photonics 社製）を使用して、励起波長 34 0 nmと 3 8 0 nmで、蛍光ィメージを得た。 34 0/ 3 8 0の蛍光比を、文献（Cell, 88, 49-55, 1997) 記載のとおりに [C a ² +] _;に変換した。

(TUNE L、増殖及び遊走の分析）

TUN E L及び細胞増殖の分析のため、標準培養培地を満たした Lab-Tek 4-well ガラススライドに、 2 X 1 0⁴個ノゥエルの密度で細胞を載せた。載せてから 6時間後に培地をグルタミン酸を含まないものと取り替え、細胞にアデノウイルスを感染させた。載せてから 48時間後、グルタミン酸（ Ι Ο Ο ^Μ) を培地に添加し、感染 5 日後に細胞を固定した。 In Situ Cell Death Detection kit (MB L社製）を用いて TU NE L分析を行い、抗 K i 一 6 7モノクローナル抗体（Dako社製）染色指数を用いて細胞増殖分析を行った。遊走分析は、トランスゥエル · チヤンバー（孔径 (Corning Corstar Corp.社製）中で行った。上部チャンバ一に 5 X 1 0⁴個ダウエルの密度で細胞を載せた。載せてから 6時間後に、 1 0 %の透析済 F C Sを添加した、グルタミン酸を含まない培地で、かかる細胞に組換え型アデノウイルスを感染させた。感染の 4 8時間後、グルタミン酸（ Ι Ο Ο ^Μ) を培地に添加した。細胞をさらに 24時間培養し、多孔質膜を通過して遊走した細胞の数を対物 2 0倍の顕微鏡で計数した。

また、別の遊走分析実験で、一方の端部をシリコングリースでコーテイングしたガラス製クローニングシリンダー（直径 7 mm) を培養皿の中央に置いた。シリンダーの中に 2 X 1 0⁴個の細胞を入れた。感染の 48時間後、クローニングリングを除去し、細胞をさらに 2 4時間培養した。その後、クローニングリングによる境界を越えた細胞の数を計数した。 (動物モデル）

培養培地中に C GNH— 8 9細胞を 1 X 1 0⁷ / 1 0 0 /X 1 で懸濁した。 A x C AG F P及び Ax CAL NL G 1 u R 2を感染させ、さらに A X C AN C r eを感染させた懸濁液、或いは感染させなかった懸濁液の部分標本 2 ^ 1 を、エーテル麻酔下のヌードマウスの脳に定位的に注入した。そして、注入の 9〜 1 4日後に脳組織を調べた。

また、腫瘍の成長に対するアデノウィルスによる G l u R 2 (R) 及び G 1 u R 2 (Q) の発現の効果を、 AMP A型ダルタミン酸受容体拮抗薬である YM 8 7 2を用いたものと、用いないものについて、皮下腫瘍中で定量的に評価した。細胞懸濁液（ 1 Χ 1 0 ⁷/ 1 0 0 /ζ 1 ) を、 5〜 6週齢（体重 1 8〜 2 0 g)のヌ一ドマウスの脇腹に皮下注射した。アデノウィルス（ 1 X 1 0⁷ P F U、全量にして I O O Iの P B Sで稀釈）を、腫瘍接種後 5 日目に、 2 7番の針を用いて腫瘍内に一度投与した。 A X C AN C r eを含まない A X C A L N L G 1 u R 2を、コントロ一ル用に投与した。

Yamanouchi Pharmaceutical Company より供与された YM 8 7 2を P B Sに溶解させた。投与量 1 0mg/k g、 5 0 m g / k g , 及び 1 0 OmgZk gで YM 8 7 2を 2週間にわたって毎日腹腔内注射した（腫瘍接種の 1 日後に開始した）ところ、腫瘍の成長が投与量依存的に阻害されているのが観察された。この一連の実験では、 l O Omg/k gの YM 8 7 2を使用した。コントロールとして、 P B S ( 1 0 0 ^ 1 ) を腹腔内に投与した。（縦 X横²) / 2という公式にしたがい、腫瘍の容積を計算した。各実験の最後に、腫瘍組織の組織学的分析を行った。

(データ分析）

データは、平均士 s . e . mとして表されている。無対 t検定又は一元配置分散分析（ A N O V A s : Schef fe s test for post-hoc comparison) により、統計上の比較を行った。

[図の説明]

(図 1 ヒト神経膠芽腫細胞で発現した AMP A受容体を示す写真） a〜 c ；外科的標本原本の連続切片である。 a ; へマトキシリンーェォシン（HE) で染色した浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積を示す。 b ； in situ ハイブリダイゼーションで検出した G 1 u R 1 mRN Aの発現（二トロブルーテトラゾリゥムクロライド、青色）を示す。 c ； G 1 u R lの免疫蛍光法（ローダミン、赤色）によるイメージを示す。

d〜 g ；外科的標本原本の連続切片（GN S— 3 1 4 8 ) でぁる。（1 ；浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積（HE染色）を示す。 6 ; 抗0 1 1 1^ 1 抗体を用いた免疫染色である。 f ；抗 G 1 u R 2抗体を用いた免疫染色である。 g ；抗 G 1 u R 4抗体を用いた免疫染色である。

h〜 k ； d〜gと同じ標本の隣接組織である。 h ；大脳皮質の浸潤腫瘍細胞（HE染色）である。 i、 j 及び k ；抗 G 1 u R 1抗体、抗 G 1 u R 2抗体及び抗 G 1 u R 4抗体をそれぞれ用いた免疫染色を表す。

1〜 n ；抗 G 1 u R 1抗体（Alexa 594、赤色）（ 1 ) 及び抗 G 1 u R 4抗体（F I T C、緑色）（m) を用いた免疫染色、並びに一次培養の腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ（n) を表す。

o〜 Q ；抗 G 1 u R 1抗体（Alexa 594、赤色）（ o ) 及び抗 G 1 u R 2抗体（F I T C、緑色）（p) を用いた免疫染色、並びに腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ（Q) を示す。 Q中のスケールバ一は、 a〜gについては 1 0 0 m、 h〜（！については 5 0 xm。

r〜 s ； —次培養の腫瘍細胞（ r ) 及び切除前の腫瘍細胞に隣接していた正常な脳組織（ s ) における、 G 1 u R 1〜4に特異的なプライマ —を用いた RT— P C R分析結果である。 rと sの両方において、右と左の 4レーン（R 1から R 4) は、各 G l u R l〜4 DN Aに特異的な制限酵素による分断の前後における P C R産物の電気泳動を、それぞれ示すものである。右側のレーンにある分断した断片の大きさ： B g 1 I で切断した G l u R lについては 1 8 9及び 44 8 b p、 B s p 1 2 8 6 Iで切断した G 1 u R 2については 3 6 8及び 2 7 0 b p、 A v a I で切断した G 1 u R 3については 4 2 0及び 2 3 7 b p、 P v u IIで切断した G l u R 4については 3 7 9及び2 4 7 13 。レーン φは、密集した 5 0 0 b pバンドをそなえた DNAサイズマ一力一を示す。

(第 2図培養腫瘍細胞における、 AMP Aが誘導した [C a ^{2 +}] iの変化を示す写真）

a〜 c ; f u r a _ 2 AMを負荷した一次培養の腫瘍細胞における、

AMP Aが誘導した [C a ^{2 +}]；の増加を示す。励起波長 3 4 0 nmでの蛍光ィメ一ジ（ a)、並びに 2 0 0 ^1^の八！^?八及び 1 0 0 Mの C T

Zに曝露する前（b) 及び曝露中（ c ) における、 3 4 0 Z 3 8 0 nm 比の仮染色イメージを示す。

d〜 f ；移植片培養物から取り出された単層中の細胞における、 AM p Aが誘導した [C a ^{2 +}] iの増加を示す。これは、 a〜 cと同じ装置でイメージを撮影した。

g〜 i ；ビメンチン（g、 F I T C、緑色）及び G 1 u R 1 (h、口ーダミン、赤色）の二重免疫蛍光法並びにそれらを組み合わせたィメ一ジ（ i ) を表す。 f 中のスケ一ルバ一は、〜にっぃて 2 0 111、 i 中のスケ一ルバ一は、 a〜 c及び g〜 i について 1 0 0 mを示す。 (第 3図アデノウィルスが介する AM P A受容体サブュニットの発現の作用を示す写真）

a〜 c ；コントロール。培養細胞（C GNH— 8 9 ) に A x CAG F Pと Ax C AL NL G 1 u R 2を感染させ、 Ax CAN C r eを感染させなかった。 G F P蛍光（ a)、 G 1 u R 1の免疫蛍光法（ b )、及びそれらを組み合わせたイメージ（ C ) である。

d〜 f ； G 1 u R 2を発現する細胞である。 Ax CAGF P、 Ax C ALNL G l u R 2、及び A x C A N C r eを感染させた。 GF P蛍光 ( d)、 G 1 u R 2の免疫蛍光法（ e ) 及びそれらを組み合わせたィメージ（ f ) である。

g ；コンドロール用に Ax CAL NL G 1 u R 2のみを感染させ、ビメンチン（F I T C、緑色）とヨウ化プロピジゥム（P I ) (赤色）で二重染色した細胞である。 '

h ;Ax CAL NL G 1 u R 2と Ax CANC r eを細胞に感染させ、ビメンチン（F I TC、緑）と G l u R 2 (ローダミン、赤）を対象として二重染色した細胞である。 G 1 u R 2タンパク質発現細胞中の分断したビメンチンフィラメントに注目のこと。

i ； Ax CAGF P、 A X C A L N L G 1 u R 2及び A X C AN C r eを細胞に感染させ、 P Iで染色した細胞である。アポト—シス小体及び核における泡状突起形成に注目のこと。

j 〜 1 ； G 1 u R 1を過剰発現する細胞である。それらの細胞を、 A x CALNL G 1 u R l及び Ax CANC r eを用いて感染させた。ビメンチン（ j 、 F I T C、緑色）及び G 1 u R 1 (k、口一ダミン、赤色）の免疫蛍光法及びそれらを組み合わせたイメージ（ 1 ) を示す。

m〜 o ； Ax CAGF P (m)、 Ax CAG F P、 Ax CAL NL G 1 u R 2及び Ax C AN C r e (n)、並びに Ax CAGF P、 A x C AL N L G 1 u R 2 (Q) 及び Ax CANC r e ( o ) を感染させた U 8 7 一 MG細胞である。それらを G 1 u R 2 (ローダミン、赤色）を対象として染色した。 G F P及び G 1 u R 2の免疫蛍光法の、組み合わせたィメ一ジを示す。 i中のスケールバーは、 a〜 f 及び！〜 oについては 1 0 Ό rn, g〜 i については 2 0 m。 p〜x ; f u r a - 2 AMを用いた [C a ²⁺] jの測定の結果を表す。コントロールの C GNH— 8 9細胞（p〜r ) 並びに G l u R 2 ( s〜 u) 及ぴ G l u R 2 (Q) (v〜x) を発現する細胞である。左から右に向かって、励起波長 3 4 0 nmでの蛍光イメージ、 2 0 0 / Mの AMP A及び 1 0 0 Mの C T Zに曝露する前及び曝露中における、 3 4 0ノ 3 8 0 nm比の仮染色ィメージである。

(第 4図 G l u R 2及び G l u R 2 ( Q ) の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す写真）

a〜c ；トランスゥエルニ重チャンバ一を用いて調べた腫瘍細胞の運動性を示す図である。多孔質膜下にある下部チャンバ一中の細胞の共焦点顕微鏡像である。抗 G 1 u R 2抗体（ローダミン、赤色）及び抗ビメンチン抗体（F I T C、緑色）で細胞を染色した。 a ; Ax CAL NL G 1 u R 2を感染させ、 Ax C AN C r eを感染させなかった細胞である。ビメンチンを発現する細胞のいくつかは遊走して、 2 4時間以内に多孔質膜を通過していた。 b ； G 1 u R 2を発現させるために Ax C A NC r eと Ax CAL NL G l u R 2を感染させた細胞である。 2 4時間後に下部チャンバ一で認められたのは、分断された細胞の断片のみであった。 c ； G 1 u R 2 (Q) を発現させるために A x CAN C r e及び A x C A L N L G 1 u R 2 (Q) を感染させた細胞である。 aよりも多数の腫瘍細胞が遊走して、 24時間以内に多孔質膜を通過していた。

d〜 f ；クロ一ニンダリングを用いて調べた腫瘍細胞の運動性を表す。 Ax CAL NL G l u R 2のみ（d、コントロール）、 G 1 u R 2発現細胞（ e )、又は G l u R 2 (Q) 発現細胞（ f ) を感染させた細胞の、クローニングリング除去後 24時間以内の遊走を示す。抗ビメンチン抗体及び抗 G 1 u R 2抗体で細胞を染色した。白線はクローニングリングによる境界を示す。 f 中のスケールバ一は、 a〜 cについては 5 0 m、 d〜 f については 1 0 0 mを示す。

(第 5図 G l u R 2の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す写真） a ~ c ；培養した神経膠芽腫細胞のヌードマウス皮下への移植により形成された腫瘍の組織病理を表す。かかる腫瘍は、多形性（ a )、 pseudopalisading を伴う壊死（b)、及び微小血管の増殖（c ) を特徴としている。図中「v」は腫瘍血管（HE染色）を示す。

d ； 2 X 1 0⁵個の培養神経膠芽腫細胞の、ヌードマウスの大脳皮質下領域への移植後 9日目における腫瘍形成状況を表している。 G F P (緑色）を発現させるため、移植の 2日前に、 A X C A G F P及び A X C A L NL G 1 u R 2を培養細胞にそれぞれ MO I 5で感染させ、 P I (赤色）で染色していた。 e ； dのボックス部分の拡大図である。

f ； 2 X 1 0 ⁵個の培養神経膠芽腫細胞の移植後 1 4日目における細胞である。 G F Pと G 1 u R 2をともに発現させるため、移植の' 2 日前に、 Ax CAG F P、 Ax CALNL G l u R 2、及び Ax CAN C r eを培養細胞にそれぞれ MO I 5で感染させていた。

g ； f のボックス部分の拡大図である。 G 1 u R 2の発現により生じた核のアポトーシス状形態に注目のこと。 g中のスケールバ一は、 a、 e及び gについては 5 0 m、 bについては 1 0 0 m、 cについては 7 5 τη, dについては 1 5 0 0 /zm、及び f については l O O O ^m を示す。

(第 6図 AMP A受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図） a ；各種の処理が、ヌードマウスの皮下組織に移植した腫瘍の成長速度に及ぼす作用： P B Sの注入（YM 8 7 2の使用に対するコントロ一ルとしてのビヒクル、（V) ； G 1 u R 2 (Q) の発現（口）； A X C AN C r eを含まない A x CAL NL G 1 u R 2の注入（G 1 u R 2及び G 1 u R 2 ( Q) を発現させるためのコントロールとしてのベクター、 (秦）； G 1 u R 2 (Q) の発現及び YM 8 7 2の使用（△) ; G 1 u R 2の発現（令）； YM 8 7 2の使用（画）； G l u R 2の発現及び YM 8 7 2の使用（▲)。各処理には、 1 2匹の動物を使用した。各区画は腫瘍容積の平均土 s . e . m. (n = 1 2 ) を表す。

b；接種の 2 2 日後に測定した腫瘍容積の区画を表す。各処理のため、 1 2匹の動物から得た生データを割り振った。 *はコントロール（ビヒクル又はベクターのいずれか）に関する p< 0. 0 0 1での有意な差異を示す。

c〜； f ；ビヒクル（c ) 及び YM 8 7 2 (d) で処理した腫瘍組織、及び G 1 u R 2遺伝子が送達された腫瘍組織（ e、 f ) の組織構造を表す。 c、 d及び e ； HE染色である。 f ；抗 G 1 u R 2抗体を用いた免疫染色である。

g〜！ 1 ； G 1 u R 2 (Q) 遺伝子が送達された腫瘍組織における HE 染色（ g) 及び抗 G 1 u R 2抗体を用いた免疫染色（h) である。

i ； YM 8 7 2で処理した、 G 1 u R 2 (Q) を発現する腫瘍組織の HE染色を表す。

j ； YM 8 7 2で処理した、 G 1 u R 2を発現する腫瘍組織の HE染色を表す。 c〜 j の組織は、腫瘍接種の 2 2日後に採取したものである。 j 中のスケールバ一は、 c〜 j について 5 0 mを示す。産業上の利用可能性

本発明により、動物の発症する脳腫瘍細胞において、 AMPA型ダルタミン酸受容体サブュニッ卜による C a ^{2 +}透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができる。特に、本発明により、 AM P A型グルタミン酸受容体サブユニット G 1 u R 2の遺伝子を脳腫瘍細胞に導入することにより、脳腫瘍細胞における C a ^{2 +}透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができるため、最も悪性であり、遊走性及び湿潤性の高い腫瘍として知られている神経膠芽腫のような脳腫瘍の治療に有効な手段となる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、 A M P A型ダルタミン酸受容体サブュニットの発現を検出 ·測定することにより、脳腫瘍細胞の増殖 · 浸潤活性を測定することを可能とするため、該方法を用いて、脳腫瘍の悪性度を把握することが可能であり、脳腫瘍の診断や予防或いは治療のための有力な手段となる。

Claims

請求の範囲

1. 動物の発症する脳腫瘍細胞において発現する AMP A型ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

2. ダルタミン酸受容体サブュニットによる C a ^{2 +}透過性の制御を、動物の発症する脳腫瘍細胞に、 AMPA型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことを特徴とする請求項 1記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

3. AM P A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子が、 AMPA型グルタミン酸受容体サブュニット G 1 U R 2の c DNAであることを特徴とする請求項 2記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

4. 動物の発症する脳腫瘍細胞に、発現ベクターを用いて、 AMPA型グルタミン酸受容体サブュニット G 1 U R 2の遺伝子を導入し、発現させることを特徴とする請求項 2又は 3記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

5. 発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクタ一であることを特徴とする請求項 4記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

6. 脳腫瘍細胞が、神経膠芽腫細胞であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。

7. AM P A型ダルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の遺伝子を、脳腫瘍細への遺伝子導入 ·発現用ベクターに組み込んだことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター。

8. 発現ベクターが、アデノウイルスベクタ一であることを特徴とする請求項 7記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現べクタ一。

9. 請求項 7又は 8記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクターをセットしたことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット。

1 0. 動物の発症する脳腫瘍細胞における AMP A型グルタミン酸受容体サブュニッ卜の発現を検出 ·測定することを特徴とする脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性の測定,方法。

1 1. グルタミン酸受容体サブユニットの発現の検出 ·測定が、 AMP A型グルタミン酸受容体サブュニット G 1 u R 2の検出 ·測定であることを特徴とする請求項 1 0記載の脳腫瘍細胞の増殖 ·浸潤活性の測定方法。