JP2003507008A - 後根神経節におけるヒトナトリウムチャンネルの調節 - Google Patents
後根神経節におけるヒトナトリウムチャンネルの調節Info
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Abstract
Description
tant)の新規なヒトナトリウムチャンネルおよびそれに関連するヌクレオチ
ド、並びに、急性若しくは慢性の痛み、あるいはその他の興奮性過敏症の治療に
有効な薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本出願は、19
98年1月29日に出願された米国仮出願60/072990、1998年11
月20日に出願された米国仮出願60/109402、1998年11月20日
に出願された米国仮出願60/109666、1999年1月29日に出願され
たPCT国際出願PCT/US99/02008、および1999年7月16日
に出願された米国特許出願09/354147とに関連しており、これらは、そ
の全体が参考文献として本明細書に援用されている。
あり、興奮性細胞(ニューロンおよび筋繊維)に、電気インパルスを引き起こし
伝播させる分子バッテリーとして機能している。ラットの脳由来の電位依存性N
a+チャンネルは、小孔を形成するaサブユニット(260KDa)と、aサブ
ユニットの特性を調節し得る2つの補助的サブユニット、b1(36KDa)お
よびb2(33KDa)との3つのサブユニットからなる。細胞膜を通してNa
電流を発生させる機能的なチャンネルを形成するには、aサブユニットのみで十
分である(Catterall, (1993) Trends Neurosci. 16, 500-506; Isom et al., (
1994) Neuron 12, 1183-1194)。脊椎動物においては9個の別個のaサブユニッ
トが同定されており、これらは、ある拡大している遺伝子ファミリーのメンバー
によってコードされている(Goldin (1995) Handbook of receptors and channe
ls (North, editor) CRC Press; Akopian et al., (1996) Nature 379, 257-262
; Akopian et al., (1997) FEBS Lett. 400, 183-187; Sangameswaran et al.,
(1996) J. Biol. Chem. 271, 5953-5956)。また、それらのうちの幾つかに対応
したオルソログが、ヒトを含む種々の哺乳類種からクローニングされている。特
定のaサブユニットは、組織および発育に対して特異的に発現される(Beckh et
al., (1989) EMBO J. 8, 3611-3616; Mandel, (1992) J. Membr. Biol. 125, 1
93-205)。電位依存性ナトリウムチャンネルのaサブユニットの異常発現パター
ンまたは変異は、ヒトおよび動物における数々の障害の根底にある(Roden & Ge
orge, (1997) Am. J. Physiol. 273, H511-H525; Ptacek, (1997) Neuromuscul.
Disord. 7, 250-255; Cannon, (1997) Neuromuscul. Disord. 7; 241-249; Can
non, (1996) Trends Neurosci. 19, 3-10; Ruzzo et al, (1996) Eur. Neurol.
36, 3-12)。
にするが、同じような予測構造を持つ4つのドメイン(D1−4)からなり、こ
れらのドメインは、3つの細胞内ループ(L1−3)により繋がれている。これ
らの4個のドメインは、細胞膜にたたみ込まれてチャンネルを形成している。こ
のチャンネルは、小孔を介して細胞質と細胞外との両方に開く。その小孔は、細
胞膜の生理学的状態に応じて開いたり閉じたりする。
らのセグメントは、細胞内および細胞外リンカーで、そのタンパク質分子を細胞
膜に織り込んでいる。これら4個のドメインにおけるS5−S6セグメントのリ
ンカーは、チャンネルの小孔に並ぶ配列および高度に保持されたアミノ酸のサブ
セットを含んでいる。このサブセットは、ナトリウムイオンをチャンネルの小孔
を介して選択的に細胞質内へ移動させ、それによって電流が生じるようフィルタ
ーとして働いている。4個のドメインのそれぞれにある両親媒性のS4セグメン
トは、3個のアミノ酸毎に繰り返される塩基性残基に富んでおり、電圧センサー
として働き、細胞膜内外の電圧差の違いから形態的変化を起こす。この変化が、
また、細胞外Na+イオン勾配に対し小孔が開くよう、そのタンパク質に形態的
変化を引き起こす。
の開口(活性化)後、数ミリ秒内で、チャンネルは急速に閉まり、不作動状態(
不活性)に変化する。一方、SNSタイプのチャンネルは、ゆっくりと不活性化
し、活性化にはより大きな電圧変化を必要とする。ドメインD3とD4をつなぐ
ループであるL3は、活性化後に小孔を閉じてチャンネルを不活性状態に誘発さ
せる細胞内プラグとして働くトリペプチドを含んでいる。不活性化の後、これら
のチャンネルは更に形態変化を起こし、独自の静止状態を回復し、次の活性化に
応じられるようになる。この期間は、不活性化からの回復(リプライミング)と
言われる。異なるチャンネルは、異なった速度でリプライムし、SNSにおける
リプライミングは、比較的早い。
、さらに2つのサブファミリーに区分される(Felipe et al., (1994) J. Biol.
Chem. 269, 30125-30131)。クローニングされた9個のチャンネルのうち8個
は、サブファミリー1に属する。これらのチャンネルは、特にそれらのS4細胞
膜セグメントにおいて、多くの構造上の特徴を共有している。しかしながら、そ
の幾つかのチャンネルは、不活性化およびリプライミングに対し、別個の動的特
性を持っていると示されている。異形型チャンネルとも言われるただ1個のサブ
ファミリー2のチャンネルのみが、ヒト、ラットおよびマウスの組織において同
定されている。このサブファミリーは、主に、S4セグメントにおける減少した
数の塩基性残基で特徴づけられており、よって、サブファミリー1に比較し、違
った膜電圧依存性を持つだろうと予測されている。サブファミリー2チャンネル
の生理学的機能については、その電気生理学的特性が未だ解明されておらず、現
在のところ知られていない。
断することは、感受性(TTX−S)および抵抗性(TTX−R)表現型とに、
これらのチャンネルを機能的に分類することに役立ってきた。これまでに、哺乳
類の2つのTTX−R性チャンネルが同定されており、そのうちの1つは、心筋
および中枢神経系内の非常に限られた部位に特有のものであり、2つ目のTTX
−R性チャンネルであるSNSは、後根神経節および三叉神経節の末梢ニューロ
ンに制限されている。TTXに対し抵抗性または感受性を授与する特定のアミノ
酸残基は、チャンネル小孔のイオン選択性フィルターに局在化されている。また
、SNSチャンネルについては、国際特許出願WO97/01577に記載され
ている。
性および電圧依存性が異なるので、興奮性の細胞の興奮特性は、細胞が発現する
チャンネルの種類の精密な混和に依存する。心筋および骨格筋aサブユニットの
突然変異体が、数々の筋肉障害を起こすと示されてきた。その数例が、次に挙げ
てある。骨格筋チャンネルのS4における、ただ1つの塩基性アミノ酸残基の変
化は、このチャンネルの動的特性を変え、多くの患者に疾病状態を誘発するのに
十分である。心筋チャンネルのL3におけるトリペプチド(不活性化ゲートに隣
接している)の欠失は、長期QT症候群と呼ばれる心臓障害を誘発する。チャン
ネルの小孔に並ぶ領域であるScn8aのドメイン1のS5−S6リンカーにお
ける、単一のアミノ酸の変化は、マウス突然変異体"Jolting"を引き起こ
す。他の突然変異によるこのチャンネルの完全な欠損は、マウスにおけるモータ
ーエンドプレート"med"障害を引き起こす。この突然変異は、運動ニューロン
から神経が分布した筋肉への刺激損失として特徴づけられる。
と言われる)を引き起こす。数々の研究が、軸策損傷後における、ニューロン体
および樹状突起の変えられた興奮性を示しており(Eccles et al., (1958) J. P
hysiol. 143: 11-40; Gallego et al., (1987) J. Physiol. (Lond) 391, 39-56
; Kuno & Llinas, (1970) J. Physiol. (Lond) 210, 807-821)、軸策損傷に引
き続き、ニューロン体および樹状突起上のNa+チャンネル密度に変化が起こる
ことが明らかになっている(Dodge & Cooley, (1973) IBM J. Res. Dev. 17, 21
9-229; Titmus & Faber (1986) J. Neurophysiol. 55, 1440-1454; Sernagor et
al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7966-7970)。また、ニューロ
ンにおいて異種のナトリウムチャンネルが異常に混合されて発現されると、異常
な興奮につながり(Rizzo et al., (1996) Eur. Neurol. 36, 3-12)、興奮性過
敏症状、感覚異常症、または痛みの一因となり得る。
TX−S性電流の発現プロフィール、並びにDRGニューロンにおいてこれらの
電流の原因となるチャンネルをコードするmRNAの転写物数が、種々の障害に
引き続き、劇的に変化することが示されてきた(Rizzo et al., (1995) Neurobi
ol. Dis. 2: 87-96; Cummins et al., (1997) J. Neurophysiol. 17, 3503-3514
; Dib-Hajj et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14950-14954)。
例えば、同定された感覚系皮膚求心性ニューロンにおいて、軸策損傷後に、ゆっ
くりと不活性化するTTX−R性電流が減衰し、それと同時に、急速に不活性化
するTTX−S性Na+電流が増強することが示されてきた(Rizzo et al., (19
95) Neurobiol. Dis. 2, 87-96)。また、痛い刺激に反応する(痛み)ニューロン
において、軸策損傷後に、ゆっくりとリプライムするTTX−S性電流とTTX
−R性電流がなくなり、急速にリプライムするTTX−S性電流が増大すること
が示されてきた(Dib-Hajj et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1
4950-14954)。また、SNS転写の下位調節(ダウンレギュレート)およびそれ
と同時に起こるα−III転写の上位調節(アップレギュレート)が示されてい
る(Cummins & Waxman (1997) . Neurophysiol. 17, 3503-3514)。aIおよび
aIImRNAsの濃度がゆるやかに上昇することも、軸策損傷に関連している
(Waxman et al., (1994) J. Neurophysiol. 72, 466-470)。ナトリウムチャン
ネルプロフィールのこうした変化は、軸策損傷後に患者が被る神経障害痛の根底
にある異常なニューロン興奮の一因と思われる。
ューロンにおけるナトリウム電流プロフィールに変化を引き起こす。炎症性の調
節子は、培養系で、痛みに反応するDRGニューロンのうち小さなCタイプのも
のにおいて、TTX−R性電流を上位調節する(Gold et al., (1996) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 93, 1108-1112; England et al., (1996) J. Physiol. 495
, 429-440)。このような調節子の急速な働きは、それらの働きが、存在してい
るTTX−R性チャンネルの翻訳後の修飾を含むことを示している。また、炎症
により、TTX−R性Na+電流が増加し、CタイプのDRGニューロンのSN
S転写が上位調節されることが決定されている(Tanaka et al., (1998) Neuror
eport. 9, 967-972)。本明細書のデータは、ナトリウム電流プロフィールの変
化が、炎症により引き起こされた痛みの一因であることを提案している。
シチーネのような抗不整脈剤、リドカインのような局所麻酔薬)が、Na+チャ
ンネルに作用する。様々なNa+チャンネルは、異なる特性を持つナトリウム電
流を引き起こすので、特定チャンネルのサブタイプを選択的に遮断または活性化
(またはその他の調節)することには、重要な治療価値があると期待される。さ
らに、特定の種類のニューロンにおける、ある種のa−サブユニットのアイソフ
ォーム(isoform)(PN1、SNS、NaN)の選択的な発現は、それ
らの性質を選択的に変えるための手段を提供する。
電流の主な供給源である。したがって、TTX−R性電流を引き起こすNa+チ
ャンネルは、痛みを引き起こすニューロンの操作にとって、比較的特異的なター
ゲットを提供する。このようなDRGニューロンの、ある1つのTTX−R性チ
ャンネル(SNS)の分子構造は、これまでに同定されているが、本発明以前に
は、他のTTX−R性チャンネルがこれらのニューロンに存在するかどうか、決
定されていない。もし、このようなチャンネルが同定されるとすれば、それらは
、痛みに反応するニューロンにおいて選択的に発現されるターゲット分子として
、理想的な候補物であり、また、それらの調節は痛みの伝達を弱め得る。
存性Na+チャンネル(NaNチャンネル)をコードする単離された核酸分子を
含む。(本発明者等の本出願に先行する米国仮出願60/072990において
は、このNaNチャンネルは、NaXと言われた)。好ましい実施の形態におい
ては、前記の単離された核酸分子は、図1(配列番号1)、図7A(配列番号4
)、図8A(配列番号6)、図11A(配列番号41)に示される配列、この配
列の対立遺伝子変異体(alleic variant)、またはストリンジェ
ントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子を含む。
いて選択的に発現される電位依存性Na+チャンネルをコードする単離された核
酸分子単独からなる発現ベクター、または、前記の単離された核酸分子に適当な
調節および発現制御要素が備わった発現ベクターを含む。好ましい実施の形態に
おいては、発現ベクターは、図1(配列番号1)、図7A(配列番号4)、図8
A(配列番号6)、図11A(配列番号41)に示される配列、この配列の対立
変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核
酸分子を有する単離された核酸分子を含む。
、適当な調節および発現制御要素を備えた、電位依存性Na+チャンネルをコー
ドする単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含む
。好ましい実施の形態においては、発現ベクターは、図1(配列番号1)、図7
A(配番号4)、図8A(配列番号6)、図11A(配列番号41)に示される
配列、この配列の対立変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列に
ハイブリダイズする核酸分子有する単離された核酸分子を含む。
単離された電位依存性Na+チャンネルを含む。好ましい実施の形態においては
、このチャンネルは、図2(配列番号3)、図7B(配列番号5)、図8B(配
列番号8)または図11B(配列番号42)に示されるアミノ酸配列を有し、ま
たは図2(配列番号3)、図7B(配列番号5)、図8B(配列番号8)または
図11B(配列番号42)に示される配列、この配列の対立遺伝子変異体、また
はストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする核酸分子でコー
ドされている。このチャンネルのペプチドフラグメントも、本発明に含まれる。
であって、前記薬剤を、その表面にNa+チャンネルを発現している細胞に接触
せしめ、脱分極化または結果として起こるナトリウム電流の変化を測定する工程
を含む。この測定工程は、電圧クランプ測定法により、脱分極化および細胞内ナ
トリウムレベルを測定することにより、またはナトリウムの流入を測定すること
により達成される。
訳を調節する薬剤を同定する方法である。この方法は、前記薬剤を、その表面に
Na+チャンネルを発現している細胞に接触せしめ、その結果生じるナトリウム
チャンネルの発現レベルを測定する工程を含む。
ルを介して流れるNa+電流を調節(例えば抑制または増強)することが可能な
薬剤の有効量を投与することによって、動物またはヒト検体において、痛み、感
覚異常症および興奮性過敏症を治療するための方法を含む。この方法には、Na
NチャンネルをコードするmRNAの転写または翻訳を調節することが可能な薬
剤の有効量を投与することが含まれてもよい。
酸である。好ましい実施の形態においては、アンチセンス核酸は、NaNチャン
ネルmRNAの発現を、そのmRNAを含む細胞において調節するのに十分な長
さのものである。
抗体または他の標識リガンドを投与することによって、動物またはヒト検体にお
いて、DRGニューロンまたは三叉ニューロンに媒介されて起こる興奮性神経過
敏症に関連する痛みのレベルの尺度を提供するするための、または、痛みの発生
の遺伝子座を画像化するためのシンチグラフィー法である。
び細胞種を同定する方法である。この方法は、細胞表面で、細胞表面へ行く途中
で、またはNaNをコードするmRNAの存在下で、NaNを検出する工程から
成る。
細胞を製造する方法を含む。この方法は、適当な調節および発現制御要素ととも
に、図1、図7A、図8Aまたは図11Aに示される配列、この配列の対立遺伝
子変異体、またはストリンジェントな条件下で前記の配列にハイブリダイズする
核酸分子を有する単離された核酸分子を含むベクターで細胞を形質転換する工程
を含む。また、本発明は、組換えNaNタンパク質を製造する方法を含み、この
方法は、NaNナトリウムチャンネルまたはタンパク質が発現される条件下で、
形質転換された宿主を培養し、NaNタンパク質を回収する工程を含む。
異的な、単離された抗体を含む。単離された抗体は、標識されていてもよい。
たDRGニューロン、または高周波数で興奮するようになった正常なDRGニュ
ーロンにおいて、急速にリプライミングするナトリウム電流の流れを減少させる
ことが可能な薬剤の有効量からなる治療的組成物を含む。また、本発明は、動物
またはヒト患者において、前記の治療的組成物を投与することによって、急性の
痛み、急性若しくは慢性の神経性または炎症性の痛み、および興奮性過敏症状を
治療する方法を含む。
スクリーニングする方法を含む。この方法は、軸策切断された、炎症を起こした
、さもなければ損傷されたDRGニューロンにおいて、NaNチャンネルのmR
NAまたはタンパク質の発現または活性を変化させる前記の候補化合物の能力を
試験することによる。
関する。NaNは、以前には同定されていなかった、ここではNaNと言われる
タンパク質をコードしている。NaNは、aサブユニット電位依存性ナトリウム
チャンネルタンパク質ファミリーに属し、TTX−R性のナトリウム電流を引き
起こす。このようなチャンネルは、ニューロンおよび筋繊維のような興奮性の細
胞において、インパルスの発生と伝播の根底にある。NaNは、新規なナトリウ
ムチャンネルであり、これまでに同定された他のチャンネルとは別個の配列を持
つ。他のニューロンでなく感覚ニューロンで発現されるという、この選択的なN
aNの発現は、急性および/または慢性の痛み病理に関連した診断上および/ま
たは治療上の使用にとって、このチャンネルを有効なターゲットとしている。
の意味を持つこととする。
れの量と活性を上位または下位調節することを言う。例えば、薬剤は、Na+電
流を抑制(減少)または増強(増加)することにより、Na+電流を調節し得る
。同様に、薬剤は、NaNナトリウムチャンネルの発現量、または発現するNa
Nチャンネルの活性を調節し得る。
トリウムイオンに対し、選択的に透過性のチャンネル(特殊化されたタンパク質
)を介して起こる、細胞膜を横切るナトリウムイオンの流れを意味する。
ルが開くことを意味する。電圧感受性ナトリウムチャンネルは、細胞膜が脱分極
化された時に開く。その後、これらのチャンネルは、Na+イオンを細胞内へ流
れ込ませ、脱分極化を更に進める。これにより、細胞は、電気インパルス(活動
電位としても知られる)を引き起こす。
ァミリーメンバーに比べ、電流が、より急速に不活性化から回復することを意味
する。
約100nMのテトロドトキシン(特定種において生産される神経毒)濃度に対
して、それぞれ抵抗性または感受性であることを意味する。
例えば脊根およびそれに関連する後根神経節(DRG)および三叉神経節などの
神経節、ならびに末梢神経繊維についていう。
と比較し、電流の流れを減少させることを意味する。好ましい抑制剤は、他のナ
トリウムチャンネルの電流に影響すること無く、選択的にこのような電流を抑制
する。さもなければ、その抑制剤は、他のチャンネルに比べ、関心のチャンネル
を流れるナトリウム電流を、非常に大きな程度で抑制する。
と比較し、電流の流れを増強させることを意味する。好ましい増強剤は、他のナ
トリウムチャンネルの電流に影響すること無く、選択的にこのような電流を増大
する。さもなければ、その増強剤は、他のチャンネルに比べ、関心のチャンネル
を流れるナトリウム電流を、非常に大きな程度で増大する。
1のDNA配列のようなNaNナトリウムチャンネルをコードする核酸に、非常
にストリンジェントな条件で、または中程度にストリンジェントな条件で、ハイ
ブリダイズする核酸について言う。
実質的に精製されたか、または、それらから分離された核酸のことを言う。核酸
とは、cDNA分子およびアンチセンスRNA分子を含む全てのDNAおよびR
NA型を意味する。
(RT)に引き続き起こる、特定のcDNAテンプレートについての、ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)を使った増幅工程を意味する。PCRは、遺伝的または
遺伝子に特定的なプライマーおよび熱的に安定なDNAポリメラーゼ、例えばT
aq DNA ポリメラーゼ、を必要とする。
織に比べある限定された組織において、多量に検出され発現されることを意味す
る。例えば、後根神経節または三叉神経節において、選択的に発現される電位依
存性Na+チャンネルは、他の組織や細胞種と比べ、後根神経節または三叉神経
節において、より大量に検出される。電位依存性Na+チャンネルの量は、特異
的なRNA量の検出および特定の抗体を使ったチャンネルタンパク質の検出を含
む、利用可能などんな方法によっても検出できる。
ネルaサブユニット(NaN)に関する。NaNは、TTX−R性の電位依存性
チャンネルであり、また、身体(後根神経節またはDRG)および顔(三叉神経
節)へ入っていく感覚ニューロンにおいて選択的に発現されていると予測されて
いる。NaNタンパク質分子をコードする配列部分である、オープンリーディン
グフレームは、図2(配列番号3)、図7B(配列番号5)、図8B(配列番号
8)または図11B(配列番号42)に示されているその推定上のアミノ酸配列
を使い、異なる動物種(ラット、マウス、ヒト)から決定されている。
の予測された位置に存在しており、このことは、NaNがナトリウムチャンネル
ファミリーに属することを指し示す。しかし、NaNは、これまでに同定されて
きた全てのナトリウムチャンネルとは異なり、それらとは、53%以下の配列上
の同一性を共にしている。NaNは、PNSにおいて本発見以前に同定されたN
a+チャンネルサブユニットであり唯一他のTTX−R性のものであるSNSと
も異なる。発明者等は、SNSに基づく若しくは特異的であるプライマーまたは
プローブを使うこと無しに、NaNを同定しクローニングした。さらに、NaN
とSNSは、その予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)が、ほん
の47%の類似性を共有し、これは、全てのサブファミリー1メンバーに対する
NaNの限られた類似性に比較される。
遺伝子であり、現存しているチャンネルの単なる変異体でないことが、明らかに
確認される。他の電位依存性チャンネルに比較しての配列の違いは、NaNが新
規でありこれまでに同定されていないようなプロトタイプであり、SNSと比べ
て異なった特性を持つ三番目の種類のTTX−R性チャンネルであろうことを示
唆している。痛みに反応するDRGニューロンおよび三叉ニューロンにおいて存
在するNaNとSNSは、薬学的な介入に対し異なって反応しうる。感覚性のD
RGニューロンおよび三叉ニューロンにおけるNaNの選択的な発現は、脳およ
び脊髄における他のニューロンに影響すること無く、選択的にこれらの感覚ニュ
ーロンの性質を変えるターゲットを提供する。痛みに反応するDRGニューロン
に特徴的であり、痛みのメッセージの伝播と神経損傷後およびその他の痛みの状
態における異常な興奮パターンに寄与している、TTX−R性電流の機能調節の
ためにデザインされた薬の効果を、より完璧に理解するためには、NaNチャン
ネルの性質をさらに解明することが重要である。
オチド配列、並びに図2、図7B、図8Bおよび図11Bのアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を含む。また、本発明の請求項にかかる核酸は、図1、
図7A、図8Aおよび図11Aに示されたヌクレオチド配列からなる核酸と、ま
たは図2、図7B、図8Bおよび図11Bのアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列からなる核酸とに、特異的にハイブリダイズする核酸を含む。そのヌク
レオチド配列からなる核酸に、特異的にハイブリダイズする核酸は、非常にスト
リンジェントな条件下、または中程度にストリンジェントな条件下で、前記の核
酸に安定して結合している。非常にストリンジェントな条件、または中程度にス
トリンジェントな条件とは、Sambrook等((1989) Molecular Cloning
? A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press)またはAusubel
等((1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing)に
よって、一般的に定義され利用されているものである。ストリンジェンシーの正
確なレベルは、重要でなく、むしろ、選択的なハイブリダイゼーションが起こっ
た時、明瞭で検出可能な信号が提供される条件を選択すべきである。
、緩衝液塩の含有量、配列の長さおよび二重溶解温度(T[m])の関数である(
Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press参照
)。配列長、緩衝液塩の濃度および温度の類似性は、ハイブリダイゼーション法
により、配列の同一性(ホモロジー)を評価するにあたり、有効な変数を提供す
る。例えば、少なくとも90%のホモロジーがあれば、一般に、ハイブリダイゼ
ーションは、20XSSCから希釈された6XSCCのような緩衝液塩中で68
℃で行われる(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ?A Laboratory A
pproach, Cold Spring Harbor Press参照)。最終のサザンブロット洗浄用の緩
衝液塩が、例えば、0.1XSSCのような低濃度で、例えば、68℃のような
高温において使われると、二つの配列はハイブリッド二重鎖(ハイブリダイズ)
を形成する。上記のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を共に使用すること
は、高度のストリンジェンシーまたは高度にストリンジェントな条件であると定
義される。中程度にストリンジェントな条件は、二つの配列が少なくとも約80
%のホモロジーを持つときに、使用され得る。ここで、ハイブリダイゼーション
は、6XSSCを使い約50〜55℃の温度で行われる。最終の洗浄には、約1
〜3XSSCの塩濃度と、約60〜68℃の温度とが使われる。これらのハイブ
リダイゼーションおよび洗浄の条件は、中程度にストリンジェントな条件を定義
する。
性があるというの条件下で起こる。特定のハイブリダイゼーションにおいては、
一般に、相補性は、少なくとも約70%、75%、80%、85%であり、好ま
しくは、約90〜100%、さらに好ましくは、約95〜100%である。配列
番号41および配列番号42のヒトNaN配列に関して言えば、好ましい相同(
ホモロガス)配列とは、一般的には、配列番号42に対して、少なくとも81%
のアミノ酸配列類似性または少なくとも75%若しくは76%の配列同一性を示
すNaNタンパク質をコードするものである。
Local Alignment Search Tool)分析によって決定
される(Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87, 2264-2268およ
び Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300、両者とも、参考文献として
本明細書に援用されている)。BLAST分析は、配列の類似性捜索用に作られ
、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよ
びtblastxによって利用されたアルゴリズムを使用している。BLAST
プログラムによって使われるアプローチは、疑問の配列とデータベース配列の間
の類似したセグメントを最初に考慮し、次に、同定された全ての対の統計学的有
意性を評価し、最後に、前もって選択されている有意性の閾値を満足する対にだ
け約言する。配列データベースの類似性捜索における基本問題の論議については
、本明細書に参考文献として援用されているAltschel等の文献(Nat. G
enet. (1994) 6, 119-129)を参照する。histogram、descrip
tions、alignments、expect(例えば、データベース配列
に対するマッチを報告するための統計上の有意性閾値)、cutoff、mat
rix、filterの捜索パラメータは、デフォルトセッティングのままであ
る。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxによっ
て使われるデフォルトのスコアマトリックスは、BLOSUM62マトリックス
であり、本明細書に参考文献として援用されている(Henikoff et al. (1992) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)。blastnについては、ス
コアマトリックスは、M(例えば、マッチする残基の一対に対する報酬スコア)
とN(例えば、ミスマッチする残基の一対のためのペナルティスコア)の比によ
ってセットされ、MおよびNのデフォルト値は、それぞれに5および−4である
。
らの核酸は、相同性のNaN配列をコードする他のDNA配列を、ハイブリダイ
ゼーションにより選択するために、他のcDNAおよびゲノムDNAのライブラ
リーをスクリーニングするための核酸プローブとして使われる。意図される核酸
分子としては、放射性ヌクレオチドで、または非放射性法(例えば、ビオチン)
で、ラベルされたRNAまたはDNAがある。スクリーニングは、近く関連する
相同体または遠く関連する相同体を単離するために、様々なストリンジェンシー
(イオン強度と、温度と、および/もしくはフォルムアミドの存在との普通のコ
ンビネーションを使って、ハイブリダイゼーションTm操作を通じ)の下で行わ
れる。また、これらの核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を使って、c
DNAまたはゲノムDNAを増幅するプライマーを生産するために使われる。さ
らに、本発明の核酸配列は、例えば、NaNの制御要素であり側面に位置する配
列のような、ゲノムにおける隣接する配列を同定するために使われる。また、こ
れらの核酸は、NaNの遺伝子発現のレベルを調節するために利用され得るアン
チセンスプライマーまたは構築物を生産するために使われる。そのアミノ酸配列
は、NaNに特異的で、NaNを特異的な細胞に局所化でき、細胞表面でNaN
チャンネルの機能を調節できる抗体をデザインし製造するために使われる。
N配列が含まれる。例えば、融合タンパク質は、本明細書において開示されたオ
ープンリーディングフレームまたはその機能的断片、および、いかなる利用可能
な融合タンパク質を使って調製される。また、キメラなNaNタンパク質(例え
ば、異種からの個々のドメインを含むキメラなタンパク質)をコードする核酸分
子を調製することもできる。これらのキメラなタンパク質には、マウス若しくは
ラットのドメインを含むヒトNaNキメラ、または、ヒトのドメインを含むマウ
ス若しくはラットのキメラが含まれるが、それらに限定されるものではない。好
ましいキメラとしては、ヒトNaNのアミノ酸670に相当する残基を取り巻い
ているラット若しくはマウスのドメインを有するヒトNaNがある。
する核酸の発現を、複製および指示することが可能な組換えベクターからなる。
例えば、本発明に従い、T4DNAリガーゼのような酵素を使って、DNAをベ
クターへ挿入することは、いろいろな従来の方法によっても行うことができる。
このようなDNAの挿入は、DNAと望ましいベクターが同じ制限酵素によって
切られていれば、相補的DNA末端が作製されるので、簡単に遂行できる。もし
、そうでなければ、DNAのシングルストランドを消化することによって作製さ
れた切断末端を修飾し、ブラント(平滑)末端を作製する必要がある。または、
適当なDNAによりシングルストランド末端を埋めて同じ結果を成し遂げる必要
がある。このようにして、ブラント末端連結反応が行われる。代わりとして、い
ろいろな望ましい位置が、ヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結す
ることによって作製される。このようなリンカーは、制限位置認識配列をコード
する特異的オリゴヌクレオチドからなる。
(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ? A Laboratory Approach, Co
ld Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Mole
cular Biology, Greene Publishing)。商業的に利用可能なベクターには、例え
ばNew England Biolabs社、Promega社、Strat
agene社または他の供給源から入手可能なものが含まれる。
、一般に、使われたベクターの種類と宿主システムに依存する周知の方法によっ
て成される。カエルの卵胞子にRNAが挿入されると、チャンネルを発現する。
しかし、哺乳類細胞系における発現のほうが、好ましい。原核生物の形質転換に
関しては、電気的ポーレーションおよび塩処理法が、一般的に利用される(例と
して、Cohen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114; お
よび Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning ? A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Press を参照)。rDNAを含むベクターを使って脊椎動物
の細胞を形質転換することに関しては、電気的ポーレーション、カチオン性脂質
または塩処理法が、一般的に利用される(Graham et al., (1973) Virology 52,
456-467; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76, 1373-1376
)。
の技術により同定できる。例えば、本発明のrDNAが導入された細胞は、単一
コロニーを作製するようクローニン化されうる。これらのコロニーから細胞は、
収穫され、溶解され、それらのDNA含有物は、rDNAの存在を確かめるため
、従来法により調べられる(Southern, (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517)。
または、細胞によって製造されたタンパク質は、免疫学的手法により、アッセイ
される。もし、組換えDNAの構築に、緑蛍光タンパク質のような標識が利用さ
れるとすると、このような細胞の蛍光によって細胞を区分けすることから、感染
された細胞をインビボで検出できる。
の測定するための形質転換された宿主細胞は、一般に、りん酸カルシウム塩沈降
法を使い、蛍光性レポータープラスミドで、HDK293細胞のような細胞を、
構築物で感染させることにより調製する(Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 6
63-676)。HEK293細胞は、10%の胎児牛血清(Life Techno
logies社)で補充された高濃度のグルコースを含むDMEM(Life
Technologies社)中で成長する。48時間後、緑蛍光を示す細胞を
、記録のために選択する(Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14)
。
を哺乳類細胞の選択的マーカーを有する他のベクターへクローニングする。形質
転換は、りん酸カルシウム沈殿法により行われる(Ukomadu et al., (1992) Neu
ron 8, 663-676)。ヒト胎児腎臓(HEK−293)細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣(CHO)細胞、その他の適した細胞系を、10%の胎児牛血清で補充
したDMEM培地で、標準的な培養の条件下で成長させる。この細胞培養培地に
、りん酸カルシウムとDNAの混合物を加え、15〜20時間経過した後、細胞
を新鮮な培地で洗浄する。48時間後、ネオマイシン抵抗性を獲得した細胞を選
択するため、抗生物質(G418)を加える。2−3週間後、G418を加えた
培地中で、10〜20の単離された細胞コロニーを、滅菌された10ml用のピ
ペットチップを使って取り入れる。コロニーを更に4〜7日間成長させ、薄くは
がし、引き続き、ホールセルパッチクランプレコーディング法およびRT−PC
Rにより、チャンネルの発現について試験する。
ajj等((1997) FEBS Lett. 416, 11-14)によって記載された通り、Na+電
流を、パッチクランプ法を使って測定する(Hamill et al., (1981) Pflugers A
rch. 391, 85-100)。MacIntosh Quadra 950または同様の
コンピュータで、Pulse(vv7.52、HEKA製、ドイツ)などのプロ
グラムを使って、これらの記録データを得る。一般に、加熱研磨された電極を、
Sutter P−87プーラーまたはこれに類したものを使って、キャピラリ
ーガラスから作製する。非常に精密な分析では、一般に、細胞の初期シール抵抗
が<5Gohmである場合、分析のために考慮される。このような細胞は、大量
の漏れ電流、細胞膜ブレブ、および5Mohm以下の接触抵抗を持つ。一般に、
接触抵抗は、実験を通してモニターされ、もし、抵抗の変化が起こればデータは
分析に使われない。電圧エラーは、シリーズ抵抗補正を使って最小限化され、容
量アーチファクトは、コンピュータにより制御された増幅回路またはこれに類似
する他の方法を使って取り消される。活性化と不活性化の電圧依存性を比較する
ために、補正後の電圧エラーの最大限が±10mVの細胞を使う。普通、電圧ク
ランプレコーディングには、直線漏れ減法を使う。膜電流は、一般に、5KHz
でフィルターにかけられ、20KHzで試験に使われる。ピペットには、標準的
な溶液(例えば、140mM CsF、2mM MgCl2、1mM EGTA
、および10mM Na−HEPES(pH 7.3))が含まれる。標準的細
胞外溶液は、一般的に、140nM NaCl、3mM KCl、2mM Mg
Cl2、1mM CaCl2、10mM HEPES、および10mMグルコース
の溶液(pH 7.3)である。
プレコーディング法のような方法を使った電圧クランプ研究は、ナトリウム電流
密度の量的測定(細胞中のナトリウムチャンネル数)およびチャンネルの生理学
的特性を提供する。ナトリウムチャンネルのようなイオンチャンネルを通して流
れる電流を測定するこれらの方法は、Rizzo等によって記載されている((1
995)Neurobiol. Dis. 2, 87-96)。これに変わる手法として、ナトリウムチャン
ネル機能の遮断または増強は、ナトリウム感受性色素またはアイソトープで標識
されたNaを使ったオプティカルイメージングにより測定される。これらの方法
は、Rose等((1997) J. Neurophysiol. 78, 3249-3258)および Kimelberg
& Walts((1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton et al., 編集) Hum
ana Press)により記載されており、ナトリウムチャンネルが開いたときに起こ
る細胞内のナトリウムイオン濃度の増加を測定する。
似する他のイオン感受性色素を使った[Na+]iの比較イメージ法によって測定で
きる。Sontheimer等((1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475)により
記載された通り、この方法では、細胞内フリーNa+は、例えばSBFI(So
dium−binding benzofuran isophthalate
;(Harootunian et al., (1989) J. Biol. Chem. 264, 19458-19467)または類
似色素のようなNa+に対しての指示薬を使って測定される。細胞は、最初に、
色素の膜透過性アセトキシメチルエステル型(ジメチルスルフォキシド(DMS
O)中に10mMのストック濃度で溶解されている)で仕込まれる。顕微鏡台上
で、比較イメージセットアップ(例としてGeorgia Instrumen
ts社)によってレコーディングを獲る。励起光は、適当な波長(例えば、34
0:385nm)を持つように提供される。励起光は、反射板(400nm)を
介して細胞に通され、450nm以上の蛍光を収集する。蛍光信号は、例えばイ
メージ増倍装置(GenIISyS)で増幅され、CCDカメラまたはフレーム
グラバーに接続した同類の装置により収集される。蛍光衰退を計上するため、蛍
光比340:385が細胞内フリーNa+のアッセイに使われる。
、0、30、および50mM[Na+])を含む換算用の溶液、およびグラミシジ
ンやモネンシンのようなイオノフォアを、細胞の一面に注ぎSBFI蛍光較正を
行う。RoseやRansom((1996) J. Physiol. (Lond) 491, 291-305)に
って報告されたように、細胞内SBFIの345/390nm蛍光比は、[Na+ ]iの変化と共に単調に変化する。一般に、実験を多数(一般に少なくとも4回)
の異なるカバースリップについて繰り返す。これにより、対照細胞および様々な
濃度の薬剤にさらされた細胞における、細胞内ナトリウムの、統計学的に有意義
な測定が提供される。
(Kimelberg & Waltz, (1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton et al
., 編集) Hamana Press)。また、86Rbは、Na+/K+−ATPase活性を
測定するために使われる(Sontheimer et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2464-
2475)。86Rbイオンは、K+イオンと同様に、Na+/K+−ATPaseによ
って取り除かれるが、42K+に比べ、非常に長い半減期を持っている(Kimelberg
& Mayhew (1975) J. Biol. Chem. 250, 100-104)。したがって、ウアバイン感
受性86Rbの一方向取り込みを測定することは、ニューロンにおける電気的興奮
のもう1つの指標となるNa+/K+−ATPase活性をアッセイするための定
量法を提供する。NaNを発現する細胞を、アイソトープ22Naと共に培養した
後、アイソトープの細胞内含有量を、液体シンチレーション計数法または類似の
方法により測定する。また、細胞内タンパク質を、GoldschmidtとK
imelbergによって記載された培養細胞のための修正((1989) Anal. Bio
chem. 177, 41-45)に従い、例えばビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Smith
et al., (1985) Anal. Biochem. 150, 76-85)の様な方法で測定する。22Naお
よび86Rbの流れを、NaNを遮断、抑制または増強する薬剤の存在下でまたは
非存在下で測定する。これにより、これらの薬剤のNaNに対する作用を確定す
る。
たは増強)することが可能な薬剤を同定するために、幾つかのアプローチが使わ
れる。一般的に、NaNナトリウムチャンネルを発現するモデルとなる培養細胞
系が、このような薬剤を同定するために使われる。また、幾つかの従来アッセイ
法が、Na+電流の測定に使われる。このような従来アッセイには、上述した、
パッチクランプ法、[Na+]iのイメージ比較法、および22Naと86Rbの使用が
含まれる。
性を評価するために、形質転換を受けた適当な宿主細胞でNaNを発現している
ものへ、薬剤を接触させる。それらを混合した後、または、適当な培養時間後、
その薬剤がNa+電流量を抑制したか増強したかを決定するために、Na+電流を
測定する。
の専門家であれば、特定の薬剤がNa+電流量を調節するかどうかを決定するに
当たり、様々な周知技術を容易に使うことができる。
は慢性の痛みに対し薬剤によって処理された実験動物の反応を測定することによ
って、Na+チャンネル機能を遮断、抑制または増強するその薬剤をデザインす
ることも可能である。本発明のこの局面におけるある実施形態では、ラットのよ
うな実験動物は、例えば、NaNを遮断または抑制する薬剤(または、遮断また
は抑制すると考えられる薬剤)で処理される。その後、様々な痛みの刺激に対す
る反応を、後尾軽打試験および肢撤回反射のような試験法を使い測定し、処理さ
れていない対照動物と比較する。これらの方法については、Dubnerによる
記載((1994) Textbook of Pain (Wall & Melzack, 編集) Churchill Livingsto
ne 出版社)がある。本発明のこの局面における他の実施形態にでは、ラットな
どの実験動物に、フォルマリン(Cubuisson & Dennis (1997) Pain 4, 161-74)
、フロイントアジュバント(Iadarola et al., (1998) Pain 35, 313-326)また
はカラゲーニンのような痛みを起す炎症性の薬剤を局所的に注射し、または、持
続性の痛みを生じさせる神経圧縮(Bennett & Xie, (1988) Pain 33, 87-107; K
im & Chung (1992) Pain 50, 355-363)または神経断面切断(Seltzer et al.,
(1990) Pain 43, 205-218)を行う。その後、様々な普通の刺激および痛みの刺
激に対する動物の反応を測定する。例えば、暖刺激または暑刺激から撤回反射ま
での時間の潜在時間を測定し(Dubner, (1994) Textbook of Pain (Wall & Melz
ack, 編集) Churchill Livingstone 出版社)、対照動物とNaNを変化させる
と考えられる薬剤で処理された動物とを比較する。
ある。それらは、絶対的に選択的(ナトリウムチャンネルを抑制するが他のチャ
ンネルや受容体とは結合せず、直接的に他のチャンネルや受容体に影響を与えな
いテトロドトキシン、TTXのようなもの)でも、または、比較的に選択的(数
種のイオンチャンネルに結合し、およびそれらを遮断するが、ナトリウムチャン
ネルに偏好があるリドカインのようなもの)でもよい。抑制剤または増強剤にと
って、効き目があるために、絶対的な選択性は必要でない。ナトリウムチャンネ
ルに対する効果と他のチャンネルまたは受容体に対する効果との比により、ター
ゲットに加えて幾つかのチャンネルに対する薬剤の1効果または複数の効果を測
定する(Stys et. al., (1992) J. Neurophysiol. 67, 236-240)。NaNの調
節物を、第一次感覚ニューロンで発現される他のチャンネルを調節する薬剤と組
み合わせまたは共投与することができる。これらには、PN1/hNEおよびS
NS/PN3(Waxman (1999) Pain Supplement 6:S133-140)があるが、これら
に限定されるものではない。
ミン誘導体、並びに炭水化物であろうと予想される。その道の専門家であれば、
本発明の調節薬剤の構造的性質に関しては、制限が無いということが容易に認識
できる。NaNまたはそれを通っての電流量を調節する薬剤については、分子ラ
イブラリーのスクリーニングにより明らかになる。同様に、天然毒(特定の魚、
両生類および無脊椎動物によって生産されるものなど)についても、スクリーニ
ングができ得る。ナトリウムチャンネルを発現している形質転換された宿主細胞
または他の細胞を、これらの薬剤にさらし、結果として起こるNa+電流の変化
を測定することにより、日常的に、このような薬剤は同定され得る。
G−456のようなプロテアーゼ欠失株の中で、発現させることができ、従来法
により精製することができる。
プチド合成法を使って調製することが可能である。加えて、これらのペプチドを
コードするDNAは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機器を使って
合成され、標準的な組換え生産システムを使って組換え製造される。固層ペプチ
ド合成を使う生産は、もし遺伝子によってコードされないアミノ酸が入っていれ
ば必要とされる。
。これらの抗体は、チャンネルを介して、電流の流れを遮断、抑制または増強す
ることができ得る。抗原決定領域であるNaNの部位、特に(しかし、必ずしも
そうでない)細胞上の細胞外に出ている部位、を含むペプチドで、適当な動物被
検体を免疫化することにより、これらの抗体は得られる。また、これらの免疫学
的薬剤は、2次抑制薬を同定するための競合結合研究においても使うことができ
る。これらの抗体は、従来法によって適当に標識化されれば、イメージング研究
においても利用できる。
ニック動物も、本発明に含まれる。また、NaNおよびSNS/PN3遺伝子の
両者が修飾を受け、分裂され、またはある型で修飾されたトランスジェニック動
物も、本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、遺伝子的に修飾を受けた
動物であり、組換え、外因性、またはクローニングされた遺伝子材料を実験的に
転移してできたものである。このような遺伝子材料は、度々トランス遺伝子とい
われる。トランス遺伝子の核酸配列は、この場合においてはNaNの型であり、
その特定の核酸配列が普通には見られないゲノムの遺伝子座か、またはトランス
遺伝子のための普通遺伝子座のどちらかへ組み込まれる。トランス遺伝子は、タ
ーゲット動物の種類とは異なる種類のゲノムから、または同じ種類のゲノムから
派生した核酸配列からなる。
報がその生殖細胞系に導入され、その遺伝子情報を子孫に移転することができる
能力を得たトランスジェニック動物のことを言う。もし、実際に、このような子
孫がその変異または遺伝子情報の幾つかまたは全部を所有していれば、それらも
また、トランスジェニック動物である。
るか、特定の個々の受容者にとって外来のものであるか、または遺伝子情報は既
に受容者によって所有されている。最後の場合、変異した遺伝子または導入され
た遺伝子は、自然の遺伝子とは異なって発現され得る。
微量注入、遺伝子ターゲティング、並びに組換えウイルス感染およびレトロウイ
ルス感染、を含む様々な異なる方法によって生産することができる(米国特許4
736866号;米国特許5602307号; Mullins et al. (1993) Hyperte
nsion 22, 630-633; Brenin et al. (1997) Surg. Oncol. 6, 99-110; Tuan (19
97), Recombinant Gene Expression Protocols, Humana Press (1997)。
らの中には、活性化されたガン遺伝子配列を発現するもの(米国特許47368
66号)、サイウイルスSV40T−抗原を発現するもの(米国特許57289
15号)、インターフェロン制御因子−1(IRF−1)の発現を欠くもの(米
国特許5731490号)、ドーパミン性障害を示すもの(米国特許57237
19号)、血圧制御に関係しており少なくとも1つのヒト遺伝子を発現するもの
(米国特許5731489号)、自然に生じたアルツハイマー病の状態に非常に
似た状態を示すもの(米国特許5720936号)、細胞接着を媒介する能力が
劣ったもの(米国特許5602307号)、牛成長ホルモン遺伝子を所有するも
の(Clutter et al. (1996) Genetics 143, 1753-1760)、または、完全なヒト
抗体の反応を発生できるもの(McCarthy (1997) Lancet 349, 405)、が含まれ
る。
きた一方、他の動物種を使うことの方が好ましい場合、または必要な場合がある
。トランスジェニック工程は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパ
ンジー、ハムスター、ラビット、ウシ、およびギニアピッグを含むネズミ科以外
の動物においても、成功して使われてきた(Kim et al. (1997) Mol. Reprod. D
ev. 46, 515-526; Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. 35, 609-617; Petter
s (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 643-645; Schnieke et al. (1997) Science
278, 2130-2133; および Amoah (1997) J. Animal Science 75, 578-585)。
時形質転換に都合が良ければいかなる方法であってもよい。トランスジェニック
動物を生産する詳しい工程は、米国特許5489743号および米国特許560
2307号に開示されたものを含み、当業者にとって容易に利用可能である。
のではない。
)を切除し、全細胞RNAをチオシアン酸グアニジン・フェノール一回抽出法(
Chomczynski, (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159)により分離した。分析用
には数匹の動物から同時にDRG組織を切除して用いた。1%アガロースゲル中
で電気泳動によって、RNAの品質および相対収量を測定した。原材料の後根神
経節は4個体から平均10mgと限られた量しか得られなかったため、RNA収
量の定量は行わなかった。PolyATract分離システム(Promega
社)を用い、製造者の指示に従い、300μgの後根神経節トータルRNAから
ポリA+RNAを精製した。精製RNAの半分は、定量せずにマラソンcDNA
(後述)調製に用いた。
-82)したように第一鎖cDNAを合成した。簡潔に説明すると、最終量25m
l中で、1mMのランダム・ヘキサマー(Boehringer Mannhe
im社)および500単位のスーパースクリプトII逆転写酵素(Life Te
chnologies社)を用い、100単位のリボヌクレアーゼ阻害剤(Bo
ehringer Manheim社)存在下にトータルRNAを逆転写した。
反応バッハァーは、50mMTris塩酸(pH8.3)、75mM KCl、
3mM MgCl2 、10mM DTTおよび125mM dNTPからなってい
た。反応を37℃で90分間、42℃で30分間進行させ、65℃で10分間熱
することにより停止させた。
マニュアルに従って行った(バッファーおよび酵素は全て製造者であるClon
tech社より購入した)。
ンプル1mg(1−4ml)、cDNA合成プライマー 1ml(10mM)お
よび滅菌H2O、を全量が5mlとなるように混合する。成分を混合し、チュー
ブを短時間マイクロ遠心機で遠心する。混合液を70℃で2分間保温し、次に直
ちにチューブを氷中で2分間急冷する。チューブを瞬時遠心(タッチ・スピン)
して結露分を集める。各反応チューブに以下の試薬:5Xファースト・ストラン
ド・バッファー2ml、dNTPミックス(10mM)1ml、[α-32P]dC
TP(1mCi/ml)1ml、AMV逆転写酵素(20単位/ml)1mlを
加え、10ml容とする。放射標識dCTP(cDNA合成の収量測定用)は、
任意であって、使用しない場合は滅菌H2Oで置き換えてもよい。穏やかにピペ
ッティングしてチューブの内容物を混合し、チューブをタッチ・スピンして内容
を底に集める。混合液を結露の少ないようインキュベータ中、42℃で一時間保
温し、第一鎖cDNAの収量を増やす。チューブを氷中に置き、第一鎖合成反応
を停止する。
ンド・ストランド・バッファー16ml、dNTPミックス(10mM) 1.
6ml、20Xセカンド・ストランド・エンザイム・カクテル4mlを加え全容
量を80mlとする。穏やかにピペッティングして前記成分を完全に混合し、マ
イクロ遠心機でチューブを短時間遠心する。混合液を16℃で1.5時間保温し
た後、T4DNAポリメラーゼ2ml(10単位)を加え、穏やかにピペッティ
ングして内容物を完全に混合し、混合液を16℃で45分間保温する。EDTA
/グリコーゲンを4ml加えて混合し、第2鎖反応を終了させる。混合液を等容
のバッファー飽和フェノール(pH7.5):クロロフォルム:イソアミルアル
コール(25:24:1)で抽出する。ボルテックスにより内容物を完全に攪拌
し、チューブをマイクロ遠心機で最高速度(毎分14,000回転または13000xg)4
℃にて0分間遠心し、液層を分離する。上層の水層を注意深く、清浄な0.5m
lチューブに移し替える。水層を100mlのクロロフォルム:イソアミルアル
コール(24:1)で抽出し、ボルテックスし、前回同様に遠心して液層を分離
する。上層の水層を注意深く、清浄な0.5mlチューブに回収する。2分の1
容の4M酢酸アンモニウムおよび2.5倍容の95%エタノールを室温で加え、
二本鎖cDNAをエタノール沈殿する。ボルテックスにより完全に攪拌した後、
ただちにチューブをマイクロ遠心機で最高速度、室温にて20分間遠心する。上
清を注意深く除き、沈殿ペレットを300mlの80%エタノールで洗う。前回
同様にチューブを10分間遠心し、上清を注意深く除去する。 沈殿ペレットを
10分間ほど風乾しcDNAを10mlの滅菌H2Oに溶かし、−20℃で貯蔵
する。cDNA溶液2mlを適切な分子量マーカー用DNA(例えば、Gibc
o・BRL社製1kilobpラダーなど)とともに1.2%EtBr/アガロースゲ
ル上で泳動することによりcDNAの収量およびサイズを分析する。EtBr染
色がシグナルを示さず、反応液中に[α-32P]dCTPが含まれていた場合は、
アガロースゲルを真空ゲルドライ装置にて乾燥した後、−70℃にて一晩X線フ
ィルムに露光する。
dscDNA 5ml、マラソン cDNAアダプター(10mM)2ml、5
XDNAライゲーション・バッファー2ml、T4DNAリガーゼ(1単位/m
l)1ml、の順に加え、全量を10mlとする。穏やかにピペッティングして
成分を完全に混合した後、チューブをマイクロ遠心機で短時間遠心する。16℃
終夜か、室温(19〜23℃)で3〜4時間のいずれかで保温する。混合液を7
0℃で5分間加熱し、リガーゼ酵素を失活させる。この反応液1mlを250m
lのトリシン−EDTAバッファーで希釈し、RACEのプロトコルに使用する
。希釈していないアダプターをライゲーションしたcDNAを使用するまで−2
0℃で保存する。
ドメイン1(D1)中の高度保存配列に対して設計された汎用プライマーを使用
し、さらに発見された新規a-サブユニットを収容するためにより多くのプライ
マーを追加した。このようにして全ての公知のNa+チャンネルにある保存配列
を認識する汎用プライマーを用いた。増幅領域の中央部には有意な配列があり、
遺伝子長ポリモルフィズム(多型性)が認められた(図6および Gu et al., (1
997) J. Neurophysiol. 77, 236-246; Fjell et al., (1997) Mol. Brain Res.
50, 197-204)。コドンの縮退に応じ、cDNAプール中に存在しうる全てのテ
ンプレート(表1)に対して高い効率でプライミングが行われるよう、順方向プ
ライマー4本(F1〜F4)および逆方向プライマー3本(R1〜R3)を設計
した。しかしながら、反応のストリンジェンシー(厳格性)によっては、これら
のいずれのプライマーも複数のテンプレートに結合し得る。順方向プライマーF
1は、サブユニットaI、aIII;aNa6;aPN1;am1、arH1およ
びaSNS/PN3にマッチする。個々のサブユニットの配列中にはこのプライ
マーに対して1ないし2箇所のミスマッチを示す。すなわち、第16位のCに対
してT、および第18位のGに対してA(aNa6)、第6位のRに対してC(
am1)、第18位のGに対してA(arH1)、そして第3位のCに対してT
(aSNS)である。順方向プライマーF2はサブユニットaIIに適合する。順
方向プライマーF3は、aNa6と完全に一致し、またarH1に対しては単一
のミスマッチすなわち第16位のTに対しCでマッチする。逆方向プライマーR
1はサブユニットaI、aII、aIII、aNa6、aPN1、am1およびar
H1にマッチする。このプライマーは4つのサブユニットと比較すると以下のミ
スマッチ部位を有する。すなわち、第3位のAに対してG、第4位のGに対して
T、および第7位のGに対してT(aI);第1位のCに対してTおよび第19
位のGに対してA(aPN1);第3位のAに対してGおよび第7位のGに対し
てA(am1);第3位のGに続いてGの追加、第14〜15位のCTに対して
GCおよび第21位のTに対してA(arH1)。逆方向プライマーR2はサブ
ユニットaSNS/PN3にマッチする。
プライマー。マラソンプライマーを除く全てのプライマーはエール大学、病理学
科、分子医学重要技術プログラムにおいて合成された。
増幅するため、マウスの非典型ナトリウムチャンネルmNa2.3を用いて、順
方向プライマーF4および逆方向プライマーR3を設計した(Felipe et al., (
1994) J. Biol. Chem. 269, 30125-301231)。増幅された配列をpCR−SCR
IPTベクター(Stratagene社)のSrfI部位にクローニングした
。前記ヌクレオチド断片は対応するmNa2.3配列に対し88%の同一性を示
した(Dib−HajjとWaxman、未発表)。制限酵素XbaIは、本サ
ブユニットにユニーク(一箇所のみ切断点を持つ)であることが見出された。最
近、推定ナトリウムチャンネルであるNaG様(SCL−11:Y'09164
)サブユニットの全長cDNAクローンの配列が公表された(Akopian et al.,
(1997) FEBS Lett. 400, 183-187)。報告された配列は本発明者らの配列と99
%一致し、NaGのPCR産物のサイズおよび制限酵素多型性が確認される。
示した。サブユニット配列は全てGenbankデータベース(登録番号: a
I:X03638;αII:X03639;αIII:Y00766;αNa6:L
39018;αhNE−Na:X82835;αm1 M26643;αrH1
M27902およびαSNBS X92184;mNa2.3 L36761
9)。続いて、NaN特異的プライマーおよび汎用プライマーR4およびR5の
2本とを用い、前述の断片の3'末端側NaN配列の増幅が達成された。R4プ
ライマーの配列はドメインIIS6セグメントのちょうどN末端に位置するアミノ
酸配列MWV/DCMEV(配列番号38)に基づいた。(参考資料として電位
依存性ナトリウムチャンネルaサブユニットの図3模式図を参照)。R5プライ
マーの配列は、ドメインIIIS3セグメントのN末端部分の一部を形成するアミ
ノ酸配列AWCWLDFL(配列番号43)に基づく。
8mMおよびExpand Long Template DNAポリメーラーゼ
ミックス(Boehringer Mannheim社)17.5単位を用いて
行った。Expand Long Template DNAポリメーラーゼ ミッ
クスは、従来の熱耐性DNAポリメラーゼ類と比較して、非特異的な増幅の増加
なしにPCR産物の収率を増加する(Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.U
SA 91, 2216-2220; Cheng et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 569
5-5699)。PCR反応バッファーは、50mMTris塩酸(pH9.2)、1
6mM(NH4)2SO4、2.25mM MgCl2 、2%(v/v)DMSO
および0.1%Tween20からなる。前述(Dib-Hjj et al., (1996) FEBS
Lett. 384, 78-82)のように、増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置
(PTC−200、MJResearch社)を用いて2段階で行った。第一に
、熱変性ステップを90℃で4分間、アニーリングステップを60℃で2分間、
そして伸長反応ステップを72℃で90秒とした。第2に、熱変性ステップを9
4℃で1分間、アニーリングステップを60℃で1分間、および伸長反応ステッ
プを72℃で90秒とした。第2段階は33回のリピートとし、最終サイクルの
伸長反応ステップを10分間に延長し、全段で35サイクルとした。
マラソンAP−1およびNaN特異的プライマー0.2mMおよびExpand
Long Template 酵素ミックス3.5単位を用い、全量を50ml
として行った。伸長反応時間は予期される産物に基づいて毎分800bpとなる
ように調整した。5'および3'RACE増幅を、マラソンAP−1/NaN−特
異的R6プライマーのペア、およびNaN−特異的F5/マラソンAP−1プラ
イマーのペアをそれぞれ用いて行った。PCR反応バッファーは、50mMTr
is塩酸(pH9.2)、16mM(NH4)2SO4、3.0mM MgCl2
、2%(v/v)DMSOおよび0.1%Tween20からなる。3段階増幅
反応はプログラム式サーマルサイクラー機(PTC−200、MJリサーチ社)
を用いて行った。初段熱変性ステップは92℃で2分間とした。続いて、熱変性
92℃・20秒、アニーリングステップ60℃・1分間、伸長反応ステップ68
℃を1サイクルとして35サイクルとした。最後に伸長反応を68℃で5分間行
った。Nested PCRを、一次RAGE増幅産物の500倍希釈2mlを
用い、全量50mlとして一次RAGE反応と同条件で行った。プライマー・ペ
ア、AP−2/NaN特異的R7およびNaN特異的F6/マラソンAP2を、
それぞれNested5'および3'RACE反応に用いた。2次RAGE産物を
1%アガロースゲルからバンド単離し、Qiaexゲル抽出キット(Qiage
n)を用いて精製した。
ット間で長さ、配列ともに変化に富んでいる。この例外は、ドメインIIIとIVの
間のループである。
シング・グループ W.M.ケック財団バイオテクノロジー・リソース研究所に
おいて配列決定した。予想アミノ酸配列決定を含む配列分析は、市販ソフトウェ
アLasergene(DNASTAR)およびGCGを用いて実施した。図2
にNaNの推定アミノ酸配列を示す。ドメインI〜IVの膜貫通セグメントを下線
で示した。
ンcDNA構築を前述のラットにおける実験と同様に行った。一次増幅はラット
NaNプライマーを用いて行った。順方向プライマーはラット配列のヌクレオチ
ド765−787(5'CCCTGCTGCGCTCGGTGAAGAAG3')
(配列番号24)に対応し、そして逆方向プライマーはラット配列のヌクレオチ
ド1156−1137(5'GACAAAGTAGATCCCAGAGG3'(配
列番号25);ネガティブストランド)に対応する。増幅により期待されるサイ
ズの断片が得られた。本断片の配列はラットNaNと高い類似性を実証した。異
なったラット由来プライマーおよび新規マウスNaN配列に基づいて新たに設計
されたプライマーを用いて、他の断片を増幅した。最終的に、マウスマラソンc
DNAテンプレートおよびマウスNaN特異的プライマーと、マラソンcDNA
合成時に導入されたアダプタープライマーとを組み合わせて用い、より長い断片
を増幅した。これらの断片をプライマー・ウォーキング法により配列決定した結
果を図7Aに示した。
開始コドンATGから数えて−8番目に位置するフレーム外ATGが欠失してい
る。翻訳終止コドンTGAは5314位に位置する。ポリA付加信号(AATA
AA)は5789位に位置し、23ヌクレオチド長と推定されるポリAテールは
5800位から始まる。前記配列は、ラットNaNと90%類似する1765ア
ミノ酸残基のORF(オープンリーディングフレーム)をコードする(図7B)
。NaNをコードする遺伝子はScn11aと命名された。
行い、C57BL/6J系統およびSPRET/Ei系統間の遺伝子多型を同定
した。94匹の動物についてBSS戻し交配パネル法(Rowe et al., (1994) Ma
mm. Genome 5, 253-274)による遺伝子型(ゲノタイプ)決定を行い、第9染色
体遠位端マーカー群とリンケージすることが証明された(図10)。Scn11
aとマイクロサテライトマーカーD9Mit19との間では組換えは観察されな
かった。マウス第9染色体のMGDコンセンサスマップと発明者らのデータを比
較した結果、Scn11aは、他の2つのTTX−R型電位依存性ナトリウムチ
ャンネルScn5a(George et al., (1995) Cytogenet Cell. Genet. 68, 67-
70)およびScn10a(Kozak & Sangameswaran, (1996) Mamm. Genome 7, 78
7-788; Souslova et al., (1997) Genomics 41, 201-209)に近接することが明
らかになった。
述の方法で行った。
ス鎖)に相当する。前記プライマーの配列は、5'CTCAGTAGTTGGC
ATGC3'(配列番号26)である。逆方向プライマーはEST AA8852
1 1の配列270−247(マイナス鎖)に相当する。前記プライマーの配列
は5'GGAAAGAAGCACGACCACACAGTC3'(配列番号27)
となる。前述の方法で増幅を行った。PCR増幅はうまくゆき、そして2.1K
bpf断片が得られた。前記断片はゲル精製され、マウスNaNで行ったのと同
様にプライマーウォーキング法による配列決定を外注した。EST配列を両方向
に延長し、他のサブユニットと比較したところ、新たに得られた配列はマウスN
aNと最も高い類似性が認められた。
ト2.1kbp断片について配列決定を行った。両プライマーでは伸長しきれな
かった残りの部分の配列決定には、これらに加えて新たに2本のプライマーを用
いた。このようにして、順方向プライマー1(上記)および本2.1kbp断片
5'末端近傍に相当するヒトNaN逆方向プライマー(5'GTGCCGTAAA
CATGAGACTGTCG3')(配列番号44)を用い5'上流側配列にまで
延長した。部分アミノ酸配列を図8Bとして提出する。
バイオテクノロジーインフォメーションセンター(National Center for Biotec
hnology Information)のアドバンスドBLASTプログラムを用いて解析した
結果、ラットNaNの相当部分に対して64%の同一性を示した(伝統的な置換
法を許容する場合では73%の類似性となる)。クラスタル法による並列比較(
Lasergeneソフトウェア、DNAStar社)を用いるとヒトNaNは
マウスおよびラットNaNに対し、それぞれ68%および69%の類似性を示す
。マウスとラット間では相当部分の類似性は88%となる。
ィングフレーム全長にわたっていることが分かった。この伸張した配列は、図1
1A(配列番号41)に示されている。cDNAの部分配列に関して言及された
特徴に加えて、伸張された配列の顕著な特徴には、31位の翻訳開始コドン(A
TG)、5400位の翻訳終止コドンがある。認識可能なポリアデニル化信号は
、まだ観察されていないが、開示された配列の3'に位置していると推定される
。ヒトNaNタンパク質の推定上のアミノ酸配列は、図11B(配列番号42)
に記されている。
て、図1および2に示すラットNaN全長cDNAに対し、C末端側が切断され
た短縮型をコードするラットNaNcDNAが得られた。前記変異体NaNcD
NAは、全長NaNのC末端側387アミノ酸残基を欠失し、そのC末端には新
規の94アミノ酸残基の延長を含むNaNをコードする。この新規の配列は、エ
クソン23内の潜在的スプライシング・ドナー・サイトとイントロン23の位置
にあたる部分からなる新たなエクソン23'から生じる。この新規のC末端アミ
ノ酸配列は:AAGQAMRKQG DILGPNIHQF SQSSETPFL
G CPQQRTCVSFVRPQRVLRVP WFPAWRTVTF LSR
PRSSESS AWLGLVESSG WSGLPGESGP SSLL (配列
番号28)である。短縮型変異体のN末端側は図2に示した全長ラットNaNの
アミノ酸残基第1〜1378番と同一である。代替エクソンおよびそのスプライ
シングパターンはcDNA配列および染色体ゲノム配列のそれぞれの領域を比較
することにより確認された。
決定された(George et al., (1993) Genomics 15, 598-606; Souslova et al.,
(1997) Genomics 41, 201-209; McClatchey et al., (1992) Hum. Mol. Genet.
1, 521-527; Wang et al., (1996) Genomics 34, 9-16)。これらの遺伝子群は
、それらの構成において顕著な類似性を有し、大部分のエクソン・イントロンの
境界の予想マップを提供する。本明細書に開示され、入手可能なNaNのラット
、マウスおよびヒトcDNA配列に基づき、標準的PCRプロトコルを用いて、
他の種からのNaN同族配列を増幅するPCRプライマーを設計する。
特異的プローブで、市販のゲノムDNAライブラリーを標準的ライブラリースク
リーニング法(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ? A Laboratory
Approach, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Proto
cols in Molecular Biology, Greene 出版社)を用いてスクリーニングする。こ
の戦略は、配列決定できるゲノムDNA単離体を与え、そしてエキソン/イント
ロン境界がラット、マウスまたはヒトcDNA配列へのホモロジーによって決定
できる。
プルまたは手術組織から得たヒト後根神経節または三叉神経節または他の頭頚部
神経節より全長NaNヒトcDNAホモローグを単離する。トータルリボ核酸(
RNA)は、これらの組織から実施例1に記載したイソチオシアン酸グアニジン
中に抽出することによって単離される(Saiki et al., (1985) Science 230, 13
50-1354)。
サイズを決定するにあたっては、転写産物のサイズを決定する方法は実施例9に
記載のとおりである。
経節のポリA+RNAからcDNAライブラリーを調製した(Sambrook et al.,
(1989) Molecular Cloning ?A Laboratory Approachm, Cold Spring Harbor P
ress; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Gre
ene 出版社)。
酵素により1本鎖cDNAとしてコピーした。次いで、RNA−DNAハイブリ
ッド中のRNAをリボヌクレアーゼHにより断片化させつつ、大腸菌DNAポリ
メラーゼIにより第2鎖断片を合成した。大腸菌DNAリガーゼを用い、2本鎖
cDNAの両端を修復し、かつ、特定の制限酵素(例えば、EcoRI)認識部
位を持つリンカーを連結した。集積したcDNAインサートをラムダ−Zap(
Stratagene社)などの種々の市販品バクテリオファージベクターの1
つに連結した。操作手順を以下に詳述する。
を65〜70℃で、2〜5分間熱し、次ぎに直ちに氷中で急冷する。別のチュー
ブに、5mMdNTPミックス(終濃度各500μM)20ml、5xRTバッ
ファー(終濃度1x)40ml、200mMDTT(終濃度10mM)10ml
、0.5mg/ml oligo(dT)12-18(終濃度50mg/ml)、60
ml脱イオン水、10単位RNasin(終濃度50単位/ml)10mlを、
この順に加える(全体で180ml)。Voltexで混和し、短時間ミクロ遠
心機にかけ、この混合液をRNAの入ったチューブに加える。200単位のAM
VまたはMMLV逆転写酵素20mlを、200mlの溶液の終濃度が1000
単位/mlとなるように加える。数回上下にピペッティングして混和した後、1
0mlを、α32PdCTP1mlを入れた別のチューブに移す。通常、両方のチ
ューブを室温で5分間保温した後、両方のチューブを42℃で1.5時間保温す
る。放射標識したアリコートを、取りこみと回収率が推定できるよう回収する。
0.5M EDTA、pH8.0を1ml加えて反応を停止し、−20℃で凍結
保存する。放射標識した反応液は、後にcDNAインサートの平均サイズおよび
収量を推定するのに用いる。0.5M EDTA(pH8.0)を4ml、バッ
ファー添加フェノールを200ml加えて主反応を停止する。混合液を十分にボ
ルテックスし、マイクロ遠心機により室温で1分間遠心して液相を分離し、上部
の水層を新しいチューブに移す。フェノール層を1xTEバッファー(10mM
Tris、1mM EDTA、pH 7.5)で再抽出し、2回の抽出の水層を
集める。フェノール層を再抽出することにより収量が改善される。cDNAを、
7.5M酢酸アンモニウム(終濃度2.0〜2.5M)および95%エタノール
を用いてエタノール沈殿する。ドライアイス・エタノール浴中に15分間置き、
4℃にまで暖め、マイクロ遠心機中、4℃で10分間、最高速度で遠心して核酸
をペレット化する。黄白色の小ペレットを氷冷70%エタノールで洗い、マイク
ロ遠心機に4℃、最高速度で3分間かける。再び上清を除き、短時間ペレットを
乾燥する。
以下の順に加える(全量400ml):5mM dNTPミックス(各終濃度5
0μM)4ml、5x第2鎖バッファー(終濃度1x)80ml、5mM β-N
AD(終濃度150μM)12ml、10μCi/ml α32P-dCTP(終濃
度50μCi/ml)2ml。ボルテックスで混和し、短時間マイクロ遠心機に
かけた後、RNaseH 4単位(終濃度10単位/ml)4ml、大腸菌DN
Aリガーゼ20単位(終濃度50単位/ml)4ml、および大腸菌DNAポリ
メラーゼI100単位(終濃度250単位/ml)10ml。上下にピペッティ
ングして混和し、短時間マイクロ遠心機にかけた後、12〜16時間、14℃で
保温する。第2鎖合成の後、反応液4mlを取り、酸不溶性画分への放射標識取
り込み分から収率を決定する。第2鎖合成反応液を400mlのバッファー添加
フェノールで抽出し、前述のように、200mlのTEバッファーpH7.5で
再抽出する。次ぎに、前述のように2本鎖cDNAをエタノール沈殿する。
端を平滑化する。ペレットを42mlの水に再懸濁し、以下の試薬を以下の順に
加える(全量80ml):5mM dNTPミックス(各終濃度310μM)5
ml、5xTAバッファー(終濃度1x)16ml、5mMβNAD(終濃度6
2μM)1ml。ボルテックスで混和し、短時間マイクロ遠心機にかけ、以下を
加える:2mg/ml RNaseA(終濃度100ng/ml)4ml、RN
aseH 4単位(終濃度50単位/ml)4ml、大腸菌DNAリガーゼ20
単位(終濃度250単位/ml)4ml、およびT4DNAポリメラーゼ8単位
(終濃度100単位/ml)4ml。前述のように混和し、37℃で45分間保
温する。120mlのTEバッファー(pH7.5)、次いで1mlの10mg
/ml tRNAを加える。200mlのバッファー添加フェノールで抽出し、
前述のように、100mlのTEバッファーで再抽出する。前述のように2つの
水層の分を合わせエタノール沈殿する。
0ng、リンカー・アダプター溶液(10mM)2ml、5xDNAライゲーシ
ョンバッファー2ml、T4DNAリガーゼ(単位/ml)1mlを以上の順序
で加え、全量を10mlとする。穏やかにピペッティングして内容物を完全に混
和した後、チューブをマイクロ遠心機中で短時間遠心する。16℃で一晩、また
は室温(19〜23℃)で3〜4時間保温する。70℃で5分間熱してリガーゼ
酵素を失活させる。このcDNAを通常はEcoRIにより消化して、ベクター
へ連結するためのcDNAの粘着性末端を用意し、そしてリンカーによるコンカ
テマーを切断する。反応液の組成は、通常、cDNA10ml、10xEcoR
Iバッファー(内容は販売元により異なる)2ml、EcoRI(10単位/m
l)2mlに滅菌水を加えて全量を20mlとする。混合液を37℃で2〜4時
間保温する。
)cDNA断片を除去する。例えば、プラスチック製カラム(プラスチック製5
mlピペットを用いてもよい)に滅菌したグラスウールの小片で栓をして、1−
ml セファロースCL−4Bカラムを調製する。前記カラムを、0.1M食塩
を含む1xTE(10mM Tris、1mM EDTA、pH7.5)で平衡化
する。cDNAをカラムにロードし200μlづつ分画を採取する。各分画の2
μlアリクォートをゲル電気泳動法およびオートラジオグラフィーにより分析し
て、cDNA溶出画分のピークを決定する。通常、ピークの前半分を含む画分を
プールし、エタノール沈殿で精製し、蒸留水10μlに再懸濁する。
化され、断端がリン酸化されたものが市販されている(例えば、Stratag
ene社製ラムダgt10など)。調製したcDNAを製造者のマニュアルに従
ってラムダベクターにライゲーションにより挿入する。ライゲーションしたベク
ター/cDNA分子を市販のパッケージング抽出液を用いてファージ粒子にパッ
ケージする。
るRNAプローブを用いる。他のヌクレオチド配列は、ヒト核酸配列のヌクレオ
チド第765-1160番のようなNaN配列に基づき開発することができる(
図2,7および8)。NaNのHindIII/BamHI断片をpBluesc
ript(SK+)ベクター(Stratagene社)に挿入した。得られた
構築物の配列をシークェンシングで確認した。挿入DNAの方向は、HindII
IおよびBamHIのそれぞれの制限酵素切断部位で直線化した構築物をの5'端
および3'端がT7およびT3RNAポリメラーゼのプロモーターそれぞれに近
接するようにした。ジゴキシゲニン標識されたセンス(HindIIIで直線化し
T7RNAポリメラーゼで転写)およびアンチセンス(BamHIで直線化しT
3RNAポリメラーゼで転写)の転写産物をMEGAscript転写キット(
Ambion社)を用い、製造者の特性表に基づきインビトロで調製した。簡潔
に説明すると、1μgの直線化したテンプレートをそれぞれのRNAポリメラー
ゼにより、以下試薬を含む、すなわち、それぞれのRNAポリメラーゼおよびR
Nase阻害剤および反応バッファーを含む1x酵素ミックス(Ambion社
)、7.5mMATP、GTPおよびCTPのヌクレトチド、5.625mM
UTPおよび1.725mM Dig−11UTP(Boehringer M
annheim社)からなる全量20μl中で転写した。インビトロ転写反応は
37℃水浴中で、3時間行った。リボヌクレアーゼを含まないデオキシリボヌク
レアーゼI(2単位/μl)1μlを各反応液に加え、37℃でさらに15分間
保温することによりDNAテンプレートを除去した。ヌクレアーゼを含まない水
、30μlおよびLiCl溶液(7.5M塩化リチウム、50mM EDTA)
25μlを加えて反応を停止した。
心機で13000xg、4℃、15分間ペレットした。上清を取り除き、ペレッ
トを100μlの75%エタノールで一回洗った。混合液を室温13000xg
で5分間再遠心した。その後、ペレットを閉じたチャンバー内で風乾し、続いて
リボヌクレアーゼを含まない水、100mlに溶解した。転写産物の収量および
完全性は、DIG/Geniusキットを用い、製造者(Boehringer
Mannheim社)の推奨する条件で、フォルムアルデヒド入りアガロース
ゲル上で対照用DIG標識RNAと比較して決定した。あるいはまた、熟練した
当業者であれば、オートラジオグラフィー分析用の放射標識プローブを設計する
こともできる。
例えば3'非翻訳領域配列なども、同様の方法により、cDNAライブラリ・ス
クリーニングまたはノザン・ブロット解析用のプローブとして用いることができ
る。とりわけ、ファルマシア社製オリゴ・ラベリング・キット、Geniusキ
ット(ベーリンガー・マンハイム社)などの市販のキットを用いてプローブを調
製することができる。
識(上記)または放射標識したDNAまたはcRNAのNaN特異的プローブを
用い、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション・ウォッシュ(50〜
60℃、5xSSC、30分)により、ヒトNaNナトリウムチャンネルの全長
ホモローグを含む組換えプラークを検出する。組換えファージを乗せたニトロセ
ルロースまたはナイロンのフィルターの調製を伴う、標準的プロトコル(Sambro
ok et al., (1989) Molecular Cloning ?A Laboratory Approach, Cold Spring
Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular Bio
logy, Greene 出版社)を用いて、ライブラリーをスクリーニングする。次いで
組換えDNAをNaN特異的プローブ(上記)とハイブリダイズさせる。適度に
ストリンジェントなウォッシュを行う。
ックグラウンドではない)プラークを選び、以降の精製を行う。通常、ファージ
を分離するため、希釈後、一回以上のスクリーニングを実施する。その後、この
結果得られたプラークを精製し、DNAを抽出してクローンDNAのサイズを定
性的に解析する。クローン群について、標準的手法で互いにクロス・ハイブリダ
イゼーションを行い(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning ?A Labora
tory Approach, Cold Spring Harbor Press)、別個の陽性クローンを同定する
。
的クローニング手法を用いて、任意の5'非翻訳配列、開始コドンATG、コー
ド配列、停止コドンおよび任意の3'非翻訳配列、ポリA付加コンセンサス配列
、および場合によりポリA配列、を含む全長cDNA構築体を製造する。重複ク
ローン断片が、全長cDNAクローンを構成するに十分な断片を生成しない場合
、RACE(PCRに基づく)のような別法を用いて、不足部分または全長クロ
ーンを生成することができる。
ローンから得られるNaN特異的cDNA配列をプローブとして用い、ノザンブ
ロット解析法により、ヒト組織中のメッセンジャーRNAのサイズを決定する。
ラットNaNについて記載したものと同様の方法を用いて、クローンしたcDN
Aの生物学的活性を確認する。
摘出組織から得たヒト後根神経節、三叉神経節または他の頭頚部神経節から、前
述のように単離する。それから実施例1に記載したように、cDNAの調製法お
よびPCRに基づく手法を使用する。
イマー(図2(配列番号3)、図7B(配列番号5)、図8B(配列番号8)お
よび図11B(配列番号41)参照)を用い、ポリメラーゼ連鎖反応によりcD
NAを増幅する(Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354)。熟練した
当業者であれば、必要とするホモローグ配列を取得するためにPCR反応におい
て、多くの変更可能な操作条件を操作することができる。このような条件として
は、各サイクルおよびステップの温度、サイクルおよびステップ数、熱耐性ポリ
メーラーゼ、およびMg2+濃度を挙げることができるが、これらに限定されない
。NaNナトリウムチャンネルのうち、より保存された配列に由来するNest
edプライマーを用いれば、より高度の特異性を達成することができる。
xpand Long Template DNAポリメーラーゼ ミックス(Bo
ehringer Mannheim社)1.75単位を用い、全量60μlで
行う。Expand Long Template DNAポリメーラーゼ ミック
スは、従来の熱耐性DNAポリメラーゼ等と比較して、非特異的な増幅の増加な
しでPCR産物の収量を増やす(Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA9
1, 2216-2220; Cheng et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695-5
699)。PCR反応バッファーは、50mMTris塩酸(pH9.2)、16
mM(NH4)2SO4、2.25mMMgCl2、2%(V/V)DMSOおよび
0.1%Tween20からなる。前述(Dib-Hajj et al., (1996) FEBS Lett.
384, 78-82)のように、増幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置(P
TC−200、MJResearch社)を用いて行う。第1に、熱変性ステッ
プを90℃で4分間、アニーリングステップを60℃で2分間、そして伸長反応
ステップを72℃で90秒とする。第2に、熱変性ステップを94℃で1分間、
アニーリングステップを60℃で1分間、および伸長反応ステップを72℃で9
0秒とする。第2段階は33回のリピートにして全段で35サイクルとし、最終
サイクルの伸長反応ステップを10分間に延長する。これに加えて、サンプルと
並行して対照反応を実施する。これには、1)cDNAを除く全ての成分(ネガ
ティブ・コントロール)、2)構成的に発現する産物(例えば、GAPDH)に
対する、プライマーと全ての反応液成分を用いるべきである。
予想したサイズの増幅反応産物に対応するゲル(エジジウムブロミドで染色し、
紫外線光で観察する)に基づきゲルから切り出し、DNAを精製する。
(Invitrogen社)またはpGEMT(Promega社)などであっ
て、これに限定されない、適切なベクターにライゲーションする。この後、クロ
ーンをシークェンシングして、ラット、マウスまたはヒト部分NaNナトリウム
チャンネル配列と類似する配列を含むものを同定する。
た、慣用技法により、発現産物の生物学的活性も確認する。
販のヒト胎児cDNAライブラリーおよび/またはcDNAプールを、NaN特
異的(PCR用)プライマーまたはプローブ(ライブラリー・スクリーニング用
)でスクリーニングする。
び大脳半球、小脳および肝臓(陰性反応組織として)からの全RNAの、10〜
30μgを変性1%アガロース−フォルムアルデヒド・ゲルまたはアガロース−
グリオキサル・ゲル中で電気泳動し、それから標準的分子生物学マニュアル(Sa
mbrook et al., (1989) Molecular Cloning ?A Laboratory Approach, Cold Sp
ring Harbor Press; Ausubel et al., (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, Greene 出版社)に記載され、複数のステップで達成されるとも記載
されているようにナイロン・メンブレンに移す。放射標識(放射比活性が108
dpm/μg以上)またはジゴキシゲニン標識したRNAプローブが通常ノーザ
ン分析に用いられる。アンチセンスRNAプローブ(NaN特異的プローブを用
いるインサイチュハイブリダイゼーションについて記載する実施例20を参照)
を、センスDNA断片からインビトロ合成で創製する。RNAを固定化したメン
ブレンを6xSSCに浸し、RNA側を上にしてハイブリダイゼーション用チュ
ーブ内に置く。メンブレン10平方センチメートル当たり1mlのプレハイブリ
ダイゼーション・ハイブリダイゼーション溶液を加える。通常、プレハイブリダ
イゼーションおよびハイブリダイゼーションは市販のハイブリダイゼーション用
オーブン内のガラスチューブ中で行われる。チューブをハイブリダイゼーション
用オーブン内に置き、回転させながら、60℃で15分間ないし1時間保温する
。希望する容量のプローブをピペットでハイブリダイゼーション・チューブに注
入し、回転させながら60℃で一晩保温を続ける。ハイブリダイゼーション溶液
内のプローブ濃度は、比放射活性が108dpm/μgであれば10ng/ml
、または比放射活性が109dpm/μgであれば2ng/mlとすべきである
(ジゴキシゲニン標識プローブは2〜10ng/mlで用いる)。
を加える。回転させながら室温で5分間保温を行う。ウォッシュ液を交換し、こ
のステップを繰り返す。バックグラウンドを低らすためには、ウォッシュ液の容
量を倍加することも役に立つかもしれない。ウォッシュ液を等量の0.2xSS
C/0.1%SDSに交換し、チューブを回転しながら室温で5分間保温する。
ウォッシュ液を交換し、このステップを繰り返す(これはストリンジェンシーの
低いウォッシュである)。中程度ないし高度にストリンジェントな条件には、適
度な温度(42℃)または高温(68℃)に予熱したウォッシュ液によりさらに
ウォッシュする。最終のウォッシュ液を除き、メンブレンを2xSSC中、室温
でリンスする。次いで、オートラジオブラフィーを1週間までの期間実施する。
代替法として、非放射性プローブを使用する場合は、化学発光技術(Amers
ham社)を利用して信号を検出する。ゲルからの信号をゲル用標準分子量マー
カーと比較し、転写産物のサイズを計算する。
)(配列番号39)および逆方向(5'GACAAAGTAGATCCCAGA
GG3')(配列番号25)プライマーを用い、複数のラットから調製したcD
NAをテンプレートとするRT−PCRを行った。これらのプライマーは、Na
N配列中ヌクレオチド第765番および第1156番の間(392bp)を増幅
し、これらはデータベース中に類似の配列が存在しないことから(国立バイオテ
クノロジーインフォメーションセンターのBLASTNなどのプログラムを使用
)判断してNaN特異的である。通常、増幅反応は、第1鎖cDNA1μl、各
プライマー0.8μMおよびExpand Long Template DNA
ポリメラーゼ酵素ミックス(Boehringer Mannheim社)1.
75単位を用い、全量60μlとして実施した。Expand Long Tem
plate DNAポリメーラーゼ酵素ミックスは、従来の熱耐性DNAポリメ
ラーゼ等と比較して、非特異的な増幅の増加なしにPCR産物の収量を増加する
(Barnes, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220; Cheng et al.,
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695-5699)。PCR反応バッファー
は、50mMTris塩酸(pH9.2)、16mM(NH4)2SO4、2.2
5mMMgCl2、2%(V/V)DMSOおよび0.1%Tween20から
なる。前述(Dib-Hajj et al., (1996) FEBS Lett. 384, 78-82)のように、増
幅反応はプログラム式サーマルサイクラー装置(PTC−200、MJRese
arch社)を用い、2段階で行った。第1に、熱変性ステップを94℃で4分
間、続いてアニーリングステップを60℃で2分間、そして伸長反応ステップを
72℃で90秒で行った。第2に、熱変性ステップを94℃で1分間、アニーリ
ングステップを60℃で1分間、次いで伸長反応ステップを72℃で90秒とし
た。第2ステージは33回のリピートとして全段で25〜35サイクルとし、最
終サイクルの伸長反応ステップを10分間に延長した。
阻害因子によるものではないことを確認するため、内部対照としてグリセルアル
デヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を用いた。ラットGAPDHの
配列をヌクレオチド第328−994番(登録番号:M17701)に対応する
66bpの産物を増幅するプライマーを用いて、共増幅した。ヒト遺伝子の構造
に基づき、増幅産物は複数のエクソン・イントロン接合部位にまたがる(Benham
et al., (1987) Nature 328, 275-278)。調整されたトータルRNAを汚染し
ているかもしれないゲノムの偽遺伝子発現産物からのGAPDH配列の増幅を防
止するため、逆転写反応に先立ち、定法どおりデオキシリボヌクレアーゼIによ
る処理を行った(Ercolani et al., (1988) J. Biol. Chem. 263, 15335-15341
)。
現する。図4に、種々の神経性および非神経性組織について行ったRT−PCR
によるスクリーニングの結果を示す。レーン1,2,4,9および16は400
bpマーカーとともに泳動した単一の増幅産物が、392bpのNaN特異的産
物と一致することを示す。レーン1および16、2,4および9は、それぞれD
RG、大脳半球、網膜および三叉神経節を用いた産物を含む。このアッセイ法に
より、NaNは、小脳、視神経、脊髄、座骨神経、前頭部脳神経節(superior cr
anial ganglia)、骨格筋、心筋、副腎、子宮、肝または腎(それぞれ、レーン3
、5−8、および10−15)において検出されなかった。並行して行ったPC
R反応においては、GAPDHの増幅産物が同様に得られていることから(デー
タ示さず)、NaNの信号が大脳半球および網膜において減衰し、かつ、他の組
織において検出されないことは、分解したRNAまたはcDNAテンプレートお
けるのPCRの阻害因子によるものではないことがわかる。
換宿主細胞は、通常、HEK293細胞などの細胞にコンストラクト(構築物)
とともに、蛍光レポータープラスミド(pGreen Lantern−1、L
ife Technologies社)をリン酸カルシウム沈殿法を用いて同時
に形質導入することにより調製される(Ukomadu et al., (1992) Neuron 8, 663
-676)。HEK293細胞は、通常10%子牛胎児血清(Life Techn
ologies社)添加高ショ糖DMED培地(Life Technolog
ies社)中で培養する。48時間後、緑色の蛍光を発する細胞を記録用に選択
する(Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14)。
ストラクトを他の哺乳類細胞用選択マーカーを備えるベクターにクローニングす
る。形質導入にはリン酸カルシウム沈殿法を用いる(Ukomadu et al., (1992) N
euron 8, 663-676)。ヒト胎児腎細胞(HEK−293)、チャイニーズ・ハム
スター卵巣細胞(CHO)その他の適切な細胞株を10%子牛胎児血清添加ダル
ベッコ改変イーグル培地中で標準的組織培養条件下で培養する。細胞培養液にD
NA・リン酸カルシウム混合液を加え、15〜20時間置いた後、細胞を新鮮な
培地で洗う。48時間後、抗生物質(G418、Geneticin、Life
Technologies社)を加え、ネオマイシン耐性形質を獲得した細胞
を選択する。G418で2〜3週間後、10〜20個の単離コロニーを滅菌した
10mlピペットの先を使って収穫する。コロニーをさらに4〜7日培養し、分
割し、続いて、全細胞パッチ・クランプ記録手法およびRT−PCR法によりチ
ャンネルの発現を試験する。
、ラット、マウスまたはヒトNaNに特異的な抗体を製造する。一例として、免
疫原性および表面到達性の基準を満足するので、ペプチド鎖CGPNPASNK
DCFEKEKDSED(ラットアミノ酸第285−304番)(配列番号40
)が選択された。このペプチド配列は公開データベース中のいかなる配列にも適
合しない。下線を付したシステイン(C)残基はジスルフィド結合の形成を防ぐ
ためにアラニン(A)に変更された。このアミノ酸変更により抗体の特異性に大
差を生じないと期待される。
は標準的手法によった。精製抗体は培養物中、DRGに対して試験を行った。こ
れらの抗体を用い、過剰量ペプチドによるブロッキングに前後して、標準的手法
に従い免疫染色を実施した。
を免疫化学的に検出した。生理食塩水(137mM NaCl、5.3mM KC
L、1 ITIMM902 25mM ソルビトール、10mM HEPES、3m
M CaCl2 pH7.2)でカバーガラスを洗い、4%パラフォルムアルデヒ
ド・0.14Mリン酸バッファー中で、4℃、10分間固定し、リン酸バッファ
ー食塩水(PBS)で5分間三回洗浄後、20%ヤギ正常血清、1%ウシ血清ア
ルブミン、0.1%TritonX−100を含むPBSで15分間ブロッキン
グした。これらカバーガラスを抗NaN抗体(100倍希釈液)中で4℃、一晩
保温した。一晩保温に続き、カバーガラスをPBSでよく洗った後、Cy3標識
・抗ウサギIgG(1:3000、Amersham社)とともに室温で2時間
保温した。カバーガラスをPBSで洗浄後、アクアポリマウントでスライドガラ
スにマウントした。ニューロンを、蛍光波長ユニットを装備したライツアリスト
プラン光学顕微鏡で検査し、Dage社DC330TカラーカメラおよびSci
onCG−7カラーPCIフレームキャプチャ装置で画像を録画した(図7を参
照)。
けるナトリウムチャンネル発現の可塑性を調べた。体重240〜260gのSp
lague−Dawley系成熟メスラット22匹をペントバルビータール・ナ
トリウム塩(50mg/kg静注)で麻酔し、右側座骨神経を大腿部中央で露出
した。BennetteとXieの方法(1988,Pain 33, 87-107)により
、クロム・ガット手術糸(4−0号)で神経周囲を4針、緩く結紮した。切開部
位を層状に重ねて閉じ、静菌性抗生物質を筋注した。
的な変動が見られ、これと並行してこれらのニューロンにおいて種々のナトリウ
ムチャンネルの転写産物が変動することが判明している。TTX−Rであるナト
リウム電流および2つのTTX−Rナトリウムチャンネル(SNS/PN3およ
びNaN)は、顕著に減衰したが、その一方、急速にリプライミングされるTT
X−S電流が出現するようになり、TTX−S電流を生じるαIIIナトリウムチ
ャンネルの転写産物はアップレギュレートされる。本発明者らは、軸索切断と対
照的に、術後14日間でDRGにCCIに起因する変化が生じることを見出した
。TTX−Rナトリウム電流同様、2つの感覚ニューロンに特異的なTTX−R
チャンネルであるNaNおよびSNSの転写産物は著しくダウンレギュレートさ
れ、その一方、TTX−S αIIIナトリウムチャンネルの転写産物は、小径DR
Gニューロンでアップレギュレートされていた。これらの変化は、外傷から引き
起こされる痛覚過敏の一因であるDRGニューロンの高興奮性の原因の一部とな
りうる。
性を調節する薬剤、例えば、チャンネルを遮断し、または阻害し、あるいはチャ
ンネルの開口を促進する薬剤をアッセイする。チャンネル活性は電位依存性であ
るため、試験する薬剤によって変調されたベースライン活性を観察するためには
、脱分極条件を用いることもある。脱分極は、利用可能ないかなる手段によって
も達成できるが、例えば、細胞外カリウムイオン濃度を約20〜40nMに増加
させるか、あるいは電気パルスを繰り返し印加する、などの方法がある。
転換細胞と培養する(Dib-Hajj et al., (1997) FEBS Lett. 416, 11-14)。十
分な期間培養を続けた後、Na+チャンネル活性における薬剤によって誘発され
た変化をパッチクランプ法で測定することができる(Hamill et al., (1981) Pf
lugers Arch. 391, 85-100)。これらの測定のデータは、マッキントッシュ・ク
ァドラ950または同様のコンピューター上でPulse(バージョン7.52
、ドイツ、HEKA社)などのプログラムを用いて得られる。ガラス毛細管をS
utter社P−87プラー機または同様の装置を用いて、炎で先端を滑らかに
して電極(0.8〜1.5MW)を工作する。通常、細胞については、シール電
圧初期値が5Gオーム未満である、漏洩電流が大きい(−80mでの保持電流が
0.1nA未満)、膜に気泡がある、およびアクセス抵抗値が5Mオーム未満で
ある場合のみ分析が考慮される。アクセス抵抗値をモニターし、抵抗値に変動が
生じた場合はデータを使用しない。直列の補償抵抗を用いて、電圧誤差を最小に
する、そして、必要であればコンピューター制御アンプまたは同様の手法でキャ
パシタンス浮動を相殺する。
最大電圧変動が10mV以下となるものを使用する。電圧クランプ記録を取るた
めにリニアサブトラクション法を用いる。膜電流は、典型的には5KHzでフィ
ルターをかけ、20KHzでサンプリングする。ピペット溶液は、140mM
CsF、2mM MgCl2、1mM EGTAおよび10mM Na−HEPES
(pH7.3)などの標準的溶液を含む。標準のベージング溶液は140mM
NaCl、3mM KCl、2mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM H
EPES、および10mMグルコース(pH7.3)などの標準的溶液である。
位)不活性化特性に基づきトロドトキシン(TTX)抵抗性およびTTX感受性
Na+電流を区別する、プレ・パルスプロトコルによってTTX抵抗性およびT
TX感受性電流を測定する(Cummins & Waxman (1997) J. Neurophysiol. 17, 3
503-3514; Sontheimer & Waxman, (1992) J. Neurophysiol. 68, 1001-1011)。
常(電位)状態の特性、キネティックス、およびリプライミングなどのナトリウ
ム電流の性状を測定する。電流量および細胞のキャパシタンスを測定することに
よりNa+電流密度を推定し、これに基づいて異なる条件下でのチャンネル密度
を比較することが可能となる(Cummins & Waxman (1997) J. Neurophysiol. 17,
3503-3514, 30)。電流クランプ条件で細胞を調べて、自発性および誘発性活動
電位の発生パターン、発生の閾値、反応周波数特性、および脱分極・過分極、さ
らに発電の他の局面を調べる(Sontheimer & Waxman, (1992) J. Neurophysiol.
68, 1001-1011)。NaNを発現する対照細胞、および試験する薬剤に曝露され
た細胞の両方でこれらの測定を行う。
活性を調節する薬剤のアッセイ 試験する薬物を、NaNチャンネル活性を呈する細胞とともに培養する。十分
な期間の培養後、薬剤により誘発されたNa+チャンネル活性の変化を、SBF
Iを用い、イメージの相対強度により[Na+]量を測定する。本方法では、S
BFI(ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート(Harootunian et al.,
(1989) J. Biol. Chem. 264, 19458-19467))のようなNa+の指示薬または同
様の色素を用いて、よって細胞質中のフリー[Na+]を測定する。まず、細胞
に膜透過性であるSFBIのアセトキシメチル・エステル体(SBFI/AM)
または同様の色素(通常、ジメチルスルフォキシド(DMSO)に10mMの濃
度に溶かしてストック溶液とする)をロード(浸透)させる。市販の相対光強度
測定装置(例えば、Georgia Instruments社製品など)を用
いて顕微鏡のステージ上で信号強度を記録する。適切な波長(例えば、340:
385nm)の励起光を供給する。励起光を円二色性反射盤(400nm)を通
して、細胞へ通過させ、450nm以上の発光を集光する。蛍光シグナルは、例
えば(GenIISySなどの)イメージ・インテンシファイアーで増幅され、C
CDカメラまたは同様のデバイスに集められ、フレーム・グラバーへインターフ
ェースされる。蛍光の減衰を考慮して、細胞質中フリー[Na+]のアッセイに
は340:385の波長比が用いられる。
液を潅流する(典型的には、0および30mM、または、0,30および50m
M[Na+]、およびグラミシジンおよびモネンシン)。RoseとRanso
mの報告によれば(Rose & Ransom, (1996) J. Physiol. (Lond) 491, 291-305
)、SBFIの345/390の蛍光比は[Na+]i濃度の変化に対して単調に
変化する。実験は複数(典型的には少なくとも4)の異なるカバーガラスを用い
て繰り返し行い、対照用細胞、およびチャンネルの活性を遮断し、阻害し、また
は増強する様々の濃度の薬剤に曝露した細胞において統計的に有意な測定結果が
得られるようにする。このような方法はSontheimerらにより解説され
ている(Sontheimer et al., (1994) J. Neurosci. 14, 2464-2475)。
性を調節する薬剤、例えば、チャンネルを遮断し、阻害し、あるいはチャンネル
の開口を促進する薬剤をアッセイする。例えば、試験する薬剤を、Na+チャン
ネルを発現するHEK293、または他の形質転換細胞(Dib-Hajj et al., (19
97) FEBS Lett. 416, 11-14)と培養する。十分な期間の培養後、アイソトープ
法によりNa+の流入量を測定し、薬剤により誘発されたNa+チャンネル活性の
変化を検出する。22Naは、ガンマ線の放出体であり、Na+の流量測定に利用
でき(Kimelberg & Waltz, (1988) The Neuronal Microenvironment (Boulton e
t al., 編集) Humana Press)、そして36Rb+はNaチャンネル活性の指標とな
るNa+/K+ATPase活性の測定に利用できる(Sontheimer et al., (1994
) J. Neurosci. 14, 2464-2475)。86Rb+イオンはK+イオンと同様にNa+/
K+ATPaseに取り込まれるが、その半減期は42K+よりもはるかに長いとい
う利点を有する(Kimelberg & Mayhew (1975) J. Biol. Chem. 250, 100-104)
。したがって、一方向性のウアバイン感受性36Rb+の取り込みを測定すること
により、活動電位の源であるNa+/K+ATPase活性を定量的にアッセイす
ることができる。
プ含量を液体シンチレーションカウンターまたは類似の方法で測定し、細胞蛋白
量を培養細胞用変法等(Goldschmidt & Kimelberg (1989) Anal. Biochem. 177,
41-45)に従うビシンコニン酸蛋白アッセイ(Smith et al., (1985) Anal. Bio
chem. 150, 76-85)等で決定する。Na+を遮断し、阻害し、またはチャンネル
の開口を促進する薬剤の存在下または非存在下で22Naおよび36Rb+の流量を
決定する。これによりこれら薬剤のNaNに対する作用の決定が可能となる。
ている(Rizzo et al., (1994) J. Neurophysiol. 72, 2796-2815)。 簡略に述
べると、Splague−Dawley系成熟メスラットからの腰椎神経節(L
4、L5)の支持組織・髄鞘を除去し、コラーゲナーゼ、次いでパパインを含む
酵素溶液中で順次培養する。組織を、1:1ダルベッコ改変イーグル培地(DM
EM)およびハンクスF12培地、10%ウシ胎児血清、1.5mg/mlトリ
プシン・インヒビター、1.5mg/mlウシ血清アルブミン、100単位/m
lペニシリン、および0.1mg/mlストレプトマイシンをふくむ培養液中で
摩砕し、細胞を500〜1000個/mm2の密度でポリオルニチン/ラミニン
を塗布したカバーガラス上に播いた。細胞を加湿した95%空気/5%CO2イ
ンキュベーター中で、37℃に一晩維持し、その後、前述のように in sit
u ハイブリダイゼーション・細胞化学用に処理する(Black et al., (1994) Br
ain Res. Mol. Brain Res. 23, 235-245; Zur et al., (1995) Brain Res. Mol.
Brain Res. 30, 97-105)。熟練した当業者であれば、同様の方法で三叉神経節
を培養することもできる。
深層麻酔し、まず、リン酸バッファー生理食塩水(PBS)溶液で、次に4%パ
ラフォルムアルデヒド添加ソレンセンリン酸バッファー、pH7.4を、4℃で
心臓を通して還流した。潅流固定の後、L4およびL5の部位の後根神経節およ
び三叉神経節を採取し、新鮮な固定液中に置いた。2〜4時間後、組織を4%パ
ラフォルムアルデヒドおよび30%Sucroseを含む0.14Mリン酸バッ
ファー中に置き、4℃で一晩保存した。15μmの組織切片を切り、ポリ-L-リ
ジンを塗布したスライドガラス上に置いた。スライドを以前に報告されたように
in situハイブリダイゼーション・細胞化学用に処理する(Waxman et al.
, (1994) J. Neurophysiol. 72, 466-470; Black et al., (1994) Brain Res. M
ol. Brain Res. 23, 235-245)。in situハイブリダイゼーション・細胞
化学処理を行った後、スライドを脱水、清浄し、Permountでマウントし
た。図5にこの結果を示す。
識を示さなかった(図5、パネルC)。NaNアンチセンス・リボプローブをハ
イブリダイズしたDRG(図5、パネルA)および三叉神経節(パネルB)では
、NaNのシグナルが殆どの小ニューロン(直径30mm未満)に存在しており
、対照的に、殆どの大ニューロン(直径30mm以上)は、NaNのハイブリダ
イゼーションによるシグナルを示さなかった。アンチセンスNaNリボプローブ
をハイブリダイズした脊索、小脳および肝臓の切片には特異的シグナルは観察さ
れなかった(それぞれ、パネルD、EおよびF)。
ロサテライトは、ヒトSCN11a遺伝子では多型性を示すかもしれない、疾病
に関連する変異体対立遺伝子をスクリーニングするためのマーカーとして利用で
きるであろう。このようなスクリーニング法として、ハイブリダイゼーションま
たはアンプリフィケーション・アッセイは、容易く利用できる。
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTTGGGGGGTGGTGGCAGAGTCTGGTA
TTGGTAAGGTGAGAGCAATCCCAGAACGTCCACCTGCTCTTCCATTTTATTAATCAGGCAGGCCTCT イントロン5:マイクロサテライトはdCdTdG(dNdG2)x(X5−
30)(配列番号30) GTAAGCCACTGGCTCTTAACTAAAATGCTCGTTGGCATTAGAACATTTCTGAGCTGGGGTGGTGGTGGTGGT
GGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGTGGTGGAGGTGGNGGTGGAGGTGGT
GGCTGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGTGGTGGANGTGGANGTGGTGGCGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGAG
GTGGTGGCTGTGGTGGTNGTGGTGGC イントロン6:マイクロサテライトはdCdA(配列番号31) TGTGCATGCTTGATTCCCAGCTCCTATGGTCTGATTACTCGGTCCTTAGGAGCAAGGCCAGACTGTCCACCC
TGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTGTAGAGAATTACCTCATTC
TTGGAGTTTCTCTGGAAAAGGAATGTCTCAAAGCCAAGTTCACAGAGCAACAGCTG イントロン8:5'マイクロサテライトはdTのストレッチが後に続くdTd
Cg(配列番号32) TGTTAGAAACTCTAAGACAATGAAGCACCATGCTGGAAATAAGAGCACAAACTCTTTCTTCATGCATTACCC
ACTGCTTGTGCTTTCACCTTAGTGCTCGTGCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTTT イントロン8:3'マイクロサテライトはdCdA(配列番号33) CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAAACACTGTCGCAGTCATACATATAAAGA
TAAATACATCTTAAAAAAAGAACCATGTGATTGAGTTATAAAATATTCCAACTTAT イントロン10B:マイクロサテライトはdCdA、続いて、3個のヌクレオ
チド下流のdCdA3(配列番号34) AGGTCATTTCCTCTGCAGTGTGCTTGGCAGGAAAAACTTCCTGGCTATTCAAGTCAGTGCCCTGCTTGATCA
TCCATGTATCACACACACACAAAACAAACAAACAAACAAACAAAACCCTGGGGAAGAAGGAAGAGGTTAAGC
ACATAGGCAGAGAGCAGCCAGGCTGACTCAGAGCAAACACCTGATCATTCTTCCAT イントロン12:マイクロサテライトはdPydG(dt/dCdG)(配列
番号35) GTGCTGGGATCAAAGGCGTGCGCCGCCACCACGCCCGGCCCCTTTTTATGTTTCAAATTTACTTTTATCATG
TGCACGTGTGTGGGTGCGTGCATGTGTGTGCGTGCGTGTGCGTGTGNGTGTGNGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
TGTGTGTGTGTGTG イントロン14:マイクロサテライトはdCdA(配列番号36) CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACTTGCATCTTTGAGTT
AATTGGATAGGCTGAGTCTTACACCGGAATCATACTGTTGC イントロン15A:マイクロサテライトはdCdA(配列番号37) CCAATGAGAGACTCTTGTCTCAAAAAAGCCATGGTGTCCAGATCCTGAGGAATAACACCTAAGAATGTGCTC
TGGCCTGAAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTTTATTTATTTATTTAAAAAA
ATATGTCTCTAGGCATTGCTGAAATGTCTCCTACAGGATTAAGTCAACCAGAGCCA
するものであることを理解すべきである。本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなく様々な修正や等価な変更がなしうることは、当業者にとっては明白であ
ろう。本特許明細書において引用および参照された文献は、その全体が参考文献
として本明細書に取り込まれている。
ンI−IVの予測された細胞膜部分に下線が引いてある。TTX−R表現型に関
連するDI−SS2のアミノ酸、セリン"S"は、太活字で示してある。
ーを使って行ったRT−PCR分析結果を示す。NaNは、背骨神経節と三叉神
経節において多量に発現している。低レベルのNaNが大脳半球と網膜組織にお
いて検出される。小脳、視神経、脊髄、挫骨神経、上位頸部神経節、骨格筋、心
筋、副腎、子宮、肝臓および腎臓では、NaN信号は検出されない。
。三叉神経節細胞は、中程度から高程度のハイブリダイゼーション信号を示す(
A)。後根神経節細胞は、その小さな細胞において、中程度から高程度のハイブ
リダイゼーション信号を示す(B)。大きな後根神経節細胞では、ハイブリダイ
ゼーション信号が減衰している(矢印)。DRGニューロンにおいては、センス
プローブの信号が無い(C)。脊髄、小脳および肝臓においては、ハイブリダイ
ゼーション信号は見られない(D−F)。全ての組織は、成長したスプレードー
リーラットからのものである(スケールバー=50μm)。
びそのサブユニットに特異的な制限酵素プロフィールを示す。
免疫蛍光局在決定用に処理されたDRGニューロンの培養物を示す。(A−B)
NaN免疫染色は、DRGニューロンの細胞体で顕著である。(C)NaNは、
DRGニューロンの細胞体並びに神経突起に存在する。(D)NaNタンパク質
を発現しないニューロンのノルマルスキー写真像。(D')NaNタンパク質を
発現しないニューロンの蛍光写真像。
所を示す。ジャクソンBSSバッククロスからのハプトタイプ。黒箱は、C57
BL/6Jアリールを表し、白箱は、SPRET/Eiアリールを表す。それぞ
れのハプトタイプを持つ動物数が、それそれの行の下に示してある。タイピング
が不明瞭なときは、欠けているデータは、近接したデータから推論された。
からのScn5aとScn10aの位置およびヒトのオルソログ位置が印されて
いる。ナンバーは、コンセンサスマップ上のcM位置である。 (http://www.informatics.jax.org/bin/ccr/index)。
クレオチド配列(配列番号41)を示す。
Claims (37)
- 【請求項1】 配列番号41を含む核酸分子と、配列番号42のアミノ酸配
列をコードする核酸分子と、配列番号42の対立遺伝子変異体をコードする核酸
分子と、配列番号42に対して少なくとも約76%のアミノ酸配列同一性を示す
ヒトタンパク質をコードする核酸分子と、ストリンジェントな条件下で前記の配
列の1つにハイブリダイズする核酸分子とからなる群より選択される、単離され
た核酸分子。 - 【請求項2】 前記核酸が、後根神経節または三叉神経節において選択的に
発現される電位依存性Na+チャンネルをコードする、請求項1に記載の単離さ
れた核酸分子。 - 【請求項3】 前記核酸が、ヒトNaNナトリウムチャンネルをコードする
、請求項2に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離された核酸を、単
独で或いは適当な調節および発現制御要素とともに含む発現ベクター。 - 【請求項5】 請求項4に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 【請求項6】 請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離された核酸分子に
よってコードされるNa+チャンネル。 - 【請求項7】 配列番号42のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のNa + チャンネル。
- 【請求項8】 配列番号42のアミノ酸配列またはそのペプチド断片よりな
る単離されたタンパク質分子。 - 【請求項9】 請求項5に記載の宿主細胞から単離された膜断片内に含まれ
るタンパク質。 - 【請求項10】 請求項6に記載のNa+チャンネルの活性を調節する薬剤
を同定する方法であって、該薬剤を、Na+チャンネルをその表面に発現する細
胞と接触させる工程と、その結果生じるナトリウム電流の変化、膜電位の変化、
または細胞内Na+の変化を測定する工程とを含む、前記方法。 - 【請求項11】 前記測定工程が、電圧クランプ測定または膜電位の測定に
よって達成される、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 前記測定工程が、細胞内ナトリウムのレベルを測定するこ
とによって達成される、請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 前記測定工程が、ナトリウムの流入を測定することによっ
て達成される、請求項10に記載の方法。 - 【請求項14】 前記ナトリウムの流入が、22Naまたは86Rbを用いて測
定される、請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 請求項6に記載のNa+チャンネルをコードするmRNA
の転写または翻訳を調節する薬剤を同定する方法であって、該薬剤を、Na+チ
ャンネルを発現する細胞と接触させる工程と、その結果生じるNa+チャンネル
発現のレベルを測定する工程とを含む、前記方法。 - 【請求項16】 DRGニューロンまたは三叉神経ニューロン中のNaNチ
ャンネルを介してのNa+電流の流れを変化させる薬剤の有効量を投与すること
によって、動物またはヒト被検体において、痛み、感覚異常および/または興奮
過敏症状を治療する方法。 - 【請求項17】 請求項6に記載のNa+チャンネルをコードするmRNA
の転写または翻訳を調節する薬剤の有効量を投与することによって、動物または
ヒト被検体において、痛み、感覚異常および/または興奮過敏症状を治療する方
法。 - 【請求項18】 請求項1に記載の核酸に対してアンチセンスであり、かつ
、mRNAを含む細胞中のNaNチャンネルの発現を調節するのに十分な長さで
ある単離された核酸。 - 【請求項19】 ヒトNaNNa+チャンネルに特異的な標識モノクローナ
ル抗体または他の標識リガンドを投与することによって、動物またはヒト被検体
において、痛みの発生の遺伝子座を画像化するか、或いはDRGニューロンまた
は三叉神経ニューロンに媒介される興奮過敏症状に関連する痛みのレベルの尺度
を提供する、シンチグラフィー法。 - 【請求項20】 細胞表面上または細胞内でヒトNaNを検出する工程を含
む、ヒトNaNナトリウムチャンネルを発現する組織、細胞または細胞型を同定
する方法。 - 【請求項21】 ヒトNaNをコードするmRNAの存在を検出する工程を
含む、ヒトNaNを発現する組織、細胞または細胞型を同定する方法。 - 【請求項22】 NaNをコードする外因性核酸を発現する形質転換された
細胞の製造方法であって、適当な調節または発現制御要素とともに請求項1〜3
のいずれか1項に記載の単離された核酸を含む発現ベクターで、前記細胞を形質
転換する工程を含む、前記方法。 - 【請求項23】 ヒトNaNチャンネルまたはそのポリペプチド断片に特異
的な単離された抗体。 - 【請求項24】 前記抗体が標識されている、請求項23に記載の単離され
た抗体。 - 【請求項25】 請求項5に記載の形質転換された宿主を、NaNナトリウ
ムチャンネルまたはタンパク質が発現される条件下で培養する工程を含む、組換
えNaNタンパク質の製造方法。 - 【請求項26】 軸索切断された、炎症をおこした、さもなければ損傷され
たDRGニューロンにおいて、急速にリプライミングする電流の流れを変化(例
えば、増加または減少)させることが可能な薬剤の有効量を含む治療的組成物。 - 【請求項27】 請求項26に記載の治療的組成物を投与することによって
、動物またはヒト被検者において、急性の痛み、急性または慢性の、神経性若し
くは炎症性の痛み、および興奮過敏症状を治療する方法。 - 【請求項28】 軸索切断された、炎症をおこした、さもなければ損傷され
たDRGニューロンにおいて、NaNチャンネルmRNAをアップレギュレート
またはダウンレギュレートする能力を試験することによって、痛みおよび興奮過
敏症状の治療に用いる候補化合物をスクリーンニングする方法。 - 【請求項29】 NaNキメラチャンネル。
- 【請求項30】 少なくとも1つのヒトドメインが、他の種からのNaNチ
ャンネルの対応ドメインで置換されている、請求項29に記載のキメラチャンネ
ル。 - 【請求項31】 前記種がラットまたはマウスである、請求項30に記載の
キメラチャンネル。 - 【請求項32】 請求項29〜31のいずれか1項に記載のNaNキメラチ
ャンネルをコードしている核酸分子。 - 【請求項33】 正に荷電したアミノ酸を、配列番号42の残基670に対
応する位置に含む、NaNチャンネルタンパク質。 - 【請求項34】 前記正に荷電したアミノ酸がアルギニンである、請求項3
3に記載のNaNチャンネルタンパク質。 - 【請求項35】 請求項33または34のいずれか1項に記載のチャンネル
タンパク質をコードしている単離された核酸分子。 - 【請求項36】 第一次感覚ニューロン中のチャンネルを調節する、少なく
とも1つの第二の薬剤を更に含む、請求項26に記載の治療的組成物。 - 【請求項37】 前記組成物が、NaNと、PN1/hNEおよびSNS/
PN3からなる群より選択される少なくとも1つのチャンネルとを調節する薬剤
を含む、請求項36に記載の治療的組成物。
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EP1485467A4 (en) * | 2002-03-20 | 2006-05-10 | Transmolecular Inc | RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS FOR FUNCTIONAL NAV1.9 SODIUM CHANNELS |
US7130691B2 (en) * | 2002-06-27 | 2006-10-31 | Falci Scott P | Method for eradicating pain of central origin resulting from spinal cord injury |
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US9084058B2 (en) | 2011-12-29 | 2015-07-14 | Sonos, Inc. | Sound field calibration using listener localization |
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US9706323B2 (en) | 2014-09-09 | 2017-07-11 | Sonos, Inc. | Playback device calibration |
US9106192B2 (en) | 2012-06-28 | 2015-08-11 | Sonos, Inc. | System and method for device playback calibration |
US9219460B2 (en) | 2014-03-17 | 2015-12-22 | Sonos, Inc. | Audio settings based on environment |
US9690539B2 (en) | 2012-06-28 | 2017-06-27 | Sonos, Inc. | Speaker calibration user interface |
US9668049B2 (en) | 2012-06-28 | 2017-05-30 | Sonos, Inc. | Playback device calibration user interfaces |
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US9264839B2 (en) | 2014-03-17 | 2016-02-16 | Sonos, Inc. | Playback device configuration based on proximity detection |
US9910634B2 (en) | 2014-09-09 | 2018-03-06 | Sonos, Inc. | Microphone calibration |
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US10127006B2 (en) | 2014-09-09 | 2018-11-13 | Sonos, Inc. | Facilitating calibration of an audio playback device |
WO2016172593A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Sonos, Inc. | Playback device calibration user interfaces |
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US9693165B2 (en) | 2015-09-17 | 2017-06-27 | Sonos, Inc. | Validation of audio calibration using multi-dimensional motion check |
US9743207B1 (en) | 2016-01-18 | 2017-08-22 | Sonos, Inc. | Calibration using multiple recording devices |
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US11106423B2 (en) | 2016-01-25 | 2021-08-31 | Sonos, Inc. | Evaluating calibration of a playback device |
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US9860662B2 (en) | 2016-04-01 | 2018-01-02 | Sonos, Inc. | Updating playback device configuration information based on calibration data |
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US10299061B1 (en) | 2018-08-28 | 2019-05-21 | Sonos, Inc. | Playback device calibration |
US10734965B1 (en) | 2019-08-12 | 2020-08-04 | Sonos, Inc. | Audio calibration of a portable playback device |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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GB9513180D0 (en) | 1995-06-28 | 1995-08-30 | Univ London | Ion channel |
US6184349B1 (en) * | 1995-10-11 | 2001-02-06 | Syntex (Usa) Inc. | Cloned peripheral nerve, tetrodotoxin-resistant sodium channel α-subunit |
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